Artículo de investigación
Estudios cromosómicos, morfología y fertilidad polínica
en Dioscorea ayardei (Dioscoreaceae)
Chromosomal studies, pollen morphology and fertility
in Dioscorea ayardei (Dioscoreaceae)
Patricia N. Asesor1, 3 , Aldo R. Andrada2 , Valeria de los A. Páez2 , Nora J. F. Reyes1 , Eva Bulacio1
Resumen:
Antecedentes y Objetivos: La gran variabilidad de caracteres en Dioscorea dificultan la delimitación de las especies, por lo que estudios complementarios son necesarios para lograr su identificación. Dioscorea ayardei, especie endémica descrita recientemente de las Sierras de Calilegua (Jujuy,
Argentina), se diferencia por la particularidad del androceo en sus flores estaminadas, la cual consiste en una estructura navicular con una sola antera
en el centro y tres apéndices dendriformes erectos. El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio conjunto de sus caracteres cromosómicos y
palinológicos, que sumados a los morfológicos aporten información complementaria para su correcta delimitación.
Métodos: El material estudiado fue identificado según los métodos clásicos en taxonomía y depositado en el Herbario LIL, de la Fundación Miguel Lillo. Para estudiar la meiosis se seleccionaron al azar botones florales jóvenes, que fueron fijados en Farmer durante 24 horas y conservados en alcohol
etílico 70° a -4°C. La tinción de los cromosomas se realizó con hematoxilina propiónica al 2%. La fertilidad de los granos de polen se estimó mediante
las técnicas de Mützing y DAPI. Para describir la morfología polínica, el material fue procesado según las técnicas convencionales de acetólisis y polen
natural; se tomaron fotos con microscopía óptica (MO) y electrónica de barrido (MEB).
Resultados clave: Dioscorea ayardei presentó un número gametofítico n=20II. El comportamiento meiótico fue generalmente regular. Las técnicas
para estimar viabilidad y fertilidad del grano de polen revelaron un valor de 90-93% respectivamente. La morfología muestra un grano disulcado de
tamaño pequeño (16-24 µm) a mediano (25-30 µm) con tectum microreticulado.
Conclusiones: Se reafirma el número cromosómico básico para el género x=10. Dioscorea ayardei es un tetraploide con n=20, de comportamiento
meiótico normal que concuerda con la viabilidad potencial del grano de polen. La ornamentación de la exina y el número cromosómico la relaciona
con el clado Nuevo Mundo II.
Palabras clave: comportamiento meiótico, morfología polínica, número cromosómico gametofítico, viabilidad de polen.
Abstract:
Background and Aims: The great variability of characters in Dioscorea makes it difficult to define the species, therefore additional studies are necessary to identify them. Dioscorea ayardei, a recently described endemic species from the Sierras de Calilegua (Jujuy, Argentina), differs by the particularity of the androecium of its staminate flowers which consists of a navicular structure with a single anther in the center and three erect dendriform
appendages. The aim of this paper was to carry out an ensemble study of its chromosomal and palynological characters that, added to the morphological ones, provide complementary information for its correct delimitation.
Methods: The studied material was identified according to the classic methods in taxonomy and deposited in the LIL Herbarium, of the Fundación
Miguel Lillo. For study of meiosis, young flower buds were randomly selected, which were fixed in Farmer for 24 hours and preserved in 70° to -4°C
ethyl alcohol. For chromosome staining, 2% propionic hematoxylin was used. Fertility of pollen grains was estimated using the Mützing and DAPI
techniques. For the pollen morphology description the material was processed according to the conventional techniques of acetolysis and natural
pollen; photographs were taken with light microscope (LM) and scanning electron microscope (SEM).
Key results: Dioscorea ayardei presented a gametophytic number n=20II. Meiotic behavior was generally regular. The techniques to estimate viability
and fertility of the pollen grain revealed a value of 90-93%, respectively. The morphology showed a small (16-24 µm) to medium (25-30 µm) sized
disulcate grain with microreticulate tectum.
Conclusions: The basic chromosome number for the genus x=10 is reaffirmed. Dioscorea ayardei is a tetraploid with n=20, with normal meiotic behavior consistent with the potential viability of the pollen grain. The exine ornamentation and chromosome number relates with the New World II
clade.
Key words: gametophytic chromosome number, meiotic behavior, pollen morphology, pollen viability.
Instituto de Taxonomía Fanerogámica y Palinología,
Área Botánica, Fundación M. Lillo, Miguel Lillo
251, T4000JFE San Miguel de Tucumán, Tucumán,
Argentina.
2
Instituto de Genética y Microbiología, Área Biología Integrativa, Fundación M. Lillo, Miguel Lillo 251, T4000JFE
San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina.
3
Autor para la correspondencia: pnasesor@lillo.org.ar
1
Recibido: 7 de julio de 2022.
Revisado: 27 de julio de 2022.
Aceptado por Rosario Redonda-Martínez: 12 de
septiembre de 2022.
Publicado Primero en línea: 15 de septiembre de 2022.
Publicado: Acta Botanica Mexicana 129(2022).
Citar como: Asesor, P. N., A. R. Andrada, V. de los
A. Páez, N. J. F. Reyes y E. Bulacio. 2022. Estudios
cromosómicos, morfología y fertilidad polínica en
Dioscorea ayardei (Dioscoreaceae). Acta Botanica
Mexicana 129: e2095. DOI: https://doi.org/10.21829/
abm129.2022.2095
Este es un artículo de acceso abierto
bajo la licencia Creative Commons 4.0
Atribución-No Comercial (CC BY-NC 4.0 Internacional).
e-ISSN: 2448-7589
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Asesor et al.: Estudios cromosómicos y palinológicos en Dioscorea ayardei
Introducción
Dioscorea L. es un género que incluye alrededor de 630
especies (Govaerts et al., 2018) distribuidas en regiones
tropicales y subtropicales, y solo algunos representantes
se encuentran en zonas templadas de todo el mundo (Wilkin et al., 2005; Romero-Hernández et al., 2019). La mayor
variedad y concentración ocurre en el Neotrópico, con al
menos 55% de los taxones conocidos (Govaerts et al., 2007;
Couto, 2015).
La gran diversidad morfológica, su naturaleza dioica,
el tamaño pequeño de las flores, así como la plasticidad fenotípica en algunas especies de Dioscorea, dificultan su delimitación (Wilkin et al., 2005; Raz, 2016). Esto llevó a que
se reportaran complejos taxonómicos sin límites específicos, tornándose en un desafío para su sistemática (Couto et
al., 2014; Wilkin y Muasya, 2015; Fraga et al., 2019).
Las especies de Dioscorea se diferencian principalmente por las características del androceo de las flores estaminadas al presentar uno, tres o seis estambres, libres
o unidos formando una columna estaminal cilíndrica, piramidal u ovoide que puede o no contener apéndices y estar
inserta o no en un disco carnoso (Xifreda y Seo, 2009; Asesor y Bulacio, 2017; Romero-Hernández et al., 2019). Numerosos estudios taxonómicos, incluso la delimitación de
especies neotropicales, se han centrado en caracteres morfoanatómicos y polínicos destacando su importancia para
comprender las relaciones interespecíficas (Xifreda, 1990,
2000; Couto et al., 2014; Tenorio et al., 2017; Alzer et al.,
2019; Da Luz et al., 2020).
Los análisis citogenéticos en Dioscorea de Argentina
son escasos (Wulff et al., 2003), solo se registran recuentos cromosómicos para algunas especies del Nuevo y Viejo
Mundo. Estos estudios mencionan números básicos x=9
y x=10 (Martin y Ortiz, 1963; Baquar, 1980; Essad, 1984;
Bousalem et al., 2006; Viruel et al., 2008) con niveles de
ploidía desde 2x hasta 10x para D. althaeoides R. Knuth y D.
benthamii Prain & Burkill, respectivamente (Kiangsu Institute of Botany, 1976; Chin et al., 1985). Xifreda (2000) considera que estudios adicionales, como el número cromosómico en especies del Nuevo Mundo, sin duda mejorarían la
sistemática infragenérica de Dioscorea.
Entre los caracteres palinológicos que definen al género, la ornamentación de la exina evidencia una variación
desde tipos perforados, rugulados, estriados hasta reticulados (Xifreda, 2000; Alzer et al., 2019; Da Luz et al., 2020).
Diversos autores difieren al momento de describir mediante microscopía óptica (MO) la ornamentación de la exina
en individuos de una misma especie de Dioscorea (Xifreda,
2000; Alzer et al., 2019; Da Luz et al., 2020). Esto demuestra
la importancia del uso de la microscopía electrónica (ME)
para tales estudios, además de una correcta identificación
taxonómica. Por su parte, el tamaño del grano de polen
puede variar respondiendo, entre otros factores, al amplio
rango geográfico en el que habitan las especies y en donde
están sometidas a diferentes condiciones ambientales (Da
Luz et al., 2020).
Por último, en relación con el número de aberturas, se han reportado granos de polen mono y disulcados
(Caddick et al., 1998; Schols et al., 2001, 2003, 2005; Wilkin et al., 2009; Viruel et al., 2010). Sadik y Okereke (1975)
sostienen que los estudios polínicos son claves para definir la identidad de las especies y analizar su éxito germinativo.
Dioscorea ayardei Asesor es una especie recientemente descrita, endémica de las Sierras de Calilegua (Jujuy, Argentina), que se caracteriza por la particularidad
del androceo de sus flores estaminadas, la cual consiste
en una estructura navicular con una sola antera inserta en
el centro y tres apéndices dendriformes erectos (Asesor y
Bulacio, 2021). El objetivo de este trabajo fue realizar un
estudio conjunto de caracteres cromosómicos y palinológicos, que sumados a los morfológicos aporten información
complementaria para su correcta delimitación.
Materiales y Métodos
Recolecta de Dioscorea ayardei
El material estudiado proviene de las Sierras de Calilegua,
departamento Valle Grande, ubicado al sureste de la provincia Jujuy (Argentina) (Fig. 1). El mismo fue recolectado
entre 1500 y 2800 m s.n.m., en el piso altitudinal del bosque montano superior de las yungas y en los pastizales de
neblina y arbustales mesofíticos (Oyarzabal et al., 2018;
Arana et al., 2021). Para identificar la especie se utilizaron
técnicas tradicionales en taxonomía y se consultó bibliografía específica: Grisebach (1842, 1875), Hauman (1916),
Knuth (1917, 1924), Castillón (1927), Xifreda (1982a, b,
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Asesor et al.: Estudios cromosómicos y palinológicos en Dioscorea ayardei
Figura 1: Sitios de colecta de Dioscorea ayardei Asesor, en las Sierras de Calilegua, Jujuy, Argentina.
1983, 1984, 1996), Huber (1998), Govaerts et al. (2007),
Xifreda y Seo (2009), Couto (2010, 2015), Jørgensen et al.
(2014), Asesor y Bulacio (2021). El material colectado se
herborizó y otra parte fue fijada en líquido conservante
FAA (1:2:7:10, ácido acético glacial, formaldehído, agua y
alcohol) (D’Ambrogio de Argüeso, 1986), para su posterior
análisis en el laboratorio. Finalmente, ejemplares de referencia se depositaron en el Herbario Fanerogámico de la
Fundación Miguel Lillo (LIL) (Thiers, 2022).
Material estudiado
ARGENTINA. Provincia Jujuy, Valle Grande, Sierras de Calilegua, Puesto Duraznillo, 23°37'35.39''S, 64°53'46.67''O,
2600 m, arbustal mesofítico, 24.II.2015, P. Asesor et al.
115 (LIL); camino a Alto de Calilegua, pasando Quebrada
Honda, 23°33'57.30''S, 64°53'46.67''O, 2610 m, quebrada húmeda en pastizal con Alnus acuminata y Polylepis
australis, 25.II.2009, E. Bulacio y H. Ayarde 1055 (LIL); Quebrada por Paso Despensa, 23°38'13.89''S, 64°56'24.23''O,
1500 m, arbustal de ecotono, 29.III.2009, E. Bulacio y H.
Ayarde 1288 (LIL); Quebrada de Cortaderas, 23°37'07.27''S,
64°54'30.91''O, 2600 m, quebrada húmeda con arbustales
bajos, 26.II.2016, E. Bulacio y H. Ayarde 3029 (LIL); Puesto
Aguas Blancas, 23°36'01.33''S, 64°54'25.62''O, 2690 m, pastizal, 12.I.2017, E. Bulacio y H. Ayarde 3170 (LIL).
Recuento
meiótico
cromosómico
y
comportamiento
Meiosis: Se recolectaron al azar botones florales jóvenes.
El material se fijó en Farmer (3:1 alcohol etílico 96° y ácido
acético glacial) (Sharma y Sharma, 1965) durante 24 horas
y luego se conservó en alcohol etílico 70° a -4 °C. Las anteras se hidrolizaron con ácido clorhídrico (HCl) 1N a 60 °C
durante 20 minutos, posteriormente se lavaron en agua
destilada. La coloración y el montaje se efectuaron con una
gota de hematoxilina propiónica al 2% con cristales de citrato férrico. Se llevaron a cabo recuentos cromosómicos
en microscopio (Nikon Eclipse E200, Tokio, Japón) con cámara Moticam (1000, 1.3 MP, Tokio, Japón), sobre diez diacinesis/placas metafásicas y para el análisis de la meiosis
se observaron en cada estadio 100 células madre del polen
(CMPs) como mínimo.
Fertilidad del polen
La estimación de la viabilidad de los granos de polen y el
estado del núcleo se realizaron mediante una selección al
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Asesor et al.: Estudios cromosómicos y palinológicos en Dioscorea ayardei
azar de diez flores inmediatamente antes de la antesis, que
se fijaron en Farmer.
Se empleó la técnica de coloración de Müntzing
(Sharma y Sharma, 1965) observándose como mínimo
1000 granos de polen, considerando viables aquellos que
resultaron teñidos de color rojo intenso en 2/3 de su contenido.
Para determinar el estado de los núcleos se utilizó el
fluorocromo 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de acuerdo
con el protocolo de Dewitte et al. (2010). Los núcleos se observaron en 100 granos de polen como mínimo, en microscopio de epifluorescencia (Olympus BX43F, Tokio, Japón;
cámara Olympus Q color-5 (5 MP), Tokio, Japón).
Morfología del polen
Se realizaron observaciones en microscopio óptico (MO)
(Carl Zeiss Axio LAB A1, Göttingen, Alemania) con cámara
Axiocam (ERc5s, Göttingen, Alemania), aplicándose la técnica de Wodehouse (1935), para polen no acetolizado y la
de Erdtman (1960) en el acetolizado. A partir de un mínimo
de 20 granos de polen, en cada tipo de material, se midieron los siguientes parámetros: diámetro ecuatorial mayor
en vista polar (DM), diámetro ecuatorial menor en vista
polar (Dme), diámetro polar en vista ecuatorial (DP) y longitud de la apertura (Lap). Para el análisis de microscopía
electrónica de barrido (MEB) los granos de polen acetolizados se metalizaron con oro (Dorador, Ion Spotter, JFC 1100
Joel, Japón), de acuerdo con la técnica de Karnovsky (1965).
Se utilizó el microscopio electrónico de barrido Zeiss Supra
55VP (Oberkochen, Alemania).
La terminología empleada en la descripción polínica corresponde a Erdtman (1943), Sáenz Laín (2004), Punt
et al. (2007), Hesse et al. (2009) y Alzer et al. (2019). Las
muestras palinológicas se incorporaron a la Palinoteca del
Laboratorio de Palinología de la Fundación Miguel Lillo
(PAL-TUC), Tucumán, Argentina.
Resultados
Recuento
meiótico
cromosómico
y
comportamiento
Dioscorea ayardei (Fig. 2) presentó un número gametofítico de n=20II (Fig. 2B). El comportamiento meiótico fue
generalmente regular (Fig. 2C); sin embargo, se observa-
ron algunas aberraciones durante las diferentes etapas
meióticas. El 4% de las células en metafase I (MI) mostraron 1-4 cromosomas fuera de la placa ecuatorial o un par
de univalentes dispuestos al azar en el citoplasma (Fig.
2D), mientras que en metafase II (MII) 2.3% de CMPs presentaron cromosomas fuera de la placa ecuatorial (Fig.
2E).
Fertilidad del polen
Al estimar la viabilidad de los granos de polen, se observó
que 90% de ellos se colorearon con solución de Müntzing,
10% restante corresponde a granos no viables; son translúcidos, presentaron forma alargada y aspecto plasmolizado
(Fig. 2H).
La tinción con DAPI reveló dos núcleos bien definidos
en 93% de los granos viables en D. ayardei; el núcleo de
mayor tamaño corresponde al generativo (NG) y el menor,
al núcleo vegetativo (NV), el resto de los granos solamente
exhibieron el generativo (Fig. 2G).
Morfología polínica
Dioscorea ayardei presenta mónadas heteropolares, con
simetría bilateral, disulcadas, elípticas en vista polar, donde
se observan los sulcos. En material acetolizado el tamaño
de los granos es pequeño a mediano, con DM de 20.6 (25.7)
29.7 µm y Dme de 14 (16.41) 17.8 µm, mientras que en el
no acetolizado se encuentran granos pequeños con DM de
20 (22) 24 µm y Dme de 16.7 (18.3) 21.5 µm. En la exina
tectada-columelada de 1-2.4 µm de espesor se puede diferenciar la sexina de 0.4-1.9 µm de la nexina de 0.2-0.8 µm.
Con MEB se observa un tectum microreticulado con muros
de 0.25-0.5 µm de ancho y lúmenes poligonales irregulares
de 0.2-0.7 µm (Fig. 2I, J).
Discusión
Los números cromosómicos básicos de las especies de
Dioscorea varían según la región que ocupan en su amplia distribución. Los antecedentes bibliográficos generales reportan números cromosómicos 2n=20-140, con
formas diploides, tetraploides, hexaploides, octoploides
e híbridos inter e intraespecíficos (Martin y Ortiz, 1963;
1966; Paul y Debnath, 2019). Lewis (1980) propuso como
número básico para las especies del Viejo Mundo x=10,
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Figura 2: Dioscorea ayardei Asesor. A. flor masculina; B. diacinesis n=20II; C. células madre de polen (CMPs) en Metafase I (MI) regulares; D. MI con
cromosoma fuera de la placa ecuatorial (punta de flecha negra); E. Metafase II (MII) con cromosoma fuera de la placa ecuatorial (punta de flecha
negra); F. grano de polen viable e inviable teñidos con Müntzing; G. núcleos en granos de polen teñidos con DAPI, la punta de flecha blanca indica
núcleo vegetativo (NV); H. grano de polen acetolizado en vista polar distal; I-J. grano de polen observado en MEB. Escalas: A-G=10μm, H=20μm,
I-J=5μm.
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mientras que las del Nuevo Mundo son tratadas como
poliploides derivados de un ancestro putativo aneuploide con n=9, aunque este número no ha sido registrado
hasta el momento.
En la actualidad, se han realizado estudios citogenéticos en 66 especies (16 son sudamericanas), de las 650 que
comprende Dioscorea (Goldblatt, 1979; Wulff et al., 2003).
La escasa información citológica se debe a la dificultad de
llevar a cabo recuentos cromosómicos dado su tamaño
pequeño (1-2.5 µm), priorizando estudios en taxones de
importancia económica (Martin y Ortiz, 1966). Wulff et al.
(2003) y Xifreda y Seo (2009) sugieren x=10 como número
básico para las secciones Monadelpha Uline, Centrostemon
Griseb. y Cycladenium Uline, aportando los primeros datos
para diez especies de Argentina. En este trabajo se reporta
por primera vez el número cromosómico gametofítico en
D. ayardei, n=20. Nuestros resultados son coincidentes con
los obtenidos por Wulff et al. (2003) para D. cienegensis R.
Knuth y D. monadelpha (Kunth) Griseb., ambas pertenecientes a la sección Monadelpha y afines a D. ayardei, cuya
ubicación dentro de una sección requiere de estudios complementarios, principalmente moleculares.
El comportamiento regular observado en ambas etapas de la meiosis de D. ayardei revelaría el nivel de estabilidad en el taxón. La ausencia o baja frecuencia de anormalidades constituye uno de los factores que se relacionan con
su adaptabilidad (Caetano, 2003), tal como lo reflejan los
porcentajes de viabilidad potencial polínica. La predominancia de dos núcleos en los granos de polen de D. ayardei
da lugar a una alta viabilidad ya que cuentan con las proteínas implicadas en la germinación del tubo polínico, en
contraste con los granos mononucleados que carecen de
ellas (Zhou y Meier, 2014).
Los análisis palinológicos mostraron que D. ayardei
tiene exina microreticulada con sectores en donde los muros pierden continuidad y se produce la fusión de lúmenes
dando una apariencia de superficie rugulada. Esta característica coincide con Xifreda (2000), quien mencionó la
presencia de polen rugulado-reticulado en especies sudamericanas de las secciones Monadelpha, Centrostemon y
Dematostemon Griseb. Mientras que Da Luz et al. (2020)
manifestaron que este tipo de ornamentación se encuentra solo en las especies que pertenecen al clado Nuevo
Mundo II, propuesto a partir de análisis filogenéticos moleculares (Wilkin et al., 2005; Viruel et al., 2016), el cual
agrupa taxones neotropicales de las secciones señaladas
por Xifreda (2000).
La abertura disulcada (siguiendo la terminología de
Alzer et al., 2019) que presenta D. ayardei coincide con
lo reportado por Da Luz et al. (2020), en el análisis polínico de especies neotropicales. Sin embargo, el carácter es
poco común en monocotiledóneas puesto que está restringido a familias como Amaryllidaceae y Arecaceae (Schols
et al., 2003). En el género Dioscorea la predominancia del
polen monosulcado ocurre en secciones basales como
Stenophora Uline, mientras que en las derivadas existe una
variación en el número de aberturas (Su, 1987; Schols et al.,
2001, 2005). Dicho aumento ofrecería una ventaja selectiva, debido al incremento de los sitios de germinación posibles, facilitando así el contacto entre al menos una abertura
y la superficie del estigma (Doyle, 2005).
Estudios micromorfológicos, anatómicos y polínicos demostraron ser útiles en revisiones taxonómicas de
Dioscorea (Tenorio et al., 2017; Alzer et al., 2019). Por lo
tanto, el aporte de tales datos, sumados a los cromosómicos, ayudarán a esclarecer los límites y relaciones entre especies neotropicales, debido a la amplia plasticidad fenotípica de Dioscorea.
Conclusiones
Se aportan datos que reafirman un número básico x=10
para Dioscorea. Los resultados citológicos obtenidos en
este trabajo revelan que Dioscorea ayardei es un tetraploide con n=20. Su comportamiento meiótico concuerda directamente con la alta viabilidad potencial de los granos de
polen. La ornamentación de la exina y el número cromosómico de D. ayardei la relacionan con especies del clado
Nuevo Mundo II.
Contribución de autores
PNA y EB concibieron y diseñaron el estudio; ambas colectaron el material analizado y PNA escribió el manuscrito.
VP y ARA realizaron los análisis citogenéticos y de fertilidad
polínica, y NR caracterizó los granos de polen. Todos los autores contribuyeron en la redacción, discusión, revisión y
aprobación del manuscrito final.
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Asesor et al.: Estudios cromosómicos y palinológicos en Dioscorea ayardei
Financiamiento
El estudio fue apoyado por la Fundación Miguel Lillo, la cual
financió los viajes de campo y el equipamiento necesario
utilizados para concretar esta investigación, que se enmarca en los proyectos B-0013-1, B-0015-1 y B-0022-1 (Miguel
Lillo 251, T4000JFE, Tucumán).
Agradecimientos
A los revisores anónimos por su importante contribución
para mejorar el manuscrito.
Literatura citada
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