MEDICINAL PLANT COMMUNICATIONS © / ISSN 0717 7917 / www.mpc.ms-editions.cl https://doi.org/10.37360/mpc.21.4.3.12 Short Communication Actividad antiangiogénica de los extractos diclorometánicos de hojas y ramas de Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) [Antiangiogenic activity of leaves and branches dichloromethane extracts of Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae)] Amanda B. Carvalho, Daiane M. Ramos, Nádia C. Falcão-Bücker, Cecilia V. Nunez* Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia, Coordenação de Tecnologia e Inovação, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, AM, Brasil *Correspondence to: cecilia@inpa.gov.br Abstract: Various mechanisms are involved in the formation and growth of tumors, among which is the formation of new blood vessels, angiogenesis. The present work investigated the antiangiogenesis activity of dichloromethane extracts from the leaves and branches of Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae). Which is an arboreal and fruit species from the Amazon Rainforest and for which triterpenes and indole alkaloids have already been isolated. The antiangiogenic capacity of the extracts was evaluated using the Chorioallantoic Membrane Assay method in chicken eggs. The results show that the extracts inhibited the formation of new vessels in a range of 80 to 50% in the doses of 1000, 500 and 100 µg/mL. These results indicate the great antiangiogenic potential of this species. Keywords: Bioprospection; Natural products; Phytochemistry; Triterpenes; Antiangiogenesis. Resumen: Diversos mecanismos están involucrados en la formación y crecimiento de tumores, entre los cuales está la formación de nuevos vasos sanguíneos, la angiogénesis. El presente trabajo investigó la actividad antiangiogénesis de los extractos diclorometánicos de las hojas y ramas de Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae). La cual es una especie arbórea y frutal de la Selva Amazónica y para la cual ya fueron aislados triterpenos y alcaloides indólicos. La capacidad antiangiogénica de los extractos fue avaliada mediante el método del Ensayo sobre la Membrana Corioalantoica en huevos de gallina. Los resultados muestran que los extractos inhibieron la formación de nuevos vasos en un rango de 80 a 50% en las dosis de 1000, 500 y 100 µg/mL. Estos resultados indican el gran potencial antiangiogénico de esta especie. Palabras clave: Bioprospección; Productos naturales; Fitoquímica; Triterpenos; Antiangiogénesis. Received: December 31, 2021 Accepted: January 26, 2022 This article must be cited as: Carvalho AB, Ramos DM, Falcão-Bücker NC, Nunez CV. 2021. Actividad antiangiogénica de los extractos diclorometánicos de hojas y ramas de Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae). Med Plant Commun 4 (3-4): 82 – 86.. 82 Carvalho et al. Actividad antiangiogénica de los extractos Duroia macrophylla INTRODUCCIÓN Amazonia es el mayor bosque tropical del mundo y concentra alrededor del 20% de la biodiversidad mundial. Se estima que existen en él más de 14.000 especies de plantas con semillas (fanerógamas) (Cardoso et al., 2017), lo que sugiere que también existe una gran diversidad de metabolitos secundarios: sustancias producidas por las plantas como recurso adaptativo para ambiente en el que viven, desarrollando funciones importantes para la regulación, equilibrio y defensa del organismo y que pueden tener importantes actividades biológicas, sirviendo como materia prima para productos farmacéuticos (Taiz y Zeiger, 2006; Barreiro y Bolzani, 2009). La familia Rubiaceae es la segunda familia más abundante de la selva amazónica (Cardoso et al., 2017) y es productora de una gran diversidad de metabolitos secundarios como iridoides, triterpenos y alcaloides indólicos (Martins y Nunez, 2015). Estudios realizados por nuestro grupo de investigación con la especie Duroia macrophylla Huber, un árbol frutal conocido popularmente como “apuruí” o “puruí-grande-da-mata”, demostraron que es productora de metabolitos secundarios activos sobre diferentes actividades biológicas, tales como antibacteriana, anti micobacteriana y antifúngica (Carrion et al., 2013, Martins et al., 2013; Martins et al., 2014; Reis et al., 2016). Además, de ella fueron aislados alcaloides indólicos derivados de la ajmalicina de sus hojas y ramas (Martins, 2014). Los metabolitos secundarios, como los terpenos, también pueden tener actividades anticancerígenas, ya sea en la toxicidad de las líneas celulares tumorales o en la inhibición del crecimiento tumoral (Lima Filho et al., 2020). La angiogénesis es la generación de nuevos vasos sanguíneos, necesarios para este crecimiento y expansión de tumores cancerosos, cuando estos nuevos vasos se inhiben, la acción se denomina antiangiogénica (Su et al., 2005). Para evaluar esta acción se puede utilizar un método alternativo al uso de animales denominado HET-CAM (Test de la Membrana Corioalantoica de Huevos de Gallina), observando la inhibición de los vasos embrionarios cuando son interceptados por la muestra insertada en la membrana corioalantoica (Nguyen et al., 1994). Observando la creciente búsqueda de alternativas para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer combinada con la variedad de metabolitos activos aislados de plantas amazónicas, este estudio propone evaluar la actividad antiangiogénica de extractos diclorometánicos de hojas y ramas de Duroia macrophylla. MATERIALES Y MÉTODOS El material vegetal fue recolectado en Reserva Adolfo Ducke en 5 de diciembre de 2008, luego de la recolección, se secó y molió en molino de cuchillos, y se sometió a extracción utilizando el solvente diclorometano en baño de ultrasonidos por 20 min. Después de este tiempo, el material vegetal fue filtrado y una nueva extracción con diclorometano fue realizada, con el mismo procedimiento, totalizando 3 extracciones. El extracto diclorometánico fue concentrado en evaporador rotativo. Para el análisis fitoquímico preliminar, los extractos se analizaron en Cromatografía de Capa Fina para detectar las clases de sustancias químicas presentes en cada extracto según reveladores físicos (luz UV 254 y 365 nm) y químicos: reagente de Dragendorff (para alcaloides), sulfato cérico (oxidante general y para terpenos), anisaldeido (también oxidante general y para terpenos). Para el ensayo de antiangiogénesis se utilizó el modelo de membrana corioalantoica, método propuesto por Nguyen y colaboradores (1994). En el cual son usados embriones de huevo de gallina (Gallus domesticus), por triplicado. Los huevos son primeramente incubados durante 48 horas a 37,5ºC y entonces una pequeña cantidad de clara de huevo es retirada y los huevos son incubados nuevamente por 72 h, luego se insertaron discos de metilcelulosa, conteniendo los extractos diclorometánicos de hojas y ramas de D. macrophylla en las concentraciones de 100, 500 y 1000 µg/mL (disueltos en etanol), junto con el grupo de control negativo donde los discos de metilcelulosa se insertaron solo con etanol y sin muestra. Los huevos entonces fueron incubados por 48 h y después cada huevo fue fotografiado con una camera de aumento de 20x, para contar los vasos sanguíneos interceptados y obtener el porcentaje de vasos inhibidos por el extracto. Los resultados se expresaron como Media ± Desviación Estándar, n = 3, mostrando una diferencia estadísticamente significativa (p<0,001) con relación al grupo de control negativo (CN). RESULTADOS En la evaluación fitoquímica preliminar se observó la presencia de sustancias terpénicas en los dos extractos, al revelar las placas cromatográficas con sulfato cérico y anisaldeído sulfúrico. El extracto diclorometánico de las ramas cuando se Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/ 83 Carvalho et al. Actividad antiangiogénica de los extractos Duroia macrophylla reveló con DPPH adquirió un color amarillo, lo que sugiere la presencia de sustancias antioxidantes. El extracto diclorometánico de hojas de D. macrophylla fue sometido a fraccionamiento por la Dra. Daiane Martins Ramos y las fracciones obtenidas fueron purificadas por HPLC e identificadas por RMN de 1H (400 MHz) y 13C (100 MHz) mono y bidimensionales, identificando los triterpenos: ácido oleanólico y ácido ursólico (Martins et al., 2013). La evaluación de los extractos sobre el modelo de membrana coirioalantoica de huevos de gallina mostró una actividad inhibidora del 80%, 70% y 50% en las dosis de 1000, 500 y 100 µg/mL, respectivamente, para el extracto diclorometánico de las hojas (Figura Nº 1), y mostró una actividad inhibidora de 70%, 60% y 50% en las dosis de 1000, 500 y 100 µg/mL, respectivamente, para el extracto diclorometánico de las ramas (Figura Nº 2). Figura Nº 1 Actividad antiangiogénica del extracto diclorometánico de las hojas Figura Nº 2 Actividad antiangiogénica del extracto diclorometánico de las ramas Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/ 84 Carvalho et al. Actividad antiangiogénica de los extractos Duroia macrophylla Las actividades antiangiogénicas de ambos extractos mostraron un carácter dependiente de la dosis: aumentando la inhibición con un aumento de la dosis de la muestra administrada. Ambos extractos también mostraron actividad antiangiogénica similar en la dosis de 100 µg/mL, sin embargo, el desempeño del extracto diclorometánico de las hojas fue superior en la dosis de 1000 µg/mL, demostrando que la concentración de sustancias capaces de inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos es más grande en este extracto. DISCUSIÓN Ambos extractos mostraron considerable actividad antiangiogénica, pero el extracto de diclorometano de hojas mostró mayor efectividad en la dosis más alta, del que fueron aislados los triterpenos: ácido ursólico y ácido oleanólico. Estas sustancias ya fueron relatadas en la literatura con actividad antitumoral (Dalla Vechia et al., 2009). El ácido ursólico, que se encuentra en el extracto diclorometánico de las hojas de D. macrophylla, es un triterpeno pentacíclico, con fórmula molecular C30H48O3, los estudios indican su capacidad antiproliferativa in vitro para las células de cáncer de mama (Zhang et al., 2020), y su antioxidante y antiinflamatorio. Ya se conoce la actividad en células normales y células cancerosas (Tu et al., 2009; Ye et al., 2010). Sus derivados sintéticos también muestran actividades citotóxicas considerables como lo observaron Nedopekina et al. (2017), en células de adenocarcinoma y neuroblastoma y por Shao et al. (2011), en los derivados probados en cuatro líneas celulares cancerosas, así como la actividad antioxidante observada por Nascimento (2014). El ácido oleanólico también es un isómero triterpénico pentacíclico del ácido ursólico, a menudo se encuentra en la cera epicuticular (una capa que cubre la superficie exterior de la cutícula de la planta), donde previene la pérdida de agua y protege contra patógenos (Heinzen et al., 1996). Una de las actividades biológicas más conocidas del ácido oleanólico es su actividad hepatoprotectora, utilizada como tratamiento para trastornos hepáticos como la hepatitis viral (Liu, 1995). Khwaza et al. (2018), señalan como principales actividades del ácido oleanólico las acciones antivirales, antiinflamatorias, analgésicas, antibacterianas, antioxidantes y anticancerígenas (Khwaza et al., 2018), siendo esta última también reportada por sus derivados, como se observa en estudios realizados por Laszczyk (2009), informa que el ácido oleanólico marca las células tumorales induciéndolas a la apoptosis y modulando el desarrollo tumoral, justificando así la actividad antiangiogénica del extracto de D. macrophylla. CONCLUSIÓN En la Amazonía, existe una gran biodiversidad de plantas aún inexploradas que puede tener una potencial actividad bioactiva contra el cáncer, que victimiza a miles de personas en todo el mundo. De esta manera, el bosque se convierte en fuente de materia prima para insumos terapéuticos, lo que también incentiva la apreciación de la flora biodiversa y la innovación científica en la región. Así, la importancia de la bioprospección de las plantas amazónicas, junto con la evaluación de sus actividades biológicas, abre posibilidades para nuevas materias primas para medicamentos, que también pueden actuar para inhibir la formación de vasos que, en consecuencia, dificultan la nutrición de los tumores. Por ello, el presente estudio pone en práctica esta búsqueda de nuevas formas de tratar el cáncer, demostrando que Duroia macrophylla también es capaz de producir sustancias que pueden ser una alternativa para inhibir el desarrollo de tumores. REFERENCIAS Barreiro EJ, Bolzani VS. 2009. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. 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