Für Markus und Henriette Rosa agrestis SAVI var. sepium THUILL (Zeichnung: Pierre-Joseph Redouté (1817-1824): Les Roses. Paris) „Die Rosenarten sind schwierig zu unterscheiden, noch schwieriger zu bestimmen; mir scheint die Natur viele zu mischen oder im Spiel aus einer viele zu bilden; deshalb wird derjenige, der wenige Arten gesehen hat, dieselben leichter unterscheiden, als derjenige, der viele gesehen hat.“ (C. Linnaeus: Species Plantarum. Tom.1. Impensis Laurentii Salvii, Holmiae 1753, S. 492) Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der FriedrichSchiller- Universität Jena von Diplom-Biologin Christiane Ritz geboren am 23. März 1978 in Karl-Marx-Stadt, jetzt Chemnitz Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Inhaltsverzeichnis 1. 1.1 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 7.1. 7.1.1. 7.1.2. 7.1.3. 7.1.4. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. 7.6. 8. 9. Einleitung ...................................................................................................................... 5 Die Untersuchungsgruppe .............................................................................................. 5 Die Canina-Meiose ......................................................................................................... 6 Die Reproduktion ........................................................................................................... 8 Die Evolution der Gruppe............................................................................................... 8 Morphologie und Klassifikation................................................................................... 10 Hybridisierung und Merkmalsvererbung...................................................................... 10 Rostpilze auf Rosen ...................................................................................................... 11 Zielsetzung ................................................................................................................... 11 Übersicht zu den Manuskripten................................................................................ 13 Manuskript I:.............................................................................................................. 15 Ritz, C. M., Schmuths, H., Wissemann, V. (2005): Evolution by reticulation: European dogroses originated by multiple hybridization across the genus Rosa. Journal of Heredity 96 (1): 4-14. Manuskript II: ............................................................................................................ 27 Wissemann, V. & Ritz, C. M. (2005): The genus Rosa (Rosoideae, Rosaceae) revisited: molecular analysis of nrITS-1 and atpB-rbcL intergenic spacer (IGS) versus conventional taxonomy. Botanical Journal of the Linnean Society. 147: 275290. Manuskript III:........................................................................................................... 44 Ritz, C. M. & Wissemann, V. (2003): Male correlated non-matroclinal character inheritance in reciprocal hybrids of Rosa section Caninae (DC) SER. (Rosaceae). Plant Systematics and Evolution. 241 (3-4): 213-221. Manuskript IV: ........................................................................................................... 54 Ritz, C. M., Maier, W. F. A., Oberwinkler, F. & Wissemann, V. (im Druck, akzeptiert am 03. März 2005): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycological Research. Gesamtdiskussion ....................................................................................................... 72 Diskussion der verwendeten Methoden........................................................................ 72 Nachweis des hybridogenen Ursprungs der Caninae mit nrITS-1............................... 72 nrITS-1 und atpB-rbcL-IGS- Phylogenien................................................................... 73 Morphologische Analyse der intrasektionellen Hybriden der Caninae ....................... 73 Phylogenetische und ökologische Untersuchungen der Rosenroste............................. 74 Der hybridogene Ursprung der Caninae ...................................................................... 74 Schwestergruppen der Ur-Caninae und intrasektionelle Gliederung........................... 77 Intrasektionelle Hybridisierung der Caninae und Merkmalsvererbung ....................... 80 Rostpilze auf Hundsrosen............................................................................................. 82 Hybridisierung als Evolutionsfaktor in der Sektion Caninae....................................... 83 Zusammenfassung / Summary .................................................................................. 84 Referenzen................................................................................................................... 86 Anhang: Abbildungen 1 und 3 (vergrößert) aus Manuskript I 4 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 1. Einleitung Rosen haben eine Jahrtausende alte Kulturgeschichte und gehören zu den ältesten Zierpflanzen der Welt. Ihre extreme phänotypische Plastizität hat Systematikern seit Generationen enorme Schwierigkeiten bereitet. Diesen „schlechten Ruf“ haben Rosen vor allem der Sektion Caninae (Hundsrosen) zu verdanken. Die Diversität der Hundsrosen hat besonders im 19. Jahrhundert eine Flut von Artbeschreibungen ausgelöst. Natürliche Einheiten innerhalb der Caninae sind aufgrund genereller Merkmalsarmut der Taxa einerseits und der Fähigkeit zur inter- als auch intrasektionellen Hybridisierung andererseits schwer zu erkennen (Gustafsson 1944; Feuerhahn & Spethmann 1995; Wissemann & Hellwig 1997). Entscheidend für die Rosenforschung war die Entdeckung der in der Natur einmaligen Canina-Meiose (Täckholm 1920; Blackburn & Harrison 1921; Täckholm 1922). Die Caninae befinden sich in einem Stadium permanenter Anorthoploidie (Grant 1971), bei der ein meist pentaploider somatischer Zustand durch die Befruchtung einer tetraploiden Eizelle mit einer haploiden Spermazelle aufrechterhalten wird. Diese Heterogamie resultiert in einer betont matroklinen Merkmalsvererbung, da 4/5 des Genoms mütterlich und nur 1/5 väterlich sind. Die Anorthoploidie der Caninae ließ viele Wissenschaftler vermuten, dass Hundsrosen allopolyploid durch Hybridisierung entstanden sind (Gustafsson & Håkansson 1942; Fagerlind 1948; Stebbins 1951; Zielinski 1985). Den ersten molekulargenetischen Hinweis auf allopolyploide Entstehung der Caninae konnte Wissemann (1999, 2000a, 2002) mit Analysen von nrITS-Sequenzdaten (nuclear ribosomal internal transcribed spacers) liefern. Die Genese biologischer Diversität in den Caninae hat nicht nur Auswirkung auf die Radiation und Speziation in der Gruppe selbst, sondern kann auch die Evolution mit ihr obligat verbundener Parasiten beeinflussen. Rostpilze der Familie Phragmidiaceae sind stark durch koevolutive Prozesse an die Rosaceae gebunden (Savile 1979). Am Beispiel der Rosenroste der Gattung Phragmidium kann untersucht werden, ob die Radiation der Caninae eine Speziation ihrer Parasiten nach sich zieht. 1.1. Die Untersuchungsgruppe Die Gattung Rosa L. umfasst weltweit etwa 200 Arten und ist in den temperaten Zonen der Nordhemisphäre verbreitet (holarktisches Florenelement). Sie ist in vier Untergattungen gegliedert: Hulthemia (DUMORT.) FOCKE, Platyrhodon (HURST) REHDER, Hesperhodos COCKERELL und Rosa (Rehder 1949; Wissemann 2003a). Die ersten drei Untergattungen sind entweder monotypisch oder beinhalten lediglich zwei Arten, während über 95 % aller Rosen in der Untergattung Rosa vereinigt sind. Innerhalb dieser Untergattung werden zehn Sektionen unterschieden: Banksianae LINDL. (2 Arten), Bracteatae THORY (1-2 Arten), Caninae (DC.) SER. (ca. 50 Arten), Carolinae CRÉP. (5 Arten), Cinnamomeae (DC.) SER. (ca. 80 Arten), Indicae THORY (3 Arten), Laevigatae THORY (1 Art), Pimpinellifoliae (DC.) SER. (ca. 15 Arten), Rosa (1 Art) und Synstylae DC. (ca. 25 Arten) (Rehder 1949; Wissemann 2003a). Als Typusart ist momentan Rosa centifolia L. gültig, aber umstritten (Wissemann 2003a). 5 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Die Erstbeschreibung der Caninae wurde von De Candolle in (Seringe 1818) als ranglose Rosa K. Caninae veröffentlicht und von Seringe im Prodromus von (De Candolle 1825) als Sektion eingestuft. Die aktuelle Gliederung der Hundsrosen in sechs Subsektionen (Henker 2000; Wissemann 2003a) beruht auf Christ (1873) und Crépin (1892). Die Sektion Caninae ist aufgrund ihrer hybridogenen Entstehung nicht durch spezifische morphologische Merkmale, aber durch ihre einzigartige Meiose gut abzugrenzen (Zielinski 1985). 1.2. Die Canina-Meiose Die Canina-Meiose wurde erstmals von Täckholm (1920, 1922) und Blackburn & Harrison (1921) bei Hundsrosen beobachtet. Nahezu simultan gelang es ihnen zu zeigen, dass die Basiszahl in Rosa x = 7 und nicht wie zuvor von Strasburger (1904) angenommen, x = 8 beträgt. Daraus ergibt sich die für die meisten Caninae zutreffende pentaploide somatische Zahl von 2n = 5x = 35. Die tetra- bis hexaploiden Arten der Sektion Caninae (2n = 4x, 5x, 6x = 28, 35, 42) verbindet ein anomales Syndeseverhalten, bei dem sowohl gepaarte Chromosomen (Bivalente) als auch ungepaarte Chromosomen (Univalente) vorliegen (Täckholm 1920, 1922). Eine pentaploide Art bildet in der Meiose 7 Bivalente und 21 Univalente (7 II +21 I). Die Anzahl der Bivalente ist auch in tetra- bzw. hexaploiden Arten gleich, es ändert sich lediglich die Zahl der Univalente (14 bzw. 28 Univalente). Die Meiose läuft in der Mikro- und Megasporogenese verschieden ab, da die Univalente in unterschiedlicher Weise auf die Tochterzellen aufgeteilt werden. In einer pentaploiden Pollenmutterzelle liegen die 14 Bivalente in der Äquatorialebene und werden von den 21 Univalenten umgeben. Die Bivalente trennen sich und wandern zu den Polen. Die Univalente werden in Chromatiden gespalten, diese beginnen erst dann zu den Polen zu wandern, wenn die Chromosomen der Bivalente die Pole fast erreicht haben. Da die neue Kernmembran schon gebildet wird, gelangen nicht alle Chromatiden der Univalente in die Telophasenkerne. Die Univalente liegen frei im Plasma oder sind in Zwergkernen eingeschlossen. Die zweite meiotische Teilung führt zu einem weiteren Ausschluss von Univalenten aus den Mikrosporenkernen. Die Bivalente werden in Chromatiden gespalten und zu den Polen gezogen. Die Chromatiden der Univalente bleiben in der Äquatorialebene. Es entstehen Mikrosporen, die die sieben paarungsfähigen Chromosomen enthalten und Mikrosporen, die Zwergkerne mit einer unbestimmten Anzahl von Univalenten enthalten. Nur die Pollenkörner, die genau sieben Chromosomen besitzen, sind lebensfähig, alle anderen Pollenkörner mit abweichenden Chromosomenzahlen degenerieren. In der Embryosackmutterzelle einer pentaploiden Art ordnen sich in der Metaphase I die Univalente oberhalb der Bivalente im mikropylaren Teil der Äquatorialebene an. Während der Anaphase trennen sich die Bivalente normal und wandern in Polrichtung, die Univalente hingegen bewegen sich ausschließlich zum mikropylaren Pol. Im weiteren Verlauf entwickelt sich nur der mikropylare Tochterkern weiter, so dass Eizellen mit 28 Chromosomen entstehen. 6 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 1. Canina-Meiose bei der Mikrosporogenese a) Metaphase I b) Anaphase I d) Metaphase II e) Anaphase II c) Telophase I 2. Canina-Meiose bei der Megasporogenese a) Metaphase I b) Anaphase I c) Telophase I Abb.1: Schema zur Canina-Meiose während der Mikro- und Megasporogenese einer tetraploiden Hundsrose (2n = 4x = 28) nach Täckholm (1922). Die 14 Bivalente sind schwarz, die 14 Univalente weiß dargestellt. Es entstehen haploide Mikrosporen und triploide Megasporen. 1. Canina-Meiose bei der Mikrosporogenese: a) Metaphase I: Bivalente und Univalente liegen in der Äquatorialebene, die Bivalente paaren, b) Anaphase I: Die Bivalente werden zu den Polen gezogen, die Univalente bleiben noch in der Äquatorialebene und beginnen sich in Chromatiden zu teilen, c) Telophase I: Die Bivalente erreichen die Pole, die Chromatiden der Univalente werden zu den Polen gezogen, d) Metaphase II: Die Bivalente befinden sich in der Äquatorialebene, die Univalente, die in der Telophase I die Pole erreicht haben liegen ebenfalls in der Äquatorialebene, e) Anaphase II: die Chromatiden der Bivalente trennen sich, die Chromatiden der Univalente bleiben in der Äquatorialebene, f) Telophase II und Zellteilung: Nur die Kerne, die die Chromatiden der Bivalente enthalten, entwickeln sich zu fertilen Mikrosporen. 2. Canina-Meiose bei der Megasporogenese: a) Metaphase I: Die Bivalente liegen in der Äquatorialebene und paaren, die Univalente befinden sich ausschließlich im mikropylaren Teil der Äquatorialebene, b) Anaphase I: Die Bivalente werden zu den Polen gezogen, die Univalente wandern ausschließlich zum mikropylaren Pol, c) Telophase II: Die eine Hälfte der Bivalente erreicht den chalazalen Pol, die andere Hälfte der Bivalente und alle Univalente erreichen den mikropylaren Pol. Es entwickelt sich nur der mikropylare Telophasenkern weiter. Die zweite meiotische Teilung verläuft normal und ist nicht dargestellt. 7 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 1.3. Die Reproduktion Täckholm (1920, 1922) nahm an, dass dieses heterogame System durch Apomixis aufrechterhalten wird. Blackburn & Harrison (1921) halten sporadische sexuelle Reproduktion für möglich. Fagerlind (1940) betrachtet die Caninae als voll sexuell und bestreitet jeden Hinweis auf Apomixis. Dingler (1908), Matsson (1912) und Schwertschlager (1915) nahmen an, dass Hundsrosen sich ursprünglich v. a. xenogam reproduzierten. Die Reproduktion der Caninae folgt ihrer Meinung nach einem Trend von der Xenogamie zur Autogamie hin zur Apomixis. Neuere Arbeiten von Wissemann & Hellwig (1997), Reichert (1998a) und Werlemark (2000) beweisen das Vorkommen von Apomixis in Hundsrosen. Wissemann & Hellwig (1997) konnten mit Kreuzungsexperimenten zeigen, dass die Caninae sich vorzugsweise xenogam reproduzieren. In ihrem Experiment wurde eine höhere Anzahl fertiler Samen bei xenogamen Kreuzungen als bei autogamen Kreuzungen gebildet. Die Anzahl der fertilen Samen, die durch Apomixis hervorgegangen sind, ist um ein Vielfaches geringer als die Anzahl der xenogam gebildeten Samen. Im Gegensatz dazu haben Fagerlind (1940) und Werlemark (2000) keinen Unterschied in der Anzahl der Samen nach sexueller Reproduktion und nach Apomixis feststellen können. In dieser Untersuchung wurde Apomixis allerdings nicht experimentell festgestellt, sondern nur aufgrund rein maternaler RAPD-Markervererbung vermutet. 1.4. Die Evolution der Gruppe Die charakteristischen Asyndeseverhältnisse bei Hundsrosen führten zu verschiedenen Theorien über den vermutlichen Ursprung der Gruppe. Blackburn & Harrison (1921), Täckholm (1922) und Blackburn (1925) nahmen an, dass Hundsrosen Primärbastarde zwischen diploiden Rosen und polyploiden Ur-Caninae sind. Täckholm (1922) hielt eine polytope Entstehung für wahrscheinlich, da seiner Meinung nach die tetra- bis hexaploiden Caninae aus jeweils verschiedenen Hybridisierungsereignissen mit tetra, hexa- oder dekaploiden Ur-Caninae hervorgegangen sind. Hurst (1925) betrachtete einen hybridogenen Ursprung der Caninae als unwahrscheinlich. Er postulierte eine ausgestorbene dekaploide Stammart, deren Nachfahren in der Evolution ganze Chromosomensätze bis hin zur diploiden Stufe verloren haben. An rezenten diploiden Arten können die fünf Chromosomensätze (Septette), die in der hypothetischen dekaploiden Stammart zu finden waren, morphologisch genau charakterisiert werden (z.B. Septett A ist gekennzeichnet durch eine bogenförmige Wuchsform, zurückgeschlagene und früh abfallende Kelchblätter, Septett B zeichnet sich durch eine starr aufrechte Wuchsform und persistierende Kelchblätter aus, usw.). Die Betrachtungsweise, dass ausschließlich ganze Chromosomensätze ohne Rekombination vererbt werden, führt zu einem nahezu mathematischen Artkonzept. Jede heute existierende Rosenart ist durch eine Genomformel gekennzeichnet (z.B. Rosa canina AABDE) und verdankt ihre morphologischen Merkmale allein der Kombination der jeweiligen Chromosomensätze. Diese Septett-Theorie wurde aufgrund cytologischer Befunde und evolutionsbiologischer Gesichtspunkte vielfach 8 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) angegriffen (Erlanson 1929, 1938; Gustafsson & Håkansson 1942; Fagerlind 1944; Gustafsson 1944; Blackhurst 1948), außerdem wurde nie eine dekaploide Rosenart gefunden (Fagerlind 1944). Gustafsson & Håkansson (1942) und Gustafsson (1944) modifizierten das Genomformelsystem von Hurst. Sie schlossen aus dem Syndeseverhalten und der Vererbung morphologischer Merkmale von Kreuzungen aus Hundsrosen mit Rosa rugosa THUNB. auf einen internen autotriploiden Zustand der Caninae. Ihrer Meinung nach sind die Caninae autoalloploid: in der Eizelle liegen zwei nicht paarungsfähige Genome und ein diploider Satz von paarungsfähigen Chromosomen vor, von denen sich einer mit dem Chromosomensatz aus dem Pollenkorn vereinigt. Demgegenüber ergaben die cytologischen Beobachtungen von Fagerlind (1948), dass sich alle Genome der Gattung Rosa mehr oder weniger homolog zueinander verhalten und das Syndeseverhalten keinen Rückschluss auf die interspezifisch polyploide Natur der Caninae zulässt. Fagerlind (1944, 1948) und Blackhurst (1948) nahmen an, dass die Canina-Meiose von einem spezifischen Genkomplex gesteuert wird und nicht aus den Homologieverhältnissen der beteiligten Genome resultiert. Zielinski (1985) vermutete, dass nur zwei Genome aus den „Prä-Caninae“ für die CaninaMeiose verantwortlich sind. Diese diploiden, der Rosa canina L. sehr ähnlichen Stammformen entwickelten die Canina-Meiose und hybridisierten dann mit verschiedenen Vertretern anderer Rosengruppen im Spättertiär. Im Pleisto- und Holozän begannen die Hybriden sich rasant auszubreiten. Diese Hypothese wird durch Untersuchungen von Wissemann (1999, 2000a, 2002) gestützt, der den allopolyploiden Ursprung der Caninae erstmals molekulargenetisch nachgewiesen hat. Wissemann fand in pentaploiden Arten maximal vier verschiedene nrITS-Typen (A-, B-, C-, E-Typ). Diese Typen repräsentieren seiner Meinung nach die verschiedenen Genome der Hundsrosen, da Ma et al. (1997) nur jeweils eine NOR-Region (nucleolus organizer region) pro Chromosomensatz identifiziert hat. Der nrITS-C-Typ ist für die Caninae spezifisch, und sein Auftreten ist mit der CaninaMeiose korreliert (Wissemann 1999, 2000a, 2002). Eine Studie mit Mikrosatellitenmarkern von Nybom et al. (2004) weist ebenfalls darauf hin, dass pentaploide Caninae vier unterschiedliche, aber homologe Genome beinhalten, von denen eines diploid vorliegt und vorwiegend an der Bivalentenbildung beteiligt ist. Wulff (1954) beobachtete dagegen das spontane Auftreten einer canina-ähnlichen Meiose bei einer Nicht-Hundsrose Rosa x ruga LINDL. (Rosa arvensis HUDS. x R. chinensis JACQ.). Er folgerte, dass das Zusammenspiel einer endomitotischen Autopolyploidisierung und einer Mutation der die Meiose regulierenden Gene partielle Asyndese auslösen kann und die Caninae daher mehrfach autopolyploid entstanden sind. Molekulargenetische Untersuchungen innerhalb der Gattung Rosa lieferten bisher keine eindeutigen Ergebnisse über die Verwandtschaftsbeziehungen der Caninae (Millan et al. 1996; Matsumoto et al. 1997; Matsumoto et al. 1998; Matsumoto et al. 2000). Es wurden nur wenige Arten untersucht und mit den verwendeten Markern (cpDNA- und nrITSSequenzen, RAPD) nur schlecht aufgelöste Stammbäume erstellt. 9 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 1.5. Morphologie und Klassifikation In „Species Plantarum“ beschrieb Linnaeus (1753) zwölf Arten der Gattung Rosa. Bis zum Ende des 19. Jahrhunderts in der so genannten „analytischen Phase der Rosensystematik“ vermehrte sich die Anzahl der Rosenarten inflationär. Besonders innerhalb der Caninae wurden anhand unterschiedlicher Merkmalen (Hagebuttenform, Bestachelung, Bedrüsung der Blätter und Blütenstiele, Blättchenserratur) hunderte Arten in Europa beschrieben (Crépin 1869; Déséglise 1877). Das erste große monographische Werk „Die Rosen der Schweiz“ von Christ (1873) markiert einen Wendepunkt in der Rosensystematik. Christ kehrt sich von der analytischen Betrachtungsweise damaliger Rhodologen ab und reduziert durch sein synthetisches Modell die Caninae auf ca. 30 Arten. Er klassifiziert die Rosen anhand der Gesamtheit ihrer Merkmale, das heißt jede Rosenart ist durch eine Kombination verschiedener miteinander korrelierter Merkmale charakterisiert. Daraus ergeben sich innerhalb der Caninae mehreren Verwandtschaftsreihen, die ein annähernd natürliches System beschreiben. In späteren Arbeiten wie der Rosenmonographie von Keller (1931), und der „Flora Europaea“ von Kláštersk? (1968) wird die Einteilung nach Christ beibehalten. Sie ist auch heute noch aktuell (Henker 2000; Wissemann 2003a). Großen Wert legte Christ (1873, 1844) auf die Korrelation morphologischer Merkmale mit der Ökologie der Arten. Als erstes erkannte Baker (1869) zwei morphologische Typen, bei denen Griffelbehaarung und das Verhalten der Kelchblätter nach dem Abblühen korreliert sind. Christ (1873, 1844) fügte zu diesen beiden Typen noch weitere morphologische Merkmale (Kronblattfarbe, Fruchtstiellänge, Durchmesser des Griffelkanales, Blattgröße und Zeitpunkt der Fruchtreife) hinzu und stellte einen Zusammenhang dieser Merkmale mit dem Vorkommen der Typen fest („Arten der Ebene und Arten der Berge“). Dingler (1907) schloss sich den Überlegungen Christs an und erwähnte als zusätzliches Merkmal der vikariierenden Typen die bogige bzw. gedrungene Wuchsform. Da die ökologische Trennung dieser beiden morphologischen Typen nicht absolut ist, hat Reichert (1998b) die Bezeichnung L-Typ und D-Typ und die Übergangsform L/D-Typ eingeführt. Pflanzen des L-Typs (laxus, loose, locker) sind durch eine bogige Wuchsform, abfallende Kelchblätter, einen engen Griffelkanaldurchmesser (<1mm) und späte Hagebuttenreife gekennzeichnet. Rosen des D-Typs (densus, dense, dicht) sind durch eine gedrungene Wuchsform, persistierende Kelchblätter und einen weiten Griffelkanaldurchmesser (>1mm) charakterisiert. Der L/D-Typ beinhaltet alle Phänotypen zwischen den beiden Typen und umfasst eine sehr heterogene Gruppe von Rosen, die sich nicht in die beiden eng umschriebenen Extreme einordnen lassen. 1.6. Hybridisierung und Merkmalsvererbung Hybridisierung ist ein bedeutendes Phänomen in der Gattung Rosa (Keller 1931; Graham & Primavesi 1993; Wissemann & Hellwig 1997). Kreuzungen sind nach bisherigen Erkenntnissen zwischen allen Rosenarten sogar zwischen Vertretern verschiedener Sektionen und Untergattungen möglich. Hybriden innerhalb der Caninae sind in der Natur oft sehr schwierig bis überhaupt nicht zu erkennen, da die Pollenfertilität selbst zwischen 10 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) den Elternarten stark streut (Wissemann & Hellwig 1998) und die Kreuzungen nicht zwangsläufig steril sind (Gustafsson & Håkansson 1942; Fagerlind 1944; Gustafsson 1944; Fagerlind 1948, 1951; Stebbins 1951; Zielinski 1985; Eigner 1993; Wissemann & Hellwig 1997; Eigner & Wissemann 1999). Hybriden der Caninae sind zum einen durch den Mangel an spezifischen Merkmalen innerhalb der Sektion und zum anderen durch die matrokline Merkmalsvererbung infolge der Canina-Meiose morphologisch schwer zu charakterisieren. Beispielsweise gibt es keine Möglichkeit, die Hybride Rosa canina L. x R. corymbifera BORKH. anhand von morphologischen Merkmalen von Ihren Elternarten zu unterscheiden, da beide sich nur durch das einzige Merkmal „Behaarung der Blattunterseiten“ unterscheiden. Untersuchungen an experimentell erzeugten Hybriden der Caninae wurden von einer Reihe von Wissenschaftlern durchgeführt (Gustafsson & Håkansson 1942; Gustafsson 1944; Fagerlind 1948; Stebbins 1951; Zielinski 1985; Feuerhahn & Spethmann 1995; Nybom et al. 1997; Werlemark et al. 1999; Werlemark et al. 2000; Wissemann 2000b; Werlemark & Nybom 2001; Nybom et al. 2004). Erwartungsgemäß wurde die Mehrzahl aller morphologischen Merkmale und auch der molekularen Marker ausschließlich maternal vererbt. Interessanterweise beobachtete Gustafsson (1944), dass das taxonomisch bedeutende Merkmal „Abfallen oder Perisistieren der Kelchblätter nach dem Abblühen“ vom Pollenelter gesteuert wird. 1.7. Rostpilze auf Rosen Rostpilze der Gattung Phragmidium gehören zu den bedeutendsten Parasiten auf Rosen. Alle Vertreter der Phragmidiaceae haben einen autözischen Lebenszyklus (ohne Wirtswechsel) und sind ausschließlich auf den Rosaceae verbreitet. Die Koevolution zwischen Rosten und ihren Wirten ist so eng, dass das Vorkommen von bestimmten Rostarten Rückschlüsse auf die phylogenetischen Beziehungen der Wirte erlaubt (Savile 1979). Gäumann (1959) beschreibt vier Arten der Gattung Phragmidium auf Hundsrosen, von denen Phragmidium mucronatum (PERS.)SCHLTDL. und P. tuberculatum J.MÜLLER die häufigsten sind. Ob die offensichtlich starke Radiation der Caninae auch eine Kospeziation ihrer Parasiten induziert oder ob diese Prozesse durch Hybridisierung innerhalb der Wirte verschleiert werden, ist bisher nicht untersucht (Floate & Whitham 1993). 1.8. Zielsetzung Der Evolutionsfaktor Hybridisierung spielt in der Evolution der Caninae eine bedeutende Rolle. Die Caninae sind hybridogen entstanden und ich habe in dieser Arbeit versucht, anhand molekularer Methoden Rückschlüsse über die Herkunft und die verwandtschaftlichen Beziehungen der Hybridgenome zu ziehen. Eine morphologische Analyse von künstlichen Hybriden der Caninae hat gezeigt, dass wahrscheinlich auch innerhalb der Hundsrosen Hybridisierungsereignisse vorkamen oder auch gegenwärtig noch auftreten. Rostpilze der Gattung Phragmidium sollten Aufschluss darüber geben, ob 11 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) die Radiation der Caninae eine Kospeziation ihrer Parasiten induziert oder ob die retikulate Evolution der Wirte diese verhindert. Der allopolyploide Ursprung der Caninae wurde anhand von nrITS-Sequenzen untersucht. Die Arbeiten von Wissemann (1999, 2000a, 2002) zeigten, dass vier verschiedene ITSTypen die an der Entstehung der Caninae beteiligten Genome repräsentieren. Es stellte sich die Frage, ob diese ITS-Typen auch in anderen Sektionen der Gattung Rosa zu finden sind und Rückschlüsse darüber erlauben, welche Vorfahren rezenter Rosen an der hybridogenen Entstehung der Hundsrosen beteiligt waren. Weiterhin sollte geklärt werden, ob der ITS-C-Typ, wie von Wissemann postuliert (Wissemann 1999, 2000a, 2002), ausschließlich in Hundsrosen vorkommt und damit das Genom der Ur-Caninae repräsentiert oder ob er auch in anderen Rosensektionen zu finden ist (Manuskript I). Da der ITS-C-Typ auf die Ur-Caninae zurückweist, habe ich anhand von phylogenetischen Analysen innerhalb der Gattung Rosa die möglichen Schwestergruppen der Ur-Caninae identifiziert. Die Variation innerhalb des ITS-C-Typs und der Chloroplastenmarker atpBrbcL intergenic spacer (IGS) sollten Aufschluss über die phylogenetischen Beziehungen innerhalb der Caninae geben (Manuskript II). Mit Hilfe von morphologischen Merkmalen habe ich künstliche Hybriden aus den Kreuzungsversuchen von Wissemann & Hellwig (1997) charakterisiert, um die Auswirkung der matroklinen Vererbung auf taxonomisch bedeutsame Merkmale zu bewerten. Hierbei standen die für die L/D-Typisierung relevanten Merkmale wie Durchmesser des Griffelkanales und das Verhalten der Kelchblätter nach dem Abblühen im Vordergrund. Ich habe geprüft, ob Hybriden rein morphologisch erkennbar und von den Elternarten zu unterscheiden sind und ob sich der Reproduktionserfolg von interspezifischen Hybriden signifikant von dem ihrer Elternarten unterscheidet. Diese Untersuchungen sollten erste Anhaltspunkte darüber geben, ob Hybriden innerhalb der Caninae in der Natur gebildet werden und sich etablieren können (Manuskript III). Rostpilze der Gattung Phragmidium dienten als Modell, die Auswirkungen der Radiation der Caninae auf ihre Parasiten zu untersuchen. Wie von Savile (1979) auf großsystematischer Ebene gezeigt, sollte innerhalb der Caninae geprüft werden, ob Speziationsprozesse des Wirtes Kospeziation ihrer Parasiten nach sich zieht. Hierfür habe ich Roste von drei ausgewählten Rosenarten (Rosa canina, R. corymbifera und R. rubiginosa L.) gesammelt und bestimmt, um nachzuprüfen, ob ein bestimmter Rost auf den Befall einer bestimmten Rosenart spezialisiert ist. Die nrLSU-Sequenzdaten (nuclear ribosomal large subunit) der gesammelten Roste flossen in eine phylogenetische Analyse der Gattung Phragmdium ein, um die Verwandtschaftsverhältnisse der beobachteten Roste zu charakterisieren (Manuskript IV). 12 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 2. Übersicht zu den Manuskripten 1. Ritz, C. M., Schmuths, H., Wissemann, V. (2005): Evolution by reticulation: European dogroses originated by multiple hybridization across the genus Rosa. Journal of Heredity. 96 (1): 4-14. In dieser Publikation wird die hybridogene Entstehung der Caninae anhand von nrITS-1-Sequenzdaten untersucht. Eine Haplotypenanalyse der fünf nichtkonzertierten ITS-Typen in den Caninae zeigt, dass Hundsrosen mehrfache Allopolyploide aus den vermutlich ausgestorbenen Ur-Caninae und Rosen anderer Sektionen sind. Die gesamten Laborarbeiten und der Hauptteil der Auswertung zu dieser Publikation wurden von mir durchgeführt. Ich habe auch im Wesentlichen das Manuskript verfasst. Heike Schmuths hat mir beim Erstellen und Auswerten des Haplotypennetzwerkes geholfen. Volker Wissemann hat diese Publikation durch sein DFG-Projekt im Schwerpunktprogramm Radiationen - Genese biologischer Diversität: „Radiation, biological diversity and host-parasite interactions in wildroses, rust fungi and insects“ (Wi 2028/1) angeregt und das Manuskript korrigiert, ergänzt und verbessert. 2. Wissemann, V. & Ritz, C. M. (2005): The genus Rosa (Rosoideae, Rosaceae) revisited: molecular analysis of nrITS-1 and atpB-rbcL intergenic spacer (IGS) versus conventional taxonomy. Botanical Journal of the Linnean Society. 147: 275-290. In dieser Publikation werden die molekulargenetische Ergebnisse zur Phylogenie der Gattung Rosa (nrITS-Sequenzen und atpB-rbcL IGS) mit der konventionellen Taxonomie, die auf morphologischen Daten beruht, verglichen. Der ITS-C-Typ (canina-ITS-Typ), der die Ur-Caninae repräsentiert, hat zu wenige Polymorphismen, um eine Gliederung innerhalb der Caninae zu erkennen. Die atpB-rbcL-Phylogenie unterscheidet innerhalb der Caninae zwei Gruppen: Hundsrosen mit duftenden Blattdrüsen und drüsenlose bzw. Hundsrosen mit duftlosen Drüsen. Beide Molekularphylogenien deuten darauf hin, dass die Sektionen Indicae, Synstylae und Gallicanae Schwestergruppen zu den Ur-Caninae sind. Die Laborarbeiten und die Rekonstruktion der molekularen Phylogenien wurden von mir durchgeführt. Volker Wissemann hat den Hauptteil des Manuskriptes verfasst und die morphologischen Merkmale diskutiert. Volker Wissemann hat diese Publikation durch sein DFG-Projekt im Schwerpunktprogramm Radiationen Genese biologischer Diversität: (Wi 2028/1) angeregt. 13 Christiane Ritz 3. Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Ritz, C. M. & Wissemann, V. (2003): Male correlated non-matroclinal character inheritance in reciprocal hybrids of Rosa section Caninae (DC) SER. (Rosaceae). Plant Systematics and Evolution. 241 (3-4): 213-221. Mit Hilfe von morphologischen Merkmalen wurden künstliche Hybriden der Caninae analysiert. Wie für die heterogamen Hundsrosen zu erwarten, wurden die Merkmale Behaarung und Bedrüsung der Blätter matroklin vererbt. Erstaunlicherweise wurden die taxonomisch bedeutenden Merkmale Durchmesser des Griffelkanales und das Verhalten der Kelchblätter nach dem Abblühen paternal vererbt. Aufgrund dieses Vererbungsmusters sind bestimmte intrasektionelle Hybriden der Caninae mit bereits beschriebenen Hundsrosenarten morphologisch identisch. Diese Ergebnisse deuten auf das Vorkommen von Hybridisierung innerhalb der Caninae hin. Die morphologischen Untersuchung der Hybriden und die statistische Auswertung habe ich durchgeführt. Ich habe auch den Hauptteil des Manuskriptes verfasst. Volker Wissemann hat diese Publikation durch sein DFG-Projekt im Schwerpunktprogramm Radiationen - Genese biologischer Diversität: (Wi 2028/1) angeregt und das Manuskript korrigiert, ergänzt und verbessert. 4. Ritz, C. M., Maier, W. F. A., Oberwinkler, F. & Wissemann, V. (im Druck, akzeptiert am 03. März 2005): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycological Research. Auf drei ausgewählten Hundsrosenarten wurden zwei Rosenroste Phragmidium mucronatum und P. tuberculatum gefunden. Die beiden Roste zeigten innerhalb der Rosenarten keine Nischendifferenzierung. Es ist anzunehmen, dass die hybridogene Entstehung der Caninae und intrasektionelle Hybridisierung Kospeziationsprozesse zwischen Rosten und Rosen behindert. Trotz der großen morphologischen Ähnlichkeit und dem überlappenden Wirtsspektrum der beiden Roste sind sie in einer phylogenetischen Rekonstruktion der Gattung Phragmidium keine Schwestergruppen. Phragmidium mucronatum befindet sich in einem Monophylum mit anderen Rosenrosten, während für P. tuberculatum ein Wirtswechsel von Rubus bzw. Sanguisorba zu Rosa angenommen werden muss. Die Aufsammlung der Roste und die statistische Auswertung zu ihrem Vorkommen habe ich ausgeführt. Die Bestimmung der Arten, die Laborarbeiten für die molekulargenetische Analyse, die Rekonstruktion der Phylogenien und das Anfertigen des Manuskriptes wurden zu gleichen Teilen von Wolfgang Maier und mir durchgeführt. F. Oberwinkler und V. Wissemann haben diese Publikation durch ihr gemeinsames DFG-Projekt im Schwerpunktprogramm Radiationen - Genese biologischer Diversität: (Wi 2028/1, Ob24/25) angeregt und das Manuskript korrigiert, ergänzt und verbessert. 14 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 3. Manuskript I: Ritz, C. M., Schmuths, H., Wissemann, V. (2005): Evolution by reticulation: European dogroses originated by multiple hybridization across the genus Rosa. Journal of Heredity 96 (1): 4-14 Die Abbildungen 2 und 3 des Manuskriptes sind im Anhang vergrößert dargestellt. 15 Journal of Heredity 2005:96(1):4–14 doi:10.1093/jhered/esi011 Advance Access publication December 23, 2004 ª 2005 The American Genetic Association Evolution by Reticulation: European Dogroses Originated by Multiple Hybridization Across the Genus Rosa C. M. RITZ, H. SCHMUTHS, AND V. WISSEMANN From the Institute of Systematic Botany, University of Jena, Philosophenweg 16, D-07743 Jena, Germany (Ritz, Wissemann); and the Department of Experimental Taxonomy, IPK Gatersleben, Corrensstr. 3, D-06466 Gatersleben, Germany (Schmuths) Address correspondence to C. M. Ritz at the address above, or e-mail: christiane.ritz@uni-jena.de) Abstract The European dogroses (Rosa sect. Caninae (DC.) Ser.) are characterized by a unique meiosis system (‘‘canina-meiosis’’), which controls the heterogamous development of tetraploid egg cells and haploid pollen grains resulting in a pentaploid somatic status. This permanent anorthoploidy is supposed to have originated by a hybridization event in the postglacial period. In this study we present molecular evidence by an analysis of nuclear ribosomal DNA data that dogroses are complex allopolyploids resulting from multiple hybridization events. As previously described, the nrITS-1 region does not undergo concerted evolution in dogroses. Thus, different ITS-1 sequences persist within single individuals. Secondary structure predictions do not point to the existence of pseudogenes within these ITS-1 types. Our data suggest that the pentaploid Caninae genome originated from different members of nondogroses and the now extinct Protocaninae. The genus Rosa (Rosaceae) is one of the most important genus of ornamental plants in terms of economy and cultural history of humankind with about 200 species distributed in the Northern Hemisphere (Rehder 1949; Wissemann 2003a). Conventional taxonomy (Wissemann 2003a) divides the genus into four subgenera, three of which are monotypic: Hulthemia (Dumort.) Focke, Platyrhodon (Hurst) Rehder, and Hesperhodos Cockerell. The fourth subgenus, Rosa, habors about 95% of all species and is subdived into 10 sections including Caninae, which is subject of this study. Phylogenetic investigations on the genus have been carried out, for example, by Wu et al. (2000, 2001) and Matsumoto et al. (1998, 2000). However, results of these studies remain contradictory. The natural distribution of the genus is separated into three major geographical areas: North America, East Asia, and Europe/West Asia. The European/West Asian region is dominated by members of section Caninae (DC.) Ser., the dogroses, which play an essential role in the production of root stocks for ornamental rose breeding. Dogroses have an exceptional position among plants due to their unique meiotic behaviour and breeding system (Grant 1971; Wissemann 2000). Contrary to normal meiosis, by which gametes of equal chromosome numbers are produced, canina-meiosis is a heterogamous system with haploid pollen grains and 4 tetraploid egg cells (Blackburn and Harrison 1921; Täckholm 1920, 1922). Outbreeding leads to permanent pentaploid organisms, which are matroclinal in characters due to the differential contribution of maternal (80%) and paternal genomes (20%) (Ritz and Wissemann 2003; Wissemann and Hellwig 1997). The evolutionary origin of this peculiar phenomenon in dogroses has been under intensive discussion since the beginning of the 20th century (Wissemann 2000). Grant (1971) assumed that the system originated by hybridization leading to an allopolyploid status that enabled subsequent postglacial radiation. To investigate the hybridogenic origin of the dogroses, we analyzed nuclear ribosomal DNA sequence data. We sequenced the internal transcribed spacer, ITS-1, which does not undergo concerted evolution in dogroses (Wissemann 2000, 2003b) as is also described for a variety of other plant genera (reviewed in Alvarez and Wendel 2003; Bailey et al. 2003). The ITS region is located within the 18S-5,8S-26S rDNA at a single nucleolus organizer region (NOR) per haploid chromosome set in Rosa (Ma et al. 1997). Thus, up to five paralogous ITS sequences are expected to be found in the pentaploid dogroses under the assumption that ITS sequences are concerted within a NOR. Homogeneity within NORs was observed by Schlotterer and Tautz (1994), who showed that 35S rDNA repeats within the same NOR are Ritz et al.
Evolution by Reticulation more similar than copies from different NORs. The potential of nrITS sequence data to prove historical hybridization and/or polyploidization events has been shown in Rosaceae for Amelanchier (Campbell et al. 1997) and in other plant taxa (Ainouche and Bayer 1997; Ritland et al. 1993; Sang et al. 1995, Soltis et al. 1995; Soltis and Soltis 1991; Suh et al. 1993; Vargas et al. 1999). Additionally, we analyzed secondary structure predictions of the nonconcerted ITS-1 paralogs to detect the possible existence of pseudogenes, which may strongly bias phylogenetic hypotheses. The ITS region is subject to evolutionary constraints related to maintenance of secondary structures and functionality (reviewed in Alvarez and Wendel 2003; Baldwin et al. 1995). Secondary structure predictions and minimum free energy of the ITS region must be treated with caution, because ITS-1 does not exist as separate molecule but forms the 35S precursor rRNA together with ITS-2, parts of the IGS, 18S rDNA, 5.8S rDNA, and 28S rDNA (Volkov et al. 2004). However, although secondary structure predictions of ITS-1 cannot be considered true structure, they can help in the identification of pseudogenes (Bailey et al. 2003; Mayol and Rossello 2001) and can support phylogenetic hypotheses (Denduangboripant and Cronk 2001; Gottschling et al. 2001; Mayol and Rossello 2001). Here we present molecular evidence for the multiple allopolyploid origin of dogroses. Dogroses contain a mixed set of different ITS sequence types. Several of these types are also found in nondogrose sections, but one ITS type, the canina type, is exclusively restricted to dogroses and thus might trace the former existence of extinct ancestors of the Caninae, which we call Protocaninae roses. Materials and Methods Plant Material The plant material was collected from the field and from botanical gardens and rose nurseries. Voucher specimens were deposited in the author’s herbarium (wis). Nomenclature of the taxa is according to Wissemann (2003a) and for members of sect. Caninae to Klásterškỳ (1969) as well as Henker and Schulze (1993). The list of plant samples analyzed in the study, including classification, localities, and EMBL accession numbers, is shown in Table 1. DNA Extraction Total DNA was extracted from silica gel–dried material of living plants or herbarium specimens using E.Z.N.A. Plant DNA Mini Kit (Peqlab Biotechnologie GmbH) following the manufacturer’s instructions. Amplification Amplification of double-stranded DNA was performed in 25 ll containing 2.5 ll 10-fold polymerase buffer, 2.5 ll 2 mM dNTP, 10 pmol/ll of each primer, 1 U of Taq polymerase (QBiogene), 1 ll DNA template, and 1 ll DMSO to avoid the amplification of pseudogenes (Buckler and Holtsford 1996; Buckler et al. 1997). Primers for ITS-1 regions were taken from White et al. (1990): ‘‘ITS5’’ 59-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG39 and from Ochsmann (2000): ‘‘P2’’ 59-CTCGATGGAACACGGGATTCTGC-39. The standard polymerase chain reaction (PCR) conditions consist in a initial denaturation of 180 s at 958C, 28 cycles of 30 s at 958C, 1 min at 488C, and 120 s at 728C, with a final extension of 180 s at 728C. PCR products of nondogroses were directly sequenced in both directions with the same primers as for amplification with Amersham Bioscience Thermo Sequenase labeled Primer Cycle Sequencing kit with 7-deaza-dGTP. Samples of sect. Caninae and Rosa were subcloned before sequencing. PCR products were purified using Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturer’s instructions and subcloned with a t-tailed pBluescript II SK (þ) cloning vector into the Escherichia coli strain JM13 via electroporation. Transformed E. coli cells were plated on LB agar with ampicillin (100 lg/ml), IPTG (0.2 mM), and X-Gal (40 lg/ ml). White colonies were selected for growth, and these clones were picked and directly added to the amplification mix for ITS-1 and afterward sequenced (protocols and cycling profiles are identical to the ones described). Data Analyses DNA sequences were aligned using ClustalX 1.83 (Thompson et al. 1997) and manually edited afterward. Additionally sequences of R. gallica L. were taken from GenBank (accession numbers AB035656, AB043835, AB043824). The complete alignment is deposited in GenBank. A haplotype network was calculated with TCS (Clement et al. 2000) using a parsimony algorithm (Templeton et al. 1992). Within the cladogram built by TCS, we detected five different nrITS-1 types, which consist of highly homogenic sequences. These ITS-1 types are also identified by eye on the base of a combination of 13 coupled diagnostic polymorphic sites in the alignment. Consensus sequences for the five different ITS-1 types were determined based on all sequences within the respective gray shaded box in the cladogram in Figure 1. To exclude the existence of pseudogenes secondary structure predictions of the five ITS-1 types were inferred with the program Alifold (Hofacker et al. 2002). The analysis was based on separate alignments of the sequences of the different ITS-1 types identified by the TCS analysis and the diagnostic polymorphic sites (a separate alignment of one ITS-1 type contains all sequences in the respective gray shaded box in Figure 1). Alifold was run with the partition function pair probabilities fold algorithm at 208C using DNA parameters (SantaLucia 1998) and default options. Results ITS Analysis The complete alignment (length ¼ 259) of the ITS-1 sequence data of different species of Rosa contains 51 5 Journal of Heredity 2005:96(1) Table 1. Analyzed Rosa species with sources and EMBL accession numbers Taxon Sample origin and voucher no. EMBL no. Subgen. Hesperhodos Cockerell 1913 R. stellata Wooton 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Hessen, Kassel VW163 AJ631842 Germany, Göttingen Botanic Garden, Section Ecology C10 AJ631841 Germany, Hessen, Kassel VW72 AJ631843 Subgen. Rosa Sect. Banksianae Lindl. 1820 R. banksiae Ait. 2n ¼ 2x, 4x ¼ 14, 28 USA, Texas, TAMU VW314 AJ631853 Sect. Bracteatae Thory 1820 R. bracteata Wendl. 2n ¼ 2x ¼ 14 USA, Texas, TAMU VW315 AJ631863 Switzerland, Glarus, Braunwald C9_1 C9_2 C9_3 AJ631940 AJ631941 AJ631942 R. agrestis Savi 2n ¼ 5x, 6x ¼ 35, 42 unbalanced, heterogamous Germany, Niedersachsen, Banenrode, VW150_1 VW150_3 VW150_4 VW150_5 VW150_6 VW150_7 AJ631899 AJ631956 AJ631957 AJ631959 AJ631958 AJ631904 R. caesia Sm. 2n ¼ 5x, 6x ¼ 35, 42 unbalanced, heterogamous Germany, Schleswig-Holstein, Fehmarn C6_1 AJ631954 R. canina L. 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Niedersachsen, Bovenden, North of Göttingen VW355_1 VW355_2 Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Neubrandenburg, Lindenberg C3_1 AJ631886 AJ631923 Germany, Niedersachsen, Gross Schneen near Göttingen C5_1 Germany, Niedersachsen, Botanic Garden Göttingen, Section Systematics VW17_1 VW17_2 VW17_3 Germany, Rheinland-Pfalz, Mertesdorf near Trier VW356_1 VW356_2 Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Neustrelitz C2_1 C2_2 C2_3 C2_4 C2_5 C2_6 AJ631931 Subgen. Hulthemia (Dumort.) Focke 1888 R. persica Michx. ex Juss. 2n ¼ 2x ¼ 14 Subgen. Platyrhodon (Hurst) Rehder 1940 R. roxburghii Tratt. 2n ¼ 2x ¼ 14 Sect. Caninae (DC.) Ser. 1825 R. abietina Gren. ex Christ 2n ¼ ? unbalanced, heterogamous R. rubiginosa ssp. columnifera Schwertschlager 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous R. corymbifera Borkh. 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous R. glauca Pourr. 2n ¼ 4x ¼ 28 unbalanced, heterogamous R. jundzillii Besser 2n ¼ 6x ¼ 42 unbalanced, heterogamous R. micrantha Borrer ex Sm. 2n ¼ 4x, 5x, 6x ¼ 28, 35, 42 unbalanced, heterogamous 6 AJ631934 AJ631895 AJ631896 AJ631903 AJ631884 AJ631924 AJ631840 AJ631887 AJ631929 AJ631930 AJ631888 AJ631933 Ritz et al.
Evolution by Reticulation Table 1. Continued Taxon Sample origin and voucher no. EMBL no. R. mollis Sm. 2n ¼ 4x, 5x, 6x ¼ 28, 35, 42 unbalanced, heterogamous Germany, Schleswig-Holstein, Geltinger Birk, Flensburg VW152_1 VW152_2 VW152_3 VW152_4 VW152_5 VW152_6 VW152_7 AJ631901 AJ631907 AJ631960 AJ631905 AJ631906 AJ631961 AJ631949 R. montana Chaix 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Italy, Südtirol, Vinschgau, Sonnenberg near of Schlanders C8_1 C8_2 AJ631947 AJ631948 ‘‘R. mosqueta’’ ¼ R. rubiginosa L. from South America 2n ¼ ? unbalanced, heterogamous Argentinia, Provincia del Chubut, near of Parque Nacional Los Alerces, Puerto Limonoa C51_1 C51_2 C51_3 Argentina, Provincia de Neuquen, near of Parque Nacional Lanin, Hua-Hum C54_1 C54_2 C54_3 C54_4 C54_5 Argentina, Provincia de Neuquen, near of Parque Nacional Lanin, Hua-Hum C55_1 AJ631890 AJ631916 AJ631915 AJ631891 AJ631892 AJ631893 AJ631902 AJ631900 AJ631894 R. pseudoscabriuscula (R. Keller) Henker & G. Schulze 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Burg Stargard C1_1 C1_2 C1_3 AJ631927 AJ631928 AJ631932 R. rubiginosa L. 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Schleswig-Holstein, Helgoland VW354_1 AJ631885 R. sherardii Davies 2n ¼ 4x, 5x, 6x ¼ 28, 35, 42 unbalanced, heterogamous Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Neukloster VW309_1 AJ631925 R. sicula Tratt. Germany, Sachsen-Anhalt, SGH VW161_1 VW161_2 VW161_3 VW161_4 VW161_5 VW161_6 AJ631937 AJ631938 AJ631939 AJ631889 AJ631955 AJ631946 R. stylosa Desvaux 2n ¼ 5x, 6x ¼ 35, 42 unbalanced, heterogamous Germany, Baden-Württemberg, Badenweiler C7_1 AJ631926 R. subcanina (H. Christ) R. Keller 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Warin VW141_1 VW141_2 AJ631935 AJ631936 R. subcollina (H. Christ) R. Keller 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Niedersachsen, Westharz, Hohegeiss VW140_1 AJ631897 R. tomentella Léman 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Poischendorf VW146_1 AJ631945 7 Journal of Heredity 2005:96(1) Table 1. Continued Taxon Sample origin and voucher no. EMBL no. R. tomentosa Sm. 2n ¼ 5x ¼ 35 unbalanced, heterogamous Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Züsow VW142_1 VW142_2 AJ631943 AJ631944 R. villosa L. 2n ¼ 4x, 8x ¼ 28, 56 unbalanced, heterogamous Germany, Mecklenburg-Vorpommern, Lübz VW143_1 VW143_2 VW143_3 AJ631917 AJ631898 AJ631918 Sect. Carolinae Crép. 1891 R. carolina Willd. I 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Hessen, Kassel C19 AJ631861 R. carolina Willd. II 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C29 AJ631855 R. nitida Willd. Germany, Niedersachsen, Göttingen, Leonard Nelson Strasse C18 AJ631860 R. palustris Marsh. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Niedersachsen, Göttingen, Botanic Garden, Section Systematics C17 AJ631864 R. virginiana Herrm. 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C28 AJ631857 Sect. Cinnamomeae (DC.) Ser. 1825 R. arkansana I Porter ex. I.M. Coult 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C30 AJ631858 R. arkansana II Porter ex. I.M. Coult 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C35 AJ631862 R. beggeriana Schrenk 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C24 AJ631866 R. blanda Ait. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C31 AJ631859 R. cinnamomea Linn. var. glabra 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C21 AJ631854 R. laxa Retz 2n ¼ 2x ¼ 14 China, Xinjiang, Kongur, Atoinak, 2750m, leg. M. Richter 1996–07–04 C36 AJ631881 R. majalis Herrm. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Baden-Württemberg, Rottenburg/Neckar, Äuble C39 AJ631867 R. multibracteata Hemsl. et E.H. Wilson 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C34 AJ631872 R. pendulina L. 2n ¼ 2x ¼ 14 Switzerland, Engadin, Chua-Litschana C16 AJ631844 R. rugosa Thunb. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Schleswig-Holstein, Sylt DL58 AJ631865 R. sertata Rolfe 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C33 AJ631856 R. suffulta Greene 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C32 AJ631851 R. willmottiae Hemsl. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Niedersachsen, Botanic Garden, Göttingen, Section Systematics C14 AJ631871 R. woodsii Lindl. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Hessen, Kassel C15 AJ631852 Sect. Indicae Thory 1820 R. chinensis Jacq. 2n ¼ 2x, 3x, 4x ¼ 14, 21, 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C38 AJ631847 8 Ritz et al.
Evolution by Reticulation Table 1. Continued Taxon Sample origin and voucher no. EMBL no. R. odorata (Andrews) Sweet 2n ¼ ? Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C37 AJ631848 Sect. Laevigatae Thory 1820 R. laevigata Michx. 2n ¼ 2x ¼ 14 USA, Texas, TAMU VW313 AJ631873 Sect. Pimpinellifoliae (DC.) Ser. 1825 R. altaica Willd. 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Schleswig-Holstein, Fehmarn DL36 AJ631849 R. ecae Aitch. 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH DL7 AJ631878 R. foetida J. Herrm. 2n ¼ 4x ¼ 28 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH DL20 AJ631879 R. hugonis Hemsl. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH DL6 AJ631882 R. primula Boul. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH DL5 AJ631876 R. sericea Lindl. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH DL18 AJ631874 R. spinosissima L. 2n ¼ 4x ¼ 28 Austria, Senftenberg, Krems DL-V14 DL-V17 DL55 DL56 DL57 AJ631880 AJ631850 AJ631868 AJ631869 AJ631870 R. xanthina Lindl. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Sachsen-Anhalt, SGH DL62 AJ631875 Germany, Baden-Württemberg, Rottenburg/Neckar, Seebronn VW101_1 VW101_2 sequence from EMBL database sequence from EMBL database sequence from EMBL database Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C25_2 C25_3 C25_4 AJ631908 AJ631922 Sect. Rosa (Gallicanae DC.) Ser. 1825) R. gallica L. 2n ¼ 4x ¼ 28 R. alba (¼ gallica x dumetorum) AB035656 AB043824 AB043835 AJ631919 AJ631951 AJ631952 R. alba var. suaveolens Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C26_1 AJ631920 R. alba ‘‘Mme. Plantier’’ Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C40_11 C40_12 C40_15 AJ631909 AJ631883 AJ631914 R. alba ‘‘Königin von Dänemark’’ Germany, Niedersachsen, Göttingen, Botanic Garden, Section Systematics C41_6 C41_7 C41_8 C41_10 AJ631913 AJ631911 AJ631910 AJ631912 R. alba x corymbifera Germany, Sachsen-Anhalt, SGH C44_1 C44_2 C44_3 AJ631921 AJ631953 AJ631950 9 Journal of Heredity 2005:96(1) Table 1. Continued Taxon Sample origin and voucher no. EMBL no. Sect. Synstylae DC. 1813 R. helenae Rehd. & Wils. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Hessen, Kassel C13 AJ631877 R. multiflora Thunb. ex. Murr. 2n ¼ 2x, 3x ¼ 14, 21 Germany, Niedersachsen, Göttingen, Botanic Garden, Section Systematics C12 AJ631845 R. wichurana Crép. 2n ¼ 2x ¼ 14 Germany, Niedersachsen, Göttingen, Botanic Garden, Section Systematics C11 AJ631846 Subgeneric classification, nomenclature and chromosome numbers are taken from Wissemann (2003a). Abbreviations: SGH ¼ Europa-Rosarium Sangerhausen, Kassel: Rose collection Kassel-Wilhelmshöhe, Germany; TAMU: Collection from Texas A&M University, Dept. of Horticultural Sciences. polymorphic sites resulting in up to 4.6% sequence divergence. In a haplotype network, nrITS-1 sequences sampled from across the genus Rosa were confined to five major clusters: the canina, gallica, rugosa, wichurana, and woodsii types (Figure 1). These five ITS-1 types, with almost no sequence variation within the cluster, can be differentiated by a characteristic combination of 13 coupled single nucleotide substitutions. The consensus sequences of the five different ITS-1 types with the diagnostic polymorphic sites are shown in Figure 2. ITS sequences of species of sect. Caninae and Rosa are nonconcerted. No double bands were detected when the ITS sequences of nondogroses were sequenced directly after PCR amplification and thus gave no hint for nonconcerted ITS evolution in these sections so far. With Figure 1. Haplotype network of nrITS-1 sequences from the genus Rosa. Clonal sequences of sect. Caninae, sect. Rosa and ‘‘Alba’’ roses are named by a number code. Clonal sequences of sect. Caninae are presented in bold, sequences of sect. Rosa are marked with a circle and sequences of ‘‘Alba’’ roses are marked with an asterisk. The first number equals a specific individual of a dogrose (see Table 1), the second number corresponds to the number of the clone. (Example: C54_2 ¼ Rosa rubiginosa L., clone 2). All other rose taxa are indicated by their full species names. 10 Ritz et al.
Evolution by Reticulation Figure 2. Alignment of the consensus sequences of the canina, gallica, rugosa, wichurana, and woodsii ITS-1 types. Thirteen polymorphic sites diagnostic for the respective ITS-1 types are shown by numbers in circles and are marked by gray bars. the exception of the wichurana type, the various ITS-1 sequences of dogroses occurred in all ITS-1 types. The canina type is restricted to dogroses (sect. Caninae) and clones of R. 3 alba, a group of putative R. canina 3 gallica hybrids. Within the gallica type ITS-1 sequences of Rosa gallica (sect. Rosa), R. 3 alba and one dogrose individual (‘‘R. mosqueta,’’ c53) are found. Roses of other sections contain ITS-1 sequences, which are distributed within the rugosa, wichurana, and woodsii type. The rugosa type contains ITS-1 sequences of the monotypic sect. Bracteatae and species of sect. Carolinae, Cinnamomeae, and Pimpinellifoliae. The wichurana type occurs in species of the sections Cinnamomeae, Indicae, Pimpinellifoliae, and Synstylae. The ITS-1 sequences of R. stellata (subgen. Hesperhodos), R. cinnamomea, R. multibracteata, R. palustris, R. willmottiae, R. laxa (sect. Cinnamomeae), R. laevigata (sect. Lavigatae), R. sericea, and R. hugonis (sect. Pimpinellifoliae) are not directly recognized by the polymorphic sites diagnostic for the wichurana or rugosa type but have an intermediate position between these types. The woodsii type comprises in addition to ITS-1 sequences of sect. Caninae and Rosa, R. banksiae (sect. Banksianae) and R. woodsii (sect. Cinnamomeae). Secondary Structures Secondary structure predictions of the nrITS-1 sequences for the alignments of the five different ITS-1 types are shown in Figure 3. GþC content is nearly identical between these alignments (Table 2). We identified five different domains (or arms) within the secondary structures, which are shown as shaded areas in 11 Journal of Heredity 2005:96(1) Figure 3. Secondary structures of the different ITS-1 types predicted by the program Alifold. (A) Canina type, (B) gallica type, (C) rugosa type, (D) wichurana type, and (E) woodsii type. Diagnostic polymorphic sites are marked by gray circles and numbers (see alignment in Figure 2), helix domains are marked by shaded areas and Roman letters. Figure 3. Domain I is found in all ITS-1 types (alignment position 1–22 and 194–255) but is slightly different in the rugosa and wichurana type (alignment position 1–38 and 188– 255) (Ia). Secondary structures of all ITS-1 types contain domain II. This domain is identical for the gallica, rugosa, and wichurana type consisting of alignment positions 111–114 and 160–187. The first part of this domain of the canina and woodsii type includes the alignment positions 32–34 instead of 111–114. This domain contains the conserved angiosperm motif GGCRY-(4 to 7n)-GYGYCAAGGAA (Liu and Schardl 1994) in all ITS-1 types. The domain III is lacking in the canina and woodsii type but present in the gallica, rugosa, and wichurana type consisting of the alignment positions 116– 159. Domain IV is found in the gallica, rugosa, and wichurana type (alignment positions 39–44 and 83–110) but lacking in the canina and woodsii type. Domain V (alignment position 12 46–79) is present in all ITS-1 types with the exception of the canina type. Secondary structures of the rugosa and wichurana type are nearly identical, sharing all five domains. The gallica type is also very similar to the rugosa and woodsii type but contains the domain I instead of Ia. The canina type differs mostly from all Table 2. Mean GþC content of the five nrITS-1 types and minimum free energy of the predicted secondary structures Type GþC [%] DG (208C) [kcal/mol] canina gallica rugosa wichurana woodsii 59.80 59.30 59.68 58.13 57.72 72.43 77.33 75.19 72.42 71.53 Ritz et al.
Evolution by Reticulation other ITS types because domains III, IV, and V are replaced by a unique structure. Alifold computed the secondary structures based on the most frequent base at ambiguous sites, but results did not differ when ambiguous sites (variable positions no. 5, 7, 8, and 9 in the wichurana type) were directly implemented. Discussion ITS-1 sequences sampled from across the genus Rosa were confined to five major clusters: the canina, gallica, rugosa, wichurana, and woodsii types (Figure 1). The woodsii, gallica, and canina types are identical with the A-, B- and C-ITS types, respectively, detected in a previous study of dogrose species by Wissemann (2000). The apparent absence of concerted evolution of ribosomal DNA among various chromosome sets of different origin within dogroses, which putatively hybridize in nature (Ritz and Wissemann 2003) contrasts with the fast homogenization of ITS sequences in artificial Armeria hybrids (Aguilar et al. 1999) and with the elimination of parental rDNA in the putative hybrid Nicotiana tabacum (Volkov et al. 1999). On the other hand different ITS copies persist for long time periods in hybrids of Amelanchier (Campbell et al. 1997). Minimum free energy values of the secondary structure predictions, the GþC content and the presence of the conserved angiosperm motif GGCRY-(4 to 7n)-GYGYCAAGAA (Liu and Schardl 1994) in all ITS-1 types do not point to the existence of pseudogenes. Minimum free energy values and the GþC content differ only in up to 5.8 kcal/ mol (2.6%), whereas Mayol and Rossello (2001) found differences of the GþC content of 12.7% and 43.6 kcal/mol of the mimimum free energy of ITS-1 sequences of Quercus rubra L. and thus suggested the existence of pseudogenes. We assume that all detected ITS-1 types are potentially functional, because the rugosa, the wichurana, and the woodsii type occur also exclusively in diploid roses of nondogrose sections. The canina type and the gallica type always co-occur with other types (e.g., in Rosa gallica with the woodsii type and in dogroses with the woodsii type or the rugosa type), but the data are inconclusive as to whether several or only one ITS types are transcribed in the plants. Relative similarity of secondary structures corresponds with the relationships reflected in the minimum spanning tree. Secondary structures of the closely related rugosa and wichurana type are most similar to each other sharing all five helix domains. The secondary structure of the canina type and the woodsii type are most distinct from all other types, which is also mirrored by their more isolated positions. With the exception of the wichurana type, ITS-1 sequences in dogroses occur in all clusters detected by us. The canina type is restricted to dogroses and the Alba roses (putative R. canina 3 R. gallica hybrids), whereas the other four types contain ITS-1 sequences of various other wild roses of different sections of Rosa. The coexistence of identical ITS-1 sequences in the pentaploid genomes of the dogroses on one hand and in several sections of the genus Rosa on the other hand suggests that the Caninae genome arose by hybridiza- tion. Thus our results based on molecular data confirm the hybridogenic origin of dogroses first postulated by Täckholm (1920, 1922) and also suggested by Blackburn and Harrison (1921), Gustafsson (1944), Gustafsson and Hakansson (1942), and Hurst (1925, 1928) based on cytological observations. Furthermore, our data implicate the multiple allopolyploid origin of dogroses between different ancestors of non-Caninae wild roses and Protocaninae. The restriction of the canina type sequences to dogroses implies the existence of a diploid ancestral Protocanina. By hybridogenic introgression into this diploid Protocanina the modern Caninae may have evolved, whereas ancient roses of the canina type cluster became extinct. However, the exact evolutionary process of the joining of the different nondogrose genomes and the Protocaninae genome remains unresolved. We hypothesize that the final pentaploid hybrid and its offspring became established by reproductive isolation via the Canina meiosis, which enabled subsequent radiation when an open landscape appeared after the end of the last glacial period in Europe. Acknowledgments The work was funded by a grant from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to V.W. (Wi 2028/1). We thank the Europarosarium Sangerhausen and the Rosensammlung Kassel-Wilhelmshöhe for providing plant material and the VDR Stiftung Europa-Rosarium Sangerhausen for financial support for the analysis of the Alba-roses. The possibility to work in the molecular laboratories of F. H. Hellwig and G. Theiben (both University of Jena) is gratefully acknowledged. We thank M. Vökel (G. Theiben’s lab) for the kind help with the cloning procedure. We also thank N. Drechsler and R. Melzer for their work in the lab. Special thanks go to K. Bachmann (Gatersleben) and V. Hemleben (Tübingen) for critical comments and discussions. 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(2005): The genus Rosa (Rosoideae, Rosaceae) revisited: molecular analysis of nrITS-1 and atpB-rbcL intergenic spacer (IGS) versus conventional taxonomy. Botanical Journal of the Linnean Society. 147: 275-290. 27 Blackwell Science, LtdOxford, UKBOJBotanical Journal of the Linnean Society0024-4074The Linnean Society of London, 2005? 2005 1473 275290 Original Article Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290. With 2 figures PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) V. WISSEMANN and C. M. RITZ The genus Rosa (Rosoideae, Rosaceae) revisited: molecular analysis of nrITS-1 and atpB-rbcL intergenic spacer (IGS) versus conventional taxonomy VOLKER WISSEMANN FLS* and CHRISTIANE M. RITZ Friedrich-Schiller University Jena, Department of Systematic Botany, Philosophenweg 16, D-07743 Jena, Germany Received March 2004; accepted for publication September 2004 Sequences of the nrDNA internal transcribed spacer 1 (nrITS-1) and atpB-rbcL intergenic spacer (IGS) of the cpDNA were analysed for all sections of the genus Rosa L. (Rosoideae, Rosaceae) to study molecular infrageneric taxonomy and relationships of Rosa with respect to conventional taxonomy based upon morphological and anatomical data as well as phytochemical characters. The results suggest that Rosa in its traditional infrageneric circumscription is not reflected by molecular data. Cinnamomeae, Carolinae and Pimpinellifoliae are not monophyletic based on the molecular data and this is mirrored in conventional taxonomy that separates these sections by weak morphological characters such as sepal performance, existence of bracts, and number of flowers per inflorescence. Section Pimpinellifoliae is split by the monotypic sections Laevigatae, Platyrhodon, Bracteatae and Hesperhodos. Section Caninae is a natural allopolyploid group characterized by its autapomorphic ITS C-type and Canina-meiosis. CpDNA subdivides sect. Caninae into two natural clusters of eglandular and glandular species. NrITS shows sect. Synstylae/ Indicae to be the direct sister group to sect. Caninae, not Rosa (Gallicanae) although both groups are morphologically characterized by pinnate sepals. From our molecular data sect. Indicae and sect. Synstylae are consectional. The highest taxonomic rank below the generic level should be the sectional status. © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290. ADDITIONAL KEYWORDS: evolution – Hulthemia – hybridization – molecular phylogeny – wild roses. INTRODUCTION Rosa L. is distributed throughout the temperate and subtropical regions of the Northern hemisphere (Rehder, 1949). The genus comprises about 200 species and the taxonomic treatment of the highly diverse group is complicated due to biological phenomena in reproductive biology, insufficient morphological and anatomical characters to adequately discriminate between species and the human impact by rose breeding (Wissemann, 2003a). Conventional taxonomy (Rehder, 1949; Wissemann, 2003a) divides the genus into four subgenera, three of which are monotypic or contain two species: Hulthemia (Dumort.) Focke, 1888, Platyrhodon (Hurst) Rehder, 1940, Hesperhodos Cockerell, 1913 and Rosa. A fourth subgenus Rosa harbours about 95% of all species and is subdivided into ten sections: *Corresponding author. E-mail: Volker.Wissemann@uni-jena.de Pimpinellifoliae (DC.) Ser. 1825; Rosa (= sect. Gallicanae (DC.) Ser. 1825); Caninae (DC.) Ser. 1825; Carolinae Crép., 1891; Cinnamomeae (DC.) Ser. 1825; Synstylae DC. 1813; Indicae Thory, 1820; Banksianae Lindl., 1820; Laevigatae Thory, 1820; Bracteatae Thory, 1820. Since the lectotypification by Britton & Brown (1913), R. centifolia L. from the former Gallicanae is the generic type. However, this typification has been disputed (e.g. de la Roche, 1978; Rowley, 1992) but the proposal to replace this typification by R. cinnamomeae L. as been rejected by the nomenclatural committee in Tokyo 1995 and again in Saint Louis 2000 and thus R. centifolia is still the valid choice. Since roses have been of great influence on human cultural evolution, the earliest attempts to classify the genus date back to the 16th century, when roses were treated either as wild or ‘gentle’ species and were additionally divided based on petal colour (Wissemann, © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 275 276 V. WISSEMANN and C. M. RITZ 2000). This was accepted until Linnaeus (1753, 1772) classified all species of Rosa known at that time, mainly on the shape of the hip. Willdenow (1811) introduced the presence and form of prickles as well as the indumentum and occurrence of glands as taxonomic relevant characters. From then on, the number of described species increased rapidly into several thousands (most prominent Déséglise, 1877; Gandoger, 1892) mirroring uncertainty about the diversity of roses rather than insight into evolutionary processes (Wissemann, 2003a). Delimitation of species in nature, as indicated by natural populations, has been a problem in roses for a long time. Introduction of different gene pools by replanting of disturbed or protected areas is one of the most serious problems for conservation genetics. Herrmann (1762) claimed that horticulture had merged the species so that they would be no longer recognizable. He also pointed to the shortage of phenotypic characters that delimit determination. This lack of characters has been the source of several attempts based on different markers to get insight into phylogenetic relationships within the genus. Debener, Bartels & Mattiesch (1996), Matsumoto & Fukui (1996) and Millan et al. (1996) used RAPD markers or RFLP studies (Matsumoto, Wakita & Fukui, 1997) to elaborate the phylogeny of Rosa. Sequence data from matK and nrITS have been inves- tigated for their ability to resolve the phylogeny (Matsumoto et al., 1998, 2000; Wu et al., 2000, 2001) and Grossi, Raymond & Jay 1998 and Grossi et al. 1999 investigated biochemical data (flavonoids and isoenzyme polymorphisms). However, results of these investigations remain contradictory due to the small sample of investigated taxa and the inadequate resolution of the markers, which in most cases were also not discussed in the context of morphology, distribution and other sources of evidence. We applied sequences of the nrDNA internal transcribed spacer 1 (nrITS-1) and the cpDNA marker: atpB-rbcL intergenic spacer (IGS) to study molecular infrageneric taxonomy and phylogenetic relationships among Rosa with respect to conventional taxonomy. The results are interpreted in a broader context of evolutionary biology in Rosa. MATERIAL AND METHODS TAXON SAMPLING We sequenced four Rubus-species (R. caesius L., R. idaeus L., R. saxatilis L. and R. ulmifolius Schott) as outgroup taxa according to the results of the molecular analyses in Rosoideae by Eriksson et al. (1998, 2003). Sampling of the ingroup taxa represent all sections of the genus Rosa (Table 1). Table 2 presents the Table 1. List of taxa and sources of plant material analysed. Subgeneric classification and nomenclature follows Wissemann (2003a). Accession numbers are for the EMBL data base. Abbreviations: SGH = Europa-Rosarium Sangerhausen, Germany, Aeuble = Wildrose collection of the Schwäbische Albverein Rottenburg/Neckar, Germany; Kassel: Rose collection Kassel-Wilhelmshöhe, Germany; TAMU: Collection at Texas A.M. University, Department of Horticultural Sciences, USA Taxon Subgen. Hulthemia (Dumort.) Focke (1888) R. persica Michx. ex Juss. Subgen. Platyrhodon (Hurst) Rehder 1940 R. roxburghii Tratt. Subgen. Hesperhodos Cockerell 1913 R. stellata Wooton Subgen. Rosa Sect. Pimpinellifoliae (DC.) Ser. 1825 R. altaica Willd. R. ecae Aitch. R. foetida J. Herrm. R. hugonis Hemsl. R. primula Boul. R. sericea Lindl. Accession nrITS1 atpB-rbcL IGS D-Lower Saxony Göttingen, Bot. Garden, Sect. Ecology, leg. VW AJ631841 AJ628770 Kassel, leg. VW AJ631843 AJ628823 Kassel, leg. VW AJ631842 AJ628824 Altai, Ortsausgang Aktasch, Richtung Ust-Ulangom, leg. F. Schlütz 02.09. 2000 SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. AJ631849 AJ628774 AJ631878 AJ631879 AJ631882 AJ631876 AJ631874 AJ628781 AJ628785 AJ628780 AJ628822 AJ628784 © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) 277 Table 1. Continued Taxon Accession nrITS1 atpB-rbcL IGS R. spinosissima L. Sect. Rosa (Gallicanae (DC.) Ser. 1825) R. gallica L. A-Senftenberg, Krems, Austria leg. M. Koch V14 AJ631880 AJ628787 D-Rottenburg/Neckar, Seebronn. leg. G. Timmermann AJ631922 AJ628788 H-Kanton Glarus, Braunwald, leg. G. Timmermann AJ631940 (C9–1) AJ631941 (C9–2) AJ631942 (C9–3) – AJ628797 AJ628816 – AJ628795 AJ628791 AJ631923 AJ631934 (C3–1) AJ628811 Sect. Caninae (DC.) Ser. 1825 R. abietina Gren. ex Christ R. agrestis Savi R. caesia Sm. R. jundzillii L. R. rubiginosa ssp. columnifera R. corymbifera Borkh. R. dumalis Bechst. R. elliptica Tausch R. glauca Pourr. R. inodora Fries R. jundzillii Besser R. micrantha Borrer ex Sm. R. mollis Sm. R. montana Chaix ‘R. mosqueta’ = R. rubiginosa L. from South-America R. pseudoscabriuscula (R. Keller) Henker & G. Schulze R. rubiginosa L. R. sherardii Davies R. sicula Tratt. R. stylosa Desvaux R. subcanina (H. Christ) R. Keller R. subcollina (H. Christ) R. Keller R. tomentella Léman D-Niedersachsen, Banenrode, leg. E. Garve & H. Henker Ro 12/92 D-Schleswig-Holstein, Fehmarn, leg. V.W. D-Niedersachsen, Bovenden, north of Göttingen, leg. V.W. D-Mecklenburg-Vorpommern, Neubrandenburg, Lindenberg leg. A. Mohr Schwertschlager D-Niedersachsen, Gross Schneen near Göttingen, leg. V.W. D-Schleswig Holstein, Fehmarn, north of Bisdorf 1996, Wissemann 1013 D-Thüringen, Schmon, leg. G. Schulze 5/90 D-Niedersachsen, Göttingen, Bot. Garden, Sect. Systematics, leg. V.W. D-Mecklenburg-Vorpommern, Wismar, leg. H. Henker Ro 1/92 D-Rheinland-Pfalz, Mertesdorf near Trier, leg. H. Reichert 93–199 D-Mecklenburg-Vorpommern, Neustrelitz, leg. H. Henker Ro 46/92 D-Schleswig-Holstein, Geltinger Birk, Flensburg, leg. V.W. I-Südtirol, Vinschgau, Sonnenberg near of Schlanders, leg. V.W. Argentinia, Provincia del Chubut, Comarca Andino Parallelo 42, Warton, leg. C. Ritz D-Mecklenburg-Vorpommern, Burg Stargard, leg. H. Henker Ro6/91 D-Schleswig-Holstein, Helgoland, leg. V.W. D-Mecklenburg-Vorpommern, Neukloster, leg. H. Henker 23/87 SGH, leg. V.W. D-Baden-Württemberg, Badenweiler, leg. G. Timmermann D-Mecklenburg-Vorpommern, Warin, leg. H. Henker 24/87 D-Niedersachsen, Westharz, Hohegeiss, leg. H. Henker Ro 10/92 D-Mecklenburg-Vorpommern, Poischendorf, leg. H. Henker 20/87 AJ628793 AJ811537 – – – AJ628814 AJ628808 – AJ628815 AJ631924 AJ628794 AJ631929 AJ631930 AJ631933 AJ631949 (C2–3) (C2–4) (C2–6) (VW152–7) AJ631947 (C8–1) AJ631948 (C8–2) – AJ631927 (C1–1) AJ631928 (C1–2) AJ631932 (C1–3) AJ631885 AJ631925 AJ628806 AJ628812 AJ628796 AJ628809 AJ628810, AJ628819 AJ628813 AJ631937 (VW161–1) AJ631938 (VW161–2) AJ631939 (VW161–3) AJ631926 AJ628817 AJ631935 (VW141–1) AJ631936 (VW141–2) – AJ628790 AJ628792 AJ631945 (VW146–1) AJ628789 © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 AJ628798 278 V. WISSEMANN and C. M. RITZ Table 1. Continued atpB-rbcL IGS Taxon Accession nrITS1 R. tomentosa Sm. D-Mecklenburg-Vorpommern, Züsow, leg. H. Henker 18/87 D-Mecklenburg-Vorpommern, Lübz, leg. H. Henker 34/88 AJ631943 (VW142–1) AJ631944 (VW142–2) – AJ628805 SGH, leg. V.W. (C29) D-Göttingen, Leonard Nelsonstrasse, leg. V.W. D-Niedersachsen, Göttingen, Bot. Garden, Sect. Systematics, leg. VW SGH, leg. V.W. AJ631855 AJ631860 AJ628771 AJ628828 AJ631864 AJ628830 AJ631857 AJ628776 SGH, leg. V.W. (C30) AJ631858 AJ628778 SGH, leg. V.W. (C35) AJ631862 AJ628779 SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. China, Xinjiang, Kongur, Atoinak, 2750 m, leg. M. Richter 1996-07-04 Rottenburg/Neckar, Äuble, leg. C. Ritz SGH, leg. V.W. AJ631866 AJ631859 AJ631881 AJ628829 AJ628772 AJ628775 AJ631867 AJ631872 AJ628777 AJ628821 D-Schleswig-Holstein, Sylt, leg. D. Loessner SGH, leg. V.W. SGH. Leg. V.W. D-Niedersachsen, Göttingen, Bot. Garden, Sect. Systematics, leg. V.W. Kassel, leg. V.W. AJ631865 AJ631856 AJ631851 AJ631871 AJ628782 AJ628773 AJ628820 AJ628783 AJ631852 AJ628826 I-Südtiro, Kastel Feder, leg. V. W. Kassel, leg. V.W. D-Niedersachsen, Göttingen, Bot. Garden, Sect. Systematics, leg. V.W. D-Niedersachsen, Göttingen, Bot. Garden, Sect. Systematics, leg. V.W. – AJ631877 AJ631845 AJ628804 AJ628802 AJ628799 AJ631846 AJ628827 SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. SGH, leg. V.W. AJ631847 – AJ631848 AJ628800 AJ628802 AJ628801 TAMU, leg. D. Byrne AJ631853 AJ628825 TAMU, leg. D. Byrne AJ631873 AJ628786 TAMU, leg. D. Byrne AJ631863 AJ628818 I-Südtirol, Andrian, leg. V.W. I-Südtirol, Nals, leg. V.W. I-Südtirol, Felixer Weiher, leg. V.W. I-Südtirol, Andrianer Wald, leg. V.W. AJ631965 AJ631962 AJ631963 AJ631964 – – AJ628832 AJ628831 R. villosa L. Sect. Carolinae Crép. 1891 R. carolina Willd. R. nitida Willd. R. palustris Marsh. R. virginiana Herrm. Sect. Cinnamomeae (DC.) Ser. 1825 R. arkansana I Porter ex. I.M. Coult R. arkansana II Porter ex. I.M. Coult R. beggeriana Schrenk R. blanda Ait. R. laxa Retz R. majalis Herrm. R. multibracteata Hemsl. et E.H. Wilson R. rugosa Thunb. R. sertata Rolfe R. suffulta Greene R. willmottiae Hemsl. R. woodsii Lindl. Sect. Synstylae DC. 1813 R. arvensis Huds. R. helenae Rehd. & Wils. R. multiflora Thunb. ex. Murr. R. wichurana Crép. Sect. Indicae Thory, 1820 R. chinensis Jacq. (C38) R. chinensis Jacq. (C20) R. odorata (Andrews) Sweet Sect. Banksianae Lindl., 1820 R. banksiae Ait. Sect. Laevigatae Thory, 1820 R. laevigata Michx. Sect. Bracteatae Thory, 1820 R. bracteata Wendl. Outgroup taxa Rubus caesius L. Rubus idaeus L. Rubus saxatilis L. Rubus ulmifolius Schott AJ628807 © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) Table 2. List of taxa analysed. Subgeneric classification and nomenclature follows Wissemann (2003a). The first number indicates the estimated total number of species in the section, the second number represents the number of species included in this study Taxon Subgen. Hulthemia (Dumort.) Focke, 1888 Subgen. Platyrhodon (Hurst) Rehder, 1940 Subgen. Hesperhodos Cockerell, 1913 Subgen. Rosa Sect. Pimpinellifoliae (DC.) Ser. 1825 Sect. Rosa (Gallicanae (DC.) Ser. 1825) Sect. Caninae (DC.) Ser. 1825 Sect. Carolinae Crép., 1891 Sect. Cinnamomeae (DC.) Ser. 1825 Sect. Synstylae DC., 1813 Sect. Indicae Thory, 1820 Sect. Banksianae Lindl., 1820 Sect. Laevigatae Thory, 1820 Sect. Bracteatae Thory, 1820 1/1 1/1 2/1 184?/58 15/7 1/1 50/25 5/4 80?/12 25/4 3/2 2?/1 1/1 2?/1 distribution of the sampling within the genus. All specimens are deposited at the author’s herbarium (Herbarium Wissemann). DNA ISOLATION, PCR AMPLIFICATION, SEQUENCING, CLONING Total DNA was extracted from silica gel-dried material of living plants or herbarium specimen using E.Z.N.A. Plant DNA Mini Kit (Peqlab Biotechnologie GmbH) following the users protocol. Amplification of double stranded DNA was performed on 25 ml containing 2.5 ml 10-fold polymerase buffer, 2.5 ml 2 mM dNTP, 10 pmol ml-1 of each primer, 1 unit of Taq polymerase (Appligene), 1 ml DNA template. Primers for ITS-1 regions were taken from White et al. (1990): ‘ITS5’ 5¢-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3¢ and from Ochsmann (2000): ‘P2’ 5¢-CTCGATGGAACACGGGATT CTGC-3¢. Primers for the amplification of the 5¢ end of the atpB-rbcL intergenic spacer (‘2’ 5¢GAAGTAGTAG GATTGATTCT-3¢ and ‘10’ 5¢-CATCATTATTGTATAC TCTTTC3¢)-were taken from Savolainen et al. (1994). The standard PCR conditions consist in an initial denaturation of 180 s at 95 ∞C, 28 cycles of 30 s at 95 ∞C, 60 s at 48 ∞C and 120 s at 72 ∞C with a final extension of 180 s at 72 ∞C. PCR products except for samples of ITS-1 PCR products of section Caninae and Gallicanae were directly sequenced in both directions with the same primers as for amplification with Amersham Bioscience Thermo Sequenase labelled Primer Cycle Sequencing kit with 7-deaza-dGTP. Samples of section Caninae 279 and Rosa were subcloned before sequencing. PCR products were purified using Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturer’s instructions and subcloned with a t-tailed pBluescript II SK (+) cloning vector into the E. coli strain JM13 via electroporation. Transformed E. coli cells were plated on LB agar with ampicillin (100 mg ml-1), IPTG (0.2 mM) and X-Gal (40 mg ml-1). White colonies were selected for growth and these clones were picked and directly added to the amplification mix for ITS-1 and afterwards sequenced (protocols and cycling profiles are identical to the ones described above). SEQUENCE ALIGNMENT AND PHYLOGENETIC ANALYSES DNA sequences were aligned using ClustalX, version 1.83 (Thompson et al., 1997) and apparent misalignments were corrected manually. The final alignment has been deposited in TreeBase http:// www.herbaria.harvard.edu/treebase/, accession numbers are given in Table 1. Phylogenetic relationships were analysed via Bayesian inference using Monte Carlo Markov chains (MCMC) was conducted with MrBayes 3.0b4 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001). Four incrementally heated simultaneous Monte Carlo Markov chains were run over 2 000 000 generations, using the general time reversible model of DNA substitution with gamma distributed substitution rates, random starting trees and default starting values of the DNA substitution model. Trees were sampled every 100 generations resulting in an overall sampling of 20 001 trees. The first 1000 trees were discarded as ‘burnin’. From the remaining trees a 50% majority rule consensus tree was computed to obtain estimates for the a posteriori probabilities. Branch lengths were estimated as mean values over the sampled trees. This Bayesian approach of phylogenetic analysis was repeated four times, always using random starting trees and random starting values. RESULTS Description of sequence data: nrITS-1: 264 bp in total, from all positions including outgroup 75 were variable, 189 constant positions. Only ingroup: 54 variable. cpDNA: 616 bp in total, from all positions including outgroup 59 were variable, 557 constant positions. Only ingroup: 39 variable. ITS sequences of species of sect. Caninae and Rosa evolve non-concerted (Wissemann, 1999, 2000, 2002, 2003b), polymorphisms can be easily detected by direct sequencing but required a cloning step to obtain sequences suitable for phylogenetic reconstruction. No polymorphisms (double bands) were detected when the ITS sequences of non-dog roses and nongallicaroses were sequenced directly after PCR © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 Support Conflict Subgen. Hulthemia (Dumort.) Focke, 1888 Subgen. Platyrhodon (Hurst) Rehder, 1940 Molecular: nrITS data support inclusion in genus Rosa. Morphology: leaf, pollen exine patterns, hips. Morphology: peeling bark, hip, number of leaflets. Reproductive biology: reduced interfertility with other species. Molecular: nrITS data and cpDNA support inclusion in genus Rosa. Morphology: leaf, autapomorphic pollen exine pattern, hips. Absence of disc. Cytology: few metacentric chromosomes. Molecular: cpDNA support sister relationship of Hulthemia to the remainder of the genus. Molecular: nrITS and cpDNA are ambiguous. Molecular: nrITS and cpDNA data do not show monophyly of the section. RFLP combines it with Cinnamomeae. Morphology: black hips occur also in Cinnamomeae. Morphology: pinnate sepals occur also in sect. Caninae. Sect. Carolinae Crép., 1891 Phytochemistry: kaempferol, quercitin 4¢-glucosides). Morphology: high number of leaflets, single flowers without bracts. Molecular: Distinct ITS-sequence, but ambiguous position. Morphology: hip with long glandular stalk. Molecular: nrITS data show monophyly of the allopolyploid section by existence of an autapomorphic ITS-type. CpDNA separates the section from other sections. Reproductive biology: heterogamy. Cytology: Caninae-meiosis. Morphology: deciduous sepals. Phytochemistry: specific anthocyanin. Sect. Cinnamomeae (DC.) Ser. 1825 Morphology: entire sepals, corymbose flowers. Single flowers with bracts. Sect. Synstylae DC., 1813 Morphology: agglutinated styles. Phytochemistry: biochemical data, carotene. Sect. Indicae Thory, 1820 Morphology: exserted styles, but not agglutinated. Sect. Banksianae Lindl., 1820 Sect. Laevigatae Thory, 1820 Sect. Bracteatae Thory, 1820 Morphology: see Discussion. Molecular: matK, nrITS and cpDNA data do not show monophyly of the section, species are intermixed with Cinnamomeae. Morphology: deciduous sepals occur also in sect. Caninae and are used to separate species within a section. Phytochemistry: flavonoid, enzyme polymorphisms are the same as within Cinnamomeae. Molecular: nrITS and cpDNA data do not show monophyly of the section and intermixes with Pimpinellifoliae. RFLP combines it with Pimpinellifoliae. Phytochemistry: close affinity and intermixing of biochemical patterns. Molecular: nrITS and cpDNA data do not show monophyly of the section, content but consectionality with sect. Indicae. Phytochemistry: similar flower flavonoid composition with Indicae. Molecular: nrITS and cpDNA data do not show monophyly of the section, but consectionality with sect. Synstylae. Phytochemistry: similar flower flavonoid composition with Synstylae. Molecular: nrITS and cpDNA are ambiguous. Morphology: see Discussion. Molecular: nrITS and cpDNA are ambiguous. Morphology: see Discussion. Molecular: nrITS and cpDNA are ambiguous. Subgen. Hesperhodos Cockerell, 1913 Subgen. Rosa Sect. Pimpinellifoliae (DC.) Ser. 1825 Sect. Rosa (Gallicanae (DC.) Ser. 1825) Sect. Caninae (DC.) Ser. 1825 Molecular: nrITS data and cpDNA support inclusion in genus Rosa, but uncertain placement. Morphology: characterization is only possible by a combination of characters, no autapomorphic character state exists. V. WISSEMANN and C. M. RITZ © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 Taxon 280 Table 3. Synopsis of the main characters which (a) support or (b) conflict with the current taxonomy. For details see the Discussion PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) amplification and thus gave no hint for non-concerted ITS evolution in these sections so far, although they include a range of ploidy levels up to the tetraploid status. Analysis of cpDNA and nrDNA-1 sequences resulted in partly incongruent topologies of the trees. Since cpDNA is maternally inherited and nuclear sequences originate by biparental inheritance, we do not expect congruent topologies. Extensive reticulation and non-concerted evolution of the ribosomal repeat restrict the assumption of congruent trees. However, complementary information with respect to hybridization events are expected and are discussed below by the description of the different sections. The lack of resolution in certain parts is in accordance with findings by other authors employing different molecular markers (see Discussion for further possible explanation of this phenomenon). Both data sets showed Rosa to be monophyletic with respect to the outgroup taxa. By cp-data Rosa persica Michx. (section Hulthemia) is nested within Rosa and not a separate genus Hulthemia, supporting the view of Wissemann (2003c), but nrITS sequences place Hulthemia in a sister relationship to the remainder of the genus. NrITS-1 data reveal Rosa sect. Caninae to be a monophyletic group by the existence of the autapomorphic C-type ITS (Wissemann, 2000, 2002, 2003b). Within the Caninae nrITS does not allow any conclusion for intrasectional differentiation. However, cpDNA divides the Caninae species into two clades, one with odorant glands (but not discriminating between the terpentine- and the wine-scented roses) and one with either eglandular or non-odorant glanded species. By nrITS sequences, the monotypic section Rosa with R. gallica appears not to be direct sister to section Caninae. R. gallica is characterized by its pinnate sepals, a character to be universally expressed in the Caninae. R. gallica is completely nested with its areal and its distribution amongst the Caninae. However, Bayesian analysis does not mirror this relationship, here section Synstylae is next to section Caninae. Chloroplast data places R. gallica in an uncertain position within the Caninae, interestingly next to R. tomentella, a species from subsection Tomentellae but also of uncertain relationship to other Caninae based on morphological data. Sister to the clade of Caninae-Rosa (Gallicanae) species are members of sect. Synstylae/Indicae according to the cpDNA data, the close relationships result in R. arvensis being placed within the Caninae-Rosa (Gallicanae)clade. Morphologically the character of agglutinated styles of the Synstylae is not realized in the sister clade. The sister relationship to the Caninae is not resolved in the trees, but is focused on the two sections Rosa and Synstylae. Based on morphological data, R. gallica, with its distinct pinnate sepals, more resembles the Canina-roses. However, pinnate sepals 281 are also known from section Synstylae, for example R. longicuspis Bertol. NrITS and atpB-rbcL IGS sequences unify the Asian sections Indicae and Synstylae into a consectional group. The positions of the monotypic sections Laevigatae, Banksianae and Bracteatae and the monotypic subgenus Platyrhodon and Hesperhodos are not resolved. There is clear evidence via both genetic sources that the two sections Cinnamomeae and Carolinae, are consectional. The North American Carolinae-roses are morphologically only distinguished from the Cinnamomeae by their reflexed, spreading and deciduous sepals after anthesis, whereas the Cinnamomeae have erect and persistent sepals, a character state used in the Caninae to separate next related species. The weak and complicated morphological separation of sect. Pimpinellifoliae from sect. Cinnamomeae by mostly solitary flowers without bracts, is mirrored in both data sets, which include sequences from the Pimpinellifoliae into the Cinnamomeae-Carolinae-clade. As a futureorientated proposal, the highest subgeneric rank should be the sectional status. However, more data need to be evaluated and we discuss here the pro and cons of a new taxonomy using the backbone of conventional taxonomy. DISCUSSION The low resolution in Rosa of the molecular data in this extensive study is new for these markers, but is in accordance with low resolution obtained by the use of other markers (matK; trnL/trnF: Starr & Bruneau, 2002; matK: Matsumoto et al., 1998). The reconstruction of the evolutionary history of Rosa is further complicated by insufficient morphological, anatomical and phytochemical data (see Table 3). This deficiency is not due to a lack of data, but rather the non-existence of informative character states between species. From the point of cultural history, Rosa is a typical genus being ‘oversystematized’, where numerous scientists have put more opinion than knowledge into monographic studies. There is no revision available for the genus, nomenclature of the thousands of names (species and cultivars) is in its infancy, and the complicated open breeding system with interfertility of many species reticulates all taxa in the genus. The fossil record of roses dates back to the Middle Oligocene of the Cenozoic (Mai & Walther, 1978, 1988). For the uniformity of characters in Rosa the principal scenario is likely that the explosive radiation of the Tertiary genus happened in the Holocene of the Quaternary. The still observable close relationship of all character states is the product of a lack of time since radiation and interfertility because there was no time since the spread to develop sufficient reproductive barriers. Secondary evidence for this assumption is that neither © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 282 V. WISSEMANN and C. M. RITZ cpDNA nor nrITS sequence positions in the trees follow a geographical distribution of the taxa. Ecological, geographic or genetic separation triggers speciation by genetic isolation and evolution of sterility barriers, but is rarely seen in the genus since differentiation is rare, and it has not resulted in isolation within the genus. Examples are R. persica from the monotypic section Hulthemia, which is geographically separated by its distribution in the Afghanistan region and R. palustris from sect. Carolinae, which is ecologically niched into the swampy regions in North America. Recently Rieseberg et al. (2003) demonstrated, that ecological transitions, and thus subsequent speciation by genetic isolation, are facilitated by hybridization. This also happened in dog roses: genetically separated (but not isolated) is the sect. Caninae, which is of allopolyploid origin (Wissemann, 2000, 2002) and characterized by the unique heterogamous reproduction via Caninae-meiosis (Täckholm, 1920; 1922) and the existence of an autapomorphic nrITS type (Ritz & Wissemann, 2003a). EVOLUTION OF AND WITHIN THE SUBGENERIC TAXONOMICAL UNITS (NOMENCLATURE ACCORDING TO WISSEMANN, 2003a) Subgenus Hulthemia (Dumort.) Focke (1888) Our nuclear molecular data clearly demonstrate that Hulthemia is a member of the genus Rosa and is not a separate genus. This monotypic subgenus has been disputed since its description by Dumortier (1824). The outstanding character of the central Asian and east Asian (Siberian) Rosa persica Michx. ex Juss., 1789 is the reduction of the leaf to a single leaflet without stipules. The position of R. persica within the genus Rosa in our phylogenies (Figs 1, 2) does not indicate this simplicity to be either an archetypal or an advanced character. Within the genus Rosa, variability in the number of leaflets is high from 11 to 9– 7 leaflets in sect. Pimpinellifoliae, 9–7 in Bracteatae, 7 (-5) in most sections, e.g. Caninae, 5 in Indicae (5)-3 in Laevigatae and subgenus Hesperhodos, and 1 in Hulthemia. In agreement with Parmentier (1897) we interpret the reduction to be a result of ecological adaptation to the hot summer season in the areas where they are found in central Asia (Afghanistan, Usbekistan, Iran). Two morphotypes are reported for R. persica, a more southern distributed form with hairy branches and leaves (Boissier, 1872; Meikle, 1966; Zielinski, 1982) and a second glabrous taxon (used in this study here) in the northern range of distribution (Bean, 1980), but the taxonomic relevance of this character state is not clear. Regel (1877) combined both types into one single species (R. berberifolia Pall.). Our chloroplast data of atpB- rbcL-IGS do not support the finding of Starr & Bruneau (2002) that based on chloroplast trnL/trnL-F, Hulthemia is nested within the subgenus Rosa. In our cpDNA tree R. persica is sister to the remainder of the genus, however, in contrast to Wu et al. (2001) whose nrITS data place the species with R. stellata (subgenus Hesperhodos) in a sister relationship to some species of the Pimpinellifoliae and Laevigatae. Interestingly, Ueda & Tomita (1989) claimed close phylogenetic relationships between Pimpinellifoliae and Hulthemia based on pollen exine patterns. With its chestnut-like hips and basal insertion of the seeds, the fruit characters resemble subgenus Hesperhodos (R. stellata Wooton, 1898) and the subgenus Platyrhodon (R. roxburghii Tratt., 1823). R. persica is able to hybridize with other species from the genus Rosa. This has been reported for naturally occurring plants by de la Roche (1978) and Bean (1980), as well as for ornamental breeding (Harkness, 2003). Based on similar insertion patterns of the seeds in the hip, Parmentier (1897) assumed Hulthemia, Hesperhodos and Platyrhodon to be closely related. Unfortunately he interpreted the insertion as a basiparietal insertion and correlated it to the similar situation in Cinnamomeae, by which Cinnamomeae became an archetype of roses in the genus. In fact, seed insertion of Hulthemia, Hesperhodos and Platyrhodon is only basal, thus supporting the relationship between the three subgenera. Seeds do not grow on the side walls of the hip and thus seed insertion in these three subgenera is fundamentally different from the situation in Cinnamomeae (see Crépin, 1898). Molecular, anatomical, as well as reproductive, data (natural hybridization with Rosa-species) support the view of R. persica being a member of the genus Rosa, thus Hulthemia is best treated as a section, but not as a separate genus. Subgenus Hesperhodos Cockerell, 1913 Again the molecular data do not support the treatment of Hesperhodos at generic rank. At first glance the North American subgenus Hesperhodos seems to be most closely related to the central Asian subgenus Hulthemia. Both subgenera have prickly, chestnutlike hips and basal insertion of seeds. R. stellata has few leaflets (3–5), but which again are interpreted as the result of ecological adaptation to its dry habitat. However, our nrITS data also indicate a close relationship of the two subgenera. Morphologically, the two subgenera are separated by the existence of adnate stipules with divergent, rounded or broadened auricles in Hesperhodos. The most prominent morphological character of subgenus Hesperhodos is the complete absence of the disc. Since in both trees R. stellata is nested within species from subgenus Rosa, the elevation of Hesperhodos to generic rank © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) R. canina (VW355_2) R. pseudoscabriuscula (C1_1) R. jundzilii (VW356_2) R. dumalis (VW358_2) R. abietina (C9_2) R. sicula (VW161_6) R. abietina (C9_3) R. pseudoscabriuscula (C1_2) R. subcanina (VW141_2) R. sicula (VW161_1) R. tomentosa (VW142_2) R. micrantha (C2_4) R. subcanina (VW141_1) R. micrantha (C2_6) 97 R. montana (C8_1) 67 R. micrantha (C2_3) R. stylosa (C7_1) R. tomentella (VW146_1) R. mollis (VW152_7) R. pseudoscabriuscula (C1_3) R. sicula (VW161_3) R. rubiginosa (VW354_2) R. montana (C8_2) 100 R. sicula (VW161_2) R. tomentosa (VW142_1) R. columnifera (C3_1) R. abietina (C9_1) R. sherardii (VW309_1) R. multiflora R. chinensis II R. wichurana R. odorata R. roxburghii R. suffulta R. altaica R. helenae 56 R. banksiae 100 R. jundzillii (VW356_1) R. woodsii R. spinosissima R. gallica (VW101_2) R. ecae R. foetida 93 R. primula 100 R. laevigata R. sericea R. persica 63 R. stellata R. nitida R. arkansana ll R. bracteata R. palustris R. blanda R. rugosa 83 57 R. carolina 55 R. sertata 83 92 R. virginiana R. arkansana l R. beggeriana R. majalis 50 R. willmottiae R. multibracteata 75 R. laxa R. hugonis 99 Rubus idaeus 100 Rubus saxatilis 59 Rubus ulmifolius Rubus caesius 0.1 283 sect. Caninae sect. Synstylae sect. Indicae sect. Synstylae sect. Indicae subgen. Platyrhodon sect. Cinnamomeae sect. Pimpinellifoliae sect. Synstylae sect. Banksianae sect. Caninae sect. Cinnamomeae sect. Pimpinellifoliae sect. Rosa sect. Pimpinellifoliae sect. Laevigatae sect. Pimpinellifoliae subgen. Hulthemia subgen. Hesperhodos sect. Carolinae sect. Cinnamomeae sect. Bracteatae sect. Carolinae sect. Cinnamomeae sect. Carolinae sect. Cinnamomeae sect. Carolinae sect. Cinnamomeae sect. Pimpinellifoliae Figure 1. Bayesian inference of phylogenetic relationships of representatives of the genus Rosa: Monte Carlo Markov chain analysis based on nrITS-1 sequence data (using the general time reversible model of DNA substitution with gamma distributed substitution rates, 2 000 000 generations). The 50%-majority rule consensus tree was computed from 19 001 trees that were sampled after the process had reached stationarity. The topology was rooted with Rubus idaeus, R. saxatilis, R. ulmifolius and R. caesius. Numbers on branches are estimates for a posteriori probabilities. © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 284 V. WISSEMANN and C. M. RITZ 100 100 R. persica R. subcollina R. jundzillii R. subcanina R. caesia R. corymbifera R. montana 94 R. canina R. abietina R. stylosa R. chinensis I R. wichurana R. multiflora 94 R. chinensis II 95 R. odorata R. helenae R. arvensis R. gallica R. tomentella R. pseudoscabriuscula 56 R. columnifera 70 R. ‘mosqueta’ R. villosa R. micrantha R. glauca 89 R. mollis R. sherardii R. elliptica R. sicula R. rubiginosa 94 R. tomentosa R. agrestis R. inodora R. palustris R. rugosa R. roxburghii R. altaica R. woodsii R. carolina R. nitida R. beggeriana R. blanda R. arkansana II R. sertata R. arkansana I 83 R. laxa R. virginiana R. majalis R. spinosissima R. bracteata R. banksiae R. hugonis R. ecae R. sericea R. foetida R. willmottiae R. stellata R. suffulta 59 R. multibracteata R. primula R. laevigata sect. Caninae sect. Indicae sect. Synstylae sect. Indicae sect. Synstylae sect. Rosa sect. Caninae sect. Carolinae sect. Cinnamomeae subgen. Platyrhodon sect. Pimpinellifoliae sect. Cinnamomeae sect. Carolinae sect. Cinnamomeae sect. Carolinae sect. Cinnamomeae sect. Pimpinellifoliae sect. Bracteatae sect. Banksianae sect. Pimpinellifoliae sect. Cinnamomeae subgen. Hesperhodos sect. Cinnamomeae sect. Pimpinellifoliae sect. Laevigatae subgen. Hulthemia Rubus ulmifolius Rubus saxatilis 0.1 Figure 2. Bayesian inference of phylogenetic relationships of representatives of the genus Rosa: Monte Carlo Markov chain analysis based on sequence data of the 5¢-region of the cpDNA marker ‘atpB-rbcL IGS’ (using the general time reversible model of DNA substitution with gamma distributed substitution rates, 2 000 000 generations). The 50%-majority rule consensus tree was computed from 19 001 trees that were sampled after the process had reached stationarity. The topology was rooted with Rubus saxatilis and R. ulmifolius. Numbers on branches are estimates for a posteriori probabilities. © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) (e.g. by Boulenger or Hurst, see Bean, 1980: 121) is not justifiable. The morphological examinations by Lewis (1965) indicated that Hesperhodos is the only group with finely reticulate pollen surface, whereas the pollen sculpturing of all other species of Rosa is striate. Parmentier (1897: 110) analysed the pericycle of R. minutifolia Engelmann. He found shorter and oval cells differing from those in all other members of Rosa where the pericycle consists of elongate and fusiform cells. Ma et al. (1997) detected significantly fewer metacentric chromosomes in R. minutifolia than in the other sections. Taken together the morphological differences elucidated by Parmentier (1897) and Lewis (1965) and the genetic separation detected in this study, Hesperhodos is best treated at sectional level and not at subgeneric rank. Subgenus Platyrhodon (Hurst) Rehder, 1940 The third subgenus with prickly, chestnut-like hips with basal insertion of seeds is the monotypic subgenus Platyrhodon (R. roxburghii Tratt., 1823) but differs in a number of autapomorphic character states, which do not allow a satisfying placement based on morphology. Zielinski (1985) interprets the restricted distribution, the non-juicyness of the fruit and the disc structure as the most primitive characters in the whole genus. The number of leaflets per leaf is high (> 7–15) and it is the only species in the genus with peeling bark. Subulate auricles at the tip of the adnate stipules is a further character state which discriminates Platyrhodon from Hesperhodos. The molecular data are ambiguous. NrITS indicates a close relationship to R. gallica, which is unsupported by morphology. CpDNA places the species next to R. rugosa from the Cinnamomeae, again not supported by morphology, but supporting the view held by Ma, Crane & Byrne (1996, 1997) based on karyotypic relationships, Lewis & Basye (1961) based on cross compatibility and Kim (1994) from isoenzyme analysis (the latter two references are cited in Ma et al., 1997). The phylogenetic relationships of R. roxburghii remain uncertain. Hip morphology indicates the affinity to Hesperhodos and Hulthemia, although the basal insertion of the seeds is not as flat as in the other subgenera, but on a placenta-like structure, already mentioned by Crépin (1891). The functional most prominent character of the peeling bark, not known in any other species of the genus, has not been discussed in the literature. By cpRFLP, Takeuchi et al. (2000) proposed a separate placement of Platyrhodon in Rosa. Furthermore, crossability of R. roxburghii is difficult, again pointing towards the isolated position of R. roxburghii in the genus. Naturally, only R. ¥ micrugosa originated by hybridization between R. rugosa ¥ R. roxburghii, but pollen-, seed-parent direction is unknown. Wulff (1954) and Bean (1980) 285 report rare cases from the ornamental breeding in which R. roxburghii served as pollen donor. Schum, Hofmann & Felten (2002) established somatic hybrids with R. roxburghii. From the overall view of the data, Platyrhodon seems to be a morphologically isolated member of the subgenus Rosa, thus not deserving subgeneric rank, but should presumably be treated in a monotypic sectional status within subgenus Rosa. The data available at present contradict the view of Zielinski (1985) that R. roxburghii is the most basal, ancient rose species. Subgenus Rosa Section Pimpinellifoliae (DC.) Ser. 1825 Based on morphology, Pimpinellifoliae seems to be a rather loosely-defined group by their mostly single flowers without bracts, a high number of small, round leaflets per leaf, and intensive coloured, often black, hips (although R. gymnocarpa Nutt. from Cinnamomeae also has black hips). Currently the group of Pimpinellifoliae is still widely accepted in practice and literature. Mikanagi et al. (1995) recognized the occurrence of unique kaempferol and quercetin 4¢-glucosides in Pimpinellifoliae. However, recently more data have emerged, which raise doubts about the monophyletic status of the section Pimpinellifoliae (Matsumoto et al., 2000, 2001). R. sericea is morphologically distinct by flowers with mainly four petals and wedgeshaped prickles and extremely high numbers of leaflets (-17), but also has individuals with five petals. Its position is uncertain since both markers, cp- and nrDNA, place R. sericea in different positions. Whereas ITS combines it with R. laevigata (sect. Laevigatae) in a sister group relationship to members of the yellow-flowering Lutea-group of Pimpinellifoliae, cpDNA indicates a position of R. sericea within these Lutea-species. The Lutea group itself with R. ecae, foetida, hugonis, primula is clearly paraphyletic, but relationships are not resolved, although we can reject the view of Rowley (1961), that the bright yellow Austrian briar, Rosa foetida, is the nearest ally of R. spinosissima as was also shown by the extensive morphological study on Pimpinellifoliae by Roberts (1977). It is noteworthy that the proposal of Roberts (1977), based on morphology to transfer R. farreri and R. forrestiana from Pimpinellifoliae into Cinnamomeae, is supported by matK-analysis (Matsumoto et al., 2001). The most divergent group within the Pimpinellifoliae are the Scots roses themselves. R. spinosissima L. and its morphological twin R. altaica Willd., which can currently be separated morphologically only by size, are genetically completely distinct (both species are tetraploid, at least R. spinosissima seems to be allotetraploid: V. Wissemann, isozyme-analysis, unpubl. data). The unresolved position of R. altaica in the nrITS tree next to © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 286 V. WISSEMANN and C. M. RITZ R. suffulta as well as the placement of R. altaica in the atpB-rbcL IGS tree within the Carolinae–Cinnamomeae clade might point to a cryptic hybridization event between a R. spinosissima-derivate and a member of Cinnamomeae. On this assumption the occurrence of black hips on some morphotypes of R. altaica completely resembling the receptacles from R. rugosa Thunb. (Cinnamomeae) can be explained, as well as the biochemical relationships detected by Grossi et al. (1998). Interestingly, RFLP studies by Matsumoto et al. (1997) also combined R. rugosa (Cinnamomeae) with R. spinosissima (Pimpinellifoliae). De la Roche (1978) mentioned that all natural hybrids known so far from Pimpinellifoliae are by R. spinosissima, and always with R. spinosissima as the pollen parent. However, molecular evidence for this assumption is currently lacking. Section Caninae (DC.) Ser. 1825 In Europe, after the retreat of the last glaciation, dog roses (sect. Caninae) spread over the landscape. Because of their vigorous allopolyploid constitution (Wissemann, 2002) they were able to take the area by force and started to establish ecological types in different niches. This ecological differentiation within Caninae can be seen for example in the differentiation of the ecological ‘L-’ and ‘D-type’ roses (Christ, 1873, 1884; Reichert, 1998; Wissemann, 2000). Dog roses have been identified as allopolyploids (Wissemann, 2000, 2002) but are characterized as a natural evolutionary unit by the autapomorphic characters of a specific nrITS-type and the heterogamous mode of reproduction via Canina-meiosis (Täckholm, 1920, 1922; Blackburn & Harrison, 1921; Lim et al., 2000). Given the specific nrITS-type, this type is distinct, but closely related to sequences from members of the Synstylae and Indicae. Currently we cannot draw the conclusion that this is a hint for the geographical or seed paternal origin of the Caninae, since characters of these two sections, e.g. agglutinated styles and entire sepals, are not represented in the dog roses. Further insight from biochemical and molecular data is needed here. However, Zielinski (1985) claimed that members of Indicae and Synstylae are the closest relatives to R. canina from sect. Caninae based on morphology. From the cpDNA data, Caninae is split into two major clades, one with eglandular or with non-odorant glands and one with odorant (wine and terpentinescented) glands. Interestingly, these clades are split by a clade including R. gallica from sect. Rosa and members of the Synstylae-Indicae-group, which again supports a close relationship of Caninae with Synstylae. The unique heterogamous meiosis has led to numerous opinions about the mode of reproduction in this section including apomixis. However, Wissemann & Hellwig (1997) were able to show, that sexual repro- duction via heterogamy is the predominant way of reproduction in this section, although apogamy cannot be excluded in certain cases (e.g. Fagerlind, 1940; Flory, 1950; Wissemann & Hellwig, 1997; Werlemark et al., 2000). Section Rosa (= sect. Gallicanae (DC.)) Ser. 1825 Section Rosa is a monotypic section with the European and west Asian species R. gallica L., 1759 (Wissemann, 2003a). All other OTUs given species rank from this section are long cultivated hybridogenic, synanthropic species of which natural populations are not known (de la Roche, 1978). From molecular data the position of R. gallica is uncertain. The close relationship of R. gallica to the upper Caninae-clade in the cpDNA-dataset is morphologically supported by lobed or pinnate sepals and the occurrence of non-odorant glands. However, R. gallica is a homogamous species with regular meiosis and does not harbour the specific Caninae-nrITS (Wissemann, 1999). We still believe this species, or an unknown and extinct close relative, to be one partner during the process of allopolyploidization of the Caninae, which has introduced the morphological character of pinnate sepals. The possibility of this has been shown for the origin of R. jundzillii (Wissemann, 1999). Section Carolinae Crép. 1891 Section Carolinae is completely dispersed within the clade of roses from sect. Cinnamomeae, supporting the view of Wylie (1954) who treated both groups as consectional. Morphologically only the non-persistence of sepals separates Carolinae from the Cinnamomeae, a character used in the Caninae to separate closely related species and subject to dominant inheritance (Ritz & Wissemann, 2003b). Based on anatomical data, Parmentier (1897) had already claimed consectional status for Carolinae and Cinnamomeae. Grossi et al. (1998) analysed flavonoid and enzyme polymorphisms of Carolinae and Cinnamomeae and were able to show that again Carolinae grouped with the Cinnamomeae. However, Grossi et al. (1999) detected a specific anthocyanin (pelargonidin-substituted) present in Carolinae but not in Cinnamomeae. MatK-analysis by Matsumoto et al. (1998) also combined the two sections. From the knowledge of character inheritance in Caninae (Wissemann, 2000; Ritz & Wissemann, 2003b), we do not expect that the species in Carolinae, if included into the Cinnamomeae, represent one clade of closely related species based on presence of deciduous sepals. Species with deciduous sepals in the Caninae are completely mixed in the section. Our analysis of the cpDNA (as well as nrITS sequences) support this view; species with deciduous sepals do not form a monophyletic group in the trees (Figs 1, 2). Section Carolinae is here included in section Cinnamomeae. © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 PHYLOGENY OF ROSA (ROSOIDEAE, ROSACEAE) Section Cinnamomeae (DC.) Ser. 1825 (incl. section Carolinae Crép., 1891) Section Cinnamomeae is by far the largest section within the genus with c. 80 species. After inclusion of the Carolinae it harbours about 50% of all species in the genus. Differentiation within this section is high and there is much variability between the described species. Ecological and subsequent genetic differentiation occurred within R. palustris Marsh., 1785, that is clearly separated by the cp-sequence but nested within Cinnamomeae by nrITS sequences. Our data suggest from the nrITS sequence a closer relationship of Cinnamomeae-Carolinae to the subgenera Hulthemia, Platyrhodon and Hesperhodos, which Parmentier (1897) already had assumed by the ‘basi-parietal insertion of seeds’. However, the interpretation of Parmentier (1897), that these three subgenera have basiparietal insertion of seeds is wrong, as already pointed out by Crépin (1898). Hulthemia, Platyrhodon and Hesperhodos have a pure basal insertion of the seeds at the bottom of the hip, not on the walls (Herring, 1925). Affinity of parts of Pimpinellifoliae to the Cinnamomeae was shown by Grossi et al. (1998) from the chemical and biochemical pattern that can be observed in the nrITS analysis and especially the cpDNA analysis. It is noteworthy that Grossi et al. (1998) found a close relationship between the Pimpinellifoliae-species, R. altaica Willd., and the Cinnamomeae-Carolinae-clade. We found the same connection in the atpB-rbcL IGS-tree, which indicates that conspecificity of R. spinosissima L. and R. altaica is doubtful (see further remarks under sect. Pimpinellifoliae). Section Synstylae DC., 1813 Grossi et al. (1998) found the Synstylae to be one of the best circumscribed groups with respect to biochemical data. Unfortunately, they did not integrate members of the Indicae into their study. Our data, both cpDNA and nuclear DNA, show consectionality of Synstylae and Indicae. In the analysis of Japanese wild roses by Wu et al. (2000) matK-DNA again merged both sections together. Mikanagi et al. (1995) showed similar flower flavonoid composition for Synstylae and Indicae, but Cao, He & Li (1996) pointed to the extreme differences in carotene content between the two sections (Synstylae on average > 6 mg/100 g; Indicae on average < 0.4 mg/100 g). Based on morphology the only taxonomically useful difference is the agglutinated style of the Synstylae but with respect to all other characters, the morphological character of columnated styles becomes doubtful as an autapomorphic character state. From the point of history of science it is noteworthy, that this character was the first and oldest morphological character proposed in the classification of the whole genus (Seringe, 1818). The only European 287 species of Synstylae, R. arvensis Huds. appears to be sister to the Synstylae-Indicae-clade in the cp-tree. Section Indicae Thory, 1820 The Chinese section Indicae, with only three species (R. odorata (Andrews) Sweet, 1818, R. gigantea Collet ex Crép. 1888 and R. chinensis Jacq. 1768), is clustered with Synstylae roses in both data sets. Shishkin & Yuzepchuk (1971: 331) already pointed to the close relationship of Indicae to Synstylae, which both have exserted styles, the first group only lacking the connection of the styles. For further remarks, see above (Synstylae). Section Banksianae Lindl. 1820 This section harbours two species (R. banksiae Ait., 1811, R. cymosa Tratt., 1823), but the taxonomic status of the latter is disputed. By RAPD-analysis Millan et al. (1996) assigned R. banksiae as a member of subgenus Rosa. Morphologically the section is characterized by free and deciduous stipules, nonpubescent receptacles and branchlets (difference to sect. Bracteatae) and reflexed and deciduous sepals (difference to sect. Laevigatae). The receptacle is smooth and not bristly as in sect. Laevigatae. The taxonomic position is completely unresolved. In all phylogenetic trees, R. banksiae is placed within or next to the Cinnamomeae-Carolinae-clade, in the atpB-rbcL Bayesian tree next to Bracteatae (also by Wu et al., 2000, 2001 using matK sequences and nrITS, respectively), but not with Laevigatae. Thus the morphological characterization by deciduous stipules indicates not synapomorphy but convergence or plesiomorphy. As in subgenus Hesperhodos, Ma et al. (1997) found fewer metacentric chromosomes than in other sections. Section Laevigatae Thory, 1820 There is only one species in this monotypic Chinese section, R. laevigata Michx., 1803. The bristly hip discriminates the species from sect. Banksianae, the difference from Bracteatae is by non-pubescent branchlets. Morphologically this section is united in a larger group with Banksianae (e.g. already included into this section by Déséglise, 1877: 65 ‘R. sinica Murray’) and Bracteatae by the free and deciduous stipules. However, as in Banksianae, molecular classification does not support a coherence based on this morphological character. In the nrITS tree, R. laevigata is nested within members of section Pimpinellifoliae, contradicting the view of de la Roche (1978) of Laevigatae being the closest relative to Banksianae. Section Bracteatae Thory, 1820 Again this presumable monotypic south-east Asian section (R. bracteata Wendl., 1798, uncertain taxonomic status of R. clinophylla Thory) is morphologi- © 2005 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society, 2005, 147, 275–290 288 V. WISSEMANN and C. M. RITZ cally characterized by free and deciduous stipules (as Laevigatae and Banksianae), but differs in pubescent or tomentose young branchlets and receptacles from these two sections. The phylogenetic position is completely uncertain based on cpDNA and nrDNA data. Whereas the ITS data indicate a position within the Cinnamomeae-Carolinae clade, cpDNA places it unsupported as sister to R. banksiae (also by Wu et al., 2000), nested within the Pimpinellifoliae clade. PERSPECTIVES As presented above, our understanding of evolution and phylogenetic relationships within the genus Rosa is on the one hand contradictory, and on the other in its infancy. The enormous phenotypic, genotypic and ecological variability and plasticity, influenced by evolutionary processes such as hybridization, currently restrict a taxonomic revision of the genus. From the classical taxonomic view, knowledge of the genus Rosa suffers from two problems. First, the European section Caninae is such a problematic taxonomic and evolutionary group, that rhodology is a eurocentric field of science. The intensive work on dogrose species since Linnaean times made Rosa into a genus completely ‘oversystematized’ for European species, but neglecting the bewildering diversity outside Europe. Second, we lack extensive knowledge of rose taxa from the centres of diversity in central Asia, necessary to understand the intrageneric relationships. Additionally, we do not only need more data, but a deeper understanding of the processes underlying the evolutionary history of the markers used for classification. This must include more detailed studies on the specific marker systems (e.g. Álvarez & Wendel, 2003; Wissemann, 2003b) and their performance under selective forces, as well as breeding experiments (e.g. Ritz & Wissemann, 2003b) to understand character inheritance and impact of ecological factors on character expression. For the reconstruction of phylogenetic relationships at species level we need a better resolving molecular marker. Nr-ITS as well as the cp-DNA currently used in Rosa-studies give insight into questions of consectionality of sections, but do not resolve deep species relationships. ACKNOWLEDGEMENTS The work was funded by a grant from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) to V.W. (Wi 2028-1). We thank the Europarosarium Sangerhausen and the Rosensammlung Kassel-Wilhelmshöhe for providing plant material. Support by the VDR Stiftung Europa Rosarium Sangerhausen is gratefully acknowledged. We thank F. H. Hellwig (Jena) for allowing work in a molecular laboratory. We like to thank the two anon- ymous referees which helped to improve significantly the quality of the paper by raising questions which are lost if one is too much in the subject. REFERENCES Álvarez I, Wendel JF. 2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogenetics and Evolution 29: 730–743. Bean WJ. 1980. Trees and shrubs hardy in the British Isles. London: Murray, Vol. 4, 1–73. 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Springer-Verlag 2003 Abstract. Artificial F1 hybrids within dog-roses (Rosa section Caninae (DC.) Ser.) have been assessed for expression of morphological characters with regards to the actual taxonomy applied. In the mostly pentaploid members of the section the unique heterogamous Canina-meiosis leads to matroclinal inheritance of characters by transmitting 4/5 of the genetic information via seed donor whereas 1/5 is provided by the pollen donor. Evaluation of phenotypic variability revealed that the two taxonomically relevant characters ‘‘widening of the orifice’’ and ‘‘persistence of the sepals’’ are statistically significant controlled by the pollen donor. Reciprocal crossings confirmed the same pattern. One possible explanation is that this phenomenon might be subject to genomic imprinting mechanisms. The morphological analysis gives clear evidence that conventional taxonomical concept is artificial and does not reflect the evolutionary patterns among dog-roses. Key words: Rosa, Rosaceae, dog-roses, hybridisation, heterogamy, imprinting, Arabidopsis, speciation. Introduction The enormous phenotypic plasticity of the genus Rosa L. has frightened numerous plant systematists (for an overview see Wissemann, in press). Especially within the section Caninae (DC.) Ser. taxonomy remains difficult for a number of biological reasons (Wissemann 2000a). The actual taxonomy of dog-roses (Rosa sect. Caninae) is based on a synthetic model (Wissemann 2000a) which allows the identification of species by a set of combined and correlated characters. Two morphologically well defined base types (L-Type and D-Type) are distinguished in this model (Christ 1873, Dingler 1907, Reichert 1998). Rosa species which belong to the L-type (laxus, loose) are characterised by a lax growth habit, deciduous sepals and a narrow orifice of the hips (diameter < 1 mm). Plants which are grouped within the D-type (densus, dense) show a compact growth habit, persistent sepals and a wide orifice. The system suffers from a very narrow and strict definition of the edge types by creating a rather broadly circumscribed complex of L/D- types, which contains numerous intermediate forms. As already outlined by Wissemann (2000a) this L/D model is a highly artificial system which serves as a system to classify morphospecies but does not necessarily reflect phylogenetic relationships and evolutionary history. Contrary to the elusive phenotypic plasticity, section Caninae is clearly defined by the unique 214 C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance meiotic behaviour which is characteristic for all members of this section, the Canina-meiosis (Täckholm 1920, 1922). With a base number of x ¼ 7 the pentaploid somatic cells contain 7 bivalents (14 chromosomes) and 21 univalents (21 chromosomes). After meiosis the fertile pollen grain harbours 7 chromosomes, whereas the egg cell contains 28 chromosomes. This bias leads to a pronounced matroclinal inheritance whereby 4/5 of the nuclear genome is provided by the seed parent and only 1/5 by the pollen parent. The occurrence of interspecific hybridisation within section Caninae is widely known (Keller 1931, overview by Wissemann and Hellwig 1997). However, the identification of hybrid offspring is extremely complicated due to the lack of differential characters to discriminate the taxa. Despite the strong interest in hybridisation events within sect. Canina, experimental crossings are scarce (Dingler 1908, Hurst 1927, Gustafsson 1944, Feuerhahn and Spethmann 1995, Wissemann and Hellwig 1997, Werlemark et al. 1999). Evidence from artificial crossings with regard to the occurrence of differential characters between the well defined L- and D- type is only available from Gustafsson (1944) with respect to presence of hairs, odorant glands and sepal persistence. The reproductive fitness of hybrids is also controversially discussed. Keller (1931) described natural hybrids of dog-roses and assessed low to none reproductive success with regard to hip maturation and the number of grains per hip. Contrary, Eigner and Wissemann (1999) were able to demonstrate, that even an intersectional hybrid is able to produce numerous fertile seeds. Gustafsson (1944) observed differences with regards to fertility between reciprocal crossings. Wissemann and Hellwig (1997) compared reproductive success (number of grains per hip and seed viability) between the outcomes of apogamous, autogamous, geitonogamous and xenogamous crossings (F1). In the study presented here the reproductive success (number of grains per hip and seed viability) is compared between the bushes grown from the crossings of Wissemann and Hellwig (1997). Additionally, the interspecific crossings are investigated in detail with regard to the differential characters which distinguish the parents of the hybrids. The following aims are addressed:
Which morphological characters are shown by hybrids of artificial crossings between different dog-rose species with regards to the actual taxonomy?
Does offspring of crossings between L- and D-types morphologically cluster between the two narrowly defined types and thus represent L/D-types?
Is the strong matroclinal inheritance reflected in the distribution of morphological characters of the outcomes of crossings?
Do hybrids differ significantly in reproductive success (number of grains per hip and viability of seeds) from their parents? Do they express heterosis or hybrid depression?
Do F1-outcomes of autogamous, geitonogamous and xenogamous crossings show significant differences with regard to reproductive success (number of grains per hip and viability of seeds)? Material and methods Crossing experiments were carried out in 1996 (Wissemann and Hellwig 1997) for R. canina L., R. corymbifera Borkh., R. rubiginosa L., R. elliptica Tausch and R. micrantha Borr. ex Sm. The taxonomy followed Klášterský (1969) as well as Henker and Schulze (1993). 139 plants produced by apogamy, autogamy, geitonogamy, xenogamy and hybrids were equally treated and randomly planted in the Botanical Garden of the Georg-AugustUniversität Göttingen, Germany in 2002. Hipbearing twigs of all investigated plants were gathered and the specimens were deposited in the herbarium Wissemann (wis). Differential characters such as presence of hairs at the lower leaf surface and the rachis, presence of glands on leaf surface and pedicel were examined in the herbarium specimens. If possible ten hips were harvested from every shrub. Diameter of the orifice and persistence of sepals were assessed directly in the field. Number C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance of grains per hip were counted and the fertility of seeds were tested using Fagerlind’s test in relaxed water (Fagerlind 1940, 1944). This quick and easy test was shown to yield comparable results for large samples as e.g. TTC based methods (Wissemann 1995) and allows in contrast to destructive or chemical tests further experiments with the harvested seed. The statistical analyses were performed with SPSS 10.0. Analyses of variance (GLM) or alternatively the nonparametric Kruskall-Wallis test was performed to investigate differences of the number of grains per hip and seed fertility between species and crossing types. Linear regression was used for the analysis of the diameter of the orifice. Plants with less than three hips were excluded from the statistical analyses. Results Morphology. The results of the morphological analysis of distinctive characters are shown for all parental species and all artificial F1-hybrids in Table 1. The offspring of the interspecific crossings is not reciprocal. Generally, hybrids strongly resemble the seed parent in their vegetative habit. The hybrids are not distinguishable from the species the seed parent belongs to, with respect to the presence of hairs or glands at leaf surface, rachis or pedicels (Table 1). In contrast, hybrids may differ in fruit characters (sepal persistence and diameter of orifice) from the seed parent. In the case of different character states for sepal persistence and the diameter of orifice between seed and pollen parents, the offspring clearly resembles the character state of the pollen parent. For example the hybrid R. corymbifera · rubiginosa does not possess odorant glands neither on the leaf surface nor at the pedicel but at least the rachis is densely hairy as in R. corymbifera. The hip of the hybrid bears persistent sepals and the diameter of the orifice exceeds 1,0 mm by far as in R. rubiginosa. In the reciprocal case (R. rubiginosa · R. corymbifera) the hybrid expresses odorant glands on the leaf surface as well as at the pedicel, whereas the diameter of orifice is clearly below 1,0 mm (Table 1). A linear regression between the diameter of orifice (Fig. 1 and Fig. 2) was conducted 215 including hybrids and the parents respectively. This analysis demonstrates a significant correlation between the diameter of the orifice of the pollen parent and of the respective offspring. (R2 ¼ 0.678, p ¼ 0.023). Nearly 70% of the variation of this character is explained by the variation of the pollen parent. A non significant, very weak correlation was detected between the diameter of the orifice of the hybrid and the respective seed parent (R2 ¼ 0.209, p ¼ 0.303). The state of the sepal persistence of the hybrids corresponds exactly with the state of sepal persistence of the respective pollen parent with one exception (R. rubiginosa · micrantha). Hybrid seed set and fitness. The total number of seeds per hip does not differ significantly between hybrid plants and the different modes of pollination (KruskallWallis, v23 ¼ 1.15, p ¼ 0.765). Furthermore, no statistically significant differences of the percentage of infertile seeds per hip between hybrids and the different modes of pollination were found (ANOVA, F2,33 ¼ 0.577, p ¼ 0.587). Discussion Hybrid offspring of artificial crossings among dog-roses strongly resemble the seed parent in the vegetative habit. Hybrids without hips are not distinguishable from the mother plant. This pattern is very reasonable taking into account the matroclinal mode of inheritance of dog-roses. The characters ‘‘hairyness of leaves’’ and the presence of glands at the leaf surface and pedicels as well as the epicuticular wax sculptures (Wissemann 2000b) are inherited maternally; the paternal influence of only one fifth of the somatic chromosome number is not recognisable by morphology. Contrary to the matroclinal inheritance, the diameter of the orifice and the behaviour of sepals during hip ripening do not follow this mode of inheritance. The investigated hybrids express this character in the same way as the pollen parent, regardless which character state is expressed. It 216 C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance Table 1. Key characters and the diameter of the orifice of five species of Rosa sect. Caninae and their interspecific hybrids, data marked by an asterisk are excluded from the linear regression, because fewer than 3 hips per plant could be gathered Hairs at rachis and lower leaf surface Odorant glands at leaf surface and pedicel Odorant glands at the pedicel Persistence of sepals Diameter of orifice [mm] number of plants and standard error R. canina L. absent absent absent deciduous R. corymbifera Borkh. present absent absent deciduous R. rubiginosa L. present present present persistent R. micrantha Borr. ex Smith. present present present deciduous R. elliptica Tausch present present absent persistent R. canina · corymbifera absent absent absent deciduous R. corymbifera · canina present absent absent deciduous R. canina · rubiginosa absent absent absent persistent R. rubiginosa · canina present present present deciduous R. rubiginosa · corymbifera present present present deciduous R. corymbifera · rubiginosa present absent absent persistent R. rubiginosa · micrantha present present present persistent R. micrantha · rubiginosa present present present persistent R. elliptica · rubiginosa present present absent persistent R. canina · elliptica absent absent absent deciduous 0.55 n = 7; se = 0.05 0.71 n = 3; se = 0.10 1.23 n = 6; se = 0.10 0.70 n = 4; se = 0.09 0.85 n = 1; 0.56 n = 3, se = 0.02 0.4* n=1 1.00 n=1 0.6* n=1 0.65 n=1 1.28 n = 2; se = 0.13 0.58 n=1 0.84 n=1 0.8* n=1 0.9 n= 1 is remarkable that the outcomes of the here investigated crossings between species of the L- (low diameter of the orifice and deciduous sepals) and D-type (wide diameter of the orifice and persistent sepals) are not totally intermediate (L/D-types), but their sepal persistence and the diameter of the orifice corresponds to the L-type when the pollen parent was an L-type or to the D-type, when the pollen parent was a D-type. Results from the C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance 217 diameter of the orifice of the hybrid [mm] 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 diameter of the orifice of the pollen parent species [mm] Fig. 1. Relationship between the diameter of the orifice of the pollen parent species and the hybrid [mm]; linear regression: y¼ 0.795x+0.073; R2 ¼ 0.0678, p ¼ 0.023 diameter of the orifice of the hybrid [mm] 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 diameter of the orifice of the seed parent species [mm] limited number of hybrids in our study is well supported by data from existing literature, where this morphological phenomenon has been unrecognised in its importance and implications when it was described by e.g. Gustafsson (1944) for a number of experimental crossings within section Caninae as well as for intersectional hybrids. The same pattern 1,3 Fig. 2. Relationship between the diameter of the orifice of the seed parent species and the hybrid [mm]; linear regression: y ¼ )0.378x+1.128; R2 ¼ 0.209, p ¼ 0.303 was recognised by Graham and Primavesi (1993) for 13 assumingly intrasectional natural hybrids of section Caninae in Britain, as well as by Feuerhahn and Spethmann (1995) for an artificial intersectional hybrid between R. nitida Willd. (sect. Carolinae Crépin, seed parent) and R. rugosa Thunb. (sect. Cinnamomeae DC., pollen parent). 218 C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance The separate occurrence of both characters (diameter of the orifice and sepal persistence) has never been described for a species (Henker 2000). Thus it is likely that the persistence of sepals and the diameter of the orifice are influenced by the same gene or gene-complex or are at least coupled. There is no formal genetic explanation for this mode of inheritance, because a dominant/recessive relation of the character is not observed and maternal inheritance of organelles was shown by Matsumoto et al. (1997) for the intersectional hybrid R. · fortuniana Lindl. (R. laevigata Michx. (sect. Laevigatae), seed parent · R. banksiae Regel (sect. Banksianae), pollen parent, as well as by Matsumoto et al. (2001) for R. californica ‘Plena’. We sequenced both, experimental as well as natural hybrids of Rosa sect. Caninae (data not shown) and found the same pattern of matroclinal cpDNA inheritence in the system under study here. By contributing the genetic information from the single chromosome set from a pollen grain the persistence of sepals is switched in a 0/1 mode to either the D- or the L-type. The gene or the genes encoding for the diameter of the orifice and sepal persistence are located within the 7 chromosomes of the pollen grain and thus they belong to the bivalent forming group of chromosomes. The strong paternality of these characters may be explained by epigenetic phenomena including genomic imprinting. Genomic imprinting has been described in mammals and plants (Alleman and Doctor 2001). Genes that are targets for imprinting in plants are with the exception of the MEDEA gene in Arabidopsis involved in the development of the triploid secondary endosperm, where the balance between paternal and maternal genes is controlled by imprinting (Alleman and Doctor 2001). In angiosperms, haploid organisms are easily created from anther culture and the presence of both parental genomes seems not to be necessary to develop complete plant bodies, thus imprinting may be restricted to the endosperm which is dependent from both parental genomes (Alleman and Doctor 2001). This may not be true for roses of sect. Caninae. Producing haploid cultures from Rosa anthers was not possible until now (Wissemann et al. 1996, 1998). Probably, the 7 chromosomes of the pollen parent are not sufficient to produce a plant. It is still unknown why paternal distribution of orifice diameter and persistence of sepals should be controlled by genetic imprinting. The evolutionary significance of these two characters is not obvious. Presumably these characters are linked to other unknown characters which are targets for imprinting. However, imprinting as an active process causes expenses and so must be exposed to selective pressure. In the scenario of imprinting the male alleles silence four female ones. In contrast to dioecious organisms it remains unclear why selective pressure favours sex-related characters in hermaphroditic plants. To answer the question, genetic evidence (methylation patterns) for imprinting events needs to be tested. An alternative explanation for this pattern of paternal inheritance may be a heterozygous situation of 2 · 2 co-dominant alleles in the egg cell caused by balancing selection. If the pollen parent is homozygous (that may be reasonable due to the narrowly circumscribed edge species), the pollen parent would turn the balance to the expression of the paternal allel. Not in accordance to this hypothesis are the observations of Feuerhahn and Spethmann (1995), who observed the same pattern of patroclinal inheritance of sepal persistence in crossings of two diploid rose species. The strictly co-dominant inheritance does not explain the occurrence of intermediate forms of the L/D-type in nature, either. Summing up, at least one allele for sepal persistence and the diameter of the orifice is located on the chromosomes of the bivalent forming chromosomes of the pollen grain. Grant (1976) concluded that the bivalents carry the variation between the species, because of their normal meiotic pairing behaviour and the capability for crossing over, whereas the univalents contain the constant characters for the respective group of roses C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance 219 Table 2. Number of seeds per hip and the percentage of infertile seeds, values given as mean ± standard error for shrubs produced by different crossing types Seed number per hip Percentage of infertile hips Autogamy n=2 Geitonogamy n=7 Xenogamy n = 19 Hybrids n=9 11.7 ± 1.8 27% ± 13 11.8 ± 2.3 32% ± 2 11.4 ± 0.9 34% ± 4 9.8 ± 1.2 44% ± 11 Table 3. Hybrids between different subsections of sect. Caninae and species with identical character distribution concerning presence of glands and hairs on leaf surface and persistence of sepals and the diameter of the orifice Hybrid Corresponding species R. R. R. R. R. R. R. Rosa Rosa Rosa Rosa Rosa Rosa Rosa canina · rubiginosa rubiginosa · canina rubiginosa · corymbifera corymbifera · rubiginosa canina · elliptica canina · corymbifera corymbifera · canina dumalis Bechstein, R. subcanina (H. Christ) R. Keller micrantha, R. columnifera (Schwertschl.) Henker & G. Schulze micrantha, R. columnifera caesia Sm., R. subcollina (H. Christ) R. Keller dumalis, R. subcanina canina corymbifera (subsect. Vestitae H.Christ, subsect. Rubigineae H.Christ, subsect. Tomentellae H.Christ and subsect. Caninae). This is consistent with the distribution of the characters studied here, because the L- and the D-type occur in all subsections of sect. Caninae (Wissemann 2000a). Thus hybrids between L- and D-types of different subsections strongly resemble morphologically described species (Table 3), because Rosa species are always defined by a combination of several characters. Nevertheless, the conclusion that hybrids between distinct species are morphologically undistinguishable with other described species (L/Dtypes) remains unsatisfactory without explicit knowledge about the genetic constitution of the respective species and the resembling hybrids. A cluster analysis using AFLP data could shed light onto these relations. Presently we can only detect hybrids with for example a strongly Rosa micrantha -like appearance. Keller (1931) described hybrids of different members of sect. Caninae from field observations. The hybrid R. eglanteria L. · R. canina L. ssp. dumetorum Thuill. is characterised by the same characters as the artificial hybrid R. rubiginosa · R. corymbifera investigated here. The leaves are hairy and bear odorant glands, the pedicel is glandulous and sepals are reflexed and deciduous (Keller 1931). The same correspondence we found also between R. eglanteria L. · R. canina L. ssp. R. vulgaris Gams and the corresponding artificial hybrid R. rubiginosa · R. canina. Keller (1931) described the natural hybrid as a plant with hairy and glandulous leaves with gland bearing pedicels and reflexed and deciduous sepals. This description completely agrees with the characters found in the artificial hybrid. The fertility of the hybrid outcomes of sect. Caninae hybrids is in general discussed controversially (e.g. Christ 1873, Keller 1931). However, Gustafsson (1944) was able to show, that no general assumption is possible here, each hybridisation appearing in its effects as a singular fortuitous event. Keller (1931) reports for R. eglanteria L. · R. canina L. ssp. R. vulgaris Gams that soon after flowering hips are deciduous and sterile. Also R. micrantha Sm. · rubiginosa L. develops only very few 220 C. M. Ritz and V. Wissemann: Male correlated non-matroclinal character inheritance hips containing only 1–2 grains per hip (Keller 1931). These observations are contradictory to our findings. We could not detect any statistically significant difference neither in the total number of seed per hip nor in the percentage of fertile seed per hip between the hybrid outcomes and the parental species. The total number of hips per shrub was not investigated because the plants are still too young and flowered in 2001 for the first time. Hybrids do not suffer from a hybrid depression. This seems reasonable taking into account that the entire section Caninae is of hybrid origin (Täckholm 1922) and the genetic distances between the species is very low (Wissemann 2000a). Probably, Keller was searching for plants with low fertility, because this was one of his obvious characters to identify a hybrid. The artificial hybrids produced here would be probably not detectable in the field, because of their extreme resemblance or even identity to other described species (Table 3). The F1 outcomes of the autogamous, geitonogamous and xenogamous crossings do not differ in their reproductive success. Plants that arose from these crossings show no inbreeding depression. These results show that Rosa sect. Caninae is able to successfully reproduce sexually. Interspecific hybrids do not show any disadvantages and may become established easily, some of them are already presumably described as separate species. These observations make clear that the taxonomy of Rosa sect. Caninae does not sufficiently reflect patterns and processes of variation, because the understanding of the genetic background of the hybrids and character inheritance is still in its infancy. We like to thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for financial support of this study by a grant to V.W. (Wi 2028-1) under the DFG priority programme 1127 ‘‘Radiations – Origins of Biological Diversity’’. We express our gratitude to F.H. Hellwig (Jena) and G. Theißen (Jena) for stimulating discussion of the results as well as to two anonymous reviewers, who helped to improve the manuscript. The help of S.R. Gradstein (Göttingen) who supports our studies by providing the fields for the experimental rose collection in the Göttingen Botanical Garden for the next years is greatfully acknowledged. We thank the staff of the Botanical Garden Göttingen for their kind help and cooperation during this study. References Alleman A., Doctor J. (2000) Genomic imprinting in plants: observations and evolutionary implications. Pl. Molec. Biol. 43: 147–161. Christ H. (1873) Die Rosen der Schweiz. Verlag H. Georg, Basel. Dingler H. (1907) Versuch einer Erklärung gewisser Erscheinungen in der Ausbildung und Verbreitung der wilden Rosen. Mitt. Naturwiss. Vereins Aschaffenburg 6: 1–38. Dingler H. (1908) Neuere Beobachtungen in der Gattung Rosa. Bot. Jahrb. 40: 100–108. Eigner A., Wissemann V. 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Caninae (DC.) SER.) 6. Manuskript IV: Ritz, C. M., Maier, W. F. A., Oberwinkler, F. & Wissemann, V. (im Druck, akzeptiert am 03. März 2005): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycological Research. 54 Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 1 Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts Ritz, C.M.1§; Maier, Wolfgang. F.A.23§, Franz Oberwinkler2 & Volker Wissemann1 1 Friedrich-Schiller-Universität Jena, Institut für Spezielle Botanik, Philosophenweg 16, D07743 Jena, Germany 2 Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Lehrstuhl für Spezielle Botanik und Mykologie, Auf der Morgenstelle 1, D-72076 Tübingen, Germany 3 Present address: Department of Genetics, FABI, University of Pretoria, Pretoria 0002, South Africa 1 address for correspondence: christiane.ritz@uni-jena.de § The first two authors contributed equally to the paper. Abstract Rust fungi in the genus Phragmidium are frequent pathogens of both wild and cultivated roses. We investigated the occurrence and relationships of rusts on dogroses, Rosa sect. Caninae (Rosa canina, R. corymbifera and R. rubiginosa) in Germany. Two Phragmidium species, P. mucronatum and P. tuberculatum, were found and they were able to infect each of the three dogrose species examined. However, the overall infection of R. rubiginosa was significantly lower, which could be important for rose breeding. Despite overlapping host ranges, the evolutionary background of P. tuberculatum and P. mucronatum is quite distinct. Phylogenetic analyses of the D1/D2 region of the large ribosomal subunit suggest that P. mucronatum shares a common ancestor with other rose rusts, whereas P. tuberculatum evolved from a Rubus-Sanguisorba rust clade and must have undergone a host shift to Rosa spp. Keywords rust fungi, Phragmidium, Phragmidiaceae, dogroses, Rosa, Rosaceae, host-parasite interaction, nrLSU, host switch Introduction The predominantly Northern hemispheric rust genus Phragmidium comprises about 60 species (Cummins & Hiratsuka 2003). Phragmidium species, like the entire family Phragmidiaceae, have an autoecious life cycle and are restricted to rosaceous hosts, with only two documented exceptions from the USA (Peterson & Cronin 1967). On dogroses four Phragmidium species can be found in Central Europe, viz. P. fusiforme J. Schröt., P. mucronatum (Pers.) Schltdl. P. tuberculatum J. Müller and P. rosae-pimpinellifoliae (Rabenh.) Dietel. However, the taxonomic history of many species is rather complex (see Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 2 Dietel 1905a,b) and especially the Phragmidium species on roses, “Formenkreis Phragmidium mucronatum”, were said to have overlapping morphological characters (Gäumann 1959). This casts doubt onto the broad host ranges stated for P. mucronatum and P. tuberculatum since these species could have been misidentified due to excessively broad morphological species concepts (compare Newcombe 2003). The Eurasian dogroses (Rosa L. sect. Caninae (DC.) Ser.) are a morphologically and genetically highly diverse group, about 30 species of which can be found in Central Europe (Klásteršk? 1969; Henker & Schulze 1993). Their most striking feature is a unique meiotic behaviour, the so-called “Canina-meiosis” (Täckholm 1920, 1922), where the pentaploid genome is distributed unequally during meiosis resulting in haploid pollen grains and tetraploid egg cells. After fertilization the pentaploid state is restored and results in full sexual reproduction (Wissemann & Hellwig 1997). During the course of this study we investigated which rust species can be found on the three most common dogrose species in Germany (Rosa canina L., R. corymbifera Borkh. and R. rubiginosa L.). We examined the frequency of the occurring rusts and whether these rust species show any infection preference for a particular rose host. By means of molecular phylogenetic analyses based on nrLSU sequence data we tested whether the morphological species determinations proved valid and whether there is any correlation between specific host infection and pathogen phylogeny. Materials and methods Sampling and collection Three species of dogroses differing in leaf surface characters were investigated, i.e. R. canina with glabrous leaves, R. corymbifera with hairy leaves and R. rubiginosa with glandular leaves. Rust fungi from these hosts were collected during August 2002 in Germany at 16 sample sites representing a geographical north-south axis of 800 km (Fig. 1). A sample site consists of populations of the respective host-species and represents an area of 500 to 1000 square metres. Rust specimens used for DNA analyses, voucher information and GenBank accession numbers are listed in Table 1. For DNA extraction rust fungi were collected as silica-gel dried infected leaf material. A total of 15 rose bushes (five bushes per species) were sampled at each site. Rust infection was recorded as categorical data (presence or absence of rust). In the case of infection, the rust species was morphologically identified after Gäumann (1959) based on either aeciospore or teliospore characters, using a Carl Zeiss microscopes (with bright field and phase contrast optics). Specimens of rust fungi were deposited in the herbarium of the University of Tübingen (TUB). Statistical analyses of rust infections were performed using the software package SPSS 11.0. Presence/absence data of rust infection were compared between the rose species using logistic regression. Abundance of rust fungi and niche differentiation (e.g. the preferential infection of a given host by one of the two rust species) were analysed using a six-field Chi2 test. Since the absolute abundance of the two observed rust species was found to be very different, the expected values of the six-field-test were corrected for the relative frequency of the respective rust fungus. Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 3 We determined nrLSU sequences for P. mucronatum, P. fusiforme and P. tuberculatum and integrated all available (nrLSU) sequences of Phragmidiaceae from an earlier study (Maier et al. 2003) for phylogenetic analyses. DNA extraction Total DNA was extracted from either aeciospores or teliospores using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer’s protocol. The protocol was modified by shaking the dried samples with the help of a mixer mill (MM 300, Retsch, Haan) for 3 min at 30 Hz in a 1.5 ml tube together with one tungsten carbide ball (3 mm diam). DNA amplification The 5’ end of the nuclear 28S rRNA gene (nrLSU) was amplified from diluted extracts (10-1and 10-2). Primers for the amplification were LR0R (5’-ACC CGC TGA ACT TAA GC) described by Moncalvo et al. (1995) and LR6 (5’-CGC CAG TTC TGC TTA CC) described by Vilgalys & Hester (1990). PCR conditions consisted of an initial denaturation at 94 °C for 180 s, 12 cycles of 94 °C for 35 s, 45 °C for 45 s, 72 °C for 60 s, 12 cycles of 94 °C for 35 s, 45 °C for 55 s, 72 °C for 90 s, 12 cycles of 94 °C 35 s, 45 °C for 60 s, 72 °C for 120 s and a final elongation of 72 °C for 10 min. Sequencing The amplified DNA was purified using Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) following the manufacturer’s instructions, and was then sequenced directly in both directions. Cyclesequencing was performed using the ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems, Warrington) or the ThermoSequenase labelled primer cycle sequencing Kit (Amersham Pharmacia, Uppsala) with the unlabelled or IRD-labelled primers NLMW1 (5’-TCA ATA AGC GGA GGA AAA GA; Sampaio et al. 2002) and NL4 (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G; O'Donnell 1992, 1993). The cycle sequencing profile was 25 cycles of 96 °C for 10 s, 50 °C for 5 s and 60 °C for 4 min. The resulting DNA fragments were separated on an acrylamide gel, using an automatic LI-COR DNA sequencer 4000L or an ABI 373A Stretch (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Phylogenetic reconstructions Sequence alignment was carried out using the software Clustal X 1.83 (Thompson et al. 1997) followed by slight manual editing. The final alignment has been deposited in TreeBase (http://www.herbaria.harvard.edu/treebase/) and is accessible under the following study accession number (preliminary access SN1944). Parsimony analyses were performed using the heuristic search mode in PAUP 4.0b10 (Swofford 2002) with 100 random addition sequence replicates and TBR branch swapping. All character states were treated as unordered, equally weighted and gaps were treated as missing characters. Branch support was evaluated by 1000 bootstrap replicates (Felsenstein 1985) and with the help of Bremer support (Bremer 1994) using the software AutoDecay 3.0 (Eriksson & Wikström 1995). Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 4 Bayesian inference of phylogeny using Monte Carlo Markov chains (MCMC) was conducted with MrBayes 3.0b4 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Four incrementally heated simultaneous Monte Carlo Markov chains were run over 2.000.000 generations, using the DNA substitution model of Hasegawa, Kishino and Yano (HKY 85; Hasegawa et al. 1985) with gamma-distributed substitution rates (see Swofford et al. 1996), random starting trees and default starting values of the very DNA substitution model. The HKY+G model of DNA substitution was chosen by both the Akaike information criterion and the likelihood ratio tests implemented in MrModeltest 1.0b (Nylander 2002). Trees were sampled every 100 generations resulting in an overall sampling of 20.001 trees. The first 1000 trees were discarded as “burnin”. From the remaining trees a 50 % majority rule consensus tree was computed to obtain estimates for the a posteriori probabilities. Branch lengths were estimated as mean values over the sampled trees. This Bayesian approach of phylogenetic analysis was repeated four times, always using random starting trees and random starting values for the HKY85 model to test the independence of the results from topological priors (Huelsenbeck et al. 2002). Furthermore, a neighbour-joining analysis was performed also using HKY 85 as DNA substitution model. The unrooted dendrograms from neighbor joining, parsimony and MCMC analyses were rooted with Kuehneola uredinis (Link) Arth., Triphragmium ulmariae (Hedw. f. ex DC.) Link and Trachyspora intrusa (Grev.) Arth. according to the findings of Maier et al. (2003). Results Rust species Of the four potentially occurring dogrose rusts, we only detected Phragmidium mucronatum and P. tuberculatum. Statistical analyses of infection The number of rose bushes (R. canina, R. corymbifera and R. rubiginosa) infected by P. mucronatum and P. tuberculatum is shown in Table 2. The investigated rose species displayed different responses to rust infection (logistic Regression; Wald = 31.64, df = 2, p < 0.001). Rust infection on R. rubiginosa was significantly lower compared to R. canina (log. Reg.; Wald = 30.37, df = 1, p < 0.001) and R. corymbifera (log. Reg.; Wald = 18.75, df = 1, p < 0.001), whereby no significant difference of rust infection could be detected between R. canina and R. corymbifera (log. Reg.; Wald = 2.05, df = 1, p = 0.15). These results did not change if the logistic regression was performed for the two rust species separately. Additionally, we tested whether P. mucronatum and P. tuberculatum showed a niche differentiation among the three rose species. Since P. tuberculatum was significantly rarer than P. mucronatum on the three investigated rose species (χ²1 = 10.37, p = 0.001), the expected values of the six-field-test were corrected for the relative abundance of the rust fungus (Table 2). No significant host preferences could be detected between the two rust fungi (χ²1 = 0.47, p = 0.79). Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 5 Phylogenetic reconstructions Phylogenetic analyses of the nrLSU sequence data based on maximum parsimony (MP), neighbor joining (NJ) and Bayesian inference (MCMC) resulted in the same tree topology (Fig. 2 and Fig. 3, NJ not shown). Furthermore, all four runs of MCMC-analyses yielded identical tree topologies. Members of the genus Phragmidium appear as a monophyletic group with 64% and 72% bootstrap support (MP and NJ, respectively) and 99% a posteriori probability. The observed rose-parasitizing rust fungi P. mucronatum and P. tuberculatum were not monophyletic. While P. mucronatum grouped with P. fusiforme, mainly occurring in the Alps, and P. montivagum pathogenic on North American wild roses (both bootstrap and a posteriori probability of 100%), P. tuberculatum appeared as the sister taxon to four Phragmidium species living on either Rubus fruticosus agg., Rubus idaeus, Sanguisorba minor or Potentilla sterilis (supported by 83% bootstrap and 76% a posteriori probability). The 5’-regions of the nrLSU of all investigated specimens of P. tuberculatum were identical, with P. mucronatum differing from P. tuberculatum in 8-9% of the 527 characters of the alignment. In P. mucronatum, seven of the ten sequenced specimens were identical, with the other specimens differing from them and from each other in about 1% of the examined nucleotides. These were the collections U2, T10, and T15. Discussion Species delimitation and phylogeny On the three most common dog roses in Germany (Rosa canina, R. corymbifera, R. rubiginosa) we detected only Phragmidium mucronatum and P. tuberculatum. While P. rosae pimpinellifoliae has been recorded from R. canina and R. rubiginosa, the mainly alpine P. fusiforme has not been observed on any of the here studied dog roses (Gäumann 1959). It was stated that the morphological features of the European rose rusts are partly overlapping which question the data given on their host range. However, we found that species determination of P. mucronatum and P. tuberculatum based on both aecio- and teliospore features according to Gäumann (1959) was unambiguously reproducible. Since species determination is easiest if both species are available for comparative microscopy, the unexpectedly large differences in the LSU sequences will prove helpful as additional characters for species determination in future. Interestingly, sequences of some P. mucronatum specimens differed slightly from the majority of specimens of that species. However, no morphological differences could be detected, and further investigations will be necessary to decide whether there are cryptic species in this taxon. Due to the overlapping host ranges of P. tuberculatum and P. mucronatum and their strong morphological resemblance (Sydow & Sydow 1915), we expected also a close phylogenetic relationship between them. However, this assumption was not reflected by the phylogenetic reconstructions because P. mucronatum grouped within a clade comprising P. fusiforme and the North American P. montivagum, while P. tuberculatum Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 6 was a sister group to European Rubus- and Sanguisorba-rusts (Figs. 2 and 3). Thus, we suggest the existence of a core rose rust clade on the one hand and a host jump from a predecessor of P. tuberculatum that had lived on Rubus or Sanguisorba to Rosa on the other hand. The phylogenetic hypotheses derived from the trees also contradict subgeneric delineations based on the structure of teliospore pedicels (Arthur 1906 fide Gäumann 1959) – being hygroscopic (subgenus Earlea) or firm (subgenus Euphragmidium) – as well as the host genus-specific “Formenkreise” of Gäumann (1959). The detected sequence divergences in the D1/D2 region of the nrLSU of Phragmidium as a whole, being up to 10% in some species pairs, are the highest observed for a rust genus so far (see Maier et al. 2003). This is roughly twice as much as in other rust genera, suggesting either that Phragmidium is a relatively old genus or has an accelerated substitution rate. Support for the first explanation is provided by the fact that Phragmidium species are restricted to a relatively old host family, the Rosaceae (Kalkmann 1988), in contrast to e.g. Puccinia which has its focus on more recently evolved angiosperm families like Poaceae, Cyperaceae and Asteraceae. Ecological infection data Neither P. mucronatum nor P. tuberculatum showed any infection preferences with respect to one of the observed rose species. This results in overlapping host ranges, as summarized by Gäumann (1959), who stated broad host ranges for both species including also non-dog roses. These wide host ranges might be a consequence of the putative hybridisation of dog roses after the last ice age (Grant 1971). Similar hypotheses to explain broad host ranges which are rather unusual for the rusts were formulated for cereal and grass rusts (Savile & Urban 1982, Urban & Marková 1984), and it has been assumed that hybridisation of hosts can form a bridge for parasites, enabling them to infect paternal lineages as well as hybrids (Floate & Whitham 1993). The observation that P. tuberculatum was only half as frequent as P. mucronatum might be explained by the distinct phylogenetic history of the two rusts. It can be speculated that P. tuberculatum, which evolved from the Rubus-Sanguisorba rust clade might be less adapted to Rosa as compared to P. mucronatum which is in the rose rust clade and most likely shares a longer adaptational or coevolutionary history with its rose hosts. However, phylogenetic host data and quantitative data on infection severity (rust pustules per leaf surface) derived from laboratory-based experiments will be needed to test this hypothesis. The observation that R. rubiginosa was infected significantly less frequently in nature than the other investigated rose species might be somehow correlated with the conspicuously scented glands producing a sticky epicuticular secretion on the leaf surface. Furthermore, we detected that R. corymbifera, a species with a hairy lower leaf surface, was infected as frequently as the glabrous R. canina. The result that the presence of trichomes has no influence on rust infection corresponds also with the findings of Rubiales & Niks (1992) who found no correlation between the presence of hair in Hordeum species and rust infection. Besides leaf surface, another and maybe more important parameter influencing the infection patterns of the investigated rust fungi might be the relative frequency of the rose species in the sample area, since Rosa canina and R. corymbifera are more frequent than R. rubiginosa in Europe (Kurrto et al. 2004). With a rather lax growth habit these two Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 7 species occur on dry grasslands, meadows and pastures as well as in hedges and forest belts, whereas the rather thermophilous R. rubiginosa with its more condensed growth habit is found mainly in open areas. It seems plausible that the wind-distributed rust fungi might be best adapted to the most frequent rose species. The lack of any obvious niche differentiation of the two Phragmidium species and the putative host jump of P. tuberculatum to Rosa contradicts a priori assumptions on strict cospeciation of specific rust-plant interactions. A similar exception has been described for Puccinia spp. parasitizing Arabis spp. (Roy 2001). Furthermore, host switches within Phragmidium were also detected by reconciliation analyses of parasite and host trees of various genera of rust fungi infecting Rosaceae (Jackson 2004). In the mentioned study, however, the role of association by descent was significant. Our current hypothesis is that the frequent hybridisation of dog roses in nature (Ritz & Wissemann 2003) might have prevented host-induced speciation in the parasites and is furthermore the cause of the wide host range of the two observed rose rust taxa. Acknowledgements We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for financial support of this study (Wi 2028/1-1, OB 24/25-1) under the DFG priority programme 1127 “Radiations – Origins of Biological Diversity”. The practical help of Nadine Drechsler during identification of the numerous fungus samples is gratefully acknowledged. References Arthur, J.C. (1906) Eine auf die Struktur und Entwicklungsgeschichte begründete Klassifikation der Uredineen. Wissenschaftliche Ergebnisse des Internationalen Botanischen Kongresses, Wien 1905: 331-348. Bremer, K. (1994) Branch support and tree stability. Cladistics 10: 295-304. Cummins, G. B. & Hiratsuka, Y. 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Tab. 1: Taxon Host plant, specimen voucher and GenBank No. herbarium accession No. Rosa corymbifera, B21, TUB 012075 AJ715513 Rosa corymbifera, C2, TUB 012076 AJ715519 Rosa corymbifera, G7, TUB 012077 AJ715516 Rosa rubiginosa, G8, TUB 012078 AJ715517 Rosa corymbifera, P15, TUB 012082 AJ715514 Rosa corymbifera, S14, TUB 012083 AJ715515 Rosa rubiginosa, T10, TUB 012084 AJ715521 Rosa corymbifera, T14, TUB 012085 AJ715512 Rosa canina, T15, TUB 012086 AJ715518 Rosa canina, U2, TUB 012090 AJ715520 Rosa canina, H2, TUB 012079 AJ715508 Rosa canina, J12, TUB 012080 AJ715510 Rosa canina, M8, TUB 012081 AJ715511 Rosa corymbifera, W9, TUB 012087 AJ715509 Rosa rubiginosa, W11, TUB 012088 AJ715507 Rosa corymbifera, W20, TUB 012089 AJ715506 Phragmidium fragariae Potentilla sterilis AF426217 Phragmidium fusiforme Rosa pendulina AJ715522 Phragmidium montivagum Rosa cf. woodsii AF426213 Phragmidium rubi-idaei Rubus idaeus AF426215 Phragmidium sanguisorbae Sanguisorba minor AF426216 Phragmidium violaceum Rubus fruticosus agg. AF426214 Kuehneola uredinis Rubus fruticosus agg. AF426218 Trachyspora intrusa Alchemilla vulgaris agg. AF426220 Triphragmium ulmariae Filipendula ulmaria AF426219 Phragmidium mucronatum Phragmidium tuberculatum 12 Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 13 Tab. 2: Rosa canina Rosa corymbifera Rosa rubiginosa sample sites with infection Phragmidium mucronatum 30 29 10 17 Phragmidium tuberculatum 20 12 4 13 Number of sampled bushes 80 80 80 Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. 14 Fig. 1: Sample sites of rust collection during summer 2002 in Germany. (B): Baden-Württemberg, Zollernalbkreis, Beuren, (C): Nordrhein-Westfalen, Geseke, (D): Thüringen, Kahla, Dohlenstein, (E): Niedersachsen, Groß Schneen, Einzelberg, (F): Schleswig-Holstein, Fehmarn, Gammendorf, (G): Niedersachsen, Göttingen, Gartetal, (H): Bayern, Happertshausen, (J): Thüringen, Jena-Zwätzen, (M): Rheinland-Pfalz, Mainz-Finthen, (P): Schleswig-Holstein, Pöschendorf, (R): Baden-Württemberg, Rottenburg/Neckar, (S): Sachsen-Anhalt, Sangerhausen, (T): Rheinland-Pfalz, Trier-Ruwer, (U): Nordrhein-Westfalen, Westheim, (W): Mecklenburg-Vorpommern, Neubrandenburg, Krickow, (Z): Rheinland-Pfalz, Hunsrück, Züsch. Fig. 2: Strict consensus of 54 equally most parsimonious trees (67 parsimony informative characters of a total of 527 characters) based on nrLSU sequence data (tree length 156, CI = 0.69, RI = 0.92, RC = 0.70). Bootstrap values are shown above branches (1000 replicates), Bremer support values are indicated below branches. The topology was rooted with Kuehneola uredinis, Triphragmium ulmariae and Trachyspora intrusa. Fig. 3: Bayesian inference of phylogenetic relationships of representatives of Phragmidiaceae: Monte Carlo Markov chain analysis based on nrLSU sequence data (substitution model of Hasegawa, Kishino, and Yano with gamma distributed substitution rates, 2.000.000 generations). The 50%-majority rule consensus tree was computed from 19.001 trees that were sampled after the process had reached stationarity. The topology was rooted with Kuehneola uredinis, Triphragmium ulmariae and Trachyspora intrusa. Numbers on branches are estimates for a posteriori probabilities. Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. Fig. 1: 15 Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. Fig. 2: 16 Ritz et al. (im Druck): Different evolutionary histories of two Phragmidium species infecting the same dogrose hosts. Mycol. Res. Fig.3: 17 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 7. Gesamtdiskussion 7.1. Diskussion der verwendeten Methoden 7.1.1. Verwendung von nrITS-1-Sequenzen für den Nachweis des hybridogenen Ursprungs der Caninae Die nrITS-Region (nuclear ribosomal internal transcribed spacer) ist der populärsten kernkodierte molekulare Marker für phylogenetische Rekonstruktionen auf Gattungs- und Artebene in der Botanik. Die Vorteile des Markers sind vielfältig. Er wird biparental vererbt, ist aufgrund seiner geringen Größe, der zahlreichen Kopien und der nahezu universellen Primer von White et al. (1990) leicht zu amplifizieren. Der nrITS wird zwar transkribiert und nimmt eine spezifische Sekundärstruktur an, ist aber eine nichtkodierende Sequenz und unterliegt daher einem geringen Selektionsdruck (Baldwin et al. 1995). Der nrITS gehört zu einer multi-copy-Genfamilie der ribsomalen DNA, die sich in den NOR-Regionen (nuclear organizer region) der Chromosomen befindet. Die ribosomale DNA unterliegt dem Phänomen der konzertierten Evolution (Elder 1995). Mechanismen wie Genkonversion und ungleiches Cross-over sorgen für die Homogenisierung aller Wiederholungseinheiten der nrDNA. Neuere Arbeiten weisen darauf hin, dass diese Konzertierung bei weitem nicht vollständig verlaufen muss, so dass paraloge Sequenzen und Pseudogene innerhalb eines Individuums phylogenetische Rekonstruktionen verfälschen können (Alvarez & Wendel 2003; Bailey et al. 2003; Wissemann 2003b). Die fehlende Konzertierung von ITS-Sequenzen in allopolyploiden Genomen bietet aber auch eine Informationsquelle, um Hybridisierungsereignisse in Pflanzen nachzuweisen (Soltis & Soltis 1991; Ritland et al. 1993; Suh et al. 1993; Sang et al. 1995; Soltis et al. 1995; Ainouche & Bayer 1997; Campbell et al. 1997; Vargas et al. 1999). Wissemann (1999, 2000a, 2002) zeigte, dass in der Sektion Caninae die ITS-Region nicht-konzertiert evolviert und schloss damit auf den allopolyploiden Ursprung der Caninae. Diese Schlussfolgerungen beruhen auf den Befunden von Ma et al. (1997), die in den polyploiden Rosen pro Chromosomensatz eine NOR-Region gefunden haben. Schlotterer & Tautz (1994) zufolge liegen ITS-Sequenzen innerhalb einer NOR-Region konzertiert vor. Ich nehme daher an, dass die verschiedenen ITS-Typen nur in jeweils einer NORRegion auftreten und deshalb die Genome repräsentieren, die an der hybridogenen Entstehung der Caninae beteiligt waren. In der vorliegenden Arbeit wurden diese ITSTypen dazu verwendet, die Herkunft der Hybridgenome aufzudecken. Zusätzlich zu einem Haplotypennetzwerk, das die Verteilung der ITS-Typen in der Gattung Rosa veranschaulicht, wurden von jedem ITS-Typ Sekundärstrukturen berechnet. Ich verwendete dazu das Programm „Alifold“, das es ermöglicht, Sekundärstrukturen auf der Basis von Alignments der verschiedenen ITS-Typen zu ermitteln (Hofacker et al. 2002). Die relative Stabilität der ITS-Sekundärstrukturen soll Aufschluss darüber geben, ob diese ITS-Typen Pseudogene (degenerierte Sequenzen) enthalten, die die Ergebnisse des Haplotypennetzwerkes verfälschen könnten. 72 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 7.1.2. Phylogenien auf der Basis von nrITS-1 und atpB-rbcL-IGS- Sequenzen Durch die oben erwähnten Schwierigkeiten, die bei den phylogenetischen Rekonstruktionen mit ITS-Sequenzen auftreten können, erschien es sinnvoll, die Ergebnisse mit einem Chloroplastenmarker zu untermauern. Ich habe den atpB-rbcL intergenic spacer sequenziert, da Sequenzen der matK- und der trnL-trnF-Region nur wenige Polymorphismen aufweisen (Matsumoto et al. 1998; Starr & Bruneau 2002). Die Auflösung der nrITS- und der atpB-rbcL-IGS-Phylogenie war auch in dieser Arbeit sehr niedrig. Der geringe Variabilität von geläufigen molekularen Markern in sehr nah verwandten Arten ist in vielen phylogenetischen Studien ein Problem (Ritz et al. 2003b). Möglicherweise können Analysen, die auf schneller evolvierenden Markern (z.B. Mikrosatellitensequenzen) beruhen, besser aufgelöste Phylogenien erzielen. Bei den pentaploiden Caninae wäre das mit einem erheblichen Aufwand durch Klonieren verbunden. Ich vermute, dass einerseits das junge Alter der Gruppe für die niedrige Variabilität der Marker verantwortlich ist und andererseits die intrasektionelle Hybridisierung der Caninae eine divergente Markerevolution behindert. 7.1.3. Morphologische Analyse der intrasektionellen Hybriden der Caninae Experimentell hergestellte Wildrosenhybriden sind schwierig zu untersuchen, da mehrere Jahre verstreichen, ehe die Hybriden sich zum ersten Mal reproduzieren und ein entsprechend großes Versuchsfeld zum Aufpflanzen der Sträucher notwendig ist. Dadurch war die Anzahl der untersuchten Hybriden leider sehr gering. Morphologische Untersuchungen an Hundsrosenhybriden wurden von Dingler (1908), Hurst (1928), Gustafsson (1944), Feuerhahn & Spethmann (1995), Werlemark et al. (1999) und Werlemark & Nybom (2001) durchgeführt. Aspekte zur L/D-Typ-Merkmalsvererbung wurden lediglich von Gustafsson (1944) tangiert. Ich habe in meinen Untersuchungen an der Hybridsammlung von Wissemann & Hellwig (1997) den Schwerpunkt auf die den L/D-Typ bestimmenden Merkmale Kelchblattpersistenz und Griffelkanaldurchmesser gelegt, weil diese Merkmale zu den bedeutendsten in der Hundsrosentaxonomie gehören (Henker 2000). Es war nicht möglich, den Griffelkanaldurchmesser der Hybriden direkt mit dem der Elternindividuen zu vergleichen, da diese sich an den Originalfundorten befinden und teilweise nicht mehr existieren. Ich konnte die Griffelkanaldurchmesser und das Verhalten der Kelchblätter nach dem Abblühen nur auf die Elternarten beziehen, daher ist es nicht zulässig, die Heritabilität dieser Merkmale zu bestimmen (Falconer & Mackay 1975). Hinzu kommt, dass ich über die genetische Konstitution der Eltern keine Information habe. Die Eltern entsprechen nicht den bei Züchtern üblichen reinen Linien, sondern wurden nach dem taxonomischen Konzept von Kláštersk? (1969) den Arten zugeordnet. Solche reinen Linien zu erzeugen würde Jahrzehnte dauern. 73 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 7.1.4. Phylogenetische und ökologische Untersuchungen der Rosenroste Ich habe drei unterschiedliche Rosenarten auf ihren Rostbefall untersucht, um festzustellen, ob eine ökologische Nischendifferenzierung innerhalb der Rosenroste auf ihre Wirte besteht. Ich habe die vorkommenden Roste bestimmt, aber die Befallsdichte der Roste nicht berücksichtigt. Angaben wie z.B. die Anzahl der Pusteln pro Blättchen geben ein differenzierteres Bild über eine Nischendifferenzierung der Roste. Solche Dichtezählungen sind aber schwierig zu standardisieren. Die Pusteln sind unterschiedlich groß, und Aecio-, Uredo- und Basidiosporen können gleichzeitig vorkommen. Hinzu kommt, dass die von Rost befallenen Rosen, vor allem Rosa canina, ihre Blätter schon im Hochsommer abwerfen und danach erneut austreiben. Die D1/D2-Region der nrLSU (nuclear ribosomal large subunit) wird häufig zur phylogenetischen Analyse von Pilzen verwendet (Berres et al. 1995; Begerow et al. 1997; Weiss & Oberwinkler 2001) und hat sich auch für die Rostpilze (Uredinales) als gut geeignet erwiesen (Maier et al. 2003). Ein Anteil polymorpher Positionen von bis zu zehn Prozent zwischen einzelnen Phragmidium-Arten wurde innerhalb der Rostpilze bisher noch nie beobachtet (Maier et al. 2003). Die ITS-Region ist vermutlich noch variabler, aber ihre Amplifikation ist bisher nicht gelungen. Um das Vorhandensein von subspezifischen Stämmen innerhalb der Rostarten zu untersuchen, sind populationsgenetische Analysen mit AFLPs am besten geeignet. Dieser Ansatz scheitert im Moment daran, dass die Kultivierung von Rosten extrem schwierig ist und Basidiosporen aufgrund der Rekombination nicht verwendet werden können 7.2. Der hybridogene Ursprung der Caninae Bereits Täckholm (1920, 1922) hat nach seiner Entdeckung der Canina-Meiose den hybridogenen Ursprung der Caninae postuliert. Diese Hypothese wurde später von den meisten Rhodologen übernommen (Keller 1931; Gustafsson & Håkansson 1942; Fagerlind 1948; Stebbins 1951; Zielinski 1985). Sequenzdaten ribosomaler DNA lieferten den ersten molekulargenetischen Nachweis der Allopolyploidie der Caninae (Wissemann 1999, 2000a, 2002). Wissemann identifizierte vier verschiedene nrITS-1-Typen (A-, B-, C-, ETyp), die die einzelnen Genome repräsentieren. Der ITS-C-Typ wurde bisher nur in Vertretern der Caninae gefunden. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Ergebnisse bestätigt (Manuskript I: Ritz et al. 2005). Die von Wissemann identifizierten ITS-Typen haben auch mit einer deutlich größeren Stichprobe sowohl innerhalb der Caninae als auch der gesamten Gattung Rosa Bestand. Alle untersuchten Arten der Caninae und der Gallicanae (Rosa) zeigten nicht-konzertierte ITS-Evolution und beinhalteten bis zu drei verschiedene ITS-Typen pro Individuum. Wissemann (1999, 2000a, 2002) fand sogar vier verschiedene ITS-Typen in einer pentaploiden Hundsrose und widerlegt damit die Hypothese von Gustafsson & Håkansson (1942), die die Caninae aufgrund ihrer Kreuzungsexperimente für interne Autotriploide hielten. Im Gegensatz zu den Caninae lag bei den Arten der übrigen Sektionen Banksianae, Bracteatae, Carolinae, Cinnamomeae, Indicae, Laevigatae, Pimpinellifoliae und 74 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Synstylae, sowie bei den Subgenera Hesperhodos COCKERELL, Hulthemia (DUMORT.) FOCKE und Platyrhodon (HURST) REHDER kein Hinweis auf nicht-konzertierte ITSEvolution vor. Diese Arten enthalten jeweils nur einen ITS-Typ. Ich habe diese Typen, um die Verbindung zu den korrespondierenden Artengruppen zu verdeutlichen, nach der bekanntesten diploiden Rosenart mit dem jeweiligen Typ benannt. Der A-Typ wurde als woodsii-, der B-Typ gallica- und der C-Typ canina-Typ bezeichnet. Der E-Typ spaltet sich in den wichurana- und den rugosa-Typ. Die Caninae können den canina-, den gallica-, den woodsii- und den rugosa-Typ enthalten, der wichurana-Typ wurde bei meinen Untersuchungen in keiner Hundsrose gefunden. In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass der canina-Typ (ITS-C-Typ) ausschließlich auf Hundsrosen beschränkt ist. Er ist bei keiner der hier untersuchten diploiden Rosen gefunden worden. Daraus ergibt sich die mögliche Erklärung, dass die diploiden bzw. autopolyploiden Vorfahren der Caninae ausgestorben sind. Die Existenz der Ur-Caninae bzw. Prae-Caninae wurde bereits von Täckholm (1920, 1922) und Zielinski (1985) angenommen. Die Frage, ob die Ur-Caninae tatsächlich ausgestorben sind, kann nicht eindeutig beantwortet werden, da hier nur Vertreter der Caninae aus Mitteleuropa untersucht worden sind. Es ist theoretisch möglich, dass z.B. in Vorderasien, einem rhodologisch kaum erforschten Verbreitungszentrum der Caninae, noch Hundsrosenvorläufer vorkommen können. Abgesehen davon deuten die hier gewonnenen ITS-Daten auf mehrfache Hybridisierung der Ur-Caninae mit den Vorfahren verschiedener Rosenarten anderer Sektionen hin. Diese Hybridisierungsereignisse haben entsprechend der Verbreitung der Caninae vermutlich im europäisch-vorderasiatischen Raum stattgefunden. Aus dem gleichen Grund ist weiterhin anzunehmen, dass die anderen Hybridisierungspartner unter den Vorfahren heutiger Cinnamomeae, Gallicanae, Pimpinellifoliae oder Synstylae zu suchen sind. Täckholm (1920, 1922), Keller (1931) und Gustafsson & Håkansson (1942) nahmen an, dass die Caninae mehrfach entstanden sind. Täckholm (1920, 1922) wie auch Gustafsson & Håkansson (1942) gehen von separaten Hybridisierungsereignissen für jede in den Caninae vorkommende Ploidiestufe (tetra, penta- und hexaploid) aus. Für diese Autoren resultiert die Canina-Meiose aus den Homologieverhältnissen der Hybridgenome. Fagerlind (1948) wies als erster darauf hin, dass die Canina-Meiose von einem Genkomplex gesteuert sein muss und nicht auf die Asyndeseverhältnisse der beteiligten Genome zurückzuführen ist. Seiner Meinung nach sind alle Rosengenome stark autogenomatisch, d.h. alle sind homolog zueinander. Unter diesem Gesichtspunkt scheint eine polyphyletische Entstehung der komplexen Canina-Meiose unwahrscheinlich. Zielinski (1985) vermutet, dass ein diploides Ur-Caninae-Genom für die Canina-Meiose verantwortlich ist. Die nrITS-Daten von Wissemann (1999, 2000a, 2002) und die Mikrosatellitendaten von Nybom et al. (2004) bestätigen, dass ein intern diploider Chromosomensatz in Hundsrosen vorkommt. Wissemann (1999, 2000a, 2002) und ich (Manuskript I: Ritz et al. 2005) fanden jeweils nur maximal vier verschiedene ITS-Typen und Nybom et al. (2004) identifizierten lediglich vier Allele eines Mikrosatellitenmarkers in pentaploiden Hundsrosen. Nybom et al. (2004) zeigten anhand von Mikrosatellitenmarkern, dass die Chromosomenpaarung zwischen zwei stark homologen Genomen stattfindet und dass eines dieser Genome vom Pollen stammt, d.h. die Genome en block vererbt werden wie von Hurst (1925) angenommen. Es ist wahrscheinlich, dass es 75 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) sich bei diesen Genomen um das vom canina-ITS-Typ repräsentierte diploide Ur-CaninaeGenom handelt. Allerdings wurden bisher die ITS-Typen in einem Individuum nicht quantitativ kloniert, um ihre relative Häufigkeit abzuschätzen. Widersprüchlich zu diesen Befunden ist, dass, wenn nur das Ur-Caninae-Genom an der Bivalentenbildung beteiligt ist und die Hybridgenome ausschließlich Univalente formen, diese Univalente stets in vollständigen Sätzen vorliegen. Wieso bleiben die Hybridgenome vollständig erhalten, obwohl in Rosen aneuploide Reihen absolut selten sind? Eigene unveröffentlichte Untersuchungen zur genetischen Konstitution von Einzelpollenkörnern zeigen, dass sich nicht ausschließlich der canina-ITS-Typ sondern alle möglichen in Hundsrosen vorkommenden ITS-Typen in den Pollenkörnern befinden. Nach den oben genannten Ergebnissen von Nybom et al. (2004) ist zu erwarten, dass die Pollenkörner mit dem canina-ITS-Typ einen Selektionsvorteil gegenüber Pollenkörnern mit anderen ITS-Typen haben, und nur sie die Eizellen befruchten. Leider konnten meine Ergebnisse aufgrund von methodischen Schwierigkeiten der Einzelzell-PCR bisher nicht reproduziert werden. Zielinskis Hypothese über ein die Canina-Meiose regulierendes diploides Ur-CaninaeGenom wird durch die Befunde von Wulff (1954) untermauert. Wulff (1954) beobachtete das spontane Auftreten einer canina-ähnlichen Meiose während der Mikrosporogenese in der diploiden intersektionellen Hybride Rosa x ruga (Rosa arvensis x R. chinensis). Wulff entdeckte, dass die Pollenmutterzellen einer Blüte spontan zur pentaploiden Stufe polyploidisierten und dann haploide Pollenkörner gebildet wurden. Er erklärte diesen Vorgang durch partielle Endomitose des diploiden Hybridgenoms. Seiner Meinung nach hat sich das arvensis-Genom, das den Caninae phylogenetisch nahe steht zweimal verdoppelt, während das chinensis-Genom ungeteilt blieb. Möglicherweise gibt es einen regulierenden Genkomplex, der beim Eintreten der Meiose angeschaltet wird und der partielle Endomitose und Asyndese auslöst, wie Blackhurst (1948), Fagerlind (1948) und Wulff (1954) vermuten. Wulff (1954) schloss aus diesen Beobachtungen, dass eventuell sogar rein diploide Arten wie z.B. Rosa arvensis unter bestimmten Umständen befähigt sind, die Canina-Meiose zu entwickeln. Der Caninae-Komplex ist demzufolge mehrfach mutativ und nicht hybridogen entstanden (Wulff 1954). Wie oben erwähnt, weisen alle molekularen Daten auf den hybridogenen Ursprung der Hundsrosen hin (Wissemann 1999, 2000a, 2002, Nybom et al. 2004, Manuskript I: Ritz et al. 2005). Auch nach Zielinskis Überlegungen entsteht die Canina-Meiose in einer autotetraploiden Ur-Caninae (Zielinski 1985). Erst danach begannen die Ur-Caninae, durch Hybridisierung Genome von Nicht-Caninae aufzunehmen. Diese Hybridisierungsereignisse fanden mehrmals unabhängig voneinander und mit verschiedenen Hybridisierungspartnern statt. Die Introgression fremder Genome umfasste für tetraploide Arten maximal zwei, für pentaploide Arten maximal drei und für hexaploide Arten maximal vier Chromosomensätze, da für die Ausprägung der Canina-Meiose ein diploider Satz UrCaninae-Genome notwendig ist. Danach sind die Caninae mit Hybridgenomen „gesättigt“, das heißt, sie können nur noch von Spermazellen mit dem Ur-Caninae-Genom befruchtet werden, um den internen diploiden Zustand und damit die Canina-Meiose aufrechtzuerhalten. Allerdings bleibt unverständlich, unter welchem Selektionsdruck sich die Canina-Meiose in Autopolyploiden entwickelt hat und wieso diese keine NormalMeiose beibehalten haben. 76 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Die von Nybom et al. (2004) entwickelte Hypothese zur Evolution der Caninae beruht auf dem Entstehen einer interspezifischen triploiden Hybride. Diese Hybride verdoppelte durch partielle Endomitose das Ur-Caninae-Genom und war zur Canina-Meiose befähigt. Neben dieser Hypothese ist auch vorstellbar, dass eine diploide Ur-Caninae eine unreduzierte Eizelle bildete und mit einer allotetraploiden Nicht-Hundsrose hybridisierte. Die daraus hervorgegangene tetraploide Hybride enthält ein diploides Ur-Caninae-Genom und entwickelt die Canina-Meiose. Diese beiden Szenarien, bei denen eine Hybridisierung der Entstehung der Canina-Meiose vorangeht, erscheinen weitaus plausibler als Zielinskis (1985) Hypothese, da die Canina-Meiose den Ausweg aus der Hybridsterilität der Primärbastarde darstellt. Abbildung 2 zeigt schematisch, wie die verschiedenen Ploidiestufen der Caninae entsprechend dieser beiden Hypothesen entstanden sein könnten. Alle bisher erwähnten Hypothesen zur Entstehung der Caninae beruhen auf der Existenz einer diploiden Ur-Caninae. Diese Hypothesen sind letztendlich nicht falsifizierbar, sondern nur verifizierbar, wenn eine diploide Ur-Caninae gefunden wird. Eine meiner Meinung unwahrscheinliche Alternativhypothese zum Vorhandensein einer diploiden UrCaninae ist die mutative Entstehung des Caninae-Genom in allopolyploiden NichtHundsrosen. Ein Beispiel hierfür aus einer anderen Pflanzengruppe ist die mutative Entstehung von Mais aus Teosinte (Doebley 2004). Ähnlich den hypothetischen UrCaninae wurde auch für die Evolution der Gattung Zea L. die Existenz eines „Ur-Maises“ postuliert, den es jedoch wahrscheinlich nie gegeben hat. Zielinski (1985) vermutet die Entstehung der Caninae im Spättertiär. Erst im Pleisto- und Holozän, nach dem Rückzug des Inlandeises, haben sich die Arten weiter verbreitet. Die meisten nacheiszeitlich radiierten polymorphen Sippen sind agamosperme Komplexe. Darlington (1932) und Fagerlind (1948) bezeichneten die Caninae als semiklonal und erklärten so den extremen, mit apomiktischen Sippen vergleichbaren Polymorphismus der Gruppe. Im Gegensatz zu den agamen Komplexen sind die Caninae funktionell diploid. Sie konnten durch ihre einzigartige Meiose die Hybridsterilität überwinden. 7.3. Schwestergruppen der Ur-Caninae und intrasektionelle Gliederung Wie im vorhergehenden Kapitel dargestellt, konnte ich die Hypothese von Wissemann (1999, 2000a, 2002), dass der canina-ITS-Typ (C-Typ) ausschließlich in Hundsrosen vorkommt, bestätigen. Wissemann zufolge ist der canina-Typ daher geeignet, die phylogenetischen Beziehungen der Caninae zu untersuchen. In meiner Arbeit (Manuskript II: Wissemann & Ritz 2005) sind die canina-ITS-Typen von 14 Arten der Sektion Caninae in eine phylogenetische Rekonstruktion der gesamten Gattung Rosa eingeflossen. Diese auf Kernmarkern basierende Phylogenie wurde durch eine zweite Rekonstruktion mit dem Chloroplastenmarker atpB-rbcL IGS ergänzt. Beide Phylogenien sind sowohl innerhalb 77 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 78 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Abb. 2: Schema zur hypothetischen Entstehung der Caninae und der Canina-Meiose. Die Genome sind nur durch ein einzelnes Chromosom dargestellt. Das Ur-Caninae-Genom ist weiß und mit einem „C“ gekennzeichnet. Die verschiedenen Nicht-Caninae-Genome sind durch unterschiedlich gemusterte Chromosomen dargestellt (schwarz, längs- und quergestreift). Das Ur-Caninae-Genom liegt in allen Caninae diploid vor und bildet die Bivalente in der Meiose (Nybom et al. 2004). A: Entstehung der Caninae ausgehend von einer interspezifischen triploiden Hybride, die die CaninaMeiose durch partielle Endomitose entwickelt (modifiziert nach Nybom et al. 2004, Manuskript I: Ritz et al. 2005). B: Entstehung der Caninae ausgehend von einer Hybridisierung einer unreduzierten Eizelle der Caninae und einer Spermazelle einer allotetraploiden Nicht-Caninae. der Gattung Rosa als auch innerhalb der Caninae schlecht aufgelöst. Die bisher publizierten molekularen Phylogenien der Gattung Rosa lassen ebenfalls keine eindeutige Gliederung zu (matK: Matsumoto et al. 1998 und Wu et al. 2001; trnL-trnF Region: Starr & Bruneau 2002; RFLP der Organellen-DNA: Matsumoto et al. 1997 und Matsumoto et al. 2000). In der nrITS-Phylogenie erscheinen die Sektionen Indicae und Synstylae als Schwestergruppen zu den Hundsrosen, in der atpB-rbcL-Phylogenie erscheinen sie innerhalb der Caninae. Diese Ergebnisse widersprechen den morphologischen Daten. Die charakteristischen Merkmale der Synstylae und Indicae, ein verwachsenes Griffelbündel und ungeteilte Kelchblätter, treten in den Caninae nicht auf. Die monotypische Sektion 79 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Rosa besitzt neben den Caninae als einzige geteilte Kelchblätter. Sie ist in der atpB-rbcLPhylogenie innerhalb der Caninae zu finden, in der nrITS-Phylogenie ist sie jedoch eine Schwestergruppe von Vertretern der Sektionen Pimpinellifoliae und Cinnamomeae. Die matK-Phylogenie von Matsumoto et al. (1998) weist auf eine enge Verwandtschaft der Caninae, Synstylae, Indicae und Gallicanae (Rosa) hin, da diese Sektionen als ein Monophylum erscheinen. Zielinski (1985) vermutete aufgrund von ihm nicht genannter morphologischer Merkmale, dass Synstylae und Indicae verwandtschaftlich Rosa canina nahe stehen. Die Variabilität des canina-ITS-Typs ist nicht ausreichend, um die phylogenetischen Beziehungen innerhalb der Caninae aufzudecken. Die Caninae erscheinen in der atpBrbcL-Phylogenie nicht als monophyletische Gruppe, sondern bilden ein Monophylum mit den Sektionen Synstylae, Indicae und Rosa. Das ist eher in der schlechten Auflösung des Markers begründet als in einer möglichen Polyphylie der Caninae. Der kernkodierte canina-ITS-Typ, der die Ur-Caninae repräsentiert, ist monophyletisch, und auch die Chloroplasten müssen von den Ur-Caninae stammen. Ich halte für sehr unwahrscheinlich, dass es mehrere verschiedene Gruppen von Ur-Caninae gegeben hat, die das komplexe System der Canina-Meiose mehrfach unabhängig voneinander entwickelten. Allerdings ist nichts darüber bekannt, von wie vielen Genen die Canina-Meiose gesteuert wird und wie viele Mutationsschritte nötig sind, um die Canina-Meiose zu ermöglichen. Da die CaninaMeiose während der der Mikro-und Megasporogenese auf sehr unterschiedliche Weise abläuft, gehe ich davon aus, dass es sich um es sich um ein komplexes Multigensystem handeln muss. In der atpB-rbcL-Phylogenie werden die Arten der Caninae in Vertreter mit duftlosen Drüsen (Subsektion Caninae, Subsektion Trachyphyllae H.CHRIST) und duftenden Drüsen (Subsektion Rubigineae H.CHRIST und Vestitae H.CHRIST) aufgespaltet. Die beiden zuletzt genannten Subsektionen unterscheiden sich durch den Besitz von fruchtig duftenden Drüsen (Subsektion Rubigineae) bzw. harzig duftenden Drüsen (Subsektion Vestitae). Sie erscheinen im Stammbaum aber nicht als getrennte Gruppen. Die geringe Variabilität der DNA-Marker innerhalb der Caninae ist einerseits durch ihr vermutlich geringes Alter verständlich. Andererseits können ständige intrasektionelle Hybridisierungsereignisse eine divergente Evolution der Caninae verhindern. Im folgenden Kapitel zeige ich, dass die intrasektionelle Hybridisierung in den Caninae tatsächlich eine bedeutende Rolle gespielt hat und eventuell gegenwärtig noch spielt. 7.4. Intrasektionelle Hybridisierung der Caninae und Merkmalsvererbung Die Merkmalsvererbung in den Caninae ist matroklin, da bei den pentaploiden Arten 4/5 der kernkodierten Erbinformation von der Eizelle und nur 1/5 von der Spermazelle stammt. Die Auswirkung dieser Matroklinie habe ich an künstlich hergestellten intrasektionellen Hybriden der Caninae untersucht (Manuskript III: Ritz & Wissemann 2003a). Wie zu erwarten, verhielten sich die Mehrzahl der morphologischen Merkmale entsprechend dem oben genannten Schema. Alle Kreuzungen prägten hinsichtlich der Blattbehaarung, der Bedrüsung der Blätter und Fruchtstiele ausschließlich maternale Merkmale aus. Matrokline 80 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Merkmalsausprägung stellte Wissemann (2000b) außerdem bei epikutikulären Wachsstrukturen, Werlemark et al. (1999) bei Fruchtknoten- und Kelchblattgröße, Kelchblattserratur und RAPD-Markern sowie Nybom et al. (2004) bei Mikrosatellitenmarkern fest. Unerwartet war die Beobachtung, dass die den L/D-Typ bestimmenden Merkmale Kelchblattpersistenz und Durchmesser des Griffelkanales rein paternal vererbt wurden. In reziproken Kreuzungen zwischen einem L- und D-Typ-Elter wurde ausschließlich der paternale Merkmalszustand vererbt. Beispielsweise bringt ein Pollenelter mit engem Griffelkanal und abfallenden Kelchblättern Nachkommen mit engem Griffelkanal und abfallenden Kelchblättern hervor. Gustafsson (1944) beobachtete das gleiche Phänomen, zog aber keine Schlussfolgerungen zur Merkmalsvererbung. Dieses Vererbungsmuster ist formalgenetisch nicht zu erklären. Die möglichen Ursachen sind ausführlich in Manuskript III: (Ritz & Wissemann 2003a) diskutiert. Paternale Vererbung von morphologischen Merkmalen wurde auch von Werlemark & Nybom (2001) an der Kreuzung R. rubiginosa x R. sherardii DAVIES beobachtet. Leider hatten Werlemark & Nybom (2001) weder eine reziproke Kreuzung dieser Hybride zur Verfügung noch spielen die Merkmale Kelchblattpersistenz und Griffelkanaldurchmesser in ihrer Untersuchung eine Rolle. Unsere Beobachtungen zur Vererbung von morphologischen Merkmalen wirken sich stark auf das taxonomische Konzept der Sektion aus. Das aktuelle taxonomische System beruht auf einem synthetischen Modell (Christ 1873), bei dem jede Rosenart durch eine Kombination verschiedener miteinander korrelierter Merkmale charakterisiert ist. In diesem Modell spielen die L/D-Typen-Merkmale eine zentrale Rolle. Die hier untersuchten Hybriden entsprechen mit ihrer Kombination aus maternal vererbten Merkmalen (Blattbehaarung und Blattbedrüsung) und paternal vererbten Merkmalen (Kelchblattpersistenz und Griffelkanaldurchmesser) bereits beschriebenen Arten. Beispielsweise ist die Hybride R. rubiginosa x R. canina anhand vegetativer Merkmale nicht von der Mutterpflanze R. rubiginosa zu unterscheiden, hat aber abfallende Kelchblätter und einen engen Griffelkanal. Diese Kombination trifft genau auf R. micrantha BORRER ex SMITH zu. Die reziproke Hybride R. canina x R. rubiginosa ist durch die selben morphologischen Merkmale gekennzeichnet wie R. dumalis BECHST. In Anbetracht der Tatsache, dass der Reproduktionserfolg der Hybriden sich nicht von „reinen“ Arten unterscheidet (Manuskript III: Ritz & Wissemann 2003a), sind selbst Hybriden zwischen L- und D-Typen im Feld nicht von beschriebenen Arten zu unterscheiden. Es bleibt offen, ob diese Hybriden micrantha-ähnlich aussehen oder ob Rosa micrantha tatsächlich eine intrasektionelle Hybride ist. Handelt es sich bei diesen Arten um in der Vergangenheit entstandene und mittlerweile etablierte Hybriden oder entstehen diese gegenwärtig immer wieder neu? Die Entstehung solcher Hybriden ist möglicherweise ein seltenes Ereignis, weil der Anteil fertiler Samen nach einem Hybridisierungsereignis gering ist (Wissemann & Hellwig 1997). Aufschluss über diese Fragestellung soll eine Mikrosatelliten- und AFLP-Analyse geben, die im Rahmen weiterführender Arbeiten durchgeführt werden. Im folgenden Kapitel wird die Auswirkung der retikulaten Evolution auf die Rosenpathogene der Gattung Phragmidium erläutert. 81 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 7.5. Rostpilze auf Hundsrosen Rostpilze (Uredinales) sind obligate Pflanzenparasiten und durch Koevolutions- und Kospeziationsprozesse streng an bestimmte Wirtsfamilien gebunden (Dietel 1904; Savile 1979, 1990). Die Gattung Phragmidium ist nahezu ausschließlich auf Vertretern der Unterfamilie Rosoideae verbreitet. Um zu prüfen, ob die Diversität und Radiation der Caninae sich auch in ihren Parasiten widerspiegelt, wurden die drei in Deutschland häufigsten Hundsrosen: Rosa canina, R. corymbifera und R. rubiginosa auf Rostbefall untersucht. Diese drei Rosenarten unterscheiden sich vor allem durch die Behaarung der Blattflächen: Rosa canina hat kahle, R. corymbifera behaarte und R. rubiginosa drüsige Blätter. Von den vier Rosten, die auf einheimischen Caninae vorkommen (Gäumann 1959), fand ich nur zwei Arten: Phragmidium mucronatum und P. tuberculatum (Manuskript IV: Ritz et al. im Druck). Die Roste parasitieren auf den drei Rosenarten gleichermaßen. Beide Arten befielen R. canina am stärksten und Rosa rubiginosa am schwächsten, und keiner der beiden Roste zeigte einen stärkeren Befall an einer Rosenart als der andere. Zwischen den Rosten ist keine Nischendifferenzierung hinsichtlich dieser Wirte nachweisbar. Ähnlich weite Wirtsspektren fanden auch Savile & Urban (1982) und Urban & Marková (1984) für den Grasrost Puccinia graminis PERS. EX PERS. Es bleibt ungeklärt, ob der geringe Befall von R. rubiginosa mit der starken Bedrüsung der Blätter zusammenhängt. Experimente, bei denen Blättchen der drei Rosenarten mit den Rosten infiziert wurden, schlugen aufgrund der niedrigen Infektionsrate fehl. Das weite Wirtsspektrum der Arten und die fehlende Nischendifferenzierung widersprechen der Kospeziationshypothese von Phragmidien und den Caninae. Der hybridogene Ursprung der Caninae und die vermutlich andauernde intrasektionelle Hybridisierung verwischen diese Prozesse. Hybridisierungsereignisse innerhalb der Wirte können Brücken für Parasiten bilden, die es ihnen ermöglichen, sowohl die Elternarten als auch die interspezifischen Hybriden zu befallen (Floate & Whitham 1993). Die verwandtschaftlichen Beziehungen von Phragmidium tuberculatum und Phragmidium mucronatum wurden durch eine phylogenetische Analyse mit der D1/D2 Region der nrLSU-Sequenzdaten der Gattung Phragmidium analysiert. Das überlappende Wirtsspektrum (Gäumann 1959, Manuskript IV: Ritz et al. Im Druck) und die große morphologische Ähnlichkeit beider Roste (Sydow & Sydow 1915) lassen eine enge Verwandtschaft der Arten vermuten. Erstaunlicherweise befindet sich nur Phragmidium mucronatum in einer monophyletischen Gruppe von Rosenrosten. Phragmidium tuberculatum ist eine Schwestergruppe zu Rosten, die auf Rubus und Sanguisorba parasitieren. In der Evolution dieser Art hat wahrscheinlich einen Wirtswechsel von diesem Verwandtschaftskreis zur Gattung Rosa stattgefunden. Ähnliche Vorgänge wurden auch in anderen Vertretern der Uredinales nachgewiesen (Savile 1990; Roy 2001; Jackson 2004). Dieser Wirtswechsel verhindert ebenso wie die Hybridisierung der Wirte Kospeziation zwischen Rosten und Rosen. 82 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 7.6. Hybridisierung als Evolutionsfaktor in der Sektion Caninae Hybridisierung spielt neben der Canina-Meiose in der Evolution der Hundsrosen eine zentrale Rolle. Zum einen ist der gesamte allopolyploide Caninae-Komplex hybridogen entstanden und zum anderen scheint Hybridisierung auch innerhalb der Caninae häufig zu sein. Die Canina-Meiose stellt einen funktionell diploiden Zustand der permanent pentaploiden Rosen her und ermöglicht die sexuelle Reproduktion und das Überwinden der Hybridsterilität. Die allopolyploide Entstehung der Caninae hat neue Genotypen hervorgebracht. Diese hatten nach dem Rückzug des Inlandeises einen Selektionsvorteil gegenüber ihren Eltern. Ihre rasante Ausbreitung zeigt sich in der extremen Dominanz der Caninae in der mitteleuropäische Rosenflora. Die divergierende Evolution der Caninae wird wahrscheinlich durch intrasektionelle Hybridisierung gestört. Die komplette morphologische Übereinstimmung von beschriebenen Arten mit experimentell erzeugten Hybriden lässt ein beträchtliches Ausmaß von intrasektioneller Hybridisierung in der Vergangenheit und/oder Gegenwart vermuten. Der Faktor Hybridisierung beeinflusst nicht nur die Evolution der Caninae selbst, sondern verhindert auch Kospeziationsprozesse zwischen Hundsrosen und Rostpilzen der Gattung Phragmidium. Rosen der Sektion Caninae sind ein gutes Beispiel dafür, dass Hybridisierung ein bedeutender Evolutionsfaktor (Arnold 1997) und nicht nur ein Hintergrundgeräusch der Evolution ist. Erkenntnisse aus dem Bereich der Genomik bestätigen eindrucksvoll, dass Polyploidisierungen, die unter anderem auf Hybridisierungsereignisse zurückzuführen ist, eine bedeutende Rolle nicht nur in der jüngeren Evolution (Neopolyploidie) sondern auch in der frühen Evolution (Paläopolyploidie) der Angiospermen spielen (Otto & Whitton 2000; Wendel 2000; Simillion et al. 2002; Blanc & Wolfe 2004). Hybridisierung wurde und wird in der Systematik stiefmütterlich behandelt, weil sie mit den klassischen v. a. von Zoologen geprägten Artkonzepten in starkem Konflikt steht. Nach dem biologischen Artkonzept sind Arten komplett reproduktiv isoliert und dürfen keine fertilen Nachkommen bilden (Dobzhansky 1937; Mayr 1942). Das phylogenetische Artkonzept basiert auf einer divergenten Evolution durch Aufspaltung von Arten, Retikulation ist nicht definiert (Hennig 1966; Cracraft 1989). Hybridisierung ist nicht zwangsläufig eine Nebenerscheinung nicht-abgeschlossener divergenter Evolution von Arten. Hybriden sind auch per se nicht weniger fit als ihre Elternarten. Die Evolution der Caninae zeigt beide Mechanismen: Hybridisierung ist ein Evolutionsfaktor, der einerseits die Evolution der Canina-Meiose induziert hat und damit zur Entstehung der Caninae geführt hat. Andererseits verhindert Hybridisierung eine divergente Evolution innerhalb der Caninae. 83 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 8. Zusammenfassung Die Sektion Caninae der Gattung Rosa (Hundsrosen) ist eine hochpolymorphe und taxonomisch schwierig zu erfassende Gruppe. Die Caninae sind durch ihr in der Natur einzigartiges Meiosesystem gekennzeichnet. Die sogenannte Canina-Meiose erhält den meist pentaploiden somatischen Zustand durch die Bildung von tetraploiden Eizellen und haploiden Spermazellen. Diese Heterogamie lässt eine hybridogene Entstehung der Gruppe vermuten. Tatsächlich sind die Caninae Allopolyploide, was molekulargenetisch anhand der nicht-konzertierten nrITS-Region nachgewiesen wurde. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Caninae durch mehrfache Hybridisierung aus vermutlich ausgestorbenen UrCaninae und Rosen anderer Sektionen entstanden sind. Die bisherige Forschung deutet auf das Vorkommen eines diploiden Ur-Caninae-Genomes hin, das an der Bivalentenbildung in der Canina-Meiose beteiligt sein muss. Die diploiden Ur-Caninae bildeten wahrscheinlich durch Hybridisierung mit Nicht-Caninae-Rosen einen Primärbastard, der die Canina-Meiose entwickelte und sich dadurch aus der Hybridsterilität rettete. Dieser Primärbastard nahm durch nachfolgende Hybridisierungen weitere Genome von NichtCaninae auf. Molekulare Phylogenien der Caninae sind wenig aufgelöst und lassen keine genaue Gliederung innerhalb der Hundsrosen zu. Die Phylogenie anhand des Chloroplastenmarkers atpB-rbcL intergenic spacer trennt die Caninae in Vertreter mit duftenden Drüsen und in drüsenlose Vertreter. Die geringe Variabilität der molekularen Marker ist einerseits durch das geringe Alter der Gruppe begründet. Außerdem verhindert wahrscheinlich intrasektionelle Hybridisierung eine divergierende Evolution des caninaITS-Typs. Einen weiteren Hinweis auf das Vorkommen von intrasektioneller Hybridisierung liefert die morphologische Untersuchung zur Merkmalsvererbung an künstlich hergestellten Hundsrosenhybriden. Die vegetativen Merkmale Blattbedrüsung und Blattbehaarung werden erwartungsgemäß matroklin vererbt, da 4/5 des Genoms von der Eizelle stammen Die paternale Vererbung der taxonomisch bedeutsamen Merkmale Griffelkanaldurchmesser und Kelchblattpersistenz ist formalgenetisch nicht zu erklären. Durch dieses Vererbungsmuster sind bestimmte Hybriden morphologisch nicht von beschriebenen Hundsrosenarten zu unterscheiden und wahrscheinlich mit ihnen identisch. Hybridisierung beeinflusst nicht nur die Evolution der Caninae selbst, sondern verhindert vermutlich auch Koevolutions- und Kospeziationsprozesse von Rostpilzen der Gattung Phragmidium und Hundsrosen. Die beiden Rosenroste Phragmidium mucronatum und P. tuberculatum zeigen keine Nischendifferenzierung innerhalb von drei ausgewählten Hundsrosenwirten. Trotz dieses überlappenden Wirtspektrums und der morphologischen Ähnlichkeit der Pilze ist nur P. mucronatum mit anderen Rosenrosten verwandt, während für die Evolution von P. tuberculatum ein Wirtswechsel von Rubus bzw. Sanguisorba (Rosoideae, Rosaceae) anzunehmen ist. 84 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Summary Roses of sect. Caninae (dogroses) are a morphologically highly diverse and taxonomically challenging taxon. They are characterised by a unique meiosis system, the so called canina-meiosis. The pentaploid somatic status of the Caninae is maintained by the fusion of tetraploid egg cells and haploid sperm cells. This permanent anorthoploidy is supposed to have originated by hybridisation. The investigations the non-concerted nrITS sequences gave evidence for the allopolyploidy of dogroses. This study shows that the Caninae arose by multiple hybridisation events of extinct ProtoCaninae and roses of other sections. The results suggest the existence of a diploid ProtoCaninae genome, which forms the bivalents during meiosis. I hypothesize that a diploid Proto-Caninae hybridised with a non-dogrose. The resulting hybrid individual developed the canina-meiosis to overcome sterility. This hybrid received further non-dogrose genomes by ongoing hybridisation events. Molecular phylogenies of the Caninae are poorly resolved and do not allow a subsectional classification. The phylogeny based on the chloroplast atpB-rbcL intergenic spacer subdivides the Caninae in two clusters, one containing glandular and the other eglandular species. The low sequence polymorphism is probably caused by the young age of the Caninae. Furthermore, divergent evolution of the canina-ITS-type is probably prevented by intrasectional hybridisation events. A morphological analysis of character inheritance in artificial dogrose hybrids gave evidence for hybridisation events among dogrose species. The vegetative characters the presence of glands and hairs of leaves were according to the canina-meiosis maternally inherited. However, the taxonomically important traits: diameter of the orifice and the persistence of sepals were paternally inherited, which cannot be explained by formal genetics. This pattern of character inheritance results in the total morphological identity of certain dogrose hybrids and described species of the Caninae. Hybridisation does not only influence the evolution of the Caninae, but also prevents coevolution and cospeciation processes of dogroses with rust fungi of the genus Phragmidium. The rose rusts Phragmidium mucronatum and P. tuberculatum do not show any niche differentiation within three different dogrose species. Despite the overlapping host range and the strong morphological resemblance of two rusts they have no sister group relationship in an nrLSU based phylogeny. P. mucronatum belongs to a core rust clade whereas the ancestor of P. tuberculatum is supposed to have undergone a host jump from Rubus or Sanguisorba (Rosoideae, Rosaceae). 85 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) 9. Referenzen Ainouche, M. L. & Bayer, R. J. (1997): On the origins of the tetraploid Bromus species (section Bromus, Poaceae): insights from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA. Genome 40 (5): 730-743. Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003): Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molec. Phylogenet. Evol. 29 (3): 417-434. Arnold, M. L. (1997): Natural hybridization and evolution. Oxford University Press, New York, Oxford. Bailey, C. D., Carr, T. G., Harris, S. A. & Hughes, C. E. (2003): Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes. Molec. Phylogenet. Evol. 29 (3): 435-455. Baker, J. G. (1869): Monograph of British roses. J. Linn. Soc 11: 197-243. Baldwin, B. 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Hellwig dafür, dass ich im Institut für Spezielle Botanik arbeiten durfte, für viele anregende Diskussionen und Ratschläge und für die wissenschaftliche Motivation. Prof. G. Theißen für die Möglichkeit in den Laboren des Lehrstuhls für Genetik die Klonierungen zusammen mit der unverzichtbaren Hilfe von Monika Völkel durchzuführen und dafür, dass er immer ein offenes Ohr für meine „Hundsrosensorgen“ hatte, und mir viele wertvolle Tipps und Anregungen vermittelt hat. Prof. Dr. K. Bachmann und Heike Schmuths dafür, dass ich mit ihnen zusammen am IPK Gatersleben meine Sequenzdaten auswerten durfte und für das Korrekturlesen des Publikationsmanuskriptes und viele wertvolle Hinweise. Prof. Dr. V. Hemleben dafür, dass ich sie in Tübingen besuchen konnte und sie sich Zeit genommen hat, mit mir über ITS-Evolution und Entstehung von Hundsrosen zu diskutieren und für die wertvollen Ratschläge, die daraus hervorgegangen sind. Prof. Dr. F. Oberwinkler, für die Möglichkeit einen Teil der Rostsequenzierungen im Labor des Instituts für Spezielle Botanik / Mykologie in Tübingen durchzuführen und für viele wertvolle Ratschläge. Wolfgang Maier, für die ausdauernde Hilfe bei den Laborversuchen für die Rostsequenzen, für die große Geduld und den Langmut bei der Korrektur unserer gemeinsamen Veröffentlichung, für sein exzellentes Auge zur Rostbestimmung, für viele tief greifende und anregende Diskussionen und für die herzliche Aufnahme und Unterbringung in Tübingen. Dr. F. Eggeling für die Möglichkeit meine Einzellpollenkornversuche im Institut für Humangenetik in Jena durchzuführen. Susanne Michel und Bettina Schimmel für die unersetzliche Hilfe bei der Bedienung der wunderbaren Mikroskope. 92 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Katrin Lehmann für die nette und lustige Begleitung auf unseren gemeinsamen Sammelreisen. Nadine Drechsler und Rainer Melzer für engagierte ihre Hilfe beim Sequenzieren und Mikroskopieren. Ludwig Martins und Jörn Hentschel für die anregenden Diskussionen über phylogenetische Rekonstruktion im Allgemeinen und „MrBayes“ im Speziellen. Stefan Arndt für eine wirklich angenehme Zimmergemeinschaft, für viele gute Tipps und Ratschläge, und zwar nicht zur Promotion, für jede Menge Nervennahrung und viele schöne gemeinsame Familienwochenenden. Sämtlichen Mitarbeitern des Instituts für das angenehme Arbeitsklima und für viele Hilfen und Anregungen Prof. Dr. R. Gradstein für die Möglichkeit, die Hybridrosensammlung von Dr. V. Wissemann im Botanischen Garten in Göttingen unterzubringen und für die Möglichkeit dort zu arbeiten. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Finanzierung des Forschungsprojektes. „Radiation, Genese biologischer Diversität und Interaktion im Coevolutionssystem Rosen, Rostpilze, gallbildende Insekten“ (wi20/28-1) und damit für die Finanzierung meiner Stelle. Dem Europarosarium Sangerhausen und der Rosensammlung Kassel-Wilhelmshöhe für die Bereitstellung von Pflanzenmaterial. Der VDR-Stiftung Europarosarium Sangerhausen für die finanzielle Unterstützung der Laborarbeiten. Den Mitgliedern des Arbeitskreises Wildrosenfreunde für die freundliche Unterstützung meiner Arbeit und für die Hilfe beim Auffinden geeigneter Hundsrosenpopulationen. Meinen Eltern und meinem Bruder für ihr Verständnis und ihre Unterstützung. Schließlich meinem Mann Markus für die geduldige Hilfe bei vielen statistischen Problemen, für sein stets geduldiges Zuhören und für seine vielen Ermutigungen und meiner Tochter Henriette für die nötige Ablenkung und Freude. 93 Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Lebenslauf Name Geburtsdatum Geburtsort Familienstand Christiane Maria Ritz, geb. Scholz 23.03.1978 Karl-Marx-Stadt, jetzt Chemnitz verheiratet, ein Kind Schulbildung 1984-1992 Polytechnische Oberschule Fritz Schmenkel bzw. Oberschule Schönau in Chemnitz 1992-1996 Johann-Wolfgang-von-Goethe-Gymnasium in Chemnitz Abschluss: Abitur (Note: 1,0) Universitätsausbildung 1996-2002 Biologie Studium (Biologie, Diplom) an der Technischen Universität Dresden 2001-2002 externe Diplomarbeit am Institut für Spezielle Botanik an der Friedrich-Schiller-Universität Jena mit dem Titel: „Molecular, morphological and anatomical investigations on the phylogeny of the Meleuphorbia-complex of the genus Euphorbia L.“ (Betreuer: Prof. F. H. Hellwig) Diplomabschluss (Note: 1,0) 2002 2002-2005 Promotionsstudium am Institut für Spezielle Botanik der Friedrich -Schiller-Universität Jena mit dem Thema „Evolution von Wildrosen“ Berufstätigkeit 2002-2004 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Spezielle Botanik im DFG Projekt: „Evolution von Wildrosen I“ des DFGSchwerpunktprogramms: Radiationen-Genese biologischer Diversität April 2004September 2004 Elternzeit ab Oktober 2004 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Spezielle Botanik im DFG Projekt: „Evolution von Wildrosen II“ des DFGSchwerpunktprogramms: Radiationen - Genese biologischer Diversität Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Praktika 1999 Queen Sirikit Botanic Garden, Chiang Mai, Thailand (2 Monate) 2000 Illinois State University, Dept. of Biology, Evolutionary Systematics (Lab D. Byers), Illinois, USA (2 Monate) Ort, Datum Christiane Ritz Christiane Ritz Evolution von Hundsrosen (Rosa L. sect. Caninae (DC.) SER.) Ehrenwörtliche Erklärung Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass mir die geltende Promotionsordnung der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena bekannt ist und ich die vorliegende Arbeit selbst angefertigt habe. Alle von mir benutzten Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen habe ich in meiner Arbeit angegeben. Bei der Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes haben mich die in der Danksagung auf Seite 92 der Dissertation genannten Personen unterstützt. Ferner erkläre ich ehrenwörtlich, für die Anfertigung der Arbeit keinen Promotionsberater in Anspruch genommen zu haben, und dass Dritte weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten erhalten zu haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Dissertation habe ich bisher nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere wissenschaftliche Prüfung vorgelegt. Auch habe ich weder diese Dissertation noch eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Abhandlung bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht. Jena, den 6. April 2005 Christiane Ritz