2.1   人脂肪间充质干细胞的形态学特征   倒置显微镜下可见不同方法获取的原代细胞接种后1 d开始贴壁，形态呈卵圆形；2 d后贴壁细胞数量逐渐增加，形态向长梭形过渡；培养3 d左右，贴壁细胞明显增多，且形态逐渐呈长梭形；在第7天左右，细胞融合至90%左右，生长呈一定的规律性，以组织块为中心，不断向周围生长，呈旋涡状，见图1。



2.2   人脂肪间充质干细胞的产量比较   胶原酶Ⅰ消化后细胞于24 h大量贴壁，在第3天细胞不断从未消化完全的疏松组织块中爬出，原代细胞培养至3 d和7 d后，细胞计数比较发现，改良法每1 g脂肪组织获取的细胞产量明显高于常规胶原酶Ⅰ消化法，具有显著性差异，见图2。



2.3   人脂肪间充质干细胞活力的比较    计数12代以内人脂肪间充质干细胞，常规组的细胞活力均为95%左右，而改良组的细胞活力均为98%左右。
2.4   人脂肪间充质干细增殖能力的比较   用细胞计数法检测两组细胞生长增殖能力，观察发现两种不同方法所培养的人脂肪间充质干细胞生长曲线均呈“S”型。经计算，常规组细胞的群体倍增时间为49.51 h，而改良组群体倍增时间为41.34 h，见图3。




2.5   人脂肪间充质干细胞表面抗原鉴定   运用流式细胞术检测改良组第3代人脂肪间充质干细胞表面抗原的表达，结果表明，CD105、CD73与CD44均呈阳性，且纯度均达93%以上，见图4。



2.6   人脂肪间充质干细胞的成骨及成脂分化 
2.6.1   成骨分化   镜下观察见未诱导的人脂肪间充质干细胞镜下形态均一，呈长梭形，当细胞融合至80%-90%时，表现为鱼群样生长，碱性磷酸酶染色胞浆呈淡灰色，碱性磷酸酶活性为阴性，见图5A。

诱导后的细胞形态由长梭形变为多角形，逐渐成复层生长，部分区域出现点状钙化斑，且钙化斑随着诱导的时间逐渐增大。诱导2周后行碱性磷酸酶染色，成骨诱导组细胞胞浆呈灰黑色，见图5B。



2.6.2   成脂分化   镜下观察发现，成脂诱导 3 d后细胞逐渐由长梭形变为卵圆形、多角形，部分细胞内可见多个小脂滴。诱导2周后油红O染色显示细胞内有大小不一的橘红色脂滴，部分融合成团，大部分细胞胞浆被染成橘红色，见图6。

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间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能[1-2]，是组织工程的重要组成部分，最早于1974年在骨髓中被发现[3]，主要包括骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞及脐带间充质干细胞等[4-5]，其中脂肪间充质干细胞是一种从脂肪组织中获取的间充质干细胞，主要来源于脂肪组织的基质血管部分[6-7]。ZUK等[8]2001年首次在脂肪中分离出了脂肪间充质干细胞，为干细胞的研究提供了新的方向。脂肪间充质干细胞可以通过分泌细胞因子、脂肪因子、生长因子、血管生成因子和神经营养因子来促进功能恢复或减少损伤[9-10]。

与其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有以下优势：①脂肪间充质干细胞提取浓度明显高于骨髓、胚胎、脐带等其他来源的间充质干细胞[11]；②脂肪间充质干细胞获得的途径多且方法较为简单[12]；③脂肪间充质干细胞体外增殖能力强，更易培养[13]；④脂肪间充质干细胞更适合同种异体移植[14]；⑤脂肪间充质干细胞受到伦理学的限制较小[15]。

目前，体外培养脂肪间充质干细胞尚无标准化的方法，大部分研究者采用胶原酶消化法[16]、组织块法及双通脂肪乳糜器提取脂肪间充质干细胞[17-18]，而基础培养基、胶原酶的种类与浓度、消化时间、离心的转速及时长等都存在差异。由于脂肪间充质干细胞属于脂肪组织中的基质血管成分，在提取过程中如果消化不完全，就会极大降低提取的细胞浓度。供者的性别及脂肪组织提取部位也会影响脂肪间充质干细胞的获取浓度。高龄、肥胖、糖尿病和内分泌治疗等会降低脂肪间充质干细胞的增殖和分化潜能[19]。在该实验中，选择50岁以下无代谢性疾病患者的皮下脂肪组织，利用胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法期望能够获取更多活力好、增殖能力强的人脂肪间充质干细胞，为更多的研究者提供一个高效的获取方法，便于后续研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   利用两种方法获取人脂肪间充质干细胞，观察其形态，比较不同方法对细胞获取量、细胞活力及增殖能力的影响，并对改良法获取的细胞进行表面标志物及分化能力的鉴定。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年11月在牡丹江医学院医药研究中心完成。
1.3   材料
1.3.1   人脂肪组织   来源于牡丹江医学院附属医院外科手术患者，年龄< 50岁，无影响糖脂代谢性疾病，无吸烟、酗酒史。获取皮下脂肪组织，告知患者及其家属此次实验目的，并签署相关知情同意书。该研究的实施符合牡丹江医学院的相关伦理要求(伦理批号：2020-MYK012)。
1.3.2   实验试剂及仪器   胎牛血清及低糖DMEM(Hyclone公司，美国)；胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶(Gibco公司，美国)；抗CD44、CD73及CD105单克隆抗体(Invitrogen公司，美国)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂、油红O染色试剂盒(碧云天公司，中国)；维生素C、吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、链霉素、青霉素(Sigma公司，美国)；β-甘油磷酸钠(上海源叶生物公司，中国)；FITC标记-IgG(北京中杉)；超净工作台(哈尔滨东联，中国)；CO2培养箱(三洋公司，日本)；倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)；移液枪(Eppendorf公司，德国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   取材   取干净无污染的皮下脂肪组织块放入无菌采样管中，迅速带回实验室。
1.4.2   人脂肪间充质干细胞的原代培养   称量脂肪组织，将脂肪组织随机分为2组，分别用传统胶原酶Ⅰ消化法及改良胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法提取人脂肪间充质干细胞。
(1)胶原酶Ⅰ消化法：用0.01 mol/L无菌PBS冲洗脂肪组织至无血色，去除血管及结缔组织后剪成约1 mm3大小的碎块，加入等体积0.1%胶原酶Ⅰ于37 ℃条件下振荡消化60 min，至糊状；终止消化，200目筛网过滤，收集滤液并离心(1 000 r/min，15 min)；将下层细胞重悬于培养基中(含体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素的低糖DMEM培养基)，接种至培养瓶，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养；待细胞融合至80%-90%，1∶3传代培养。
(2)胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法：用无菌0.01 mol/L PBS反复冲洗脂肪组织，直至无血色；应用无菌眼科剪刀和镊子去除多余组织，将其剪成约1 mm3大小，加入等体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡消化30 min；用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化后，以1 000 r/min的速度离心15 min；弃上清，将未消化完全的结构松散的组织块及下层的细胞团重悬，接种于培养皿并放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内稳定培养；待细胞融合至80%-90%，1∶3传代培养。

1.4.3   计数细胞产量   分别用两种不同方法提取1 g脂肪组织中的人脂肪间充质干细胞，2 d后首次换液，之后每3 d更换培养基，分别用锥虫蓝拒染法计数原代第3天和第7天细胞。收集细胞制成单细胞悬液，将细胞悬液与锥虫蓝溶液混合，使锥虫蓝终浓度为0.04%，染色3 min左右。将盖玻片盖在事先消毒好的计数板上，从盖玻片的一侧加入10 μL细胞悬液，加样过程中混悬液不要溢出盖玻片，不要产生气泡。在倒置显微镜下，分别计数四大格中蓝染的细胞总数及未蓝染的细胞总数，对于压线的细胞，只计上侧和左侧，分别计数3次，取平均值，计算细胞总数。
1.4.4   人脂肪间充质干细胞活力检测   利用锥虫蓝拒染法计数不同方法获取的第1-12代人脂肪间充质干细胞的活细胞数，计算活细胞/死细胞的百分率。
1.4.5   人脂肪间充质干细胞增殖能力检测   将不同方法获取的第3代人脂肪间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，以每孔5×103个接种于24孔板中；每天随机消化3孔，用锥虫蓝拒染法计数，连续观察9 d，以横坐标为细胞培养时间，纵坐标为单位细胞数，绘制人脂肪间充质干细胞的生长曲线图。采用Patterson公式DT=Δt×lg2/lg(Nt/No)计算人脂肪间充质干细胞的细胞群体倍增时间(DT)[20]，Δt为细胞培养时间，No为细胞对数生长期细胞的首次计数值，Nt表示培养时间为t时的细胞数。一般情况下，No在细胞培养24 h后计数，而Nt常为对数生长期终点时的细胞数。
1.4.6   流式细胞仪检测改良组人脂肪间充质干细胞表面标志物   将改良法获取的第3代人脂肪间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化，细胞数约为2×105个，用预冷的0.01 mol/L PBS重悬并洗涤细胞2次(1 500 r/min，10 min)，常温下孵育一抗(CD105、CD73、CD44，1∶100)0.5 h；PBS洗净一抗后，加入1∶50的FITC-二抗孵育液，4 ℃避光条件下孵育0.5 h；再次充分洗涤后用少量PBS重悬细胞，用于流式细胞仪(FACS)分析。
1.4.7   改良组人脂肪间充质干细胞成骨及成脂分化   将改良法获取的第3代人脂肪间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至1×108 L-1，均匀接种于24孔板，24 h后更换为成骨诱导液(含0.2 mmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8 mol/L地塞米松，体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基)或成脂诱导液(含0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素、4 mmol/L L-谷氨酰胺、体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基)[21]，每3 d换1次液，倒置显微镜下观察。
成骨诱导2周后，细胞爬片，用体积分数10%中性甲醛固定0.5 h左右；加入预温的碱性磷酸酶孵育液，37 ℃恒温箱内孵育3 h以上；无菌蒸馏水充分水洗1 min，共3次，2%硝酸钴水溶液处理5 min；再次用无菌蒸馏水充分水洗两三次；1%硫化铵水溶液作用1 min，流水水洗后用无菌蒸馏水充分水洗1 min，共3次；常规脱水、透明，中性树胶封固，显微镜下观察。
成脂诱导2周后，常规细胞爬片，用体积分数10%中性甲醛固定0.5 h左右，用60%异丙醇或体积分数75%乙醇进行漂洗；以3∶2的比例取适量油红O储备液及蒸馏水，室温下将其混合后静置片刻，滤纸过滤，染色10 min左右；60%异丙醇或体积分数75%乙醇漂洗，去除多余的染液；无菌蒸馏水充分冲洗，Mayer氏苏木精淡染核5 min左右；1%盐酸乙醇粗略分化，流水漂洗10 min左右后置于载玻片上，甘油明胶封固，显微镜下观察。
1.5   主要观察指标   ①常规法与改良法提取的人脂肪间充质干细胞的生物学特征(形态、产量、活力、增殖能力)；②改良法获取的人脂肪间充质干细胞表面标志物CD44、CD73、CD105的表达；③改良法获取的人脂肪间充质干细胞的成骨及成脂分化能力。
1.6   统计学分析   采用SPSS 25.0软件进行数据整理并进行统计分析，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过牡丹江医学院公共卫生学院统计学专家审核。

近年来，随着医学的不断发展，许多疾病的治疗都是基于干细胞疗法，这也是目前再生医学的研究热点。脂肪是包含免疫细胞、脂肪间充质干细胞、血细胞和成纤维细胞等多种类型细胞的组织[22]。脂肪间充质干细胞因其易获得、增殖能力强、可以定向分化为不同的细胞类型，且具有低免疫原性和免疫调节性的特性，被视为目前最具潜力的研究对象之一[22-23]。目前，脂肪间充质干细胞对于疾病治疗的研究非常广泛，如骨性关节炎[24]、皮肤创面愈合及新冠肺炎等[25-26]。现阶段主要通过原代培养获取人脂肪间充质干细胞，因其生物学特性更加适合于人类疾病细胞移植及组织工程学研究的应用[27]。所以，如何简单且高效地获取人脂肪间充质干细胞就成为研究者需要考虑的首要问题。

若想获得足够量的细胞，常规运用胶原酶Ⅰ消化法提取人脂肪间充质干细胞通常需要消化60 min左右，由于消化的时间过长，导致获得的细胞活性变差；而单独使用组织块培养法提取的人脂肪间充质干细胞，虽然细胞活性好，但细胞贴壁速度较慢，获取足够量的细胞就需要更长的时间；近年来部分研究者采用双通乳糜器、吸附柱等来提取人脂肪间充质干细胞[18]，但这些技术多受脂肪来源、实验条件等多种因素的限制。因此，该实验应用胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法提取人脂肪间充质干细胞，将酶消化时间缩短为30 min，使组织块变得疏松，利于细胞从组织块中爬出，降低胶原酶Ⅰ对于细胞活力的影响。在原代培养的过程中，为了探讨胶原酶Ⅰ对细胞活力的影响，应用了锥虫蓝拒染法计数细胞数量，计算活细胞/总细胞的百分率，即细胞活力。常规组人脂肪间充质干细胞的细胞活力约为95%，而改良组的细胞活力约为98%，这在一定程度上提示改良法降低了胶原酶对于细胞活力的影响。同时，采用改良法分离的人脂肪间充质干细胞的产量极高，每1 g脂肪能分离出(4.0-5.0)×106个原代细胞，且提取的细胞可以稳定传代，这满足了组织工程对种子细胞数量的需求[28]。

倒置显微镜观察发现，细胞在培养3 d左右形态逐渐生长为长梭形，7 d左右即可融合至80%-90%，且细胞呈鱼群样生长。人脂肪间充质干细胞在体外可传至第13代，镜下观察发现细胞形态始终呈纺锤形或长梭形，且均匀一致，无明显变化，这符合间充质干细胞的镜下形态学特征[29]。通过比较两种不同方法从相同质量的脂肪组织中获取的原代人脂肪间充质干细胞在培养3，7 d时的数量，结果发现，在3 d时常规酶消化法由于消化时间充足，所获取的细胞较改良组多，但随着贴壁细胞的不断增殖以及组织块中细胞的不断爬出，改良法所获取的细胞数量远多于常规酶消化法。同时，从绘制的细胞生长曲线可以观察到，两种方法所获取的细胞在前48 h均处于潜伏期，从第3天开始进入快速上升的对数生长期，改良组细胞生长速度明显快于常规组，常规组在第7天达生长高峰，随后生长速度逐渐变缓，进入稳定的平台期，而改良组到达平台期仅需6 d左右，且两组细胞到达平台期后，改良组的细胞数也远多于常规组。经计算，常规组人脂肪间充质干细胞的群体倍增时间为49.51 h，而改良组人脂肪间充质干细胞的群体倍增时间为41.34 h，这说明两组细胞均具有高效的增殖能力，但改良组的增殖能力更强。

利用流式细胞术检测了第3代改良组人脂肪间充质干细胞的免疫学表型，结果显示CD105、CD73与CD44均呈阳性，且纯度均达93%以上，这符合间充质干细胞表面标志的特性[22]，表明通过此方法可获得高纯度的人脂肪间充质干细胞。

为了证实改良法获取的细胞具有多向分化的能力，利用碱性磷酸酶染色评估了人脂肪间充质干细胞成骨分化的能力。未成骨诱导的细胞碱性磷酸酶染色后胞浆呈淡灰色，碱性磷酸酶活性为阴性，而成骨诱导2周的人脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶染色后，细胞胞浆呈灰黑色，碱性磷酸酶活性为阳性。同时，利用油红O染色评估了人脂肪间充质干细胞成脂分化的能力，第3代细胞成脂诱导3 d后，细胞形态逐渐由典型的长梭形变为多边形或类圆形，7 d左右可见部分细胞内出现小脂滴，14 d后可见大小不一的橘红色脂滴部分融合成团，大部分细胞胞浆被染成橘红色。通过以上两种染色鉴定，发现改良组碱性磷酸酶染色与油红O染色结果与常规酶消化法获取的细胞染色结果无明显差别[21]，表明改良组人脂肪间充质干细胞具有良好的成骨及成脂分化能力。

综上所述，运用改良法成功获取了人脂肪间充质干细胞，并通过比较两组细胞的产量及生长状况，同时鉴定其表面抗原与多向分化能力，发现改良法获取的细胞活力更强，细胞产量多于相同条件下的常规法，而分化能力无明显差异。这种改良方法的使用提高了脂肪组织的利用率，节约了研究者的时间和成本，这将为细胞移植治疗及组织工程学研究提供丰富的种子细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
胶原酶消化法：该方法是获取脂肪间充质干细胞最常用的方法，目前对于酶的类型、浓度以及消化所需时间等没有统一的标准。酶消化时间足够充分时能够在较短的时间内获得足量的原代脂肪间充质干细胞，但在酶的影响下细胞活力和增殖能力会变差。
胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法：0.01 mol/L无菌PBS冲洗脂肪组织至无血色，将组织用无菌眼科剪刀和镊子清理干净后剪成约1 mm3大小，加入适量的0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃下振荡消化30 min；用含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化并离心(1 000 r/min，15 min)；弃掉离心后的混悬液上清，将未消化完全的组织块及下层的细胞团重悬，混匀后接种至培养皿，放入37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Zuk 等人于2001年从吸脂术抽取的脂肪中发现人脂肪间充质干细胞，科研工作者们发现其具有成骨、成脂、成软骨及成神经等多向分化的潜能。近年来，人脂肪间充质干细胞在整形医学、临床治疗及组织工程学等方面都受到广泛关注，这使得种子细胞的获取、培养传代及扩增成为了重中之重。该实验通过酶消化联合组织块法获取大量活性好、增殖能力强、可稳定传代的人脂肪间充质干细胞，并鉴定其表型及分化能力，以期为将来进一步的科学研究打下坚实基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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