微挥和荧光素-提拉美化物，用于小鼠肾上腺的多重免疫染色 – 使用来自同一宿主物种的未结合原抗体

在多路免疫染色中，使用结合原抗体直接染色可提供信息性结果。不使用二级抗体，直接染色方法具有来自抗体交叉反应的虚假共定位信号的低风险。然而，在原抗体上的偶联记者（荧光、酶）或生物锡限制了其未来用途。或者，间接免疫染色通常通过使用未结合的初级抗体与标记的次级抗体提供更强的信号。理想情况下，用于多倍免疫染色的未结合原抗体应来自不同宿主物种，以避免抗体交叉反应。然而，不同宿主物种的初级抗体的适当组合并不总是可用的。

已经建立了几种方法来消除二级抗体与不需要的初级抗体反应的风险。一种常见的方法是使用F（ab）单体抗体在第二原抗体¹染色之前，阻断第一原抗体复合物上任何剩余的结合表位。抗体剥离，这是类似于条带和重新探针的西方斑点片，去除以前染色的抗体复合物，而不剥离可检测的检测报告分子的沉积，如3，3'-二氨基苯甲二甲酸酯四氯化物^（DAB）2和荧光酪酰胺沉积^3。使用这种方法，不同颜色的记者从分子可以在同一张幻灯片上显示多路复用结果。通过完全去除先前沉积的抗体层，以及从其他抗体^4、5中对齐随后获得的图像，也可以实现多重染色。这些方法都提供了可靠的结果，尽管每种方法都有其局限性，并且需要复杂的过程或特殊的成像系统。

本协议显示了使用常用缓冲液的抗体剥离方法的应用。该协议可用于对正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 小鼠肾上腺部分执行多倍免疫荧光染色，同时使用来自同一宿主物种的两种未标记的主要抗体。

1. 使用第一抗体染色

1. 脱蜡和再水化 FFPE 滑动，每个步骤分配 5 分钟：二甲苯或等效试剂 3x、100% 乙醇 2x、95% 乙醇 1x、70% 乙醇 1x、50% 乙醇 1x 和蒸馏水 2x。
   注：滑轨应从此补液步骤开始保持湿润，直到安装到最后一步。
2. 对于可选的抗原检索，将幻灯片放入 275 mL 的沸腾柠子钠溶液（10 mM，pH = 6.0）8分钟。为了保持溶液沸腾，将幻灯片平放在 14 x 9.5 x 9 cm³ （W x L x H） 移液器的底盒上，带盖子和微波炉，将溶液在 700 W 微波炉中加热 8 分钟。然后从微波炉中取出移液器提示盒，打开盖子，让溶液在室温 （RT） 下冷却至少 20 分钟。
3. 将滑片转移到含有PBST（磷酸盐缓冲盐水，含0.1%多索巴20/80）的科普林罐中。用 PBST 清洗 5 分钟 3 倍。如果未立即移动到下一步，则将此步骤中的幻灯片与 PBST 一起存储在 RT 处的 Coplin jar 中数小时，或在 4°C 下存储 1-2 天（如果不立即移动到下一步）。
4. 准备阻滞溶液使用二级抗体宿主物种的正常血清作为阻断试剂。也可以使用其他商业阻断试剂。如果使用本研究提出的正常血清，将100μL的正常驴血清加入4.9 mL的PBST。阻隔溶液可在4°C下储存长达3天。
5. 要进行阻塞，请从幻灯片上摆脱 PBST，并快速用足够的阻止解决方案覆盖它们。在加湿室中用RT孵育幻灯片30分钟。
6. 使用阻隔溶液制备原抗体溶液（两个幻灯片为500 μL），将原抗体稀释至所需浓度。溶液应储存在冰上，直到使用。
   1. 对于3+HSD，将2μL的3μHSD加入498μL的阻断溶液中。
   2. 对于TH，将0.5μL的TH抗体加入499μL的阻断溶液中。
   3. 对于β-卡腾宁，将1μL的β-卡泰宁抗体加入499μL的阻断溶液中。
   4. 对于20μHSD，在499μL的阻断溶液中加入1μL的20+HSD抗体。
   5. 对于CYP2F2，将2μL的CYP2F2抗体加入498μL的阻断溶液中。
7. 通过从幻灯片中摇动阻塞溶液，用足够的原抗体溶液快速覆盖原抗体，孵育原抗体。在4°C的加湿室中孵育幻灯片过夜。在孵育过程中，幻灯片可以覆盖一小块石蜡薄膜，以防止干燥。
8. 第二天早上用PBST清洗幻灯片5分钟3次。
9. 使用阻隔溶液将生物浸化二级抗体稀释至所需浓度（例如，驴抗小鼠抗体的1μL或驴抗兔抗体进入499μL的阻断液）制备二级抗体溶液（两片幻灯片为500μL）解决方案）。溶液应储存在冰上，直到使用。
10. 通过从幻灯片上甩掉PBST，用足够的二级抗体溶液快速覆盖它们，孵育第二抗体。在 RT 处将幻灯片孵育在加湿室中 1 小时。
    注：如果内源性生物锡是一个问题，请使用过氧化物酶结合的二级抗体，而不是生物异位化二级抗体。如果在步骤 1.10 中使用过氧化物酶结合的二级抗体，则跳转到步骤 1.14。
11. 用 PBST 清洗幻灯片 5 分钟 3 倍。
12. 在PBS的499μL中加入0.5 μL的SA-HRP溶液（两片幻灯片为500 μL），制备马萝卜过氧化物酶结合链球菌蛋白（SA-HRP）溶液（两片幻灯片为500μL）。最终浓度为1微克/mL。
13. 使用 SA-HRP 解决方案孵育。从幻灯片中摆脱 PBST，使用足够的 SA-HRP 解决方案快速覆盖幻灯片。在 RT 处将幻灯片孵育在加湿室中 0.5 小时。
14. 用 PBST 清洗幻灯片 5 分钟 3 倍。
15. 根据制造商的说明（例如，5 μL 的荧光磷-酪酰胺）将氟磷-酪酰胺与其稀释缓冲液稀释至稀释缓冲液（例如，将 5 μL 的氟磷-酪酰胺转化为 496 μL 稀释缓冲液），从而制备荧光酸酯溶液。
16. 通过从幻灯片中甩出PBST，用足够的荧光磷-酪酰化物溶液快速覆盖幻灯片，使用氟磷-酪酰胺执行信号开发。在RT的加湿室中孵育1分钟。可以调整孵育时间以获得所需的荧光强度。通过将幻灯片转移到含有 PBST 的科普林罐中，停止反应。用 PBST 清洗幻灯片 3 分钟 2 倍。
17. 信号可以在荧光显微镜下快速检查，以确认该阶段的结果。如果未使用盖玻片，请在每个部分涂抹一滴甘油：PBS （1：1），以保持样品湿润。用 PBST 清洗幻灯片 3 分钟 2 倍。在进入下一步之前，幻灯片可在 4°C 的 PBST 中存储几天。

2. 剥去第一抗体

1. 将滑片放入 275 mL 的沸腾柠子钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中至少 8 分钟。将幻灯片平放在 14 x 9.5 x 9 cm³ （W x L x H） 移液器底部，带盖子，在 700 W 微波炉中用 70% 的功率微摇溶液 8 分钟，使溶液保持沸腾。如果首选较长的剥离时间，则可能需要使用沸腾的柠酸钠溶液从缓冲液中顶下，以保持幻灯片始终保持在缓冲液中。从微波炉中取出移液器提示盒，打开盖子，让溶液在 RT 下冷却至少 20 分钟。
2. 将幻灯片转移到包含 PBST 的科普林罐中。用 PBST 清洗 5 分钟 3 倍。如果不立即执行下一步，将幻灯片存放在带有 PBST 的 Coplin 罐中，在 RT 上存放几个小时或 4°C 1-2 天。

3. 第二抗体染色

1. 从阻止步骤开始，按照步骤 1.5 中的步骤 1.5 到步骤 1.14 中的相同过程。在信号开发步骤（步骤 1.15 和步骤 1.16）中，在不同的荧光光谱中使用荧光素-酪酰胺。
   注：可以使用此方法多次剥离幻灯片，以便进行多路染色。最后一种抗体不需要作为报告人使用氟磷-酪酰胺。荧光团二级抗体可用于显示来自最后一个初级抗体的信号。
2. 在RT孵育2μg/mL 4'，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）或Hoechst溶液，如果需要核计数器染色，在RT上孵育1分钟。然后用 PBST 清洗幻灯片 3 分钟 2 倍。

4. 使用荧光显微镜检测信号的成像

1. 安装盖玻片，安装一滴适合免疫荧光的安装介质。
2. 对于成像，使用荧光显微镜检测每个荧光通道的信号。从核染色 （DAPI） 通道和 4x 透镜开始，以定位幻灯片上的组织。
3. 切换到 10 倍镜头进行成像。调整曝光时间（300 ms）和光源强度（80%强度）。如果信号太亮或太暗，请调整这些设置。在不移动舞台的情况下拍摄每个通道的照片。每个通道可能需要重新聚焦。使用显微镜的软件或 ImageJ（imagej.nih.gov/ij/）合并每个通道的图像。

结果来自经过所有步骤处理的样本，包括抗原检索步骤1.2。这里使用的所有二级抗体都是生物异位。氟磷-酪酰胺用于从第一和第二原抗体产生信号。使用配备 FITC 立方体（用于绿色荧光）、TxRED 立方体（用于 Cy3）和 DAPI 立方体（用于 DAPI）的荧光显微镜捕获图像。

微摆动介导剥离消除了交叉反应性。
小鼠FFPE肾上腺部分使用两个原发性兔子抗体染色。在没有剥离（图1A-C）的情况下，TH的二级抗体拾取了3μHSD（+）位点，并在肾上腺皮质发出红色信号（图1B）。缺乏剥离导致黄色（图1C）中出现错误的共定位信号。这种交叉反应性来自 （1） 促进第一个酪酰胺反应的 HRP 酶和 （2） 抗体物种交叉反应。为了从第一次免疫染色中去除抗体交叉反应和HRP，我们测试了1分钟（图1D-F）和8分钟微波介导剥离（图1G-I）。两种处理都足以消除非特异性信号，产生清洁的双重染色结果（图1F，I）。阴性对照遵循所有相同的步骤，除了与原抗体孵育（图1J）。在负控制中未拾取任何重要信号。我们发现，在沸腾的丁酸盐缓冲液中剥离8分钟就足以消除肾上腺中常用的许多抗体的抗体交叉反应（图2）。

限制 - 微波介导剥离的功效是抗体依赖。
尽管该协议中使用的微波介导剥离适用于大多数情况，但这种方法存在局限性。对于某些抗体，具有酸盐缓冲液的微波介导剥离方法可能无法完全去除抗体的交叉反应性。例如，8分钟的剥离从小鼠抗TH抗体和小鼠抗CYP2F2抗体中去除了大多数非特异性信号，但仍可检测到弱假阳性信号（图3E中的medulla和图3K中的内皮层）。请注意，将微摆动时间增加到20分钟仍不能完全消除抗体交叉反应（图3H，K）。

图1：P1 FFPE小鼠肾上腺功能代表性双免疫染色。FFPE小鼠肾上腺部分被兔子的两种主要抗体染色：抗3μHSD（绿色+皮层），抗TH（红色=梅杜拉）。三组污渍包括三种不同的剥离程序：（A-C）无剥离，D-F） 1 分钟剥离，和 （G-I） 8 分钟剥离。请注意，在没有微摆动的情况下，带TH的二级抗体仍然接收3μHSD信号，而在1分钟和8分钟的微波处理组中获得特定的染色结果。阴性对照中没有阳性信号，没有用原抗体孵育。刻度条 = 100 μm. DAPI = 细胞核，蓝色。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：P21 FFPE小鼠肾上腺功能代表性双免疫染色。FFPE小鼠肾上腺部分被兔子的两种主要抗体染色，顺序如下：抗β-卡泰宁（绿色=外皮层），然后是抗20μHSD（红色=内皮层）。中间执行了 8 分钟的剥离步骤。刻度条 = 100 μm;DAPI = 细胞核，蓝色。请点击此处查看此图的较大版本。

图3：某些抗体可能无法完全剥离，这可能导致弱非特异性信号。FFPE小鼠肾上腺部分被小鼠的两种主要抗体染色：抗CYP2F2（绿色+内皮层）和抗TH（红色=梅杜拉）。无剥离组 （A-C） 的结果显示，检测 CYP2F2 蛋白质的反应仍然污染 TH（+） 区域.在肾上腺美杜拉 （C. ） 中出现了一个虚假的共定位。虽然8分钟和20分钟的微波处理降低了梅杜拉的绿色荧光强度，但一个明显的背景仍然存在（D-I）。抗CYP2F2抗体是另一个例子，表明即使在微摆动（J-L）20分钟后，交叉反应性也不能完全去除。请注意，阴性对照中没有正信号，没有用原抗体孵育，表明假阳性信号来自抗体交叉反应（M）。刻度条 = 100 μm;DAPI = 细胞核，蓝色。请点击此处查看此图的较大版本。

多路免疫染色可用于检查两种或两种以上抗原的细胞共定位。当初级抗体与不同的检测器（直接染色）结合时，这种广泛使用的技术提供了令人信服的共定位结果。然而，与间接染色相比，直接染色通常提供较弱的信号，这涉及结合的二级抗体来检测初级抗体。在间接染色中，高质量的多路免疫染色结果取决于二级抗体能否区分不同的原抗体。由于可能的抗体交叉反应，使用间接染色方法的多重染色使用来自不同宿主物种的初级抗体可以看得更清楚。卡尔等人开发了一种利用过量未结合的IgG F（ab）片段来阻止抗体交叉反应¹的抗大方案。类似的策略用于"小鼠对小鼠"染色，它使用F（ab）单体抗小鼠抗体来防止抗小鼠二级抗体检测组织中的任何内源性小鼠免疫球蛋白。然而，这种阻断方法很耗时，可能无法完全阻断先前步骤中的抗体，特别是如果检测抗原是高丰度^2。

热介导剥离是防止多倍免疫染色中抗体交叉反应的另一种方法。这个概念类似于西方斑点的条带和重新探针方法。使用微波将滑道在丁酸盐缓冲液中煮沸，对阻断抗体交叉反应具有显著的积极作用。连续几轮色度免疫染色两轮5分钟微波处理，利用小鼠单克隆抗体²在同一张幻灯片上检测多个抗原。微波处理结合使用荧光酰胺-酪酰胺作为HRP基质的甲状腺信号扩增（TSA）方法，也可用于免疫荧光双染色^3，6，7。第一和第二染色周期之间的微波处理阻止第一免疫复合物的活性，而不洗掉其荧光酪氨酸沉淀物。然而，微波处理可能无法完全防止污染在染色^8。虽然一些使用不同类型的剥离缓冲液的方法可能提供更好的剥离功效，但需要具有较长孵育时间的特殊缓冲液，或者样品需要进行图像采集，然后再应用另一个污点^{4，5，7，9，10，11。}在这里，我们演示了一个简单的方法，其程序较不复杂，并且用于在多路免疫荧光染色中微波介导抗原检索的常用缓冲液。虽然这种方法消除了大多数交叉反应，但用户应该意识到，即使在20分钟的微波处理后，也可能存在与某些抗体的弱错误共定位。

内源性生物锡可用作肾上腺皮层¹²中类固醇细胞的标记物。链球菌结合的荧光酸仅就足以检测内源性生物锡并照亮整个肾上腺皮层，特别是在冷冻部分。由于内源性生物蛋白通常被阻断在FFPE样品中，avidin-生物蛋白过氧化物酶程序（即ABC试剂盒）仍然广泛用于扩增FFPE肾上腺样本中的目标。需要注意的是，抗原检索步骤也揭开内源性生物子，诱导其免疫活性^13。由于我们的方法结合了微波介导抗原检索和使用链球菌结合的HRP，有可能内源性生物锡会导致假阳性信号，特别是在富含内源性生物锡（如肝脏、肾脏和某些肿瘤）的组织中^。如果需要阿维丁生物蛋白过氧化物酶程序来放大信号，则额外的阻断步骤，如用游自由阿丁和游免费生物蛋白预孵化，可能有助于减少内源性生物蛋白信号^14。虽然我们的方法在FFPE小鼠肾上腺上给出了一个低内源性生物蛋白背景，但在使用avidin-生物/过氧化物酶程序时，始终对每个样品进行阴性对照处理非常重要。另一种方法是使用过氧化物酶结合的二级抗体，而不是生物仿当化二级抗体。

结果表明，用丁酸缓冲液进行微波处理是多倍免疫荧光染色的有用方法。然而，应当指出，并非所有交叉反应都能完全阻止。弱错误共定位是可能的。当不同宿主物种的初级抗体没有适当的组合时，该协议可用作替代方法。用户应注意从剩余的交叉反应性以及恢复的内源性生物锡的可能误报。应始终包含适当的负控制。