Métodos diagnósticos em Doenças Micóticas

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DOENÇAS MICÓTICAS 
 
INTRODUÇÃO 
 
 
Os fungos reconhecidos por suas estruturas 
reprodutivas (fungos perfeitos) classificam-se em 
zigomicetos, ascomicetos ou basidiomicetos, com 
base no tipo de estrutura reprodutiva. Os que não 
possuem estruturas reprodutivas sexuadas 
reconhecidas são os Deuteromicetos - fungos 
imperfeitos. 
!Em geral, usa-se o nome anamórfico (assexuado) 
para descrever uma espécie de fungo. 
 
Colônia: As colônias de leveduras em geral são lisas, 
com margem regular. Já os mofos possuem colônias 
de aparência lanosa, felpuda ou aveludada, às vezes 
pontilhada com aspecto granular ou pulverulento; 
ainda, a colônia pode ter um aspecto glabro (liso). 
 
Estrutura: A estrutura filamentosa de um mofo é 
conhecida como hifa, e uma massa de hifas 
denomina-se micélio. O micélio que cresce na 
superfície ou dentro do ágar é chamado vegetativo, 
enquanto extensões acima da colônia denominam-
se micélios aéreos. 
 
Pigmentos: em alguns casos uma pigmentação clara 
pode produzir colônias coloridas (coloração leve) 
em alguns mofos hialinos. Entretanto , em colônias 
dematiáceas tanto a frente (obverso) quanto o 
verso (reverso) demonstram o pigmento escuro. 
 
Estruturas reprodutivas: O principal meio de 
reprodução assexuada das leveduras é a formação 
de blastoconídios, isto é, brotamento. Um septo 
sela o limite entre a célula-filha e a parental. Se não 
ocorrer separação, surge uma pseudo-hifa. 
 
Dimorfismo: normalmente, o isolado inicial é a fase 
de mofo, porque as placas de cultura em geral são 
incubadas a 25-30ºC. A conversão à fase tecidual é 
conseguida incubando-se uma subcultura a 37ºC. 
 
 
 
 
 
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS 
 
O maior perigo para o pessoal do laboratório vem da 
manipulação de culturas de mofos dos patógenos dimórficos 
C. immitis e H. capsulatum. 
A fase tecidual de patógenos dimórficos não é 
infecciosa por via aerógena, de modo que existe 
pouco risco de manipular amostras de tecidos com esses 
patógenos. Exceção: se C. immitis crescer em sua fase de 
mofo dentro de uma cavidade pulmonar que esteja 
conectada à árvore brônquica. 
 
*As melhores amostras para diagnóstico micológico são 
raspados, material colhido por curetagem, aspirados e 
biópsias de lesões. As amostras de biópsias devem ser 
enviadas em um recipiente estéril com solução fisiológica ou 
um meio de transporte também estéril. 
*Pelos infectados com fungos dermatofíticos (p. ex., 
Microsporum canis) fluorescem à luz ultravioleta de longo 
comprimento de onda (lâmpada de Wood) e podem ser 
selecionados para exame. 
 
 
 
 
 
 
 
EXAME DIRETO 
A fresco 
Em amostras com restos teciduais e células, pode-se usar uma solução de hidróxido de potássio (KOH) 
para dissolver o material de tecido. 
*1 gota KOH 10% na qual se imerge a amostra; (SN) aquecer levemente sem ferver. 
Gram 
Útil para a detecção de leveduras (se comportam como GP). 
Mofos podem ficar GP ou GN, mas é pouco confiável. 
Giemsa ou Wright Úteis para demonstrar as células de leveduras (histoplasmose) dentro de macrófagos. 
Nanquim 
Lembrar que embora as cápsulas geralmente sejam grandes ao exame direto das amostras, o isolamento 
do patógeno em ágar caracteriza-se pela produção de uma cápsula muito diminuída, que não é tão 
óbvia. 
*Centrifugar o LCR por 10 minutos, adicionar a 1gota do material 1 gota de Nanquim. 
Corantes 
Histoquímicos 
- O método do ácido periódico de Schiff (PAS) é útil para demonstrar detalhes internos. 
- Metenamina de prata de Gomori (GMS) é considerada uma das melhores colorações para demonstrar 
fungos pelo alto contraste com coloração mínima do fundo. 
- Hematoxilina e eosina (H&E) é importante para o estudo da reação do hospedeiro e a determinação 
quanto a um fungo ser hialino ou dematiáceo. 
- Mucicarmina de Mayer para a demonstração da cápsula mucoide de C. neoformans. 
- Fontana-Masson para a demonstração de melanina (ou similar) em agentes da feoifomicose. 
Calcoflúor branco 
Liga-se à quitina nas paredes das células fúngicas e fluoresce na cor branca ou verde-maçã quando 
exposto à luz UV de onda curta de um microscópio de fluorescência. 
Pode ser misturado com KOH para clarear a amostra. Cuida com coloração inespecífica de elementos não 
fúngicos! 
 
 
 
 
Isolamento em Cultura 
 
*O meio tradicional é o ágar Sabouraud glicose, que tem 
um pH de 5,5 a 5,6. A modificação de Emmons para esse 
meio, com menos glicose e pH de 6,8 a 7, é mais usada na 
micologia clínica como meio geral de crescimento. 
*No caso de amostras de locais não estéreis, 
recomenda-se a inoculação em ágar não seletivo 
e seletivo. Os meios de ágar seletivos mais comuns 
empregam ciclo-heximida para inibir fungos saprófitas e 
um agente antibacteriano (cloranfenicol ou gentamicina) 
para inibir bactérias. 
 
Incubação: ar ambiente a 25- 30ºC. Não é necessário 
incubar placas paralelas ou tubos a 37ºC para 
recuperação da fase de levedura de fungos dimórficos, 
porque isso acrescenta pouco aos resultados. 
*Tempo de incubação: 7 dias para detectar a presença de 
leveduras na boca, na garganta ou na vagina; 21 dias para 
patógenos fúngicos em tecidos e líquidos corporais 
estéreis que não o sangue, e até 28 dias para amostras 
respiratórias, da MO, de sangue e aquelas em que se 
suspeita de um fungo dimórfico. Em geral, todas as 
outras amostras devem ser incubadas por até 14 dias. 
 
Taxa e temperatura de crescimento: fungos patogênicos dimórficos e dematiáceos crescem mais devagar (1semana 
ou mais para ver as colônias). Crescimento rápido pode ser contaminação, mas lembrar que C. immitis pode crescer 
rapidamente em outros meios que não para fungos. 
*Mofos crescem melhor a 25- 30ºC; leveduras crescem bem a 35-37ºC. 
 
Identificação morfológica 
 
Leveduras: teste do tubo de germinação é a etapa inicial. Tubos de germinação verdadeiros são formados tanto por 
C. albicans quanto por C. dubliniensis, após crescimento em soro a 37ºC por não mais que 4 horas. 
Passa colônias para tubo com 0,5 mL de soro (humano, fetal, bovino...); incuba por 2-4 horas; visualizar 1 
gota da mistura em microscópio. 
Seguido desse teste, a incubação prossegue para o estudo subsequente da morfologia da hifa e da formação de 
clamidioconídios a 25- 30ºC (ágar com maisena, técnica de Dalmau). 
Inóculo de colônias sobre ágar com maisena contendo Tween 80. Cobrir área inoculada com lamínula e 
incubar por 24-72 horas para depois observar em microscópio. 
 
Mofos: montagem em fita de celofane, usando-se uma fita transparente que é corada com anilina azul de 
lactofenoal (algodão) (LPAB). Pode ser necessário fazer uma cultura em lâmina para preservar estruturas de 
conídios. A abordagem clássica envolve o corte de quadrados de um meio de ágar apropriado, que são suspensos em 
uma lâmina apoiada por bastões de vidro em uma placa de Petri. 
 
Identificação bioquímica 
 
*Estudo da fermentação ou padrões de assimilação. O teste da assimilação avalia a capacidade de um isolado usar 
um carboidrato como única fonte de carbono necessária para o crescimento ou de nitrato como única fonte de 
nitrogênio. O método auxanográfico de Wickerham usa um meio basal em que um carboidrato particular ou nitrato 
serve como nutriente. 
*A estimulação do crescimento por compostos 
bioquímicos é um teste secundário na diferenciação de 
certas espécies de Trichophyton - inclusão de inositol e 
tiamina em várias combinações de meios de ágar. 
*O teste para produção de urease por criptococos é de 
utilidade para diferenciá-los de Candida em amostras 
respiratórias. Teste em caldo ou ágar inclinado de 
Christensen com ureia + indicador da pH para ver 
alcalinização. Lembrar que Criptococcus não produzem 
pseudo-hifa e não crescem em meio com ciclo-heximida. 
A produção de urease em quatro dias ajuda ainda a diferenciar Trichophyton mentagrophytes (urease-positivo) de T. 
rubrum (urease-negativo), com incubação mínimade 3 dias. 
 
Identificação sorológica e molecular, TSA 
 
*A cápsula polissacarídica do C. neoformans dissolve-se no soro e 
no LCE, o que pode ser detectado pelo teste de algutinação no 
látex ou o imunoensaio enzimático. 
*A detecção de antígenos para o diagnóstico de histoplasmose 
provou ser útil quando se usa soro, urina ou líquido de lavado 
broncoalveolar. 
*Há um ELISA para detecção de antigenemia por galactomanano 
em aspergilose invasiva. FP com antibioticoterapia (pipetazo ou 
amoxa-clavulanato). 
 
- Ensaios moleculares normalmente realizados para confirmar o 
resultado da cultura. 
 
- Embora os testes de suscetibilidade de todos os isolados 
fúngicos não sejam recomendados, eles podem ser indicados: 
( 1) como parte de pesquisas periódicas que estabelecem 
antibiogramas para isolados em uma instituição; 
(2) para ajudar no tratamento da candidíase orofaríngea refratária em pacientes com falha terapêutica e 
(3) para ajudar no tratamento da candidíase invasiva, quando o uso de antifúngicos à base de azóis é incerto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referência: Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais de Henry. 21ªed. 2012.