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TAXONOMIA MOLECULAR. Bibliograf ía: Brock.10ma edici ón. Cap ítulos 10, 11. Rodicio cap. 11. Taxonom í a de procariotas: cl ásica. Se basa en el fenotipo , incluye:. morfolog ía movilidad nutrición y fisiología estructuras celulares particulares contenido de ácidos grasos.
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TAXONOMIA MOLECULAR Bibliografía: Brock.10ma edición. Capítulos 10, 11. Rodicio cap. 11.
Taxonomía de procariotas: clásica Se basa en el fenotipo, incluye: • morfología • movilidad • nutrición y fisiología • estructuras celulares particulares • contenido de ácidos grasos. • Muchas son características altamente variables, de bajo valor taxonómico. • Frecuencia de convergencia evolutiva o paralelismo.
Análisis de ácidos grasos (FAME: fatty acid methyl ester) • Caracterización de ácidos grasos de la membrana plasmática y pared celular. • Perfil de ácidos grasos es particular de cada bacteria. • Los ácidos grasos son extraídos, tratados e identificados por cromatografía gaseosa. • Resultado: cromatograma con tipo y cantidad de ácidos grasos. • Comparación con bases de datos. • Uso rutinario Desventajas: • Requiere estandarización: ácidos grasos varían en distintas condiciones. • Imposible para algunos organismos. • Variabilidad intraespecífica.
Taxonomía molecular 1- Contenido de G+C • Porcentaje de guaninas y citosinas en el DNA genómico. • Valores entre 20-80% en Bacteria y Archaea. • DNA con mayor porcentaje de G+C se desnaturaliza a mayor temperatura. • DNA absorbe mayor radiación UV cuando se desnaturaliza. Tm: melting temperature
1- Contenido de G+C • La temperatura de desnaturalización es proporcional al contenido de G+C.
1- Contenido de G+C • Si 2 organismos difieren en mas del 5%, entonces no estarían estrechamente relacionados. • Sin embargo, 2 organismos con igual G+C content pueden ser muy distintos.
Taxonomía molecular 2- Hibridación genómica: reasociación DNA:DNA • Comparación de secuencias de DNA (total). • Complementario al analisis de secuenciación de SSU rRNA. • Dos DNA se hibridan en proporción a su similitud. • El grado de similitud podrá determinar los organismos estrechamente relacionados. • útil en organismos relacionados y similares.
Taxonomía molecular 3- Ribotipado: Análisis de RNA ribosómico (fingerprinting) • Digestión de DNA total con enzimas de restricción • Separación en gel por electroforesis • Transferencia de DNA a membrana • Hibridación con sonda de rRNA • Los sitios de corte en el rRNA son particulares de cada bacteria. • Comparación con trabajos anteriores. Movie http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_5.html
Taxonomía molecular 4- Secuenciaciónde rRNA u otro gen Filogenia es la historia evolutiva de una especie. Arbol filogenético es la historia evolutiva, representado por un diagrama de lineas que se bifurcan y que reflejan las relaciones evolutivas. PCR movie: http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_6.html Sanger sequencing: http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter15/animation_quiz_1.html
Ribosomas: complejo ribonucleoproteico para la síntesis de proteínas. + 31 rpl + 21 rps Ribosoma bacteriano
Operón de rRNA Procariotas SSU rRNA = 16S rRNA Eucariotas SSU rRNA = 18S rRNA Aprox. 1500 nt. de longitud
Cantidad de copias del operón de rRNA: 1-15. • Existe cierta variabilidad intraindividuo o intragenoma.
Concepto de especie en microbiología • Taxonomía polifásica: combinación de diversas técnicas para la determinación de especies: fenotipo, genotipo y filogenias. • Normalmente incluye: secuenciación de la SSU rRNA e hibridación genómica. • Se propuso: procariotas que difieren en >3% en secuencia de rRNA son especies diferentes. • Mayor resolución en la hibridación genómica u otros genes (gyrB) para identificar nuevas especies. • Por arriba del nivel de especie, secuenciación de rRNA es una herramienta poderosa. • Diferencias > 5-7% en secuencia del 16S rRNA determina un nuevo género. • La especiación y taxonomía bacteriana está afectada por la transferencia horizontal de genes entre especies distintas.
Dos bacterias que difieren en más del 3% en la secuencia de 16S rRNA, hibridizan en menos del 70% y son especies distintas.
- + • distribución universal • secuencia suficientemente conservada • largo de la molécula suficiente. • insuficiente variabilidad para distinguir especies de bacterias. • posible error por transferencia horizontal. Pros y contras del uso de SSU rRNA en sistemática?
Preguntas Luego de realizar un análisis de lípidos en dos cultivos, observan que uno contiene abundantes ácidos grasos insaturados y el otro contiene fitanil con uniones éter. A qué dominio pertenecen? Imagine que le han entregado varios cultivos de bacterias de diferentes países y todas causan una enfermedad gastrointestinal. Luego de realizar análisis de ribotipado, identifica 4 cepas. Cómo haría para testear si dichas cepas pertenecen a la misma especie? Imaginen que han descubierto una nueva forma de vida microbiana que parece representar un cuarto dominio de vida. Cómo lo caracterizaría y cómo determinaría si es evolutivamente distinto que Bacteria, Archaea y Eukarya? Qué tipo de caracteres utilizan los feneticistas y los cladistas?
LEER Y TRAER: Para próxima clase teórica (miércoles) el siguiente artículo: McInerney et al 2008.
