免疫荧光染色应用

图2. 表征热休克蛋白的表达[2]

在高于体温5℃ 的条件下，癌细胞会异常过表达热休克蛋白（HSPs），以提高自身的耐热性和稳定性。因此，调节癌细胞内HSPs的表达可以实现温和的光热疗法（PTT）从而促进癌细胞的凋亡。其中HSP-90、HSP-70是主要的应激诱导蛋白质，通过对其进行免疫荧光染色来表征热休克蛋白的表达。图2所示无论是否有激光照射，HmPGTL NPs均可下HSP-90和HSP-70的表达，从而降低肿瘤的耐热性，增强温和PTT的疗效。

PART.03

测定炎性因子

图3. 测定促炎性细胞因子[3]

白细胞介素-6 （IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是参与多种生理与免疫过程的重要细胞因子，是参与全身炎症反应综合征、脓毒症的重要炎症介质，通过对其免疫荧光染色处理后可反映感染的严重程度。图3显示未经DNase-CO@MPDA纳米粒子处理的创面呈现出大量的红色和绿色荧光斑点，表明创面分别分泌了大量的IL-6和TNF-α，这表明存在严重的炎症反应。当感染创面接受DNase-CO@MPDA NP治疗时，炎症反应可通过减少炎症细胞因子的分泌而在一定程度上减轻。

PART.04

表征血管生成

图4. 表征血管生成情况[4]

CD31 又称血小板-内皮细胞黏附分子，主要用于证明内皮细胞组织的存在及评估血管生成。通常对CD31进行免疫荧光染色来观察感染组织治疗过程中的血管生成情况。图4显示UCNPs/PSeV在经激光照射后红色荧光信号明显增加，其微血管密度是其他组的4倍。

PART.05

表征肿瘤相关成纤维细胞（TAFs）的形成

图5. 表征肿瘤相关成纤维细胞（TAFs）的形成情况[5]

肿瘤微环境在肿瘤转移中起重要作用，肿瘤相关成纤维细胞（TAFs）是肿瘤微环境的主要成员。肿瘤细胞分泌的 TGF-β 将正常成纤维细胞（NAF）激活为 TAF。然后TAFs成为促进肿瘤细胞转移的TGF-β的主要来源。因此，抑制TAFs的形成和调节肿瘤微环境可以有效降低TGF-β的分泌，阻碍肿瘤的转移。通常对TAFs的标志物α-SMA（绿色）进行免疫荧光染色来表征TAFs的形成情况。图5所示经过NLC/H（D+F+S）NPs处理后，绿色荧光最弱，说明TAFs的标志物α-SMA减少，从而抑制了TAFs的形成。

PART.06

评估ICD的发生

图6. 评估ICD的发生[6]

PART.07

检测Foxp3和CD8+ T细胞的表达

图7. 检测乳腺癌组织中Foxp3和CD8+T细胞的表达情况[7]

CD8+ T 细胞介导Ⅰ型免疫反应，可增强CD8 +和CD4 + T 细胞的积聚，并促进其抗肿瘤作用。叉头状转录因子p3（Foxp3）是CD4+CD25+ Tregs 的特异性生物标志，其在肿瘤免疫中也发挥重要作用。既往的研究表明，Foxp3的高表达意味着较差的预后而CD8+肿瘤淋巴细胞浸润意味着预后较好。往往采用免疫荧光染色评估乳腺癌组织中Foxp3 阳性Tregs及CD8+T 细胞的表达情况，来评价某一手段治疗乳腺癌的效果。如图6所示，采用CD8+（红色）和Foxp3 +（绿色）抗体对肿瘤切片进行染色，经第7组处理后CD8+ T细胞在Tregs中所占比例相对较高，说明该处理方式能有效抑制肿瘤生长。

PART.08

表征肿瘤低氧状态

图8. 表征肿瘤低氧状态[8]

实验中常通过测定低氧诱导因子-1α （HIF-1α ）的表达状况以评估肿瘤处的低氧状态。如图8 所示，C. butyricum组中呈微弱的绿色荧光，表明HIF-1α的表达显著降低，证明其可以改善黑色素瘤的乏氧环境，这有助于提高光敏剂D-Ala-TPApy的光动力治疗的效果。

PART.09

细胞凋亡

图9. 细胞凋亡[9,10]

除了常用的Tunel染色外，也常通过考察Caspase-3的表达来评估细胞的凋亡程度。Caspase-3免疫荧光图像显示，空白组及各个对照组中并未展现出明显的红色荧光，表明小鼠的肿瘤区域未见明显的凋亡，而ANBDP NP s处理组小鼠经NIR激光照射后，C aspase-3表达明显上调，表明ANBDP NPs的治疗效果更加优异。

PART.10

参考文献

7. Jin F, Qi J, Liu D, et al. Cancer-cell-biomimetic Upconversion nanoparticles combining chemo-photodynamic therapy and CD73 blockade for metastatic triple-negative breast cancer.J. Control. Release, 2021, 337, 90-104.返回搜狐，查看更多