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Articulo. Determinación del porcentaje de linfocitos T cooperadores y citotóxico en sangre periférica mediante Cartometría de Flujo Multiparamétrica
Inmunología General (Bio0099)
Universidad Nacional Autónoma de México
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Determinación del porcentaje de linfocitos T cooperadores y citotóxico en sangre periférica mediante Cartometría de Flujo Multiparamétrica
Flores Espino María Fernanda; Guillén Arzaluz Salma Daniela
Inmunología General, Departamento de Biología, Edificio A, Facultad de Química, UNAM. Circuito exterior S/N, Coyoacán, Cd Universitaria, 04510 Ciudad de México, CDMX.
RESUMEN: La citometría de flujo es una técnica que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas suspendidas en líquido que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz. En este artículo se muestran los principales aspectos metodológicos a tener en cuenta para un mejor desarrollo e interpretación del inmunofenotipo por CMF, entre los que se encuentran: tamaño, forma, complejidad, tipo, cantidad, empleo de anticuerpos,lisado de eritrocitos, fijación celular y por supuesto, cualquier componente celular o función que pueda ser marcada con un fluorocromo. Todo lo anterior resulta de gran utilidad para el diagnóstico de la enfermedad (VIH) que permite estratificar a los pacientes en diferentes grupos de riesgo e individualizar el tratamiento.
PALABRAS CLAVE: Citometría de flujo, fluorocromos, linfocitos T, CD8 y CD4, fluorocromo
INTRODUCCIÓN:
La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de célu- las, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión principio en el que se basa es en hacer pasar células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La información producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se
convierten en señales digitales que son procesadas por una computadora. La citometría de flujo ha encontrado amplia utilidad en ciencias como la inmunología, hematología, oncología, anatomía patológica y biología celular. La conjugación de marcadores fluorescentes con anticuerpos monoclonales o policlonales ha hecho posible los estudios de la densidad y la distribución de determinantes y receptores de la superficie y del citoplasma celular, permitiendo identificar subpoblaciones celulares. Los cluster of differentiation (CD) o grupo de diferenciación, son moléculas antigénicas, expresadas en la superficie celular, que tienen diversas funciones biológicas. Los linfocitos T humanos pueden dividirse funcionalmente en células que proveen
cooperación a otras células del sistema inmune y células que median actividad citotóxica. Las cooperadoras expresan preferencialmente el antígeno CD4 y las citotóxicas, el CD8. Las moléculas CD4 y CD8 tienen la función biológica de interactuar con la estructura molecular del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase II y clase I, respectivamente. Este proceso es vital durante la presentación antigénica y la posterior activación del sistema inmune determinación en el laboratorio del número de células CD y CD8 se sustenta en la utilización de la citometría de flujo.
OBJETIVO: Interpretar y analizar los resultados obtenidos por el citómetro de flujo, diferenciando poblaciones celulares.
HIPÓTESIS: La manipulación de la muestra afectará la acertividad de los resultados obtenidos.
MATERIAL: ● Tubos de citometría de 13x ● Ligadura ● Torunda con alcohol ● Tubo de Vacutainer con EDTA ● Micropipeta (10 y 100) ● Puntas de micropipeta (10 y 100) ● Centrífuga ● BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 en solución tamponada con 0% de azida sódica ● Solución de lisis BD FACS ● Citómetro de flujo
METODOLOGÍA:
Se obtuvo por una punción venosa 4mL de sangre periférica en un tubo con EDTA para posteriormente colocar 50 μL en tubo de citometría de flujo. Se agregó a la mezcla anticuerpos e incubó durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente y protegido de la luz. Después se agregó 1 mL de solución de fijación y lisis a cada uno de los tubos, se mezclo e incubó durante 10 min a temperatura ambiente, para añadir 1mL del buffer de FACS Al último se centrifugó a 1000rpm durante 10 minutos, descartando el sobrenadante y resuspendiendo con 200μL de buffer de FACS para pasar al citómetro de flujo y analizar los resultados.
RESULTADOS:
Imagen 1. Granularidad vs tamaño 1
granulocitos con un porcentaje respectivamente de 72% para linfocitos, 3% para monocitos y 15% para granulocitos. La célula CD45 comprende el 10% del área de superficie en linfocitos, esta es la razón de se graficar contra FL- 3 correspondiente a PercP. En la Imagen .2 hay 97% que expresan CD45, de donde aproximadamente el 70% corresponde a Linfocitos; Anti-CD3 se gráfica contra FL-1. Se observa aproximadamente el 60% corresponde a CD3+ (Imagen 5) y el 32% de linfocitos B, CD3-. Los histogramas muestran la intensidad de expresión de un marcador versus el número de eventos. El desplazamiento de la curva hacia la derecha indica mayor expresión del marcador, mientras que la altura del pico indica la frecuencia de las células capturadas (Imagen 5). En este sentido, es importante recalcar que el area bajo la curva contiene a las celulas que se estan analizando. En el histograma se observan dos picos; el pico de la derecha representa a las células positivas para el marcador mientras que el de la izquierda muestra las células negativas para este marcador. Se observa que el pico de la izquierda es más alto que el de la derecha; por tanto, existe un mayor número de células negativas CD En la Imagen 6. se graficaron los CD3+, para identificar CD4 y CD8, con un porcentaje de 53% positivo para CD y negativo para CD8 en los cuales cuantificamos los linfocitos T cooperadores en un menor porcentaje 6% de los linfocitos T citotóxicos con un CD3+, CD4- y CD8-. El desplazamiento de los puntos hacia la derecha indica la expresión de un marcador X, mientras que el
desplazamiento de los puntos hacia arriba, muestra la expresión de un marcador Y. El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), fundamentalmente la cuantificación en sangre periférica de las células CD4+ y los linfocitos CD8+ aporta un valor diagnóstico y pronóstico en esta patología CONCLUSIONES: Con la citometría de flujo logramos separar subpoblaciones de células para poder analizarlas, identificándose por su tamaño o por el fluorocromo utilizado y con los resultados de las gráficas concluimos que al diferenciar CD4 (Linfocitos cooperadores) y CD (Linfocitos citotóxicos) en la sangre periférica de nuestro sujeto de la muestra, al ser un sujeto sano en el momento del estudio solo presentaba CD4 positivo y CD8 negativo. BIBLIOGRAFÍA - Goding JS. Conjugation of Antinodies with Fluorochromes Modifications to the Standard Methods. J Immunol Meths - Asbury CL, Esposito R, Farmer C, van den Engh G. Fluorescente Spectra of DNA Dyes Measured in a Flow Cytometry. Cytometry 1996 - Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Proc Soc Exptl Biol Med
Articulo. Determinación del porcentaje de linfocitos T cooperadores y citotóxico en sangre periférica mediante Cartometría de Flujo Multiparamétrica
Materia: Inmunología General (Bio0099)
Universidad: Universidad Nacional Autónoma de México
