Imprimiendo - Revista de la Sociedad Mexicana de Historia Natural

INFLUENCIA DE LA SELECCION DE LEVADURAS EN VINIFICACIONA. SANCHEZ-MARROQUIN, E. MEDELLIN yC. ALVAREZLaboratorio de Microbiología Experimental. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas,I. P. N., México, D. F.La industria vinícola mexicana ha alcanzado ya un magnífico desarrollo, pues la producción en la zona de BajaCalifornia, solamente, oscila alrededor de 4 millones de litro por año y creemos que cualquier intento que se hagapara estudiar los problemas con ella relacionados adquiere cierto interés, ya que de esa manera se contribuye aladelanto técnico que la referida industria comienza a tener en nuestro tiempo.El presente trabajo pretende ocuparse del estudio de las levaduras que predominan en las heces de algunosvinos de la región de Saltillo y de su utilización, al estado de pureza, en la elaboración de vinos con una sola y convarias especies asociadas. Actualmente, la mayor parte de las fábricas de vino de nuestro país no emplealevaduras seleccionadas para la obtención de vinos de mesa de calidad, a excepción de los vinos espumosos quepor su elaboración requieren cultivos puros de levaduras.El buen éxito de las industrias de fermentación que utilizan levaduras depende desde luego de un número defactores relacionados con su actividad. (Bilford et al., 1942), entre los cuales pueden citarse: pH, temperatura,concentración de los azúcares fermentescibles, supresión de microorganismos indeseables, selección de las cepaso “razas” de levaduras, adición de substancias nutritivas complementarias, etc.En la mayoría de las industrias, principalmente las pequeñas, la fermentación se efectúa en forma natural oespontanea, pero en este caso las levaduras autóctonas interfieren durante la vinificación causando cambiosindeseables o una tendencia a “enfermar”. Sin embargo, existen levaduras autóctonas que pueden ocasionarcambios deseables que mejorarían el producto considerablemente. Por esta razón, en la actualidad, se tiende aemplear mezclas seleccionadas de cepas “puras” de levaduras afines, debidamente controladas, para asegurar laformación de mayor cantidad de ésteres y mejorar con ello el “bouquet” desarrollado durante la segundafermentación, así como algunas otras características que contribuyen a la mejor calidad del producto.En la presente comunicación se comparan, asimismo, los resultados obtenidos respecto a la obtención devinos con una sola especie de levadura y con una mezcla de tres levaduras afines, previamente seleccionadas deacuerdo con sus principales características bioquímicas.MATERIALES Y METODOSLevaduras. Para el aislamiento y estudio de las levaduras se emplearon los siguientes medios: mosto simple;mosto preparado con jugos de uva americano (Welch’s) y nacional (Ju-fruta); mosto de cerveza al 50% (tipo Lager,d 20/20 = 1.05933), con y sin lúpulo y otros medios similares. Con estos medios líquidos se prepararon tambiénmedios sólidos mediante la adición de agar al 2.5% o gelatina al 20%.Los 35 cultivos obtenidos se purificaron según la técnica de Lindner. Una vez que se obtuvieron cultivos deorigen monocelular se procedió a estudiar las características morfológicas y propiedades bioquímicas. Laesporulación se investigo en los diversos medios recomendados para el objeto y la utilización de alcohol en elmedio de Lodder, según Guilliermond-Tanner (1920). Para el estudio de la fermentación de la rafinosa, enparticular, se siguió el método de Skinner y Bouthilet (1947). La clasificación de las levaduras se efectuó mediantela clave de Stelling-Dekker (1931) y el resumen que sobre la clasificación de la familia Torulopsidaceae de Lodder,viene en la monografía de Henrici (1941).Una vez separadas en grupos y estudiadas taxonómicamente, se seleccionaron 4 de aquellas levaduras quepor su crecimiento y propiedades bioquímicas se consideraron provisionalmente como más activas y se investigó elóptimo respecto al pH, temperatura y concentración del substrato. Este último estudio se efectuó mediante laestimación del CO2 desprendido, haciendo observaciones cada 12 horas. La velocidad de fermentación se apreció

controlando las variaciones del substrato, el alcohol producido y las fluctuaciones de la acidez, en el siguientemedio azúcar invertido 24.95 g.; sulfato de amonio 0.5 g.; sulfato de magnesio 0.24 g.; fosfato dipotásico 0.25 g.;peptona 1.0 g. y agua c. b. p. 100 ml.TABLA N° ICARACTERES BIOQUIMICOS DE LAS LEVADURAS ESTUDIADASCEPAS FERMENTACION DE AZUCARES ASIMILACION DE AZUCARES(Método Auxanográfico)NITROGENOASIMILACION DE:CARBONOGlucosaGalactoSacasa rosaMaltosaLactosaRafinosaGlucosaGalactosa SacarosaMaltosaLactosaRafinosaPeptonaAsparragina UreaNitratosSulfatodeamonioAlcoholL-1 + + + + - 1/3 + + + - - ± + + - - - -L-2 + + + + - 1/3 + + ± ± - - + + - - - -L-3 + - ± + - + + ± - - - - + + - - - -L-4 + + + - + - + + - - - - + + - - - -Para iniciar la fermentación normal se preparó un “pie de cuba” adecuado y antes de añadirle el volumen totalde mosto (1,225 ml., más 225 ml. de pie de levadura) se le determinó el contenido de azúcares remanentes, elporciento de alcohol y la acidez total y volátil, siguiéndose para ello los métodos de la A. O. A. C. (1945). Lascantidades de alcohol y acidez encontradas se restaron de los valores obtenidos en las pruebas parciales de lasalícuotas tomadas cada cuatro horas durante los 7 días de fermentación. De estos valores se dedujo la velocidadde fermentación de cada cepa.Fermentación. Una vez establecidos los óptimos para las cepas más activas se procedió a efectuar unafermentación en mayor escala empleando en un caso (vino I), una sola especie de levadura seleccionada y en otro(vino II), una mezcla de tres especies diferentes de levaduras seleccionadas. Para la elaboración del vino se usómosto de uva de la variedad Tokay y se siguió, en términos generales, él proceso que comúnmente se emplea en laindustria (Pacottet, 1920; Cruess, 1934, 1942 y 1943; Amerine, 1940; Salinas, 1943; Norris, 1945; Sannino, 1948),comprendiendo las siguientes fases: preparación del mosto; adición de SO2; corrección de los mostos mediante elcontrol de los azúcares presentes y la acidez total; preparación del “pie de cuba”; aeración durante la fermentación,según el método de Traube; primera fermentación; descubre de las tinas; segunda fermentación; trasiego,clarificación y filtración y por último, añejamiento y pasteurización.La segunda fermentación se efectuó en barricas cerradas de 20 litros conservando el vino durante un mes atemperatura ambiente.El estudio de los clarificantes se practicó añadiendo previamente 1% de tanino q. p. al vino y observando laspruebas de fotocolorímetro Evelyn. Como clarificantes se emplearon: albúmina de huevo mezclada con sal común(10 g. por cada 4 g. de albúmina seca) en dosis media de 8 g./hectl. bentonita 25 g./hectl.; caseína (12 g. hectl.), ypectinol añadido antes de la fermentación en proporción de 4.8 g. por litro.El añejamiento se efectuó por el proceso natural de la acción solar (González, 1939; Tuneu, 1941).Los vinos obtenidos se pasteurizaron a 60-65º C. durante 30 minutos.Análisis. La determinación de los caracteres físicos, incluyendo el peso específico, aspecto, color, etc., seefectuó siguiendo los métodos de la A. O. A. C. (1945). Las estimaciones de alcohol, extracto, glicerol, cenizasalcalinidad de las cenizas, ácido tartárico total, bitartrato de potasio, ácido tartárico libre, sulfatos, acidez total,acidez volátil, acidez fija, tanino materia colorante, SO2 total y SO2., libre, se practicaron según métodos de lamisma A. O. A. C. (1945). La determinación de azúcares se efectuó mediante el método de Lane-Eyon citado porBrowne y Zerban, (1941). La cuantificación de cloruros se realizó por el método de Mohr, citado por Kolthof, (1943).Por último, el ácido fosfórico se valoró según los métodos consignados por Browne y Zerban (1941) y Scott (1944).En el vino II (obtenido con mezcla de las levaduras L-1, L-3, y L-4) se determinaron además las impurezas en el

destilado por los métodos de la A. O. A. C. Los alcoholes superiores se estimaron según el método de Rocques.RESULTADOSDe las heces de vinos blanco y tinto procedentes de la Compañía Vinícola de Saltillo, S. A., se aislaron 35cepas de levadura que quedaron finalmente reducidas a cuatro grupos representativos, que se designaronarbitrariamente como L-1, L-2, L-3 y L-4 y que por el estudio taxonómico correspondieron a las especies S.cerevisiae var. ellipsoideus (L-1 y L-2), Sacch. pasteurianus (L-3) y Sacch, fragilis (L-4). Sus principalescaracterísticas bioquímicas se dan en la Tabla I.Se encontró, asimismo, un grupo de levaduras anascosporadas, no productoras de carotenoides, queclasificamos dentro del género Torulopsis, pero que no se estudiaron en el presente trabajo.Los óptimos para el crecimiento de las tres especies señaladas fueron los siguientes: pH 4.5-5.0, temperatura28-30º C.La influencia de la concentración del substrato, estimada por el desprendimiento de CO2 se muestra en lasgráficas 1, 2, 3, y 4, de cuya observación puede estimarse que las cepas L-1, L-2 y L-3 dieron una mayor cantidadde CO2.Los resultados del control de la velocidad de la fermentación, según las variaciones del azúcar consumido,alcohol producido, acidez volátil, acidez fija y acidez total, se muestran en las gráficas 5, 6, 7 y 8 y como puedeverse, los máximos resultados correspondieron a las cepas L-1, L-2 v L-4. Para construir estas gráficas se tomópara las variaciones del azúcar consumido, la mitad del valor encontrado; la acidez volátil se multiplico, por 300 y enel caso de la acidez total, por 100, con objeto de hacer más perceptibles sus variaciones.En la Tabla II se presentan los resultados obtenidos respecto a la selección de clarificantes. El mejor resultadocorrespondió a la mezcla de albúmina de huevo y bentonita.CLARIFICANTESEMPLEADOSALBUMINIA DE HUEVO YBENTONITATABLA No. IIDATOS RESPECTO A LA SELECCIÓN DE CLARIFICANTESDOSISUTILIZADAS (g.por hectolitro)pH DELMEDIOLECTURA DELGALVANOMETRO %TRANSMITANCIADENSIDADOPTICA L-2-log.Gx10825 3.6 100 0.00BENTONITA Y PECTINOL 25480 3.9 98.25 0.077BENTONITA 25 3.6 96.50 0.155ALBUMINA DE HUEVO 8 3.7 96.25 0.144PECTINOL 480 3.8 92.75 0.324CASEINA 12 3.7 79.25 1.010Lecturas a 19º C. en todos los casos, empleando fotocolorímetro Evelyn.TABLA Nº IIICARACTERES FISICOS DE LOS VINOS ESTUDIADOS COMPARADOS CON DOS VINOS SIMILARESCARACTERESFISICOSVINO I (Una solalevadura)VINO DESALTILLOVINO ESPAÑOLVINO II (Mezcla de3 levaduras)

Aspecto Brillante Brillante Brillante BrillanteColor Amarillo-rojizo Amarillo-oro Amarillo-pálido AmarilloOlor SO2 ligeramente Vinoso SO2 ligeramente VinosoSabor Semiseco Semiseco Seco SecoTipo Quieto Quieto Quieto QuietoLos caracteres físicos de los vinos obtenidos de la fermentación de mosto de uva con una levaduraseleccionada (Cepa L-1 de Sacch. cerevisiae var. ellipsoideus) y con mezclas de levaduras (Cepas L-1 de Sacch.cerevisiae var. ellipsoideus, L-3 de Sacch. pasteurianus y L-4 de Sacch. fragilis), se consignan en la Tabla III, entanto que los resultados de los análisis químicos de estos mismos vinos se dan en la Tabla IV.Por último, en la Tabla V están los datos obtenidos de la determinación de impurezas en el destilado del vino IIo sea el preparado con mezclas de tres levaduras.Todos los análisis se refieren a determinaciones efectuadas después de cinco meses de haber terminado laprimera fermentación.DISCUSIONAl utilizar una sola levadura para la elaboración del vino se obtuvo un rápido rendimiento alcohólico en lafermentación del mosto, lo que representa una ventaja, ya que se acorta el tiempo de la segunda fermentación, asícomo el de clarificación y añejamiento del vino. Sin embargo, al emplear mezclas de tres levaduras los resultadosalcanzados fueron comparativamente mejores.Si se utiliza una sola levadura, sólo es posible exigir una fermentación regular y completa, una clarificaciónrápida y la producción del aroma característico según la levadura empleada. Si, por el contrario, se empleanmezclas de levaduras, se obtendrán algunas mejoras respecto a algunos de los productos que determinan la buenacalidad.Comparando los caracteres de estos vinos con otros similares de reconocida buena calidad, se pudo notar quepresentan más o menos los mismos caracteres físicos y que sólo difieren en algunos aspectos de la composiciónquímica, siendo en lo general buenos, pero el vino II resulta más robusto.Con el empleo de las mezclas de levaduras (vino ll) se pudieron apreciar las siguientes características: a) seobtuvo mayor desdoblamiento o consumo del azúcar y por lo tanto, un vino de mayor grado alcohólico, con unaumento de 2.18% en volumen respecto al vino I; b) el vino II presentó una acidez volátil baja, lo que indica la noparticipación de otras levaduras diferentes a las de la mezcla empleada, así como que el vino está sano, ya que unaacidez volátil alta es un factor negativo en la conservación de los vinos y c) la cantidad de anhídrido fosfórico en elvino II fue mayor que en el vino I preparado con una sola levadura. No obstante las ventajas del uso de mezclas delevaduras, éstas no deben emplearse arbitrariamente, sino después de haberse seleccionado de acuerdo con suscaracterísticas bioquímicas generales, para obtener un valor estimativo más justo respecto a su actividadfermentativa y ensayar luego mezclas de ellas en los diferentes mostos, hasta lograr una asociación de aptitudesafines, para su adaptación tanto al mosto como a los diversos factores que afectan el proceso de la vinificación.Esto permite obtener altos rendimientos alcohólicos y características físicas y químicas deseables durante laprimera fermentación, quedando un porcentaje baja de azúcares remanentes, que durante la segunda fermentaciónse transforman en un tiempo menor.TABLA NºIVRESULTADO DE LOS ANALISIS DEL VINO OBTENIDO CON UNA LEVADURA SELECCIONADA, VINOSSIMILARES Y VINO OBTENIDO CON UNA MEZCLA DE LEVADURAS SELECCIONADAS.DeterminacionesVino I (unalevadura selec.)Vino deSaltilloVinoEspañolVino ll (Mezclade levadura)

Peso específico 20/20 1.0128 1.0097 1.0020 1.0024Alcohol en vol. 20/20 12.12 15.54 11.53 14.30Alcohol en peso 20/20 9.72 12.54 9.29 9.72Extracto: (g/100)a) real 4.30 4.35 2.79 3.0b) aparente 5.80 5.54 3.18 4.45pH 3.75 3.85 4.25 3.82Glicerol g/lt. 6.80 6.30 6.53 6.78Cenizas g/lt. 2.29 2.90 1.58 3.08Bitartrato de potasio g/lt. 1.54 1.93 2.58 1.60Acido tartárico libre g/lt. 1.09 0.82 1.17 1.75Acidez total (ac. Tartárico g/lt.) 5.50 8.60 6.42 5.0Acidez volátil (ac. Acético) g/lt. 1.38 3.25 0.80 0.36Acidez fija (ac. Tartárico) g/lt. 3.72 4.81 0.43 2.09Reductores directos (glucosa)g/lt. 21.22 38.00 18.55 14.5Reductores totales (Sacarosa)g/lt. — — — 0.80Sulfatos g/lt. Huellas — — 1.52Cloruros g/lt. Huellas — — HuellasTanino y materia colorante g/lt. 0.68 0.84 0.59 0.50SO2 total g/lt. 0.29 0.01 0.37 0.28Fosfatos (P2O5) g/lt 0.18 0.25 0.09 0.32TABLA Nº VDETERMINACION DE IMPUREZAS EN EL DESTILADO DEL VINO IIGrado alcohólico del destilado................Acidez en mg. Acido acético/100 ml. De alcohol anhidro..Esteres, en mg. Acetato de etilo/100 ml. De alcohol anhidro...Furfural en mg./100 ml. De alcohol anhidro.....Alcoholes superiores....................................................................Aldehidos, en mg. Acetaldehido/100 ml. De alcohol anhidro...Total de impurezas en alcohol anhidro.........................................13.16% en volumen127.0 mg.120.0 mg.0.37 mg.Prueba negativa128.0 mg.375.37 mg.RESUMEN Y CONCLUSIONES1.- Se presenta un estudio de algunas levaduras aisladas de heces de vinos tinto y blanco de la región deSaltillo, seleccionando aquellas cuya actividad resultó óptima frente a los factores principales queintervienen en una fermentación: pH, temperatura, concentración de substratos y velocidad defermentación.2. - Con una levadura seleccionada (cepa L-1 de Sacch. cerevisiae var. ellipsoideus) se preparó un vino blanco(vino l) cuyas características físicas y composición química se compararon con otro (vino II) obtenido conmezclas de tres levaduras (L-1, L-3 y L-4), así como con dos vinos similares de reconocida buena calidad.3. - Las diferencias primordiales encontradas respecto a la composición y calidad del vino II comparado con el

vino I fueron las siguientes: a) aumento en el grado alcohólico hasta en un 2.18% en volumen; b ) bajaacidez volátil y C) mayor proporción de anhídrido fosfórico.4. - Se concluye que el empleo de la mezcla de levaduras, en las condiciones estudiadas, influyófavorablemente en la calidad del Vino obtenido.Agradecemos al Sr. Ing. Juan Manuel Noriega Jr., algunas valiosas sugestiones durante el desarrollo de estetrabajo.BIBLIOGRAFIAA. O. A. C. 1945. Official and Tentative Methods of Analysis, 6 a . Ed. Washington. D. C.AMERINE, M. A. y M. A. Joslyn. 1940 Commercial Production of Table Wine. California Agr. Exp. Sta. Bull. 639.BROWNE. C. A., y F. W. Zerban. 1941. Physical and Chemical Methods of Sugar Analysis, 3a. Ed. John Wiley andSons. Inc. Nueva York.BILFORD, H. R.. R. E. SCALF, W. H. STARK y P. J. KOLACHOW. 1942 Alcoholic fermentation of molasses. Ind.Eng. Chem. (Ind. Ed.) 34: 1406.CRUESS, W. V. 1942 Research in Enology. Proc. Inst. Food Technol, p. p. 152-161.——— 1943 The role of microorganisms and enzymes in wine making. Adv. in Enzym. 3: 349 - 386.——— 1934 The Principles and Practice of Wine Making. The Avi Publishing Co. Nueva York.GUILLlERMOND, A., y F. W. Tanner, 1920 The yeasts. John Wiley and Sons. Nueva YorkGONZALEZ TORINO, H., y R. TUNEU. 1939 Envejecimiento de vinos bajo la influencia de la acción solar. Rev. Fac.Agr. (Univ. de Montevideo) . No 18:18.HENRICI, A.T. 1941 The yeasts. Genetics, Cytology, Variation Classification and Identification. Bact. Rev., 5:97-179.KOLTHOF, I. M., y E. B. Sandell. 1943 Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. The Macmillan Company, NuevaYork.NORRIS, S. R 1945 The Chemical Industrial Process. Mc. Graw-Hill Book Co. Inc. Nueva York.PACOTTET, J 1920 Vinificación, 2a. Edición, Salvat Editores. Barcelona.SANNINO, F. A. 1948 Tratado de Enología. Versión Española de la 2a. Edición Italiana. Gustavo Gil, Ed. BuenosAires.SKINNER, C.E., y R. BOUTHILET. 1947 Melibiose-broth for classifying yeast. Jour. Bact. 53 (1): 37-43.SALINAS IRANZO, J. 1943 Enología. Ed. Consejo de Cultura Superior. Univ. de Nuevo León, Monterrey, N. L.(México).SCOTT, W. W. 1944 Standard Methods of Chemical Analysis, Tomo ll. N. H. Furman, Editor. Nueva York.STTELLING-DEKKER, N. M. 1931 Die Hefesammyung des Central bureau voor Schimmel-cultures, I Teil. DieSporogenen Hefen. Amsterdam.TUNEU, R. 1941 Envejecimiento de vinos bajo la influencia de la acción solar Rev. Fac. Agr. (Univ. de Montevideo)No. 24: 49.

Gráficas 1 y 2, indicando el CO 2desprendido por las cepas L-1 y L-2 respectivamente, a diferentes concentracionesde azúcar invertido.

Gráficas 3 y 4. CO 2desprendido por las cepas L-3 y L-4 respectivamente.

Gráficas 5 y 6. Velocidades de fermentaciones de las cepas L-1 y L-2 respectivamente.

Gráficas 7 y 8. Velocidades de fermentación de las cepas L-3 y L-4 respectivamente.

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