o Manuel de procédures techniques - Direction des laboratoires

Ministère de la Santé 

et de la Prévention Médicale 

République 

du 

Sénégal 

RNL SN 

Réseau National de 

Laboratoires du Sénégal 

MANUEL DE PROCEDURES DES 

TECHNIQUES DE LABORATOIRES 

D’ANALYSES MEDICALES 

1 ère Edition 

Rédaction : Janvier 2004 

Révision : Novembre 2008 

RNL Sénégal : Manuel de Procédures techniques (Page 1)

REPUBLIQUE DU SENEGAL 

MINISTERE DE LA SANTE ET DE LA PREVENTION 

RESEAU NATIONAL DE LABORATOIRES 

MANUEL DE PROCEDURES DES 

TECHNIQUES DE LABORATOIRES 

D’ANALYSES MEDICALES 

1 ère Edition 

Rédaction : Janvier 2004 

Révision : Novembre 2008 


REPUBLIQUE DU SENEGAL 

MINISTERE DE LA1 SANTE ET DE LA PREVENTION 

RESEAU NATIONAL DE LABORATOIRES 

MANUEL DE PROCEDURES TECNIQUES 

DE LABORATOIRES D’ANALYSES MEDICALES 

Coordonnateur : 

Professeur Ahmad Iyane Sow, 

Coordonnateur du Réseau National de Laboratoires 

Equipe de Rédaction : 

Pr. Moussa Fafa Cissé : Médecin-Chef des Laboratoires, CHNU Albert Royer 

Pr. Jean Marie Dangou : Laboratoire d’Anatomie Pathologique, FMPOS 

Dr. Abdoulaye Séga Diallo : Laboratoire de Cyto-Génétique, FMPOS 

Pr. Aïssatou Gaye Diallo : Laboratoire de Bactériologie, CHNU Le Dantec 

Dr. Ousmane Diop : Laboratoire de Virologie, Institut Pasteur de Dakar 

Pr. Saliou Diop : Centre National de Transfusion, Service d’Hématologie 

Pr. Yémou Dieng : Laboratoire de Parasitologie, CHNU de Fann 

Dr. Roughyatou Ka : laboratoire de Bactériologie, CHNU de Fann 

Dr. Abibatou Sall : Laboratoire de Biologie, CHNU A. Le Dantec 

Pr. Niama Diop Sall : Laboratoire de Biochimie CHNU A. Le Dantec 

Saliou T all (CNTS) 

Adama Coly (CHU de Fann) 

Dr Khadidiatou Sèye Guèye (CHR Kaolack) 

Dr Jeanne Guèye Sarr (DPL) 

Dr Ibrahima Ndir (Centre de Santé Baudoin) 

Dr Abba Sow (Région Médicale de Fatick) 

Dr Rokhaya Diagne (CHU de Fann) 

Dr Mariane Cissé (Labo Régional Kaolack) 

Dr Oumar Kanté (CHR Ziguinchor) 

Magatte Sy Gaye (CHU de Fann) 

Binta Gassama Gaye (CHU de Fann) 

Mamour Faye (CHR Tambacounda) 

Dr Roughyatou Ka (CHU de Fann) 

Dr Awa Ndour Seck (CHR de Louga) 

Dr Marième Kane (CHR de Thiès) 

Dr Lam Toro M. Seck (CHR Ourossogui) 

Samba Ngom (Labo SLAP Thiès) 

Benoît Chevalier (Hôpital Principal) 

Thierno Samb (CHU de Fann) 

Pr Jean Marie Dangou (Fac. Médecine) 

Pr Omar Faye (Fac. Médecine) 

Dr Moctar Dieng (CHU Le Dantec) 

Ont participé à l’atelier de validation : 

Dr El H. Mokhtar Mboup (CHR Kolda) 

Hawa Thioube (CHU Le Dantec) 

Dr Mamadou Ngom (OMS, Dakar) 

Ndèye Adjaratou M. Diop (CS Ouakam) 

Farma Thiam (CHU de Fann) 

Pr Moussa Fafa Cissé (CHU Albert Royer) 

Abdou Guèye (Centre de Santé de Rufisque) 

Bousso Fall (CHU de Fann) 

Dr Arame Diop (CS Garpard Kamara) 

Pr Iyane Sow (RNL) 

Dr Aminata Touré (HOGGY) 

Dr Oumou Barry Kane (Direction de la Santé) 

Dr Fatou Diallo (CHU Le Dantec) 

Dr Aïcha M. Sarr (CHU Le Dantec) 

Aly Fall (Centre de Santé Sicap Mbao) 

Pr Omar Ndir (Fac. Médecine, Pharmacie) 

Dr Aliou Thiam (Labo Régional ST-Louis) 

Pr Yémou Dieng (CHU de Fann) 

Dr Ousmane M. Diop (Institut Pasteur) 

Dr Katy Ndong Ndiaye (CHR Diourbel) 

Dr Oumarou Foly Diallo (CHR ST-Louis) 


AVANT PROPOS 

La mise en place d’un manuel de procédures techniques constitue un 

besoin qui s’est fait sentir très tôt au sein du Réseau National de Laboratoires, 

d’une part pour renforcer les capacités des techniciens des laboratoires 

d’analyses médicales, d’autre part pour répondre à un souci d’harmonisation 

des techniques utilisées dans ces laboratoires. Par ailleurs, ce manuel vient 

accompagner la mise en place de la démarche qualité dans nos laboratoires et 

constitue un outil de paillasse pour que chaque analyse soit effectuée de la 

même manière partout au Sénégal. 

Le Réseau National de Laboratoires du Sénégal est né avec la stratégie 

d’intégration prônée par l’OMS, ce qui justifie la multidisciplinarité de ce 

document. Seules les techniques d’analyses biochimiques manquent encore du 

fait de leur diversité ; nous espérons pouvoir procéder au meilleur choix lors 

de la prochaine révision. C’est pour nous l’occasion de remercier 

chaleureusement tous les collègues des différentes disciplines biologiques qui 

n’ont ménagé aucun effort pour rédiger cet ouvrage, ainsi que ceux qui ont 

procédé à sa correction et tous les participants à l’atelier de validation. 

Le présent manuel de procédures comprend trois parties : 

- Le paquet minimum d’activités par niveau que chaque laboratoire doit 

être en mesure de réaliser, 

- L’équipement minimal nécessaire pour la réalisation de ce paquet 

minimum d’activités, 

- Les procédures techniques par analyse. 

Le manuel de procédures est un outil commun que le Réseau National de 

Laboratoires met à la disposition de tous les laboratoires. Son utilisation est 

indispensable pour atteindre l’objectif d’harmonisation des techniques ; c’est 

pourquoi le Réseau National de Laboratoires en appelle à la vigilance de tous 

les biologistes chefs de laboratoires et de tous les personnels de laboratoires. 

Nous attendons un retour de l’information à la pratique pour améliorer 

en continu ce document. Les suggestions des utilisateurs sont également les 

bienvenues pour la révision du manuel. 

Professeur Ahmad Iyane Sow 

Coordonnateur du RNL du Sénégal 


Sommaire 

Chapitre 1 : Paquet minimum d’activités : 

1.1 Laboratoire de niveau périphérique : P. 2 

Pour les maladies à potentiel épidémique P. 3 

En Hématologie P. 3 

En Parasitologie P. 3 

En Bactériologie P. 4 

En Biochimie P. 4 

En Anatomie et Cytologie Pathologiques P. 4 

1.2. Laboratoire de niveau intermédiaire : P. 5 







1.3. Laboratoire de niveau National : P. 8 







Chapitre 2 : Equipements et matériels nécessaires : P. 12 

2.1. Laboratoire de niveau périphérique P. 13 

2.2. Laboratoire de niveau intermédiaire P. 14 

2.3. Laboratoire de niveau National P. 15 

Chapitre 3 : Procédures techniques et réactifs : P. 17 

3.1. Pour les maladies à potentiel épidémique P. 18 

3.2. En Hématologie P. 24 

3.3. En Parasitologie P. 58 

3.4. En Bactériologie P. 69 

3.5. Antibiogramme P. 84 

3.6. En Anatomie et Cytologie Pathologiques P. 95 


Chapitre 1 

PAQUET MINIMUM 

D’ACTIVITES PAR NIVEAU 


1.1. Laboratoire de niveau périphérique : 

1.1.1. Pour les maladies à potentiel épidémique : 

Choléra : 

Examen macroscopique 

Examen microscopique 

Ensemencement de milieu de transport (EPHA, Cary Blair) 

Méningite cérébro-spinale : 



Recherche d’antigènes solubles (agglutination au latex) 

Ensemencement de milieu de transport (Trans-Isolate, …) 

Shigellose : 



Ensemencement de milieu de transport (Cary Blair) 

Fièvre jaune et autres fièvres hémorragiques : 

Conditionnement des échantillons prélevés 

Acheminement au Laboratoire National de Référence 

1.1.2. En Hématologie 

Hémogramme 

Vitesse de sédimentation 

Test d’Emmel 

Taux des réticulocytes 

Temps de saignement 

Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR) 

Temps de céphaline activée (TCA) 

Dosage du fibrinogène 

Groupage sanguin dans les systèmes ABO et Rhésus 

1.1.3. En Parasitologie 

Dans le sang : 

Recherche directe d’hématozoaires : goutte épaisse et frottis sanguin 

Recherche indirecte d’hématozoaires : Test d’immunochromatographie ICT, Optimal, Paracheck 

etc … 

Recherche directe de Trypanosomes et de microfilaires 

Dans les urines 

Recherche directe de Schistosoma haematobium, de Trichomonas vaginalis, 

de microfilaires, de levures. 

Dans les selles : 

Recherche des kystes, amibes, œufs et parasites par un examen direct 

Identification macroscopique de vers intestinaux 

Dans le LCR : 

Recherche de cryptocoque à l’encre de chine. 


1.1.4. En Bactériologie 

Dans les urines : 



Dans le pus : 



Dans les sécrétions broncho-pulmonaires : 



Dans les sécrétions ORL : 



Sécrétions génitales (voir manuel du programme de lutte contre les IST) 



1.1.5. En Biochimie 


- Glycémie 

- Azotémie 

- Cholestérol total 

- Créatininémie 

- Ionogramme (Na, K, Cl) 

- Protidémie 

- Albuminémie 

- Bilirubinémie 

- Transaminases (ASAT, ALAT) 


- Albumine 

- Sucre 

- Corps cétoniques 

1.1.6. En Anatomie et Cytologie Pathologiques 

Frottis cervico-vaginal de dépistage 

Liquides biologiques 

Ponction à l’aiguille fine de masses palpables 

Biopsies et pièces opératoires (si le Centre de santé est doté d’un bloc opératoire) 


1.2. Laboratoire de niveau intermédiaire : 

1.2.1. Pour les maladies à potentiel épidémique 

Choléra : 



Isolement et Identification 

Antibiogramme 

Acheminement des souches au Laboratoire National de Référence 






Antibiogramme 


Shigellose : 




Antibiogramme 


Fièvre jaune et autres fièvres hémorragiques : 

Conditionnement des échantillons prélevés 

Acheminement au Laboratoire National de Référence 


Hémogramme 








Dosage des PDF 

Dosage du D-Dimère 


Recherche de l’antigène D faible 

Test de Coombs direct 

Test de Coombs indirect 

Test de compatibilité au laboratoire entre poche de sang et receveur 

Dépistage et identification des agglutinines irrégulières 





Recherche indirecte d’hématozoaires : Test d’immunochromatographie: ICT, Optimal, Paracheck 

etc… 


Recherche des parasites sanguicoles par des techniques de concentration : leucoconcentration à 

la saponine (microfilaires), triple centrifugation (trypanosomes) 

Détermination de la parasitémie. 

Dans les urines 



Détermination de la charge parasitaire 




Recherche des kystes et œufs après une technique de concentration 

Recherche spéciale d’œufs d’oxyure et de taenia 

Dans le LCR : 



Urines : 



Dénombrement des germes urinaires 

Identification 

Antibiogramme 

Pus : 



Isolement, identification 

Antibiogramme 

Sécrétions broncho-pulmonaires : 




Antibiogramme 

Sécrétions ORL : 




Antibiogramme 






Antibiogramme 

Sang : Hémoculture 

Sérologies : 

Sérodiagnostic de Widal et Félix 

Sérodiagnostic des streptococcies : ASLO, ASDOR-B 

Sérologie syphilitique (voir manuel du programme de lutte contre les IST) 

Sérodiagnostic des infections à VIH (voir manuel du programme VIH) 



- Glycémie 

- Azotémie 


- Cholestérol HDL 

- Triglycérides 



- Protidémie 



- Amylasémie 

- Calcémie 

- Magnésémie 

- Phosphorémie 

- Phosphatases alcalines 

- Fer sérique 

- Electrophorèse des protéines 

- Electrophorèse de l’hémoglobine 


- Albumine 

- Sucre 






Biopsies et pièces opératoires 

Procédures de coloration des Frottis cervico-vaginaux : 

Coloration de Papanicolaou 

Coloration de Harris Shorr 

Screening des Frottis cervico-vaginaux 


1.3. Laboratoire de niveau National : 

1.3.1. Pour les maladies à potentiel épidémique 

Choléra : 




Antibiogramme 







Antibiogramme 


Shigellose : 




Antibiogramme 



Hémogramme (NFS) 




Electrophorèse de l’hémoglobine 

Dosage de l’Hb F 

Dosage de l’Hb A2 

Adénogramme 

Myélogramme 




Temps de thrombine 


Dosage des D-Dimère 

Dosage des facteurs de la coagulation 

Dosage du facteur Willebrand 

Dosage des protéines S, C et de l’antithrombine 

Détermination des anticorps anti phospholipides (LA et APA) 


Recherche de l’antigène D faible 

Phénotypage étendu 

Test de Coombs direct 

Test de Coombs indirect 

Test de compatibilité au laboratoire entre poche de sang et receveur 

Dépistage et identification des agglutinines irrégulières 





Recherche indirecte d’hématozoaires : Test d’immunochromatographie : ICT, Optimal, Paracheck 

etc… 


Recherche des parasites sanguicoles par des techniques de concentration : leucoconcentration à 

la saponine (microfilaires), triple centrifugation (trypanosomes) 

Détermination de la parasitémie. 

Identification des microfilaires 

Sérologie parasitaire et mycologique 

Recherche et culture de Leishmanies 




Détermination de la charge parasitaire 

Test d’éclosion des œufs de schistosomes 




Recherche des kystes et œufs après une technique de concentration 

Recherche spéciale d’œufs d’oxyure et de taenia 

Recherche spéciale des larves d’anguillule 

Recherche des Cryptosporidies 

Recherche des Microsporidies 

Recherche d’Isospora belli, de Cyclospora 

Dans le LCR : 


Prélèvements divers 

Recherche de parasites. 

Recherche de champignon par examen direct, culture et antifongigramme. 

Recherche de Pneumocystis carinii 


Urines : 



Dénombrement des germes urinaires 


Antibiogramme 

Pus : 




Antibiogramme 


Sécrétions broncho-pulmonaires : 




Antibiogramme 

Sécrétions ORL : 




Antibiogramme 





Antibiogramme 

Sang : Hémoculture 

Sérologies : 

Sérodiagnostic de Widal et Félix 

Sérodiagnostic des streptococcies : ASLO, ASDOR-B 

Sérologie syphilitique (voir manuel du programme de lutte contre les IST) 

Sérodiagnostic des infections à VIH (voir manuel du programme VIH) 

Antibiogramme 



- Glycémie 

- Azotémie 



- Cholestérol HDL 

- Triglycérides 


- Gaz du sang (pH, PaCO 2 , PaO 2 , HCO 3 ) 

- Protidémie 



- Phosphatases alcalines 

- Gamma GT 

- Amylasémie 

- Calcémie 

- Magnésémie 

- Phosphorémie 

- Fer sérique 

- Ferritine 

- Transferrine 


- Electrophorèse des protéines 

- Electrophorèse de l’hémoglobine 

- Hormones Thyroïdiennes (T3, T4, TSH) 

- Fertilité (FSH, LH, Prolactine) 

- Hormones sexuelles (Testostérone, Oestradiol, Progestérone…) 

- Marqueurs tumoraux (PSA, CA 125, CA 15-3…) 


- Albumine 

- Sucre 


- Densité 

- pH 






Procédures de coloration des Frottis cervico-vaginaux 

Coloration de Papanicolaou 

Coloration de Harris Shorr 

Screening des Frottis cervico-vaginaux 


Chapitre 2 

EQUIPEMENTS ET MATERIELS 

NECESSAIRES PAR NIVEAU 


2.1. Laboratoire de niveau périphérique : centres de santé des Districts 

Equipement / Matériel Quantité minimale 

Agitateur type vortex 1 

Appareil semi automatique d’hémostase 1 

Armoire réfrigérée type « banque de sang » 1 

Automate de numération et approche de formule sanguine 1 

Bac de coloration 2 

Balance portable (portée 5000 g) 1 

Bain marie thermostaté 1 

Bec Bunsen 2 

Centrifugeuse de paillasse 1 

Déminéralisateur 1 

Distillateur d’eau 1 

Egouttoir 2 

Glacière et accumulateurs de froid 2 

Microscopes optiques 2 

Micropipettes à volume variable 0 à 1000 µl 2 de chaque 

Minuterie 2 

Réfrigérateur avec congélateur 1 

Spectrophotomètre UV-VIS 1 

Cet équipement est à compléter par le matériel consommable et les réactifs 


2.2. Laboratoire de niveau régional : Hôpitaux régionaux, labo régionaux 


Agitateur de plaques 1 


Agitateur magnétique 1 

Appareil semi automatique d’hémostase 1 


Autoclave vertical (150 litres ou plus) 1 

Automate de numération et approche de formule sanguine 1 

Automate de biochimie environ 100 tests/heure 1 




Bec Bunsen 4 


Centrifugeuse sur pied 1 

Centrifugeuse réfrigérée 1 

Chaîne Elisa (Laveur + incubateur + lecteur) 1 

Chaîne d’électrophorèse 1 


Densitomètre 1 

Dispositif complet d’électrophorèse 1 


Etuves bactériologiques 2 




Minuterie 2 


Rotateur 1 

Spectrophotomètre 1 


Cet équipement est à compléter par le matériel consommable et les réactifs 


2.3. Laboratoire de niveau national : Hôpitaux nationaux, laboratoires de 

référence des programmes de lutte contre les maladies prioritaires 


Agitateur de plaques 1 


Agitateur magnétique 2 

Armoires de rangements de lames et de blocs 2 

Automate d’hémostase 1 

Automate d’enrobage à la paraffine 1 

Automate de déshydratation 1 

Automate de coloration 1 


Autoclave vertical (150 litres ou plus) 1 

Automate d’hématologie en formule complète 1 

Automates de numération et approche de formule sanguine 1 

Automate de biochimie environ 150 tests/heure 1 




Bec Bunsen 4 

Bouteille de transport d’azote liquide 2 


Centrifugeuse réfrigérée 1 

Centrifugeuse sur pied 2 

Chaîne Elisa (Laveur + incubateur + lecteur) 1 

Chaîne d’électrophorèse 1 

Congélateur à -80°C 1 

Cryomicrotome 1 

Cytocentrifugeuse 1 


Densitomètre 1 

Dispositif complet d’électrophorèse 1 


Etuves bactériologiques 2 

Four à micro-ondes 1 

Gazomètre 1 


Incinérateur (accessibilité) - 



Microscopes de recherche 1 

Microscope à observateurs multiples 1 

Microtome 2 


Minuterie 2 

Platine chauffante 1 

Photomicroscope 1 


Rotateur 2 

Spectrophotomètre 1 


Trocarts de Mallarmé pour myélogramme 4 


Chapitre 3 

PROCEDURES TECHNIQUES 


3.1. MALADIES A POTENTIEL EPIDEMIQUE 

3.1.1. Choléra : 

Prélèvement 

En cas de suspicion de choléra, les selles sont prélevées chez le patient conscient, dans un pot propre 

hermétiquement fermé. 

Chez le malade fatigué ou avec des troubles de la conscience, un écouvillonnage rectal est effectué. 

Pot de coproculture 

Transport 

Le prélèvement est immédiatement acheminé au laboratoire ; si le transport est différé, les selles doivent 

être ensemencées dans un milieu Cary Blair. 

a) Examen macroscopique : 

L’examen macroscopique apprécie à l’œil nu l’aspect des selles qui, dans les cas typiques, sont liquidiennes, 

ressemblant à de l’eau de riz. 

D’autres aspects sont cependant possibles. 

b) Examen microscopique : 

Il s’agit surtout d’un examen à l’état frais (une goutte de selles entre lame et lamelle observée à l’objectif x 

40) pour rechercher essentiellement une mobilité suspecte des bactéries, à savoir des bacilles très mobiles 

grâce à une ciliature polaire, comparés à des étoiles filantes. 

Une coloration de Gram peut être effectuée : les vibrions se présentent alors sous forme de bacilles à 

Gram négatif incurvés (en virgule). 

Aspect en virgule des vibrions après coloration de Gram 


NB : Les laboratoires périphériques qui ne peuvent pas procéder à la culture : 

- rendent les résultats obtenus aux deux premières étapes (examens macroscopique et microscopique) 

- ensemencent un milieu de transport (Cary Blair) qui sera envoyé au laboratoire régional ou national 

le plus proche. 

Milieu de Cary Blair (gélose semi solide) 

c) Isolement : 

La culture des selles à la recherche de Vibrio cholerae est effectuée sur deux sortes de milieux : 

/ Le milieu d’enrichissement qui est un bouillon permettant une culture abondante et rapide des vibrions : 

l’Eau Peptonée Hypersalée Alcaline (EPHA) est utilisée en général. Après ensemencement, ce milieu est 

incubé à 37°C pendant 4 h puis repiqué sur milieu d’isolement. 

/ Les milieux d’isolement, qui peuvent être sélectifs ou non, permettent d’obtenir des colonies caractéristiques : 

- Sur gélose nutritive alcaline (GNA), les colonies de vibrions sont de taille moyenne, à surface 

lisse, transparentes, avec des contours réguliers. 

- Sur gélose TCBS (Thiosulfate, Citrate, Bile, Saccharose), les colonies sont moyennes à grosses, 

lisses, à contours réguliers, de couleur jaune du fait de la fermentation du saccharose. 

Aspect des colonies de V. cholerae sur GNA (à droite) et sur TCBS (à gauche) 

d) Identification 

L’identification est réalisée en deux étapes sur les colonies suspectes après vérification de leur morphologie 

et de leur mobilité à l’examen microscopique (bacilles très mobiles par ciliature polaire, à Gram négatif 

incurvés) : 


Identification biochimique d’abord qui est effectuée grâce : 

- au test à l’oxydase qui est positif 

- à l’ensemencement d’une galerie d’identification minimale (Kligler-Hajna, Mannitol-Mobilité, Citrate 

de Simmons, Urée-Indole, Eau peptonée sans indole, Eau peptonée nitratée). 

Les principaux caractères biochimiques de Vibrio cholerae sont les suivants : Glucose (+) fermenté sans 

gaz, Lactose (-) ou lent avec test à l’ONPG (+), SH2 (-), uréase (-), indole (+), nitrate réductase (+), 

catalase (+), oxydase (+). La classique sensibilité au composé O/129 n’est plus un test spécifique à cause 

de la circulation de plus en plus fréquente, de souches résistantes. 

/ Identification immunologique par agglutination sur lame grâce à un test au latex pour déterminer 

le sérogroupe et le sérotype. Les sérogroupes O1 et O139 sont responsables d’épidémies ; le sérogroupe 

O1 compte trois sérotypes : Ogawa, Inaba et Hikojima. 

Test d’agglutination sur lame pour le sérogroupage 

(positif à gauche, négatif à droite) [Source : A. Dodin] 

NB : En cas d’épidémie, une démarche plus rapide (ci-dessous décrite) est adoptée et lorsque 

l’épidémie est confirmée les analyses de selles sont réalisées chez 1 malade sur 10. 

- Après les examens macroscopique et microscopique, un milieu d’enrichissement est ensemencé 

et incubé pendant 3 heures. 

- Le 1 er tube est repiqué sur un 2 e contenant de l’EPHA et réisolé parallèlement sur milieux d’isolement 

(GNA, TCBS). 

- Au bout de trois autres heures, la même opération est répétée à partir du 2 e tube d’EPHA. 

- Après 16 à 18 heures, les tests suivants sont réalisés sur colonies suspectes isolées sur GNA : examen 

microscopique, test à l’oxydase et tests d’agglutinations. 

NB : à défaut de GNA, on peut utiliser la gélose Mueller Hinton 

le test d’agglutination ne doit pas être effectué sur les colonies de TCBS 

d) Antibiogramme : 

Il est réalisé sur gélose Mueller Hinton (MH) selon la technique décrite plus loin. 

Les antibiotiques suivants doivent être testés pour les besoins de la surveillance comme du traitement : 

amoxicilline, tétracycline, doxycycline, chloramphénicol, cotrimoxazole, furazolidone, érythromycine, 

norfloxacine. 

e) Acheminement des souches au Laboratoire National de Référence : 

Les souches identifiées et isolées en culture pure seront envoyées au Laboratoire National de Référence 

sur milieu de conservation qui sera mis à la disposition des laboratoires du Réseau, et conformément aux 

règles d’expédition des échantillons infectieux. 


3.1.2. Méningite cérébro-spinale : 

a) Prélèvement 

Le prélèvement du LCR se fait par ponction lombaire qui est un acte médical (doit être effectué par un 

médecin). 

Le recueil se fait dans trois tubes stériles dont un destiné à l’étude bactériologique. 

b) Transport 

Le LCR doit être acheminé rapidement au laboratoire car les bactéries responsables généralement de 

méningites sont fragiles. 

Au laboratoire, le tube peut être conservé à 37°C en attendant d’être traité 

c) Examen macroscopique : 

L’aspect du liquide céphalorachidien (LCR) est noté dès l’arrivée de l’échantillon. 

Il peut être clair louche, trouble, purulent, hématique, xanthochromique. Un LCR clair n’exclut pas une 

méningite : c’est les cas des méningites purulentes au début ou décapitées par une antibiothérapie préalable, 

c’est aussi le cas des méningites tuberculeuses, virales, parasitaires … 

d) Examen microscopique : 

Il permet une étude cytologique et bactériologique : 

/ La cytologie quantitative est effectuée sur le LCR total par dénombrement sur cellule de Malassez ou de 

Nageotte qui permet de déterminer le nombre de cellule par millimètre cube de LCR. Ce nombre est égal 

à 1 à 3 / mm 3 dans un LCR normal. 

/ La cytologie qualitative, réalisée sur le culot de centrifugation, précise la nature des cellules présentes 

(polynucléaires, lymphocytes …) 

/ Un frottis est réalisé à partir du culot de centrifugation pour une coloration de Gram. L’examen au 

microscope peut mettre en évidence des bactéries 

Exemples : . diplocoques à Gram négatif en ‘grain de café’ 

. diplocoques à Gram positif lancéolés, encapsulés 

. bacilles à Gram négatif polymorphes, … 

e) Recherche d’antigènes solubles (agglutination au latex) : 

Elle permet un diagnostic rapide de la méningite grâce un test d’agglutination effectué sur le surnageant de 

centrifugation. (suivre les directives formulées par le fabricant du kit utilisé). 

NB : Pour les laboratoires ne disposant pas de plateau technique pour faire plus, les résultats obtenus sont 

rendus (examens macroscopique, cytologie quantitative et qualitative, test d’agglutination) et le reste de 

l’échantillon de LCR est mis dans un milieu de transport comme le Trans-Isolate qui sera acheminé au 

Laboratoire régional ou national le plus proche. 

f) Culture 

Dès l’arrivée du LCR, il est ensemencé sur milieux enrichis qui seront incubés sous atmosphère enrichie en 

CO2. 

g) Isolement et Identification de Neisseria meningitidis (agent de méningite épidémique): 

La culture est réalisée avec le LCR total sur des milieux riches : Mueller Hinton et Gélose au sang cuit 

additionnée de mélange polyvitaminique. 

Après isolement, un test à l’oxydase est réalisé sur les colonies suspectes puis une galerie d’identification 

ensemencée (Galerie API NH, Galerie Neisseria 4 heures). 


Les principaux caractères d’identification de Neisseria meningitidis sont les suivants : diplocoques à 

Gram négatif, aérobie stricte, oxydase (+), Maltose (+), Glucose (+). 

Les tests d’agglutination permettront la confirmation, en précisant le sérogroupe. 

g) Antibiogramme : La sensibilité des souches aux antibiotiques suivants sera particulièrement surveillée : 

chloramphénicol, cotrimoxazole, aminopénicilline, céphalosporines de 3 e génération. 

h) Acheminement des souches au Laboratoire National de Référence : 




3.1.3. Shigellose : 

a) Prélèvement : 

Les selles sont recueillies dans des pots propres. 

b) Transport : 

Le prélèvement est immédiatement acheminé au laboratoire ; si le transport est différé, les selles doivent 

être ensemencées dans un milieu Cary Blair. 

c) Examen macroscopique : 

Il vérifie la consistance des selles, la présence de glaire, de sang de mucus. 

Selles sanglantes, suspectes de shigellose 

d) Examen microscopique : 

En cas de shigellose, on note la présence de nombreux polynucléaires et un déséquilibre de la flore avec 

prédominance de bacilles immobiles. 

En outre, cet examen permet d’écarter la présence d’amibe. 

NB : Les laboratoires périphériques qui ne peuvent pas procéder à la culture rendent les résultats obtenus 

aux deux premières étapes, puis ensemencent un milieu de transport (Cary Blair) qui sera envoyé au 

laboratoire régional ou national le plus proche. 

e) Isolement et Identification : 

L’ensemencement est réalisé sur milieux sélectifs (exemples :gélose Hektoen, gélose SS (Salmonella - 

Shigella) qui sont incubés à 37°C. Au bout de 24 heures, les colonies suspectes (Lactose -, SH2 -) sont 

ensemencées sur milieu Urée – Indole. 


Culture sur gélose Hektoen 

Après 18 à 24 heures d’incubation, les souches uréase (-) sont mises en culture sur une galerie d’identification 

en tubes (kligler hajna, mannitol mobilité). 

Les principaux caractères des shigelles sont : bacilles à Gram négatif, immobiles, AAF, catalase (+) sauf 

S. dysenteriae-1, uréase (-), fermentent le glucose sans production de gaz, H2S (-), Citrate de Simmons 

(-). Les caractères différentiels des espèces sont résumés dans le tableau ci-dessous. 

Shigella dysenteriae est la seule espèce renfermant un sérotype épidémiogène, Shigella dysenteriae-1. 

Caractères S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonnei 

Mannitol (-) (+) (+) (+) 

Indole (-) V V (-) 

ONPG V (-) V (+) 

f) Antibiogramme : tester les antibiotiques suivants : amoxicilline, acide nalidixique, cotrimoxazole, 

tétracycline. 

g) Acheminement des souches au Laboratoire National de Référence : 





3.2. HEMATOLOGIE 

3.2.1. Hématologie cellulaire 

a) Hémogramme (NFS) 

C’est l’étude quantitative et qualitative des éléments figurés du sang. 

Le prélèvement est effectué sur tube EDTA 

(Le sang de contrôle (haut, normal et bas) passé une à deux fois par jour selon le nombre de 

prélèvements doit donner des résultats inclus dans les normes établies par le laboratoire). 

Il doit comporter : 

♦ la numération des cellules sanguines (globules rouges, globules blancs et plaquettes) 

♦ l’étude des constantes hématologiques : 

Taux d’hémoglobine (Hb) 

Hématocrite (Ht) 

Volume globulaire moyen (VGM) 

VGM= Ht / nombre de GR (en millions) ×10 

Il est exprimé en femtolitre (fL) ou en microns cube (µ3) 

Teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH) 

TCMH= Hb/ nombre de GR (en millions) ×10 

Il est exprimé en pico gramme (pg) 

Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) 

CCMH= Hb / Ht × 100 

Il est exprimé en pourcentage 

♦ L’étude morphologique des cellules sur frottis sanguin qui permet en outre d’établir la formule 

leucocytaire. 

Réalisation d’un frottis 

- Déposer à 1 cm de l’extrémité d’une lame parfaitement propre, une goutte de sang à l’aide 

d’un capillaire. 

- Placer le bord de la lamelle à étalement en contact avec la lame, à proximité de la goutte de 

sang. 

- Faire glisser la lamelle inclinée à 45° sur la lame jusqu’à atteindre la goutte de sang. Le sang 

s’étend par capillarité sur toute la largeur de la lamelle. 

- Tirer la lamelle d’un mouvement régulier et rapide. Il faut conserver l’inclinaison et ne pas trop 

appuyer sur la lamelle. Tout le sang doit être étalé avant d’atteindre le bout de la lame. 

- Sécher à l’air. 

NB : A la place de la lamelle, on peut utiliser une lame à bord mousse 


Réalisation d’un frottis 

Coloration au May Grunwald Giemsa (MGG) 

Fixation 

- Placer la lame du frottis sur un support horizontal au dessus d’un bac de coloration. 

- Verser sur la lame 5 gouttes de colorant May-Grünwald pur de façon à recouvrir complètement le 

frottis. Laisser agir 3 minutes. Laver à l’eau tamponnée (à défaut utiliser l’eau de robinet) 

Coloration au Giemsa 

- Préparer une dilution du Giemsa au dixième avec de l’eau tamponnée (eau neutre) 

- Recouvrir le frottis de la solution diluée 

- Laisser agir 20 mn 

- Laver à l’eau 

Séchage 

- Laisser sécher la lame à l’air, en position inclinée, après avoir essuyé la face inférieure de la lame 

avec du papier filtre. 

- Attendre au moins 5 minutes avant l’examen microscopique du frottis. 


Galerie de photographies des éléments figurés du sang après coloration au MGG 

Polynucléaire neutrophile 

o Taille: 12 à 14µm, arrondi 

o Noyau : 3 à 5 lobes 

o Cytoplasme : acidophile, 

petites granulations marron clair 

(granulations neutrophiles) 

Polynucléaire neutrophile : La chromatine du 

noyau forme des mottes denses avec de petits 

espaces clairs. Deux plaquettes sont visibles 

à gauche de l’image. 

Polynucléaire neutrophile: Le noyau est 

formé ici de 5 lobes reliés entre eux par un fin fil 

de chromatine. Le cytoplasme est rosé et rempli 

de petites granulations 


Polynucléaire éosinophile : Noyau souvent bilobé 

(comme sur cette image). Cytoplasme rempli de 

grosses granulations oranges (éosinophiles) 

Polynucléaire éosinophile 

Polynucléaire basophile 

o Taille:11 à 13µ arrondi 

o Noyau:2 à 4 lobes denses 

o Cytoplasme:acidophile clair 

o Granulations:bleu violet foncé, 

nombreuses pouvant recouvrir le noyau 


Polynucléaire basophile: les nombreuses 

granulations violet foncé sont le critère 

majeur d’identification de la cellule. 

Lymphocyte (Petit): 

o Taille: 9-11µ arrondi 

o Noyau: rond et dense 

o Cytoplasme: basophile clair 

o Granulations: néant 

Lymphocyte (Grand): 

o Taille: 10-15µ arrondi, 

déformable 

o Noyau: rond, ovale ou en 

drapeau 

o Cytoplasme: bleu très clair 


Lymphocyte (Granuleux): 


o Noyau: rond, ovale 

o Cytoplasme: bleu clair 

o Granulations: quelques 

granulations azurophiles 

Monocyte 


o Noyau: rond ou irrégulier 

o Cytoplasme: bleu clair, peut 

contenir des vacuoles 

o Granulations: très fines, très 

nombreuses, azurophiles 

Monocyte: 

Noyau irrégulier, cytoplasme gris 

dans lequel on devine de fines 

granulations 


Paquettes: 

Cinq petits éléments colorés en violet. 

NB : une différence de taille = aniso 

cytose plaquettaire 

Numération globulaire et paramètres érythrocytaires 

Hématies 10.6/µL 

(Tera/L) 

Leucocytes 10³/µL 

(Giga/L) 

Plaquettes 10³/µL 

(Giga/L) 

1ère 

semaine 

8 jours à 3 

mois 

3 mois à 3 

ans 

3 à 6ans 

6 à 15 

ans 

5,0 à 6,0 3,8 à 4,8 3,6 à 5,2 4,1 à 5,3 4,0 à 5,4 

Adulte 

H : 4,5 à 5,8 

F : 3,8 à 5,4 

10,0 à 30,0 6,0 à 18,0 6,0 à 15,0 5,0 à 13,0 5,0 à 11,0 4,0 à 10,0 

150 à 400 150 à 400 150 à 400 150 à 400 150 à 400 150 à 400 

Hémoglobine g/dL 14,5 à 22,5 10 à 16 10,5 à 13,5 

10,5 à 

13,5 

11,5 à 

14,5 

Hématocrite % 44 à 58 38 à 44 36 à 44 36 à 44 37 à 45 

H : 13,5 à 

17,5 

F : 12,5 à 

15,5 

H : 40 à 50 

F : 37 à 47 

VGM fl 100 à 120 85 à 96 70 à 86 73 à 89 77 à 91 82 à 98 

TCMH pg 34 à 38 24 à 34 23 à 31 24 à 30 24 à 30 > ou = 27 

CCMH g/dL 32 à 36 32 à 36 32 à 36 32 à 36 32 à 36 32 à 36 


Formule leucocytaire 

en 10³/µL 1ère semaine 8 jours à 3 mois 3 mois à 3 ans 3 à 6 ans 6 à 15 ans Adulte 

Polynucléaires neutrophiles 6,0 à 26,0 1,5 à 8,5 1,5 à 8,5 1,5 à 8,5 1,8 à 8,0 

Polynucléaires éosinophiles 0,2 à 0,85 0,2 à 1,2 0,05 à 0,7 0,02 à 0,65 0 à 0,6 

b) Vitesse de sédimentation 

Conditions de prélèvement 

- Prélèvement de sang veineux (en général au pli du coude) ; le tube de prélèvement contient un anticoagulant : 

EDTA ou citrate trisodique à 3,8% dans une proportion de 20% (1 volume d’anticoagulant pour 4 volume 

de sang) 

- Le prélèvement est réalisé de préférence à jeun 

Principe 

C’est la vitesse à laquelle les hématies contenues dans le plasma sédimentent au fond d’un tube calibré et 

gradué, appelé tube de Westergreen. Elle correspond à la hauteur de chute des particules sanguines dans 

le tube. 

Matériel et réactifs 

- le tube de Westergreen : c’est une pipette de dimensions standardisées : longueur totale 300 mm, diamètre 

inférieur à 2,5 mm. Cette pipette est graduée de 0 à 200 mm de haut en bas. Elle est en matière plastique 

et à usage unique. 

- le support : généralement adapté aux pipettes, il permet de les maintenir strictement verticales. 

Technique 

- Aspirer le sang, bien homogénéisé, dans la pipette de Westergreen jusqu’au trait 0 en tirant sur la 

languette présente dans la pipette. 

- Placer aussitôt la pipette sur le support. 

1,8 à 

7,5 

0,04 à 

0,8 

Polynucléaires basophiles 0 à 0,64 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,2 

Lymphocytes 2,0 à 11,0 2,0 à 11,0 4,0 à 10,5 2,0 à 8,0 1,5 à 6,5 

Monocytes 0,4 à 3,1 0,05 à 1,1 0 à 0,8 0 à 0,8 0 à 0,8 

1,0 à 

4,5 

0,2 à 

1,0 


Lecture 

Lire la hauteur du plasma surnageant (exprimée en mm) au bout d’une heure. 

NB : les anciennes lectures à 2h et 24h n’ont pas d’intérêt. 

Résultats 

Les valeurs normales sont : - enfant : 6 à 25 mm 

- femme adulte : 4 à 20 mm 

- homme adulte : 3 à 10 mm 

Portoir pour vitesse de sédimentation 

Causes d’erreurs 

La sédimentation des hématies peut être ralentie artificiellement si : 

- l’échantillon sanguin est partiellement coagulé 

- la mesure est faite à partir d’échantillon sanguin prélevé depuis plus de 2 heures 

- la température du laboratoire est basse 

La sédimentation des hématies peut être augmentée artificiellement si : 

- la pipette de Westergreen est inclinée 

- l’échantillon sanguin est hémolysé ou prélevé avec un excès d’anticoagulant 

- la température du laboratoire est élevée. 


) Test d’Emmel ou test de falciformation des hématies 


- le prélèvement est effectué sur sang veineux dans un tube avec ou sans anticoagulant 

- il n’est pas nécessaire d’être à jeun 

Principe 

En présence d’un réducteur (métabisulfite de sodium à 2%), les hématies du drépanocytaire prennent une 

forme en « faucille » ou en « feuille de houx ». 


- Spatule 

- Méta bisulfite de sodium en poudre 

- Balance de précision 

- Eau distillée 

- Flacon de 125 ml 

- Papier buvard 

- Lame 

- Lamelles 

- Vernis à ongles 

Technique 

o Préparation du métabisulfite 

- déposer le papier buvard sur le plateau de la balance 

- calibrer l’appareil 

- à l’aide de la spatule, prélever la poudre de méta bisulfite et la déposer sur le papier buvard 

- peser exactement 2 grammes de cette poudre 

- recueillir les 2 grammes dans un flacon de 125 ml 

- ajouter 100 ml d’eau distillée 

- mélanger et attendre 15 mn environ pour que la solution soit stable 

- tester la solution de méta bisulfite à 2% avec les échantillons positifs de la veille 

NB : Le contrôle de qualité interne exige de préparer le métabisulfite tous les jours et de le vérifier sur des 

échantillons considérés connus positifs et négatifs. 

o Préparation du test 

- déposer sur une lame propre une goutte de sang et une goutte de la solution de métabisulfite 

- mélanger doucement 

- déposer sur le mélange une lamelle en évitant les bulles d’air 

- essuyer délicatement l’excès du mélange avec du papier buvard (à défaut utiliser une compresse) 

- sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles ou de la paraffine, le but étant d’empêcher 

le contact des hématies avec l’oxygène de l’air ambiant. 


Lecture 

Elle se fait au bout de 15 à 30 mn au microscope à un grossissement 40. 

Résultats 

- test négatif : les hématies gardent leur forme régulièrement arrondie ; 

- test positif : présence de nombreuses hématies en forme de « faucille ». 

une hématie normale : 

un beau disque biconcave de 7 µm de diamètre 

Hématies normale et falciforme 

Frottis sanguin avec présence de drépanocytes 


- Etalement mal fait avec hématies « traumatisées » 

- Présence de bulles d’air 

b) Taux des réticulocytes 


- sang veineux sur tube EDTA ou sang capillaire 

- il n’est pas nécessaire d’être à jeun 

une hématie falciforme 


Principe 

Les réticulocytes sont des globules rouges jeunes qui possèdent encore des ribosomes et des 

mitochondries. Ils sont dès lors capables d’un métabolisme assez intense et ils synthétisent encore activement 

de l’hémoglobine. On les reconnaît le plus facilement au moyen de colorations utilisant le bleu de crésyl ou 

le bleu de méthylène nouveau : dans ces conditions les organites cellulaires cités plus haut sont rendus 

visibles sous la forme d’une “substance granulo-filamenteuse” caractéristique. 


- bleu de crésyl brillant ou bleu de méthylène 

- tube à hémolyse 

- bain marie 

- pipette Pasteur 

- lame 

Technique 

- dans un tube à hémolyse, déposer 1goutte de sang et 1goutte de bleu de crésyl (si le taux d’Hb est 

inférieur à 11g/dL, mettre 2 gouttes de sang et 1 goutte de bleu de crésyl) 

- incuber au bain marie à 37°C pendant 20 mn 

- puis confectionner un frottis et lire au microscope au grossissement 100 avec de l’huile à immersion 

(idéalement lire sur dix champs ; compter le nombre de réticulocytes et de globules rouges et 

exprimer le pourcentage de réticulocytes sur le nombre globules rouges). 

Résultats 

Le résultat est exprimé en pourcentage et surtout en valeur absolue de réticulocytes par mm 3 de sang. Le 

taux normal est de : 

- 0,2 à 2% chez l’adulte (généralement 0,5 à 1,5%) 

- 2 à 6% chez le petit enfant 

Le taux des réticulocytes traduit l’activité de l’érythropoïèse médullaire. Il est un indicateur du type d’anémie. 


Frottis avec présence de réticulocytes (3 réticulocytes sont visibles sur chaque frottis) 


- corps de Jolly 

- hématies à ponctuations basophiles (mieux visibles sur microscope à diaphragme fermé) 

- inclusions parasitaires (plasmodium) 

- corps de Heinz 


) Détermination de la résistance globulaire osmotique 


- sang veineux 

- utiliser un tube avec de l’héparine (EDTA contient des sels) 

Principe 

Les hématies, qui in vivo sont dans un milieu isotonique, se comportent in vitro dans des solutions 

hypotoniques comme des osmomètres. Par osmose, l’eau diffuse du milieu le moins concentré en osmoles 

vers le compartiment le plus concentré en osmoles. 

Dans les solutions hypotoniques, l’eau pénètre dans les hématies qui gonflent grâce aux propriétés d’élasticité 

de la membrane plasmique. Au-delà d’un volume maximal, les hématies éclatent en libérant l’hémoglobine 

dans le milieu extérieur : il y a hémolyse. 

Dans certaines pathologies et notamment lors d’anémies hémolytiques, la résistance globulaire osmotique 

(ou RGO) des hématies peut être : 

- augmentée : l’hémolyse apparaît pour des solutions de concentration en NaCl inférieure à celle 

provoquant normalement l’hémolyse, donc pour des solutions d’hypotonie supérieure. C’est le 

cas lors de ß thalassémies 

- diminuée : l’hémolyse apparaît pour des solutions de concentration en NaCl supérieure à celle 

provoquant normalement l’hémolyse, donc pour des solutions d’hypotonie inférieure. C’est le cas 

lors de la microsphérocytose. 

Matériel 

- tubes à hémolyse 

- portoir 

- eau distillée 

- NaCl 

- Pipette 

- Etuve 

- Centrifugeuse 

Technique 

La détermination de la RGO se réalise sur sang total ou sur sang déplasmatisé, à 37°C pendant une heure. 

On réalise une gamme de solutions de NaCl hypotoniques par rapport au plasma. Les concentrations en 

NaCl de ces solutions varient de 2,6 à 6g/L et sont croissantes de 0,2 en 0,2g/L. 

- disposer les 18 tubes à hémolyse sur un portoir et les numéroter 

- préparer les 18 solutions de NaCl à partir d’une solution mère à 7g/L et d’eau distillée selon le 

protocole présenté dans le tableau suivant : 

N° des tubes 1 2 3 4 5 …. 14 15 16 17 18 

Nombre de gouttes d’eau 

distillée 

Nombres de gouttes de solution 

mère de NaCl à 7g/L 

Concentration finale en NaCl en 

g/L 

5 6 7 8 9 18 19 20 21 22 

30 29 28 27 26 17 16 15 14 13 

6 5,8 5,6 5,4 5,2 3,4 3,2 3 2,8 2,6 


- mettre d’abord l’eau distillée 

- distribuer la solution de NaCl à 7g/L avec la même pipette après l’avoir correctement rincée avec 

cette solution 

- ajouter dans chaque tube une goutte de sang homogénéisé, ou d’hématies déplasmatisées 

- mélanger doucement, boucher les tubes et les porter à l’étuve à 37°C pendant 1 heure 

- centrifuger tous les tubes 2 mn à 2000 tours par minute. 

Lecture 

o Lecture directe 

Faire la lecture de la gamme de gauche à droite en partant des solutions les moins hypotoniques. Observer : 

- dans les premiers tubes, le surnageant est incolore, les hématies sont intactes et forment un culot 

rouge au fond du tube : il n’y a pas d’hémolyse 

- à partir d’un certain tube, le surnageant devient jaune, quelques hématies ont été lysées et ont 

libéré leur hémoglobine : il y a hémolyse partielle ; dans les tubes suivants, le culot globulaire 

diminue de plus en plus et la couleur du surnageant s’accentue 

- à partir d’un certain tube, le culot globulaire a disparu, toutes les hématies sont détruites, l’hémolyse 

est totale : il reste un petit culot blanchâtre composé de restes membranaires. 

Noter les concentrations en NaCl des solutions des 2 tubes : 

- Hi ou hémolyse initiale : premier tube où le surnageant est jaune 

- Ht ou hémolyse totale : premier tube où le culot globulaire a disparu. 

o Lecture ou spectrophotomètre 

Compléter la lecture en mesurant l’absorbance de chaque surnageant à 540 nm afin de doser la quantité 

d’hémoglobine libérée. L’absorbance du surnageant du premier tube de la gamme correspondra à 0% 

d’hémolyse et l’absorbance du surnageant du dernier tube correspondra à 100% d’hémolyse. 

Tracer la courbe % d’hémolyse = f (concentration en NaCl) 

Déterminer la valeur de la concentration en NaCl correspondant à 50% d’hémolyse (H50%) 

Résultats 

o Lecture directe 

Les valeurs normales sont les suivantes : 

Valeurs normales de la RGO 

Sang total Hématies déplasmatisées 

Hi 4,4 à 4,6 g/L 4,8g/L 

Ht 3,4g/L 3,6g/L 

o Lecture au spectrophotomètre 

La valeur normale moyenne H50 % est de 3,8 à 4,2g/L 


Interprétation 

- pour des valeurs obtenues supérieures à la normale, la RGO est diminuée, les hématies sont plus 

fragiles. 

- Pour des valeurs obtenues inférieures à la normale, la RGO est augmentée, les hématies sont plus 

résistantes 

b) Adénogramme 

Principe 

C’est l’étude cytologique du suc ganglionnaire après ponction à l’aiguille fine. L’adénogramme permet un 

diagnostic d’orientation des proliférations lymphoïdes, qu’elles soient bénignes ou malignes. 

Matériel 

- aiguille fine (23 G de préférence) et seringue 

- lames 

- coton 

- alcool 

Technique 

- la peau non anesthésiée et désinfectée est étirée 

- introduire l’aiguille (de type intramusculaire) montée sur une seringue avec un piston bien mobile, 

dans le ganglion 

- le tissu ganglionnaire est alors aspiré en faisant varier plusieurs fois l’orientation de l’aiguille (en 

maintenant toujours l’aspiration) 

- le contenu de la seringue est ensuite chassé sur la lame 

- on confectionne des frottis qui seront colorés au MGG 

NB : Le suc ganglionnaire sera d’autant moins mêlé de sang et donc facile à analyser que l’on évitera 

d’aspirer. La meilleure technique consiste à laisser un peu de suc cellulaire remonter dans l’aiguille en 

massant fermement le ganglion, puis à chasser ce suc sur une lame et à procéder à l’étalement. 

c) Myélogramme 

Principe 

C’est l’étude cytologique de la moelle osseuse. 

Sites de la ponction 

La moelle osseuse rouge est essentiellement située dans les épiphyses des os longs et dans les os plats. Le 

site de ponction préférentiel chez l’adulte est le sternum et l’épine iliaque chez l’enfant. Chez le nourrisson, 

il faut préférer l’épine iliaque ou la tubérosité tibiale antérieure. 


Matériel 

La ponction est réalisée à l’aide d’un trocart : le trocart de Mallarmé qui est composé de 2 éléments 

distincts : 

- une aiguille creuse, à l’extrémité inférieure effilée. Sa partie supérieure est composée de 2 branches 

perpendiculaires à l’axe de l’aiguille, branches permettant une bonne prise en main par l’opérateur ; 

- un mandrin à l’extrémité supérieure aplatie afin de pouvoir exercer une pression suffisante. Le 

mandrin traverse l’aiguille creuse. 

Aiguille et mandrin doivent avoir une extrémité pointue, tranchante et non émoussée. 

Prélèvement 

Au site de la ponction : 

- la peau est soigneusement désinfectée 

- le trocart tenu fermement par l’opérateur, est enfoncé perpendiculairement à la peau et à la surface 

osseuse avec un mouvement de rotation jusqu’à ce que l’on franchisse la corticale osseuse 

- après pénétration, le mandrin est retiré et remplacé par une seringue qui aspire de la substance 

médullaire (volume prélevé est inférieur à 0,5cc) 

- enlever la seringue et replacer le mandrin 

- le contenu de la seringue est déposé directement sur la lame pour un frottis médullaire réalisé de la 

même façon qu’un frottis sanguin 

NB : si la première aspiration a ramené du matériel, l’aiguille peut être retirée et un pansement légèrement 

compressif est appliqué au point de ponction. 

Coloration 

Les frottis confectionnés sont séchés à l’air et colorés au May Grunwald Giemsa mais éventuellement avec 

des colorants cytochimiques. 

Lecture 

Elle se fera d’abord au faible grossissement pour apprécier la richesse cellulaire puis au fort grossissement 

pour l’étude des différentes lignées. 

3.2.2. Hémostase 

L’exploration de la coagulation doit se faire sur des prélèvements avec comme anticoagulant le citrate 

trisodique à raison d’un volume d’anticoagulant pour 9 volumes de sang. 

Les tests doivent être réalisés dans les 4 heures qui suivent le prélèvement. 

Les outils du contrôle de qualité reposent sur deux types d’échantillons biologiques : 

- des pools de plasmas normaux ou anormaux préparés localement et aliquotés 

- des plasmas lyophilisés préparés industriellement par différentes firmes pharmaceutiques qui 

sont soit des plasmas étalons ou standards de calibration ou alors des plasmas de « contrôle » 

ayant une valeur moyenne et un intervalle de confiance déterminée selon la technique utilisée. 

Ces différents échantillons sont utilisés pour le contrôle de qualité journalier qui permet la validation 

quotidienne des résultats. Il est préférable de passer ces contrôles en début et en cours de série et de 

mentionner les résultats sur un graphe. L’ensemble des procédures de contrôle de qualité interne doit être 

clairement décrit dans un cahier technique qui doit être régulièrement mis à jour. Le contrôle de qualité 


interne doit aussi vérifier les étapes pré analytiques (prélèvements) et post analytiques (validation, rendu et 

archivage des résultats). 

a) Temps de saignement 

Principe 

C’est un test global qui explore l’hémostase primaire dans son ensemble (l’adhésion, l’agrégation et le 

facteur Willebrand) 

.Il est réalisé in vivo et mesure la durée de l’hémorragie provoquée par une incision de la couche superficielle 

de la peau des les conditions normalisées. 

Nous décrirons la méthode d’Ivy 3 points qui est la méthode de référence. 

Matériel 

- tensiomètre 

- vaccinostyle stérile 

- papier buvard 

- éther 

- chronomètre 

Technique 

- Placer le brassard à tension au bras gonflé à 40 mm Hg, pression qui sera maintenue constante toute 

la durée du test, 

- désinfecter la peau de l’avant bras avec l’éther (l’alcool entraîne une vasodilatation), laisser sécher, 

- réaliser 3 piqûres distantes de 2 cm chacune au niveau de l’avant bras à l’aide du vaccinostyle 

- déclencher immédiatement le chronomètre, 

- l’excès de sang est épongé délicatement toutes les 30 secondes à l’aide du papier buvard (éviter de 

toucher et de frotter les berges des points de piqûre) ; 

- noter le temps au bout duquel le saignement s’arrête au niveau de chaque point de piqûre et faire la 

moyenne 

Résultats 

La valeur normale chez l’adulte doit être inférieure à 5 mn. 

b) Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR) 

Principe 

C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté, pauvre en plaquettes recalcifié en présence de 

thromboplastine tissulaire. Le TQ explore la voie extrinsèque de la coagulation. 



o Matériel (commun pour les autres tests d’hémostase) 

- Billes magnétiques 

- Barrettes 

- Plasma Citrate 

- Micropipette 

- Coagulomètre au moins semi automatique (type ST art) 

- Embouts 

o Réactif 

- Thromboplastine calcique (réactif déclenchant) 

Technique 

- déposer les barrettes dans la zone d’incubation 

- distribuer une bille dans chaque cupule 

- mettre 50µL de plasma citraté dans chaque cupule 

- incuber pendant 1mn 

- transférer dans la zone de lecture 

- déclencher la coagulation en distribuant 100µL de thromboplastine calcique (préincubée à 37°C) 

dans chaque cupule 

Le temps de coagulation se mesure par l’arrêt du mouvement de billes 

Résultats 

o Expression en pourcentage d’activité prothrombinique 

En pratique courante, le temps de Quick (TQ) est converti en taux de prothrombine (TP) exprimé en 

pourcentage. La conversion du TQ en TP se fait à l’aide d’une droite d’étalonnage ou droite de « Thivolle », 

établie à partir de plasmas normaux testés en dilution. 

Les valeurs moyennes normales sont comprises entre 70 et 100%. 

o Expression des résultats lors des traitements aux antivitamines K (AVK) 

Pour la surveillance des traitements aux AVK le pourcentage utilisé dans l’expression du TQ ne convient 

pas, car les thromboplastines commerciales utilisées ont une sensibilité inégale aux AVK. Le rapport 

international normalisé (ou International Normalized Ratio : INR) est un nombre sans dimension, égal au 

rapport entre le TQ du malade (TQm) et le TQ du témoin (TQt), rapport élevé à l’index international de 

sensibilité (ou International Sensitivity Index : ISI). 

L’ISI est déterminé pour chaque thromboplastine commerciale par rapport à une préparation de référence. 

Il est fourni par le fabricant à chaque utilisateur. 

INR= (TQm /TQt) ISI 

Les valeurs exprimées en terme d’INR définissent deux niveaux d’anticoagulation : 

- anticoagulation faible : INR= 1,5 à 3 

- anticoagulation élevée : INR= 3 à 5 

Un INR supérieur à 5 est associé à un risque hémorragique excessif 


c) Temps de céphaline activée (TCA) 

Principe 

C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté, pauvre en plaquettes, recalcifié à 37°C en présence de 

substitut plaquettaire (céphaline) et d’un activateur (kaolin, silice ou acide ellagique) standardisant l’activation 

des facteurs contacts et en présence de calcium. 

Le TCA explore la voie endogène de la coagulation ainsi que la voie commune. Seul le facteur VII n’interfère 

pas sur ce test. 

Réactifs 

- réactif céphaline activateur 

- solution de CaCl2 

Technique 

- placer les barrettes dans la zone d’incubation 

- mettre une bille dans chaque cupule 

- ajouter 50µL de plasma citraté et 50µL de céphaline activateur 

- incuber pendant 3mn 

- transférer la barrette en zone de lecture 

- déclencher la coagulation en ajoutant 50µL de solution de CaCl2 

Le temps de coagulation se mesure par l’arrêt du mouvement de billes 

Résultats 

Ils sont exprimés en secondes et varient entre 20 et 40 secondes selon le réactif utilisé. 

Est considéré comme pathologique un écart supérieur à 8 secondes par rapport au contrôle. 

Chez les enfants de moins de 5 ans, le TCA est souvent à la limite supérieure des valeurs normales voire 

légèrement allongé, sans anomalies associées. 

NB : Si le TCA d’un patient est allongé, on réalise un TCA sur le mélange à volume égal du plasma du 

malade et du plasma du témoin : 

- une correction du TCA indique un déficit en un ou plusieurs facteurs de la voie intrinsèque 

- une non correction du TCA indique la présence d’anticoagulants circulants. 

d) Temps de thrombine 

Principe 

C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté pauvre en plaquettes, recalcifié à 37°C en présence 

d’une quantité déterminée de thrombine, quantité choisie de façon à entraîner la coagulation en 20 secondes 

d’un plasma témoin. 

Le temps de thrombine explore la fibrinoformation. 

Matériel 

Solution de thrombine calcique. 


Technique 

- mettre 100µL de plasma dans les barrettes placées en zone d’incubation et contenant des billes 

- incuber 2 mn 

- déclencher la coagulation en ajoutant 100µL de solution de thrombine calcique 

Résultats 

Un temps de thrombine est généralement inférieur à 22 s. Tout écart supérieur ou égal à 5s entre le temps 

de thrombine du plasma à tester et le temps de trombine du plasma témoin est considéré comme significatif. 

e) Dosage du fibrinogène par méthode chronométrique (Clauss) 

Principe 

Le temps de coagulation d’un plasma citraté pauvre en plaquettes, dilué dans des proportions adéquates, 

mis en présence d’un excès de thrombine à 37°C et en optimum calcique, est directement fonction du taux 

de fibrinogène fonctionnel plasmatique. 

Réactifs 

- solution de thrombine contenant un inhibiteur spécifique de l’héparine permettant le dosage du 

fibrinogène sur le plasma des patients traités par cet anticoagulant. 

- Tampon pH 7,35 permettant la dilution du plasma (tampon Owren-Koller) 

Technique 

- réaliser une dilution du plasma au 1/20 avec le tampon 

- mettre 100µL de la dilution dans les cupules placées en zone d’incubation et contenant des billes 

- incuber 1mn 

- Transférer la barrette en zone de mesure et déclencher la coagulation en ajoutant 50µL de solution 

de thrombine calcique. 

Résultats 

Le taux de fibrinogène normal est compris entre 2 et 4 g/L (le temps de coagulation mesuré est compris 

entre 8 et 20 secondes. 

f) Dosage des D-Dimères 

Principe 

Les D-Dimères sont des structures spécifiques des produits de dégradation de la fibrine. Ils sont mis en 

évidence directement dans le plasma citraté par une réaction d’agglutination passive utilisant des particules 

de latex sensibilisées avec un anticorps monoclonal anti D-Dimères ne réagissant pas avec le fibrinogène. 

Les particules de latex sont sensibilisées de telle sorte que l’on observe une agglutination à partir d’une 

concentration plasmatique des D-Dimères égale ou supérieure à 500ng/mL. 

Réactifs 

- suspension de latex sensibilisée avec des anticorps anti D-Dimères 

- plasma contrôle positif 

- plasma contrôle négatif 

- solution tampon pH 8,2 


Technique 

o Protocole qualitatif 

- sur une carte, déposer 

50 µL de contrôle positif 50 µL de plasma à tester 50 µL de contrôle négatif 

- ajouter à coté de chaque dépôt, une goutte de suspension de latex homogénéisé 

- mélanger avec un agitateur 

- imprimer à la plaque un mouvement rotatoire pendant 2 mn et observer l’apparition éventuelle 

d’agglutination 

- valider impérativement les témoins 

o Protocole semi quantitatif 

- diluer l’échantillon de ½ en ½ dans le tampon 8,2 

- procéder pour chaque dilution comme pour le test qualitatif 

Résultats 

La réaction est positive lorsqu’on observe une agglutination 

Le seuil de sensibilité de la technique étant de 500µL, une agglutination indique une concentration de D- 

Dimères égale ou supérieure à 500ng/Ml dans la dilution correspondante : la concentration plasmatique en 

D-Dimères est donc estimée en multipliant cette valeur par l’inverse de la dernière dilution donnant une 

agglutination. 


Les valeurs physiologiques en D-Dimères sont inférieures à 500ng/mL 

Des valeurs supérieures traduisent une activation de la fibrinolyse consécutive à une activation anormale de 

la coagulation. 

NB : Il existe une méthode immuno-enzymatique plus sensible mais plus longue dans sa réalisation. 

g) Dosage de l’activité des facteurs de la coagulation 

Le dosage consiste à mesurer le temps de coagulation d’un plasma contenant tous les facteurs de coagulation 

à l’exception du facteur à doser, celui ci étant apporté par le plasma à étudier, convenablement dilué. 

Le système test utilisé doit être sensible au facteur à mesurer : temps de Quick pour les facteurs II + X, V 

et VII, temps de céphaline activée pour les facteurs VIII, IX, XI, XII et contacts. 

h) Dosage du facteur Willebrand 

Il s’agit d’apprécier l’activité biologique d’agrégation plaquettaire du facteur Willebrand en présence d’un 

inducteur qui est la Ristocétine. La vélocité d’agrégation des plaquettes est proportionnelle au taux de 

facteur Willebrand contenu dans le plasma. Cette vélocité est mesurée par un agrégomètre ou un automate 

d’hémostase. 

En ce qui concerne le facteur Willebrand 3 entités peuvent être dosées : 

• Mesure de l’activité CoFacteur de la Ristocétine : peut être réalisée par une technique d’agglutination 

sur lame (test semi quantitatif) ou une technique d’agrégation de plaquettes lavées en présence de 

plasma et de Ristocétine 


Le taux normal est compris entre 50 et 150% 

• Mesure du Facteur Willebrand Antigène (vWAg) : ce facteur peut être dosé par des méthodes 

immunologiques à l’aide d’antisérum hétérologue par électro-immuno-diffusion (Laurell), immunoenzymologie 

(ELISA), ou radio-immunologie. 

• Mesure du Facteur VIIIc 

i) Dosage des protéines S, C et de l’antithrombine 

Les protéines S, C et l’antithrombine sont les inhibiteurs physiologiques de la coagulation. Leur mesure 

repose sur des techniques chronométriques ou immunologiques (en centre spécialisé uniquement). 

j) Détermination des anticorps anti phospholipides (LA et APA) 

Les anti phospholipides de type lupus anticoagulant (LA) sont dépistés devant un allongement d’un temps 

de la coagulation non corrigé par l’adjonction d’un plasma normal. 

Le principe des tests spécifiques d’identification de cet anticoagulant circulant est basé, soit sur des tests 

de potentialisation en diluant la céphaline ou la thromboplastine, soit sur des tests de neutralisation en 

apportant un excès de phospholipides. 

Les antiphospholipides de type anticardiolipine (APA) ne perturbent pas les tests de coagulation. Leur 

diagnostic est réalisé par des tests immunologiques (Elisa ou radio-immunologie). 

3.2.3. Immuno-hématologie et transfusion sanguine 

Les prélèvements peuvent être réalisés soit sur tube sec soit sur tube avec anticoagulant. 

Le contrôle de qualité interne repose sur l’analyse quotidienne d’échantillons de contrôle effectuée dans 

les mêmes conditions que celles appliquées aux échantillons biologiques. 

a) Groupage sanguin dans les systèmes ABO 

Principe 

Le groupage sanguin dans le système ABO repose sur deux épreuves réalisées simultanément et 

complémentaires, toutes deux étant des réactions d’agglutination directe : 

- épreuve de Beth Vincent (ou épreuve globulaire) : les hématies à tester sont mises en contact avec 

des anticorps sériques connus afin d’identifier les allo-antigènes de ces hématies. 

- épreuve de Simonin (ou épreuve sérique) : des hématies tests, dont les allo-antigènes du système 

ABO (H) sont connus, sont mises en contact avec le sérum à tester afin d’identifier les anticorps 

du système ABO(H) présents dans ce sérum 

Réactifs 

o Sérums tests 

- sérum-test anti-A 

- sérum-test anti-B 

- sérum-test anti-AB 

o Hématies tests 

Ce sont des hématies humaines prélevées sur une solution anticoagulante et conservatrice, lavées 3 fois en 

sérum physiologique, puis remises en suspension dans cette solution. 


Sont utilisées : 

- des hématies-tests A 

- des hématies tests B 

- des hématies tests O 

NB : les hématies tests doivent être préparées quotidiennement au laboratoire. 

Les diverses techniques 

Elles doivent toujours être réalisées: 

- deux fois 

- par deux manipulateurs différents 

Elles sont variées : 

- technique en plaque 

- technique en tube à hémolyse 

- technique en microplaque (technique manuelle ou automatisée 

- technique en gel (technique manuelle ou automatisée) 

Technique en plaque : technique classique manuelle 

Epreuve globulaire directe de Beth Vincent 

Sur une plaque : 

- déposer dans l’ordre : - une goutte de sérum test anti-A 

- une goutte de sérum test anti-B 

- une goutte de sérum test anti-AB 

- ajouter à côté de chaque goutte de sérum test, une goutte de culot d’hématies à tester (une petite 

goutte ou des hématies diluées) 

- mélanger soigneusement les deux gouttes puis animer la plaque d’un mouvement rotatoire lent 

- observer au bout d’une minute et rechercher s’il y a ou non agglutination 

NB : il est important qu’il n’y ait pas trop d’hématies risquant d’empêcher l’observation correcte des 

agglutinations. 

Epreuve sérique indirecte de Simonin 

Sur une plaque : 

- déposer dans l’ordre : - une goutte de suspension d’hématies-tests A 

- une goutte de suspension d’hématies-tests B 

- ajouter à côté de chaque goutte deux gouttes de culot du sérum à tester (une petite goutte ou des 

hématies diluées) 

- mélanger soigneusement les deux gouttes puis animer la plaque d’un mouvement rotatoire lent 

- observer au bout d’une minute et rechercher s’il y a ou non agglutination 


Les différents groupes sanguins 

Epreuves de Beth Vincent et de Simonin 


Les témoins 

Les épreuves de Simonin et de Beth Vincent doivent être obligatoirement validées par des témoins : 

Témoin «AB» : mélanger une goutte de sérum AB et une goutte de culot d’hématies à tester. 

Ce témoin ne doit pas présenter d’agglutination. Il permet de s’assurer que les hématies testées ne sont 

pas agglutinées par des anticorps sériques autres que les Ac anti-A ou anti-B. La présence 

d’agglutination signifie une poly agglutinabilité 

Le témoin AB permet de contrôler l’épreuve de Beth Vincent. 

Témoin « allo » : mélanger une goutte de sérum à tester et une goutte de culot d’hématies tests O. 

Ce témoin ne doit pas présenter d’agglutination. Il permet de s’assurer qu’il n’y a pas dans le sérum à 

tester, d’Ac susceptibles de réagir avec des structures érythrocytaires autres que les Ag A et B. 

La présence d’agglutination attesterait de la présence d’allo Ac en dehors du système ABO. 

Le témoin allo permet donc de contrôler l’épreuve de Simonin. 

Témoin « auto » : mélanger une goutte de sérum à tester et une goutte de culot d’hématies à tester 

Ce témoin, réalisé à partir des hématies et du sérum du sujet ne doit pas présenter d’agglutination. Il 

permet de s’assurer que dans le sérum du sujet, il n’y a pas d’auto-anticorps dirigés contre des structures 

de membrane des hématies et que les hématies ne sont pas auto-agglutinables. 

Il permet donc le contrôle des agglutinations observées dans les deux épreuves. 

Quelques causes d’erreurs 

o Erreurs de manipulation : - erreurs d’étiquetage des échantillons 

- existence d’homonymes 

- technicité défaillante 

o Erreurs sérologiques : 

- agglutination faible ou incomplète 

- double population d’hématies (après une transfusion hétérogroupe ou incompatible) 

- altérations des érythrocytes : on observe une positivité dans tous les tests sériques. 

a) le Phénotypage Rhésus 

Principe 

C’est la recherche à la surface des hématies testées des allo Ag courants du système Rhésus, l’Ag D, l’Ag 

C, l’Ag E, l’Ag c et l’Ag e, en mettant en contact ces hématies avec des Ac spécifiques connus : 

- anti-D 

- anti-C 

- anti-c 

- anti-E 

- anti-e 

Réactifs nécessaires 

- sérum-test anti-D d’origine humaine ou monoclonale 

- sérum-test anti-E d’origine humaine ou monoclonale 

- sérum-test anti-e d’origine humaine ou monoclonale 

- sérum-test anti-C d’origine humaine ou monoclonale 

- sérum-test anti-c d’origine humaine ou monoclonale 


Technique sur plaque chauffée à 40°C 

o Mode opératoire 

- prélever dans un mélange constitué du même volume de culot globulaire et de plasma 

- délimiter sur la plaque chauffante d’un microscope, huit espaces séparés les uns des autres de 2 

à 3 cm 

- au niveau de chaque espace, réaliser rapidement les dépôts comme indiqués ci-dessous 

1goutte de 

sang à 

tester 

Technique du phénotypage Rhésus 

1 2 3 4 5 6 7 8 

+ 

1goutte de 

sérum 

témoin 

albumineux 

1goutte 

hématies 

O 

Rhésus+ 

+ 

1goutte 

de sérum 

test 

anti-D 

1goutte 

hématies 

O rhésus 

– 

+ 

1goutte 


test 

anti-D 

1goutte 

de sang à 

tester 

+ 

1 goutte 


test 

anti-D 

- mélanger sans délai, à laide d’un agitateur bien propre 

- agiter en inclinant doucement la plaque sur le rhésuscope par des mouvements lents de 

balancier, pendant 1 à 3 secondes 

- observer tout d’abord les témoins (dépôts 1, 2 et 3). Si les résultats attendus sont observés, 

lire alors les essais et conclure. 

o Résultats attendus pour les témoins 

1goutte 


tester 

+ 

1 goutte 


test 

anti-C 

1goutte 


tester 

+ 

1 goutte 


test 

anti-c 

1goutte 


tester 

+ 

1 goutte 


test 

anti-E 

1 : témoin réactif 2 : témoin positif 3 : témoin négatif 

Il ne doit pas présenter 

d’agglutination. Une image 

d’agglutination peut être 

due : 

- à une auto-agglutination des 

hématies testées en raison 

d’une altération membranaire 

ou de la présence d’auto-Ac 

dans le sérum 

- à une formation de rouleaux 

d’hématies dus à la BSA et 

pouvant être confondus avec 

des agglutinants 

Il doit présenter une 

agglutination. Il permet de 

tester l’efficacité du sérum 

anti-D en milieu albumineux 

en s’assurant que dans ces 

conditions, les Ac anti-D 

agglutinent bien les hématies 

porteuses d’Ag D. 

1goutte 


tester 

+ 

1 goutte 


test 

anti-e 

Il ne doit pas présenter 

d’agglutination. Il permet de 

vérifier : 

- la spécificité des Ac anti-D 

en vérifiant qu’ils ne donnent 

pas de réactions croisées 

avec d’autres Ag 

- la non formation de 

rouleaux d’hématies par le 

sérum anti-D. 


o Lecture des essais 

- présence d’agglutination : les hématies du sang testé portent à leur surface l’Ag spécifique des 

Ac utilisées 

- absence d’agglutination : les hématies du sang testé ne portent pas à leur surface l’Ag spécifique 

des Ac utilisés. 

NB : En laboratoire, il est usuel de réaliser simultanément le groupage ABO et le 

phénotypage Rhésus 

a) Recherche de l’Ag D faible (par le test de Coombs indirect) 

Principe 

Il consiste à vérifier si les hématies possèdent l’Ag D faible (lorsqu’elles se sont avérées sans Ag D avec le 

test précédent), en utilisant des Ac anti-D lors d’une réaction d’agglutination active indirecte (artificielle) 

utilisant comme artifice des antiglobulines. 

L’antigène D faible se recherche d’abord par 1 préchauffage des hématies à l’aide d’un rhésuscope afin de 

mieux mettre à nu les épitopes de l’antigène. 

Réactifs nécessaires 

- sérum test anti-D 

- hématies O Rhésus standard + 

- hématies O Rhésus standard – 

- sérum antiglobuline humaine 

- sérum albumineux sans Ac anti-D 

Technique 

* dans un tube à hémolyse, mettre 1ml de sang à tester 

* laver les érythrocytes à tester en sérum physiologique et préparer, à partir de ces érythrocytes, une 

suspension à 5% dans du sérum physiologique 

* prendre 4 tubes à hémolyse et introduire dans les tubes 2, 3, et 4 : 100 µL de sérum anti D et dans 

le tube 1 : 100 µL de sérum albumineux témoin sans anti-D 

* ajouter : - en 1 : 50 µL d’érythrocytes à examiner 

- en 2 : 50 µL d’érythrocytes O Rh standard + 

- en 3 : 50 µL d’érythrocytes O Rh standard - 

- en 4 : 50 µL d’érythrocytes à examiner 

* incuber les 4 tubes au bain marie pendant 45mn 

* laver 3 fois la pastille globulaire en eau physiologique de la façon suivante : 

- remettre les hématies en suspension dans l’eau physiologique, centrifuger 1 mn à 750 g 

- la même opération est répétée 3 fois 

- après le dernier lavage, la totalité du surnageant doit être bien éliminée 

* ajouter 100 µL de sérum antiglobuline 

* agiter doucement pour remettre les érythrocytes en suspension 

* centrifuger 1 mn à 400 g 

* faire la lecture après agitation douce 


Interprétation des résultats 

o Premier cas 

L’agglutination n’est observée que dans le tube 2 : cela signifie que les érythrocytes testés ne possèdent 

pas d’Ag D faible. Le sujet est donc Rh standard – 

o Deuxième cas 

L’agglutination n’est observée que dans les tubes 2 et 4 : cela signifie que les érythrocytes testés possèdent 

l’Ag D faible. Le sujet est donc D faible. 

o Troisième cas 

Les tubes 1, 2 et 4 présentent une agglutination : 

- l’agglutination du tube 2 est normale 

- l’agglutination dans le tube 1 témoigne de la présence d’auto-Ac sur les érythrocytes ou de formation 

de rouleaux en présence de BSA. Le résultat positif dans le tube 4 ne peut être validé. 

o Quatrième cas 

Aucune agglutination n’est observée dans le tube 2 (ni dans aucun des 3 autres tubes), il s’agit d’une erreur 

ou de mauvais réactifs notamment le sérum anti D. il faut donc recommencer. 

b) Phénotypage étendu 

Il consiste à rechercher un ou plusieurs antigènes érythrocytaires autres que ceux qui sont définis par le 

groupage ABO-D et le phénotypage Rhésus. 

Pour un système donné, la recherche de chaque antigène est basée sur l’utilisation de l’anticorps monoclonal 

spécifique et du témoin adéquat. 

Le contrôle de qualité interne doit utiliser deux échantillons de contrôle de phénotypes garantis, l’un étant 

négatif, et l’autre d’expression « hétérozygote ». 

Principe 

c) Test de Coombs direct 

Le test direct à l’antiglobuline ou test de Coombs direct permet la mise en évidence de la sensibilisation in 

vivo des hématies humaines par des anticorps de nature Ig G et/ou des fractions du complément. Ce test 

doit être réalisé sur un échantillon de préférence anti coagulé. 

Il repose sur l’utilisation d’antiglobuline humaine polyspécifique ou monospécifique. 

Le contrôle de qualité utilise des hématies préalablement sensibilisées par une antiglobuline in vitro par des 

Ig G et éventuellement du complément. 

Technique 

- Laver les hématies à tester 3 fois 

- Diluer les hématies lavées à 5% 

- Mettre dans un tube à hémolyse 1 goutte de la dilution 

- Ajouter une goutte d’antiglobuline 

- Centrifuger 1 mn à 1000 tr/mn 


- Lecture : - si présence d’agglutination : CD Positif 

- si absence d’agglutination: CD Négatif 

Principe 

d) Test de Coombs indirect 

Ce test met en présence le sérum à tester dans lequel on recherche des anticorps libres, avec des hématies 

comportant des sites antigéniques spécifiques de ces anticorps. Le test est positif lorsqu’il existe une 

agglutination des hématies en présence d’une antiglobuline. 

Technique 

- Faire un panel O+ 

- Diluer le pannel à 5% 

- Mettre dans un tube à hémolyse 1goutte de la dilution 

- Ajouter 3 gouttes de sérum à tester 

- Incuber 45 mn au bain marie préchauffé à 37°C 

- Après incubation lire une première fois 

- S’il n’y a pas d’agglutination faire 3 lavages à l’eau physiologique 

- Bien égoutter l’eau du troisième lavage 

- Ajouter une goutte d’antiglobuline 

- Centrifuger une minute à 1000 tr/mn 

- Remettre doucement les hématies en suspension, 

- Agiter et incliner pour déceler la présence d’agglutination ou observer au microscope x 40 (entre 

lame et lamelle) 

Lecture 

- Si présence d’agglutination : CI + = Présence d’anticorps dans le sérum 

- Si agglutination absente : CI - = Absence d’anticorps dans le sérum 

e) Recherche des agglutinines irrégulières (RAI) 

Principe de la recherche de l’agglutination par le test de Coombs indirect 

On recherche dans un sérum des Ac irréguliers en incubant le sérum en présence d’hématies porteuses des 

Ag spécifiques. Les anticorps, s’ils sont présents, s’unissent aux Ag : on obtient des hématies sensibilisées, 

mais souvent sans provoquer une agglutination, en raison : 

- des forces de répulsion électrostatiques importantes entre hématies voisines 

- du caractère masqué, peu accessible de certains antigènes 

Provoquer l’agglutination en réalisant un pontage spécifique entre Ac unis à des hématies voisines grâce à 

des antiglobulines spécifiques des épitopes des Ig humaines. 

Il s’agit donc d’une réaction d’agglutination active indirecte. 


NB : D’autres tests peuvent être utilisés, il s’agit de : 

- la recherche de l’agglutination par le test aux enzymes 

- la recherche de l’agglutination en milieu salin (ne détecte que les Ac irréguliers complets) 

Technique en tubes à usage unique 

Le sang examiné doit être, de préférence, prélevé sur tube sec, les agglutinines sont alors recherchées sur 

le sérum. 

- réaliser un pannel O+ 

- laver les hématies 3 fois à l’eau physiologique (le surnageant du dernier lavage doit être complètement 

éliminé) 

- remettre les hématies en suspension dans l’eau physiologique (dilution à 3%) 

- Prendre 3 tubes à hémolyse, déposer dans chaque tube, 1goutte de la dilution et 3 gouttes de 

sérum à tester 

- Incuber le tube 1 à 37°, le tube 2 à 25° (température ambiante) et le tube 3 à 4° pendant 45 mn 

- Faire une première lecture en agitant le tube tout doucement 

- Si le test est négatif, faire trois lavages à l’eau physiologique (le surnageant du dernier lavage doit 

être complètement éliminé) 

- Dans chaque tube mettre une goutte d’antiglobuline 

- Centrifuger 1 mn à 1000 tours/mn 

Lecture 

- S’il y a présence d’agglutination dans l’un des 3 tubes la RAI est positive et il faut spécifier la 

température 

- S’il n’y a pas d’agglutination, la RAI est négative 

NB : les échantillons positifs doivent faire l’objet d’une seconde étape d’identification qui utilise au 

moins 10 hématies tests de groupe O qui doivent porter séparément différents antigènes (les différents 

Ag du système rhésus, Ag Kell, Kidd, Duffy, MNS, Lewis, Lutheran…) 

Le contrôle de qualité interne utilise des échantillons de contrôle comportant des anticorps de spécificité et 

de titre connus et sur des hématies comportant l’antigène correspondant d’expression « hétérozygote ». 

h) Test de compatibilité au laboratoire entre poche de sang et receveur 

C’est une analyse qui consiste à tester l’échantillon de sérum ou de plasma du receveur vis-à-vis des 

hématies de la tubulure du produit sanguin à transfuser. 

Ce test comporte la sélection des unités de sang à transfuser en respectant les bonnes règles de distribution, 

puis à préparer des hématies de la tubulure afin qu’elles puissent être testées dans les mêmes conditions 

techniques que la RAI, et enfin à l’exécution technique du test qui est identique à celle utilisée par la RAI. 

Le contrôle de qualité interne doit utiliser des échantillons identiques à ceux utilisés pour la RAI. 


3.3. PARASITOLOGIE 

3.3.1. Examen parasitologique des selles : 


Emettre au laboratoire la totalité des selles dans un récipient adapté à l’usage, étanche et résistant. Les 

techniques d’analyse demandent un minimum de matières fécales et certains éléments parasitaires sont 

faiblement représentés dans les selles. 

Lorsque l’émission au laboratoire est impossible, l’acheminement de l’échantillon doit être immédiat. 

b) Examen macroscopique : 

Il renseigne sur l’état de la selle (diarrhée / constipation), sur la présence d’anneaux de taenia, d’adultes 

d’helminthes. 

c) Examen microscopique à frais : 

Il est fait à partir d’un frottis de selles étalées dans une goutte d’eau. La totalité de la préparation doit être 

examinée au grossissement 10 puis au 40. 

Il permet de mettre en évidence : des flagellés ou des amibes mobiles, des kystes, des œufs et larves 

d’Helminthes intestinaux. 

d) Examen microscopique après coloration 

La coloration de lugol ou du M.I.F précisent certains éléments morphologiques des protozoaires intestinaux. 

* Coloration au lugol (solution iodo iodurée à 1%) 

- déposer une goutte de selles liquides (ou rendues liquides avec de l’eau physiologique) ; 

- ajouter une goutte de lugol sur la préparation et mélanger avant de recouvrir d’une lamelle. 

Le lugol colore en jaune les kystes et en brun foncé les vacuoles intra cytoplasmiques. 

Le noyau, les cristalloïdes et la membrane cytoplasmique apparaissent par réfringence. 

Le lugol détruit les formes végétatives de trichomonas intestinalis 

* Coloration au MIF (Mercurothiolate-Iodo-Formol) 

- Le mélange MIF est préparé au moment de l’emploi de la manière suivante : dans un tube à hémolyse, 

mettre 0,15 ml de solution iodo iodurée à 5% puis 2,35 ml de solution mère MF et mélanger par 

retournement du tube 

- Ajouter au mélange ainsi réalisé une parcelle de selles, homogénéiser à l’aide d’un agitateur. - Laisser 

sédimenter 30 min puis recueillir avec une pipette Pasteur, la partie supérieure du culot où sont rassemblés 

les parasites. 

Le MIF colore en rouge le cytoplasme, la membrane nucléaire et le caryosome des protozoaires. La 

chromatine non colorée apparaît par réfringence. Les kystes murs apparaissent en blanc sur fond rosé de 

la préparation. 

e) Examen microscopique après la concentration de Ritchie modifié : 

Diluer une noix de selles dans de l’eau formolée à 10%. Après avoir tamisé, transvaser 9 ml dans un tube 

conique et ajouter 3 ml d’éther. Agiter et centrifuger 1 mn à 1000 tours/ mn. Rejeter le surnageant, prélever 

et examiner le culot. 


3.3.2. Recherche des Plasmodies 


Le sang est recueilli au bout du doigt ou au niveau du talon s’il s’agit d’un bébé après piqûre à l’aide d’un 

vaccinostyle. 

b) Confection : 

/ Frottis : 

Placer à une extrémité d’une lame une petite goutte de sang. Sans attendre que le sang sèche, appliquer sur 

la lame à côté de la goutte, entre elle et le centre de la lame, l’arête d’une lame rodée. Former environ 

45°du côté de la goutte. Reculer la lame jusqu’à ce qu’elle touche la goutte. Par capillarité, celle-ci s’étale 

le long du dièdre. Par un mouvement uniforme, sans excessive rapidité, faire parcourir au dièdre la surface 

de la lame. Ne pas quitter le contact de la lame avant la fin de l’étalement. Agiter la lame pour obtenir un 

séchage rapide. Colorer. 

/ Goutte épaisse : 

Placer au centre de la lame une goutte de sang. Défibriner le sang en tournant à l’aide du coin d’une autre 

lame ou d’un vaccinostyle et étendre la surface de la goutte en raclant la surface de la lame (1-2 mn). 

Laisser sécher 2 h au minimum (étuve à 37°) à l’abri de la poussière et des mouches. Déshémoglobiniser 

avec quelques gouttes d’eau jusqu’à lyse totale des hématies. Egoutter, sécher, colorer. 

c) Coloration : 

/ Frottis : 

- Fixer le frottis avec du méthanol pendant quelques secondes en le trempant dans une cuve qui en contient. 

- Préparer une solution de Giemsa à 10% (1ml de solution mère dans 9 ml d’eau de robinet). 

- Recouvrir toute la lame de cette solution et laisser colorer pendant 15minutes. 

- Chasser délicatement le colorant de la lame en ajoutant de l’eau propre goutte à goutte. Faire sécher à 

l’air libre et examiner au microscope 

/ Goutte épaisse : 

La coloration se fait comme pour le frottis, exception faite de l’étape de la fixation. 

d) Lecture : 

Elle se fait à l’objectif à immersion (x 100). La numération des Plasmodiums (parasitémie) est faite sur la 

goutte épaisse. Le nombre de parasites par microlitre de sang est établi par rapport au nombre de leucocytes, 

fixé à 8000 par microlitre. 

3.3.3. Recherche des oeufs de bilharzies dans les urines : 


Recueillir soit les urines de fin de miction entre 10 et 14 h après un effort modéré soit celles de 24 heures. 

Après homogénéisation, centrifuger 10 ml d’urines à 3000 tours /mn pendant 5 minutes. 

b) Examen : 

Il est fait sur le culot de centrifugation des urines. 

Parcourir toute la préparation à l’objectif x 10 


3.3.4. Recherche des microfilaires dans le sang 


Prélever 5 ml de sang par ponction veineuse. Le sang est recueilli sur anticoagulant, de préférence le 

citrate de sodium à 3,8% à raison de 0,4 ml pour 1,6ml de sang ou à défaut l’EDTA. 

Remarques : 

- Les autres anticoagulants sont déconseillés car l’héparine provoque une agglutination des microfilaires ; 

le fluorure de sodium et l’oxalate de sodium tuent les microfilaires. 

- Pour la recherche des microfilaires diurnes (Loa loa) le prélèvement doit être effectué de préférence 

entre 12 et 14 heures ; pour celles des microfilaires nocturnes (Wuchereria bancrofti), l’heure propice 

est entre 22 heures et minuit .Cependant, l’utilisation d’une technique de concentration permet d’effectuer 

tous les prélèvements pendant la journée. 

b) Frottis sanguins colorés au Giemsa 

Même procédure que pour la recherche des plasmodies mais le temps de coloration doit être de 25 

minutes. 

c) Gouttes épaisses colorées au Giemsa 

Déshémoglobiniser avec quelques gouttes d’eau jusqu’à lyse totale des hématies. Egoutter, sécher, fixer 

au méthanol puis colorer avec une solution à 10%de Giemsa pendant 25 minutes. Rejeter le colorant. 

Laver sous un fin filet d’eau de robinet ; sécher à l’air libre. 

d) la technique de leucoconcentration à la saponine 

Dans un tube à centrifuger cônique 

- Mettre 5 ml de sang citraté 

- Ajouter 10 ml de sérum physiologique 

- Mélanger par retournement du tube 

- Ajouter quelques gouttes de saponine à 2% jusqu’à l’obtention d’un sang rouge laqué 

- Retourner le tube plusieurs fois et s’assurer que l’hémolyse est complète (le liquide au niveau du 

cône doit être limpide) 

- Laisser reposer 5 minutes 

- Centrifuger à 1500 tours/mn pendant 10 minutes 

- Rejeter le surnageant 

- Recueillir à l’aide d’une pipette Pasteur le culot qui renferme les leucocytes et les parasites vivants 

- Examiner le culot entre lame et lamelle et après coloration au Giemsa 

e) Examen microscopique 

Les frottis , gouttes épaisses et culot de leucoconcentration colorés au Giemsa doivent d’abord être 

observés à l’objectif x 10 ou x 40 pour la recherche des microfilaires . L’identification des 

espèces de microfilaires se fait à l’objectif 100 sous huile à immersion. 

3.3.5. Assurance qualité et système de référence : 

Deux personnes effectuent les lectures microscopiques. Il doit y avoir corrélation des résultats. 

Voir ci-après les photos et tailles des parasites humains. 


I. Dans les selles : 

Larves d’Anguillules : 

Œufs d’Ascaris : 


Œufs de Trichuris trichiura (trichocéphale 

Œufs d’oxyures au scotch test anal : 


Œufs d’Ankylostomes : 

Hyménolépis nana : anneaux et œufs 

Anneaux Œufs 


Oocystes de cryptospridium après coloration de Ziehl Nielsen : 

Œufs de Fasciola Hepatica 

Amibe Entamoeba histolytica histolytica 


Forme végétative et kyste de Giardia intestinalis 

Trophozoite (forme végétative) Kyste 

Anneaux et œufs de tænia : 

Anneaux de Tænia saginata Œufs de tænia 

Schistosoma mansoni : 

Œufs : éperon latéral 


II. Dans le sang : 

Plasmodium : 

Trypanosomes : 


Filaires : 

Microfilaires de Loa Loa 


III. Dans les urines : 

Filaire de Médine : Dracunculose 

Schistosoma haematobium : 

Œufs : éperon terminal Accouplement de schistosomes 


3.4. BACTERIOLOGIE 

3.4.1. Urines : 


Conditions : 

. De préférence, recueillir les urines du matin avant toute miction ; à défaut, on peut prélever les urines 

à tout moment, après une rétention d’au moins 2 heures. 

. Chez le malade sous sonde, éviter de prélever directement dans la poche : clamper la tubulure et 

ponctionner en amont du clampage après nettoyage soigneux. 

. Prélever idéalement avant toute antibiothérapie 

. Respecter une asepsie rigoureuse 

Technique 

. Chez l’adulte et grand enfant : 

Au cours d’une miction physiologique, il faut nettoyer le méat urinaire, rejeter les premières gouttes d’urines 

et recueillir les urines en milieu de jet dans un pot stérile. 

. Chez le Nourrisson et le petit enfant : 

Appliquer une poche adhésive stérile autour des organes génitaux externes et la changer toutes les 30 

minutes en l’absence de miction. 

. En cas de rétention aigue d’urines, le recueil des urines se fait par sondage vésical ou par ponction 

sus pubienne 

Transport 

Procéder à un envoi immédiat de l’échantillon au laboratoire avec une fiche de renseignements bien remplie. 

Les urines peuvent aussi être conservées à +4°C pendant 2 heures. 

b) Examen macroscopique : 

Il permet d’apprécier à l’œil nu l’aspect des urines : claires, troubles, purulentes, hématiques. 

c) Examen microscopique : 

♦ L’examen à l’état frais est effectué sur les urines totales et permet une appréciation quantitative ou 

semi quantitative des leucocytes, des hématies, des cellules épithéliales (en nombre / champ ou en croix). 

Cet examen permet également de vérifier la présence de cristaux, de levures, de parasites (Trichomonas 

vaginalis, œufs de bilharzies), et de préciser la morphologie et la mobilité des bactéries. 

♦ La coloration de Gram est effectuée sur un frottis réalisé à partir du culot de centrifugation. Elle 

apporte des informations supplémentaires sur les caractères morphologiques des bactéries. Elle permet de 

mieux apprécier la flore bactérienne. 

d) Culture : Dénombrement des germes urinaires 

Elle se fait sur des milieux permettant un dénombrement des germes urinaires pour déterminer le seuil 

d’infection. 

Il existe plusieurs méthodes dont celle de la lame gélosée qui consiste à immerger la lame de DGU dans les 

urines et à la mettre en incubation à 37°C pendant 24 heures. La lecture consistera à comparer la densité 

des colonies bactériennes obtenue avec les modèles fournis dans le kit. Une infection du tractus urinaire est 

retenue lorsque le DGU donne un résultat supérieur ou égal à 10 5 bactéries / ml avec une culture en souche 

pure et la présence de leucocyturie. Des méthodes alternatives peuvent être utilisées en l’absence de lames 

gélosées. 


e) Identification 

A partir des colonies isolées, une galerie d’identification est ensemencée pour étudier les caractères 

biochimiques. L’identification est parfois complétée par des tests immunologiques avec des sérums 

agglutinants. 

f) Antibiogramme 

Les antibiotiques sont choisis en fonction de l’espèce identifiée. Les antibiotiques éliminés sous forme 

active par voie urinaire sont toujours inclus dans la liste. 

3.4.2. Pus et liquides d’épanchement : 

a) Introduction 

Le but est de détecter l’agent étiologique d’un épanchement. 

Il existe différents types de foyers infectieux suppurés : 

. foyers superficiels : plaies chirurgicales, médicales ou traumatiques, escarres, brûlures etc. 

. foyers profonds : abcès : collection de pus dans une cavité 

exemples : furoncles, anthrax, abcès des viscères 

phlegmons : inflammation localisée non collectée (prélèvement souvent impossible) 

adénites 

. foyers des séreuses : pleurésie : purulente, séro-fibrineuse 

péritonite purulente, ascite 

péricardite : purulente, séreuse 

synovite : purulente, séreuse 

b) Prélèvements 

* Indications : 

- on ne prélève que les collections fermées 

- ne pas prélever les pus de plaies ouvertes car inexploitables 

* Techniques 

- nettoyer la peau avec de l’alcool iodé 

- soit on prélève le pus avec une seringue 

- soit on incise la collection avec un bistouri et on prélève le pus avec une pipette Pasteur ou un 

écouvillon 

* Transport – conservation 

- transporter immédiatement le pus au laboratoire, 

- utiliser des milieux de transport / conservation si nécessaire (grande distance) 

- transporter le pus à l’abri de l’oxygène (si germes anaérobies à rechercher) 

c) Technologie au Laboratoire 

/ Examen macroscopique 

- noter la consistance du pus 

. purulent 

. séreux ou citrin : exsudat, transsudat 

- noter la couleur du pus 

. bleue : faisant penser au bacille pyocyanique 

. chocolat : faisant penser au pneumocoque 

- noter l’odeur : très fétide (évoquant les anaérobies) 



- Coloration de May Grunwald Giemsa : oriente vers une infection bactérienne ou virale 

. polynucléaires altérés : bactéries pyogènes 

. lymphocytes : virus, BK 

. absence de cellules : exsudat, transsudat 

- Coloration de Gram : oriente le choix des milieux à ensemencer 

. qualité de la flore : monomicrobienne ou polymicrobienne 

. quantité de la flore : abondance de germes 

/ Culture : 

- milieux 

. géloses au sang frais ou sang cuit 

. bouillon thioglycolate, ou bouillon cœur-cervelle 

- technique : méthode des quadrants 

- recherches particulières 

. anaérobies : milieu de Rosenow, milieu de Schaedler 

. gélose de Löwenstein-Jensen pour la culture des BK 

/ Résultats et interprétation 

- flore monomicrobienne : c’est l’idéal 

- flore polymicrobienne 

. peut se voir en cas de pleurésie ou de péritonite 

. il s’agit d’une association de germes anaérobies et de germes aérobies 

Caractéristiques des liquides pleuraux 

Composition 

Aspect macroscopique du liquide 

du liquide Clair Clair Louche Purulent Hématique 

Cellules/mm3 < 500 > 500 > 500 > 2000 - 

Lymphocytes + +++ ± Rares + 

Neutrophiles + Rares +++ +++++ + 

Germes 0 0 0 +++ + ou 0 

Culture - BK + + ± ; BK 

Protéine g/l < 20 > 20 > 20 > 50 > 20 

Interprétation Transsudat Exsudat Exsudat Exsudat Exsudat 

(tuberculose) Pleurésie Abcès 

Caractéristiques des liquides articulaires 

Liquide Normal Septique Tuberculose inflammation 

Aspect Clair Trouble Trouble ± trouble 

Coagulation 

spontanée 

Non Oui Oui Oui 

Leucocytes/mm3


- séreux, purulent 

- crémeux, fluide 

- épais, «grains» 

- fétides 

- fluidifier 

- homogénéiser 

Culture 

- milieux classiques 

- milieux spéciaux 

Cytologie 

- ç pharyngées 

- ç bronchiques 

- ç alvéolaires 

- leucocytes 

Produit pathologique 

Collections fermées 

Coloration de Gram 

Ne pas cultiver 

Plaies 


Coloration de Ziehl-Neelsen 

Examen cytobactériologique des pus et liquides d’épanchement 


3.4.3. Sécrétions broncho-pulmonaires : 


Le but de l’étude est de «rechercher l’agent étiologique d’une infection à germes banals des voies 

respiratoires inférieures» 

c) Indications 

Infections respiratoires inférieures 

d) Prélèvements 

* Techniques 

/ Expectorations 

. matin au réveil, après toilette bucco-dentaire 

. prélèvement physiologique : après une toux 

/ Sécrétions prélevées avec des instruments 

. aspiration trans-trachéale 

. aspiration bronchique 

. brossage bronchique 

. lavage broncho-alvéolaire (LBA) 

* Transport - conservation 

/ Transport immédiat au laboratoire (< 30mn) 

/ Ne pas conserver 

* Prélèvements complémentaires 

/ Hémoculture 

/ Sérum sanguin : recherche d’antigènes solubles 

e) Technologie au Laboratoire 

- Examen macroscopique : 

/ expectorations muqueuses, muco-purulentes, purulentes, hémoptoïques etc. 

/ aspects des liquides d’aspiration 

/ fluidifier, homogénéiser 

- Examen microscopique : 

/ fluidifier, homogénéiser 

/ cytologie : coloration de May Grunwald Giemsa 

. cellules pharyngées < 25/champ (si > 25/champ : rejeter l’échantillon) 

. leucocytes : > 25/champ : échantillon bon 

: < 25 + flore monomorphe : échantillon bon 

: < 25 + flore polymorphe : rejeter l’échantillon 

. autres cellules : bronchiques, alvéolaires 

/ Bactériologie : coloration de Gram 

. flore monomorphe + PN > 25/ champ : cultiver 

. prédominance d’un germe + PN > 25/champ : cultiver 

. autres situations : ne pas cultiver 


- Culture : 

/ milieux 

. ensemencer toujours : GSO et GSC + Facteurs de croissance 

. autres milieux : en fonction du Gram 

/ technique 

. diluer les prélèvements au 1/1000 

. appliquer méthode des quadrants 

- Résultats : 

/ Devant des bactéries pathogènes spécifiques 

- bronchopathies 

. S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus 

. B. catarrhalis, N. mucosa, 

. Bacille pyocyanique, entérobactéries 

- pneumopathies 

. pneumonie : S. pneumoniae 

. abcès : K. pneumoniae, S. aureus, anaérobies 

. pneumopathies atypiques : M. pneumoniae, 

Chlamydia, Legionella pneumophila … 

/ Interprétation nécessaire 

- expectorations et aspirations non protégées 

. seuil : 10 7 bactéries / ml de prélèvement 

. bactérie commensale : 10 5 bactéries/ml 

. signification douteuse : 10 6 bactéries/ml 

. Cytologie > 25 leucocytes/ml de prélèvement 

- aspirations bronchiques protégées, trans-trachéales 

. seuil : 10 3 bactéries / ml de prélèvement 

. présence de cellules bronchiques et pulmonaires 

3.4.4. Sécrétions ORL : 


* Composition de la sphère ORL 

- bouche, nez, sinus 

- oreille 

- pharynx ou gorge 

* Intérêt de la question : Rechercher des agents étiologiques des angines et des otites moyennes aiguës 

(OMA) non fistulisées. 

b) Prélèvement du pharynx = prélèvement de gorge 

* Indications du prélèvement de gorge 

- tout épisode d’angine 

- angines à répétition chez un enfant 

- recherche de porteur sain de bactéries pathogènes spécifiques (BPS) 


* Prélèvement 

/Technique 

- matériel : écouvillon stérile ; abaisse-langue 

- noter l’aspect anatomo-clinique de l’angine 

- technique : frotter 2 écouvillons sur les amygdales, la muqueuse du pharynx, 

sous les fausses membranes 

/ Transport – conservation 

- transport immédiat, sans délai (risque de dessèchement) 

- milieux de transport-conservation disponibles 

- humidifier les prélèvements si culture retardée 

* Technologie au Laboratoire 

/ Examen microscopique 

- coloration de Gram 

. apprécier qualité/quantité de la flore 

. chercher à isoler le germe prédominant 

- coloration au bleu de méthylène 

. pour apprécier la présence de levures, la cytologie etc. 

/ Culture 

- milieux 

. géloses au sang frais + acide nalidixique 

. gélose au sang cuit + complexe vitaminique 

. bouillon d’enrichissement : streptosel, BGT 

. spéciaux : au sérum de bœuf coagulé ; Hoyle 


/ Recherches particulières 

- Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum 

- Candida albicans 

- virus : Herpes simplex virus 

/ Résultats 

- angines rouges ou érythémato-pultacées 

. S. pyogenes, S. pneumoniae , Streptocoque du groupe C , Streptocoque du 

groupe G 

. Staphylococcus aureus, H. influenzae 

. Candida albicans 

. virus = 50% 

- angines pseudomembraneuses 

. Corynebacterium diphteriae 

. Staphylococcus aureus 

. virus : EBV (mononucléose infectieuse) 

- angines ulcéro-nécrotiques 

. angine de Vincent : association de 2 germes 

. chancre syphilitique : Treponema pallidum 

- angines vésiculeuses : elles sont virales 


Types d’angines 

- érythémateuse 

- pseudomembraneuse 

- ulcéro-nécrotique 

Gélose sang frais 

Prélèvement de gorge 

Culture 

Gélose sang cuit + FC 

- Isolement 

- Identification 

- Antibiogramme 

Microscopie 

Bleu de 

méthylène 

Gram 

- qualité flore 

- quantité flore 

Gélose Sabouraud 

Technologie du prélèvement de gorge au Laboratoire de Bactériologie 


c) Prélèvement de pus d’oreille 

* Indications 

- otite moyenne aiguë +++ 

- otite interne + 

- furoncle du conduit auditif externe 

- ne pas prélever 

: plaie du conduit auditif externe 

: otite suppurée spontanément 

* Prélèvements 

/ Techniques 

- Otite externe : ponction de furoncle 

- OMA : faire une paracentèse (acte médical) 

: nettoyer le CAE (antisepsie) 

: poser un spéculum et inciser 

: aspirer le pus 

/ Transport – conservation 

- transport immédiat au laboratoire 

- milieux de transport-conservation 

* Technologie au Laboratoire 

/ Examen macroscopique 

- Sécrétions fluides, purulentes 

- Odeur : fétides (anaérobies) 

/ Examen microscopique 

- coloration de Gram : flore monomicrobienne 

- bleu de méthylène : levures, cytologie etc. 

/ Culture 

/ Résultats 

- milieux : GSO, GSC + complexe vitaminique 


- otite moyenne aiguë 

. S. pneumoniae, Streptococcus spp. 

. S. aureus, H. influenzae, Entérobactéries, bacille pyocyanique 

- otite externe (furoncle) : S. aureus 

d) Autres prélèvements : ORL et oculaire 

* Prélèvement de sinus 

- indications : sinusites aiguës ou chroniques 

- technique : ponction-lavage, écouvillonnage méat 

- examen macroscopique 

- examen microscopique : flore souvent mixte : aérobie-anaérobie 

parfois monomicrobienne 

- milieux de culture : dépendent de la flore 

- germes : S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, streptocoques, bactéries anaérobies … 


* Prélèvement buccal et nasal 

- Indications : lèpre, ozène, rhinosclérome, portage 

- Technique : écouvillonnage 

- Examen macroscopique ; 

- Examen microscopique : Gram, Ziehl-Neelsen 

- Milieux de culture : fonction du germe recherché 

- Germes : M. leprae, K. rhinoscleromatis, K. ozenae, BPS en portage … 

* Prélèvement oculaire 

- Indications : conjonctivites 

- Technique : écouvillonnage au niveau de l’angle interne, du cul de sac lacrymal, de la conjonctive 

palpébrale 

- Examen macroscopique 

- Examen microscopique après coloration de Gram 

- Milieux de culture : fonction du germe recherché 

- Germes : Chlamydia trachomatis, Moraxella, pneumocoque, gonocoque, Haemophilus, 

Staphylococcus aureus … 

3.4.5. Hémoculture 


Il s’agit de «rechercher un agent étiologique dans le sang lors d’une infection» 

Le sang est normalement stérile, et la présence de bactéries dans le sang peut signifier : 

. une bactériémie : décharges transitoires de bactéries dans le sang pouvant être physiologique 

(après les repas) ou pathologique (à partir d’un foyer infectieux), 

. une septicémie : décharges répétées de bactéries dans le sang avec fièvre très élevée. Les 

causes fréquentes sont : l’endocardite, la thrombophlébite, la fièvre typhoïde. 

Les indications de l’Hémoculture sont : 

- toute fièvre inexpliquée chez un cardiaque, une femme enceinte, un immunodéprimé 

- tableau de septicémie 

- hypothermie 

b) Prélèvement : 

* Techniques : 

- moment du prélèvement : quand prélever ? 

. quand ? : avant toute antibiothérapie, au moment des pics fébriles, loin des repas 

. rythme : faire une hémoculture toutes les 6H 

- techniques : comment et où prélever ? 

. où : tout territoire veineux disponible 

. comment (technique) : badigeonner la peau à l’alcool 

poser un garrot 

ponctionner la veine avec une seringue stérile 

recueillir 10 ml de sang chez l’adulte, 5 ml chez l’enfant et 

1 ml chez le nouveau-né. 


- culture du sang : hémoculture 

. milieux de culture : bouillon cœur cervelle (BCC), bouillon trypticase soja (BTS) etc. 

. technique de culture. 

: nettoyer le capuchon du ballon d’hémoculture avec de l’alcool iodé 

: disposer d’une flamme : bec bunsen notamment. 

: injecter le sang dans le ballon sans l’ouvrir au travers du capuchon et cela le plus près 

possible de la flamme 

: étiqueter le ballon en précisant l’heure et la date de prélèvement, puis l’acheminer au 

laboratoire accompagné d’un bulletin d’analyse correctement rempli. 

* Transport-conservation 

- transport immédiat au laboratoire 

- conservation = incubation à +37°C 

b) Technologie au Laboratoire 

* Incubation et surveillance 

- incubation en atmosphère aérobie à + 37°C 

- examiner les ballons tous les jours 

* Traitement d’une hémoculture positive 

- le ballon devient trouble en 2-3 jours 

- faire un examen à l’état frais et après une coloration de Gram 

- repiquer systématiquement sur gélose au sang et gélose MH 

- ensemencer une galerie d’identification 

- réaliser un antibiogramme 

* Traitement d’une hémoculture négative 

- garder les ballons non suspects pendant 7 à 10 jours 

- repiquer systématiquement sur gélose au sang 

- si culture négative, rendre les résultats 

* Recherches particulières 

- médulloculture 

. fièvre typhoïde, brucellose 

. tuberculose miliaire 

- borréliose, leptospirose : milieux spéciaux 

c) Interprétation des résultats 

* Hémoculture positive 

- le diagnostic bactériologique est sûr en présence de bactéries pathogènes spécifiques comme : . 

Salmonella Typhi 

. Streptococcus pneumoniae 

. Neisseria meningitidis 

. Brucella 

- en présence de bactéries pathogènes opportunistes, le diagnostic reposera sur : 

. leur isolement dans plusieurs ballons successifs 

. si la culture est positive dans un seul ballon, le choix sera difficile entre une souillure et une bactériémie 

- présence de plusieurs germes dans un ballon 

. soit c’est une souillure 

. soit c’est une infection si le malade est cathétérisé, ou immunodéprimé 


* Hémoculture négative 

- absence d’infection bactérienne du sang 

- HC faite tardivement dans l’évolution de la maladie 

- malade sous antibiotique 

- quantité de sang prélevée insuffisante 

- milieux ou conditions de culture inappropriés 

- délai d’observation trop court 

Incubation-observation 

(atmosphère aéro/anaérobie) 

Cas particuliers 

Ballon d’hémoculture 

Hémoculture négative 

- délai : 7 jours 

Interprétation des résultats 

- Etat frais 

- Gram 

Schéma de la technologie de l’hémoculture 

Hémoculture positive 

- délai : 2-3 jours 

Examen 

microscopique 


- galerie 

- recherche d’Ag 

- ABG 


3.4.6. Sérologies : 

A/ Sérodiagnostic de Widal et Félix 

C’est le diagnostic indirect ou sérologique des salmonelloses par la recherche d’anticorps spécifiques des 

antigènes O, H, Vi de Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A , B, C, Salmonella Enteritidis et Salmonella 

Typhimurium. 

Indications 

Diagnostic des fièvres typhoïde et paratyphoïdes 

Prélèvement 

sang veineux chez un patient à jeûn 

sérum recueilli après centrifugation 

Réactifs 

sérums agglutinants de trois types : 

- sérums contenant des Antigènes O = Ag somatiques, dénaturés à l’alcool 

TO – AO – BO – CO 

- sérums contenant des Antigènes H = Ag flagellaires, dénaturés au formol 

TH – AH – BH – CH – ENH -TMH 

- sérums contenant des Antigènes Vi = Ag capsulaires, dénaturés à l’alcool de 

S. Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin 

Principe 

Réaction d’agglutination entre Ag et Ac (Sérum à étudier et suspensions antigéniques) 

Technique 

Se fait en deux temps : 

- Détecter la présence des Anticorps anti O, H, et Vi aux dilutions 1/100e et 1/200 e 

- Procéder au titrage de ces Anticorps 

1- DETECTION DES ANTICORPS 

Sérum dilué au 1/100 e + suspensions antigéniques 

Sérum dilué au 1/200 e + suspensions antigéniques 

Centrifugation – Chiquenaude – Lecture : 

Dégagement de fumée résultat négatif 

Présence d’agglutinats (grains) résultat positif 

2- TITRAGE 

Dilutions du sérum positif 

Dilutions croissantes de raison 2 : 1/400, 1/800, 1/1600 e 

Centrifugation – Chiquenaude – Lecture 

Titre final = inverse de la dernière dilution positive 

Exemple : si dilution à 1/400 e positive Titre : 400 UI/ml 



Elle permet de préciser le sérotype de Salmonelle en cause et de déterminer la période de la maladie 

grace à l’étude de la cinétique des anticorps 

Agglutinines O : apparaissent vers le 8 e jour, montent puis atteignent le titre de 400. 

Ils disparaissent après 2 à 3 semaines 

Si le taux est > 100 : infection récente ou en cours 

Agglutinines H : apparaissent entre le 10 e et 12 e jour, atteignent rapidement le titre de 800 à 1600, mais 

persistent à titre faible pendant plusieurs mois voire années 

On les retrouve seuls lors d’infection ancienne ou d’une infection récente avec antibiothérapie précoce. 

Leur association avec l’Ag O signe une infection récente ou en cours 

- Le sérodiagnostic est normalement positif pour un sérotype de Salmonella 

- Possibilité de communauté antigénique entre différents sérotypes : coagglutination 

- Une sérologie négative n’élimine pas une Salmonellose 

- Contrôle au bout de 2 à 3 semaines : évolution des taux 

NB : Manque de sensibilité et de spécificité 

Il existe des faux positif : paludisme, dysglobulinémie, typhus exanthémantique 

B/ Sérodiagnostic des streptococcies : ASLO 

Les streptocoques sécrètent des substances antigéniques appelées toxines qui induisent la production 

d’anticorps anti-toxines spécifiques par l’organisme infecté. 

La recherche de ces anticorps dans le sérum du sujet atteint et leur dosage permettent un sérodiagnostic. 

En pratique, la recherche la plus couramment demandée est le dosage des anticorps antistreptolysines 

O (ASLO). 


But 

Recherche d’anticorps antistreptolysine O dans le sérum humain. 

Principe 

C’est un test basé sur une réaction d’agglutination sur carte. 

Le réactif est constitué par un antigène fait de particules de latex polystyrène recouvertes de streptolysines 

O. 

En présence d’anticorps antistreptolysines O dans le sérum à tester, il se forme une agglutination visible à 

l’œil nu. 

Matériel nécessaire 

- Kit réactif qui comprend : réactif, contrôle positif, contrôle négatif, tigettes, carte d’agglutination ( le kit 

est conservé à +4°C) 

- Agitateur mécanique (non indispensable) 

Mode opératoire 

• Sortir les réactifs et les laisser à température ambiante 

• Prélever le sang du patient, centrifuger et recueillir le sérum 

• A l’aide d’une carte sur laquelle sont individualisés des cercles, déposer 50ul de sérum 

à tester dans un cercle et une goutte de chaque contrôle positif et négatif dans d’autres cercles 

• Agiter le réactif ASLO et ajouter une goutte à coté de chaque échantillon. 

• Mélanger, à l’aide d’une tigette à usage unique, de façon à recouvrir toute la surface 

du cercle (changer de tigette pour chaque cercle) 

• Agiter la carte à 100 tours/mn ou imprimer un mouvement de rotation avec les mains 

pendant 2 minutes 

• Lire la réaction obtenue. 

Lecture et Interprétation 

- Absence d’agglutination : réaction négative = absence d’anticorps antistreptolysine O 

- Présence d’agglutination : réaction positive = présence d’anticorps antistreptolysine O 

Une réaction positive traduit un taux >200UI/ml (seuil de positivité du réactif utilisé, Bio Mérieux) 

Tout sérum positif doit être titré. 

Pour titrer, on procède à des dilutions sériées de 2 à 2 (1/2,1/4,1/8 etc…) 

Le taux final sera défini comme étant la plus grande dilution qui donne une réaction positive (sérum positif 

à la dilution 1/A : titre = A x seuil 

exemple : un sérum positif à la dilution 1/8 correspond à un titre de 8 x 200 soit 1600 UI/ml. 

Un taux d’ASLO < ou = 200UI/ml est considéré comme normal chez le sujet africain. 

Un taux > 200UI/ml signe une infection récente. 


3.5. Antibiogramme 

Source: Comité de L’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie - Recommandations 2007 

3.5.1 - Enterobacteriaceae, bacilles à Gram négatif non fermentaires (Pseudomonas 

aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia …), 

Staphylococcus spp., Enterococcus spp. 

- Inoculum 

A partir d’une culture de 18-24 h sur milieu gélosé non sélectif, préparer une suspension en bouillon 

Mueller-Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCl) équivalente au standard McFarland 0,5 (~ 10 8 UFC/ 

ml). 

Cette suspension peut également être préparée à partir d’une culture en bouillon Mueller-Hinton obtenue 

après incubation à 37° C au bain-marie agité pendant 3 à 5 h, et dont la densité est ajustée au standard 

McFarland 0,5. 

- Milieu 

Gélose Mueller-Hinton 

- Ensemencement 

Diluer la suspension inoculum au 1/100 (~ 10 6 UFC/ml) et ensemencer par écouvillonnage ou par inondation 

en respectant les mesures de sécurité nécessaires. 

Cas particulier : Pour Staphylococcus aureus et pour l’oxacilline, diluer la suspension inoculum au 1/10 

(~ 10 7 UFC/ml) et incuber à 30°C sur milieu non supplémenté en chlorure de sodium ou à 37°C sur milieu 

hypersalé (2 à 4%). 

Prolonger éventuellement l’incubation jusqu’à 48 h si la croissance apparaît faible après 24 h. 

- Lecture 

Après 18-24 h d’incubation à 35-37° C. 

- Antibiotiques à étudier 

Enterobacteriaceae 

Amoxicilline ou Ampicilline 

Amoxicilline + ac. Clavulanique ou 

ampicilline/sulbactam 

Ticarcilline 

Pipéracilline ou Mezlocilline 

Mécillinam 

Céfalotine 

Céfoxitine 

Ceftriaxone ou céfotaxime 

Ceftazidime 

Céfixime 

Aztréonam 

Imipénème 

Chloramphénicol 

Tétracycline / Doxycycline (si Shigella) 

Gentamicine 

Kanamycine 

Tobramycine 

Cotrimoxazole 

Colistine 

Nétilmicine 

Acide nalidixique 

Norfloxacine ou Péfloxacine ou ofloxacine 

Ciprofloxacine 

Nitrofuranes 


Concentrations critiques, diamètres critiques et lecture interprétative 

Antibiotique Charge Concentration critique mg/ml Diamètre critique mm 

disque S R S R 

C 30 8 16 23 19 

TE 30 UI 4 8 19 17 

CS 50 2 2 15 15 

SXT 1,25/23,75 2/38 8/152 16 10 

NT 300 32 128 17 14 

NA 305 5 16 20 15 

CIP 5 0,5 1 25 22 

NOR 5 0,5 1 25 22 

PEF 5 1 4 22 16 

Pseudomonas aeruginosa 

Ticarcilline 

Ticarcilline/ac. clavulanique 

Pipéracilline 

Aztréonam 

Cefsulodine 

Ceftazidime 

Imipénème ou méropénème 

Aztréonam 


Kanamycine (Résistance naturelle) 

Gentamicine 

Tobramycine 

Amikacine 

Nétilmicine 

Colistine 

Péfloxacine 



- Concentrations critiques, diamètres critiques et lecture interprétative 

Antibiotique 

Autres bacilles à Gram négatif non fermentaires (Acinetobacter spp., 

Charge Concentration critique mg/ml Diamètre critique mm 

Stenotrophomonas, Burkholderia cepacia....) 

disque 

S R 

S R 

TIC 75 16 64 22 18 

TCC 75/10 16//2 64/2 22 18 

PIP Ticarcilline 75 16 64 Amikacine 18 12 

IMP 

ATM 

10 4 

Ticarcilline/ac. clavulanique 

30 4 

8 

32 

22 

Nétilmicine 

20 

17 

15 

CAZ Pipéracilline 30 4 32 Tobramycine 21 15 

CFS 

CFM 

TM 

Pipéracilline/tazobactam 

30 8 

30 4 

Ceftazidime 10 4 

32 

32 

4 


22 14 

21 15 

Tétracycline 16 14 

AN 

GM 

NET 

Céfépime 30 

15 

Imipénème 30 

8 

4 

4 

16 

4 

4 

Colistine 17 

16 

Cotrimoxazole 

19 

15 

14 

17 

CS 

CIP 

Gentamicine 50 

5 

4 

1 

4 

2 


22 

22 

19 

19 

RIF 30 4 19 19 14 




disque 

S R 

S R 

TIC 75 16 64 22 18 

TCC 75/10 16//2 64/2 22 18 

PIP 75 16 64 18 12 

IMP 10 4 8 22 17 

ATM 30 4 32 20 15 

CAZ 30 4 32 21 15 

CFM 30 4 32 21 15 

TM 10 4 4 16 14 

AN 30 8 16 17 15 

GM 15 4 4 16 14 

NET 30 4 4 19 17 

C 30 8 16 23 19 

TE 30 UI 4 8 19 17 

CS 50 4 4 22 19 

PEF 5 1 4 22 16 

CIP 5 1 2 22 19 

SXT 1,25/23,75 2/38 8/152 16 10 

Staphylococcus spp. 

Pénicilline G 

Oxacilline (sur MH 5% Nacl) 

Céfoxitine 

Gentamicine 

Kanamycine 

Tobramycine 

Erythromycine 

Lincomycine 

Pristinamycine 

Acide fusidique 

Cotrimoxazole 


Tétracycline 

Péfloxacine 


Fosfomycine 

Vancomycine 




disque 

S R 

S R 

PG 6 0,25 0,25 29 29 

OX 5 2 2 20 20 

FOX 30 27 23 

K 30 UI 8 16 15 133 

TM 10 1 1 20 20 

GM 15 1 1 20 20 

E 15 UI 1 4 22 17 

L 15 2 8 21 17 

P 15 1 2 22 19 

PEF 5 1 4 22 16 

CIP 5 1 2 22 19 

C 30 8 16 23 19 

TE 30 UI 4 8 19 17 

FA 10 2 16 22 15 

RIF 30 0,5 16 29 14 

VAN 30 4 8 17 - 

SXT 1,25/23,75 2/38 8/152 16 10 

Enterococcus spp. 

Ampicilline 

Oxacilline 

Kanamycine 

Gentamicine 

Nitrofuranes 

Vancomycine 


Tétracycline 

Erythromycine 

Lincomycine ou clindamycine 


Cotrimoxazole 

Fluoroquinolones 




disque 

S R 

S R 

AM 10 4 16 19 14 

K 1000 250 500 14 12 

GM 500 250 500 17 11 

C 30 8 16 23 19 

TE 30 UI 4 8 19 17 

E 15 UI 1 4 22 17 

L 15 2 8 21 17 

P 15 1 2 22 19 

SXT 1,25/23,75 2/38 8/152 16 10 

VAN 30 4 8 17 - 

3.5.2 - Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp. 

- Inoculum 

A partir d’une culture de 18-24 h sur gélose Mueller-Hinton additionnée de 5 % de sang de mouton, 

préparer une suspension en bouillon Mueller- Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCl) équivalente au 

standard McFarland 0,5 (~10 8 UFC/ml) 

- Milieu 

Gélose Mueller-Hinton additionnée de 5 % de sang de mouton. 

Pour le cotrimoxazole, utiliser une gélose Mueller-Hinton + 5 % de sang de cheval hémolysé. 


Diluer la suspension inoculum au 1/10 (~ 10 7 UFC/ml) et ensemencer par écouvillonnage ou par 

inondation en respectant les mesures de sécurité nécessaires. 

- Lecture 

Après 18-24 h d’incubation à 35-37°C 


Streptococcus pneumoniae 


Ampicilline ou amoxicilline 

Oxacilline 

Céfotaxime ou ceftriaxone 

Gentamicine 

Kanamycine 

Tétracycline 

Erythromycine 


Cotrimoxazole 

Fosfomycine 

Lincomycine 


Norfloxacine 

Vancomycine 




disque 

S R 

S R 

OX 5 21 - 

K 1000 250 500 14 10 

GM 500 250 500 17 11 

C 30 8 16 23 19 

TE 30 UI 4 8 19 17 

E 15 UI 1 4 22 17 

L 15 2 8 21 17 

P 15 1 2 19 - 

SXT 1,25/23,75 2/38 8/152 16 10 

CIP 5 0,12 2 30 19 

VAN 30 4 8 17 - 

Streptococcus spp. (autres que S. pneumoniae) 


Ampicilline ou amoxicilline 

Oxacilline 

Gentamicine 

Kanamycine 

Tétracycline 

Erythromycine 

Lincomycine 



Cotrimoxazole 


Vancomycine 



disque 

S R 

S R 

OX 5 26 - 

K 1000 250 500 14 10 

GM 500 250 500 17 11 

C 30 8 16 23 19 

TE 30 UI 4 8 19 17 

E 15 UI 1 4 22 17 

L 15 2 8 21 17 

P 15 1 2 19 - 

SXT 1,25/23,75 2/38 8/152 16 10 

CIP 5 0,12 2 30 19 

VAN 30 4 8 17 - 


3.5.3 - Haemophilus influenzae 

- Inoculum 

A partir d’une culture de 18-24 h sur gélose chocolat PolyViteX®, préparer une suspension en bouillon 

Mueller-Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCl) équivalente au standard McFarland 0,5 (~ 10 7 

UFC/ml). 

- Milieu 

Gélose chocolat PolyViteX® ou Milieu HTM (Mueller-Hinton + NAD 15 mg/l + hémine 15 mg/l + 

extrait de levure 5 g/l). 


Diluer au 1/10 la suspension inoculum (~10 6 UFC/ml) et ensemencer par écouvillonnage ou par 

inondation en respectant les mesures de sécurité nécessaires. 

- Lecture 

Après 18-24 h d’incubation à 35-37° C. 


Ampicilline 

Amoxicilline/ac. clavulanique 

Céfalotine 

Céftriaxone 

Tétracycline 


Kanamycine 

Gentamicine 


Cotrimoxazole 



disque 

S R 

S R 

AM 2 - 1 - 20 

CF 30 8 17 

AMC 20/10 2/1 21 

TE 30 UI 2 4 23 18 

SXT 1,25/23,75 0,5/9,5 1/19 24 - 

C 30 2 4 28 24 

RIF 30 2 4 24 20 

K 30 UI 8 16 18 15 

GM 15 2 4 15 14 

NA 30 21 


3.5.4 - Neisseria meningitidis 

- Inoculum 

A partir d’une culture de 18-24 h sur gélose chocolat PolyViteX®, préparer une suspension en tampon 

phosphate M/15 pH 7,2 équivalente au standard McFarland 0,5 (~ 10 6 UFC/ml). 

- Milieu 

Gélose Mueller-Hinton additionnée de 5% de sang de mouton. 


Ensemencer la suspension inoculum par écouvillonnage ou par inondation en respectant les mesures de 

sécurité nécessaires. Disposer les disques à une distance de 60 mm, centre à centre, afin d’éviter le 

chevauchement des zones d’inhibition. 

- Lecture 

Après 18 à 20 h d’incubation à 35-37° C en atmosphère contenant 5 % de CO2. 



Oxacilline 

Amoxicilline 

Céfotaxime ou ceftriaxone 

Gentamicine 


Spiramycine 


Cotrimoxazole 

Erythromycine 



disque 

S R 

S R 

OX 5 18 - 

OX 1 11 - 

C 30 2 4 30 - 

RIF 30 0,25 - 30 - 


3.5.5 - Neisseria gonorrhoeae 

- Inoculum 

A partir d’une culture de 18-24 h sur gélose chocolat PolyViteX®, préparer une suspension en tampon 

phosphate M/15 pH 7,2 équivalente au standard McFarland 1 (~10 8 UFC/ml). 

- Milieu 

Gélose chocolat PolyViteX® 


Ensemencer la suspension inoculum diluée au 1/100 ou ajustée au standard McFarland 0.5 (~10 6 UFC/ 

ml) par écouvillonnage ou par inondation en respectant les mesures de sécurité nécessaires. Disposer les 

disques à une distance de 60 mm, centre à centre, afin d’éviter le chevauchement des zones d’inhibition. 

- Lecture 

Après 18-24 h d’incubation à 35-37° C en atmosphère contenant 5 % de CO2, et, si la croissance est 

insuffisante, après 36-40 h. 


Pénicilline G ou amoxicilline 

Ceftriaxone 

Spectinomycine 

Tétracycline 


Erythromycine 

Acide nalidixique 

Ciprofloxacine ou ofloxacine 



disque 

S R 

S R 

SPT 100 64 64 20 20 

TE 30 UI 1 4 - 19 

NA 30 25 

CONTROLE DE QUALITE INTERNE 

Un contrôle de qualité interne doit être organisé pour s’assurer de la validité des résultats obtenus. Les 

souches de référence recommandées sont les suivantes : 

Escherichia coli CIP 7624 (ATCC 25922), 

Pseudomonas aeruginosa CIP 76110 (ATCC 27853), 

Staphylococcus aureus CIP 7625 (ATCC 25923), 

Providencia stuartii CIP 107808, 

Streptococcus pneumoniae CIP 104485 


3.6. ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES 

3.6.1. Types de prélèvement 

Frottis cervico-vaginal de dépistage : 

Parmi les actes médicaux nécessaires au dépistage et au diagnostic des lésions précancéreuses et cancéreuses 

du col utérin, le frottis cervico-vaginal de dépistage (Papanicolaou) doit rester l’examen de première 

intention, qui est facile à pratiquer, indolore et fiable. 

Cet examen permet aussi d’apprécier l’imprégnation hormonale du tractus génital de la femme et 

accessoirement de faire le diagnostic d’infections génitales. 

Liquides biologiques : 

Urines, expectorations, lavages broncho-alvéolaires, brossages des muqueuses, épanchements des séreuses 

(plèvre, péricarde, péritoine), de la synoviale articulaire et du liquide céphalo-rachidien (LCR), écoulements 

mamelonnaires spontanés ou provoqués. Le volume de prélèvement souhaité est de 5 à 10 ml. 

Ponction à l’aiguille fine de masses palpables : 

Les masses solides ou kystiques accessibles à la vue ou à l’Echographie peuvent faire l’objet d’une ponction 

à l’aide d’une aiguille fine et le produit de ponction étalé sur lames ; on réalisera aussi des frottis d’ulcérations 

du mamelon ou des lésions eczématiformes après grattage. 

Le matériel recueilli lors de la ponction est étalé sur des lames de verre en couches minces, puis fixés à la 

laque ou à l’air ambiant (préciser sur la demande d’examen le mode de fixation). Il faut un lot de lames 

suffisant. 

Lorsqu’on retire du liquide, celui ci doit être adressé rapidement au laboratoire pour une centrifugation ou 

une cytocentrifugation. En cas de délai, la préfixation est indispensable et une conservation à + 4°C. 

Biopsies et pièces opératoires (si le Centre de santé est doté d’un bloc opératoire) 

Les échantillons de petite taille (biopsies endoscopiques, biopsies à la pince, biopsie partielle cutanée ou 

biopsie exérèse, etc.) peuvent être fixés dans du liquide de Bouin (éviter alors les contenants en plastique), 

ou dans du formol à 10%. 

Les échantillons de grande taille en l’occurrence les pièces opératoires peuvent être adressés au laboratoire 

après fixation dans du formol à 10% dans un récipient de grande taille pouvant contenir 5 à 10 fois le 

volume de la pièce en fixateur et à ouverture large. Il est recommandé de ne pas sectionner la pièce pour 

permettre au Pathologiste d’en faire un examen macroscopique correct et des prélèvements de bonne 

qualité. 

3.6.2. Matériel de laboratoire nécessaire 


Spéculums, Spatules d’Ayre, brosses endocervicales, laque cytofixiante ou mélange alcool-ether, lames 

porte-objet propres, lamelles, milieu de montage, colorants et solvants 


Flacons propres, alcool 50°, EDTA, lames porte-objet propres, lamelles, milieu de montage, colorants et 

solvants 



Récipients propres, formol dilué à 10% tamponné 

Les échantillons de petite taille (biopsies endoscopiques, biopsies à la pince, biopsie partielle cutanée ou 

biopsie exérèse, etc.) peuvent être fixés dans du liquide de Bouin (éviter alors les contenants en plastique), 

ou dans du formol à 10%. 

Les échantillons de grande taille en l’occurrence les pièces opératoires peuvent être adressés au laboratoire 

après fixation dans du formol à 10% dans un récipient de grande taille pouvant contenir 5 à 10 fois le 

volume de la pièce en fixateur et à ouverture large. Il est recommandé de ne pas sectionner la pièce pour 

permettre au Pathologiste d’en faire un examen macroscopique correct et des prélèvements de bonne 

qualité. 

3.6.3. Modes de prélèvement 


Les conditions de prélèvements sont une abstinence d’au moins 48 heures, une absence de menstrues et 

de traitement local par des ovules au moment du prélèvement. 

Commencer par moucher le col afin de diminuer les sécrétions. A l’aide de la spatule réaliser un frottis à 

partir des sécrétions vaginales, d’un prélèvement exocervical et grâce à la brosse endocervicale faire un 

prélèvement endocervical et l’étaler sur une lame. 


Le seul impératif est que le prélèvement soit fait dans des conditions d’asepsie et que l’échantillon soit mis 

dans un récipient propre. 


Les modes de prélèvements sont variables. Il faut éviter de prélever des zones de nécrose, des caillots 

sanguins, ou des foyers de calcifications pathologiques. Autant que possible, le prélèvement en cas de 

biopsie sous contrôle de la vue se fera à cheval entre la zone saine et la zone pathologique. 

Tous ces échantillons seront accompagnés d’une fiche d’examen anatomo-pathologique sur laquelle 

seront mentionnés les données personnelles du patient, un résumé clinique et paraclinique et des 

hypothèses diagnostiques. 

3.6.4. Procédures de conservation 


Fixation immédiate des frottis à l’aide de la laque cytofixiante ou immersion des lames fraîches dans un 

volume alcool-ether pendant 4-5 min 


Mélange à volume égal du liquide prélevé avec de l’alcool à 50° dans un récipient propre. 

Si le liquide est hémorragique, il faut le mettre dans un tube à EDTA. 


Immersion dans 5 à 10 fois le volume de l’échantillon avec du formol tamponné à 10% 


3.6.5. Procédures d’acheminement 

Tous ces échantillons doivent être acheminés au laboratoire dans des délais raisonnables. 


Mettre les lames qui auront été pralablement identifiées pour chaque patient dans des boîtes de 

transport de lames 


Chaque flacon devra porter le nom et le prénom du patient, son âge, son sexe et le service de provenance. 

Eviter d’écrire sur les couvercles des récipients et utiliser des récipients qui ferment hermétiquement. 


Chaque flacon devra porter le nom et le prénom du patient, son âge, son sexe et le service de provenance. 

Eviter d’écrire sur les couvercles des récipients et utiliser des récipients qui ferment hermétiquement. 

_________________________________________________ 

_______________________________________ 

______________________________

o Manuel de procédures techniques - Direction des laboratoires

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?