BScmikrobifiziologia.pdf - BiomÃ©rnÃ¶ki TanszÃ©k - Debreceni Egyetem

DEBRECENI EGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR(GENETIKA ÉS ALKALMAZOTT MIKROBIOLÓGIA TANSZÉK)2011-től BIOMÉRNÖKI TANSZÉKAz oktatandó [mikrofiz] anyagot összeállította és frissítiSZENTIRMAI ATTILA Emeritus egyetemi tanárMIKROBIÁLIS FIZIOLÓGIAMit jelent?:UNIVERSITAS MAGISTRORUM et SCHOLARIUM. A hallgatók és oktatókegyetemessége, a kiemelkedő képességűek gyülekezete. — A felsőoktatási intézményekfeladata az évenként megjelenő korosztályok tehetséges képviselőinek a kiválasztása,képességeik, testi és szellemi adottságaik hasznosítható tudássá fejlesztése. Az internetenelérhető http://web.unideb.hu/~szentirmai oktatási segédanyag időnként frissítésre kerül.Ebből következik, hogy a közreadott anyaghoz nem tartozik elkülönített irodalomjegyzék,hanem, a szöveg aktuális pontjain, a megjelent tudományos közleményre hivatkozunk.Bár a segédanyag összeállítója feltételezi, hogy a kollégium hallgatói tájékozottak azÁltalános Mikrobiológia és a Biokémia szakterületén, mégis az összefoglaló vázlatok – azösszefüggések megérthetőségét elősegítendő – több esetben a biokémiai reakciók szerkezetiképletével kiegészítve tanulmányozhatók.Oktatási segédlet Debrecen 2008-tólFrissítve: 2013 03.19— 301 oldal1

Bevezetés 3A mikrovilág felfedezése 22A mikroorganizmus általános jellemzése 31A citoplazmamembrán Élettani kapcsolat a mikróba és környezete között 38Zsírsav-szintetáz 43Az Ősbaktérium-membrán építőelemeinek képződése 45Zsírsav lebontó komplex működése 50A külső membrán 56A baktériumok tokanyaga 58A sejtfal rendeltetése 60Az energianyerés mechanizmusa a mikroszervezetekben 72Metanogének 75Redukáló körülmények között kialakult sejt élettana 84Cianocobalamin 86Szénváz képződése szén-dioxidból 95Kén és a mikrovilág 98A fényenergia hasznosítása 106Oxigént nem igénylő fototróf baktériumok 108Oxigént termelő fotoszintetizáló prokarióták 117Oxigén jelenlétében kialakult mikrovilág 124Szénhidrátanyagcsere a citoplazmában 125Az aerob körülmények között működőképes Szent-Györgyi-Krebs ciklus 136A mitokondrium 143A szénhidrátlebontás alternatív útjai 145Obligát anaerob bacillusok biológiája 150Anyagfelvétel, a membrán transzportfolyamatai 153Nitrogén-anyagcsere a mikrovilágban 167Nitrogén-forgalom a természetben 171Nitrogénkötés 172Riboszomáls fehérjeszintézis 180Aminosav-anyagcsere a citoplazmában 186Az aromás aminosav-bioszintézis szabályozottsága 192Hisztidin bioszintézis 210A mikroszervezet nukleinsavtartalma 223RNS-szintézis a prokariótákban 230Endospóra képződés 236Mozgásszerv a mikrovilágban 242MIKROSZKOPIKUS GOMBÁK VILÁGA 248Szénhidrátmetabolizmus a citoplazmában 252A mitokondrium 265Sejtfal 272A dimorfizmus 275Az élesztőfélék (zymomycota) szaporodási viszonyai 277A gombák öregedése 283Eukarióta flagellum vázlata 285Mikrobiális eljárások kidolgozása példaként választva a„citromsav-termelés”-t 286Beszámoló 2992

BEVEZETÉSA természet jelenségeit figyelő ember megállapíthatja, hogy a mikrovilág tagjai az ökológiaikörnyezetükkel dinamikus egységet alkotva töltik be az élővilág fennmaradása szempontjábóllétfontosságú szerepüket. A mozgató-erő a létért való küzdelemben az élni akarás, mégpedig,egyre kedvezőbb körülmények között létezni. Ebben a küzdelemben győztes, aki a szabályozómechanizmusok hatásos működése következtében kevesebb anyag és energia felhasználásávalképes létezni, adott esetben vezető szerepre törekedve (antibiotikumok!).A gondolkodó ember – saját tapasztalata alapján – a mikrovilág természetes élőhelyükrőlkiemelt tagjai számára előnyös körülményeket biztosítva, azokat saját szolgálatába állította.Főleg az ősi élelmiszergazdaság hasznosította a mikrobák biokémiai aktivitását, nohalétezésükről őseink vajmi keveset sejtettek. Az élelmiszertartósítás, a savanyítás, a tejtermékek,a kenyér és a húskészítmények, valamint az alkoholos erjesztéssel nyerhető termékek előállításáraszolgáló ősi folyamatok kimunkálása a biblikus idők ködébe vész. Négy-ötezer évesegyiptomi és mezopotámiai írásos emlékek, többek között a sörfőzés és az ecetkészítés ma isérvényes technológiai lépéseit ismertetik A mikrobiológiai kutatómunka fejlődését éppenezeknek az ősi technológiáknak a nagyipari alkalmazása igényelte.Miért került a címlapra Pasteur képe? – Mert kisérleti eredményeiből nyertkövetkeztetései az ipari gyakorlat és az orvosi biológia számára ma is alapvető jelentőségűek. Akémiai ismereteket oktató Pasteur a borkősav forgatóképességét tárgyaló PhD dolgozatátkészítve került kapcsolatba a biológiával. – 1865-ben már állami megbízást kapott a selyemipartveszélyeztető selyemhernyóvész tanulmányozására. Szakszerű munkával bizonyította akórokozó mikróba szerepét. – A nagyipari méretben megvalósított biotechnológiai folyamatokelső tudományos igényű feldolgozása is Pasteur munkája. 1866-ban a bortermelésről, 1868-banaz ecetgyártásról, 1876-ban pedig a sörgyártásról írott műve jelent meg. Pasteur megsejtve atudományág művelésének jelentőségét szenvedélyes cikkben fejtette ki álláspontját, oktatta kiellenfeleit: "A mikrobiológiai gyakorlat nem más, mint a tudomány, esetünkben amikrobiológiai fiziológia szakterületén szerzett ismereteink alkalmazása.” (Il n y a pas dessciences appliquées... Mais il y a des applications de la science.).A huszadik század elején már számos szerves vegyipari alapanyag (butanol, aceton,tejsav, stb.) előállítására született gazdaságos mikrobiológiai, főleg anaerob fermentációs eljárás.A levegőztetett fermentorok (mikrobiális reaktorok) ipari alkalmazása a második világháborúután, a penicillin-termelés nagyipari megvalósításával kezdődött. Az antibiotikum-ipar kialakulásávalmegindult gyors fejlődés töretlen, sőt a 70-es évek molekuláris biológiai eredményei, agéntechnológia gyakorlatba vétele a század végére a mikrobiológiai eljárások gazdaságijelentőségét egyre növelte. Ezt a célt szolgálandó került a főkollégiumok közé a mikrobiálisfiziológia szaktárgy, amely a mikrovilág képviselőinek élettani tulajdonságait ismertetve kívánjabővíteni a biomérnök gyakorlatban is használható alapismereteit.A biomérnök elnevezés indukál egy filozófiai kérdést: Mi az élet? — Az életlényegének ugyanis nincs általánosan érvényes meghatározása. Filozófiai kategóriaként az életaz anyag kritikus bonyolultsági fokot meghaladó rendszere. Ezzel a kijelentéssel azonban nemjutunk előbbre. Tapasztalataink szerint az élőlény öröklött információ által irányított, aszabályozó mechanizmosok hálózatát maradéktalanul kihasználó, szűntelen fejlődésre képes,olyan önszerveződő fizikai-kémiai rendszer, amely a környezetben észlelhető rendezetlenségfelszámolásán munkálkodik, .Az élet; a múlt és a jövő találkozási pontján (a lét és a nemlét határán) kémiai ésfizikai vizsgáló módszerekkel meghatározott körülmények között létező, külső energiátfelhasználó folyamat, amelynek megjelenési alakja az élőlény, amely számára az életbenmaradást a folytonos elektronmozgás biztosítja. Az energia-kvantum forrásául szolgál a sejt éskörnyezete között a donortól az akceptorig jelentkező elektronpotenciál különbség.3

A mikroorganizmus (οργανον) tudományos jellemzése sem könnyű feladat, mégpedigazért, mert morfológiailag és fiziológiailag is változatos formában léteznek a Regnum plantarum(növényvilág), illetve a Regnum animale (állatvilág) különböző taxonómiai egységeibe soroltmikroszkopikus méretű állandóságra törekvő, de változékony, önreprodukcióra, és fejlődésre(evolúcióra) képes lények. Külső energiaforrást hasznosítva, de szelekciós nyomás alatt állóönszabályozott rendszerként létező sejtjeikben jelenik meg az élet a maga teljesbonyolultságában. Az élő sejt a környezet változására adekvát módon reagálva képesfennmaradását biztosítani. Ezek a szervezetek a létért folytatott ádáz küzdelemben, finomanszabályozott lebomlási és felépülési folyamat során, a környezettel bizonyos fokú dinamikusegyensúlyra törekedve, végül is a biotóppal egységet képező közösséget alkotva, népesítik be arendelkezésre álló élőhelyet. Ennek a szövevényes állapotnak a fenntartását szolgálómechanizmus működését kívánja bemutatni az élettan, amely végül is az élőlényekre jellemzőtulajdonságokat, az élet lényegének az ismertető jegyeit foglalja rendszerbe. A profitra törekvőipari vezetés nem sajnálja a kutatásra adott anyagi támogatást, mert az ipari jellegű kutatásieredmények gyakorlati alkalmazása bőven megtéríti a kutatás támogatására fordított anyagi erőt.Kezdetben az egyes biológiai folyamatok végbemenetelét katalizáló enzimek kristályosformában való előállítása és a működését jellemző kinetikai adatok gyűjtése lebegett célként akutatók szeme előtt. Hamarosan kiderült azonban, hogy az élő sejtben nem a kristályos enzimek(fehérjék) oldatai végzik a feladatot, hanem funkcionális csoportokba szerveződve, egymáshozszorosan illeszkedve, külcsönhaítást kiváltó asszociátumok formájában, sokszor szintekristályvizükben létezve teljesítik feladatukat. – Hol kezdődik az élet? Élőlény vajon a vírus,amely kristályosítható, kristályos formában korlátlan ideig tárolható, végül a gazdaszervezetbejutva bonyolult, többé-kevésbé ismert módon önmagához hasonló molekula-aggregátumokképződését irányítja?Nemcsak a vírus, de a baktérium esetében is elgondolkodtató a kérdés: „Meddig él abaktérium?” – Minél kedvezőbb körülmények közé kerül a kérdéses mikroba, annál rövidebbidő alatt osztódik. Húslevesben az Escherichia coli tenyészet élő egyedszáma 37 o C-on 20 percalatt megkétszereződik. Életideje tehát 20 perc? Kedvezőtlen körülmények között viszont asejtszám kétszereződését több órán keresztül folyó lassú fejlődési ciklus jellemzi. Ez esetben azéletidő több óra? Az életműködést fenntartó sejtállomány az osztódás előtt megkétszereződik,majd az eredeti sejttartalom az osztódás után egyenlő megoszlásban a két önálló utódbantalálható. Izotóppal jelzett molekulák felhasználásával több osztódáson keresztül követhetjük akiindulási sejt anyagainak a jelenlétét az utódokban.A kérdés megkerülhető, ha az egyed életideje helyett a baktériumtömeg mennyiségétmérjük. Tehetjük, mert a baktériumtelep az önmagához hasonló, azonos biológiai állapotbanlevő egyedek összessége. A kedvező életkörülmények fenntartása esetén a tenyészet elvileg adinfinitum osztódóképes. Ebből következően, az élet örök?Mi legyen az álláspontunk az endospóraképzéskor? Az mégsem állítható, hogy aspóraképződés az egyed halála, hiszen kedvező körülmények közé kerülve a spórából esetlegcsak évek múlva újra vegetatív lény fejlődik. Eldöntendő, hogy vajon ugyanaz a lény jelent-emeg, amelyik endospórát képzett, vagy ez egy másik egyed? Az endospóra képződés elsőlépése a DNS állomány megkétszeretődése, amelynek egyik példányát őrzi a spóra.Szerencsére nem ezeket a filozófiai problémákat kell boncolgatnunk, hanemösszefoglalni az általános élettani ismereteket, mindenki számára jól áttekinthető, könnyenérthető formában. A mikrobiális élettan valójában egységes szemlélettel a biológia egészélővilágra érvényes alapjelenségeit tárja fel. A szakterület művelője a biofizika, a biokémia, amikrobiológia, a sejtbiológia, a genetika és a számításterchnika specialistái által feltárteredményeket hasznosítva a “Hogyan történik?” kérdésre akar korszerű választ adni. Akörnyező világ jelenségeinek megismerhetőségébe vetett bizalom, és az okság elvének4

érvényesülésébe vetett hit a mozgatója ennek a tevékenységnek, noha a történéststatisztikailag számítható mennyiségben bekövetkező véletlen folyamat befolyásolja. Ezazonban nem csökkenti az okság elvének abszolút érvényét [Sors bona, nihil aliud. — Deusex machina.— Szerencsés véletlen.]Élettani ismereteinket ismert mikroszervezetekkel végzett kísérletek, napról-napragyarapodó reprodukálható eredményei bővítik. Nyilvánvaló, hogy a biológiai szerveződésvizsgálata – az eredmények megbízható értékelhetősége érdekében – a környezetbőlelkülönített, csupán a mikrobiológiai laboratóriumokban tiszta tenyészetként létező clon(törzs) felhasználásával, az élő rendszert provokáló mesterséges körülmények között folyik.Charles Robert Darwin (1802-82) az Origin of Species című munkájában (1859) az állat- ésnövényvilág valamilyen közös ősének létezését tételezi fel (that living organisms do not have tobe either plants or animals), amely — mint írja — szükségképpen valamilyen egysejtűkéntlétezhetett valamikor. Darwin természetszemléletét félreértve, az általa feltételezett — se nemállat, se nem növény — átmeneti lényt keresve Ernst Haeckel (1834-1919) a mikrovilágvizsgálatával kezdett foglalkozni. Ő volt az, aki az 1866-ban megjelent munkájában avéglényeket a növény- és állatvilágtól teljesen elkülönítve, harmadik regnumként a protistákbirodalmába sorolta. Hamarosan kiderült azonban, hogy ezt a birodalmat tovább kell bontani.Nem véletlen. hogy a protista elnevezés hamarosan kikopott a tudományos nevezéktanból. Azalacsonyabb rendű prokariótákon kívül a magasabb rendűek közé a gombák, algák és zuzmóksoroltattak, az egysejtű véglények pedig protozoaként kerültek tárgyalásra.— Az új regnumbevezetése nem könnyítette a biológusok tevékenységét, mert az új birodalom olyan fajokat isleválasztott a klasszikus állat- és nönyvilágból, amelyeknek rendszertani helye vitathatatlan volt.A telepesek nagy része például éppen méretükből adódóan nem tekinthető a mikrovilágképviselőinek. Tovább bonyolította a helyzetet a szubcelluláris biológiai egységek felfedezése(vírusok, fágok, plazmidok, virionok, prionok stb.) és rendszertani besorolásuk. A mikrovilágtaxonómiai (ταξιω sorba rendez) tárgyalása sohasem volt problémamentes. Akkor is erőszakez, ha természetes rendszernek nevezzük. A méret szerinti elkülönítés egy táborba sorolta atermészet sokszínűségéből következően egymástól lényegesen különböző rendszertanicsoportok, a botanika, a zoológia és a mikológia területére sorolt a mikroszervezeteket.—Carolus Linnaeus Systema naturae című munkájában (1734) a növényvilág tagjaiként említia mikroszkopikus élőlényeket. A növényrendszertan művelői a regnum vegetatile tagjaikéntVirophyta, Schizomycophyta, Thallophyta stb. törzsekként tárgyalják őket. A gombákatklorofilljukat vesztett algáknak tekintik, a magasabb rendűeket a vörös moszatokból, azalacsonyabb rendűeket a Chrysophyta moszatokból származtatják. A mikológusok a gombákatönálló törzsfejlődési vonalon kialakult olyan élőlény csoportnak tartják, amelyek atáplálkozási láncban a reducens heterotróf vonalat képviselik. (Az élesztősejttömegkettőződéséhez több mint 100 perc szükséges.)Ma a néhány gént tartalmazó nukleinsavtól a több ezer gént tartalmazó metazoákig,méret és bonyolultság szempontjából többé-kevésbé folyamatos sorba rendezhetők azegységes élővilág ismert fajai. Ez a sorrend azonban nem jelent fejlődéstani rokonságot. A fágnem létezhetett a baktérium megjelenése előtt, a vírus létéhez is szükséges a magasabb rendűszervezet kialakulása. Hipotetikus az ős-eukarióta kialakulása, amely szerint az ős-anaerobszervezetek az oxigén megjelenése után az aerob prokarióták bekebelezésével jutottak asejtszerveződés magasabb fokára. Bonyolítja a tudományterület művelőinek a hrlyzetét, hogysok esetben a tárgyalandó szervezetek olyan szoros asszociátumban élnek prokarióta illetveeukarióta szervezetekkel, hogy önálló egyedként nem vizsgálhatók.Az élettér meghódítása közben a szaporodó mikrobák szükségképpen találkoznak eltérőtulajdonságú egyedekkel. Ha az életfeltételek szempontjából nem különböznek lényegesen,5

akkor harmonikusan beilleszkednek immár közös életterükbe. Ellenkező esetben a létért valóküzdelem kegyetlen törvényei érvényesülnek. A természetes élőhely mikrobaközösségeinekösszetételében tapasztalható jelentős eltérés abból adódik, hogy a szelekciós nyomás alatt azadott fizkai, kémiai és biológiai körülményekhez legjobban alkalmazkodó egyedek válnakuralkodóvá. Fennmaradásuk a környezet hatásainak az elviselésére szolgáló mechanizmusukműködőképességétől függ. A kiválasztódás szempontja a létért való küzdelem porondjánminden esetben csak a gazdaságosság lehet. Az az egyed marad életben, amely az adott körülményekközött a legkevesebb energia felhasználásával tudja fenntartani az életműködését. Azélettér meghódítása nagymérvű specializálódással járhat. A gazdaszervezethez, vagy akörnyezethez való szélsőséges alkalmazkodás lecsökkenti ugyan az élő szervezet rugalmasságátés tűrőképességét, de kárpótlásul az adott élettérben akár uralkodó (rasszként) törzsként ismegjelenhet. A specializálódás több esetben a túlélés előfeltétele, ami azonban a körülményekváltozása esetén akár pusztulásuk okává válhat (Az oxigénigényes ecetsav baktériumok alevegőellátó rendszer zavara esetén az ecetgyártó reaktorban elpusztulnak).Tudatában kell lennünk, hogy vizsgálati eljárásaink durván megváltoztatják amikroszervezetek életkörülményeit még akkor is, ha úgy véljük, hogy kíméletes módszerekethasználunk. A megbízható és reprodukálható adatgyűjtés céljából ugyanis minden esetbeneredeti élőhelyéről kiszakítva, homogén tiszta tenyészetként, a válasz értékelhetősége céljábólszélsőséges, de ellenőrzött laboratóriumi körülmények közé helyezett tenyészet reakcióitfigyeljük. Nem felejtendő, hogy a természet csak a helyesen feltett kérdésre ad kielégítőenpontos választ. Kísérleti munkáinkban az idő függvényében változó, számszerűsített adatokatszolgáltató módszerek alkalmazásával sohasem egyetlen sejt, hanem a homogén tenyészet általokozott hatást analizáljuk. Ebből a szempontból előnyös a kémiailag egyértelmüenmeghatározott összetevőket tartalmazó táptalaj — például minimál táptalaj (ammonium szulfát,kálium foszfát, glükóz, nyomelemek) — használata.Antagonizmus – Ellentét - AνταγωνιζοµαιMinden felmerülő kérdésre igen vagy nem válasz adható (to be or not to be). Érzékelő mű-.szereink technikai szinvonala határozza meg a megismerésünk mélységét. A választottvizsgálati módszerek kivitelezésekor figyelembe kell venni, hogy, állásfoglalásunkatmegkönnyíti a feltett kérdésre kapott egyértelmű igen vagy nem válasz.A folyamat irányát számtalan részelem állapota határozza meg. A részelem zavaroskörülmények esetében is csupán igen-nem között választhat. Minden folyamatrészelemekre bontható az utolsó igen-nem válaszig (A kettes számrendszer érvényesül0 vagy 1 formában a Computerben is). A döntésképtelenség (tartózkodás) végülpusztuláshoz vezet, mert látszólag megáll a létező idő. Valójában a tartózkodás isválasz, ami a körülményekhez képest igen vagy nem. Kölcsönösen előnyösmegállapodás nem lehetséges. Kompromisszum esetén valamelyik fél mindigelőnyösebb helyzetbe kerül.A statIsztika emberi találmány mások vagy magunk félrevezetése céljából. Ez igaz?? Afejlődés statisztikusan igaz, lényeges eleme a megjelenő ellentmondás alloszterikusanérvényesülő hatásának a kifejeződése.A döntésre képes emlékező lény a mult történéseit elemezve, abból tanulva próbálja meghoznihite szerint a jövőjét befolyásoló döntését.6

Valójában gazdasági érdek irányította a figyelmet az egyetlen mikroszervezetben játszódófolyamat vizsgálatára, az élő szervezet működését irányító egyre bonyolultabb összefüggésekmegértése céljából. —A biológiai ipar számára gazdaságossági szempontból fontos akiválasztott egyed teljesítményét befolyásoló optimális környezeti tényezők felderítése. Aszénforrás, a nitrogénforrás, a kén és foszfát ellátottság, valamint a nélkülözhetetlen fém ionokszerepének a vizsgálatán túl meghatározó jelentőségű a külső tényezők, a környezetet jellemzőfizikai és kémiai paraméterek, a halmazállapotot (gáz, folyadék, szilárd fázis) befolyásolóhőmérséklet és nyomásviszonyok ismerete.— A fizikus; az anyag általános sajátosságaival foglalkozva, számszerüsíthető törvényeknekmegfelelve írja le a kiválasztott szervezet környezetében lezajló folyamatok változásait.— A kémikus; az anyag és energia megmaradás elvének érvényesülése mellett, az elemek és amolekulák mozgásformáival foglalkozva ad tanácsot a célfeladat sikeres teljesítéséhez.— A biológia kutatója; kísérletekkel igazolt eredményekkel bővíti élettani ismereteinket.— A matematika – humán szellemi termékként – alapvető állításokból (axioma), logikaimódszerekkel levezetett tételek mentén, a biológiai környezetet jellemző fizikai valóságlényeges összefüggéseinek feltárását segíti.— Az informatika az eljárás sikerét meghatározó környezeti körülmények adatainakrögzítésével és értékelésével járul hozzá a biológiai folyamat előnyös lefolytatásához.xxxxxxxxxxxxxMilyen tématerületre terjed az élettani problémák vizsgálata?Az élő szervezet a környezetében előforduló C, H, O, N, P, S atomokat tartalmazóvegyületeket használva, a környezet energia készletével gazdálkodva küzd a fennmaradásáért.A túlélés érdekében a versenyképesség fenntartása szempontjából meghatározó jelentőségű akörnyezettel való kapcsolat kialakítása, az enzim szinten és genetikai szinten megvalósulószabályozási mechanizmusok tevékenysége, továbbá a faj terjedését szolgáló szerveződéshatásos működtetése. — A fiziológus módszere: homogén növekedő tenyészetben valamilyendurva kémiai vagy fizikai beavatkozással igen/nem válasz porovokálása, majd a kapotteredmény valóságtartalmának igazolása után, esetleg opponálása alapján, a növekedés, abioszintézis befolyásolásának mértéke alapján érvényes vélemény alkotása.Vizsgálandó:– a szén-dioxid felvétele és hasznosításának kérdésköre.a légköri nitrogén megkötése területén elért eredményekaz aktív acetát (acetil-S-CoA) ellátottság gyakorlati megvalósulásaa hasznosítható energiacsomag, ATP nyeréseaz elektromágneses sugárzás hasznosításával ATP és NADPH formálásaaz energiaforrásként hasznosítható anyagok (szénhidrát, zsír) finomanszabályozott felvétele, lebontása, bioszintézise és raktározásaaz energianyerő folyamat enzimeinek szabályozott képződésea DNS-giráz működésének szabályozó szerepea hidrogén mint energiaforrás vizsgálataa szénhidrogén, alkohol, hasznosítása; glikolízis, zsírsav lebontás stb.a szaporodás, a replikáció anyag és energia igényeaz optimális nukleotíd szint biztosítása, (szintézis, felvétel, átalakítás)a membrán lipid és fehérjetartalmának a szintézisea seltfal képződéseA vizsgálandó objektum kis mérete miatt a kísérleti tapasztalatok részletes leírása, valamint amegszerzett és kritikailag igazolt ismeretek rendszerbe foglalása, a technikai fejlődés egyremagasabb szintjén a vizsgáló módszerek szüntelen fejlesztését igényli. – Csak a mikroszkóphasználatának elterjedésével tárult fel az emberiség számára a mikrovilág addig ismeretlen7

szakterülete és alakult tudománnyá a mikrobiológusok tevékenysége. Azóta is egy-egy újeszköz megszületése, egy-egy új technikai módszer bevezetése jelentős előrelépést hozott amikrovilág titkainak feltárásában. A szabad szemmel láthatatlan világ kutatása az indirektkísérletező módszerek fejlődésének, a biokémiai megközelítésből következő új szemléletkialakulásának, azaz a deduktív (következtető, valamiből levezető) gondolkodásmódterjedésének kedvezett.Hippokrates (470-364) a tapasztalat gyűjtést szorgalmaztaAristoteles (384-322) az ismeretek rendszerezését tartotta fontosnakGalenus (131-200) a módszeres kutatás apostolaHarvey (1578-1657) és Descartes (1596-1650) a kísérleti eredményektől várt fejlődéstA XIX-ik század kutatói a biofizikai-biokémiai alapozást indították.A XX-ik század a szabályozás mechanizmusát tárta fel. A genetika és a mikrobiológiaközötti szoros kapcsolat kialakulását a negyvenes évek felfedezései Delbrück és Luria, majdTatum és Joshua Lederberg genetikai munkái segítették. Az egységessé váló biológiaigondolkodást a dupla szálú DNS szerkezetéről 1953-ban a Nature-ben megjelent közlemény (J.D. Watson és F. H. C Crick) alapozta meg. Az ezt követően fejlődő molekuláris-biológiaitechnika, a genomika szintjére emelte az élővilág szakszerű leírását.A XXI század mikrobiológusa a megismerés érdekében változatlan klónt vizsgál,kiragadva a vizsgálandó egyedet a fizikai-kémiai környezet és az élő szervezet folytonoskölcsönhatást biztosító ökológiai életteréből.< Az ipari technológiák széndioxid-termelése fokozódó mértékben zavarja a kialakultegyensúlyt, noha a légkör és a hidroszféra közötti spontán kicserélődés lehetősége, az óceánokpufferhatása és az üledékképződés eddig enyhítette a környezetbarátnak nem tekinthető emberitevékenység káros következményeit.>< A napenergia hasznosításában a humán populáció eddig nem tudott számottevő eredményrejutni; ma is az évmilliárdok alatt felhalmozott szénhidrogén-készletekben eddig megőrzöttenergiát pazarolja, illetve éli fel. >8

Környezetünk fizikai-kémiai viszonyai-t meghatározó ismereteinket célszerű feleleveníteni még amikrobiális élettan tárgyalása előtt.Az élővilág környezetének nélkülözhetetlen eleme a VÍZ, amely aFöldön 1,4 milliárd km 3 mennyíségben található. Ennek 2,5%-aédesvíz formájában fordul elő. Sürüsége a hőmérséklettől függ,+4 o C-nál a legsűrübb (1g, cm –3 ) Megfagyása, mivel a jég sürüségekisebb a folyékony víznél térfogat-növekedéssel jár. Ahőmennyiség egységéül választott 15 fokos víz fajhője 1 cal g –1 C o –1 , ezért hűtő-fűtő rendszerekben előnyösen alkalmazható. —Jelenléte a mikrobák természetes élőhelyén meghatározó faktorkéntnélkülözhetetlen. Rothadás, korhadás, penészedés csak nedveskörülmények között indul meg. (A mikrobák okozta káros hatások szempontjából a trópusipáratelt klíma különösen veszélyes!) A prokarióták nem képesek magukat megvédeni akiszáradás ellen. A tenyésztésre használt légtermosztátokban ezért a páratartalom megőrzésérefokozottan ügyelni kell. — A víz kémiailag állandó vegyület. Az éllővilág számáradipólusként tetraéderes szimmetriájú H-kötésekkel stabilizált szerkezetű reakció közeg, amelyfémionok hatására átalakul. Az ionok körül hidrátburkot alkotva elősegíti az oldott molekulákdisszociációját. Gyenge sav, illetve bázisként is felfogható. Gyenge savak és bázisok sóithidrolízálja. Természetszerüleg maga is disszociál: H 2 O H + + OH – . Protonnal a vízbőlhidronium ion (H 3 O + és OH – )képződik. Tiszta vízben 1x10 –7 mol L –1 ion létezik 25 o C-on,ami lényegében nem csökkentia víz koncentrációt: 55,5 mólL –1 —Így az ion szorzata:{H + ] [OH – ] = 1,0x10 –14 . —Savanhidridekkel savat alkotCO 2 + H 2 O H 2 CO 3 . Aszénsav reverzibilis egyensúlyttart az oldott széndioxiddalCO oldott 2 CO gáz 2 , amit a közeg hőmérséklete, pH-ja, és az oldódó gáz parciális nyomásabefolyásol.—A víz fizikai-kémiai tulajdonságait az oldottanyagok minősége és mennyiségük, a közeg hőmérséklete ésnyomása, valamint pH-ja befolyásolja.– Dipólus jellege miatthidrogénhidat alkotva a környező vízmolekulákkal kapcsolatbalép. Kémiai stabilitását az alkotórészének, az oxigénkiemelkedő elektronaffinitása (elektronegativitása) okozza. Ahidrogénkötés megszüntetéséhez 3-7 kcal mol –1 energiaszükséges. Redoxpotenciálja +0,815 Volt. Több izotópjaismert. (Nehéz víz D 2 O.) Végül nem vitás, hogy vízbőlszármazik a Földi légkör oxigéntartalma, amely ahidrogénfúzióból származó fényenergia 4 1 H 2 2 He + 2 1 e o + hν hasznosításával készül.(fotoszintézis) — 2000 fok felett hidrogénre és oxigénre bomlik. Ezer fok felett pedig a szénvízgőzzel reagál: H 2 O + C –> CO + H 2 A nyert gázelegyet szintézisgáznak nevezzük.9

SZÉN-DIOXID jelenléte az élővilág számára alapvető jelentőségű. A mikrovilágszénforrásként képes hasznosítani a Föld légkörében kezdettől fogva jelenlevő szén-dioxidot. Ametanogének elektronakceptorként – négy hidrogénmolekula felhasználásával – ATP és kétmolekula víz képződése mellett metánná redukálják. Nemcsak az autotróf ősbaktériumok ésfotoszintézissel élők kötik a széndioxidot ferredoxinnal működő reduktív citromsavciklussegítségével, de az aerob energianyerő folyamatokkal rendelkező szervezetek számára isnélkülözhetetlen bizonyos vegyületek szintéziséhez. — Az oxigén felszaporodása után a piroszőlősav,illetve foszfoenol-piroszőlősav karboxilezése az egyetlen lehetőség az oxidatívcitromsav ciklus feltöltésére minden olyan esetben, amikor a mikroszervezet építőelemeinekképződése a Szent Györgyi-Krebs-ciklust terheli. Az arginin, a piridin és a purin származékokképződése szén-dioxid jelenléte nélkül leáll. A legtöbb aerob mikroba növekedése erősenlevegőztetett táptalajon nem indul meg, csak álló kulturában, mert a membrán kialakulásáhozszükséges zsírsavak (malonil-CoA igény) képződéséhez a légkör parciális szén-dioxidnyomásának egy minimális szintet kell elérnie. Ez nem meglepő, mert nem csak az élővilágkialakulásakor, de még a növényvilág megjelenésekor is, a légkör szén-dioxid tartalma a maiszintet lényegesen meghaladta. Ennek kései emléke, hogy a légkör szén-dioxid tartalmánaknövelése a növények fejlődését segíti.Szén-dioxid gáz [CO 2 ] moltömeg: 44,01 Op: –79 o C {1,56 g/cm 3 }Szublimál:– 78,5 o COldékonysága hideg vízben 171,3 g/liter 0 o C — 90,1 g/liter 20 o CA széndioxid vizes közegben oldódik, hidrolizál, disszociál, és redukálódhatSzén-monoxid gáz [CO] moltömeg: 28.01 Op: –207 o C — Fp: –192 o COldékonysága hideg vízben 3,5 g/liter 0 o C — 20 g/liter 20 o CSzén-szuboxid 0 o C-nál gáz/folyadék[O=C=C=C=O]moltömeg: 68.03 Op: –111.3 o C Fp:+7 o CGyémánt [C] moltömege: 12,01 Sürüsége 3,51 g/cm 3 20 o C Op: 3500 o C Fp: 4200 o CGrafit Sürüsége 2,25 g/cm 3 20 o C Szublimál 3600o CSzén-nanocső:sűrűség 1,33–1,40 gramm/cm 3 Szívósság:570 kJ/kg Szakítószilárdság:63 GPaVezetőképességük 4·109 A/cm 2 , a rézvezetékének több, mint ezerszerese. A rézvezetékekmár 4·106 A/cm 2 -nél elégnek. – Egyedi nanocsövekből már készítettek olyan áramköröket(tranzisztorokat, logikai kapukat), amelyeket újfajta számítógépek készítéséhez lehetfelhasználni. Ily módon 10-15 év múlva, amikor a szilícium áramkörök lehetőségeikhatárához érkeznek, ezeket a szén nanocsőből készített áramkörök helyettesíthetik.Nagyfokú szilárdság, szakítószilárdság, rugalmasság, hajlékonyság, hőstabilitás és igen kissűrűség jellemző rájuk. Az egyfalú szén nanocsövek rendelkeznek valamennyi ismert anyagközül a legnagyobb szilárdsággal, a gyémánténál erősebb C–C kötések miatt.Szakítószilárdságuk igen nagy, 63 GPa. Ez 252-szer nagyobb az ötvözetlen szerkezetiacélénál (250 MPa). 10–15-ször erősebbek a szénszálaknál is. Mivel sűrűségük 1,33–1,40gramm/cm 3 , az alumíniumnál (2,7 gramm/cm 3 ) 2-szer könnyebbek. Ezért könnyűés nagyon erős anyagok előállítását teszik lehetővé.Nagyon rugalmasak, nagy szögben hajlíthatóak károsodás nélkül.Polivinilalkohol segítségével fonallá fonhatók, a szuper erős szálak hossza akár 100 méter islehet. Szívósságuk (az a tömegegységre jutó energia, amit az anyag még szakadás vagy törésnélkül képes elnyelni) 570 kJ/kg, ami hússzor nagyobb a golyóálló mellényekben jelenleghasználatos kevlár, és háromszor nagyobb a legszívósabb természetes anyag, a pókselyemszívósságánál.Hőstabilitásuk igen nagy: vákuumban 2800°C-ig, levegőn 750°C-ig stabilak.10

A HIDROGÉN molekula (H 2 ) mint energiaforrás. A „hidrogenáz” katalizálta a reakciótermékét, a protont és az elektront az F-420 8-hidroxi-5-deazaflavin komponemse köti.GlutaminsavGlutaminsavpiroszőlősavfoszforsavribóz8-hidroxi-5-deazaflavinA HIDROGÉN mint elektronforrás11

,A riboszómális fehérjeszintézisben felhasználásra kerülő L-AMINOSAVAK(egyezményes betüjel; moltömeg; a fehérje alkotókénti szerep; összegképlet; szerkezeti képlet)12

Szénhidrátokra vonatkozó biokémiai ismeretek felelevenítéseA különböző széhdrátok valóságban azitt mutatott formában létezve vesznekrészt az élettanilag fontos reaciókbanNem csekélyjelentőségű akirális viszonyokszerepének afelelevenítése.Konfiguráció D és L(sztereoizomeria) —Anomerizációα és β —Epimerizáció(strukturizomeria)13

ÉLETTANI SZEMPONTBÓL VIZSGÁLANDÓ FONTOSABB SZAKTERÜLETEKTÁPANYAGFEFEHÉRJESZÉNHIDRÁTLIPIDaminosavakmono ésdiszacharidZsírsavGlicerinTerpénHIDROLÍZISglikolízisNH 3 CO 2 Acetil-S-CoA CO 2PIRUVÁTAcetil-S-CoA 0ATPNADHMETABOLIZMUSCITRÁT-CIKLUSCO 2NADHOxidatív foszforilációATP NAD +O 2H 2 OOXIDÁCIÓ14

MODELL-SZERVEZETEKIdőrendi szempontból a Föld felszínén megjelenő élő világ első képviselőiként a reduikálókörnyezetben megjelenő ősbaktériumok népes tábora említendő. Felfedezésük sokat váratottmagára (a 70-es évek), mert e szigorúan anaerob lények életben tartása csupán a létrejöttükidején uralkodó környezeti viszonyok között lehetséges.A Methanococcaceae családba sorolt mozgékony, anaerob Methanococcus fajok hidrogént ésszéndioxidot hasznosítanak, 85 o C-on is életben maradnak, de csak 60 o C-on osztódnak. AMethanosarcinaceae család Methanosarcina fajai szennyvíziszapban és a bendőben fordulnakelő. Az elektronmikroszkópos felvételeken lemezes szerkezetűnek tűnő, savanyú természetű,merev szerkezetű — főleg galaktózamint, glükuronsavat és galaktózamino-uronsavat tartalmazó— heteropoliszacharid sejtfallal rendelkező Methanosarcina fajok Gram szerint pozitívanfestődnek. Mindkét családra jellemzően a pszeudomurein sejtfaluk külső felületét egy proteázzalnem bontható fehérjeréteg alkotja, amelyben a glükózamin is fontos szerepet tölt be.Legnagyobb sebességgel (2 nap generációs idő) széndioxidot és hidrogént tartalmazó közegbenosztódnak. Az acetátot foszfoacetil-transzferáz segítségével hasznosítják.Methanosarcina mazei mikrofotóNormarski optikával fotózvaScanning elektronmikroszkópos fotóMethanosarcina barkeriA Methanosarcina barkeri részletes enzimológiai vizsgálata igazolta, hogy ez esetben azα-ketoglutarát citromsavon keresztül képződik.15

Evolúciós szempontból nem kétséges, hogy első élőlényként a sejtfal nélküli ősbaktériumokjelenhettek meg a Föld felszínét borító tenger redukáló légköre által meghatározott fizikaikémiaikörülmények között. A típustörzsnek tekintett Thermoplasma acidophilum (ATCC25905) első példányát Darland és munkatársai l970-ben izolálták. Evolúciós szempontból talánaz első őslények ma is élő kései leszármazottjait tisztelhetjük bennük. Élő kövületek. Többekközött szénbányák meddőhányóiból is könnyen izolálhatók ilyen törzsek.Valódi sejtfaluk nincs. A sejtjeik beltartalmát egy ellenálló, 5-10 nm vastag 20 és 40szénatomból felépülő bifitanil-étereket, glikoproteint és lipopoliszacharidot (mannóz 24 -glükózglicerindiéter) tartalmazó membrán határolja el a külső környezettől. Ostoros mozgásraképesek. Gram-negatív festődésű fakultatív aerobok. A DNS-láncaikat hisztonszerű bázikusfehérjék veszik körül.0,5 µmThermoplasma acidophilumKromoszómaméretük a prokarióták között a legkisebb (

A legrégebben vizsgált szervezet a fakultatív anaerob Bacillus coli ( a vastasgbél; colon-rólelnevezett) baktérium K-12 variansa, amely később Escherich német mikrobiológusraemlékezve nyerte nevét. Ez a mikroszervezet a huszadik század biológiai forradalmának kísérletialanyaként mind a mai napig a géntechnológiai eredmények gyakorlati kimunkálásánaklehetőségét hordozza. Az eredeti törzs minimál táptalajon tenyésztve, oxigén jelenlétében, illetveoxigénmentes körülmények között is képes a szervezete felépítéséhez szűkséges összesépítőelem (szerves vegyületek, vitaminok) maradéktalan előállítására, ami azt jelenti, hogy aköztes anyagcsere reakciómechanizmusának felderítése, a bonyolult összefüggések felismerésecsupán szorgalom függvénye. Nem véletlen, hogy a géntechnológia művelői ezen a szervezetenvégezték fejlesztő munkájukat.Gram negatív baktérium elektronmikroszkóppalkészült felvétele, továbbá tokkal és tok anélnélkül bemutatott vázlatos rajza.A törzs különösen hasznos tulajdonsága a temperált (λ) fágérzékenysége. A fertilitási plazmidfunkciójának a felismerése, majd a Hfr variáns előállítása a kromoszóma térképezés egyszerűlehetőségét adta a kutatók kezébe. A Science 1997 szeptember 5-én megjelent 277-es füzet1453-62 oldalán Frederick R. Blattner és mumkatársai a törzs teljes genomjának szekvenciájátközölték. A 4.639.221 bázispár pontos helyzetét bemutató térkép 4288 fehérjét kodoló génttartalmaz. A genom több IS elemet és több olyan szakaszt tartalmaz, amely a horizontálisgénátvitelt lehetővé teszi. — A legnagyobb géncsaládot a transzport fehérjék génjei, továbbá areplikációban szerepet játszó, rekombinációs folyamatokban szereplő gének képviselik. Ezekközül másfélszáz szabályozási feladatot lát el; 200-nál több sejtszerkezeti elemnek tekinthető;több mint 400 transzport feladatot teljesít; 243 az energia metabolizmus szokgálatában áll; 68 anukleinsav metabolizmus, 131 pedig az aminosav-metabolizmus jól ismert szereplője; 46 alipidanyagcsere, 130 a szénkatabolizmus; 188 pedig a központi anyagcsere eddig megismertenzimeivel azonosítható. A többi fehérje feladatát inkább valószínüsíteni lehet; csupán 1632molekula, a gének 38%-ának a funkciója volt ismeretlen. A géntérképet bemutató jóláttekinthető színes ábra az összehasonlíthatóság könnyítése céljából néhány már előbb közzétettgenom szekvenciáját is bemutatja.—Haemophilus influenzae, (R.D.Fleischmann et al. Science 1995; 269:496 )—Synechocystis sp.,PCC 6803 (T. Kaneko et al. DNA Res. 1996; 3:109—Mycoplasma genitalium (C. M. Fraser et al. Science 1995; 270:397)—Mycoplasma pneumoniae (R. Himmelreich et al. Nucleic Acids Res 1996; 24:4420)—Methanococcus jannaschii (C. J. Bult et al. Science 1996; 273:1058)—Saccharomyces cerevisiae (A. Goffeau et al. Science 1996; 274:546)17

A konjugáció lehetőségének az igazolása, magyarázatot adott a haploid prokariótákgenetikailag meghatározott tulajdonságainak változatlan formában való fennmaradására aspontán bekövetkező mutációk ellenére. (Sexpilus képződés az eubactériumoknál,Escherichia coli F-faktor hatására.)Általában a baktériumokban a DNStartalom0,5-2%-a fordul elő episzómáliselemként. Az első plazmid, amitazonosítottak az Escherichia coli 100 kbméretű szexfaktora, másnéven F faktor(fertility factor), amely a mikrobakonjugáló képességét hordozza. ALederberg és Tatum által felfedezett, abaktériumsejt konjugációját létrehívóF-faktor kb. 60 fehérje molekulát kódol.F-plazmidhoz kötött a szexpilus képződéseés rendeltetésszerű működtetése. Aszexpilus képződése csak bevezeti afolyamatot, később ez a két konjugáló sejtmembránja közötti kapcsolattá fejlődik. Azinformáció átadása a kialakult plazmahídon keresztül történik. A teljes folyamat végbemeneteleesetén a donor tulajdonság is öröklődik. Ha a folyamatot megszakítjuk akkor csupán az átjutottgének vehetnek részt a biológiai folyamatban. Ez a tény a gének elhelyezkedésének vizsgálatáraad lehetőséget. Az információ átadása mindkét partnerben a DNS-polimeráz aktív működésétigényli. A szexfaktor irányításával kerül át az egyik szál a recipiens sejtbe, ahol a komplementerszál elkészül. A donor sejtben vissza maradó szál komplementer szála az információ átvitellelegyidejűleg készül. Az ábra a donor és recipiens konjugációs folyamatát mutatja az F faktorátvitele közben. Ez a faktor adott esetben képes egy vagy több tulajdonságot átjuttatni a donorsejtből a recipiensbe, mégpedig oly módon, hogy az F-faktor a gazdaszervezetkromoszómájába épülve, kilépéskor a donor kromoszómáját, vagy csak egy szakaszát ismagával viszi.Az F-plazmid géntérképe kb 100 gén jelenlétére utal. A plazmid tekintélyes részéntaláljuk a szexdukciót irányító szakaszt, összefoglaló néven tragéneket (transzfer), amelyek 3operonba szerveződve teljesítik feladatukat. A traA gén terméke a 13000 (M)tömegű primerfehérje. amelyről a traQ gén kódolta proteáz emészti le az 51 aminosavból álló szignálfehérjét.A visszamaradó, terminális amino csoportján acilezett globuláris fehérje — a 7 kDa tömegűpilin — egymáshoz kapcsolódva alkotja azt a spirálisan elhelyezkedő fehérje fonalat, amelyből adonor baktérium egy két sexpílusa szerveződik. A traA és traG közötti gének felelősek akapcsolat stabilitásáért a szexuális folyamat alatt. A DNS átvitelben a tragének elején traM éstraJ valamint a végén működő tra D, tra I és traZ gének terméke jeleskedik. Az ezutánelhelyezkedő (IS) inszerciós (integrációs) szekvenciák a kromoszómába ékelődés helyéthatározzák meg.oriT || M | J | Y | A | L | F | K | B | P | | V| | W/C || U | N || F || Q || H | G | | S | | T || D || I Z | IS |67_________________________________________________________________________________________________________100Az ábra a tra-gének elhelyezkedését mutatja a F-plazmid 67–100 koordinaták között.Az F + tulajdonság csak az esetben érvényesül, ha a teljes folyamat zavartalanul végbemegy, Arecipiens sejt ez esetben donorként működhet. A folyamat megszakítása az addig átkerült génekérvényesülésére ad lehetőséget.18

A plazmid kromoszómába épülését az úgynevezett IS elemek (integrációs szekvencia) jelenlétesegíti elő. Az F-faktoron levő két IS-elem az E. coli kromoszómán található 22 IS-elem valamelyikévelléphet kapcsolatba. A belépés és a kilépés helye természetesen változhat, amibőlkövetkezik, hogy a távozó plazmid különböző kromoszóma szakaszokat vihet magával. Az ISelemekmentén a plazmid mérete bármikor bővülhet újabb rezisztencia determinánsokkal, deugyanezen az úton el is veszíthet tulajdonságokat.A mutációval előállított Hfr (high frequency of recombination) sejtek nagy gyakorisággalkonjugálnak F − sejtekkel. Mechanikai hatás a konjugációs folyamatot megszakíthatja, és így amódszer a kromoszómán elhelyezkedő gének sorrendjének a meghatározására használható.xxxxxxxxxxxxxxxxxxA spórázó bacillus képviselőjeként a Bacillus subtilis, egy apatogén apró sejtes pálcika válikvizsgálódásunk tárgyává. Ez a mikroszervezet a kutató laboratóriumok kedvelt kísérleti alanya,mivel könnyen tenyészthető, DNS-készítményekkel jól transzformálható, lizozimmal nyertprotoplasztjaik polietilénglikol segítségével fuzionáltathatók. (Az első protoplasztfúziót Alföldiés munkatársai végezték a Szegedi Biológiai Központban.) Osztódáskor a sejtek nem mindigválnak szét, ezért gazdag táptalajon tenyésztve hosszabb-rövidebb fonalakat alkot. Spóraszuszpenziója csírázóképességét hosszú időn keresztül megőrzi. Biológiailag aktív anyagok(antibiotikumok) növekedést gátló hatásának a mérésére jól használható szervezet. Asporogénmutánsaikat ipari eljárásokban amiláz és proteáz termelésre használják.19

BIOMINERALIZÁCIÓ Betonba, habarcsba, kőzetrepredésekbe került baktériumspórákbólkialakuló tenyészet környezetében kialakuló karbonátkiválás, a kalcitkristály szerkezeteszorosan kapcsolódik az alapkőzethez. A szabadalmaztatott eljárás szerint Bacillus cereustenyészet használata esetén előnyös gombaszaporodást gátló hatóanyagot juttatni az elegybe.BAKTERIÁLIS KALCITKIVÁLÁSNANOBACTERIAHidroxiapatit kiválásA petricsészébetápanyagokban gazdag(húsleves) oldatot pipettázunkA tápközeggel ezután kálciumfoszfát ionokat rartaslmazóoldatot elegyítünkésNémi várakozás után apatitmellett fehérjét tartalmazóamorf részecskékmegjelenését észlelhetjükAz amorf hidroxi-apatit rögöka környezetben előfordulószerves molekulákatmagukba zárjákkristályok megjelenéserétegesen növekedveKésőbb jól észlelhetőenkristályosodási folyamat indulés számtalan tűkristály borítjaa gömbszerűfehérje-hidroxiapatitrészecskéket.Végül a kristály szetkezetösszeomolva sziromszerűfelülettel rendelkező gömbökformájában stabilizálódvaborítja a petri csésze aljátfehérje-hidroxiapatitA témában megjelent közlésekNanobacteria elnevezésselE. Olavi Kajander and Neva Ciftcioglu —Nanobacteria: An Alternative Mechanism for Pathogenic Intra andExtracellular Calcification and Stone Formation PNAS Vol.95.No.14.8274-8279 1998 06 07Jan Martel and John Ding-E. Young —Purported Nanobacteria in Human Blood as Calcium Carbonate PNASVol.105. No.14. 5549-5554 2008 Ápril 8John D. Young et al. —Putative Nanobacteria Represent Physiological Remnants and Culture By-products ofNormal Calcium Homeostasis — PLoS ONE Vol.4.No2. e4417 2009 02 09John D. Young et al. —Characterization of Granulations of Calcium and Apatite in Serum as PleomorphicMineralo-Protein Complexes and as Precursors of Putative Nanobacteria PLoS ONE Vol.4.No.5. e5421 2009May 120

A fonalas prokarióták közül az Actinomycetales rend nevezetes törzsei kerülnek vizsgálatra.Több mint száz éve ismerik sugárgomba néven ezeket a baktérium- és „gomba”-tulajdonságokatmagukban egyesítő mikroszkopikus talajlakókat. A csoport neve az ακτινος sugár ésµυκος gomba szavak összetétele. A nyári zivatarok után érezhető jellegzetes talajillat tőlük ered.Egységes jellemzésük sokalakúságuk miatt nem könnyű feladat. A rend Gram-pozitívan festődő,morfológiai alapon megkülönböztethető családjai a Micrococcus nemzetségtől az elágazófonalas szerkezetű, differenciált telepet képező Streptoverticillium fajokig változatos képetmutatnak. DNS-tartalmukban a G+C mennyisége 55 % felett van. Sejtfalszerkezetük azonosságamellett lipidtartalmuk is hasonló. Filogenetikai kapcsolatukat a nukleinsav-hibridizációskísérletek és a 16S rRNS azonosságuk igazolja. Nagy morfológiai változatosságuk, színestelepeik, valamint a környezetbe kiválasztott színanyagaik változatossága miatt a törzsekelkülönítésére csak azonos körülmények között végzett párhuzamos kísérletek eredményeitértékelve vállalkozhatunk, mert az irodalmi adatok összehasonlítása sokszor szabadalmi okokmiatt félrevezető. Spóraképzésük a szaporodást szolgálja. Hőtűrő tartós spórát csak a Thermoactinomycesnemzetség tagjai fejlesztenek.Részletes megismerésüket indokolja a változatos morfológiájuk, differenciálódási jelenségeik, akörnyezetre gyakorolt hatásuk, az ipari alkalmazhatóságuk és ezzel összefüggő bonyolultanszabályozott anyagcsere hálózatuk. A DNS replikációt ritkán követi válaszfal képződés. Ebbőlkövetkezik a látszólag “többmagvú” prokarióta jellegük, A fonalak elágazása azonban mindigszeptum közelében indul növekedésnek. Az elágazó fonal csúcsi részében intenziv azanyagcsere. A növekedő szakasz mögötti szubapikális régióban folyó replikációt nem követi aválaszfal képződés. Lineáris szerkezetű kromoszomájuk feltűnően nagy 8Mb. (8x10 5 bázispár!)Eukarióták közül az élesztők, a fonalasgombák közül az Aspergillus nidulansés a Rhizopus nigricans lehetvizsgálatunk tárgya. (Részletesebbtájékozódás céljából ajánlható a„Gombák birodalma” címűtanügyi segédlet tanulmányozása.)21

A MIKROVILÁG FELFEDEZÉSEA gondolkodó elme a mikrovilág létére a környezetre kifejtett hatásából következtethetett. —Marcus Terentius Varro (Kr.E. ll6-30) Disciplinarum libri novem című enciklopedikusmunkájában azt írja, hogy a száj- és orrnyíláson keresztül különböző olyan láthatatlan állatkákjutnak az emberbe, amelyek elszaporodva betegséget okozhatnak. —A kórokozó elemi részecske gondolata megjelenik— a kortársai szerint őrült költő — Titus LucretiusCarus (Kr.E. 96-55) De rerum natura címűhaténekes, filozofikus költeményében. Az őatomisztikus természetfelfogásából következőenbetegséget okozó magokról, csírákról ír (ahogyan amagról kelt növény kifejlődik, úgy terjed fokrólfokra a betegség). Az elméleti sejtés természettudományosigazolására az idő tájt gondolni semlehetett, hiszen nem voltak meg a kísérletező munkatechnikai feltételei, a mikrovilág megismeréséreszolgáló eszközök. Jellemző, hogy a latin műveltségetfelejtő középkorban a misztifikált, görög eredetű(µιαινω) miazma névvel illették a járványosanterjedő megbetegedés láthatalan kórokozóit.A prokarióták mikroszkópos vizsgálatárólszóló első írásos dokumentumnak — a mikrovilágAnton van Leeuwenhoek (1632-1723)morfológiai diverzitásáról szóló első híradásnak —a Delftben élő posztókereskedőnek, Anton vanLeeuwenhoek-nak (1632-1723) a Philosophical Transaction of the Royal Society ofLondon-hoz küldött levelét tekinthetjük. Az alant idézett, 1683. szeptember 17-én írott levelébena környezetében létező kisméretű élőlényekről számol be a Proceedings of the Royal Societykiadványban.Dear Sir,I took this stuff out of the hollows in the roots, and mixed it with clean rainwater, and setit before the magnifying-glass so as to see if there were as many living creatures in it as I hadaforetime discovered in such material: and I must confess that the whole stuff seemed to me tobe alive. But notwithstanding the number of these animalcules was so extraordinarily great(though they were so little withal, that 't would take a thousand million of some of 'em to makeup the bulk of a coarse sand-grain, and though several thousands were aswimming in a quantityof water that was no bigger than a coarse sand-grain is), yet their number appeared evengreater than it really was: because the animalcules, with their strong swimming through thewater, put many little particles which had no life in them into a like motion, so that many peoplemight well have taken these particles for living creatures too.Leveléhez a látott élőlények leírásán kívül (hosszú és rövid pálcák, kokkuszok, spirillumok)azok rajzát is mellékeli, sőt egyes példányok mozgékonyságáról is említést tesz. Ezt megelőzőlegis levelezésben állt a Londonban működő társasággal, beszámolva a növényeken végzettmikromorfológiai észleléseiről. (Megfigyeléseit saját készítésű, 300-szoros nagyítású egylencsés22

mikroszkópjával végezte.) Majd később udvariasan kérdezi a bölcsek tanácsát: I have hadseveral gentlewomen in my house, who were keen on seeing the little eels in vinegar, but some ofthem were so disgusted at the spectacle, that they vowed they'd never use vinegar again. Butwhat if one should tell such people in the future that there are more animals living in the scumon the teeth in a man's mouth, than there are men in a whole kingdom?Ezt megelőzőleg Athanasius Kircher (1602-1680) saját mikroszkópos vizsgálatai alapjána mikrobákat vélte a járványos megbetegedések okozóinak. A kortárs szakmai közvéleményazonban ezt a megállapítását nem vette tudomásul. — Száz év múlva Carolus Linnaeus(1707-1778, Linné Károly) svéd orvos 1767-ben megjelent művében hat fajba csoportosítva aChaos osztályhoz sorolja az akkor ismert mikrobákat. — Christian Gottfried Ehrenberg(l795-l876) berlini egyetemi tanár az 1836-ban írt Die Infusionstierchen als vollkommeneOrganismen című alapvető munkája és az 1838-ban kiadott Atlas már a mikrovilág 600 tipusátábrázolja. Az élet ilyen egyszerű formáinak a felfedezése ezeknek a lényeknek az eredetét ismegválaszolandó kérdéssé emelte. A növények és az állatok spontán képződése fel sem merülta gondolkodókban. A mikrovilág abiogenezise, spontán képződése azonban számos hirdetőretalált. Mások, közöttük Leeuwenhoek is úgy vélték, hogy a levegőbe jelenlevő láthatatlanmisztifikált csírákból sarjad az élő mikrovilág. Francesco Redi fiziológus 1665-ben megállapítja,hogy a húsban megjelenő lárvák a légy petéiből képződnek. Finom gézzel elválasztva a nyershúst a környezettől, a lárvák nem jelennek meg. Lazzaro Spallanzani (1729-1799) kisérleteihiába bizonyították az ősnemződés tarthatatlanságát, a változás csak a 19-ik század másodikfelében következett be. Friedrich Kützing 1837-ben megállapítja, hogy az ecetsav élő szervezethatására képződik. Már működött az első sörgyár Európában Csehországban (indult 1842-ben),amikor még a mikrobák szerepét olyan tekintélyek, mint báró Jöns Jacob Berzelius (1779-1848),a Svéd Tudományos Akadémia elnöke, báró Justus Liebig (1803-1873) giesseni egyetemi tanárés Friedrich Wöchler (1800-1882) göttingeni egyetemi tanár egyértelműen tagadták. SőtCagniard de Latour és Theodor Schwann (1810-1882) 1837-ban közölt megfigyeléseit — amelyszerint fermentáció közben mikroszkóppal látható gömbalakú képződmények (élesztők)szaporodnak fel — karikatúrával ékesített pamfletben gúnyolták. A gyakorlati szakembereketazonban nem lehetett elhalgattatni. Végül Louis Pasteur (1822. december 27.- 1895. szeptember28.) tekintélye és szakmai sikerei, valamint szisztematikus kísérletező stílusa tudta csakelfogadtatni – húsz év múlva – a szakmai közvéleménnyel a fermentációs folyamatok mikrobiálisjellegét. A Strasbourgban kémiát tanító Pasteur a borkősav forgatóképességét vizsgálvafelfedezi a molekuláris aszimmetria jelenségét, megállapítva, hogy az élő szervezet a környezetkémiai változását okozza. Az Ecole normale superior igazgatójaként a Memoire sur lafermentation lactique című munkájában sikerült bizonyítani az alkoholos és tejsavas erjedésbenaz élesztők és a tejsavbaktériumok szerepét. Az aerob és anaerob létforma felismerése is Pasteurnevéhez fűződik. Megállapítja, hogy a baktériumok egy csoportjában a vajsavas erjedésmegszűnik a légköri oxigén hatására (Pasteur effektus)A nagy ellenfél, Justus Liebig számára ezek a bizonyítékok sem voltak kielégítőek.Kétségbe vonta Pasteur állítását, aki 1864-ben a pasztőrözés (56 o C/30 perc) technológiájánakkidolgozásával az ősnemződés elméletétől is megtisztította a természettudományt.(Megjegyzendő, hogy a pasztőrözés technikáját a fertőződés megakadályozására először1861-ben Preisz Móricz magyar biológus használta.) Az ősnemződés elmélete évtizedekigmakacsul megtapadt a fejekben annak ellenére, hogy a sterilitás fogalmával már LazarroSpallanzani (1729-1799) olasz természetbúvár kísérletei a XVIII században megismertették akortársakat. Schröder és van Dusch 1854-ben vatta dugó használatával akadályozzák a sterilezetttáptalaj fertőződését, 1860-ban pedig Sir Joseph Lister (1827-1912) Semmelweis munkájátolvasva az aszeptikus sebészeti gyakorlat kialakítását követeli.23

A MIKROVILÁG SZEREPE AZ ÉLŐVILÁG KIALAKULÁSÁBANA természet fejlődésében a mikroorganizmusok szerepe döntő jelentőségű. Egyedeiknagy száma, gyors szaporodásuk, haploid mivoltukból adódó változékonyságuk alkalmassá tetteőket arra, hogy évmilliárdok alatt az alapvető biokémiai folyamatok, a bennük működőenzimrendszerek összehangolt működése, szabályozottsága kicsiszolódjon. Évmilliárdok alattolyan géngyűjtemény alakult ki bennük, amely lehetőséget teremtett a magasabb rendűszervezetek kialakulására.A mikrovilág mint szelektív ágens (fertőző kórokozó) szerepet kapott a magasabb rendűszervezetek egyre tökéletesebb formáinak kialakításában is. A mikrobák szelekciós hatásátmutatja, hogy száz évvel ezelőtt a fiatalok alig 50 %-a érte el a pubertás kort. Erre talán csakmost döbbenünk rá, amikor több-kevesebb sikerrel mentesítjük magunkat a környezeti tényezőkszelekciós hatása alól. Az egészségesebb életmód, a vakcináció és az antibiotikumokhasználatának terjedésével csökkent a gyermekhalandóság. Határozottan növekedett az átlagéletkor,csökkent viszont a humánpopuláció ellenállóképessége. Ez természetesen érthető, hiszennem várható el a magunk által épített piedesztálra emelt EMBER-től, hogy ne saját rövidreszabott, egyszer megélhető életét tekintse a legfontosabbnak.Az emberi civilizációban, a mindennapi életünkben is jelentős szerepet töltöttek be amikroorganizmusok, de jelentőségük az elkövetkező időben a jelek szerint még nőni fog.Környezetünk elszennyeződésével kapcsolatos problémáink felszámolásában is segítségetkaphatunk a mikrobáktól, de csak segítséget. Az emberi civilizáció, illetve civilizálatlanságolyan gátlástalanul avatkozik be az őt környező élettérbe, amire a természet nem készült fel.Az ősi élelmiszergazdaság is hasznosította a mikrobák biokémiai aktivitását, nohalétezésükről vajmi keveset sejtettek. Az élelmiszertartósítás, a savanyítás, a tejtermékek, akenyér és a húskészítmények, valamint az alkoholos erjesztéssel nyerhető termékek előállításáraszolgáló ősi biotechnológiai folyamatok kimunkálása a biblikus idők ködébe vész. Négy-ötezeréves egyiptomi és mezopotámiai írásos emlékek, többek között a sörfőzés és az ecetkészítés mais érvényes technológiai lépéseit ismertetik. A mikrobiális fiziológia fejlődését éppen ezeknek azősi technológiáknak a nagyipari gyakorlatba vétele igényelte. Bajorországban az írásos adatokszerint az apáról fiúra szálló technológiai lépések szigorú szabályait betartva már a nyolcadikszázadban működtek sörházak. Az első sörgyár Európában Csehországban indult 1842-ben.Pasteur munkássága nagy lökést adva felgyorsította az ipari jellegű mikrobiológiaikutatást. A profitra törekvő ipari vezetők nem sajnálták a kutatásra adott anyagi támogatást, mertsaját tapasztalataik szerint az ipari jellegű kutatási eredmények gyakorlati alkalmazásakor bővenmegtérül a befektetett tőke.A századforduló körül már számosszervesvegyipari alapanyag (butanol,aceton, tejsav, stb.) előállítására születettgazdaságos fermentációs eljárás. Aklasszikus megfogalmazás szerint„fermentáció” alatt az erjedést, azanaerob körülmények közöttmegvalósuló folyamatot értik. Alevegőztetett reaktorok iparialkalmazása a második világháborúután, a penicillin-termelés nagyiparimegvalósításával kezdődött. A fejlődésazóta töretlen, sőt a molekulárisbiológiai felfedezések gyakorlatba vételeúj fellendülést hoz.24

Az élet megjelenése a Föld felszínénévA BIOSZFÉRA KIALAKULÁSA (logaritmikus időtengelyen ábrázolva)5x10 9 __redukáló légkör H 2 N 2 CO 2 CH 4 _________________________________________ARCHAIKUM4x10 9 az atomok evolúciójakémiai evolúció3x10 9 ős anaerob prokariota megjelenése PRE-KAMBRIUManaerob fotoszintetizálók megjelenése2x10 9fotoszintetizáló cianobaktériumok megjelenéseoxigén megjelenése a légkörben1x10 9 .eukarióta algák megjelenésesoksejtű növényekKAMBRIUMORDOVICIUM5x10 8SZILURprototaxitok. szárazföldi növényekDEVONgerincesek KARBONkétéltűek PERMhüllők TRIÁSZemlősökJURAmadarakKRÉTA1x10 8 ______________________________________________________________________5x10 7főemlősökPALEOCÉNEOCÉNOLIGOCÉN2x10 71x10 7 __________________________________________________________________MIOCÉN5x10 6AustralopithecusPLIOCÉN2x10 6PLEISZTOCÉNHomo erectus1x10 6 ___________________________________________________________________________Homo sapiensA mikroorganizmusok között találjuk az élet ősi formáinak ma is létező emlékeit. A magasabbrendű élet kialakulása szempontjából szerepük és érdemeik vitathatatlanok. Nemcsak a magasabbrendűéletlehetőségek megteremtőiként emlegetjük őket, de tevékenységük az életfenntartásában, a környezet szüntelen megújításában is pótolhatatlan. Az élővilágbanáltalánosan elterjedt anyagcsererendszerek optimális szabályozottsága a külső hatásokkalszembeni toleranciát alapozta. Az állandóságra törekvés és a változékonyság ellentététötvözve, a mikrovilág az evolúció érvényesülésével, az elért fejlődés eredményeit rögzíti azörökítő anyagban. A prokarióták szaporasága és rövid egyedi életük, valamint a haploidörökítőanyag-készletük a létért folytatott küzdelemben a génállomány folyamatos, viszonylag25

gyors tökéletesedésére ad lehetőséget ma is. A később megjelenő magasabb rendű lényeknek,az eukariótáknak és metazoáknak volt miből válogatni.GOMBÁK megjelenésexxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx26

A Föld légkörének összetételében bekövetkező változás a fizikai-kémiai körülményekalakulásával magyarázható, később azonban az élő szervezetek környezetalakító hatása jelentősszerepet játszott. Így a légkör nitrogéntartalmát a mikrobák kötik évmilliárdok óta. Csak azutóbbi évtizedek profit-termelő mezőgazdasága számára dolgozó nagyipari nitrogénkötésváltoztatott a helyzeten. A műtrágyagyárak által kémiailag kötött nitrogén mennyisége mármeghaladja a földfelszín élővilágának nitrogénkötő képességét. Ebből következik, hogy azegyensúly helyreállítása érdekében célszerűen olyan biotechnológiai módszer kifejlesztésévelkellene foglalkozni, amely a környezetünk elnitrátosodását visszafordítja.Szénhidrogén-képződésAz anaerob körülmények között a mineralizációcsökkent mértékű. Az ősbaktériumokban a CO 2elektronakceptorként szerepelhet. Előtérbe kerül ametán, a kőolaj és földgáz felhalmozódása. Aredukált kofaktorok (NADH, NADPH)regenerálásának legelőnyösebb útja ugyanis azsírsav-képzés. A zsírsav dekarboxileződve alifásszénhidrogénekké alakulhat.Az aerob élettér kialakításaA földfelszínt borító vízmennyiség évmilliók ótaviszonylag elviselhető életkörülményeket biztosít aként elektronakceptorként hasznosító élőlények számára. A mikrovilág arra alkalmas fajai afelszíntől a több ezer méteres mélységig benépesítik ezt az életteret. Évmilliárdok teltek el, amíga Földtörténet őskorában az oxigénmentes légkört a maihoz hasonló összetételűvé alakította aFöldfelszínt benépesítő mikrobatömeg. — Kezdetben a fényenergiát hasznosítva vizet bontó ősprokarióta,a szigorúan anaerob szervezetek számára mérgező anyagcseretermékként megjelenőoxigént a környezetébe választotta ki. A fotokémiai úton termelt mikrobiális eredetű oxigén mais döntő jelentőségű a Földfelszíni oxigénszint alakulásában. Több száz millió éven keresztül aképződő oxigén nem dúsult fel a légkörben, csak miután az őstenger ferrovas-pufferkapacitásakimerült. A folyamatosan képződő ferrivas ugyanis hidratált ferrioxidok alakjában kicsapódottés a szilikátokkal együtt a tenger fenekén vastag üledékként rozsdaszínű réteget alkotva halmozódottfel. Csak a ferrovas-ionok eloxidálása után jelenhetett meg az oxigén a légkörben. Apufferkapacitást kimerítő több száz millió év elegendő volt az aerob anyagcseréhezalkalmazkodni képes ős-szervezetek kiválogatódására.Talajképződés A múlt század végén Sergius Winogradsky (1856-1953) és Martinus WillemBeijerinck (1851-1931) által elindított talajmikrobiológiai kutatások eredményei egyértelműenbizonyítják a mikrobák jelentős szerepét a humuszképződésben, a termőtalaj kialakulásában.Nélkülük aligha jelent volna meg a növényvilág. Sőt a mai intenzív mezőgazdasági kultúra isszámít a mikrovilág biokémiai aktivitására. A növények gyökerei körül, a rizoszférában olyanmikrobaközösségek élnek, amelyek egymást segítve előnyösen hatnak a tápanyagfelvételre, agazdanövény fejlődésére. Ezt a modern mezőgazdaság is kihasználja, amikor a vetőmagot vetéselőtt a megfelelő mikrobatenyészettel kezeli.27

A szén körforgalma és a napenergia hasznosítása A Föld szénkészletének legnagyobb részema a földkéreg üledékes kőzeteiben található. Ez a szénkészlet a mikrobák számára gyakorlatilaghozzáférhetetlen. Ugyancsak csekély mértékben kerül mikrobiális hasznosításra azévmilliók alatt felhalmozódott szénhidrogén (kőszén, lignit, földgáz és kőolaj). A szén biológiaikörforgalmában ma a légkörben és a vizekben, valamint az élővilágban átmenetileg megkötöttszén vesz részt. A fotoszíntézis, a szén-dioxid anaerob és aerob megkötése valamint a mikrobákmineralizációs aktivitása (a szerves anyag szervetlen formába alakítása) gyakorlatilagkiegyenlítő hatású.A SZÉN KÖRFORGALMA A TERMÉSZETBEN\/a légkör szén-dioxid-tartalma

A MIKROSZERVEZET ÉS KÖRNYEZETE KÖZÖTTI KAPCSOLATA földtörténet évmilliárdjain keresztül az anyag és az energia szüntelen körforgásában alegeredményesebb munkát — a biocönózis aktív tagjaiként — a biotóppal egységet képezőönszabályozott rendszerek, a mikroszervezetek végezték. A vis vitalis, az életerő hajtotta élniakarás minden akadályt legyőző kényszere mindenkor megtalálja a lehető leggazdaságosabbtúlélést szolgáló utat, ha ebbéli igyekezetét nem akadályozzuk meg szándékosan, vagytudatlanságból. A ma célul magunk elé tűzött hulladékmentes termelés a természetben már megvalósult.Minden természetes anyag, természeti képződmény, valamely mikroba számáraéletteret jelent. A természetes anyagok felhasználásában, az élettérért vívott küzdelem szelekciósnyomása alatt az a szervezet győz, amelyik a leggazdaságosabban hajtja végre a feladatot.A rideg tények ismertetése előtt kíséreljük meg leírni a környezetet, ahol az első élőszervezetek kialakulhattak. A leírás alapját képezik azok az ismeretek, amelyeket a szélsőségestermészeti környezetben ma is élő mikroorganizmusok életfeltételeiből visszakövetkeztethetünk.Az ősi légkörben 3-4 milliárd évvel ezelőtt csak nyomokban fordult elő a fotodisszociációhatására megjelenő szabad oxigén. Tekintélyes mennyiségű vízgőz, széndioxid, hidrogén,nitrogén, ammónia, metán alkotta a Földfelszín redukáló tulajdonságú gázköpenyét, amely atektonikus eredetű kigázosodás (exhaláció) eredményeként jelent meg. Ilyen gázosodás ma isfolyik. Példaként szolgálhat a hawaii kigázosodás összetétele: 71,0 % víz, 14,0 % szén-dioxid,8,4 % S, SO 2 , SO 3 , 5,4 % nitrogén, 0,3 % hidrogén, 0,2 % argon, csekély sósav, hidrogénfluorid,kénhidrogén, ammónia, metán.Földünk felszínét évmilliárdok óta tenger borítja. Az archaikus időkben a szárazulatokszilárduló rétege 30 km vastag volt a mai 45 km helyett. A 4 milliárd éves üledékképződésigazolja, hogy a földfelszínt borító tenger lassan lehült. A vízgőz ugyanis eltávozott volna alégkörből. A legprimitívebb élő sejt környezetét az előző évmilliók abiotikus körülményei közöttképződött szerves (protenoid) és szervetlen vegyületek vizes oldata, szuszpenziója, illetveemulziója alkotta. Ilyen körülmények között olyan obligát anaerob heterotróf szervezetek(progenota) alakulhattak ki, amelyek a szén-dioxid redukciójával metánt, a hidrogén bontásávalelektront, az oxidált kén redukciójával kénhidrogént termeltek, a szén-dioxidból képesek voltakszénvázukat felépíteni, továbbá az ammónia, illetve a légköri nitrogén hasznosítására alkalmasenzimekkel is rendelkeztek.Ezek az ősi szervezetek jól működő RNS-, illetve DNS-helyreigazító rendszerkifejlesztésére kényszerültek, mert ez idő tájt a felső légrétegből hiányzott az ózonpajzs, amely aDNS-t károsító ultraibolya sugarak zömét ma elnyeli. Ez a törzsfejlődés szempontjából talánelőnyös is volt, mert az erős UV-sugárzás a mutációk számát növelte.A kialakuló prokrióta csoport porfirinek szintézisére alkalmas szervezetei között későbbmegjelentek az anaerob fotoszintetizálók, amelyek közül egyesek a felszaporodott hidrogénszulfidhasznosítására szakosodva nyerték a reduktív folyamatokhoz szükséges elektront.Évmilliókkal később jelenhetett meg az a kékeszöld mikroszervezet (cianobaktérium), amelyikaz elektront a víz bontásával biztosította magának, miközben a számára mérgező oxigéntkiválasztotta a környezetébe. Az őstengerben az anaerobok számára toxikus beoldódott oxigénévmilliókon keresztül a savanyú tengervízben oldott férro ionokat oxidálta. A képződött ferriionok pedig a tengeri üledék vasoxid tartalmát növelték. Az őstenger redukáló pufferkapacitásánaka kimerülése után az egyre nagyobb mennyiségben képződő, de a meleg vízben aligoldódó oxigén a légkörbe került. A tengervíz vastartalmának csökkenését ellensúlyozandómegjelentek az esszenciális vas felvételét segítő sziderofórok. — A hőmérséklet csökkenésével anövekedő oxigéntenzió új, aerob eubaktériumok kialakulását tette lehetővé. A mikrovilág azontagjai élték túl az oxidativ stressz pusztító hatását, amelyek olyan védekező mechanizmustfejlesztettek ki, amely segítségével a sejten belül fenn tudták tartani a redukáló körülményeket.29

Sőt az oxigént elektron akceptorként használva ezek a szervezetek élettani előnyt élvezvegazdaságosabban, jobb hatásfokkal létezve vezető szerephez jutottak.A kiszoruló ős anaerob szervezetek közül egyesek úgy tudtak tovább létezni, ha kisebbméretű, aerob anyagcserével rendelkező szervezeteket kebeleztek be. Az új körülményekhezalkalmazkodó ősbaktériumok a sejtmagot tartalmazó asszociátum felé mozdulva a gombák, illetveaz állatvilág felé vezető utat nyithatták meg. Ez az eredetileg anaerob őslény egy ős kékalgabekebelezésével a fotoszintetizáló lényeket is szolgálatába állíthatta, és ezzel az ősnövényirányába megtette az első lépést. — Természetesen ezen őslényekkel ma már nemtalálkozhatunk, csak a belőlük kialakult fajok kései leszármazottaival. Ezek a leszármazottakazonban genotípusukban, anyagcsererendszerükben élő kövületként a mai napig őrzik aFöldtörténet őskorában uralkodó életkörülmények lenyomatát, a létért folytatott küzdelembiokémiai emlékeit.A legidősebb, Dél-Afrikából származó üledékes kőzet, amelyben kétségtelenülkimutatható a fosszilis baktériumok jelenléte 3200 millió éves. Az Eubacterium isolatum-nak elnevezettmikroszervezet 0,75 µm hosszú, 0,25 µm átmérőjű pálcika, 0,015 µm vastag sejtfallal.Lehetséges, hogy az ősbaktériumok képviselője, valamely heterotróf anaerob élőlény számára akörnyezetben előforduló szerves és szervetlen vegyületek szolgáltak anyag- és energiaforrásként.— A Barberton-hegységből származó, valamivel fiatalabb kőzetekből Archeospheroidesbarbertonensis névvel jelölt kékmoszatok előfordulását is igazolták. Feltételezhető, hogy abennük előforduló fotoszintetizáló pigment a magasabb rendű aerob élet évmilliókkal későbbimegjelenéséhez teremtette meg az életfeltételeket. Ezen őslények mai leszármazottai arrólnevezetesek, hogy a legszélsőségesebb körülmények között is jól fejlődnek. Szélsőségesen sósszikes tavak, vagy a 93 o C-os sós termálvíz egyformán alkalmas élőhely számukra. — AzOntario államból származó, lényegesen fiatalabb üledékes kőzetekben (argon:kálium arányalapján 2360 millió évesnek tartják őket) már változatos formában, fonalas mikroszervezetek istalálhatók. Megjelennek az autotróf baktériumok, a különböző fémeket oxidáló szervezetek. Azidő előrehaladtával jelentős számban fordulnak elő az algák. Bizonyíthatóan a ma is élő fajokrokonait (Paleorivularia ontarica) találták meg közöttük.A harmadik fejlődési állapotot — a baktériumok és a cianobaktériumok (kékmoszatok)mellett a valódi zöld algák előfordulását — az alig 1000 millió éves ausztráliai kőzetekrögzítették. Ebből a leletből származik az első sejtosztódást bizonyító anyag. Megjelenik asejtmag! — A következő lépés a szárazföld meghódítása. Csenevész fotoszintetizáló (se levél, segyökér) növényfélék mellett megjelennek a nagy méretű, növényi maradékot hasznosítóprototaxitok (gombafélék). Az előbbinél fiatalabb kőzetekben már megjelennek a gombákkülönböző alakjai, a valódi sejtmaggal, kettős kromoszóma készlettel rendelkező eukarioták ésezzel együtt a szexuális szaporodás lehetősége, ami a törzsfejlődés felgyorsulására vezetve utatnyitott az élet kiteljesedése felé. — Tetszetős elmélet magyarázza a magasabb rendű szervezetkialakulásában a szimbiózis, a szoros együttélés, az egymásrautaltság szerepét. Jól ismertjelenség, hogy az egysejtű élőlények által elnyelt algák az élőlényen belül is folytatjákfotoszintetizáló tevékenységüket. Közismert, hogy a zuzmókban az algákkal együtt élő gombáka gazdanövény nélkül életképtelenek. Ehhez hasonló folyamatok a törzsfejlődés folyamán isvégbemehettek. Így kerülhettek az anaerob ősbaktériumba az energia szolgáltató szervecskék: afotoszintetizáló kloroplasztok és a terminális oxidációt végző mitokondriumok ősei. Ezek avalamikor önálló, életképes szervezetek évmilliók alatt a gazda belső viszonyaihoz alkalmazkodvaelvesztették az önálló lét feltételeit.30

A MIKROORGANIZMUS ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSEA mikroorganizmusok természetes környezetükben, azzal ökológiai egységet képezve léteznekévmilliók óta. Jellemző tulajdonságaik meghatározása céljából innen kell őket olyankörnyezetbe áthelyezni, amely életben maradásukat biztosítja. Első feladatként életbenmaradásukat biztosító, meghatározott fizikai és kémiai körülményeket alkalmazva, avizsgálandó egyedet tiszta tenyészetként (clon) kell elkülöníteni természetes élőhelyéről. Enneka feltételnek a teljesítése általában könnyen megoldható, mert a mikrobák többségének hálózatosfelépítésű anyagcsererendszere nagyfokú rugalmassággal, könnyen alkalmazkodik a változókörnyezeti körülményekhez. Az élet kezdeményeként megjelenő, a környezetétől magátmembránnal elhatároló, önreprodukáló egység, kezdetben sem volt elválasztható akörnyezetétől. Az élet megjelenése óta eltelt évmilliárdok alatt összegyűjtött és az egyedgenetikai állományában megőrzött információtömeg változatossága és jól szabályozottkifejeződése, a sokszor szélsőségesen változó életkörülmények ellenére is lehetővé teszi a környezetünkbenelőforduló mikroszervezetek életben maradását, néha tiszta tenyészet formájában.A mikrovilág egyedeinek a fennmaradását egyrészt az autarchiára törekvés, másrészt akörnyezethez való alkalmazkodás belső kényszerének az együttes jelenléte segíti. Ebben aküzdelemben az autarchiára törekvés mellett a túlélést, többek között extracelluláris enzimektermelésével, a környezet átalakítása segíti. Az élettér meghódítása közben a szaporodómikrobák szükségképpen találkoznak eltérő tulajdonságú egyedekkel. Ha az életfeltételekszempontjából nem különböznek lényegesen, akkor harmonikusan beilleszkednek immár közöséletterükbe. Ellenkező esetben a létért való küzdelem kegyetlen törvényei érvényesülnek. Atermészetes élőhely mikroba-közösségeinek összetételében tapasztalható jelentős eltérés abbóladódik, hogy a szelekciós nyomás alatt az adott körülményekhez legjobban alkalmazkodóegyedek válnak uralkodóvá. Fennmaradásuk a környezet hatásainak az elviselésére szolgálómechanizmusuk működőképességétől függ. A kiválasztódás szempontja a létért való küzdelemporondján minden esetben csak a gazdaságosság lehet. Az az egyed marad életben, amely azadott körülmények között a legkevesebb energia felhasználásával tudja fenntartani azéletműködését.Az élettér meghódítása nagymérvű specializálódással járhat. A gazdaszervezethez, vagya környezethez való szélsőséges alkalmazkodás lecsökkenti ugyan az élő szervezetrugalmasságát és tűrőképességét, de kárpótlásul az adott élettérben akár uralkodó fajként islétezhet. A specializálódás több esetben a túlélés előfeltétele, ami azonban a körülményekváltozása esetén, akár pusztulásuk okává válhat (Az oxigénigényes ecetsav baktériumok alevegőellátó rendszer zavara esetén az ecetgyártó reaktorban elpusztulnak).A mikroszervezetek — méretükből következően — érzékszerveinkkel nem vizsgálhatók.Minden esetben érzékelő műszereink technikai szinvonala határozza meg a megismerésünkmélységét. Tudatában kell lennünk, hogy vizsgálati eljárásaink durván megváltoztatják amikroszervezetek életkörülményeit még akkor is, ha úgy véljük, hogy kíméletes módszerekethasználunk. Nem felejtendő azonban, hogy kísérleti tevékenységünk közben, az idő függvényébenváltozó, számszerűsített adatokat szolgáltató módszerek alkalmazásával sohasemegyetlen sejt, hanem a homogén tenyészet által okozott hatást analizáljuk. A megbízható ésreprodukálható adatgyűjtés céljából ugyanis minden esetben eredeti élőhelyéről kiszakítva,homogén tiszta tenyészetként, a válasz értékelhetősége céljából szélsőséges, de ellenőrzöttfizikai és kémiai körülmények közé helyezett tenyészet válaszreakcióit figyeljük. Ajellemzésükhöz szükséges élettani [mikrobiális fiziológiai] ismereteket csak a környezetregyakorolt hatásuk felméréséből, illetve átgondoltan megtervezett fizikai és kémiai kísérletimódszerekkel nyerhető adatok kritikai értékeléséből nyerhetünk. A választott vizsgálatimódszerek kivitelezésekor figyelembe kell venni, hogy szakmai állásfoglalásunk tudományosértékét meghatározza a helyesen feltett kérdésre kapott egyértelmű igen vagy nem válasz.31

A MIKROBÁK NÖVEKEDÉSE, SZAPORODÁSAAz élőlény jellemző tulajdonsága a fizikai eszközeinkkel mérhető növekedés, amely többezer, részben ismert enzim katalizálta bioszintetikus lépés eredménye. Ennek a folyamatnakminőségileg elkülöníthető eseménye a sejt osztódása, a teljes sejtciklus lejátszódása, azönmagához hasonló új egyed létrejötte. Ideális esetben az élőszám kettőződésével a sejttömeg iskétszereződik (generációs idő).— Az ábrán jelzett lappangási idő (lag fázis) hossza akörnyezeti tényező függvénye. Elsősorban az oltótenyészet biológiai állapotától, korától, azoltótenyészet és a friss táptalaj összetételében mutatkozó különbségtől függ. A lag-fázisbiokémiai történéseit nem ismerjük részleteiben, csupán annyit tudunk, hogy a folyamat elsőszakaszában, a sejtszám változása nélkül jelentős RNS szintézis (riboszóma!) észlelhető, amita növekedéshez szükséges enzimek képződése követ.szárazstacioner fázistömeg lassuló sejtlízislogaritmikusskálán(log-fázis)exponenciálislag-fázisidő skálaA mikroszervezet növekedése folyékony táptalajon folytonosan kevert tenyészetbenA fázis fontos eleme a friss tápközeghez való alkalmazkodás és a környezeti tényezőkkedvező irányú befolyásolása. Ez sok esetben bizonyos vegyületeknek a sejtből történőkiáramoltatásával jár. Nagyobb mennyiségű sejttel való oltás lerövidíti a lag fázist; kevésszámú sejttel való oltás pedig akár több napra is nyújthatja ezt. A lag fázist egy rövid átmenetiszakasz követi, amelynek a végén a tenyészetben található sejtek zöme friss osztódásbólszármazó fiatal, életképes (virulens) egyed. A gyorsuló átmeneti szakasz szinte észrevétlenülvált át az exponenciális fázisba. A növekedés mértéke az adott körülmények között elérhető(µ max ) maximális osztódási sebesség,. A lag fázist követő fejlődési szakaszt azért nevezzüklogaritmikus (exponenciális) növekedési szakasznak, mivel a mérhető értékek logaritmikusskálán ábrázolva egyenest adnak. Maximális növekedési sebesség csak egy viszonylag rövidszakaszban mérhető, amikor a mikroszervezet növekedését semmi sem korlátozza. Anövekedéshez szükséges szubsztrátum elegendő és a gátló anyagcsere termékekfelszaporodása is elhanyagolható.Az egy ciklusban növekedő tenyészetben (batch culture) valójában folytonosancsökkenő tápanyag koncentráció mellett az idő előre haladtával, a tápanyag koncentrációváltozásának függvényében végül az éhező tenyészet anyagcsere viszonyairól is bőségesadatot nyerhetünk. A maximális növekedési sebesség a tenyészidő előrehaladtával csökken, és anövekedési görbe ellaposodva a veszteglő szakaszt (stacioner-fázis) mutatja. A tápanyagokmennyiségében, illetve az összetevők (táptalajalkotórészek) arányában bekövetkező változáslassítja az életműködést. A növekedés ugyan még tart, de egyre több életképtelen sejthalmozódik fel. A vizsgálódást tovább folytatva a pusztuló fázisban az élősejtszám csökkenését,majd a sejttömeg lebomlását tapasztaljuk. Az élni akaró mikroszervezet végül a pusztuló sejtek32

omlástermékeiből, az autolízis körülményei között próbálja a túléléshez nélkülözhetetlenanyagokat összegyűjteni. A magyar szakzsargon ezt az egy ciklusban folyó növekedést —történeti okból — szakaszos tenyésztésnek nevezi.A reakciótérként szereplő tápközegben a növekedés sebességét állandó hőmérsékleten, ahidrogénion-koncentráció és a vizes közegben oldott gázok (oxigén és szén-dioxid)mennyisége, valamint a mikróba által kiválasztott anyagcseretermékek is befolyásolják. (Azoxigén, vizes közegben való gyenge oldhatósága miatt, nem egy esetben növekedést limitálófaktorként jelentkezhet). Bonyolítja a helyzetet, hogy a növekedő tenyészetben jelenlevő sejtmérete az idő függvényében változik. A logaritmikus fázis kezdeti szakaszában a sejtek méreteés tömege sok esetben lényegesen nagyobb, mint a logaritmikus fázis végén. Nem egy esetben alogaritmikus fázis kezdeti szakaszában megfigyelhető mozgékonyság később megszűnik.Az élettani állapot vizsgálatakor az egy ciklusban fejlődő tenyészetnél előnyösebb a folytonosannövekedő (continuous culture) tenyészet használata. Az exponenciális szakasz növekedésisebességét sejtpusztulás nélkül, tartósan fenn lehet tartani, ha folytonosan adagolt tápanyaggalbiztosítjuk az optimális táplálást és ezzel egyidejűleg a túlfolyóval ellátott tenyésztő edényből azanyagcseretermékeket és a képződő sejtek arányos részét a hűthető gyüjtő edénybe juttatjuk. Azerre szolgáló eszköz a turbidosztát, amely aszeptikus körülmények között a mikroszervezetnövekedéséhez szűkséges fizikai kémiai körülményeket (keverés, levegőzés, hőmérséklet,optimális pH,) maradéktalanul biztosítja. A dinamikus egyensúlyi állapotban levő (steady state)tenyészet előállítása érdekében a higítás mértékét az adott generációs idő alapján meghatározottidőegység alatt adagolt táptalaj mennyisége határozza meg. A higítási állandó (D) az átfolyó frisstáptalaj és a reaktorban növekedő tenyészet térfogatának hányadosa. A kihozatali állandó aképződött sejttömeg és a felhasznált tápanyag (g.L –1 ) hányadosa.A növekedési ráta a sejtszaporodás mérésére használt eszközök teljesítményétől függőpontossággal a tenyészet biológiai aktivitásának a jellemzésére szolgál. A tenyészetnövekedésének az üteme az élő sejttömeg, illetve az élő sejtszám megkettőződéséhez szükségesidővel jellemezhető. A két adat a folytonosan növekedő tenyészetben jól egyezik. Az ilyenegyensúlyi állapotban szaporodó tenyészet tartós fennmaradását az eltávolított tenyészettérfogatával megegyező friss táptalaj folytonos adagolása teszi lehetővé.Dinamikus egyensúlyi állapotban levő (steady state) tenyészet rázó asztalra erősítettlombikban, kétcsatornás perisztaltikus pumpát használva könnyen nyerhető. A higító táptalaj avékonyabb, az elszívás pedig egy vastagabb cső használatával oldandó meg.33

A mikroorganizmus fiziológiai állapotára vonatkozó adatgyűjtésre széleskörben aslkalmazzák akemosztátban való folytonos tenyésztést. Ez esetben limitáló faktorként szabadon választható atáptalaj valamelyik nélkülözhetetlen összetevője (szénforrás, nitrgénforrás, a foszfát vagy a kén).De limitáló komponens lehet az oxigén is. A mikroszervezet fiziológiai állapotát a higítási rátaállítja be, mert a sejtben felhasznált tápanyag komponensek aktuális mennyisége, azanyagforgalom (turnover) döntően befolyásolja az élettani viszonyok koncentráció függőszabályozottságát. Az exponenciális fázis specifikus növekedési rátája a kemosztát kultúrában ahígítási rátával egyezik. A higítási rátát növelve a köztesanyagcsere szabályozási mechanizmusais érvényesül, de erőszakot alkalmazva bizonyos metabolitok túltermelése is lehetővé válik. Azátfolyási ráta emelése adott esetben kimosódáshoz vezet..A mérhető növekedés tehát számszerű adatot szolgáltat a vizsgálandó szervezet élettaniállapotáról. A növekedés ütemét valójában egy-egy limitáló hatású enzim teljesítményehatározza meg. Bármilyen sejtméreg vagy enzimgátló anyag jelenléte, tápanyaghiány vagykedvezőtlen fizikai körülmény (például a tenyészközeg hőmérsékletének változása) a generációsidő megnyúlását, a sejtosztódás sebességének a csökkenését okozhatja. A munkahipotézisszerint a növekedési sebesség fokozódása az optimális körülményekhez való közeledést jelzi.Ennek az adatnak a megbízható mérése, a növekedés ütemének a meghatározása, nem könnyűfeladat. Ezt a megállapítást igazolja az irodalomban és a laboratóriumi gyakorlatban használtmérési módszerek nagy száma. (Száraz sejttömeg mérés, élő sejtszám változás mérése,fényelnyelés mérése, nefelométer használata, DNS- tartalom mérés, fehérjetartalom-mérés, stb.)A mikroorganizmus növekedési sebessége a mikroszervezet és a környezete közöttiviszonyra jellemző számszerűen megadható adat, optimális esetben exponenciális összefüggéstmutat a tenyészidővel. Húsz perces generációs időt feltételezve 10 osztódással három és fél óraalatt a kiindulási sejtszám ezerszeresét mérhetjük. További hat óra múlva egyetlen sejtbőlkiindulva az élő csíraszám megközelíti a 100 milliót. Gyakorlatilag egy kezdeti lappangásiszakasz, várakozási idő (lag-fázis) után, a növekedés intenzív szakaszában mérhetjük atenyésztés hőfoka által befolyásolt — Escherichia coli esetében 20 perces — generációs időt.Ha a sejt térfogatot 1 µm 3 -nek tekintjük, akkor 48 óra alatt 20 perces generációs idővel 2,2x10 25m 3 protoplazmához jutnánk. Megjegyzendő: a Föld térfogata csak 1,1x10 21 m 3 .A MIKROSZERVEZET NÖVEKEDÉSÉNEK HŐMÉRSÉKLETÉRZÉKENYSÉGEA növekedés sebességét az életműködés szempontjából fontos enzimek aktivitását meghatározóhőérzékenységük befolyásolja.34

TÁPTALAJ-ÖSSZETÉTEL HATÁSA A MIKROBA NÖVEKEDÉSÉREAlaptételként elfogadandó, hogy a mikrobatörzsek az anabolikus és katabolikus folyamatokváltozó arányú működtetésével a kísérletező személy számára minden esetben az adotttenyésztési körülmények között lehetséges optimális szaporodási teljesítményt jelzik. Anövekedés mérése ennek megfelelően olyan zárt rendszerben végezhető, amely a vizsgálandóhomogén tenyészet életfeltételeit biztosítja. Minden mikroszervezet az életműködéséhez,növekedéséhez szükséges építőelemeket előnyösen a tápközegből szerzi, illetve a felvettanyagokból saját szervezetének felépítéséhez szükséges bonyolult vegyületeket enzimrendszereivelállítja elő. Ha a tápközeg valamilyen természetes eredetű növekedési faktort —például élesztőkivonatot — is tartalmaz, akkor a mikroba gyorsabban fejlődik, mert azéletműködéséhez szükséges vegyületek szintézisére fordítandó munkát megtakarítja.Célirányosan a tápközeg (táptalaj) a vizsgálandó szervezet fejlődéséhez szükséges valamennyiösszetevőt tartalmazza. A vizsgálandó homogén tenyészettel oltott tápközeget a növekedésszempontjából ideális hőmérsékleten tartva, időrendben követjük a megfigyelhető élettaniváltozásokat. Kiegyensúlyozott növekedéshez a faj, illetve mikróba-törzs számára optimálisszén/nitrogén arányú táptalaj használata kívánatos. Ez esetben a mikroszervezet nem kényszerülnagyobb mennyiségben lebontó, illetve átalakító enzimrendszerek működtetésére. Baktériumoktenyésztésére előszeretettel használják szén- és nitrogénforrásként a húslevest, mert anövekedéshez és a szaporodáshoz szükséges építőelemeket bőségesen tartalmazza.A mikróba élettani tulajdonságaira vonatkozó adatok gyűjtése és az élő rendszer tanulmányozásacéljából azonban kívánatos, hogy mérőmódszereinkkel a szükséges építőelemekfelvételét követni tudjuk. Ezért előnyösebb kémiailag tiszta, ismert összetételű tápközeghasználata, szükség esetén olyan ismert anyagokkal kiegészítve, amelyeknek előállítására a törzsgenetikai okok, például bizonyos enzimek hiánya miatt képtelen. Az úgynevezett vad törzsekáltalában az élő szervezet felépítéséhez és szaporodásukhoz szükséges építőelemek előállításáraszolgáló teljes enzimkészlettel rendelkeznek A mikroszervezet növekedését serkentő olcsóvitaminforrásként sok esetben (biosz anyagként) élesztőkivonatot adnak a tápközeghez.Az Escherichia coli K-12 élettani vizsgálatára alkalmas minimál táptalaj összetétele:0,062 M foszfátpuffer 0,0004 M magnézium szulfát 0,015 ammonium ion0,0225 M Glükóz 0,045 M GlicerinA táptalaj összetevői jól mérhetők, az anyagfelvétel és -leadás kémiai módszerekkel követhető.Az Escherichia coli a fenti minimál táptalajon tenyésztve, a terminális oxidációval, illetvefermentációval is jól működő energianyerő folyamatát hasznosítva, lehetőséget nyújt abonyolultan összefüggő élettani viszonyainak tanulmányozására, a számtalan kerülő utattartalmazó anyagcsereút részletes vizsgálatára, különös tekintettel annak a szabályozásimechanizmusaira. A tenyészet sejtjei természetesen időben jól elkülöníthetően, minőségilegeltérő fejlődési szakaszokra osztható egyéni életciklusukat élik. A gyorsan osztódó baktériumoktenyészetében az egyedek fejlődési szakaszainak random eloszlása miatt az egyes sejtek élettaniállapota — egyetlen sejtben történt változás — általában nem vizsgálható. Különlegeskörülmények között, szinkronizált kultúrában viszont ez tanulmányozhatóvá válik. Aszinkronizálás egyik módszere, ha a vegetatív oltó tenyészetet limitáló glükóz koncentrációjelenlétében (például 0,00045 M glükóz) inkubáljuk 8-10 órán keresztül. Átoltáskor a kiéhezett,de életképes sejtekben a bőséges glükózt tartalmazó táptalajon egyszerre indul a növekedés. Aszinkron fejlődés néhány kettőződésen keresztül érvényesül.35

A SZÉNFORRÁSként hasznosítható vegyületek mennyiségi változása, akár folyamatosméréssel is jól követhető. Szénhidrátokon, szénhidrogéneken, szén-dioxidon és polialkoholokonkívül az aminosavak szénváza, zsírok, szerves savak is hasznosulnak energiaforrásként. Amikrobiológiai laboratóriumok kutató és ellenőrző munkájukhoz – különösen rendszertanikérdések eldöntésekor – a polialkoholok és a szénhidrátok képviselőit előszeretettelalkalmazzák, mivel ezek – fajokra jellemzően – sok esetben eltérő mértékben hasznosulnak. Asejtmembránon való áthaladásuk, illetve foszforilációjuk sebessége eltérő lehet. Az iparigyakorlatban előszeretettel használják szén és energiaforrásként a glükózt, illetve növényipolimerjét a keményítőt. A diszacharidok közül a szacharózt és a laktózt alkalmazzák. Pentózokközül a xilóz, illetve polimerje a xilán, a polialkoholok közül a glicerin, lipidek közül pedig anövényi olaj alkalmazása említhető.NITROGÉNFORRÁSként biológiai felhasználhatóság és könnyű kezelhetőség szempontjábólaz ammóniát vizes oldatként, esetleg nitrát-, szulfát-, illetve foszfátként vagykarbamidként adják a tápközeghez. Meghatározott körülmények között a mikroorganizmusokegy csoportja képes a légköri nitrogén megkötésére. Teljes értékű táptalaj alkotórészekéntelőnyösen használhatók a növényi (szója-, mogyoró-, gyapotmag-, lucernaliszt formájában),valamint az állati erdetű fehérjék, esetleg oligopeptidekre hasított (kazein, húskivonat,kazamin, pepton, tripton) formában. Anyagilag előnyösen használhatók tápanyagkéntbizonyos ipari folyamatok melléktermékei, például a szeszlepárlás után visszamaradtkoncentrátum (szeszmoslék), vagy a keményítőgyártás melléktermékeként visszamaradókukorica-áztatólé tejsavas erjesztésével nyert koncentrátum. Ez utóbbi biosz anyagokbangazdag termék sertéstápszerként, kukoricalekvár (corn steep liquor) néven kerül forgalomba,de fermentációs eljárások nitrogénforrásaként is használható. Szerves nitrogént tartalmazótáptalajokban az aminosavak aránya általában nem egyezik a mikroszervezet szempontjábólideális igénynek. A fölöslegben levő aminosavakat a közti anyagcsere enzimei lebontják, vagya szükségletnek megfelelő aminosavakká alakítják.A FÉMIONOK a táptalajok esszenciális alkotórészei. Nagyobb mennyiségben a kálium és amagnézium, nyomokban a vas, a cink, a mangán, a molibdén, a kobalt, a réz és a kálciumjelenléte szükséges. Nyomelemeket általában a tápanyagok szennyeződésként elegendőmennyiségben tartalmaznak. — ANIONként foszfát és szulfát jelenléte nélkülözhetetlen. Ebbőlkövetkezően igényeink szerint kemosztátban akár foszfátlimitált tenyésztési körülményeket isbeállíthatunk.A HIDROGÉN az élő szervezetet felépítő elemek között legnagyobb mennyiségben fordul elő.Az élővilág kialakulásakor, a redukáló légkörben elektron forrásként hidrogént hasznosítóenzimrendszerek szerveződtek. Ezek az ősi mikrobák ma olyan biotópokban élnek, például abendő mikro-flórájában, ahol az életközösség valamelyik tagja állítja elő számukra az elemihidrogént. Jelentős mennyiségű hidrogént juttatnak a környezetbe a nitrogént kötő baktériumok.Az aerob élő világ a tápanyagként felvett vegyületek dehidrogénezésével nyert protont használjaa bioszintézisben.Az OXIGÉN az aerob mikrobák számára életműködésük fenntartása szempontjából mintlégzési szubsztrátum (elektron akceptor) meghatározó jelentőségű. Egyes vegyületeknek aképződése, például a gombák membránjában levő szterinek bioszintézise a légköri oxigénjelenlétét igényli. A kifejlesztett eljárások technológiai megoldásai a választott organizmuskielégítő oxigénellátását szolgálják. Mélyfermentációs (sűllyesztett) eljárásoknál, különösen agombák esetében az oxigén,— csekély (5 µg mL -1 ) vízoldhatósága miatt — limitáló faktorkéntjelentkezhet. Az élettanilag optimális oxigén szint az átvezetett levegő mennyiségével és akeverés mértékével szabályozható. Szűkség esetén, laboratóriumi körülmények között az oxigénparciális nyomása fölös oxigén bevezetésével növelhető.36

A MIKROSZERVEZET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE ÉS MÉRETEA mikroszervezetekben található elemek közül szárazanyagra vonatkoztatva legnagyobbtömegben a szén fordul elő. Molarányban természetesen vezet a hidrogén, majd harmadikként azoxigén, végül jelentős mennyiségben találunk nitrogént az építőelemek között.Sejtmag nélküli (prokariota) és maghártyát tartalmazó (eukariota) szervezet kémiai összetétele:Escherichia coliSaccharomyces cerevisiae(összegképlet) C 138 H 266 O 42 N 35 P 3 S C 3921 H 6365 O 2070 N 597 P 40 S 6Kén 1 % 0,2 %Foszfor 3 % 1,2 %Nitrogén 15 % 9,0 %Szén 50 % 47,0 %Oxigén 20 % 33,1 %Hidrogén 8 % 6,4 %Hamutartalom 3 % 3,1 %A mikroszervezetek kémiai összetétele a tenyészet korától függően változik. Az RNS tartalompéldául csak a logaritmikus növekedési szakaszban éri el a maximumot, amikor a riboszómákmennyisége a bioszintetikus folyamatok szempontjából optimális szintre emelkedik.A 75 % vizet tartalmazó baktérium szárazanyagának 60 %-a fehérje. Gondos analitikaivizsgálatokkal 3 % DNS-tartalom mellett 16 % ribonukleinsavat és 15 % foszfolipidet, 3 %poliszacharidot és 3 %-nyi kismolekulájú egyéb anyagot lehet kimutatni. Az élesztő viszont39,0 % fehérjét, 10,8 % ribonukleinsavat, 4,5 % foszfolipidet, 1,0 % szterolt, 2,5 % trigliceridet,34,1 % poliszacharidot és 5,0 % trehalózt tartalmaz. A mikrobák nagy fehérjetartalma indokolt,hiszen egyetlen sejt tartalmazza az életműködésükhöz szükséges teljes enzimkészletet.Amíg egy 500 kg-os szarvasmarha egy nap alatt fél kg fehérje szintézisére képes, addig500 kg élesztősejt 25-50 tonna fehérjét szintetizál 24 óra alatt.– Még kedvezőbb a helyzet, ha a rövidebb generációs idővel szaporodó és nagyobbfehérjetartalmú baktériumsejt teljesítményét számoljuk.A mikroszervezetek nagy metabolikus aktivitása valójában gazdaságos takarmányfehérjetermelésre ad lehetőséget.Megjegyzendő, hogy a szarvasmarha ezt a fehérjemennyiséget a mezőn legelve állítja elő, azélesztősejt viszont nagy költséggel épített speciális üzemben képes a fent említett teljesítményre.37

ÉLETTANI KAPCSOLAT A MIKRÓBA ÉS KÖRNYEZETE KÖZÖTTA növekedésre és szaporodásra képes mikroorganizmus megjelenését elősegítette a környezet,az élettér fizikai-kémiai tulajdonságának változása a Földtörténet során.A létezés, a növekedés feltétele:—A környezetből felvehető elektronforrásként használható szubsztrátum jelenléteHidrogén—Fémek—Szénhidrogének—Lipidek—Fehérjék—Szénhidrátok—A környezetben előforduló Szén-dioxid—Nitrogén—Kén—Oxigén—Szulfát—Nitrát—Foszfát tartalmú elektronakceptorként használható vegyületek jelenléte—A környezetből makro és mikro mennyiségben felvehető anyagok:fémionok, metabolizálható szénforrás, ammónia, aminosavak, vitamin jellegű anyagok—A környezetben rendelkezésre álló külső energiaforrás pl. hőmennyiség hasznosítása, illetveaz elektromágneses sugárzás hasznosításának kimunkálásaA mikroorganizmusok és a környezet között kialakult kapcsolat szempontjából különlegesjelentőségű a mikrobák viszonylag nagy fajlagos felülete, ami éppen kis méretükből adódik. Abaktériumok átlagos nagysága 1-2 µm, de az élesztőgomba átmérője sem éri el a 10 µm-t. Améretből adódó fajlagos felület hatása jól érzékelhető, ha megfontoljuk, hogy egyetlen köbcentiméternyitérfogatú kockában 10 12 db köbmikrométeres (µ 3 ) kis kocka helyezhető el, ami10-ezerszer nagyobb felületet jelent. A mikroba számára ez a nagy felület szolgálja akörnyezettel való kapcsolattartást, az anyagfelvételt és -leadást. Példaként szolgálhat néhányismert faj széles határok között változó oxigénfelvételének az összehasonlítása a sejtekméretből (1-10-100-500 µ) adódó fajlagos felülettel.Azotobacter sp 2000 ml oxigén · mg –1 óra -1Acetobacter sp. 1800 ml oxigén · mg –1 óra -1Pseudomonas sp 1200 ml oxigén · mg –1 óra -1Élesztők110 ml oxigén · mg –1 óra -120 ml oxigén · mg –1 óra -1VeseszövetFalevél 2 ml oxigén · mg –1 óra -1A mikroorganizmusok anyagcsere rendszerét a sejtburok legfontosabb alkotóeleme, acitoplazma-membrán, a sejthártya határolja el a környezettől. Ez a 8-10 nm vastag membrán amikroba szárazanyag tartalmának 8-15 %-át teszi ki. Ez a szerveződés nem csak elválasztja,hanem egyben összeköti a környező világgal, mivel az anyagfelvétel és -leadás is ezen azelválasztó burkolaton keresztül történik, mégpedig egyrészt passzív, másrészt aktív transzportjelenségek eredményeként. A sejtburok kémiai összetételének és szerkezetének a vizsgálatacéljából a mikrobasejt egyes alkotórészeit el kell választani.A Gram-pozitív eubaktériumokból a sejtfal lizozimes emésztése után nyert protoplasztokozmotikus elroncsolásával vízben nem oldódó frakcióként nyerhető a sejtmembrán.A baktérium összfehérje-tartalmának 20 %-a és a lipid tartalom 70-90 %-a a sejtmembránbantalálható. A sejthártya 50-60 % fehérjét, 30-40 % lipidet és 15-20 % szénhidrátot tartalmaz. Amembránban található fehérjemolekulák fontos élettani szerepet töltenek be. Ezért nemmeglepő, hogy a membrán fehérjetartalma a növekedés folyamán változik. Ezek a biológiailagaktív fehérjék saját tengelyük körül forogva, szinte úsznak az állandó mozgásban levő, főlegfoszfolipidet tartalmazó, kétrétegű membránban. – Az eukarióta membrán jelentősmennyiségű szterint is tartalmaz!A mikroorganizmus megjelenési formáját, morfológiai képét, alakját és méretét asejtburok egy alkotóeleme; a sejthártyán kívül elhelyezkedő, viszonylag szilárd sejtfalhatározza meg.38

A CITOPLAZMAMEMBRÁN-MODELLEK FEJLŐDÉSEA közvélemény leginkább a membrán Singer és Nicholson által 1972-ben leírt folyékonymozaik modelljét fogadja el. Nem csak tudománytörténeti érdekességű, de tovább gondolásraösztönöz a membránmodellek fejlődését bemutató ábra, amely szerint a biokémiai módszerekés a technikai berendezések fejlődésével összefüggésben, a leírás egyre jobban közelíti a valóhelyzetet, a ma elfogadott elképzelést.Az eubaktériumokban található kétrétegű membrán olyan kétdimenziós folyadéknak tekinthető,amelyben a foszfatidok zsírsav építőelemei a membrán síkjára merőlegesen helyezkednek el.Képlékeny szerkezete spontán kialakul, ha foszfatidokat megfelelő arányban vízzelösszekeverünk. — Az építőelemek mozgékonysága hőmérséklet függő. Magasabb hőmérsékletena telített zsírsavak mennyiségének a növelése biztosítja a membrán megfelelőfolyékonyságát. A hőmérséklet csökkenésekor viszont a telítetlen zsírsavak jelenléte biztosítmegfelelő flexibilitást. A membrán fluiditása szempontjából optimális zsírsavösszetételkialakulásában kulcshelyzetet foglal el az a tioeszteráz (glicerin-foszfát aciltranszferáz), amelyika lizofoszfatid, illetve a foszfatidsav szintézist katalizálja α-glicerinfoszfátból és a zsírsav CoAszármazékából.Ez az enzim az aktuális hőmérséklet függvényében változtatja a beépítendő39

telített, illetve telítetlen zsírsavak arányát. Az enzim a szelektáló képességét sejtmenteskörülmények között is megtartja; a reakcióelegyben levő zsírsav-CoA-tioészterek keverékébőlaz aktuális hőmérsékletnek megfelelően válogat.H 2=C–O–PO 3H 2|H–C–OH|H 2=C–OHH 2=C–O–PO 3H 2|H–C–OH|H 2=C–O–CO–RH 2=C–O–PO 3H 2|H–C–O –CO–R|H 2=C–O–CO-RCTPα-glicerin-foszfát>>>> CoA-SHglükóz-6-foszfátInozitol-1-foszfátMEMBRÁNTALKOTÓFOSZFATIDOKKÉPZŐDÉSEHOOHC-H–C-HLizofoszfatidC-H C-HInozitHOOH>>>>>>> CoA-SHONH 2| foszfatidil-inozitolFoszfatid-sav||HO-P=OC|H-C C-H OOH OH| | ||| |O=C C-HH-C-HH 2=C–O–P –O–P–O–CH 2NRCO-O-C-H\\ \\ \O |H 2=C-O-CO-RPPO O H-C CH—CH—– C-HH 2=C-O-CO-RH–C–O–CO–R| |H-C-O-CO-R||OH OHH-C-HH 2=C–O–CO-RCDP-glicerid|L-szerin >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> CMP OOH H H| |.. |H 2=C–O–P–O–C–C–COOH| | | |O H NH 2NH 2H 2 =C–C=H 2|O|H 2=C–O–PO 3H 2H–C–O–CO–R| foszfatidil-szerinH 2=C–O–CO–RCO 2|HO- P=O|O|H-C-H|HO-C-H|H-C-H|O|H 2=C–O–PO 2H|| foszfatidil-H–C–O-CO-R| etanolaminR-CO-O-C=H 2H 2=C–O-CO-R –—S—CH 3S-adenozilmetioninH 2C-CH 2-NH-CH 3CH 3|O|H 2C-O-PO 2H|H–C–O-CO-R|H 2C–O-CO-RFoszfatidil-metiletanolaminH 2=C–CH 2-N=CH 3\O\H 2C–O–PO 2H|H-C-O-CO-R|H 2C—O-CO-RFoszfatidil--dimetil-etanolaminR-CO-O-C-H| kardiolipin+ CH 3CH 2-CH 2-N =CH 3| CH 3O|H 2=C–O–PO 2H|H-C-O-CO-R|H 2=C—O-CO-RFoszfatidil-kolinA citoplazmamembrán fizikai-kémiai tulajdonságait erősen befolyásolja az építőelemek polároscsoportjának a szerkezete és a különböző élettani folyamatokat katalizáló fehérjék jelenléte. Azígy kialakuló flexibilis képződmény a sejten belüli és a sejten kívüli vizes fázisok szétválasztásávalolyan ozmotikus akadályt képez, amely egyrészt visszatartja az élő sejtéletfontosságú metabolitjait, másrészt megakadályozza a környezetben jelenlevő anyagok40

eözönlését a sejtbe. A töltéssel bíró anyagok számára a membrán fizikai-kémiai okokbólgyakorlatilag átjárhatatlan. A glicerinnél nagyobb molekulák ezen az ozmotikus gáton csakspeciális transzportmechanizmus segítségével haladhatnak át. Ilyen feladatot látnak el azok amembránfehérjék, amelyek a külső és a belső teret összekötve, lipofil régiójuk segítségévelszinte beoldódnak a membrán hidrofób rétegébe. A sejthártyában működő fehérjék egy csoportjaa membrán belső, más részük a külső oldalán a feladataiknak megfelelően, a foszfolipid rétegbesüllyedve helyezkednek el. A membránban található fehérjemolekulák katalitikus aktivitásatartja fenn az élő sejthártya külső és belső oldala között mérhető membránpotenciált, ami az életalapjának tekinthető. Az itt működő fehérjék eltérő feladataiból következően a membrán külsőés belső oldalának a kémia szerkezete jelentős mértékben különbözik. (Különösen jelentős azeltérés a külső membrán esetében!)Membránhoz kötött fehérjék az elektrontranszport és az oxidatív foszforiláció enzimei.Ide kötődnek a foszfatidsav képződését katalizáló enzimek, a muramil-peptid és teichoinsavbioszintézisében résztvevő enzimek. A membránhoz kötve találjuk azokat a fehérjéket, amelyekkésőbb a periplazmikus térben kezdik meg működésüket. Ezek az enzimek képződési helyüket –a riboszómákat – elhagyva, hidrofób régiójukkal kötődnek a membránba, és adott esetbenproteolitikus hatásra, a rögzítő fehérjeláncról leszakadva kerülnek az extracelluláris térbe. Acitoplazmamembránban készülnek, illetve itt fejeződik be azon vegyületeknek a szintézise,amelyekből a Gram-negatív baktériumok sejtfalon kívül elhelyezkedő rétege, az úgynevezettkülső membrán felépül. Membránhoz kötődik a DNS-polimeráz, sőt nagy valószínűséggel a sejtDNS-állománya is kapcsolatban lehet a membránnal. — A citoplazmamembránban működőenzimek általában csak különleges módszerekkel mozdíthatók ki a helyükről. Különféle, nemionos detergensek, dezoxikolát, dodecil-szulfát, fenol, pufferhatás, hőkezelés, esetlegproteolitikus enzimek alkalmazása vezethet eredményre. A kinyert fehérjefrakció a polároskörnyezet miatt sok esetben in vitro inaktív. A reakcióelegyhez adott foszfolipid hatásáraazonban az esetek többségében visszatér az aktivitás.A membrán építőelemeinek a képződését a membrán közelében rögzített enzimekkatalizálják. Itt képződnek a 14-18 szénatomszámú zsírsavak is. Egyes esetekben a zsírsavkülönlegesen hosszú is lehet, más esetben hidroxil-csoportot (például mikolsav), esetlegciklopropán gyűrűt, vagy metil- oldalláncot tartalmazhat. In vivo a zsírsasv választék összetételeis szabályozott; alacsonyabb hő-mérsékleten fokozódik a telitett zsírsav képződés. A hőmérsékletemelkedése viszont a telítetlen zsírsavak képződésének kedvez. A közegben levő zsírsavak isbővíthetik a választékot. A környezetből felvett zsírsav ugyanúgy CoA származékként van jelena citoplazmában, mint a saját készítésű zsírsav, amely acil-CoA formájában hagyja el azsírsav-szintetizáló komplexet.A membránt felépítő telítetlen zsírsavak két úton képződhetnek. Az egyik lehetséges út,ha a bioszintézis körfolyamatánál a vízkilépés után kimarad a telítési reakció. Így transz kettőskötésű zsírsav marad vissza. – A másik esetben az elkészült zsírsavat egy külön enzim, amembránban rögzített desaturáz dehidrogénezi cisz helyzetben. A desaturáz a hőmérséklethatására változó fluiditású membránból kiemelkedve dehidrogénezi a telített szénláncot. Ha amembrán fluiditása optimalizálódik, ez az enzim visszasűllyedve a membránba beszüntetiműködését.Escherichia coli-ban telítetlen zsírsavként főleg cisz-vaccenát (cis-ll,l2-oktadekanoát)fordul elő a tenyésztési hőmérséklettől függő mennyiségben. A magasabb rendű növényekben ésaz állatokban inkább cisz-9,l0-oktadekanoát, olajsav képződik. — A cisz-kettőskötés azsírsavlánc térbeli helyzetét változtatva a membrán fluiditását befolyásolja. Jelentős hatású amembrán flexibilitására a foszfolipid építőelemek fejrészének a mérete és a kémiai szerkezete is.A citoplazmamembránban ugyanis nem a szabad foszfatidsav, hanem annak származékaifordulnak elő. A foszfatidsav citidin-trifoszfát segítségével citidin-difoszfogliceriddé alakul41

pirofoszfát felszabadulása mellett. A CDP-glicerid azután szerinnel reagálva foszfatidil-szerinnéalakul, amely a membrán főkomponensévé, foszfatidil-etanolaminná dekarboxileződik. Ezutóbbi különböző mértékben metilezve végül foszfatidil-kolinná (lecitin) alakul. A CDP-gliceridα-glicerinfoszfáttal reagálva CMP felszabadulása mellett foszfatidil-glicerin képződéséhezvezet. Ez egy újabb CDP-gliceriddel reagálhat, aminek az eredménye a kardiolipin, (difoszfatidil-glicerin)építőelem képződése. Ugyancsak CDP-gliceridből képződik a foszfatidilinozit.A zsírsavszintézis első lépése a malonil-CoA előállítása.COOHCH 2CO-S-CoAbiotinCO 2ATPADP + Piacetil-CoA-karboxilázH 3 C-CO-S-CoAmalonil-CoA képződésKépződését alloszterikusan szabályozza a jelenlevő zsírsavak mennyisége. A karboxil csoport aAz α szénatom aktiválódásaR—C—C—S—C—C—N—(CoA)H O H H H| | | | | |karboxibiotinról kerül át az enolizáltalakban jelenlevő acetil csoport aktívált αszénatomjára.| | |H H HEnolizációO-H H H HR—C==C—S—C—C—N—(CoA)| | |H H HdisszociációO – H +| H HR —C = C— S —C—C—N — (CoA)H H H HAz aktíválódás az enolizációs folyamateredménye. Az elektronokat a karbonilcsoport oxigén atomja gyűjti ami végül azalkoholos csoport disszociációjáhozvezet.A BIOTIN a fehérjében levő lizin ε-aminocsoportjához kötődve végzi feladatát.1.) Szénsav-foszforsav vegyes savanhidrid képződésATP +H 2 CO 3 >>>>O OH|| |ADP + HO–C–O–P–OH||O2.) A szénsav-foszforsav vegyesanhidrid karboxilezia biotint (Pi felszabadulás!) biocitinné3.)Az aktívált karboxi-csoport az acetil-S-CoAaktívált metilén csoportjára kerülve hozzalétre a zsírsav szintézishez szükségesmalonil-CoA-t*(A malonil-CoA képződést a citoplazmábana CoA-S-acilát alakban jelenlevő hosszabbszénláncú zsírsavak alloszterikusan gátolják)Malonil-S-CoA képződésxxxxxxxxxx42

A ZSÍRSAV-SZINTETÁZ enzimkomplex (Pan-Enz) felületén képződnek a zsírsavak.A „Pan” elnevezés a CoA pantoténsav tartalmára emlékeztet.A pékélesztőben előforduló, 2300 kDa méretű komplexet tisztán előállították.Ugyancsaksikerült kinyerni az Escherichia coli zsírsav szintetizáló komplexének működőképesalkotóelemeit. Az Escherichia coli 8847 dalton méretű savhordozó fehérje (ACP) 36-ikaminosavaként szereplő szerinhez kapcsolódik a foszfopantetein oldallánc (valójábanCoA-analóg), amelyhez a hosszabbítandó sav kovalensen kötődik.43

Az aciltioészter hatásos acilező ágens. A kén nagyobb atomrádiusza és csekélyebb negativitásamiatt az acil csoport könnyebben távozik a vegyületből. A tioészterből távozó acil csoport instatu nascendi jelentős acilező aktivitással keresi az acilezhető komponenst.Ez a tioészterkötésben jelenlevő sav a kondenzációs reakcióban a komplex másik tagjáhozkapcsolt malonáttal CO 2 felszabadulása közben reagál. A növekvő zsírsavláncot a fehérjeasszociátum egyik tagja, a savhordozó fehérje (ACPx-acyl carrier protein) tioészter-kötésbentartja, miközben forgószínpadszerűen – a komplexen – a tevékenységük sorrendjébenelhelyezkedő enzimek a megfelelő biokémiai átalakításokat elvégzik. Minden körbefordulás kétszénatommal növeli a képződő zsírsav hosszát, amint az a zsírsav anyagcsere ábrántanulmányozható. —A bioszintézis építő elemének (malonil-CoA) citráttal serkenthető képződését, biotin igényesacil-S-CoA karboxiláz katalizálja, amelynek a működését viszont zsírsav-analógok gátolják.— Abiotin a fehérje lizin tagjának ε-aminocsoportjához kapcsolódva, ATP felhasználásávalfoszforsav-szénsav vegyesanhidrid köztes terméken keresztül karboxileződik. A savanyúkörülmények között labilis karboxi-biotinil komplexről kerül a COOH csoport az acetil-S-CoAreaktív szénatomjára.Ez a reakció-út a mikrobák szaporodása szempontjából alapvető jelentőségű.— Miért? (Mertzsírsav nélkül nincs foszfatidsav, foszfatidsav nélkül nincs membrán, a szelektívenelkülönítő membrán nélkül nincs élet.) — Ezért nem meglepő, hogy a mikrobák szaporodásátserkenteni lehet a tápközegbe adott biotinnal, és minden esetben kedvezően hat a növekedésmegindulására a szén-dioxid parciális nyomásának emelése.A kedvező hatás annak ellenére jelentkezik, hogy nem beszélhetünk a szén-dioxid fogyásáról,hiszen a malonil-S--CoA-val történő szénlánchosszabbító reakcióban a szén-dioxid felszabadulva,újra részt vehet a karboxilezési reakcióban. A pozitív hatás oka talán az, hogy a vegyesanhidridátmeneti képződésének kedvez a szén-dioxid felesleg, amely valamikor — az élő sejtmegjelenésekor — jelentős környezeti tényező volt.A képződő acetoacil-ACP a NADPH-függő ß-keto-acil-ACP reduktáz szubsztrátumakéntD-ß-hidroxi-acil-ACP-vé alakul. A továbbiakban a víz kilépését az enoil-ACP-dehidrázkatalizálja; a kettős kötés telítését pedig, az ugyancsak NADPH-függő enoil-ACP-reduktáz végzi.Az ACP-aciltranszferáz ezután a növekedő, telített intermedierrel az ACPo-foszfopanteteinoldaláncot acilezi. Ez a körfolyamat mindaddig folytatódik amíg a zsírsavlánc el nem éri akívánt hosszúságot (palmitinsav esetében hét ciklus).Alternatív lépésként egy speciális tio-transzészteráz acetil-CoA felhasználásával a zsírsavatacil-CoA formájában leválasztja az ACPx komplexről, miközben az ACPx-foszfopanteteinoldalláncra újabb malonil-csoport kerül, ami ezt követőleg részt vesz a lánchosszabbításireakcióban, illetve elindul a következő zsírsav szintézise. [ Az acetil csoport cseréjét a savmérete előnyösen befolyásolja.]* A tájékozódást megkönnyíti a ZSÍRSAV ANYAGCSERE az Escherichia coli K-12-ben címűábra (51 oldalon) megtekintése.44

Az ŐSBAKTÉRIUM-MEMBRÁN ÉPÍTŐELEMEINEK KÉPZŐDÉSEAz Archaeobaktérium membránjából izoprén egységekből felépülő telített alkoholok (fitanil)glicerinnel alkotott étereit izolálhatjuk. Membrán-szerkezetet nemcsak zsírsavak glicerofoszfátészterei,digliceridjei hozhatnak létre, hanem hosszú szénláncú alkoholok glicerinnel alkotottéterei is hasonló tulajdonságot mutatnak. A törzsfejlődés folyamán a zsírsavalapon létrejöttszerveződést megelőzően a természet ezt az elvi lehetőséget is kipróbálta.IZOPRÉN-OLIGOMEREK BIOSZINTÉZISE2 acetil-CoAacetoacetil-CoA-szintetáz >>>>>>>CoA-SH a fontosabb köztestermékekszerkezetének bemutatásávalacetoacetil-CoAacetil-CoAhidroximetil-glutaril-CoA-szintetáz >>>>>>>>>>CoA-SH COOHH-C-Hβ-hidroxi-β-metilglutaril-CoA HO-C-CH 3>>>>CoA-SH O=C-S-CoA>>>>>>>>>>>2 NADP + H H OH Hmevalonát-kinázmevalonátfoszfát-kináz3 R-mevalonát HO-C--C--C----C--COOH>>>>ADPH H OH H5-foszfo-mevalonát H 2 O 3 -P-O-C--C--C----C--COOH>ADP5-pirofoszfo-mevalonát>>> CO 2>>>>> H 2 O+PP i Hizomeráz >>>ADP H-C-H H-C-Hdimetilallil-pirofoszfát ⇔ izopentenil-pirofoszfát C--CH 3 C--CH 3C-HH-C-H0dimetilallil H-C-O---PP H-C-O--PP0transzferáz H HHO-PP CH 3geranil PPtranszferázgeranil-pirofoszfátizoprenil PPtranszferáztetraizoprenil-pirofoszfátPP--O-HCH-HC=C-HCH-HCH-HC=CCH 3 CH 3oligoizoprén szintázbaktoprenol-foszfátß-karotintetraizoprenil-retinál NADP +szkvalén45

A vázlaton jól küvethető folyamatot áttekintve megjegyzendó, hogy az 5-pirofoszfo-mevalonátdekarboxiláz katalizálta reakció közben kialakuló labilis köztes anyagból a pirofoszfáttal víztévozik. A feltüntetett végtermék a membrán szerveződése szempontjából nélkülözhetetlen. AzŐsbaktériumok ma is megtalálhatók olyankörülményekhez alkalmazkodva, amilyeneketaz észterszármazékot tartalmazóEubaktériumok nem képesek elviselni. AFöld őstörténetének hosszú periódusábanezek a baktériumok alkották az élővilágfőtömegét. Egy glicerinhez két fitanillánckapcsolódik. A glicerin harmadikszénatomjához azután polialkoholok,cukorfoszfátok kapcsolódnak szén-szénkötéssel, esetleg elvétvefoszfátészterkötéssel. A hőtűrő Sulfolobusnemzetségben például a glicerinhez egyhexit kapcsolódik C-C kötéssel és az ígylétrejövő nonit alkotja a membránépítőelempoláros fejét. Vizes közegben - afoszfatidokhoz hasonlóan - ez a lipid iskettősréteget alkot. Az éterkötés stabilitásaa nagy sótartalommal, magashőmérséklettel jellemzett savanyúkörnyezetben is elősegíti a membránszerkezetfennmaradását. Ennek a membránépítőelemnek az a különlegessége, hogy atelített izoprénláncok kovalens kötésselösszekapcsolódhatnak. Ez esetben kétszernégy, azaz összesen nyolc izoprénegységből épül fel az izoprenoid alkohol, abifitanillánc, amelynek láncvégi hidroxilcsoportjai vagy egyetlen glicerin vicinálishidroxiljaival alkotnak éterkötést, vagypedig két glicerin molekulával lépnekkapcsolatba. Ez a szerkezet jellemző ahőtűrő ősbaktériumokra, amelyekben a lánconbelüli ciklopentán gyűrűk fokozzák a membrán stabilitását. Az ősbaktérium membránjábana szemben levő fitanilláncok egymás mellé csúszva, ill. kovalensen összekapcsolódva alkotják aszélsőséges fizikai-kémiai hatásoknak is ellenálló sejthártyát. — Az izoprén egységekbőlfelépülő életfontosságú vegyületek nem csak az ősbaktériumok esetében - ahol a membránfőtömegét alkotják - de a foszfatidsavból építkező szervezetek esetében is megőrizték élettanifontosságukat. A kofaktorokat (klorofill, koenzim-Q) izoprén származékok rögzítik amembránba. Gondoljunk csak a különböző baktoprenol- és terpén-származékokra, karotinokra,retinálra, szterinekre. A peptídóglükán sejtfal építőelrmét is izoprenil-foszfát segíti át acitoplazmamembránon.Amíg egyetlen glicerin-bisz-fitaniléter képződéséhez 24 acetil-CoA, 24 NADPH, 24 ATP és 1 α-glicerin-foszfát szükséges, addig a foszfoglicerid egység 18 acetil-CoA, 36 NADPH, 18 ATP és 1 α-glicerin foszfát felhasználásával készül! (Palmitinsav esetében 16; 32; 16 a szükséges elemek száma)46

A membránösszetevőként szolgáló zsírsavak illetve fitanilalkoholok képződéséhezkiindilási anyagként acetil-CoA szükséges. Nem meglepő, hogy a redukáló környezetben élőősbaktériumokban az acetil-CoA képződését katalizáló enzimkomplex szerkezete és működésealapvetően eltér az oxidatív miliőben kialakult eubaktériumok és eukarióták dekarboxilezőaktivitásától, annak ellenére, hogy mindkét esetben a piruvátból egy CO 2 felszabadulásávalvégeredményben „aktív acetát”, acetil-S-CoA képződik.Acetil-CoA képződés az ősbaktériumokban redukáló miliőben, ésaz eubaktériumokban aerob körülmények közöttAz ábrán jól követhető, hogy az ősbaktériumokban a piruvát dekarboxilezésekor képződő TPPacetálC 2 egysége a ferredoxin-oxidoreduktáz segítségével közvetlenül kerül a CoA-ra tiolészterformában. – Az oxidatív foszforiláció megjelenése után viszont a ”piruvát-dehidrogenáz”enzimkomplex TPP-acetál HO-CH-CH 3 egysége, liponsavval alkotott közti terméken keresztülacilezi a koenzimet. Így képződik az acetil-S-CoA . A gazdaságos „üzletmenet” szempontjábólaz enzimkomplex mőködését alloszterikusan befolyásolja az ATP szint, a citromsavkoncentréciója és a NADH felszaporodása az rnzimkomplex foszforilezésén keresztül.Az őssbaktériumok a glükóz-neogenezis működésével állítják elő a növekedésükszempontjából nélkülözhetetlen hexózokat. Nem rendelkeznek hexóz permeázzal, mivel aföldfelszinen való megjelenésük időszakában a vizes környezet nem tartalmazott fölösmennyiségben szénhidrátot. — Metanogénekben az aktív acatát nyerése, az acetil-CoAelőállítása a jelentős mennyiségben rendelkezésre álló szén-dioxidból könnyen megoldható egyenzimkonplex (E 1 ) működtetésével, amely nehezen szétválasztható módon tartalmazza areverzibilisen működő szénmonoxid dehidrogenáz-t és acetil-CoA szintetáz-t. (CODH / ACS).47

A Morella .thermoacetica-ból izolált enzimkomplex tulajdonságait vizsgálva megállapították,hogy az ősbaktériumokban egy nikkel-vaskén fehérjét tartalmazó komplex végezi CO képzéstszén-dioxidból. Az eubaktériumokban ez a komplex molibdén-vaskén fehérjét tartalmaz. (areakció-egyenletben szereplő „A” képviseli a kompléx fémtartalmát) amiről az elektron aferredoxinra kerül.CO 2 + AH 2 CO + H 2 O + ASzénmonoxid dehidrogenáz az acetil-CoA képzésbenA metil átvitelben a cobalamin /B12/ szerepe megkerülhetetlenTETRAHIDROFOLSAVMETANOFURÁN METILPTERIDINA cianid helyére kerül a –CH 3Az acetil-S-CoA reakcióképességét a tioészter spontán bekövetkező enolizációjának köszönheti.Az ábra a B-12 gyógyszerként forgalmazott cianocobalamin szerkezeti képletét mutatja.Az életkörülmények változásával, a klimatikus viszonyok enyhülésével ezek az Ősbaktériumokelvesztették kiváltságos helyzetüket. Az éterszármazékok szintézisének nagy energiaigénye alétért való küzdelemben hátrányos helyzetbe juttatta őket a foszfatidokból felépülő membránnalrendelkező szervezetekkel szemben. A gazdaságosság elvének érvényesülésével olyan élőhelyekreszorultak, ahol előnyük vitathatatlan (hőforrás, iszap, mélytengeri élőhelyek, bélcsatorna,48

a kérődzők bendője, mocsár, szennyvíztisztító, stb.). Az ősbaktériumokban kialakult ferredoxintigénylő mechanizmus sok esetben jelen van az aerob szervezet génállományában is, amelyanaerob körülmények közé kerülve hasznosítható.Aerob körülmányek között a piruvát-dehidrogenáz komplex katalizálja a piroszőlősavbóltiaminpirofoszfát, liponsav és FAD segítségével történő acatil-S-CoA képződést. A FADH 2visszaoxidálása NADH képződést eredményez. A felszaporodó NADH a komplez aktivitásátalloszterikusan gátolja.49

A tiamin-pirofoszfát számos biokémiai reakcióban szerepet játszó kofaktor, a tiaminfoszfatált származéka, {C 12 H 19 N 4 O 7 P 2 S} amelyet a tiamin-pirofoszfatáz enzim állít elő.IUPAC név: 2-[3-[(4-amino-2-metilpirimidin-5-il)metil]-4-metil-1,3-tiazol-3-ium-5-il]etilfosfono-hidrogén-foszfát.(425.314382 g/mol). — A TPP nukleofil ágrnsként a szénhidrátok,az alkohol és a zsírok energiáját szabadítja fel. A pirofoszfát és a pirimidin között levőthiazol kén és nitrogén közt elhelyezkedő negatív töltésű szénatomja (a H + leadás miatt)támadja a piruvát alfa szénatomját. Az addiciós termék dekarboxilező hatásaként megjelenőhidroxi- etil-TPP rezonáló acilező ágensként nyitja fel a liponsav diszulfid kötését. — Többformában kristályosodik. 4 kristályvizes kloridsója mellett ismert a 4 kristályvizes semlegesikerionos, triklin rendszerben (P1) kristályosodósó, ahol a pirofoszfát kétszeresen ionizált, és apirimidin gyűrű egyszeresen protonált.Enzimek, melyek mellett koenzimként működikpiruvát-dehidrogenáz (piruvát oxidatív dekarboxiláció)α-ketoglutarát-dehidrogenáz (citromsavciklus)oxolutarát-dehidrogenáz komplexacetolaktát-szintáz (2,3-butándiolos erjedés)piruvátdekarboxiláz (alkoholos erjedés)piruvátoxidázindolpiruvátdekarboxilázAz alfa-liponsav vagy tiooktánsav a kofaktorok közé tartozóbioaktív vegyület. Sárga, tűszerű formában kristályosodik.Etanol, DMSO, DMF és hasonló szerves oldószerek jól oldják.Vízben, vizes pufferoldatban gyengén oldódik. Melegítve már60°C körül bomlani kezd. Kelátot képez Cu 2+ , Zn 2+ és Pb 2+ionokkal de Fe 3+ ionnal nem. Redukálva 6,8-dimerkaptooktánsav,amely erősebb kelátképző tulajdonsággal rendelkezik. — Kémiai szempontbólkéntartalmú heterociklusos, királis karbonsav. Majdnem minden eukarióta mitokondriumábanmegtalálható, ahol a piruvát-dehidrogenáz komplex részét képezi. C 8 H 14 O 2 S 2 206,328 g/molA TPP –acetál hatására kialakulú dihidroliponsav tioacil származéka spontán transzacilrzésifolyamat keretéban a CoA-SH csoportját acilezve fejezi be az enzimkomplexen folyó acetil-S-CoA szintézist.H H H H H H H O H O H H H H H H H-O CH 3 H| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |H-C—C—C—C—C—C—C—C–O-H H-C–C–S–C–C–N–C–C–C–N–C–C–C—C–O| | | | | | | | | | | | | | | | | | | |H-S H S H H H H H H H O H H O H CH 3 H PP| |C=O acetil–S–CoA ribóz-P C-3| |H–C–H| tioacetil-dihidroliponsavHadenin50

xxxxxxxxxxxA glicerin alifás alkohollal alkotott éterei az eubaktériumokban is szerepet kaphatnak.Képződésük azonban értelemszerűen eltér az ősbaktériumokban működő mechanizmustól.Plasmalogenfoszfolipidképződése(részletesebben)* ****** A plazmalogének képződésekor a dihidroxiaceton foszfátból képződő zsírsavészterből azsírsavat az alkil-dihidroxiaceton szintetáz cseréli a rendelkezésre álló alifás alkohollal.** A keto csoportot NADPH igényes oxidoreduktáz redukálja, amit a továbbiakban acil-S-CoAszolgáltatta zsírsav észterez.*** Az alkil lánc cisz dehidrogénezését a membránban jelenlevő oxigén igényes desaturázenzimkomplex katalizálja, amely a környezeti hőmérséklet emelkedésének hatására a membránfluiditásának függvényében működésbe lép. A cisz dehidrogénezés hatására a zsírsav lánctérhelyzete változik, ami a membrán fluiditását előnyösen befolyásolja.51

ZSÍRSAVLEBONTÓ KOMPLEX MŰKÖDÉSE (ß-OXIDÁCIÓ) A MIKROSZÓMÁBANA citoplazma mikroszóma-frakciójában található ß-oxidáló enzimkészlet a hosszú szénláncúzsírsavakat acetil-CoA egységekké bontja egy-egy FADH 2 és NADH képződése közben. Aredukált kofaktorok az oxidatív foszforilációt táplálva regenerálódnak. Escherichia coli-valvégzett kísérletekben nem csak a lebontásban szerepet játszó mikroszómában rögzített multifunkcionálisenzimkomplex tulajdonságait derítették fel, de a struktúrgéneknek a kromoszómánvaló elhelyezkedéséről is adatokkal rendelkezünk.ZSÍRSAV ANYAGCSERE az Escherichia coli K-12-ben{R-gén} Represszorfehérje{L-gén} Külsömembrán transzportfehérjeZsírsavlebontó komplex (mikroszómában)Zsírsavszintézis a savhordozó fehérjén (ACP)R-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CO-S-CoA>>>>>>>>>>>>>>>>CH 3 -CO-S-ACPtiotranszészterázAMP +PPFADH 2R-CH 2 -CH 2 -CH=CH-CO-S-CoA{B gén} enoil-CoA-hidratázH 2 O >>>>>>[L-ß-OH]OHR-CH 2 -CH 2 -CH-CH 2 -CO-S-CoAR-CH 2 -CH-CH 2 -CO-S-ACPxOH>>>>>>>>> NADP +D-ß-ketoacil-ACP reduktáz>>>>HS-ACPo >>>>>>>>>>>>>>>>>>CO 2

A ZSÍRSAVLEBONTÁS ÉS A ZSÍRSAVSZINTÉZIS egymástól teljesen függetlenfolyamatok. Az élő sejtben nem csak térbelileg különül el a két folyamat, de a köztes termékekkémiai szerkezete is különbözik. Amíg a lebontási út L-ß-hidroxi-acil-CoA intermedierenkeresztül, a szintézis D-ß-hidroxi-acil-Pan-Enz származékon keresztül folyik. Azsírsavlebontáshoz NAD + kofaktor szükséges, a bioszintézis folyamán viszont NADPH kofaktorkerül felhasználásra.A ZSÍRSAV TRANSZPORTját a baktérium külső membránjában helyet foglaló, 43 kDaméretű fehérje végzi, amelyet az L-gén kódol. A periplazmából a zsírsavat acitoplazmamembránba ágyazott, D-gén által kódolt acil-CoA-szintetáz tioészterként továbbítja asejtbe, ahol szabad zsírsav nem fordulhat elő.A zsírsavlebontás (ß-oxidáció) a citoplazma mikroszómáiban folyik. Az első enzimet azacil-CoA-dehidrogenázt az E-gén kódolja. Ez az enzim a zsírsav C-2, C-3 szénatomjáról távolítel egy-egy hidrogént FADH 2 képződése közben, amelynek visszaoxidálása légköri oxigénthasznosítva peroxid képződéssel jár. A B-gén két enzimet kódol az enoil-CoA-hidratázt és aNAD + kofaktorral műkődő 3-hidroxi-acil-CoA-dehidrogenázt. Itt találjuk a telítetlen zsírsavaklebontása szempontjából nélkülözhetetlen enoil-CoA-izomerázt és a hidroxiacil-CoA-epimerázt.A komplex utolsó tagja az A-gén által kódolt 3-ketoacil-CoA tioláz, amely egy acetil-CoAfelszabadításával két szénatommal rövidíti a lebontandó láncot.{A 16 szénatomot tartalmazó palmitinsav lebontása 14+21 ATP képződését teszi lehetővé. (8acetil-CoA + 7FADH 2 + 7NADH + 7H + ) Összehasonlításul aerob körülmények eseténC 6 H 12 O 6 +6O 2 =24 e –- -->6 CO 2 + 6H 2 O 32 ATP. A zsírsavlebontás sebességét a redukáltkofaktorok oxidációja szabályozza.}A zsírsavlebontás enzimeinek a képződését hosszabb szénláncú (12-18 szénatomszámú)zsírsavak indukálják; ennél rövidebbek hatástalanok. A 24 kDa méretű represszor fehérjét az R-gén kódolja a kromoszóma jól ismert régiójában. A represszor (R)-gén hibája miatt konstitutívanderepresszált mutánsokban az enzimképződést glükózzal, illetve glicerinnel lehet represszálni,mégpedig a cAMP képződés gátlása miatt. Ez a represszió cAMP-adagolással befolyásolható.Ilyen esetben két cAMP kapcsolódik a CAP-hoz. Azt is megállapították, hogy a cAMPreceptorban sérült mutánsokban a zsírsav-bontó enzimkomplex nem indukálható.— A D- és azL-génben hibás mutánsokban a multifunkcionális enzimkomplex nem indukálható. (Lehetséges,hogy D- és L-gén termékei az aktív represszorkomplex olyan építőelemei, amelyek azinduktorral való kapcsolódást segítik.) Az A-, B- és E-génben hibás mutánsokban az épenmaradt enzimek képződését zsírsavakkal serkenteni lehet.A ZSÍRKÉPZÉS ÉLETTANATömegükre vonatkoztatva a zsírok (zsírsavak glicerin észterei) a legnagyobb energiát képviselőfelhasználásra kész vegyületek. A mikroba számára.ideális tartalék tápanyagként halmozódnakfel. — Zsírképzéskor egy foszfatáz hidrolizálja a foszfatidsav foszforsav észtert és az elkészültdiacil-glicerinre az előbbi aciltranszferáz újabb acil-CoA felhasználásával elhelyezi a harmadikzsírsavat. A zsírok hidrofób tulajdonságukból következőleg heterogén fáziskéntolvadáspontjuknak megfelelően szilárd részecskék alakjában vagy olajcseppek formájábantalálhatók a citoplazmában vagy viszonylag stabil szuszpenzió vagy emulzió formájában amikrobák vizes környezetében. Legismertebb példa erre a friss tehéntej, amelyben a tejnek afehérje- és foszfatidtartalma biztosítja a (víz-zsír) kolloidrendszer viszonylagos stabilitását. A53

mikrobák – külső felszínük hidrofób jellegétől függően – feldúsulnak a zsírcseppecskék felületén.Nem meglepő, hogy a lipidgazdag tejszínben található a baktériumok fő tömege - így azesetleg jelenlevő Mycobacterium bovis (a tehén-TBC kórokozója) is. — Folyékony tápközegbena lipidgazdag felszínű mikróbák gyakran egymáshoz tapadva jellegzetes aggregátumokatképezve növekednek, amit a táptalajhoz adott, élettanilag elviselhető detergensekkel (tween-80)igyekeznek megakadályozni.A táptalajban jelenlevő, energiaforrásként hasznosítható glicerid minden esetben a mikrobaválaszreakcióját váltja ki. A mikroszervezetek egy része extracelluláris lipázt termel, másesetben a membrán külső oldalához kapcsolva működnek ezek az enzimek. A lipolitikusaktivitás eredményeként felszabaduló zsírsavak acil-CoA formájában jutnak a sejtbe, ahol akatabolikus folyamatok fűtőanyagaként vagy szénforrásként hasznosulnak, de.megtalálhatókmembránt alkotó foszfolipidek építőelemeiként is. A vízben nem oldódó trigliceridből amembránhoz kötött diglicerid aciltranszferáz választja le az első zsírsavat, amely egyátészterezési folyamat keretében CoA-S-acilát formájában jelenik meg a citoplazmában. Adiglicerid a foszfatid-foszforiláz hatására, ATP felhasználásával foszfatiddá alakulva résztvehet asejtmembrán felépítésében vagy pedig az α-glicerinfoszfát aciltranszferáz egy újabb zsírsavatválaszt le róla CoA-acilát formájában. A folyamat végén visszamaradó α-glicerinfoszfát egyNAD-függő dehidrogenáz segítségével dihidroxiaceton-foszfáttá oxidálódva kapcsolódhat azanyagcserébe. A hasznosítást elősegítendő a mikrobák hosszabb-rövidebb adaptációs idő után alipolitikus enzimek hatásos működését befolyásoló, detergens jellegű anyagokat választanak ki.A kezdetben jól elkülönülő vizes és lipidben gazdag fázis hamarosan tejszerű kolloid rendszertalkotva hasznosul.A RÖVIDEBB SZÉNLÁNCÚ SAVAK LEBONTÁSA külön enzimkomplex feladata,amelynek képződését az acetecetsav indukálja. A membránon átkerülő rövid szénláncú savat(vajsav, acetecetsav) az atoA-gén által kódolt acetoacetil-CoA-transzferáz aktíválja ecetsavképződés közben. Az enzimkomplex második, atoB-gén által kódolt tagja a tioláz II, amely egyCoA-SH felhasználásával két acetil-CoA képződését katalizálja. (E. coli-ban folyó bontás.)CH 3 - CO - CH 2 - COOHacetil-CoA >>>>>>>>> acetil-CoA-transzferáz (ato A)CH 3 - CO - CH 2 - CO - S-CoA +ecetsavCoA-SH

A MEZOSZÓMAValójában a membrán betüremlése a citoplazmába. Különösen fontos a szerepe a Gram-pozitívmikrobáknál, ahol a mezoszóma megnöveli a peptidoglükán sejtfal és a membrán között levőperiplazmikus teret. Elektronmikroszkópos felvételek szerint a Gram-pozitív baktériumoknál aDNS-replikáció folyamatában a mezoszómának is fontos szerepe lehet. Az ATP-szintézisértfelelős enzimkomplex nagyobb mennyisége is itt helyezkedik el. A mezoszóma fiziológiaijelentőségére utal, hogy a Gram-pozitív mikroorganizmusok protoplasztjain is jól látható aszerkezete.A Micrococcus lysodeikticus - neve a lizozim érzékenységére utal - mezoszómájában jelentőspeptidoglükán-hidrolizáló aktivitást találtak, amely a sejtosztódáskor fontos szerepet kap, lazítjaaz osztódó sejtek közötti kapcsolatot.A Gram-negatív baktériumokban a mezoszóma jelentéktelen méretű, protoplasztáláskorbeltartalmát kiürítve kisimul. Szerepét valószínűleg átvállalja a külső membrán, amely a periplazmikustérbe kiválasztott enzimek távozását megakadályozza.A BELSŐ MEMBRÁNA prokarioták elektronmikroszkópos felvételein sok esetben a citoplazmában különleges belsőmembránszerkezet figyelhető meg. Bizonyos reakcióutak mikroszómákba, glioxiszómábaszerveződve működnek. Ezek a kettős rétegek olyan enzimrendszereket tartalmaznak, amelyekaz életműködést fenntartó elektronáramlást biokémiailag hasznosítható energiacsomagokkáalakítják. Jelentős mennyiségű ilyen membrán található a fototróf baktériumokban, azazotobakterekben és a kemolitotróf baktériumokban, főleg azokban az organizmusokban,amelyekben az elektrontranszport-rendszer különleges szerveződésű.Az eukariótáknál erre a feladatra külön sejtalkotórészek – mitokondriumok, kloroplasztok,mikrotestek – szolgálnak. Ezekben – méretükből adódóan – a prokariótákkal összevetve,lényegesen bonyolultabb belső membránszerkezet szervezi jól szabályozott egységes rendszerréa biokémiailag és élettanilag bonyolultan összefüggő anyagcsere hálózatot.55

A KÜLSŐ MEMBRÁN a Gram-negatív festődésű prokarioták nagy csoportjánál a peptidoglükánsejtfalon kívül, ahhoz kovalensen kötve egy lipidekben gazdag, meglehetősen vastagréteget alkot.Escherichia colikülső membrán vázlatos képeA: trimer porin fehérjeB: lipopoliszacharid(A-LIPID)C: külső membrán-fehérjeD: peptidoglükán rétegE: murein lipoprotein kapcsolatF: a membrán foszfolipid elemeiA külső membrán viszonylag állandó szerkezetű a környezettel érintkező glikolipid frakciójaötféle cukrot tartalmaz; egy N-acetil-glükózamint, két glükózt, két galaktózt, két heptózt éshárom nyolcszénatomos ketocukorsavat (oktánsav). A cukrok redukáló csoportjai részt veszneka poliszacharid lánc felépítésében, ezért magának a glikolipid frakciónak nincs redukálótulajdonsága. A poliszacharid láncot a terminális 2-keto-3-dezoxi-oktonát kapcsolja az A-lipidglükózamin komponenséhez. A cukorsav savanyú karakterét ellensúlyozandó még kétetanolamin kapcsolódik foszforsavon keresztül a glikolipidfrakció állandó részéhez. Aglikolipid-frakció változó szakasza az állandó rész utolsó előtti tagjához, a glükózhozkapcsolódik. Ez a specifikus oldallánc valójában triszacharid egységek nagyszámú, akárhuszonötszörös ismétlődése. Ebből következőleg mint valami molekuláris szőrzet, úgy borítjákezek a poliszacharid láncok a Gram-negatív baktériumok külső felületét. Természetesen nemcsak az ismétlődések számában, hanem a triszacharid egységek kémiai összetételében, illetve acukoregységek közötti kötésben is lehet eltérés. Ez óriási variációs lehetőséget jelent.A külső membrán építőelemei a citoplazmában képződnek, és innen kerülnek át megfelelőcsatornákon a peptidoglükán váz külső oldalára. Egyidejűleg nő az A-lipid frakció és apoliszacharid lánc. A szénhidrát építőelemek a citoplazma enzimkészletének termékeként asajtplazmában (pool) állandóan jelen vannak.— Glükóz-6-foszfátból két izomeráz katalizálja amannóz-6 foszfát képződését, amiből mannóz-1-foszfáton keresztül UTP-vel reagálva képződikaz UDP-mannóz. Az UDP-galaktózt UDP-glükózból egy epimeráz alakítja. A ramnózTDP-glükózból képződik. A triszacharidok szintézise a citoplazma membránban elhelyezkedőundekaprenol (C-55 poliizoprenol) lipidhordozón folyik. Az undekaprenol-foszfáthozkapcsolódik a cukorfoszfát, miközben a megfelelő nukleotid felszabadul. Az elkészülttriszacharid egységek azután a membrán külső oldalán kapcsolódnak a növekvő poliszacharidlánchoz. Ez a magyarázata annak, hogy az antigén jelleget képviselő poliszacharid láncokrakémiailag jellemző a triszacharid egységek monoton ismétlődése. Az undekaprenil-pirofoszfátregenerálását egy membránba rögzített foszfatáz végzi, amely egy anorganikus foszfátleválasztásával aktiválja a lipidhordozót.(Ennek az enzimnek a működését zavarja a gyürűsszerkezetű peptid antibiotikum, a bacitracin.)56

A-lipidet acilező savanyú jellegű poliszacharid (Kdo)A külső membránt lipoproteinek kapcsolják a peptidoglükán falhoz. A diaminopimelinsavkomponens és a lipoprotein (terminális) {K} lizin ε-amino csoportja között kialakuló kovalenskötés jelenti a kapcsolatot. — Escherichia coli, Serratia sp., illetve Salmonella sp. esetében ez akapcsolat minden tizedik muraminsav egységnél jön létre.57

A külső membrán kémiai szerkezete, felépítése jelentős mértékben különbözik a már megismertcitoplazma membrán szerkezetétől. Elektronmikroszkópos felvételeken ez a különbség nemészlelhető, csupán a membrán vastagságában (10-20 nm) jelentkezik feltűnő különbség.A külső membrán belső felületén levő, a peptidoglükán sejtfalhoz kapcsolódó glicerid vázlatos szerkezeteR R R = membránba sűlyedő hosszú szénláncú zsírsavak| |O=C C=O R| | |O O H C=O A peptidóglükán sejtfalhoz kapcsolódó csatornát képző lipoprotein frakció| | | | Az L-gén által kodolt peptidláncH-C––C––C-H O végén található ciszteinhez kapcsolódó glicerint a membránba sűlyedő hosszú| | | | szénláncú zsírsavak acilezik, de zsírsav acilezi a cisztein aminocsoportját isH H S NH O| | ||H-C—-C----C---S-S-N-A-K-I-D-E-L-S-S-D-V-Q-T-L-N-A-K-V-D-E-L-S-N-D-V-N--AH HL-Ala--D-Glu--DAP-K-A-R-Y-K-T-A-M-N-D-L-R-Q-N-A-R-A-A-D-D-K-A-A-Q-V-D-S-R-M\-- muraminsav -- peptidoglükán (K)= LizinA külső membrán környezettel érintkező felületén elhelyezkedő glükolipid (A-LIPID) szerkezeteKdo--------O-CH 2 Salmonella sp. A-lipid kopolimer glükózamin diszacharid egysége|H CH----------O O-------------------------------CH 2\ / \ / |O O C C H CH----------O H|| || / \ / \ \ / \ /-O-P-O-P-O CH----------CH H C C OH O| | | | / \ / \ | ||HO OH O H-N O CH---------CH O-P-O-P-O-| | / | | || |O=C C=O O=C O H-N O OH| | | | |R R 1 R C=O C=O| |R = telített zsírsav CH 3 -(CH 2 ) 12 -COOH OH R R 1|R 1 = 3–hidroximirisztinsav: CH 3 -(CH 2 ) 10 -CH-CH 2 -COOHA külsőmembrán a sejtburok tömegének akár 80-90 százalékát is képezheti. A két elektrontelnyelő réteg között itt is egy elektront áteresztő réteg látható. Az aszimetrikus felépítésű külsőmembrán belső foszfolipidekben gazdag rétege lipoproteint is tartalmaz; a külső felületenviszont a lipopoliszacharidok döntő többségben vannak. A külső membrán kémiai kezelésselnagyobbrészt lemozdítható.Kelátképzőkkel, (EDTA) a sejtfelszínhez kötött magnézium- és kalciumionokmegkötésével a membrán jelentős mértékben károsítható. A membrán másik része fenollaltávolítható el. Gyengíthető a külső membrán és a peptidoglükán sejtfal közötti kapcsolat tripszineskezeléssel, illetve pronázzal.58

A BAKTÉRIUMOK TOKANYAGAA sejtburok járulékos alkotóelemének tekinthető a tok, más néven kapszula. A betolakodópatogén baktériumok számára ez kiváló védelmet jelent a gazdaszervezet fagocitáinaktámadásával szemben. A tok gátolja a baktérium kiszáradását, esetenként tartaléktápanyagraktárnak is tekinthető. A tok genetikailag meghatározott képződését rendszertanibélyegként használják, annak ellenére, hogy céltudatos munkával (átoltogatással) viszonylagkönnyen nyerhetünk tok nélküli (apatogén) variánsokat. Griffith 1928-ban végzett kísérletét is aPneumococcus patogén és "toknélküli", apatogén variánsával végezte.(Lásd részletesen a 3332.fejezetben)A tok mérete és állaga (kompakt vagy nyálkás) fajok szerint, sőt törzsek szerint is változhat.Képződését a tenyésztési körülmények is befolyásolhatják. Kémiailag lehet poliszacharid, polipeptidvagy fehérje-lipopoliszacharid komplex, amit negatív festéssel, például tussal is láthatóvátehetünk.Az Aerobacter aerogenes D-glükóz-D-glükóz-D-glükuronsav-L-fukóz egységekbőlfelépülő polimert termel tokanyagként.A Bacillus anthracis tokanyaga γ-poli-D-glutaminsav.A Bacillus subtilis tokanyaga az előbbi γ-poli-D-glutaminsav és γ-poli-L-glutaminsavtáptalaj-összetétellel befolyásolható keveréke. A Bacillus megaterium tokja viszont a kétféleglutaminsavból felépülő, 1:1 arányban váltakozó polimer.Az Acetobacter xylinum és az Acetobacter acetigenum borvirágnak nevezett bőrszerű,cellulóztartalmú anyagot választ ki.A Chlamidobacter fajok glükózt, glükuronsavat, galaktózt és fukózt tartalmazópolimerből készítik hüvelyüket.A Mycobacterium tuberculosis vastag lipid burkának köszönheti ellenálló képességét éssaválló tulajdonságát.A tokanyag nem egyszer a sejt aggregátumok kialakulását segíti. A Sarcina ventriculisejtcsomagjait a baktérium cellulóztartalmú terméke tartja össze. Ugyancsak ide tartozik akékbaktériumok (Cyanobacteria) fehérjetartalmú poliszacharid tokanyaga. De ide sorolható aglükokálixnak nevezett poliszacharid fonalakból álló hálózat, ami számos esetben abaktériumoknak élőhelyükön való megtapadását segíti.A tokanyag antigén tulajdonságát K-antigén, illetve virulencia-antigénként tárgyalja a szakirodalom,amelyet speciális festési módszerekkel, a tokantitesthez kötött festékkel láthatóvá lehettenni. Éppen ez a módszer bizonyítja, hogy az apatogénné tett, tokhiányos mutáns esetében a tokantigén egy vékony hártyaként jelen van a baktérium felületén.Tokanyag, illetve annak némileg módosult származéka sokszor olyan nagy mennyiségbenjelenik meg, hogy esetenként ipari termelését is megvalósították erre a célra kiválasztott, ésgenetikailag „nemesített” törzsekkel.A Leuconostoc mesenteroides extracelluláris transzglükozidáza a szacharózból dextránt (α-Dglükopiranozilglükán) termel. A Streptococcus salivarius ugyanebből a kiindulási anyagbólpolifruktózt, fruktánt állít elő.59

A SEJTFAL RENDELTETÉSEA mechanikus károsító hatást elviselő, hálózatos szerkezetű, 1 nm pórusméretű sejtfal 10 kDamoltömegig átjárható. A prokarióta és eukarióta szervezetek morfológiai képét meghatározósejtfal szerveződésében azonban alapvető eltérés mutatkozik, sőt ebből a szempontból aprokarióták is két csoportra az eubaktériumok és az ősbaktériumok csoportjára oszthatók. Ezentúlmenően Gram-pzitív és Gram-negatív festődésű szervezeteket különböztethetünk meg. — Asejtburok vizsgálata céljából a sejteket mechanikusan el kell roncsolni, majd centrifugálássalelválasztani a sejt beltartalmától a vízben nem oldódó sérült sejtfal és membrán maradékot.Ebből a frakcióból detergens használatával a lipoprotein-membrán alkotórészei könnyenelkülöníthetők. Gram-pozitív festődésű eubaktérium esetében a visszamaradt muropeptid(murus=fal), zömmel peptidoglükán, amely nagyobb mennyiségű teichoinsavat is tartalmaz. —A Gram-negatív sejtburok peptidoglükán-tartalma a Gram-pozitív sejtfalra jellemző 30-60 nmfalvastagsággal szemben lényegesen vékonyabb, 2-3 nm vékonyságú réteget alkot a citoplazmamembránés a külső membrán között. Gram-negatív sejtekből a sejtfalfrakció előállítása többmunkát igényel, mivel a külső membrán kémiailag, peptidláncokkal kötődik a sejtfalhoz. Alipoproteinek egy része eredetileg a mureinréteg és a külső membrán között alakít ki tripszineskezeléssel megszüntethető kapcsolatot. A mechanikusan elroncsolt sejtekből nyerhető membránés sejtfal elemeket tartalmazó frakcióból - a detergenssel végzett kezelést követően – lipidoldószerekkelkell eltávolítani a sejtfal frakciót szennyező lipoprotein maradványokat.A sejtfal felépítését vizsgálva megállapítható, hogy az eubaktériumok mindkétcsoportjában azonos az 1-4 glikozidos kötéssel kapcsolódó glükánkopolimer. A muraminsavhozkapcsolódó peptidlánc elvi felépítése is azonos, amennyiben a tejsavhoz kapcsolódó L-alanintminden esetben D-glutaminsav követi, a keresztkötés kialakítására pedig minden esetbenvalamilyen diaminosav (lizin, vagy diaminopimelinsav) ad lehetőséget.A peptidoglükán kémiai szerkezeteAz eubaktériumokból nyert sejtfalkészítmények savas hidrolizátumában két szénhidrátszármazék, az N-acetil-glükózamin és az N-acetil-muraminsav, (N-acetil-glükózamin-3- O-D--laktiléter) és tetrapeptid-egységenként néhány aminosav (L-Ala, D-Glu, L-Lys, mezo-DAP, D-Ala) jelenléte igazolható. Eegyes rendszertani egységekben általában oligomerek hálózatátalkotva, a sejtfal alkotórészeként jelentős mennyiségben más szénhidrátok is előfordulhatnak.Propionibacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium fajokban ramnóz, glükóz,galaktóz, és mannóz fordul elő. Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia fajokban arabinóz,glükóz, galaktóz és mannóz található. Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcusfajok sejtfalában glükóz, galaktóz és mannóz jelenlétét igazolták.A glükózamin-kopolimer építőelemei ß-1,4-glikozidos kötéssel kapcsolódnak. (A kitinépítőelemei is ß-1,4 kötéssel kapcsolódnak) A sejtfal három irányban kiterjedve épül. Azegymás fölött elhelyezkedő poliszacharidláncok között a kapcsolatot a peptidláncok alakítják ki.A peptidláncok legalább 90 %-a résztvesz a kapcsolat kialakításában. A sejtfal redukálóaktivitásából, a terminális redukáló csoportok számából a poliszacharidláncok hosszára (80-140egység) következtethetünk.Amíg a két cukorszármazék az ősbaktériumokat kivéve minden baktérium sejtfalábanjelen van, addig az aminosavak mennyisége és minősége az egyes baktériumcsaládokban, illetvenemzetségekben rendszertanilag is értékelhető eltérést mutat.A Gram-pozitív Staphylococcus nemzetség sejtfalában N-acetil-glükózaminil-N-acetil-muramilnonapeptid egységek ismétlődnek. A cukorpolimerhez a D-tejsavon keresztülL-Ala-D-Glu(α-amid)-L-Lys-D-Ala tetrapeptid kapcsolódik. A D-glutaminsav izo-helyzetbenvesz részt a peptidkötés kialakításában! Az egyes tetrapeptidláncok között egy-egy oligopeptid(pentaglicin) létesíti a kapcsolatot.60

Más esetben a glicil pentapeptid helyett az L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Thr, Gly-Gly-Gly-L-Ser-L-Ser, L-Ser-L-Ala, L-Ala-L-Ala, vagy D-Asp-L-Ala oligopeptid alakíthatja ki akapcsolatot. Egyes esetekben a D-alanin és a D-glutaminsav között diaminosavak: D-ornitin,D-diaminovajsav, illetve glicil-L-lizin dipeptid adja a kovalens kötést. Egyes Gram-pozitívbaktériumokban a D-glutaminsavamid helyett D-glutaminsav illetve D-glutamil-glicin fordulelő. L-lizin helyett (bifunkciós molekulaként) mezo-diaminopimelinsav(DAP), LL-diaminoadipinsav,L-ornitin, L-α,γ-diaminovajsav, L- homoszerin vagy L-glutaminsav fordulhat elő.A két tetrapeptidlánc közvetlenül is kapcsolódhat. A Gram-negatív Escherichia coliesetében például diaminopimelinsavhoz közvetlenül kapcsolódik a szomszéd lánc végén elhelyezkedőD-alanin. Ez a különbség a sejtfal tömörségében jelentkezve, teichoinsav nélkül,csekélyebb rétegvastagság mellett is kellő szilárdságot biztosít a mikroba számára.A baktériumok egy csoportját meghatározó jellegű anatómiai különbségként a sejtfalonkívül egy második, úgynevezett külső membrán választja el a környezetétől. Ennek az élettaniszempontból jelentős membránnak a külső felületén különböző, antigénként ismert szénhidrátpolimerektalálhatók.Gram negatívan festődő baktériumsejt burok vázlataGram pozitivan festődő baktériumsejt burok vázlataElőfordul, hogy a prokariota szervezetet a sejtfalon kívül antigén jellegű, változó szerkezetűfehérje molekulák mozaikszerűen elhelyezkedő rétege borítja. Jól elkülöníthető csoportotalkotnak a sejtfalon kívül található, zsírsavban gazdag réteggel rendelkező, úgynevezett savállószervezetek. A sejtburok külső rétegeként sok esetben több-kevesebb kocsonyás természetűfehérje, illetve poliszacharid jellegű anyag található; ha ez tömörebb szerkezetű, akkor toknaknevezzük. A prokariotákat több mint száz éve, mégpedig festődésük alapján, két nagy csoportbasorolják a biológusok. A festési eljárást a dán Christian Gram 1884-ben írta le, és azóta a rólaelnevezett festési eljárást a mikrobiológusok világszerte alapvető taxonómiai módszernektekintik.61

A tárgylemezre fixált kenetet bázikus kristályibolyával végzett festés után kálium-jodidosjódoldattal kezelik. A jód a festékmolekulákhoz kötődve olyan mértékben megváltoztatja aszínanyag fizikai tulajdonságát, hogy a festési technológia következő lépésében az acetonnalvagy alkohollal (propanol) végzett mosás a mikrobák egy jelentős csoportjából nem képeseltávolítani a jódkomplexet. Ezeket nevezzük Gram-pozitívan festődő szervezeteknek. Amikrobák másik csoportjából (Gram-negatív) a festék viszonylag könnyen kimosható.Gyakorlati szempontból a festett készítményt célszerű háttér festéssel (pl. szafranin)változatosabbá tenni. Közel hetvenöt évig használták a mikrobiológusok ezt a szelektív festésimódszert a jelenség molekuláris magyarázata nélkül. Salon úgy vélte, hogy valójában aGram-pozitív sejtburok permeábilitási viszonyai akadályozzák a festék jódkomplexénekeltávolítását. Mai ismereteink szerint a hálózatos szerkezetű, 1 nm pórusméretű sejtfal 10 kDamoltömegig átjárható. Salon és munkatársai a festék megtartását a Gram-pozitív fajokrajellemző, vastag glükopeptid sejtfal tömörségével okolták meg. Alátámasztotta ezt azelképzelést egyrészt az a megfigyelés, hogy a Gram-pozitív baktériumok idősebb tenyészete azautolitikus folyamatok előrehaladása miatt Gram-negatívként festődik, másrészt az a tapasztalat,hogy a pozitívan festődő sejtekből a fal részleges enzimes emésztése után a festék-jódkomplexkönnyen kimosható.A PEPTIDOGLÜKÁN SEJTFAL KÉPZŐDÉSE62

A sejtfal építőelemeit a sejtplazmában működő enzimrendszerek szintetizálják nem csekélyenergia felhasználásával. Az építőelemek összekapcsolása viszont a citoplazma-membránonkívül történik, mégpedig minimális energia- és anyagveszteség mellett.Az aminocukor-származékok glükóz-6-foszfátból fruktóz-6-foszfáton keresztül aglutamin amidcsoportját hasznosítva készülnek. Az uridilfoszfát-származék képződésétmegelőzi egy izomerizálási reakció, amelyben a foszforsavészter csoport a C-6-ról a C-1-revándorol. Muraminsav-képződéskor az N-acetil-glükózamin uridil származéka reagál a foszfoenol-pirofoszfáttal.A képződő enol-piroszőlősavétert egy NADPH-függő reduktáz rendszeralakítja tejsav-éter származékká (UDP-N-acetil-muraminsav), amelynek a karboxil csoportjáhozkapcsolódnak meghatározott sorrendben egy-egy ATP felhasználásával a pentapeptidet felépítőaminosavak (Stapylococcus esetében L-Ala, D-Glu(izo), L-Lys és D-Ala-D-Ala dipeptid). Abioszintézis utolsó lépései a citoplazmamembrán belső oldalán folynak, ahová a készülőépítőelemet, az N-acetil-muramil-pentapeptidet a membránba ágyazott izoprenil-foszfát(undekaprenil-alkohol foszforsavésztere) rögzíti. A rögzítés energiát alig igényel, mivel azuridil-difoszfát-N-acetil-muramil-pentapeptid pirofoszfátkötése hasad el, és az UMP szabaddáválásával egyidőben az építőelem ugyancsak pirofoszfátkötéssel kapcsolódik az undekaprenil-foszfátmembránból kinyúló foszforsav maradékához. Ezután a membránba kötve egyglikozilező enzim UDP felszabadulása mellett N-acetil-glükózamint kapcsol ß-1,4 helyzetben amuramilpentapeptid cukorkomponenséhez.Peptidoglükán sejtfal építőelemének felépülése a citoplazmábanH 2 =C-OHC=OHO-C-H GlnH-C-OH GluH-C-OH amidázH 2=C-OHF-6-PH 2=C-OHH-C-NH 2HO-C-HH-C-OHH-C-OHH 2=C-O-PGlu-amin-6-PCoA-acAcilázH 2=C-OHH-C-NH-CO-CH 3HO-C-HH-C-OHH-C-OH foszfoglüko-H 2=C-O-P mutázN-ac-Glu-amin-6-PP-O-C=H 2H-C-NH-CO-CH 3HO-C-H UTPH-C-OHH-C-OH uridilázH 2=C-.OHN-ac-Glu-amin1--PUDP-O-C=H 2H-C-NH-CO-CH 3HO-C-HH-C-OHPP H-C-OHH 2=C-OHUDP-N-acetil-glükózaminUDP-D-muramil-N-acetát képződésUDP-O-C=H 2H-C-NH-CO-CH 3HO-C-H P-E-PH-C-OHH-C-OH H 2OH 2=C-OH piruvilUDP-N-acetil-glükózaminH-C-H UDP-O-C=H 2|| H-C-NH-CO-CH 3C — — O — C-H NADPH >>>>NADP +| H-C-OHHO-C=O H-C-OH reduktázszintetáz H 2=C-OHUDP-N-acetil-piruvil-glükózamin [dehidro-tejsav-éter]CH 3 UDP-O-C=H 2| H-C-NH-CO-CH 3H-C —— O — C-H| H-C-OHHO-C=O H-C-OHH 2=C-OHUDP-D-muramil-N-acetátBactoprenol-PP (undecaprenil-PP) képződés 11 izopentenil (dimetilallil) pirofoszfátbólCH 3|11 [H 2 C=C–CH-CH 2 -PP]|HCH 3 CH 3 CH 3 O O| | | || ||H 3 C–C=CH–CH 2 –(CH 2 –C=CH–CH 2 ) 9 –CH 2 –C=CH–CH 2 –O–P–O–P–OH| |10 PP O – O –Az 55 szénatomot tartalmazó undekaprenil-pirofoszfátból egy membránhoz kötött foszfatáz egyfoszfátot eltávolít. A létrehozott bactoprenol-foszfát lép reakcióba a citoplazmában elkészültUDP-muramil-pentapeptiddel. Tehát az UMP szabaddáválása mellett a D-muramil-pentapeptid-1-foszfát reagál a bactoprenol foszfáttal. A muramil-pentapeptid így újra pirofoszfátként kötődika karrier szerepet betöltő bactoprenolhoz Ez a pirofoszfát kötés a glikozidos kötés kialakulásaszempontjából szűkséges. Itt a membránban lép reakcióba az UDP-glükózamin-N-acetilszármazéka a bactoprenolhoz pirofoszfátkötéssel kapcsolódó D-muramil pentapeptiddel. UDPfelszabadulása mellett képződik az N-acetil-glükózamint és muraminsav pentapeptidet63

tartalmazó köztes termék, amelynek savanyú karakterét csökkentendő, a D-glutaminsavγ-karboxilcsoportjának amidálása követ. Végül a köztes termék 5 glicinnel kiegészülve veszrészt a peptidoglükán sejtfal továbbépülésében. A visszamaradó bactoprenol-PP másnévenundekaprenil-pirofoszfát pedig, a fent ismertetett módon újabb sejtfal építőelem kijuttatásátsegíti a periplazmába, A beépítendő glicin molekulákat, a dekapeptid szintézishez egy különleges,a riboszómális fehérjeszintézishez nem használható glicil-tRNS szállítja. Ez amegoldás a fehérjeszintézist függetleníti a sejtfalszintézis anyaggazdálkodásától. (In vitrokisérletekben a riboszómális peptidszintézisben működő glicil-tRNS is felhasználható adekapeptid kialakításához.)64

A peptidoglükán sejtfal és építőelemeinek képződése a citoplazmában fruktóz-6-foszfátbólCH 2OH CH 2OH CH 2OH P-O-CH 2C=O H-C-NH 2 H-C-NH-CO-CH 3 H-C-NH-CO-CH 3HO-C-H Gln Glu HO-C-H acetil-CoA HO-C-H HO-C-HH-C-OH amidáz H-C-OH aciláz H-C-OH foszfoglukomutáz H-C-OHH-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OHCH 2O-P CH 2O-P CH 2O-P CH 2OHF-6-P Glükózamin-6-P N-ac-Glükózamin-l,6-P N-ac.-Glükózamin-1-PATP ADP ATP ADP transzferázO=C-OH UMP UDP UTPH 2N-C-HPPCH 3 L-Ala UDP-O-CH 2 UDP-O-CH 2racemáz H-C-NH-CO-CH 3 H-C-NH-CO-CH 3O=C-OH H 2C=C----O------C-H HO-C-HH-C-NH 2 O=C-OH H-C-OH PEP H-C-OHCH 3 D-Ala P i H-C-OH piruvil szintetáz H-C-OHCH 2OHCH 2OHO=C-OH UDP-N-acetil-piruvil-glükózamin UDP-N-acetil-glükózaminH-C-NH 2H-C-Hreduktáz>NADP +HO-C=O D-GluUDP-O-CH 2O=C-OH CH 3 H-C-NH-CO-CH 3H 2N-C-HH-C-------O--------C-HH-C-H O=C-OH H-C-OHH-C-H H-C-OH UDP-N-acetil-muraminsavH-C-HCH 2OHH-C-NH 2 L-Liz(HOOC) DAP UDP--O-CH 2H CH 3 H-C-NH-CO-CH 3H-C-------O--------C-HO=C H-C-OHL-Ala H-C-OHBaktoprenol-P D-Glu CH 2OH(undekaprenol)L-Liz (DAP)D-AlaD-Ala (Park nukleotid, UDP-muramilpentepeptid)baktoprenol-muramil-pentapeptidGln >>>>>>>>>>>Glu

mutatja: a középső lipidgazdag rétegen kifelé és befelé egyaránt töltést hordozó csoportoktalálhatók.A Gram-negatív sejtek metszetein elektronmikroszkóppal általában három fő rétegkülönböztethető meg. A belső, 7-8 nm vastag, háromrétegű membrán felett egy vékony, 2-4 nmerősen elektronelnyelő réteg, a sejtfal látható. A felvételeken jól észlelhető a sejtfal két oldalán abelső és külső periplazmának nevezett tér. Ez utóbbit határolja (körülveszi), egy 6-l8 nm vastag,a belső citoplazmamembránhoz hasonló háromréteges szerkezet. Ezeknek a rétegeknek alétezését fagyasztott mintából (freeze-etching módszerrel) hasított metszetek elektronmikroszkóppalkészült felvételei is megerősítik.Gram-negatív sejtek vékony peptidoglükán sejtfala lizozimmal — nehezebben ugyan —de eltávolítható. Az így nyert szferoplasztokon azonban a citoplazmamembrán felett a külsőmembrán is jelen van, sőt a két membrán között sejtfaltöredékek is kimutathatók. A szferoplasztlízisével a sejtmembrán és a külső membrán roncsainak a keverékéhez jutunk, amit csaksűrűség grádienssel centrifugálva lehet szétválasztani. Újabban sikerrel alkalmazzák adextrán-polietilénglikol-foszfátpuffer összetételű, kétfázisú polimer rendszereket amembránfrakciók tisztítására. A két frakciót indokolt külön tárgyalni, mert acitoplazmamembrán és a külső membrán kémiai szerkezetében lényeges különbség észlelhető. .A FALSZINTÉZIS SEJTHÁRTYÁN KÍVÜL FOLYÓ LÉPÉSEIA membrán külső oldalán található glikozilező-enzim a dekapeptid muraminsav végét, ß-1,4kötésben a már meglevő peptidoglükánváz terminális glükózamin végéhez rögzíti. A kapcsolásközben szabaddá váló hordozó (undekaprenil-karrier) vegyület pirofoszfát végének regenerálásátegy membránhoz kötött foszfatáz végzi. (Ennek az enzimnek a működése gátolhatóbacitracinnal!) A szabaddá váló undekaizoprenil-foszfát visszakerülve a membrán belső oldaláraegy újabb, éppen készülő sejtfal építőelemmel lép reakcióba, és az előbb leírt folyamatmegismétlődik. A sejtfal peptidvázának a továbbépítését a citoplazma membrán külső oldalánműködő transzpeptidáz (karbozipeptidáz, másnéven ß-laktám kötő fehérje) végzi. Ez az enzim aterminális D-alanin eltávolításával szabaddá váló karboxil csoportot a már meglevőpeptidoglükán vázon lévő glicil-oligopeptid szabad aminocsoportjához kapcsolja, miközben aD-alanin visszamarad az extracelluláris közegben. A transzpeptidáz reakcióban a nonapeptidátmenetileg acilezi az enzimet, majd erről az átmenetileg acilezett enzimről kerül a nonapeptidaz akceptor csoportra, esetünkben a glicin N-terminálisra. A penicillin molekula kémiaiszerkezete a ß-laktám gyűrű által merevítve éppen a muramil-pentapeptid terminális D-Ala-D-Ala dipeptid szerkezetéhez hasonlít. Ezért nem meglepő, hogy a penicillin molekula bejuthat aD-Ala-D-Ala transzpeptidáz aktív centrumába ahol a felnyíló laktám reakcióképes karbonilcsoportja irreverzibilisen acilezi az enzimet. A sejtfal felépítéséhez feltétlenül szükséges enziminaktiválása természetesen akadályozza a peptidoglükán sejtfal továbbépülését, miközben amikroba egyéb életfolyamatait meghatározó enzimrendszerek zavartalanul működnek. Asejttömeg gyarapodása miatt az egyre vékonyodó sejtfalon keresztül a sejtfal alkotóelemei,különböző méretű UDP-muraminsav származékok (Park-nukleotidok) kerülnek a környezetbe.A sejt térfogatának növekedése végül a citoplazma-membrán szétszakadásához, a baktériumpusztulásához vezet. (A sejtfal szerkezetéről szerzett ismereteinket — mint látható — valójábana penicillin hatásmódjának a vizsgálata gazdagította.) – A sejtfalszintézis ismertetettmechanizmusa jól példázza a gazdaságosság elvének feltétlen érvényesülését a kialakult bioszintetikusfolyamatban. Az energiaigényes körfolyamatok a citoplazmában játszódnak le, aholaz energiatárolók feltöltésére, az ATP és az UTP regenerálására a lehetőség adott. Amembránon kívül az építőelemek aktivált formában jelennek meg, és így azok minden továbbienergia befektetése nélkül felhasználhatók a falszintézis folyamatában.66

A peptídoglükán sejtfal növekedéseA sejtfal növekedése a sejt osztódása előtt a Gram-pozitív mikrobákban az ekvatoriális zónábankövetkezik be, ahol azután a válaszfal is kialakul. Ezt bizonyítja az izótóp alkalmazásával kapotteredmény; szaporodó sejtek között a jelzett sejtek száma nem változik, mivel az öreg falrésztöbb generáción keresztül érintetlenül megmarad. A Gram-negatív baktériumok sejtfala viszontdiffúz módon nő. Jelzett diaminopimelinsavat adva a növekedő tenyészethez, a jelzett vegyületdiffúz módon oszlik el a sejt felületén. A külső membrán egyidejű képződése is igényli azt, hogya sejtfal minden irányban egyidejűleg növekedjen.Az Escherichia coli plazmolízisekor (a sejteket két percig 20 %-os szacharóz-oldatban tartva) asejtplazma összehúzódik. Az elektronmikroszkópos felvételeken ilyenkor az összehúzódócitoplazma membrán és a sejtfal között összekötő fonalakat lehet látni. Feltételezhetően ezekcsatornákként szállítják a külső membrán építőelemeit a citoplazmából a felhasználási helyükre.A PEPTIDOGLÜKÁN SEJTFAL LEBONTÁSAA sejtfal lebontására szolgáló enzimek széles körben elterjedtek. Maguk a baktériumokkülönböző, általában fajspecifikus hasító enzimeket, autolizineket, peptidoglükán-hidrolázokattermelnek. Ilyenek a peptid keresztkötéseket bontó endopeptidázok, a tejsav-L-alanin kötésthasító specifikus amidázok, illetve a poliszacharid lánc kötéseit bontó glikozidázok, az endoN-acetil-muraminidázok és endo-N-acetil-glükózaminidázok. Ezek az enzimek fontos élettaniszerepet játszanak a prokarióta szaporodásakor, illetve a spóraképzéskor, spóracsírázáskor.Peptidoglükán fal lebontására specifikus enzimek magasabb rendű lényekben, így azemberi könnyben is előfordulnak, ilyen például a lizozim, amely a glikozidos kötéseket bontva agazdaszervezet baktériummal szembeni védelmét szolgálja. Ideális lizozim forrás a tyúktojás!A lizozim alakilag globuláris ovoid fehérje (4 x 3 x 3 nm). A 127 aminosavból álló 14,6 kDatömegű, négy diszulfid kötéssel merevített enzim kémiai szerkezete jól ismert. Négy α-hélix szakaszmellett több ß-hélix szakasz fordul elő benne, amelyek hajtűszerűen meghajolva redőzöttszerkezetet alakítanak ki. A fehérjemolekula belső része apoláros.Az N-acetil-glükóz-amin-N-acetil-muraminsav polimer - a lizozim külső felületéntalálható árokba fekszik. Az enzim - amelynek működőképességéhez legalább hattagú polimerszükséges - a negyedik és ötödik tag között hidrolizálja a muraminsav és glükózamin közöttiß-1,4-glikozidos kötést. A hidrolitikus folyamat első lépéseként az árokban fekvő polimernegyedik tagja félszék konformációban kimerevedik, ami kedvez a C 1 -karboniumkialakulásának. Az enzim Glu-35 tagja végeredményben apoláros közegben van, és így aglikozidos kötés oxigénje közelébe kerülő H-ion hasítja a kötést. Kialakítja a karbónium-iont,ami a leszakadt cukorrészek távozása után a vízben levő OH-ionnal reagálva a visszamaradtnégytagú fragmentum távozását is lehetővé teszi. A karbonium-ion átmeneti stabilizálásábanfontos szerepet játszik a poláros környezetben elhelyezkedő Asp-52 disszociáltkarboxilcsoportja, miközben a Glu-35 újra protonálódik.67

A lizozim felületén levő szubsztrátkötő árokA szubsztrátum megfelelő felfekvését a hexózpolimer befogadására alkalmas árok mérete ésalakja egyértelműen meghatározza. A harmadik komponens ugyanis csak glükózamin lehet,mivel nincs hely a tejsavéter számára. A lizozim hatásosságát azonban a baktériumsejtfal kémiaiszerkezete alapvetően befolyásolja. A tenyésztő táptalaj glicin tartalma megkönnyíti az enzimműködést, mert a tetrapeptideket összekötő glicinpeptid tagszáma növekedhet, ami lazítja a falszerkezetét. Ezzel elősegíthető például a saválló festődésű Mycobacterium törzsekprotoplasztálása. — A Gram-negatívan festődő mikrobák sejtfalának lebontására közvetlenülnem használható, mert a kalcium-ionokkal stabilizált külső membrán lipopoliszacharid éslipoprotein rétege miatt az enzim nem képes megközelíteni a lebontandó sejtfalat (glükánpolimert).Kelátképzőkkel (pl.EDTA) való kezeléssel a kalciumionok eltávolítása után a sejtfalaz enzim számára megközelíthetővé és ezáltal lebonthatóvá válik. De lebonthatóvá válik amikroba sejtfala, ha többször egymás után váltakozva fagyasztjuk és felengedjük a sejtszuszpenziót.Az ismételt jégkristály képződés károsítja a külső membránt.Előnyös a lizozim működése szempontjából a sejtfal peptid tartalmának a csökkenése.Különösen könnyen bontja a lizozim az endospóra falának muraminsavat tartalmazó kortexét. Aspórakéreg muraminsav állományának mindössze hat százaléka van keresztkötésben és azt semoligopeptid, hanem L-alanin kapcsolja. A Gram-pozitív mikrobák lizozim érzékenységét azokteichoinsav tartalma befolyásolja. Zavarja ugyanis az enzim működését a muraminsav C 6 -O-acilezése. (amint tudjuk ide kötődik a teichoinsav.)68

TEICHOINSAV A PEPTIDOGLÜKÁN SEJTFALBANA Gram-pozitív baktériumok sejtfalában előforduló másik polimer a teichoinsav, egypolialkohol-foszforsav-diészter kopolimer, amelyhez cukrok, aminocukrok, kolin vagy D-alaninkapcsolódhat. A polialkohol leginkább glicerin vagy ribitol. Mennyisége — fajok szerint változóan— néhány százaléktól akár a sejtfal 50 %-át is elérheti. Bioszintézisecitidil-pirofoszforil-ribitolból illetve citidil-pirofoszforil-glicerolból egy poliizoprenol hordozó(karrier) segítségével a membrán közelében folyik. A kopolimer mérete (tagszáma), pontosszerkezete, - mivel könnyen hidrolizál - nem ismert. Antigén tulajdonságát a megtámadottszervezet védekező mechanizmusa és a taxonomusok egyaránt hasznosítják.TeichoinsavGlicerin-foszforsav kopolimerhez kötüdő alanin és glükózL-alanin α-D-glükóz L-alaninA teichoinsav a peptidoglükán váz hézagaiban helyezkedik el és foszforsavval kapcsolódik amuraminsav C 6 hidroxil csoportjához. Esetenként mannóz-glükóz diszacharidon keresztül jönlétre a kapcsolat (J. Bact. 158:990). Más esetben a membrán lipidösszetevőihez kapcsolódik(BBA. 472:1). Ez utóbbi vegyületcsoportot lipoteichoinsav néven ismeri a szakirodalom. ABacillus subtilis sejtfalában foszfáthiányos táptalajon teichuronsav képződését észlelték, amelypolimer ez esetben uronsav egységekből épült fel.69

A SEJTFALSZINTÉZIS ZAVARAIEgyes baktériumok sejtfal nélküli alakját a Lister Intézetre emlékezve L-formának nevezik.Ezeket a szervezeteket 1935-ben Klieneberger-Nobel (Lister Institut in London) aStreptobacillus moniliformis tenyészeteit vizsgálva fedezte fel. Tápanyagban gazdag körülményekközött tenyésztve különleges morfológiai képet mutató telepeket észlelt. Ezek aszervezetek a szokásos módon és sebességgel növekedtek, osztódtak. A morfológiai eltérést azokozta, hogy nem volt sejtfaluk. A szakirodalom ezeket a szervezeteket - a csoport elsőkéntfelfedezett kórokozójára emlékezve, amelyet egy mellhártyagyulladásban szenvedőszarvasmarhából izoláltak - PPLO (pleuropneumonia-like organisms) néven ismeri.Különlegességük, hogy ezek a mycoplasma csoportba sorolt, sejtfal nélküli szervezetek abaktériumszűrökön is képesek áthatolni. Szaprofita fajaik a talajból, komposztból,szennyvizekből könnyen izolálhatók. Laboratóriumi munkákhoz a szintetikus táptalajon is jólnövekedő Mycoplasma laidlawii fajt használják.A penicillin felfedezése után kiderült, hogy a baktériumok L-formái penicillinre érzéketlenek,ami a penicillin hatásmódját ismerve (a peptidoglükán sejtfal képződését akadályozza) nemmeglepő, hiszen sejtfal nélküli lények. Táptalaj módosítással az L-forma visszaalakítható azeredeti sejtfallal rendelkező formává.Ilyen sejtfal nélküli, sejtfalszintézisben sérült mutánsokat, szaporodásra képes protoplasztoknak,illetve szferoplasztoknak látszó sejteket Proteus és Escherichia fajok tartós penicillinhatásnakkitett tenyészeteiből is előállítottak. Az így nyert törzseket előszeretettel használják fiziológiaimérések kísérleti alanyaiként.Sejtfal nélküli prokariótákat a növényekben és az ízeltlábúak hemolimfájában is találtak. Afertőzött növény sárgulását okozó MLO (Mycoplasma like organisms) szervezet agazdanövényből származó szövetkultúrán jól tenyészthető. (Botanikusok fitoplazmánaknevezik.)A sejtfalszintézis ellenkező irányú zavara a fokozott sejtfalképződési aktivitás. Ismeretesekolyan Escherichia coli mutánsok, amelyeknek a tenyészetében a sejtfalképződés túltengése miattkromoszóma nélküli, úgynevezett mini sejtek jönnek létre (Proc. Natl. Acad. Sci. 57:321. 1967).Ezek a mini sejtek ép anyagcserével rendelkeznek, kromoszómájuk viszont nincs, ezért osztódninem képesek.70

AZ ŐSBAKTÉRIUMOK PSZEUDOMUREIN SEJTFALA nem tartalmazmuraminsavat. A szénhidrátláncokat kizárólag L-aminosavakat tartalmazó oligopeptidekkapcsolják össze. Gram-festődésük alapján az ősbaktériumok is két csoportra, festődőkre és nemfestődőkre oszthatók. A festékkötésben mutatkozó különbség azonban megnyugtató módon ezideig nincs okadatolva.—Azkétségtelen, hogy a Gram-pozitívanfestődő metanogén ősbaktériumoksejtfala azonos mennyiségbentartalmaz N-acetil-D-glükózamint ésN-acetil-L-talózaminouronsavat. A kétkomponens glikozidos kötésselkapcsolódva alakítja ki aszénhidrátpolimert, amit azutánL-aminosavakból álló peptidekkapcsolnak össze. Az uronsav karboxilcsoportjáhozkapcsolódik az L-glutaminsav aminocsoportja. AzL-glutaminsav δ-karboxil csoportjaegy L-alaninon keresztül kapcsolódik az L-lizin ε-aminocsoportjához. Ezek a tripeptidek kapcsolódnakössze L-glutaminsav, illetve L-ornitin segitségével.N-acetil- -O- N-acetil- -O- N-acetil- -O- N-acetil- -O- N-acetil- -Oglükózamintalózamin glükózamin talózamin glükózaminuronsavuronsav| |GluGluAlaAlaLysLysGlu (Orn) Glu (Orn) Glu (Orn)Lys Lys LysAla Ala AlaGlu Glu Glu| | |N-acetil N-acetil N-acetil N-acetil N-acetiltalózamin -O- glükózamin -O- talózamin -O- glükózamin -O- talózamin -Ouronsavuronsav uronsavA sejtfalban jelenlevő dikarbonsavak és diaminosavak funkciós csoportjainak a részvétele egyigen ellenálló és nagyszilárdságú fal kialakulásának kedvez. Erre az ősbaktériumoknakélőhelyeik ismeretében szükségük is volt, de szükségük van ma is. A cukorkomponensekUDP-aktivált formában vesznek részt a polimer kialakításában. Az oligopeptid építőelemekkapcsolásában fontos szerepet játszhat az L-alanin, mert a vizsgálatok szerint a keresztkötéskialakulásakor jelentős mennyiségű L-alanin és L glutaminsav jelenik meg a környezetben.Az ősbaktérium-sejtfal soha sem érintkezik közvetlenül a mikroba környezetével.Fehérjetermészetű anyagok, illetve glükopeptidek lazább vagy kompaktabb mozaikszerűenelhelyezkedő rétege látható az elektronmikroszkópos felvételeken. S-rétegnek (surface layer)nevezi az irodalom. A felépítő elemek kristályos szerkezetűek. A monomereket gyengébb erők,só kötés, ionos kötés, hidrogén kötés vagy hidrofób kölcsönhatások kapcsolják egymáshoz, de azősbaktériumok közé sorolt Staphylothermus marinus esetében csak 70 o C-ra melegítetthangyasav roncsolja szét ezt a fehérjeréteget.71

ENERGIANYERÉS MECHANIZMUSA A MIKROSZERVEZETEKBENAz energia raktározás történhet: Pirofoszfát kötésben — ATP formábanVegyesanhidrid formában — acetil-foszfátkéntAktív észter formájában —(PEP) foszoenol piruvátkéntAz elmúlt néhány milliárd év alatt az élővilág szinte minden lehetséges módszert kipróbált azélő sejt belső terét a külvilágtól elválasztó membrán két oldala közötti membránpotenciál fenntartásáraés hasznosítására. A kemoozmotikus kapcsolási hipotézis szerint valójában azoxidációs energia jelenik meg a hidrogén ion által fenntartott elektrokémiai membránpotenciálformájában. Ezt a kedvező állapotot valamilyen aktív protonpumpa működtetésével éri el az élősejt, mivel a membrán – amelyben a légző lánc egyes elemei rögzítve vannak – a hidrogén és ahidroxil-ionok számára átjárhatatlan. Az ionvándorlás lehetőségét mindkét irányban amembránpotenciál hatására kialakuló protongrádiens teremti meg az erre szolgáló csatornákonA protont mozgató erő (Z) így milivoltokban adható meg.∆Ρ pH = ∆ψ - Z • ∆ pH∆ψ = a membrán külső és belső oldala között mérhető potenciál különbség∆pH = pH különbség a membrán külső és belső oldala közöttR TZ = 2,3 ----------- ( számszerűen 59 mV 25 °C-on)FR= egyetemes gázállandó; T= a hőmérséklet Kelvin fokban; F= Faraday állandó(96,48 kJ/volt)Az élet fennmaradásának a fizikai-kémiai alapja az elektronmozgás, az elektronáramlásfenntartása az elektrondonortól az elektronakceptor felé. Az élő rendszer igényelteelektronmozgás fenntartására leginkább az élőlény környezetében előforduló elektrondonorként,illetve akceptorként szóba jöhető vegyületek, illetve elemek kerülnek felhasználásra. Sokesetben külső energia, például fényenergia szolgáltatja a mozgató erőt.Ciklikus fotofoszforiláció az anaerob fototrófoknálcit.c cit.b ADP

endszerek működése, az ATP-hidrolízis, az anyagcsere termékek kiáramlása, abakteriorodopszin működése. PME-t hasznosítanak a transzhidrogénezési reakciók, az ATPképződés,az ostormozgatás, a transzport folyamatok. — Az ATP hidrolízise legalább kettő, deinkább négy proton átáramlását okozza. A komplex működését a sejtben levő ATP/ADP aránybefolyásolja. A protonmozgató erő azonban képes – az ATP-hidrolízist megfordítva – katalizálniaz ATP-képződést. A komplex megfordítható működése életfontosságú az anaerobéletkörülmények esetében, amikor az ionmozgást biztosító ATP-t – a citoplazmában folyóendergonikus reakciók erdményeként – a szubsztrátszintű foszforiláció szolgáltatja.Az energia gazdag foszfátkötések hidrolízisekor felhasználható energiaATP >>>>>> ADP + Pi -30,97 kJATP >>>>>> AMP + PP -31,81 kJAcetil-P >>>> acetát + P i -44,8 kJPEP >>>>> piruvát + P i -51,5 kJAz elektronmozgás biológiai-kémiai eredményeként két életfontosságú faktor, a redukáltkofaktor és az energiagazdag foszfátkötés képződése említendő. Ennek a folyamatnak agazdaságossága a létért való küzdelem szelekciós hatású eleme. A leggazdaságosabbéletműködésért folyó verseny résztvevői a szabályozási mechanizmusok egyre tökéletesebbformáinak kifejlesztésére kényszerültek. Az elektronegativitás az elektrondonor és -akceptorközött kialakuló a redoxipotenciál értékekkel jellemezhető (∆E’ 0 Volt/mol 7 pH, 1 atm. 25 °C)α-ketoglutarát / szukcinát -0,68Volt / mol 2 e -Ferredoxin ox / red -0,48Volt / mol 1 e -CO 2 / glükóz -0,43Volt / mol 24 e -2 H + / H 2 -0,42Volt / mol 2 e -CO 2 / metanol -0,38Volt / mol 6 e - Obligát anaerobNAD(P) + / NAD(P)H -0,32Volt / mol 2 e -CO 2 / acetát -0,28Volt / mol 8 e - Obligát anaerobS° / H 2 S -0,28Volt / mol 2 e - Fakultatív aerob, ill. obligát anaerob2-SO 4 / H 2 S -0,22Volt / mol 8 e - Obligát anaerobPiruvát / laktát -0,19Volt / mol 2 e -Flavin enzim ox / red -0,06Volt / mol 2 e -S 4 O 2- 2-6 /S 2 O 3 +0,024 Volt / mol 2 e -Fumarát / szukcinát +0,03Volt / mol 2 e - Fakultatív aerobCitokróm b ox / red +0,035 Volt / mol 1 e -Ubiquinon ox / red +0,11Volt / mol 2 e -Citokróm c ox / red +0,25Volt / mol 1 e -Citokróm a ox / red +0,39Volt / mol 1 e -NO - -3 / NO 2 +0,42Volt / mol 2 e - Fakultatív aerobNO - 3 / N 2 +0,74Volt / mol 5 e -Fe 3- /Fe 2- +0,76Volt / mol 1 e - Fakultatív aerob, ill. obligát anaerobMn 4- / Mn 2- +0,798 Volt / mol 2 e -½ O 2 / H 2 O +0,82Volt / mol 2 e - Obligát aerob, ill. fakultatív aerobN 2 O / N 2 +1,36Volt / mol 2 e -A fenti adatokból számítható az energia egyenérték-változás: ∆G° = -nF • ∆E’ 0n = átvitt e – száma; F = Faraday állandó (96,48 kJ/volt); ∆E’ 0 Volt /mol redoxipotenciálA legnegatívabb atom az oxigén, ideális elektronakceptor, amit a citokróm rendszer hasznosít!73

A reagáló pároktól függő redoxipotenciál értékekből számítható felszabaduló energiaa reagáló párok különbség Volt-ban ∆G 0’ /molH 2 / NADH0,10 V— -19,3 kJNADH / flavinenzimFlavinenzim / citokróm bCitokróm b / citokróm cCitokróm c / citokróm aCitokróm a / O 2—NADH / 1 / 2 O 20,24 V0,04 V0,31 V0,02 V0,52 V1,13 V— -46,46 kJ— -7,7 kJ— -59,86 kJ— -3,86 kJ—100,46 kJ—212,67 kJA kemoorganotrófok energiaforrásként - elektrondonorként - a glükózt bontják piroszőlősavig,illetve ecetsavig, egyrészt a glikolízis, másrészt a pentózfoszfát-ciklus útján. Ez utóbbi útzavartalan működése a nukleinsav-építőelemek szintézise szempontjából fontos.A REDUKÁLÓ KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT KIALAKULÓ SEJT ÉLETTANASzén-dioxid redukciója a metanogénekben metánnáA metán képződése energia kvantumként ATP-t szolgáltatPéldaként vizsgálhatóa pseudomurein sejtfalat képző hidrogént és szén-dioxidot hasznosítóMethanococcus fajok tulajdonságai, és a sejtfalnélküliThermoplasma acidophilum életviteleA citrát ciklus működése reduktív körülmények között a szén-dioxid felvételét jelentiA glükóz neogenezis lehetőséget teremt– a sejtet felépítő vegyületcsoportok (szénhidrátok képződésére– a pentóz ciklus működtetésévelegyrészt a nukleinsav képződéshez szűkséges ribóz és dezoxiribóz igény kielégítésére,másrészt az aromás vegyületek (aminosav, vitamin, etc.) bioszintézisének táplálására– az L aminosavakból felépülő fehérjék (enzimek, hisztonok) képződésére– a nélkülözhetetlen vitaminok képződésére– a nukleinsavak metabolizmusára– a szubsztrátszintű foszforilációra– a NADPH szint biztosításáraAz élővilág sejtjei minda a mai napig órzik az redukáló miliőben kialakult élettani állapotukat.A később kialakult oxidatív légkör toxikus hatása ellen az oxidatív foszforilációmechanizmusának kifejlesztésével védekeztek.Az eukariótákban ez a mechanizmus a mitokondriumokba szerveződve teljesíti feladatát.74

METANOGÉNEKAz ősi légkör alkotóelemeinek hasznosításaA Földünk légkörében előforduló metán 80-90 %-át a metanogének termelik energianyerőfolyamatuk közben. Az évi metántermelés eléri a gigatonna nagyságrendet (10 12 kg/év).{A légkörben folyamatosan felszaporodó metán az ózonpajzsot a széndioxidnál nagyobbmértékben károsítja. A légkör metántartalmának monoton növekedését a metánhasznosító aerobbaktériumok — tapasztalataink szerint — nem képesek megakadályozni. }GlutaminsavGlutaminsavPiruvátFoszforsavRibózA HIDROGÉN mint elektronforrás –A 8-hidroxi-5-deazaflavin tartalmú hidrogenáz működéseA metánképződés lehetséges energia hozadékaCO 2 + 4 H 2 —> CH 4 + 2 H 2 O ∆ G o = −135,0 kJ/mol metánH 3 C-OH + H 2 —> CH 4 + H 2 O ∆ G o = −112,5 kJ/mol metán4 H 3 C-OH —> 3 CH 4 + CO 2 + 2 H 2 O ∆ G o = −104,9 kJ/mol metán75

(1). A metánképződés formát-dehidrogenáz által katalizált — oxigénre különösen érzékeny —első lépése, a szén-dioxid megkötésével járó formilmetanofurán (CHO-MF) képződés. A széndioxidaktiválásához ATP jelenléte szükséges. Az aktiválási energia a metánképzés utolsólépésében szabadul fel. In vitro kísérletben CoM-S-CH 3 vagy titán-citrát jelenléte szükségesredukcióhoz.Metán és víz képződés szén-dioxidból az ősbaktériumokban (CoM-SH szerepe)(2). A formilcsoport a formil-transzferáz segítségével kerül a tetrahidrometanopterinre, ahol azelső redukciós lépésben a ciklohidroláz hatására kialakul az 5,10-metenil-tetrahidrometanopterin(HC=H 4 MPT) köztitermék. Egyes fajokban az F 342 sárga színű, fluoreszkáló vegyületet mintformaldehid aktiváló faktort (FAF) írták le, amelyben a pterinen kívül építőelemként hexózamin,glutamát és foszforsav jelenlétét igazolták.(3). A metenilcsoport redukcióját 5,10-metilén-tetrahidrometanopterinné az F 420 kofaktorralműködő oxidoreduktáz katalizálja.(4). A következő lépésben a metilén-reduktáz hatására jön létre a metil-tetrahidrometanopterin(H 3 C–H 4 MPT).(5). A CoM-SH-ra történő metilátvitel folyamatában a metil-5-hidroxi-benzimidazoil–kobamidkulcsintermedierként szerepel. A metilcsoport áthelyezését a pterinről kobamidra a metil-transzferázsegíti elő. A reakció szubsztrátumaként az enzim metanolt is képes hasznosítani. –Ezekben a mikrobákban – metanolt használva elektronakceptorként – jelentősen növelhető akobamid (korrinoid) tartalom a tenyészethez adott dimetilbenzimidazollal. Ezt a felismerést aB 12 -vitamin nagyipari előállításakor hasznosítják.(6). A korrinoidot tartalmazó metiltranszferáz segítségével kialakuló metil-CoM a szubsztrátumaa redukciós ciklus utolsó lépésének, amelyben a F 430 kofaktorral működő metil-CoM reduktázsegítségével a metán felszabadulásával egyidejűleg heterodiszulfid, CoM-S-S-heptanoil-treonin-76

foszfát (CoM-S-S-CoB) képződik. Az utolsó redukciós lépésben - metanofurán és szén-dioxidjelenlétében - a diszulfid-kötés reduktív felhasadása és egy újabb szén-dioxid felvétele történik.(7). A bonyolult folyamatot egy erősen konzervatív szekvenciájú, több fehérjéből állóheterodiszulfid-metil-reduktáz enzimkomplex katalizálja, amelynek tömege a metanogénbaktériumok fehérje tartalmának több mint 10 %-át képviseli. Az F 420 (8-hidroxi-5-deazaflavin)kofaktort igénylő A 1 -fehérje a CoM-S-S-heptanoil-treonin-foszfát redukcióját végzi. Az A 3avaskén-fehérje szállítja az elektronokat a metilredukcióhoz. A metilviologént tartalmazó A 3b -fehérje dehidrogenáz aktivitást mutat. Az oxigénre nem érzékeny A 2 -fehérje viszont a metil-CoA metilreduktáz ATP-függő reduktív aktiválását végzi. A hat alegységből álló (α 2 β 2 γ 2 )fehérje 2 F 420 (8-hidroxi-5-deazaflavin) kofaktort és 2 HS-CoM faktort tartalmaz.{Az idesorolt családok szigorúan anaerob, viszonylag lassú fejlődésű (2-7 nap osztódási idő)litotróf mikroszervezetek, morfológiai, biológiai és fiziológiai szempontból jelentősenkülönböznek egymástól. Közös tulajdonságuk, hogy anyagcseréjük végtermékeként metánképződik. Ez a folyamat anaerob légzésnek tekintve molekulánként egy-egy ATP szintézisétjelenti.} Megjegyzendő! A metilezett korrinoidtartalmú fehérjében a kobalt oxidáltabbformában van! Az enzimhez kötött corrinoid szerepét a metil-H 4 MPT:CoM-metiltranszferázkatalizálta reakcióban M. barkeri metanogenezisét vizsgálva tisztázták (A HS-CoM nemtartalmaz kobaltot!). Az enzimkomplexet Methanobacterium thermoautotrophicum-ból is77

kinyerték, majd 8 alegységének tömegét is meghatározták. – A hidrofób komplex 2 molkorrinoidot, 8 mol nemhemvasat és 8 mol savérzékeny ként tartalmaz A metil átvitelvalójában két részreakcióként, a korrinoidot tartalmazó fehérje metilezési és demetilezésifolyamataként jelenik meg.CH 3 -H 4 MPT + E:Co (I) >>>>>>> H 4 MPT + E:CH 3 -Co (III)E:CH 3 -Co (III) + HS-CoM >>>>>>> CH 3 -S-CoM + E:Co (I)H-N-H H| |C-----N// \NC=O\ /C===C/ \H-N N-H\ /C===C| |H 3 C H-C-CH 3|N-H|C/ \\H-C C-H|| |H-C C-H\ //C|H-C-HH-C-OHH-C-OHH-C-OHH-C-HOO--------C-HH-C-OHH-C-OHH-C-OHC-OHH-C-HOHO-P=OOH-C-COOHH-C-HH-C-HCOOHMPTTetrahidro-metilpteridinH-N-H|H-C-H|C---O//H-C\C==C-H|H-C-H|O|C/ \\H-C C-H|| |H-C C-H\ //C|H-C-HH-C-HN-HC=OH-C-HH-C-HH-C-COOHN-HC=OH-C-HH-C-HH-C-COOHN-HC=OH-C-HH-C-HH-C-COOHHOOC-C-HH-C-HH-C-HCOOHMFRMetanofuránS-H|H-C-H|H-C-H|H-C-H|H-C-H|H-C-H|H-C-H|C=O|H-N|H-C-COOH|H-C-CH 3|O|HO-P-=O|OHHS-HTP(CoB)Mercaptoheptanoiltreonin-foszfátS-H|H-C-H|H-C-H|O=S=O|OHCoM-SH2-merkaptoetán-szulfonátF-430 Ni kofaktorA metánképződésben szereplő vdgyületek szerkezeti képlete78

A filogenetikailag különböző metanogének a szigorúan anaerob ősbaktériumok csoportjátalkotják A metánképződésnek az ábrán látható egyszerű útja ugyan nem jár szubsztrátszintűfoszforilációval, de a protongrádiens (2 H + és Na + ) kialakítása lehetővé teszi az ATPszintézist. A metilotróf metanogének citokrómokat is tartalmaznak, A proton transzportotszolgáló (MP) metanofenazint a membránban izoprén egységekből felépülő izooktán rögzíti.Szerepe abaktériumokban és az aerob ősbaktériumokban előforduló quinonokéhozhasonlítható. Az oxidált forma reverzibilis redukciójaugyanis a citokromok közötti elektron átvitelt segíti,miközben a citoplazmából (∆µΗ + ) protont juttat amembrán külső felületére. Először M. mazei-ből izoláltáktisztán ezt az elektronhordozót, amely a F 420 -ról származóelektront továbbította a heterodiszulfid képződéstkatalizáló enzimhez. A redukáló rendszer elektron igényéttöbbnyire a membránhoz kötött hidrogenáz elégíti ki. Ahidrogén oxidációja a proton citoplazmamembránon kívülgyülik fel. Ez az enzim a hidrogénről származó elektront azF 420 -faktort (8-hidroxi-5-deazaflavin) tartalmazóenzimrendszerre viszi, amely redukálva színtelen, oxidált állapotban pedig zöldeskékenfluoreszkál. A hidrogenotróf Methanobacterium thermoautotrophicum viszont nem tartalmazilyen fehérjét. A metán-képző merkapto-heptanoil treonin-foszfátot tartalmazó heterodiszulfid(CoM-S-S-CoB) képződés az energiakonzerválás szempontjából figyelemre méltó. Amembránhoz kötött heterodiszulfid reduktáz működése ugyanis kapcsolatot teremthetkülönböző membránban működő elektrontranszport-mehanizmusokkal.A heterodiszulfidnak a M. mazei befordított vezikulumaiban folyó hidrogénfüggő redukciójaprotonképződéssel jár. A visszafordított vezikulumban az F 420 dehidrogenáz működéseeredményezi a kiválasztásra kerülő proton, a ∆µΗ + felszaporodást és ennekkövetkezményeként az ATP képződést. Ez utóbbit természetszerüleg a protonofórok gátolják,viszont serkentik az elektrontranszportot – azaz a heterodiszulfid redukcióját – sőt az ATPázgátlóként használt N,N´-diciklokarbodiimid hatása is felfüggeszthető protonofórokadagolásával.79

A metánképződés enzimrendszerének in vitro működése szempontjából optimális CO 2 :H 2 arány2 : 8 volna. Ezt az arányt a természetes tenyészkörülmények nem biztosítják, a hidrogénkoncentrációja sem éri el a µM nagyságrendet. Itt a velük együtt élő hidrogéntermelőkszolgáltatják a szubsztrátumot. — Kloroformmal, mint metánanalóggal a metánképződést és azATP szintézist egyidejűleg lehet gátolni. A kérődzők ez esetben szén-dioxidot és hidrogéntböfögnek metán helyett. A metilreduktáz működése CoM-analógként adagolt 2-brometánszulfonáttalszelektíven gátolható. Megfelelő kezeléssel azonban rezisztencia fejleszthető ki ellene.A tápközegben jelenlevő szénhidrátot ezek a mikrobák nem képesek felvenni, a szervezetükfelépítéséhez szükséges szénvegyületeket maguk állítják elő. Szubsztrátumként hidrogén, széndioxid,formaldehid, acetát, metanol, metilamin szerepelhet. A korrinoidot tartalmazótranszferáz közvetít a metanogenezis enzimrendszere és az anabolikus folyamatokat táplálószén-monoxid dehidrogenáz között, amely a köztes anyagcserét táplálva adja meg a lehetőségetaz ősbaktériumok növekedéséhez szükséges vegyületek szintézisére.A szén-monoxid szén-dioxiddá alakulása M. barkeri nyugvó sejtjeiben ATP képződéssel jár.A szén-monoxid-dehidrogenázok (CODH) két fő csoiportját azonosították. Aerob80

aktériumokban egy Mo-[2Fe-2S]-FAD aktivitású enzimkomplex aktívitását figyelték meg;Anaerob körülmények között novekedőbaktériumból egy Ni-[3Fe-4S] CODHenzimet tisztítottak. Mindkét enzimreverzibilisen működik a szén-dioxid (CO 2)és a szén-monoxid (CO) átalakulásban azacetil-CoA szintáz (ACS) komplex tagjaként.Az anaerob acetogén Moorella thermoaceticabaktériumban az α2β2 tetramer enzimetvizsgálva mefállapították, hogy a két β alegységhezkapcsolódik a CODH tevékenységez az enzim központi magja. Összesen a 310kDa tömegű enzim 7 vas-kén [4Fe-4S] klasztert tartalmaz. Minden α egység tartalmaz egyfém egységet, a két β egységpedig öt klasztert. Ezek külső elektron hordozókkal vankapcsolatban, mint például a ferredoxinnal . Az ACS tevékenység az α egységet tartalmazórészén történik.A képződő redukált ferredoxinról a két elektront a ferredoxin:metanofenazinoxidoreduktáza citokrómok segítségével juttatja a heterodiszulfid-reduktáz-hoz, amelyregenerálja a 2-merkaptoetánszulfonátot, ismert nevén CoM-SH-t.Az ősbaktériumokból (Methanobacterium thermoautotrophicum, M. barkeri, M. azei,Acidianus ambivalens, Sulfolobus acidocaldarius, Methanosarcina thermophila,) és azeubaktériumokból több heterodiszulfid reduktázt izoláltak. Különböző redoxreakciókbanvesznek részt ezek a nem hem vas-kén fehérjék, amelyekben a 60-90 aminosavból álló fehérjecisztein aminosavaihoz kötődő vaskén (Fe 4 S 4 ) csoport – a ferredoxin alacsony redoxpotenciálértéke (–0.43 V) miatt – alkalmas a ferredoxint redukáló fehérje (FRA: ferredoxint redukálóasszociátum) által közvetített elektron átvitelére.A ferredoxin hatócsoportjánakFerredoxin oxidoreduktáz komplex muködése(Fe 4 S 4 ) feltételezett elhelyezkedésedea gazdafehérje ciszteinjeihez kötődvefotoszintetikus elektrontranszport (2Fe,2S)a kloroplasztiszbanA ferredoxinhatócsoportjánakfeltételezettelhelyezkedésea gazdafehérjeciszteinjeihezkapcsolódva3Fe,4S ferredoxin. 4Fe-4S ferredoxin elektronfelvételiformaHidrogenáz által H 2 -bol felszabadított elektron redukálja a ferredoxint (H 2 >>>2 H + és 2 e – )A redukált ferredoxinról NADP + közvetíti az elektront a bioszintetikus folyamatokhozFerredoxin red + NADP + >>>>ferredoxin oxidoreduktáz>>>>>> ferredoxin ox + NADPHA Methanobacterium fajok növekedési sebességét - a sejt felépítéséhez szükségesvegyületek (szénváz) képződésének a sebessége (glükóz neogenezis) - a dikarbonsav-ciklusttápláló acetil-CoA képződés határozza meg. A szénhidráttermelés esetenként glükogén felhalmozásátis lehetővé teszi (Methanolobus spp.). A szén-dioxidot általában nem a Calvin-ciklusonkeresztül kötik, hanem az ismertetett reduktív-citromsav ciklusban ferredoxin segítségévelkarboxileződik az acetil-CoA, majd a foszfoenol piruvát és a szukcinil-CoA vesz fel széndioxidot.81

Az Ősbaktériumok és az anaerob Eubaktériumok között az acetil-CoA úton a CO 2aktiválásában lehet eltérés. A Clostridium thermoaceticum esetében a hangyasavdehidrogenáz és a formiltetrahidrofolát (THF) képződés energiaigényét az ATP hidrolíziseszolgáltatja. Megfordítva pedig a formiltetrahidrofolát oxidációja szubsztrátszintűfoszforilációval az ATP képződését katalizálja. – Több esetben a szénmonoxid hasznosításátbizonyították. Egyre több adat igazolja, hogy a metanogénekben, például az ecetsavat termelőClostridium thermoaceticum-ban autotróf széndioxid-fixáláshoz hasonló rendszer működik.Eztaz autotróf utat járják a szulfátredukálók.A Methanobacterium thermoautotrophicum esetében a CO 2 és H 2 felhasználásával ATPjelenlétében képződő hangyasavból származó formil-csoport kötődik a tetrahidropterinre(H 4 MPT), amelyen végbemegy a redukció. A metil-tetrahidropterinről (CH 3 -H 4 MPT) egy korrinoidottartalmazó enzim ([Co]E 2 ) közvetíti a metilcsoportot egy Ni,Fe tartalmú szénmonoxiddehidrogenázra (E 1 ), amelyen egy széndioxid redukciójával készül az acetil-CoA végtermék.Régebbi tankönyvek szerint a Methanobacillus omelianskii az etanolt is képes hasznosítani.=== 2 CH 3 -CH 2 -OH + CO 2 ------> 2 CH 3 -COOH + CH 4 ===A részletes vizsgálatok azonban kiderítették, hogy a metánképződéshez a hidrogént, a bendőkevert baktérium flórájában jelenlevő, etanolt oxidáló anaerob baktériumok szolgáltatják. (Ha ametánképződést specifikusan gátló kloroformot juttatunk a rendszerhez, akkor a bendőben csakhidrogén és széndioxid gáz képződését észlelhetjük. — Metán helyett ezt böfögik a kérődzők.)2 CH 3 -CH 2 -OH + 2 H-O-H 2 CH 3 -COOH + 4 H 2CO 2 + 4 H 2 CH 4 + 2 H-O-HEgyesek nitrogénforrásként jól hasznosítják az ammóniát. Mások, például Methanobacterthermoautotrophicum egyedüli szerves nitrogénforrásként képes hasznosítani a glutaminsavat.Több esetben a karbamid hasznosíthatóságát is megfigyelték.Néhány törzsük képes a légköri nitrogén megkötésére is. A Methanosarcina barkerimolibdént tartalmazó nitrogénkötő enzimrendszerének a működését a wolfrám gátolja, avanádium pedig helyettesítheti az enzimkomplex molibdén-kofaktorát.Az ammónia csökkenti a nitrogenáz enzimkomplex aktivitását. Kiemelendő, hogy a nifgénekszekvenciája nagyfokú egyezést mutat az eubaktériumokban megismert nif-génszerkezetével.82

Metanogének (Methanobacteriales) fontosabb csoportjainak összehasonlításaNemzetség Membrán építőelem Sejtfalszerkezet Gram-festődés mozgásMethanobacterium C 20 di- és C 40 tetraéter Pszeudomurein + -Methanobrevibacter C 20 di- és C 40 tetraéter Pszeudomurein + -Methanococcus C 20 diéter Fehérje,glükózamin - +Methanospirillum C 20 di- és C 40 tetraéter Glükoprotein - +Methanosarcina C 20 diéter Heteropoliszacharid + -Gram-pozitívan festődő, anaerob, termofil, de 70 o C felett nem növekedő, nem mozgó pálcák.Tavak üledékében, szennyvizek fenekén összegyűlő iszapban, mocsarakban élnek.Biogáztelepek baktérium-flórájában is megtalálhatók. Pszeudomurein sejtfaluk építőelemeiközött N-acetilglükózamin, N-acetilgalaktózamin, N-acetiltalózamino-uronsav, L-lizin, L-alanin,L-treonin, L-glutaminsav fordul elő számottevő mennyiségben. Kromoszómájuk mérete azősbaktériumokra jellemzően csupán 1,2x10 9 Da. Az idesorolt Methanobacteriumthermoautotrophicum a család feltűnően gyorsan osztódó (20 perc generációs idő) képviselője.Egyszerű és gyors tenyészthetősége miatt ez a mikroba a metanogéneket kutató laboratóriumokkedvelt kísérleti alanyává vált. Biokémiai tulajdonságait részletesen vizsgálták. Ez a faj csupánszervetlen anyagokból (CO 2 , NH 3 , S o , H 2 ) képes szervezetét felépíteni, szulfátot azonban nemhasznosít. A citrát-ciklusa hiányos. A széndioxid beépítésében fontos szerepet kap aKoenzim-F 420 . A szén-dioxidból történő acetil-CoA képződés mechanizmusára vonatkozóvizsgálatok ez ideig eredményt nem hoztak. Külön említést érdemel a jelentős mennyiségbenfeldúsuló ciklikus D-2,3-biszfoszfoglicerát, amelynek azonban élettani szerepét eddig nemsikerült kideríteni.Leigh 1983-ban koenzim- és vitamintartalmukat is meghatározta.(Appl. Environ. Microbiol. 45:800-803)Koenzim-MKoenzim F 420MetanopterinF 430 faktor0,3 - l6 mmol/g0,7 - 2,7 mmol/g0,7 - l,3 mmol/g0,2 - 0,8 mmol/gMetanofurán0,3 mmol/gKorrinoidok0,l - 4 mmol/gElenyészően csekély mennyiségben az eubaktériumokban előforduló vitaminokat is sikerültkimutatni. Vizsgálatai szerint ezek a vegyületek a az ősbaktériumokban is az eubaktériumokbanfelderített mechanizmushoz hasonló módon képződnek. A porfirin, korrinoid és F 430 faktorképződését például az eubaktériumokban megfigyeltekhez hasonlóan a levulinsav szabályozza,mégpedig olyan módon, hogy represszálja a δ-aminolevulinsav-dehidráz képződését.—A családtehenek bendőjéből izolálható faja a Methanobacterium ruminantium. A mérések szerint 1,7mM acetát hasznosításakor 100 millió baktérium képződik 1 ml bendőtartalomban. Gyakrantalálkozunk vele különböző anaerob protozoonok citoplazmájában. Például a bendőben élőSelenomonas ruminantium citoplazmájában ml-ként 10 10 M. ruminantium termeli a metánt.Ebből a baktériumból kinyert ATP-függő metil-CoM-metilreduktáz sejtmentes körülményekközött is hosszabb ideig működőképes.Ide tartozó fontosabb családok:A Methanothermaceae család Methanothermus fajai 80 o C feletti hőmérsékleten növekedveszén-dioxidból és hidrogénből metánt termelnek.83

A Methanomicrobiaceae család egyes tagjai (Methanomicrobium mobile) élőhelyükön abendőben, poláris ostorral mozognak, de csak 40 o C-on szaporodnak. A Methanospirillum külsőfelületén az SDS (nátrium-laurilszulfát) lazító hatásának és a proteázok hidrolitikus hatásánakellenálló, urea- és lúgrezisztens fibrilláris fehérjeréteg található. A bifitanil-diglicerol-tetraéterelemekből felépülő membrán hidroxilcsoportjához glikozidos kötéssel kapcsolódódiszacharidok, más esetben α−glicerofoszfát található.A Methanococcaceae családba sorolt mozgékony, anaerob Methanococcus fajok H 2 -t ésszén-dioxidot hasznosítanak, 85 o C-on is életben maradnak, de csak 60 o C-on osztódnak.A Methanosarcinaceae család Methanosarcina fajai szennyvíziszapban és a bendőbenfordulnak elő. Az elektronmikroszkópos felvételeken lemezes szerkezetűnek tűnő — főleggalaktózamint, glükuronsavat és galaktózamino-uronsavat tartalmazó — különösen merevszerkezetű, savanyú természetű heteropoliszacharid sejtfallal rendelkező Methanosarcina fajokGram szerint pozitívan festődnek. Mindkét családra jellemzően a pszeudomurein sejtfaluk külsőfelületét egy proteázzal nem bontható fehérjeréteg alkotja. Gram pozitívan festődnek. AMethanococcus fajok fehérjéből felépülő sejtfalában a glükózamin is fontos szerepet tölt be. Acsalád tagjaiban citokrómok jelenlétét igazolták. A légköri nitrogént is képesek megkötni, delegnagyobb sebességgel (2 nap generációs idő) a szén-dioxidot és hidrogént tartalmazó közegbenosztódnak. Az acetátot foszfoacetil-transzferáz segítségével hasznosítják. Sejtfalukbanaminocukor, cukor és uronsav található. Metilalkoholból és acetátból is képeznek metánt..Methanosarcina mazei mikrofotóNormarski optikával fotózvaScanning elektronmikroszkópos fotóMethanosarcina barkeriA Methanosarcina barkeri részletes enzimológiai vizsgálata igazolta, hogy ez esetben azα-ketoglutarát citromsavon keresztül képződik. A Methanogenium és Methanospirillum fajokfőleg csatornaiszapból izolálhatók. A Methanolobus és Methanothrix fajok sejtjei hosszúláncokat alkotnak. Lassan osztódnak (7 nap generációs idő). A sejtfaluk külső fehérjerétegenátrium-laurilszulfáttal lemozdítható. Szénforrásként acetátot hasznosítanak, mégpedig az84

acetil-CoA szintetáz segítségével. Tartalék tápanyagként polifoszfátot és glükogént halmoznakfel. A Methanococcoides fajok metanolból is képesek felépíteni a szervezetüket.Methanothrix soehngeniiFonaldarab elektronmikroszkópos fotója 0,4 µm Scanning elektronmikroszkóp fotó 1,3 µmlizáló sejt elektronmikroszkóppal fotózva 0,4 µm Fáziskontraszt mikroszkópi fotó 45 µmA Methanoplanaceae család kemotróf tagjai peritrich ostorokkal mozgó, széles, lapos testecskékformájában találhatók mocsaras területeken. Metanolból nem képesek metánt termelni. Azidesorolt kemoorganotróf Methanosphaera fajok viszont szén-dioxidból nem, csak metanolbólképesek hidrogén jelenlétében metánt termelni.REDUKÁLÓ KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT KIALAKULT SEJT TULAJDONSÁGAI:Szén-dioxid redukciója a metanogénekben metánná. A metán képződése energia kvantumkéntATP-t szolgáltat. Működésükhöz nélkülözhetetlen a metil csoportot áthelyezőcobalamin. Példaként a pseudomurein sejtfalat képző hidrogént és széndioxidothasznosító Methanococcus fajok tulajdonságait, és a sejtfalnélküli Thermoplasmaacidophilum életvitelét vizsgáljukA citrát ciklus működése reduktív körülmények között a szén-dioxid felvételét jelentiA glükóz neogenezis lehetőséget teremt a sejtet felépítő vegyületcsoportok (szénhidrátokképződésére;– a szubsztrátszintű foszforilációra;– a NADPH termelésére;–a pentózciklus működtetésével a nukleinsav képződéshez szűkséges ribóz és dezoxiribóz igénykielégítésére;– az aromás vegyületek (aminosav, vitamin, etc.) bioszintézisénektáplálására;– a nukleinsavak metabolizmusára;– az L aminosavakból felépülő fehérjék(enzimek, hisztonok) szintéziséhez nélkülözhetetlen vitaminok képződésére.85

CIANOCOBALAMIN (B 12 vitamin)) előállításaA huszadik század első harmadában még rettegett gyógyíthatatlan betegség volt a vészes vérszegénység. Abetegséget Addison írta le a XIX. században, Biermertől származik az elnevezés „anaemia perniciosa”, melyrőlmég a XX. század első évtizedében is arról folyt a vita, hogy vajon fertőző betegség, vagy valamilyen toxikuseredetű kórral küszködik az orvostudomány. Georg H. Whipple kaliforniai professzor elvéreztetett kutyákon avészes vérszegénységhez hasonló tüneteket észlelt, amit máj etetésével sikerült kedvezően befolyásolnia. Minotés Murphy 1926-ban megállapította, hogy máj etetéssel a vészes vérszegénységben szenvedőkön segíteni lehet( J. Amer. Med. Assoc. 86:470.1926). Az általuk javasolt terápia — nagy mennyiségű máj elfogyasztása —kétségtelenül sok esetben hatásosnak bizonyult. Az igazsághoz hozzátartozik, hogy Hippokratész, későbbGalenos és Avicenna is alkalmazta a májetetést a vérszegénység tüneteinek az enyhítésére.A terápia bizonytalanságát egy angol klinikus Castle 1929-ben közölt elmélete magyarázta. Acsontvelőben folyó vörösvértest képződéshez a táplálékban megtalálható „extrinsic” faktoron kívül egy másikkomponens az „intrinsic” tényező is szükséges. Ez a gyomornedvben jelenlevő hipotetikus faktor segíti a májbantalálható vitamin felszívódását és a szérumban az α-globulin frakcióhoz való kötődését. A vitaminhiány tragikuskövetkezménye valójában a gyomorban termelődő és a felszívódást segítő speciális glikoprotein, az „intrinsicfaktor” hiányával magyarázható. Normál esetben a „cobalamin-intrinsic” komplexet az ileumban találhatóreceptorok kötik meg, majd az itt termelődő disszociáló faktor segítségével a vitamin aktív transzport útján kerüla bélhámsejteken keresztül a véráramba. A bélbaktériumok által termelt vitamin a gazdaszervezet számáraáltalában nem hozzáférhető. Biztos hatás csak az extrinsic faktornak (B 12 ) a véráramba juttatásától remélhető. Acobalamin a magasabb rendű szervezetek életműködése szempontjából nélkülözhetetlen termék. Minden olyanintramolekuláris átrendeződésben nélkülözhetetlen a szerepe, amelyben egy H atom és valamilyen szubsztituenshelyet cserél, de a metil-csoport átvitelére szolgáló biokémiai reakciók végbemeneteléhez is szükséges.aa| |H − C − bX − C − b| |X − C − cH − C − c| |ddmetilmalonil-CoA: CoA-karbonil mutáz (B.B.R.C- 2:1. 1960)metilmalonil-CoA: szukcinil CoA izomerázacetohidroxisav-izomeroreduktázdioldehidráz (J.Biol.Chem. 236: 1199 .1961)homoszerin-metiláz (Nature 195:340 1962)methionint hasznosító metilezési reakciókCDP : dCDP átalakulás (J. Biol. Chem. 236:1199 1961)L-treo-3-metil-aszpartát karboxiaminometil mutáz (Proc Nat. Acad. Sci. 44:1093. 1958)Ez a prokarioták által előállított kémiailag stabil vitamin az alapvető életfolyamatokban betöltött kulcsszerepemiatt a környezetből felvett faktorként az élővilágban mindenütt előfordul. A magasabb rendű szervezetektáplálkozás közben szerzik be ezt a számukra esszenciális vegyületet, amely kis mennyiségben minden emlősszövetben µg/kg nagyságrendben megtalálható. A pillangós növények a szimbionta baktériumaiktól veszik fel.Az emberi szervezet napi szükségletét néhány µg vitamin fedezi.Természetes anyagok cianocobalaminként meghatározható vitamin tartalmaTyúk máj 80 ng/g Tyúktojás sárgája 120-1200 ng/tojásTojás fehérje 0 Tyúkürülék 13 ng/gMarha máj 1300 ng/g Tej 3 ng/gTehén ürülék 460 ng/g Bendőbaktérium 1200 ng/gBendő protozoa 80 ng/g Ehető gomba 0,5-1 ng/gÉlesztő 0,6-1,1 ng/g Halliszt 64 ng/gFöldimogyoró liszt 23 ng/g Lucerna gyökérgümő 310 ng/g86

A világpiacon évenként 10 tonna B 12 vitamin kerül eladásra, amelynek 30 %-át sertés és baromfi tápszeralkotórészeként forgalmazzák.A tématerület élettani jelentőségére utalva Murphy, Minot és Whipple felfedezésükért 1938-ban Nobeldíjatkaptak. Hamarosan világszerte megindult a verseny a májban található hatásos anyag előállítása céljából.Végül is néhány hónap eltéréssel 1948-ban három cég kutatócsoportja jelentette be a keresett, B 12 -nek nevezettvörös színű kristályos hatóanyagnak az izolálását marhamájból illetve (Streptomyces griseus)-ból.Rickes és munkatársai Merck(Science 107:396);Wijmenga és munkatársai, az Organon kutatói;Lester Smith és munkatársai a Glaxo kutatói(Biochem. J. Proc VIII 43/1948)A korrinoid váz kémiai mérésére alátható fényben és az ultraibolya tartománybanészlelhető fényelnyelésük jó lehetőséget ad, aprobléma azonban az eredmények biológiaértékelésekor jelentkezik. A magasabb rendűélőlények ugyanis csak a dimetilbenzimidazolt,illetve hidroxibenzimidazolt tartalmazócobinamid származékot képesek hasznosítani.A téma fejlődése szempontjából nagyjelentősége volt Shorb bakteriológusfelfedezésének. Megállapította, hogy bizonyosenzimhiányos baktériumok nem képesek a B 12vitamin szintézisére, számukra ez a vitaminnövekedési faktor. Ez a felismerés a bonyolultklinikai kipróbálás helyett a vitaminmennyiségének a mérését agardiffúziósmódszerré egyszerűsítette, ami felgyorsította akutatómunkát. Az Escherichia coli 113-3-58jelű mutáns ellenőrzötten tiszta tioglikolsavat ésaszparagint tartalmazó táptalajon nemszaporodik, de ha ezzel a mutánssal fertőzöttagar lemezbe fúrt lyukakba cobinamidszármazékot cseppentünk, akkor a baktérium azagarban diffundáló vitamin hatására osztódnikezd. A növekedési gyűrű átmérője a vitaminkoncentráció függvénye. Ha a mutánsban csak acobinamid váz szintézise sérült, akkor a tápközegbe adott hatástalan korrin köztes terméket maradékenzimkészletével hatásos származékká képes alakítani. Ennek a lehetőségével számolnunk kell! A növekedésisebességet az elvégzendő enzimes lépések száma befolyásolja. Az agardiffúziós módszer 5-20 pg/mL B 12koncentráció tartományban használható. Biológiai mérőtörzsnek használták a Lactobacillus leichmannii ATCC4797 számú és az ATCC 7830 számú mutánsokat. Fokozható a módszer érzékenysége, ha növekedést serkentőhatás mérését nem agar táptalajon, hanem kémcsőben végezzük. A mutáns maradék enzimkészletének zavaróhatását kiváltandó a törzs növekedésének mérésével nyert számszerű adatokat célszerű kromatográfiásmódszerekkel ellenőrizni, illetve olyan megbízható mérőtörzset alkalmazni, amelyik nem képes a köztes terméketaktiválni. A klasszikusnak tekintett papírkromatográfiás eljárással —nátrium cianidot és kálium-perklorátottartalmazó izo-butanolos futtatószerrel — jól elkülöníthető a B 12 vitamin, a cobinamid, a cobirsav és acianokobalamin 5-hidroxibenzimidazol származéka. A komponensek mennyiségi viszonyairól a kivágottfoltokból kioldott anyag spektrofotometriás vizsgálata tájékoztat.Később kiderült, hogy a magasabb rendűekhez hasonlóan már a protisták sem képesek a vitaminszintézisére, így a vitamin biológiai mérésére jól használhatók. A Euglena gracilis már ng nagyságrendbenérzékeli a vitamin jelenlétét Lényegesen javult a biológiai meghatározás értékelhetősége azzal, hogymérőtörzsként az Ochromonas malhamensis használata vált általánossá (Analyst 80:132. 1956) Ezek amikroszervezet csak B 12 vitamin jelenlétében képesek növekedni. Hátrányuk, hogy lassan szaporodnak; négy, ötnap szükséges a méréshez.A HPLC elterjedésével a korrinvázas komponensek aránya és abszolút mennyisége könnyenmeghatározható. A nyers kivonat B 12 tartalmának közvetlen meghatározása azonban a szennyező termékek miattnem végezhető. Ezért a cianid-származékká alakítást követő fenolos extrakcióval nyert vitamin-koncentrátumotelektroforézissel előtisztítják. Ez az előtisztított termék kerül a HPLC oszlopra.87

A B 12 vitamin röntgen-diffrakciós eljárással igazolt kémiai szerkezetét Dorothi Hodgkin csak 1955-ben közölte.A gyógyszerpiacon forgalmazott B 12 vitamin, acianocobalamin összegképlete C 63 H 88 O 14 N 14 PCo,móltömege:1355,5 Szerves oldószerekben rosszul,vízben jól oldódó, acetonban, éterben, kloroformbanoldhatatlan sötétvörös kristályos termék. A lúgos éssavas körülményeket jól tűri, de az erős oxidáló ésredukáló szerek károsítják. Ez az eddig ismert egyetlenbiomolekula ahol kovalens fém-szénkötés kialakul.Különlegessége a kobalt két- illetve három- értékűalakban való jelenléte. Több mint 70 lépést igénylőtotálszintézisét Woodward irányításával 1973-banfejezték be. Ez a szintézis azonban csak elméletiérdekességű. Ezért a B 12 vitamint természetes forrásbólnyerik. – A vitamin korrinoid alapváza a porfirinek jólismert tetrapirrol szerkezetétől abban különbözik, hogyaz A és D pirrol gyűrű közvetlenül metin híd nélkülkapcsolódik. Összehasonlíthatóság céljából az ábránbemutatott hem szerkezetében a pirrol gyűrűkhöz vas atom,vagy a klorofillban magnézium kapcsolódik.A cobalamin pirrolgyűrűin metil, acetamid, propilamidcsoportok találhatók; a pirrolgyűrűk N atomjai pedig egykobalt atomot kötnek. Ehhez a fématomhoz kötődik egykülönleges bázis, amelyhez α-glikozidos kötésselkapcsolódik egy D-ribóz-3-foszfát. Ez utóbbi a D gyűrűpropionsav oldalláncát amidáló amino-izopropanolhozkötődik foszfátészter kötéssel. A különleges heterociklusosbázis általában 5,6-dimetil-benzimidazol. A gyógyszerkéntforgalmazott B 12 vitamin valójában egy műtermék. A korrinoid gyűrűnek a különleges bázissal ellentétes térfelénegy cianid gyök ( – CN) kötődik a kobalt atomhoz. A cianocobalamin a természetes vitamin olyan átmeneti alakja,amely az élő szervezetben könnyen alakulhat aktív vegyületté, például az ionos kötéssel rögzült cianid gyökhelyett a kovalensen kötődő 5-dezoxi-adenozint találjuk.Szukcinil-CoAGlikokollProtoporfirin IXALSPBGS|| || δ−aminolevulinsav || || PorfobilinogénF 430 koenzinALLOSZTERIKUS SZABÁLYOZÁS Ni ++Uroporfirin III. Tetrapirrol-metán ShirohidroklorinMetilezés, Co +++Koprogén IIICobirinsavGlutaminCobirsavAminopropanolCobinamid5-dezoxiadenozinFe ++ Mg ++ 5’dezoxiadenozilkobinamidHemGTPKlorofill5’dezoxi-adenozilcobinamid-GDPHemoglobinCitokrómokKatalázPORFIRINBŐLKÉPZŐDŐVEGYÜLETEKRiboflavin5,6-dimetilbenzimidazolα-ribazol--5foszfát5’dezoxi-adenozilcobalamin-foszfát(vázlat)5’dezoxiadenozilcobalaminB 12 –koenzim88

A cobalamin bioszintézise — amint az előző vázlat mutatja — a porfirin szintézisútból ágazik el.Ebből következik, hogy a képződésében a δ-aminolevulinsav szintetáz (ALS) aktivitása meghatározó jelentőségű.Ennek az enzimnek a működését alloszterikusan szabályozza a protoporfirin-IX. Várható tehát, hogy az ALSenzimszint géntechnológiai módszerrel történő növelése fokozza a cobalamin képződést.Protaminobacter és Rhodopseudomonas törzsekből sikerült egy olyan életképes hibridet előállítani,amelyben nem működik az alloszterikusszabályozási mechanizmus.Az eredeti Protaminobacter ruberIFO 3708 jelü törzsben az amino-levulinsavszintézis szabályozása jól működik, ezért atenyészet alig éri el a néhány µg/ml cobalaminszintet. A másik mikrobában, a fototrófRhodopseudomonas spheroides IFO 12203törzsben viszont az aminolevulinsav-szintetázszabályozás nélkül működött. Ennek akövetkezményeként ebben a törzsbentermészetes élőhelyén nagy mennyiségűklorofill képződhet. A Rhodopseudomonasprotamicus névre keresztelt életképes hibridtenyészet B 12 tartalma (prekurzor adagolásnélkül) meghaladta a 100 µg/ml értéket.Végeredményben nem meglepő, hogy a kéttörzsből előállított hibridben a szabályozásnélkül termelődő δ-aminolevulinsav a B 12vitamin képződését jelentős mértékbenmegnöveli (Eur. Pat. 131456. 1985), hiszen akorrinoid váz szintézise és a klorofillképződése közös köztesanyagot hasznosít.A bioszintézis út következő lépésében — aporfobilinogén szintetáz (PGFS) felületén —két δ-aminolevulinsav kondenzál,porfobilinogén képződik, ami nem más mintegy aminometil csoporttal, ecetsavval éspropion savval szubsztituált pirrol származék.A szintézisért felelős enzimkomplexugyancsak alloszterikusan szabályozott. Azaminolevulinsav szintetázhoz hasonlóan enneka komplexnek a működését is a sejten belülihem koncentráció, a protoporfirin-IX szintbefolyásolja.A porfobilinogének összekapcsolása bonyolult enzimkomplex felületén következik be. Egy NADP kofaktortigénylő deaminációs reakcióban egy csupán átmenetileg megjelenő, igen reakcióképes hidroximetilbilánképződik. Megjegyzendő, hogy végül a kialakult tetrapirrol származék nem szimmetrikus. A tetrapirrol Dgyürűjében az ecetsav- és a propionsav-oldallánc sorrendje ellentétes a többihez viszonyítva. Ez az eltérés abioszintézis folyamán irányító szerepet tölt be.A négy porfobilinogénből kialakult uroporfirin-III (uroporfirinogén III) az utolsó közös intermedier azalapvetően fontos élettani feladatokat ellátó porfirin származékok képződésében. Ebből a vegyületből képződik afényhasznosító klorofill, de itt ágazik el a citokromok, a hemoglobin, a kataláz valamint más pirrol származékokközött a B 12 szintézis útja is.Az uroporfirinből meghatározott sorrendben bekövetkező metilezési reakciókkal alakul ki a korrin váz.A második metilezési reakció terméke a dimetilkorriferin, illetve dihidroizobakterioklorinként ismertshirohidroklorin, egy újabb elágazási pontot jelent. Innen indul ugyanis az F-430 dehidrogenáz nikkelttartalmazó kofaktorának a szintézise.A metionin segítségével folyó metilezési reakciókat követően a tetrapirrol szerkezetben a B 12 szintézisirányába mutató döntő átalakulás következik be. Nevezetesen a trimetil-korriferin C gyűrűjén található ecetsavoldallánc dekarboxilezését követően, az előző reakciósorban metilezett C 20 szénatom ecetsav formájában kiválik.Ez az eliminációs reakció az A és D gyűrű közvetlen kapcsolódását teszi lehetővé. A kialakult szerkezeti változássegíti a kobalt atom bekötődését és a cobirinsav képződését.89

90cobirinsav

A cobirinsav továbbalakulását — a B 12 koenzim bioszintézisének történéseit — szemlélteti a következő vázlat91

A kialakult erősen savas jellegű cobirinsav hét karboxil csoportja közül hat vesz részt a további átalakulásban. Acobirinsav hat glutamin felhasználásával hat amid csoport kialakításával alakul cobirsavvá. A cobirsav csupánegyetlen savas jellegű csoportot, egy propionsav oldalláncot tartalmaz, amely hamarosan egy treoninbólszármazó amino-izopropanollal peptid kötést kialakítva reagál. A szabad hidroxil csoport ezután egy ATP-bőlszármazó foszforsav-maradékkal képez észtert. – Ez az észter a továbbiakban egy GTP-ből származó guanozinmonofoszfáttalreagál pirofoszfát felszabadulása mellett. A GMP-cobirsav származék pirofoszfát kötéselehetőséget ad az α-ribazol-foszfáttal való reakcióra is. A reakcióban a ribóz C 3 hidroxil csoportja reagálguanilsav felszabadulása közben. A képződő vegyület a B 12 foszfát. Ezt követőleg a ribóz C 5 hidroxil csoportjátacilező foszforsav maradékot (foszfátészter) az utolsó lépésben egy foszfatáz eltávolítja.A ribazol imidazol csoportja lazán kötődik a korrin vázba rögzített kobalt atomhoz. Ez a komplex képzőtulajdonságáról jól ismert atom a hozzá lazán kötött imidazol gyűrű elektronszerkezetét is felhasználja a B 12vitamin által katalizált reakciók bonyolításához. A kobalamin képződés közben figyelemre méltó kémiai reakciókzajlanak a kobalt-szén kötés kialakulása érdekében. A B 12 koenzimben 5’-dezoxi-adenozin kapcsolódikközvetlenül az imidazol elektronszerkezetével kapcsolatban levő kobalt atomhoz. A kobalt körül kialakulóreakcióképes elektronrendszer miatt az 5’-dezoxi-adenozin könnyen lecserélhető. Ez történik a B 12 vitamin iparielőállításakor, amelyben a műterméknek tekinthető cianid származékot nyerjük. Ezt a vegyületet a gyógyászatbanazért alkalmazhatjuk sikerrel, mert az élő szervezetben a felhasználás helyén a cianid csoport ugyanilyen könnyencserélődik az adott reakcióban szereplő gyökkel, 5’-dezoxi-adenozinnal illetve a metioninból származó metilgyökkel.A vitamin nukleotid jellegű építőelemeiként ismeretes benzimidazol származékok az elektrontranszportfolyamatokban szereplő, különböző dehidrogenázok kofaktoraiként ismert izoalloxazin vegyületekbőlképződnek. Jól szemlélteti ez a folyamat azt, hogy az élő szervezet bonyolult anyagcsere-rendszerében még abomlástermékek is szerepet kaphatnak. Sőt - amint látható - a szelekciós nyomás hatására biológiai jelentőségetnyerve, végül is esszenciális élettani faktorrá válhatnak. A különböző flavin enzimek kofaktorainak szintézise92

guanozin-trifoszfátból (GTP) indul, amit a GTP-ciklohidroláz egy hangyasav eltávolításával 2,5-diamino-6-keto-4-(5'-foszforibozilamino)-pirimidinné alakít. Ebből egy reduktív deaminációs reakcióban 5-amino-2,6-diketo-4-(5’-foszforibozilamino)-pirimidin képződik.A következő reakcióban két molekula vesz részt. Az előbbi diketo-pirimidin származék egy másikmolekula ribitil csoportjával reagálva 6-metil-7-(1’,2’-dihidroxi-etil)-8-foszforibitil lumazinná kondenzál. Ez alumazin származék a flavin nukleotídok közös köztesterméke.Riboflavin képződéskor egy szénatom eltávolításával 6,7-dimetil-8-foszforibitil lumazin képződik,amiből ugyancsak két molekula vesz részt a riboflavin szintetáz által katalizált reakcióban. Az egyikreakciópartnerrel leszakadó négy szénatomot tartalmazó fragmentum felhasználásával fejeződik be a riboflavinszintézis, miközben az előbbi reakcióban megismert 5-amino-2,6-diketo-4-(5’-foszforibitilamino)-pirimidinképződik. Ez a „mellék-termék” a bioszintézis reakciósorában köztes termékként természetesen újrafelhasználásra kerül.Az F-420 dehidrogenáz koenzime ugyancsak a 6-metil-7-dihidroxietil-8-foszforibitil lumazinbólképződik, mégpedig célszerűen a riboflavin képződéskor eltávolított C 1 töredék felvételével a lumazin 7-hidroxi-9-D-5’-foszforibitil-izoalloxazinná alakul. (Az ábrán az utolsó sor első szerkezeti képlete) A cobalamincsoportba tartozó vegyületek benzimidazol építőelemei ezekből az izoalloxazin származékokból képződnek. Azizoalloxazin-gyűrű felnyílása után egy molekula alloxán képződése mellett a megfelelő benzimidazol származékképződik (5,6-dimetil-benzimidazol, 5-hidroxi-benzimidazol, 5-metoxi-benzimidazol, stb.)A NAD + -ból nukleotidil pirofoszfatáz hatására képződő nikotinsavamid-mononukleotid egy transzglikozidázkatalizálta reakcióban ribazol-5-foszfáttá alakul. Ez utóbbi vegyület az 5'-dezoxiadenozil-cobinamidguanizindifoszfáttal reagál. A ribazol-5-foszfát pedig egy transz-glikozidáz katalizálta reakcióban GMPlehasadása mellett a cobinamid vázhoz kapcsolódik. A képződő vitamin-foszfát azután egy foszfatázsegítségével alakul B 12 -koenzimmé. Az 5 dezoxiadenozin mobilitását előnyösen befolyásolja a korrinoid vázbanelhelyezkedő kobalthoz kapcsolódó imidazol jelenléte. A korrin váz által meghatározott sík egyik oldalánhelyezkedik el a dimetilbenzimidazol gyűrű, a másikon a kobalthoz kapcsolódó 5'-dezoxiadenozil, illetveesetenként a metil, vagyhidroxil csoport, valamint azéletmentő gyógyszerkéntforgalmazott cianocobalaminelőállításakor ott elhelyezkedő –CN gyök. A B 12 vitaminbioszintézisének az utolsófokozottan energiaigényeslépéseihez a NAD + , az ATP ésa GTP adja energiát.A B 12 vitamin nagyüzemielőállítására aerob, illetve anaerob fermentációs eljárásokat dolgoztak ki. Kisebb mennyiségben antibiotikumfermentációs eljárások melléktermékeként felszaporodó megsemmisítésre ítélt biomasszából nyerték ki. A múltszázad közepén — a Merck kutatói — Rickes és munkatársai a streptomycint termelő Streptomyces griseuskiszűrt micéliumtömegéből állították elő. Az ötvenes években a kristályos vitamin piaci értéke 1200 $/g volt,ami minden költséget elviselt.Később direktfermentációs eljárásokat dolgoztak ki az életfontosságú vitamin előállítására, amely atermelő mikroorganizmus növekedési fázisban képződik. Ez a megállapítás a genetikai beavatkozással sajátszükségletén túl termelő törzsekre is érvényes. – Miller és Rosenblum 1960-ban Pseudomonas denitrificanstörzset izoláltak, amely literenként 600 µg vitamint termelt. – A Merck cég kutatói 10 éves törzsnemesítőmunkával 60 mg literenkénti termelésre képes mutánsát állították elő. A vitaminképződés magas szintjét atáptalajba jelenlevő betain (trimetil-glicin) előnyösen befolyásolja; nem mint metil donor, hanem glicinanalógként a δ-aminolevulinsav szintetáz aktivitását fokozva növeli a vitamin képződését. A tápközegbenszénforrásként használt répamelasz bőségesen tartalmaz betaint. Prekurzorként 5,6-dimetilbenzimidazolt kelljuttatni a tenyészethez, mivel a nemesített törzs anyagcsere rendszere nem képes annyi benzimidazolt előállítani,amennyit a képződő cobinamid aktíválása igényel. Az eljárás oxigén igényének kielégítése céljából a tenyészetentérfogatával egyező levegő átáramoltatása szűkséges.A termelő táptalaj összetétele L –1 pH=7.4 90 óra 29 °C 420 ford.perc –1100,0 g cukorrépa melasz 0,025 g 5,6-dimetil-benzimidazol2,0 g élesztőkivonat 0,005 g Na 2 MoO 4 .H 2 O5,0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 0,188 g Co(NO 3 ) 2 .6 H 2 O0,3 g MgSO 4 .7 H 2 O 0,020 g ZnSO 4 .7 H 2 O0,2 g MnSO 4 .H 2 O93

A fermentációs folyamat végén a tenyészetet 30 percig 120 o C-on tartják. Ezzel kiszabadítják a vitamint ésrokonvegyületeit a baktérium sejtből. A lehűtött, feltárt sejttömeget pH=8,5-re állítva 16 órán keresztül káliumcianiddalkeverik. Literenként 60 g cinkkloriddal kiegészítve pH=8-ra állítva szűrik. A szűrletet 1 / 10 -edtérfogatnyi krezol:széntetraklorid 1:2 arányú elegyével háromszor extrahálják. Az összegyűjtött szerves fázishozfél térfogat butanolt adva vízzel extrahálják ( 1 / 10 térfogat). A vizes fázist 1 / 100 -adnyi krezol-széntetraklorideleggyel extrahálva töményítik. A szerves fázisból a vitamin aceton:éter 2:1 arányú elegyével kicsapható. — Acsapadék minimális metanolban oldva aktivált alumínium oxid oszlopon tisztítható 2 % ecetsavat tartalmazómetanollal.Gazdaságos fermentációs eljárást fejlesztettek ki a fakultatív anaerob Propionibacterium fajokkal.(Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207— P. shermannii ATCC 13673) Az eljárás első szakaszábankukoricalekvárt és 10 % glükózt tartalmazó táptalajon anaerob körülmények között propionsavas erjedés folyik.Ez az anyagcsere korrinoid vitamint igényel a szukcinil-CoA metilmalonil-CoA átalakításhoz. Nem csoda tehát,hogy a fermentációs szakaszban a B 12 vitamin 5'-dezoxiadenozil származéka túltermelődik. A glükóz mennyiségnégynapi anaerob fermentációja után kezdődik az aerob szakaszra való áttérés. Az aerob szakaszban a baktériuma fermentációs szakaszban képződött propionsavat hasznosítja. Ez az élettani reakciósor fokozottan igényli acobalamin vitamin jelenlétét. Az aerob anyagcsere elősegíti a dimetilbenzimidazol képződését a feleslegessé válóriboflavinból. Ezért a folyamat nem igényel prekurzor adagolást.A B 12 vitamin előállításának ipari megvalósításában a magyar gyógyszeripar is figyelemreméltóeredményeket ért el. A negyvenes évek végén a Kőbányai Gyógyszergyár (Richter Gedeon Rt.) májkivonata"Perhepár" néven került forgalomba. Ezt 1951-ben egy tisztított készítmény a "Neo-perhepár" váltotta fel. A gyárvegyészei heroikus munkával hat tonna májból 2 gram kristályos vitamint állítottak elő. A teljesítményegyértelművé tette a gazdasági vezetők számára, hogy kiindulási anyagként valamilyen olcsóbb vitamin-forrástkell keresni. Szabadalmi okokból a direkt-fermentációs eljárás bevezetése nem jöhetett számításba. Azantibiotikum termelés melléktermékeként való előállítását is megvizsgálták. A Chionoinban folytatottsztreptomicin termelés azonban a kiindulási anyag mennyiségét meghatározta, azaz a gyártás felfuttatását azalapanyag mennyisége limitálta. A gyár kutatóinak figyelme a rothasztó baktériumok jelentős B 12vitamintartalmára irányult. 1954-ben a soroksári szennyvíztisztító baktériumflórájából 16,8 g kristályos terméketállítottak elő. 1958-ban a kezdeti mennyiség 100-szorosára emelték az évi termelést. A hetvenes évekre avitamintermelés meghaladta a fél tonnát. Ezt azonban már nem a csatorna iszap, hanem fermentációs eljárássalnyert baktériumtömeg feldolgozása tette lehetővé. Az első 10 m 3 térfogatú anaerob fermentor 1956-ban kezdtemeg a termelést a szennyvíztisztítóból nyert vegyes baktériumpopulációval.A vizsgálatok szerint a csatornaiszapból származó populáció vitamintermelő tagja a Methanobacteromelianskii volt. A Svéd Királyi Akadémia mikrobiológusának, Halina Menjahl dolgozatában talált utalásalapján sikerült az eljárást iparilag hasznosíthatóvá tenni. – A hatvanas években az eljárást fél-folytonostechnológia bevezetésével fejlesztették. Elhagyták a szennyvíziszapot. A belőle elkülönített, metanolhasznosításra szelektált baktérium tömeg folytonos fenntartásával biztosították a folyamatos termelést. – A 80-asévekben már 500 m 3 -es fermentorokban folyt a termelés a gyár dorogi üzemegységében. Hamarosan a B 12koenzim fermentációs előállításával bővült a készítmények száma.A termelési eredmények javulása és a piaci verseny radikális árcsökkenést okozott. A kinyerésitechnológia is jelentősen változott. Mivel a hatóanyag az élő sejtben található az első lépés a sejtek feltárása, amitkövet a cian származék előállítása. A fermentléhez NaCN-ot adva és acetonnal hígítva 30 percig keverik 50 o C-on, miközben a cianocobalamin oldatba megy, a sejtből kiszabaduló fehérje pedig kicsapódva az alakoselemekkel együtt szűrhetővé válik. A vizes-acetonos oldathoz kloroformot adva a korrinoidok a vizes fázisbaszoríthatók és kromatografálással tisztíthatók. — A környezet szennyezését elkerülendő a hőkezelésselkiszabadított cianocobalamint XAD-2 gyantán kötik. Csapvízzel való mosása után a szelektíven megkötöttvitamint vizes alkohollal mossák le, majd töményítés után kristályosítják.Mai élettani ismereteink alapján nem meglepő, hogy a metanolt hasznosító mikroorganizmusokkülönösen alkalmasak a B 12 vitamin nagyipari előállítására. A metil hasznosítás első lépéseként ametiltranszferáz-hoz kapcsolódó B 12 -koenzim kobalt atomján indul a reakció. A metilcobalamin képződése segítia metanolból származó szén hasznosulását. Ebből a szénből építi fel a Methanobacterium a szénhidrátokat,fehérjéket, lipideket, az egész szervezetét. Ugyanakkor a dehidrogénezési folyamatokban eltávolított elektron ésfelszabaduló proton számára a metil csoport elektronakceptorként is hasznosul. A CoM-SH-hoz kötődőmetilcsoport az F 430 és az F 420 fehérjéket tartalmazó metilreduktáz enzimkomplex működésének eredményekéntvégül is metánként távozik az enzimfelületről. A szénlánc felépüléséhez szükséges acetil-CoA a COdehidrogenázfelületén képződik. Mint látható az Ősbaktérium csoportba sorolható baktériumtömegszénforrásként és energiaforrásként (elektronakceptorként) hasznosítja a metanoltxxxxxxxxxxx94

A SZÉNVÁZ KÉPZŐDÉSE SZÉN-DIOXIDBÓL(a reduktív citrátkör működése)aszpartátCO 2acetil-CoAferredoxin oxidoreduktázCoA-SHtranszamináztranszamináz piruvát alaninATPCO 2AMP P ioxálacetátNADHNAD +malátfoszfoenolpiruvát>ADP1,3-bisz-P-glicerátNAD(P)HH 2 Otrióz-foszfátNAD(P) +fumarátbenzilviologén 2 H fruktóz-1,6-bis-PszukcinátATP >>>> CoA-SH hexóz-monofoszfát útADP >>>> NADP + CO 2α-ketoglutarátNADPHIzocitrát-dehidrogenázNH 3 Glutaminsav-dehidrogenázNADP +glutamátATPNH 3ADPglutaminizocitrát95

CO 2 -ot beépítő(ferredoxin-függő) reduktív citromsav ciklus és a glükoneogenezisacetát CITRÁTATPCoA-SH>ADPacetil-CoAFDH 2 NADP +ferredoxincisz-akonitátizocitrátdehidrogenázCO 2 FD NH 3 CO 2NADPHpiruvát >>>>>>>> (Alanin) (Glutamát) α-ketoglutarátNADP + NADPHFDferredoxin CO 2ATP CO 2 FDH 2szukcinil-CoAADPCoA-SH P iATPADPborostyánkősavP iflavinGDP CO 2 GTP reduktázPi flavin-H 2oxálecetsav L-almasav fumársavPEP foszfoenol-piruvát NADH NAD + H 2 O==========================================enoláz2-PG 2-foszfoglicerát (Asp) 3 CO 2 CALVIN ciklusmutázfényenergia3-PG 3-foszfoglicerátATP >>>>> foszfoglicerát-kináz 6 3-PGADP

hasznosít. A reduktív citromsavciklusban felvett 3 szén-dioxid glicerinaldehid-3-foszfáttáalakítását 6 ATP, 3 NADPH, 1 NADH, 2 redukált ferredoxin és egy redukált flavinmononukleotid segíti. — A glükózneogenezis által táplált életfontosságú pentozfoszfátciklusanaerob körülmények között alakult ki. Életfontosságú az aromás csoportot tartalmazókofaktorok (PAB), vitaminok (nikotinsav), aminosavak bioszintézise szempontjából. Ezértműködése aerob kürülmények között is nélkülözhetetlen.Az anaerob körülmények között kialakult, de aerob kürülmények között is nélkülözhetetlenHEXÓZMONOFOSZFÁT-ÚT és a PENTÓZFOSZFÁT-CIKLUS műküdése6 G-6-P + 12 NADP + 6 CO 2 + 5 G-6-P + 12 NADPH6 glükóz-6-foszfát (G.6-P)O>>6 NADPH G6P-dehidrogenázI6 glükonolakton-6-foszfátD>>>>>>>>>> 6 HOHA6 glükonát-6-foszfát (6PG)T>6 NADPHV >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>6 CO 26 ribulóz-5-foszfát (Ru5P)RE epimeráz izomerázVE 2 + 2 xilulóz-5-foszfát (Xu5P) 2 ribóz-5-foszfát (R5P)RZtranszketolázIB 2 glicerinaldehid-3-foszfát (GAP) 2 szedoheptulóz-7-foszfát (Se7P)ILItranszaldolázS2 eritróz-4-foszfát (E-4-P) 2 fruktóz-6-foszfát 2 (F6P)ÁT transzketolázALAKizomerázUL 2 GAP DHAP 2tÁ 2 (F-6-P)SaldolázIfruktóz-1,6-biszfoszfát (F-1,6-P 2 )SZ Pi foszfatázAK fruktóz-6 foszfát (F-6- P)ASG6P-F6P izomerázZ5 GLÜKÓZ-6-FOSZFÁT97

KÉN ÉS A MIKROVILÁG. A KÉN BIOGEOKÉMIAI KÖRFOLYAMATASzulfát asszimiláció aerrob és anaerob körülmények között E. coli példáján mutastható be.Szulfátlégzés szigorúan anaerob körülmények között Desulfovibrio példáján tanulmányozható.Az elemi kén redukálása anaerob thermofil Desulfuromonas ősbaktérumokkal végezhető.Az elemi ként szulfáttá oxidáló Thioplaca, Thiothrix fajok 5-10 %-os kénsavban is szaporodnak.Az élővilág esszenciális alkotó elemeként számon tartott kén, atomszerkezetéből következőenfontos élettani szerepet tölt be. A kén külső elektronhéján az oxigénhez hasonlóan 6 elektrontalálható, atomátmérője miatt azonban az elektronegativitása kisebb (oxigén=3,5 — kén = 2,5).Élettani szempontból a kén két létfontosságú aminosavnak, a ciszteinnek és a metioninnak azépítőeleme. A cisztein a fehérjék térbeli szerkezetét rögzítő diszulfid kötések kialakulására adlehetőséget, a metionin pedig a bioszintetikus folyamatok metilezési reakcióiban játszikpótolhatatlan szerepet. Metionin nélkül a fehérjék szintézise sem indul meg.A kén a bioszféra számára hasznosítható elemi formában, a tengeralatti hőforrások környékénkiválva, a földfelszínen pedig kénkigőzölgésként jelenik meg. A geokémiai folyamatokbanképződő redukált kén az ásványokban fémszulfidok formájában lelhető fel. A természetesvizekben szulfátként fordul elő jelentős mennyiségben. Mindkét előfordulását a mikrovilág erreszakosodott fajai elsősorban elektronakceptorként hasznosítják.A nyolc tagú gyürűs formában előforduló kén (S 8 ) vizes szuszpenziót alkot. Magashőmérsékleten hosszú lánc formájában szulfhidrátot alkotva (S 8 OH –) felnyílik, amiből OH –ionok hatására SOH – kénhidrát (H-S-OH) szabadul fel. Végül egyensúlyra vezető reakciókbanHOS – 2 tiokénhidrát — továbbmenve pedig, H 2 SO 2 szulfoxilsav képződikSOH – + SOH – S-S-OH – + OH – S = + HO-S- OHvizes szuszpenzióban folyó egyensúlyi reakciókH 2 S + H 2 SO 3 H 2 SO 2 + H 2 SO 2 H 2 SO H 2 SO 2 + H 2 S H 2 SO S o + H 2 OA kén szulfáttá és kénhidrogénné diszproporcionálódása S 8 + 8 H 2 O 6 H 2 S + 2 H 2 SO 4vizes közegben energetikailag (∆G=+48kJ) nem előnyös, mégis redukálható fémek jelenlétében(például MnO 2 + H 2 S S o + Mn ++ + 2 OH – ∆G = –92 kJ) a folyamat végbemegy:3 S o + 4H 2 O + MnO 2 ====> 2 H 2 S + SO 42-+ 2 H + + Mn ++ + 2 OH - ∆G = -44 kJMindkét kiindulási anyagból, — az elemi kénből, illetve a szulfátból — redukcióval állítják előa mikrobák az életműködésükhöz szükséges kénhidrogént, amely azután a cisztein, illetvemetionin alkotóelemeként látja el élettani feladatát. A kénanyagcsere egyes reakciófolyamataitfunkciójuknak megfelelően nevezhetjük meg.A szulfát redukciója jelentős szabadenergia változással jár.2-4 H 2 + SO 4 —> S 2- + 4 H 2 O ∆ G° -l72 Kj2-3 H 2 + SO 3 —> S 2- + 3 H 2 O ∆ G° -l82 kJ2-4 H 2 + S 2 O 3 —> S 2- + H 2 S + 3 H 2 O ∆ G° -l93 Kj9 H 2 + S 4 O 6 —> S 2- + 3 H 2 S + 6 H 2 O ∆ G° -449 KjA szulfátlégzés eredményeként képződő nagy mennyiségű redukált kén a környezetbenkénhidrogén vagy fémszulfidok formájában halmozódik fel.98

A SZULFÁTASSZIMILÁCIÓ VÁZLATA--SO 4 >> PPAPS(szulfát)> ADP(adenilsav-kénsav vegyesanhidrid)ATP-szulfurilázAPS-kinázPAPS (foszfo-adenilsav-kénsav vegyesanhidrid)> adenozin-3,5-biszfoszfát PAPS-reduktáz>>>>>>>> NADP +SO 3--(szulfit)* ferredoxin red NADP +ferredoxin oxHS − (szulfid)>> acetátciszteinA feltüntetett szulfit-szulfid átalakítás biokémiai útja feltételezhetően valamilyen templáthozkötött, labilis köztitermékek (S 2 O 5 , S 2 O 4 , S 2 O 3 ) reverzibilis változásain keresztül vezet.Az Escherichia coli-ban 750 kDa tömegű metalloflavoprotein (4 FAD, 4 FMN, 12 Fe) komplexközvetíti a szulfitredukcióhoz szükséges elektronokat.A szulfátasszimiláció, - amely a felhasznált elektronok száma (8 e – ) és a reakcióterméke (HS – ) szempontjából a disszimilációtól nem különbözik - igen elterjedt az élők (élesztők,baktériumok, fonalas gombák, növények) világában. Lényeges különbség azonban, hogy azaerob, illetve anaerob körülmények között egyaránt folyó asszimilációs folyamat szigorúanszabályozott körülmények között képződő végterméke, a kénhidrogén nem jelenik meg akörnyezetben, hanem szerves vegyületekben, aminosavakba épülve hasznosul.Az asszimilációs út biokémiailag is eltér a szulfátlégzéstől, amennyiben a redukciósfolyamat megindulása foszfoadenilsav-kénsav vegyesanhidrid (PAPS) köztitermék képződésétigényli. A reakcióút energiaigényét (ATP) egyrészt a szénforrás lebontásával járó enzimszintűATP-képződés fedezheti, más esetben az energiaforrás dehidrogénezése közben leválasztottelektronok - a flavoproteineket és citokrómokat tartalmazó láncon végig haladva - tesziklehetővé a szükséges mértékű ATP-képződést. Feltételezhető, hogy a hordozóhoz kötött szulfitredukcióját a növényekben folyó szulfitredukcióhoz hasonlóan, redukált ferredoxin végzi, amit alegtöbb esetben NADPH-függő oxidoreduktáz tart redukált állapotban.A szulfátlégzés folyamata szigorúan anaerob körülmények között, nyolc elektronfelvételével a szulfát kénhidrogénné alakítását jelenti. A folyamatot másnévendeszulfurilezésnek, illetve disszimilációnak nevezhetjük.4 H 2 + SO 4 2- + 2 H + ======> 4 H 2 O + H 2 S99

A szulfátlégzésre képes mikroorganizumusok közül a Desulfovibrio, a Desulfotomaculum,Desulfobacter, Desulfonema, Desulfobulbus, Desulfococcus fajok jeleskednek. (Ezeket a fajokattisztázatlan rendszertani kapcsolataik miatt egyesek a Beggiatoa félék végére sorolják.) Akénhidrogén végül is a mikroba környezetében szaporodik fel.A szulfátlégző baktériumok lassan növekedő, Gram-negatív szervezetek. Osztódásuknéhány naptól néhány hétre is elnyúlhat. A növekedési görbéjük elsősorban a képződőkénhidrogén mérgező hatása miatt lineáris. Ezen a helyzeten aligha enyhít a jelenlevő nehézfémekkel,elsősorban a vassal való rekció, mert a vas-szulfid kicsapódása vashiányt okoz, amiezeknél a szevezeteknél növekedést korlátozó tényezőként jelentkezik. Szénhidrátot általábannehezen fogyasztanak, ezért laboratóriumi tenyésztéskor a tápközegbe tejsavat, élesztőkivonatotadnak.A SZULFÁTLÉGZÉS VÁZLATA2-SO 4 (szulfát)>>PPATP-szulfurilázAPS (adenilsav-kénsav vegyesanhidrid)AMPHSO 3–>3 H 2 O biszulfit-reduktáz2–S 3 O 6 (tritionát)

Az evolúció során a szulfátredukáló baktériumok az Archaebacterium fajoktól függetlenül, azöld szulfidoxidálók után, a tisztán heterotrófoktól elválva, talán a vörös szulfidoxidálókkalegyidőben jelentek meg. Semmiképen sem tekinthetők a fototróf baktériumok őseinek. A tisztánheterotrófoktól talán ők válhattak el elsőként. Lehetséges, hogy a széndioxid fixálásánaklehetőségeit is itt munkálta ki a természet. Mindent összevetve egy korai állapotot jelentenek azobligát anaeroboktól a citokróm alapon szerveződő aerob metabolizmus felé.Anaerob körülmények között az ősbaktériumok termofil kénhasznosítói közé soroltDesulfuromonas, Desulfurococcus, Staphylothermus, Pyrodictium fajok az elemi ként isképesek redukálni. Ugyanezt látjuk azoknál a kemotróf, illetve fototróf baktériumoknál is (Beggiatoa,Thiospirillum, Chromatium, Thiocystis, Thiotheca fajok), amelyek tartalék elektronforráskéntkénszemcséket halmoznak fel sejtjeikben későbbi felhasználásra.S o (elemi kén)2 e −2 e −>>>>>>>>2 e –szulfidoxidázkénreduktázS 2–(szulfid)A vasszulfid bontására is képes a Thiobacillus ferrooxidansFeS 2 + 3,5 O 2 + H 2 O =========> Fe ++ 2-+ 2 SO 4 + 2 H +A Gram-negatív szulfátlégző (szulfátredukáló) vagy kénredukáló baktériumokat lassú növekedésükmiatt nehéz tiszta tenyészetként izolálni. A feladatot valójában az teszi mégis megvalósíthatóvá,hogy kellően híg tenyészetben a szulfid-képződés miatt a telepeik feketedése felhívja amikrobiológus figyelmét a megjelenő, szulfátot redukáló klónokra. A kiválasztott telepek azutána mély agarból kiemelhetők szelektív táptalajra. —— Az esetleges fertőzés kimutatása miattpeptont és glükózt tartalmazó agart használnak 0,5 % [Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 .6 H 2 O] Mohr-sóvalkiegészítve. Az anaerob körülmény biztosítása céljából a mély agart sterilezett paraffin olajjalfedik. (A színtelen telepek megjelenése a törzs fertőzöttségére hívja fel a figyelmet!) A Földminden táján előfordulnak −5 o C-tól l04 o C-ig, savanyú vagy lúgos körülmények (5-9,5 pH)között. Egyes barofil fajok 250 o C -on a tenger mélyén élnek. A termofilek általában gyorsabbanfejlődnek.A szulfátlégző kénbaktériumok tenyésztésére alkalmas táptalaj összetétele:1 liter csapvízben: 0,5 g kálium-dihidrofoszfát 1,0 g ammónium-klorid1,0 g kalcium-szulfát 2,0 g magnézium-szulfát3,5 g nátrium-laktát 1,0 g élesztőkivonat0,1 g aszkorbinsav 0,1 g tioglikolsav0,5 g ferroszulfát· heptahidrát 15,0 g agár/Tengeri eredetű baktériumok esetében a táptalajt 0,7-10 % konyhasóval kell dúsítani./Természetes élőhelyeikről való izolálásukat az ott élők egymást segítő tevékenysége nehezíti,ami a kísérleti nehézségeket csak növeli. Ezzel magyarázható az ismert fajaik csekély száma. Amikrobiológusok szívós, célratörő jellemét bizonyítja, hogy a Desulfotomaculum nemzetségnéhány faját tiszta tenyészetben is sikerült előállítani.D. acetoxidans;D. nigrificans;D. orientis;D. ruminis.Jellemző rájuk a citokróm b jelenléte és a citokróm c 3 (P-582) hiánya. A bennük előfordulóferredoxinokban molekulánként 4 Fe atom található. (Clostridium fajokban 8 Fe, a növényekben2 Fe helyezkedik el az aktív központban.) Hőtűrő fajaik akár hetven fokot is elviselnek,szaporodni azonban csak 35-55 o C tartományban képesek. Törzseik a talajban, geotermikus101

égiókban, ízeltlábúak bélrendszerében vagy bendőben élnek. A széndioxid-asszimilációmindkét módja megtalálható bennük. A ribulóz-biszfoszfát út mellett [ Calvin-Benson ciklus ]H H HH-C-O-P H-C-O-P H-C-O-PC=O H-C-OH 2 NADPH 2 NADP + H-C=O C=OH-C-OH=====>O=C-OH ---------------------======> 2 H-C-OH ====> H-C-OHH-C-OH O=C-OH H-C-O-P H-C-OHH-C-O-P H-C-OH 2 ATP 2 ADP+2P i H H-C-OHH CO 2 H-C-O-P H-C-O-PHHpiruvát képződhet hidrogén felvételével, az acetát reduktív karboxilezésekor.2 H CO 2 O=C-OHO=C-OH ============> H-C=O =======================> C=O + H 2 OCH 3 CH 3 CH 3Növekedésüket wolframát, hidroxilamin, 1-5 µM cianid, illetve 0,1-1 µM azid, aszulfátredukciót pedig metil-benzilviologén gátolja.Az egyik legrészletesebben vizsgált fajuk a bélrendszer lakójaként megismertDesulfotomaculum acetoxidans, amely a glükóz hasznosítására is képes. (Az Entner-Doudoroffés az Embden-Meyerhof-Parnas út is működőképes bennük.) Mezofil hőigényű, peritrichostoros, endospórát képző kemoorganotróf pálca. A növekedés hőmérsékleti optimuma 36 o C.A D. nigrificans (ATCC l9998) élettani vizsgálata igazolta, hogy a szulfát-szulfidátalakítás közvetlenül nem termel ATP-t. A szubsztrátszintű ATP-képződés az acetát--oxidációhoz kapcsolódik.A Desulfovibrio nemzetség tagjai poláris ostorral mozgó, nem spórázó, görbült pálcák.Méretbeli változatosságuk egy nagyságrenden belül marad. A légköri nitrogént redukálják.Az egyik legrészletesebben vizsgált fajuk a Desulfovibrio vulgaris, régebbi nevén D.hildenborough. Kisméretű, görbült pálca (0,7 x 2,3 µm). A mikrobasejt átlagosan 31-35 %fehérjét tartalmaz. A vizsgálatok szerint az elektrontranszportláncban szereplő citokróm-c aperiplazmikus térben működik. Glükózon növesztve mannózból épülő mukopoliszacharidottermel, de a környezetében szénhidrogén képződését is igazolták. Ezekben a fajokban acitrát-szintetáz R-citromsavat termel!Ismertebb fajaik még a Desulfovibrio rubentschickii - amely képes az acetátot ishasznosítani - továbbá a nitrogénkötésre is képes D. desulfuricans és a D. azotovorans. — Alizozimmal lebontható peptidoglükán sejtfalukban diaminopimelinsav fordul elő. A lizozimhatását a külső membránt lazító EDTA fokozza. (37 o C-on 20 perc alatt lebomlik a sejtfal, ha areakcióelegyben 50 µg lizozim, 400 µg EDTA és 1 mmol kálium-foszfát van ml-ként.)Ozmotikusan stabilizált körülmények között a szferoplasztképződés penicillinnel is kiváltható.Jellemző rájuk a l3 kDa méretű, 4 hem-et tartalmazó fehérje, a citokróm c 3 és a deszulfoviridinelőfordulása. Ez utóbbi anyag — 4 Fe 4 S és 2 hem tartalmú tetramer — kimutatása egyszerű. Asejtek szuszpenziójához 1 csepp NaOH oldatot adva 365 nm-en jellegzetes fényelnyeléstészlelhető. Az elektrontranszportban szereplő rubredoxin 1-2 vasat tartalmazó, 60 kDa méretűfehérje, amely oxidálva rózsaszínű (NADH rubredoxin oxidoreduktáz), redukálva színtelen. Abennük kimutatott flavadoxin (16 kd méretű, FMN-tartalmú fehérje) fontos szerepet tölt be aszulfit redukálásakor és a piruvát hasításában. A fentieken kívül sejtjeikben menaquinonjelenlétét is igazolták. Légkörből felvett hidrogénnel (NADPH menadion-oxidoreduktáz) isképes a szulfátot szulfiddá redukálni, szulfát hiányában pedig ciszteinből kénhidrogént termelni.4 H 2 + SO 2− 4 ===========> 4 H 2 O + S 2−HS-CH 2 -HCNH 2 -COOH +2H 2 O ============> CO 2 + H 2 + H 3 C-COOH + NH 3 + H 2 S102

A szulfátredukálók ökológiai rendszerét szulfurétumnak nevezik. Az elmúlt időszakbankevéssé vizsgálták az ökoszisztémára kifejtett hatásuk biológiai és élettani alapját. Enneknehézsége könnyen belátható, mivel az élettér élőlényei közötti bonyolult kölcsönhatástegyidejűleg kellene számításba venni. Laboratóriumi vizsgálatokkal a probléma a magateljességében nem tárható fel.Metodikai nehézségek miatt az ökológiai rendszerben működő szulfátredukálók számátsem lehet megállapítani kellő biztonsággal. A sekély tengervízben például mililiterenként 1-10Desulfovibrio fordul elő, ugyanazon helyen az iszapban 100-100.000-ig nőhet a számuk. Apapírgyár szennyvízbevezetője feletti folyószakaszban mindössze 100 Desulfovibrio található, abevezető alatt viszont a számuk 1 millióra emelkedik.— A bárány bendőjében a Desulfovibriomennyisége eléri a l0 9 sejt· ml -1 értéket.Nehéz feladat a törzsek tiszta, homogén tenyészetének az előállítása; nem csak a fajoklassú növekedése, de olyan esetleg még ismeretlen növekedési faktorok hiánya miatt, amelyeketaz ökoszisztémában társaiktól kapnak. Ez az asszociátum sokszor a szintrofizmus (egyikszervezet növekedéséhez szükséges faktort vele együttélő másik szervezet szolgáltatja), illetve akonszorcium (kombinált metabolikus aktivitás) szintjét is elérheti.Hosszú ideig például a Chlorobium és a Desulfovibrio asszociátumát Chloropseudomonasethylica fajnéven tárgyalták. Stabil asszociátumot ad a Desulfovibrio aMethanosarcina barkerii-vel. A Desulfobulbus propionicus élettani viselkedése megegyezik aSyntrophobacter volnii és a Desulfovibrio desulfuricans asszociátumával. A Desulfuromonasacetoxidans-szal a Prosthecochlortis aestuani vagy a Chlorobium limicola alkothat stabilkonszorciumot.Fontos szereplői az ökoszisztémának az aerob-anaerob határterületen működő kemolitotrófkénbaktériumok (Beggiatoa alba, Sulfolobus acidocaldarius) energianyerő reakcióiH 2 S + 2 O 2 —>2−SO 4 + 2H + −798,2 kJHS − + ½ O 2 + H + —> S o + H 2 O −209,4 kJS o + H 2 O + l 1 / 2 O 2 —>2−SO 4 + 2 H + −587,1 kJS 2 O 2− 3 + H 2 O+2 O 2 —>2−2 SO 4 + 2 H + −822,6 kJ (-411 kJ/S atom)A természetes élőhelyen található szulfurétumban az aerob és anaerob viszonyok határánélő Beggiatoa fajok (a tengerben Thiovulum fajok) alatt elhelyezkedő, fototróf anaerob szulfitoxidálókfontos szerepet játszanak. Ezek a mikrobák a redukált ként szulfáttá oxidálják. Aszulfátot azután a szulfátlégzők redukálják újra kénhidrogénné. A körfolyamatot az évszakosváltozás erősen befolyásolja.Az erdei tavak flórájának összetételét és mennyiségi növekedését nyáron az ásványianyagok hiánya limitálja. Az oldott oxigénkoncentráció szintje miatt az aerob folyamatokelőnybe kerülnek; az algák, baktériumok és a sugárgombák szaporodnak el. Ősszel a lehullólomb a vízbe kerülve a tó szervesanyag-tartalmát magas értékre emeli. A tó aerob baktériumaielszaporodva elfogyasztják a tápközegből az oxigént és ily módon a fakultatív anaerobokszámára kedvezővé alakulnak a körülmények. Ebben az ökoszisztémában találják meg ahelyüket a szulfurétum tagjai is.A tengerfenéken, 600-800 méter mélységben, a metán anaerob oxidációját végzőkonsortium tevékenységét igazolták. Ilyen mélységben a jelenlevő metán-hidrátot azasszociátum ősbaktérium tagjai (Archaeobacteria) együttműködve a Beggiatoales rendképviselőivel, a jelenlevő szulfátot kénhidrogénné oxidálva, a metán széntartalmát széndioxiddáalakítják. — Feltételezhető, hogy az ősbaktériumban a metonogenezis fordítottjaként ametánból először hidrogén és szén-dioxid képződik. (CH 4 + 2 H 2 O >>>>> CO 2 + 4 H 2 )103

A szulfát redukcióját az ősbaktérium körül elhelyezkedő Beggiatoales nemzetség végzi ahidrogén terhére. (H + 2–+ 4 H 2 + SO 4 >>>>> HS – + 4 H 2 O) Végül is a konzorcium, mindentösszevetve a metán anaerob oxidációját végzi (CH 4 + SO 2– –4 >>>>>> HCO 3 + HS – + H 2 O)Fontos szerepet játszanak a szulfurétum fejlődési ciklusában a Beggiatoales rend képviselői. AMexikói öbölben Calyptogena Beggiatoa konsortium jelenlétét mutatták ki a tengeri üledékben.Egyesek az Oscillatoria fajok színtelen, heterotróf alakjának tekintve ismertetik, míg mások aheterogén összetételű, gyűjtőcsoportként szolgáló, nem fotoszintetizáló, csúszva mozgóbaktériumok közé sorolva tárgyalják őket.Gram-negatív, 2 x 6 µm-es sejtjeik 60-120 µm hosszú, szintelen fonalakat alkotvaképesek a vizi üledék felületen tovahaladni. A fonalban elhelyezkedő önálló sejtjeikmikroszkóppal nem mindig különböztethetők meg. Tartós alakot nem képeznek. Édes és sósvizekben, nedves talajban gyakran előfordulnak. Nevüket F. S. Beggiato, Vicenza városka nevesfiziológusára emlékezve nyerték. Legismertebb képviselőjük a Trevisan által l842-ben, majdWinogradsky által l888-ban leírt Beggiatoa alba, amely rosszul levegőző tavak fenekén, aziszapréteg felszínén, tehát mikroaerofil körülmények között, azon a határfelületen él, ahol azanaerob iszap és az aerob vízréteg között határozott oxid-szulfid grádiens alakul ki. Szénmonoxidraérzékeny citokróm-rendszerük van. Hasznosítható nitrogénforrás hiányában a légkörinitrogén megkötésére is képesek, de csak bőséges szulfidellátás esetén. — Ez a baktériumkülönösen olyan tavak fenekén szaporodik el, ahol az iszapban a kénhidrogén feldúsul. Kénhidrogénbőség esetén sejtjeikben a kénszemcsék nagy mennyiségben halmozódnak fel.Kénhidrogén hiánya esetében ez a kén oxidálódik szulfáttá, amit a mikroba a környezetbeválaszt ki. Újabb kénhidrogénes expozíció esetében hamarosan újra megjelennek a kénszemcséka citoplazma mezoszómaszerű betüremléseiben, a sejtfalon belül. — A szaporodó sejtek kettéosztódva a fonal hosszirányú növekedését okozzák. Katalázuk nincs, ezért előfordulhat ahidrogénproxid feldúsulása, ami a sejtek autolízisére vezethet. Szaporodási sebességük azOscillatoria fajokhoz hasonló. Egy g iszapban 0,4-0,6 mg Beggiatoa sejt található. Sejtjeikbenheterotróf életkörülmények között polihidroxi-vajsav és polifoszfát rögök felszaporodásafigyelhető meg. A Beggiatoa sejtburok felépítése egy kissé bonyolultabb, mint az eddigmegismert fajoké (J. Gen. Microbiol. 128:73-84 1984).oPHB o oo o oPHB o o oo S o o ooheterotróf körülmények szulfidoxidáló körülmények opg lps oCM A B C D EA rajz a Beggiatoa alba B15LD jelű törzs két különböző körülmények között növekedőtenyészetének elektronmikroszkópos vizsgálata alapján készült. Az "A" jelű sejt heterotrófkörülmények között fejlődött sejtrészletet ábrázol polihidroxivajsav (PHB) feldúsulással. A "B"jelű sejt szulfidoxidáló körülmények között fejlődött. A sejtfalon belül, de a membránon kívül(mezoszómában) kén (S) szemcse kiválása látható. A PHB-szemcse kis méretű, a pórusokmérete nagyobb. A citoplazmamembránon (CM) kívül a sejt alakját jól látható, 4-6 nm vastagpeptidoglükán sejtfal (A) határozza meg. Ezen kívül 10-12 nm vastag, háromrétegű, hullámosszerkezetű, lipopoliszacharidban gazdag (B) réteg látható. A következő (C) kompakt rétegvastagsága 6-8 nm, amelyet megint háromrétegű szerkezet borít. Ebben 10-12 nm méretűtestecskék láthatók egymástól 12-18 nm távolságban. A külső réteg (E) vastagsága 6-7 nm. A D-és E- réteg között 10-12 nm üres terület figyelhető meg.104

Az elemi kén szulfáttá oxidálása energiaforrást jelent olyan aerob kemolitorófok számára, mintamilyenek a Gram-negatív Thiobacillus thiooxidans vagy a különböző kénhasznosító Archaeobacteriumtörzsek. Ez esetben nem a szulfátlégzés reakcióinak megfordításáról van szó,hanem (a glükóz reszintéziséhez hasonlóan) erre feladatra szolgáló speciális enzimek vesznekrészt a szulfátképzésben. A Chromatiaceae családba sorolt fajok elektrondonorként akénhidrogénen kívül elemi ként is képesek hasznosítani. Az ide sorolt fajokban a kén szulfáttáoxidálásához szükséges teljes enzimkészlet működőképes. Ennek megfelelően előfordul bennükegy olyan flavint és két hemet tartalmazó APS-reduktáz, amely szulfitból és adenilsavból adenilsav-kénsavvegyes-anhidridet képez, miközben ő maga redukálódik. A két elektront a citokrómc555 veszi át az enzimről. Az utolsó lépésben egy ADP-szulfuriláz az APS-ből anorganikusfoszfáttal kicserélve felszabadítja a szulfátot, miközben ADP képződik.SO 3--(szulfit) 2 e − ----------------------> cyt.c- 555 ---------------------------> H 2 OAPS ADPSO 4--(adenilsav-kénsav vegyesanhidrid)ADP-szulfuriláz(szulfát)A család tagjai a tioszulfátot is redukálják. S 2 O 32−>>>>>>>>>>>>>>>>>>H 2H-S-H + SO 32−Ugyancsak fonalas szerkezetűek eredeti élőhelyükön a Thioplaca, Thiothrix, Leucothrix,Vitreoscilla fajok. Ezek feltűnően savanyú körülmények között 5-10 %-os kénsavban is képesekszaporodni. A betont és a kőfalat is megtámadják. Morfológiailag a Beggiatoa-hoz hasonlítanak;valamennyien a cianobaktériumok szintelen változatainak tekinthetők.105

A FÉNYENERGIA HASZNOSÍTÁSAProtonpumpaként működő bakteriorhodopszin a Halobacterium halobium-banA Halobacterium salinarium (régebben H.halobium) részletes vizsgálata mutatott ráelőször a fototaxis metilezési reakcióvalösszekapcsolt voltára. A citoplazmamembránban négy féle rhodopszinfehérjekomplex működik. Kettő ionpumpakéntteljesíti feladatát. A fényenergiával az egyik aprotongrádiens, a másik a klorid grádienskialakításán munkálkodva végeredményben azATP szintézist és az anyagcsere működésétbiztosítja. A két másik retinált tartalmazópigment mint fotoreceptor és kemoreceptor abaktériumot az optimális fényviszonyok irányábaA fototaxis működési vázlata aztereli. A jelzés hatására a komplexősbaktériumokbanmetilezettsége megváltozik, a his-kináztaktiválva elősegíti a regulátor fehérje (CheA)foszforileződését, amely végül is foszforilezve a Che-Yfehérjét, az ostor működését befolyásolja. A baktériumot acélpontba tartja, illetve a cél felé irányítva mozgásbahozza. A mozgás irányát az inger gyakorisága pozitívilletve negatív irányban befolyásolhatja aszerint, hogy areceptor milyen gyakorisággal fog kedvező, vagykedvezőtlen jelzést (az egységnyi időn belül jelenlevőfotonok, illetve ingerek száma alapján) .adni. Amechanizmus összehasonlítható a Caulobactercrescentus-nál tapasztaltakkal.Az aerob növekedő tenyészet levegőztetésétmegszüntetve a sejttömeg gyarapodása a sejtek osztódásamegszűnik. Az oxigénhiány hatására az addig is karotinbangazdag membránon jól észlelhető bíborvörös foltokképződnek, amelyek az idő előrehaladtával, néhány napA biborvörös bakteriorodopszin alatt a felület felére is kiterjedhetnek. A levegőzés106

újraindításával ezek a bíbor foltok lassan eltűnnek, a sejtek osztódása pedig folytatódik.A halobaktériumok (Halobacterium salinarium syn, halobium) membránjábanprotonpumpaként működő bakteriorodopszin, amely afényenergiát protonmozgató erővé alakítva segíti elő aprotonok eltávolítását a sejtből. Ez a bíborvörös színűfehérje (260 kDa) prosztetikus csoportként retinált, azazA-vitamin-aldehidet tartalmaz. A retinálcsoport amembrán külső felületétől 0,15 nm távolságra amembránba rögzített fehérje hidrofób üregében található.A transz szerkezetű retinál-aldehid protonált Schiffbázist(imin-kötés) alkot a fehérje mozgékony szakaszántalálható 41-es lizin szabad ε−amino-csoportjával. Atérközelben levő aszparaginsav karboxil-csoportjához kötődő proton gyenge ionos kötésselkapcsolódik a fenti Schiff-bázishoz. – 570 nm hullámhosszú zöld fény hatására a retinálizomerizálódik. A kialakuló cisz forma következtében a Schiff-bázis a membrán külső felületefelé mozdulva megszünteti a gyenge sókötést, elősegíti a proton külsőtérbe lökődését. Azaszparaginsav negatív töltésűvé alakuló karboxilcsoportja újra feltöltődik a citoplazma proton állományából,a retinál pedig izomerizálódva újra felveszi a kiindulási állapot tiszta transzszerkezetét, várva akövetkező fotonmegjelenését.Oxigén hiány eseténa fény hatásárakialakulóprotongrádiensaz ATP-képződéslehetőségétteremti meg(Megjegyzendő,hogy a retinálképződéséhezminimálislégkörioxigénjelenléte szükséges!)A retinált tartalmazó bakteriorodopszin katalitikus aktivitásának vázlata107

OXIGÉNT NEM IGÉNYLŐ FOTOTRÓF BAKTÉRIUMOK (Rhodobacteria)Változatos (kokkoid, spirális, pálcika, vibroid) alakú, Gram-negatív festődésű, egysejtű, 0,3-6µm átmérőjű szervezetek; néha többsejtű fonalat is alkothatnak. Mozgékony egyedeik polárisvagy peritrich ostorral rendelkeznek. Ma ezek a különleges tulajdonságú szervezetek a régmúltidők élő kövületeiként a felszíni vizek mélyebb, oxigénmentes, kénhidrogénben dús rétegeiben,fényszegény körülmények között élnek. A mikrobák ezen csoportjában a fotoszintetizáló szervezetekfontos anatómiai elemeként gázvakuóla található, amely a gravitációval szemben amikroszervezetet a fotoszintézis szempontjából legkedvezőbb vízmélységben tartja. Ez a szerv ahelyváltoztató szervekkel nem rendelkező mikrobák számára létfontosságú. Általában osztódással,egyes fajaik bimbózással szaporodnak. Festéktartalmuktól függően változatos színekbenpompáznak, a vöröstől a sárgás barnán keresztül a zöldig. Tartalék tápanyagként polifoszfátot éspolihidroxivajsavat halmoznak fel, másoknál energiarendszerük működésének eredményekéntkénszemcsék kiválását tapasztalhatjuk. (A kénszemcsék megjelenése rendszertani elkülönítésükread lehetőséget.) Energianyerő rendszerük a fényenergia hasznosításával biztosítja az életfenntartásához szükséges elektronáramlást. Anaerob körülmények között fotoszintetizálnak.Elektronforrásként főleg a kénhidrogént oxidálják. CO 2 + 2 H 2 S -------> CH 2 O + H 2 O + 2 S oA kénszemcsék megjelenése a sejten belül vagyazon kívül valójában a fotorendszert elektronnalfeltöltő mechanizmus működését jelzi.Elektrondonorként szerepelhet még a molekulárishidrogén vagy valamilyen oxidálható szervesvegyület. Növekedésük szempontjából optimális, haa légkör 95 % nitrogént és 5% széndioxidot, atápközeg pedig ammóniumsót, nátrium-szulfidot éskevés B l2 vitamint tartalmaz.Az idesorolt fajok jellegzetes tulajdonságait a 3milliárd évvel ezelőtti különleges életkörülmények,az anaerob redukáló környezet és a magasszéndioxid-tartalom mellett, az állandó felhőtakarójelenléte magyarázza. A bennük előfordulóbakterioklorofillok (a,b,c,d,e,g) több-kevesebbmértékben különböznek egymástól. A mellékeltábrán, a bakterioklorofillek pontos szerkezetének rajza felhívja igyelműnket, hogy az etil csoportoxidált formában teljesíti feladatát. Közös azonban a klorofill-a pigmenttől való egyértelműmegkülönböztethetőségük. (bakterioklorofillok fényelnyelése a:850-1000 nm, d:850-1000 nmc:735-750 nm). A kékbaktériumokban előforduló klorofill-a-nak a 2-etilén oldalláncát abakterioklorofillekben ennek oxidált alakja helyettesíti. A bakteroklorofill és a növényvilágbanelterjedt klorofill között fellelhető viszonylag csekély szerkezeti eltérés döntő fizikai-kémiaikülönbséget jelent, amennyiben a bakterioklorofill a fény vörösön túli tartományát is képeshasznosítani. — A magnéziumot tartalmazó különböző bakterioklorofill származékokvalószínűleg az elektrontranszportban fontos feladatot ellátó, vasat tartalmazó hemszerkezetbőlalakultak ki. Ezeket a tetrapirrol festékeket izoprén-egységekből felépülő fitil, illetvefarnezilláncok rögzítik a membránba.A fotoszintetizáló enzimkomplexben fontos szerepet tölt be a fényenergia hasznosításakor azizoprén egységekből felépülő színanyag, a karotin, amely a fajra jellemző karotének keverékekénttalálható a fotobaktériumok membránjában. Szerepük a fényenergia összegyűjtésével, aklorofill hatásfokának a növelése. A fotoszintetizáló rendszereikben a különbözőbakterioklorofill és karotén származékokból álló fénygyűjtő pigmentek, valamint az108

elektronhordozó fehérjék és lipidek nem egyenletesen elosztva, hanem rendszertani csoportokszerint eltérő módon szerveződve működnek.A fotoszintetikus folyamat első lépése az elektron fényaktívált átvitele a bakterioklorofillról a 6kDa méretű, negatív redoxpotenciálú vas-kén fehérjére, a ferredoxinra. A redukált ferredoxinvisszaoxidálása redukált kofaktorok képződését teszi lehetővé. A redukált piridinnukleotidokfelszaporodása az életfontosságú dehidrogénezési reakciók leállásával járhat. Ezt az élettaniproblémát az anaerob légzés, valamilyen szerves vegyület, esetleg a kén redukálása oldja meg.S o + NADH + H + H-S-H + NAD +A redukált ferredoxin visszaoxidálása annyi energiát szolgáltat, mint a hidrogén oxidációja, azazbőven elegendő egy-két ATP képződéséhez. Redukált ferredoxin segítségével anaerobkörülmények között, a széndioxid megkötését a reduktív dikarbonsav-ciklus segíti.A ciklikus fotofoszforiláció esetében a flavoproteint, kinont és citokrómokat tartalmazótranszportmechanizmus segítségével kerülhet vissza az elektron a klorofillra. A nem ciklikusfotofoszforiláció esetében elektrondonorként a víznél alacsonyabb potenciállal bíró vegyület,hidrogén vagy kénhidrogén szerepelhet.A fotoszintetikus rendszer elektronmikroszkóppal jól kimutatható szerkezete csak anaerobkörülmények között, fény hatására, néhány órás látens időszak után alakul ki. A fotoszintetizálórendszer néhány órás működése kénszemcsék megjelenésével jár. Sötétben a kénszemcsékethasznosító anaerob légzőrendszer lép működésbe. A kénszemcsék kiválása (fényben), illetvehasznosítása (sötétben), a tiszta tenyészet fenntartására is előnyösen használható. Ebből a célból109

a minimál médiumra oltott tenyészetet 1,5 mM szulfid jelenlétében néhány órán keresztülmegvilágítják. Ez idő alatt a sejtekben a kénkiválás bekövetkezik. Ezeket a sejteket ezutánsötétben több hónapig lehet 4 o C-on tartani. Néhány óra szobahőmérsékleten történő fényexpozícióvala kénszemcsék újra termelhetők. A tenyészet e kezelés után ismét hűtőbe tehető, aholaz anaerob körülményeket a tenyészetre rétegzett paraffin olaj biztosítja.µ ⋅ óra -1 µg bakterioklorofill100 µg fehérje0,2. .20növekedés0,1. .10bakterioklorofill100 200 400 600 800Fényintenzitás (gyertyafényben) hatása a Rhodospirillum rubrum növekedésére(specifikus növekedés/óra) és bakterioklorofill tartalmára ( mg klorofill/100 mg fehérje).A fototróf mikrobák színük alapján vörös, illetve zöld baktériumokra, anyagcseréjük alapjánpedig tovább oszthatók nem kénbaktériumokra és kénbaktériumokra.Vörös nem kénbaktériumok (Rhodospirillaceae - Athiorhodales).A nevükből is következtethetően fotoorganotróf módon szeves vegyületeket hasznosítanak.Legtöbb fajuk azonban fotolitoautotróf módon a molekuláris hidrogén eloxidálásával nyertelektronokat is hasznosítja. Semleges körülmények között a szulfidból, tioszulfátból,tetrationátból származó kén soha sem halmozódik fel a sejtjeiken belül.A Rhodospirillum fajokban a citoplazmamembránból a sejt belsejébe türemlőhólyagocskák tartalmazzák a bakterioklorofillal működő elektrontranszport-rendszert. Ahólyagocskák minden esetben kapcsolatban vannak a periplazmikus térrel.Legismertebb közülük egy természetes vizeinkben élő, poláris ostorral mozgó vibroid, aRhodospirillum rubrum, amiből 7-l0 µm hosszú, S alakúképletek alakulhatnak ki. Ez a faj széndioxidot, hidrogént ésammóniát hasznosítva, anaerob körülmények között, rövidgenerációs idővel építi fel szervezetét. A szulfátot csupánkénforrásként használja sejtjeinek felépítéséhez. Kevésoxigén jelenlétében is képes növekedni. Borostyánkősav ésélesztőkivonat gyorsítja a szaporodást. A sötétben tartotttenyészet szinmélysége csökken (színtelenedik).Rhodospirillum fulvum sejtjei az előbbinél rövidebbek, p-aminobenzoesav jelenlétében 25-30o C-on jól fejlődnek. Ammónián kívül a légköri nitrogént is képesek hasznosítani.Rhodopseudomonas spheroides sejtjeiben két membrán jelenlétét igazolták a vizsgálatok. Akülső membrán lipopoliszacharid rétegében a glükózamin helyett 2,3-diamino--2,3-didezoxi-Dglükózfordul elő.110

A Rhodomicrobium vannielii C. B. van Niel amerikaimikrobiológus nevét viseli. Az egymáshoz kapcsolódófonalak miatt tenyészhelyén mozdulatlan szövedéketalkot. Aerob körülmények között tenyésztve színtelen.Rhodopseudomonas acidophilaRhodospirillum molischianumBíbor kénbaktériumok (Chromatiaceae - Thiorhodales).Morfológiailag különbözőek; lehetnek gömb, ovális, vibrio, rövid pálcika, spirális alakúak.Jellemző rájuk a sejtben található kénszemcsék feltünően nagy mennyisége. A tavakoxigénmentes, kénhidrogénben dús rétegében élnek. Különösen elszaporodnak, ha a víz felsőrétegében élő algatömeg gyakorlatilag fényben szegény anaerob körülményt biztosít a mélyebbszinten élők számára.A bíbor kénbaktériumoknál a citoplazmamembránból beöblösödő képletekben működika fotoszintetizáló enzimkomplex, amely általában bakterioklorofill-a és -b színanyagot tartalmaz.Az UV sugárzás károsítü hatása ezeknél a szervezeteknél nem jelentkezik. Negyvenszerrezisztensebbek mint a cianobaktériumok. Elektronnyerő folyamat egyik elterjedt módjaként abennük feldúsuló elemi kén képződését katalizálja a szulfid-oxidáz. A leválasztott elektronokat acitokróm-c 555 veszi át, majd továbbítja a bakterioklorofillhoz. A kénszemcsék sejten belüli felszaporodásamikroszkóppal jól követhető.A Chromatiaceae családba sorolt fajok elektrondonorként a kénhidrogénen kívül elemiként is képesek hasznosítani. Az ide sorolt fajokban a kén szulfáttá oxidálásához szükségesteljes enzimkészlet működőképes. Ennek megfelelően előfordul bennük egy olyan flavint és kéthemet tartalmazó APS-reduktáz, amely szulfitból és adenilsavból adenilsav-kénsav vegyesanhidridetképez, miközben ő maga redukálódik. A két elektront a citokróm-c 555 veszi át az111

enzimről. Az utolsó lépésben egy ADP-szulfuriláz az APS-ből anorganikus foszfáttal kicserélvefelszabadítja a szulfátot, miközben ADP képződik. A család tagjai a tioszulfátot is redukálják.S 2 O 32−H 2>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>yH-S-H + SO 32−A Chromatium okenii (L. Oken német természetbúvár) poláros ostorral mozgó,viszonylag nagyméretű (4 x l0 µm), obligát fototróf, szigorúan anaerob szervezet.A Chromatium vinosum faj régóta ismert. Az 1838-ban kiadott Ehrenberg Atlaszban isszerepel Monas vinosa néven. Anaerob körülmények között fototróf; mikroaerob körülményekközött fakultatív kemoautotróf, illetve mixotróf. Tengervízből izolálható, sóigényes (1-2 %).Thiele szerint a szulfát asszimilációjára is képes.A Chromatium warmingii (E.Warming dán botanikus emlékére) mocsárban,kénhidrogént tartalmazó tófenéken él. A kénszemcsék a sejtben polárisan helyezkednek el. Asejt osztódásakor a kénszemcsék a készülő új válaszfal közelében jelennek meg.méter.55 10 15 20 25 30O 2o Co C,µg/ml oxigén,ill.kénhidrogén.10| ..:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::15 :::::::::::Chromatium:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::20H 2 S___________________________________________________200 400 600 800 1000 1200 sejt / mlKénhidrogént hasznosító Chromatium előfordulása (pontozott terület) a Belowod tóbanKusnezow S.J. vizsgálatai szerint a mért hőfok, oxigén és kénhidrogén tartalom függvényében.A Thiocystis violacea tengeri mocsaras területről izolálható. A Thiospirillum jenense(Elnevezése Jénára utal, ahol Ehrenberg felfedezte és leírta Ophidomonas jenensis néven.) 30-40µm hosszú, szigmoid szervezet, nagy mennyiségű kénszemcsével. A Thiothece gelatinosakisméretű, enyhén sótűrő, Winogradsky által izolált törzs, amelynek mai neve Thiocystisgelatinosa. A bíbor kénbaktériumok közé sorolt Ectothiorhodospiraceae családra jellemzően aképződő kén a baktérium környezetében halmozódik fel. Sötétben ezek a baktériumok az aerobkörnyeztet is elviselik.Zöld kénbaktériumok (Chlorobiaceae)Szulfidtartalmú vizekben, szigorúan anaerob körülmények között élő, fotolitoautotrófszervezetek. A barna színű fajokban, például a tengervízben élő Chlorobium phaeobacteroides(φαιος barna) fajban bakterioklorofill-e és nagy mennyiségű izorenierát fordul elő Sejtjeikösszetapadva általában fonalat alkotnak, sokszor konszorciumba szerveződve, szimbiózisbanélnek más mikroorganizmusokkal.112

Chlorella pyrenoideaChlorobium phaeobacteroidesChlorobium thiosulfatophilumChromatium okeniiRhodopseudomonas viridis400 600 800 1000 nmFototróf mikrobák abszorpciós spektruma113

A család részletesen vizsgált tagja a Chlorobium limicola. Alig 1 µm méretű, rövid pálcikák,amelyek fonalakba rendeződhetnek. Környezetükben minden esetben nagy mennyiségűkénkiválás figyelhető meg, de képesek a kén szulfiddá redukálására is. Jelentős aktivitású aflavint és két hemet tartalmazó APS-reduktázuk, amely szulfitból és adenilsavból adenilsavkénsavvegyesanhidridet képezve átmenetileg redukálódik, majd az elektronokat a citokrómc555 -nek adja át.Chlorobium thiosulfatophilum tioszulfát hasznosítására is képes. Vibroid sejtjeibőlfelépülő fonalszerű képződményeik spirálisan helyezkedhetnek el. (Analitikai laboratóriumoktioszulfát mérőoldataiban is megjelenhet!) Ezzel szemben a tengerek elzárt öbleiben élő, barnatelepeket alkotó sótűrő faj a Chlorobium phaeovibrioides tioszulfátot nem hasznosít!A zöld kénbaktériumokban a membránhoz kapcsolódó vezikulumokban lévő tilakoid tömlőkbe,úgynevezett kloroszómákba szerveződik a fotorendszer (PS), amelyiknek a redukált alakját (PS-I) a fényenergia aktíválja (PS-I*) lehetőséget teremtve az életfontosságú NADPH képződéshez.Fototróf pigmentjük általában bakterioklorofill-c és -d. Minimális mennyiségű bakterioklorofillakomponens mellett karotinként klorobaktént tartalmaznak. Feladatuk a nem ciklikus anaerobelektronáramlás fenntartása.2PS-I * =======> 2 PS-I +2 e − >>>>>>>Elektrondonor =====> oxidált termékH + NADP + =====> NADPH2 e − >>>>>>>>2 PS-I + =====> 2PS-IfényA Pelodictyon fajok sejtjei általában háromdimenzióshálózatot alkotva, gömbszerű aggregátumok formájábanlelhetők fel. A legismertebb Pelodictyon clathratiformefajt ez ideig nem sikerült tisztán, homogén tenyészetkéntelkülöníteni a hálózatban megbúvó társaktól. Az Y- alakúsejtjeik szaporodáskor általában három utódsejtrehasadnak.— Ugyanez a nehézség merül fel akonszorciumokba szerveződő baktériumoknál. Általábanl2-24 kisméretű zöld vagy barna kénbaktériumhelyezkedik el valamilyen ostorral rendelkező nagyobbbaktérium körül. Szétválasztásuk eredménytelen volt,pontosabb leírásukra még várni kell.Számos kevéssé differenciált, soksejtű zöldbaktériumotismer még az irodalom. Ezek a fakultatív anaerobfotoheterotrófok főleg bakterioklorofill-a színanyagottartalmaznak, ezért színük inkább kék. – A fotonokképviselte energia a nagyszámú aktiváló rendszerrel felszerelt klorofill (LH) közvetítésével jut elaz I.fotorendszerben a P700-as fehérjéhez, amely az ATP szint fenntartása szempontjából fontosferredoxin red képződést biztosítja114

Zöld nem kénbaktériumokA zöld kénbaktériumoktól jól elkülöníthetők a fonalas szerkezetű zöld nem kénbaktériumok. AChloroflexus csoport tagjai (Chloroflexus, Oscillochloris, Heliothrix) kemoorganotrófkéntsötétben az oxigén jelenlétét is elviselik. Fototrófként cukrot, aminosavat és szerves savakat ishasznosítanak, de fotoautotrófként H 2 , H 2 S, CO 2 -ből is képesek felépíteni szervezetüket. Aszén-dioxid megkötés a reverz citrátkörben folyik, illetve ferredoxin segíti a piruvát képződéstAcetil-CoA + CO 2>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>H 3 C–CO–COOHferredoxin red >>>>>>> ferredoxin oxIde sorolható egy, az eddigiektől teljesen kölönböző, anaerob módon növekedő, lizozimraérzékeny, fotoheterotróf faj, az 1985-ben izolált Heliobacterium chlorum (ληε nap, χλοροςzöld) (ATCC 35205). Az oxigén sötétben és világosban egyaránt toxikus számára; ezérttenyésztésekor a tápközegbe tioglikolsavat és aszkorbinsavat tesznek. Fényenergiát a farnezillánccalrögzített bakterioklorofill-g (798 nm) tartalmú pigmentjük hasznosítja.Elektronforrásként nem használja a hidrogént, sem a szulfidokat. Kénforrásként a szulfát ugyanmegfelel, de savanyító hatása miatt csak a növekedés megindulásához szükséges mennyiségűammonium-szulfátot tartalmazhat kezdetben a táptalaj. A baktérium virulens tenyészete alégköri nitrogén kötését, talán az anyagcsere-egyensúly kialakítása szempontjából, előnybenrészesíti. A Heliobacterium chlorum növekedésére kedvezően ható gázelegy 85 % nitrogént, l0% hidrogént és 5 % széndioxidot tartalmaz.Fototróf szervezetek azonosítása természetes fénnyel megvilágított edényekbenSzerves anyagottartalmazó táptalajbananaerobSzerves anyagot nem tartalmazó tápközegbenKénhidrogén jelenlétébenanaerobanaerobSzén-dioxidban dús közegcsakalacsony magas nitrát-, ill. légköri N 2szulfid- szulfid- ammónia- jelenlétetartalom tartalom tartalomvörös vörös zöld alga kéknemkénkén kén baktériumbaktérium baktérium baktériumRhodopseudomonas Chromatium Chlorobium Zöldalga CyanobacteriaÉrdekessége miatt említendő, hogy ismeretes egy bakterioklorofill-a színanyagot tartalmazó,kemoorgano-heterotróf, egyetlen ostorral mozgó Gram-negatív mikroszervezet, az Erythrobacterlongus, amely szerves anyag hiányában, aerob körülmények között képes a szén-dioxidmegkötésére. — A fototróf baktériumok néhány csoportja az evolúció színpadán talán azeubaktériumok őseiként a körülmények kedvező változását követően - elvesztve fényigényüket -kemolitotrófokká, illetve a felhamozódó szerves anyagot hasznosító gazdaságosabbenergianyerő módszert kifejlesztve — kemoorganotrófokká válhattak.115

Oxigén érzékeny fototróf baktériumok rajza116

OXIGÉNT TERMELŐ FOTOSZINTETIZÁLÓ PROKARIÓTÁKAz idesorolt mikroorganizmusokat Linnaeus (l753) véleménye alapján hosszú ideig az algákközött ismertették. Az utóbbi időkig használt Cyanophyceae elnevezést (Sachs, l874) a κυανοςkék és φυκος alga szavakból alkották. Az eubaktériumokkal való rokonságuk már a múltszázadban is felvetődött; Cohn (l875) például a Schizophyta divízióba Schizophyceae névvel, abaktériumok (Schizomycetes σχιζω hasadó µυκος gomba ) mellé sorolta őket. A bakteriológusokés a botanikusok évszázados vitáját a vizsgáló módszerek fejlődése és a rendszertanikategóriák pontosítása döntötte el. E követelmények elfogadása mindkét terület (alga ésprokarióta) fejlődését szolgálta. Mai rendszertani helyüket csak a századunk második felébenkifejlesztett sejtbiológiai, biokémiai, élettani, genetikai és morfológiai vizsgáló módszerekkelnyert eredmények erősítették meg. Ennek köszönhetően nyert elfogadást a Stanier által (l978)javasolt Cyanobacteria (Kékbaktériumok) megnevezés.A kékbaktériumok olyan vízben vagy nedves helyeken élő egysejtű szervezetek, amelyekszerkezeti felépítésük és anyagcsererendszerük alapján egyértelműen az eubaktériumok közé sorolhatók.Gram-negatívan festődő, kemolitotróf szervezetek. Morfológiailag heterogének: gömb,ellipszoid, ovoid, hengeres, piskótaszerű, félhold alakú formáik ismertek. Tenyészeteikbensokszor gélszerű, más esetben meglehetősen szívós, mindössze 10-20 % polipeptidet tartalmazópoliszacharid (pektin) burokkal összetapadt telepeket, illetve hüvellyel körülvett fonalakat,látszólag többsejtű szervezetet alkotnak. A hüvelyben egyes esetekben (trichoma)mikrofibrilláris szerkezet látható, más esetben kalcitkristályok vagy fémvegyületek feldúsulásátészlelhetjük. A hüvelyben esetenként felgyülemlő vörös, sárga vagy kék festékanyagok élettaniszerepe ismeretlen. Általában osztódással szaporodnak, de ismeretesek olyan fajaik is, amelyeksarjadzással hozzák létre leánysejtjeiket. Többségük lassú növekedésű, tenyészetük tömege12-24 óra alatt kettőződik meg. Néhány egysejtű faj és az Oscillatoria törzsek számára viszontnégy óránál rövidebb idő is elegendő az osztódási folyamathoz. Sejtjeik alakját azeubaktériumokhoz hasonló felépítésű, foszfolipidekből szerveződő membránon kívülelhelyezkedő murein sejtfal határozza meg. Ebből adódik a penicillinre való érzékenységük. Apeptidoglükán-tartalmú sejtfaluk vastagsága néhány nm-től 200 nm-ig fajok szerint változhat. Avastag fal esetében pórusok könnyítik az anyagáramlást. A pórusokon ugyanis acitoplazmamembrán kiöblösödve megközelítheti a lipopoliszacharidban dús (LPS) külsőmembránt, vagy a szomszéd sejt membránját. Külső felületükön pílusok találhatók. Ostorosegyedet eddig nem találtak közöttük. Különösen a hüvelyes alakok között jól úszók is akadnak.Néhány faj a nyálkabaktériumokhoz hasonlóan csúszó mozgással képes tovahaladni a nedvesszilárd felületen. A citoplazma külső részét a jelenlevő színanyagokra utalva kloroplazmánaknevezzük. Különböző színanyagaik egyidejű jelenlététől függően változatos színben fordulnakelő. A karotinok képződése és a színük mélysége a megvilágítottság függvénye. A kék színért afikocianin, a vörös színért a fikoeritrin (ερυϑρανος vörösödő) a felelős. Ezek a festékek elfedika klorofill jelenlétére utaló zöld színt. Ezekben a mikrobákban a fehérjéhez kötött klorofill-akarotenoidokkal és az elektrontranszport-mechanizmus elemeivel együtt a lemezes szerkezetűtilakoidokban (ϑυλακος doboz) rögzítve található.Ezek a prekambriumban megjelenő fotoszintetizáló mikroorganizmusok fontos szerepettöltöttek be az aerob életfeltételek kialakításában, és azóta is fontos a szerepük az aerobéletkörülmények fenntartásában. Közel kétezer ismert fajjal a sarkvidéktől a trópusokigmindenhol előfordulnak. Egyesek a gazdanövényeik szövetüregeiben tenyésznek, másokgombákkal élnek szimbiózisban. Feltehetőleg a növényi kloroplasztok kialakulásában isszerepük volt.117

A tilakoidhálózathoz kötődik a légzés, az elektrontranszport terminális lépése, az oxigénredukciója is. Csupán a Gloeobacter-eknél hiányzik ez az alkotóelem. A tilakoidokat egy-egy 5nm átmérőjű üreget körülzáró, elektronok számára átjárható, 7 nm vastagságú membránhatárolja. Ez a sejtalkotórész valószínűleg független a citoplazma-membrántól. A foton aktiváljaa klorofillmolekula (KI) centrumát, átmenetileg elektronakceptorrá (K*I) válik, amelyről azelektront különböző stabil elektronhordozó, például ferredoxin továbbítja felhasználási helyére.hνKl >>>>>>>>>>>> K * l >>>>>>>>>>> K + l - >>>>>>>>>> Kle –ferredoxin ox >>>>>>>> ferredoxin redA vízből származó elektron átvitele fotokémiai úton történik. A tilakoidmembránba rögzítvetalálható az összekapcsolva működő I. és II. fotorendszer. A PS-I önmagában nem elegendőa víz bontásához. Az I fotorendszer P-700 reakcióközpontja körül 130-140 fénygyűjtőklorofill-a molekula található, míg a PS-II P-680 reakcióközpontja körül 20-50 klorofill-amolekula látja el ezt a feladatot A PS-II elektronelszívó működése szükséges amangántartalmú vízbontó enzim hatására felszabaduló oxigén megjelenéséhez.A 30-40 nm méretű fikobiliszómák (σωµα test) a tilakoidokon kívül, főleg a PS-IIcentrumok közelében helyezkednek el szabályos rendben. Ezek a biliproteint és festékanyagottartalmazó, korong alakú képződmények a fényenergia hasznosítását segítik.A sejtben a tilakoidok között raktározott tápanyagként glükogén szemcsék, polifoszfát(volutin) rögök, valamint nitrogén raktárként CIANOFICIN szemcsék (arginin és aszparagin118

kopolimer) találhatók. Mennyisége a száraztömeg 10 %-ára növekedhet. Ezek a raktárak a sötétperiódus alatt hidrolizálva a bioszintetikus folyamatok anyag- és energiaigényét elégítik ki.*CIANOFICIN: Asp−− Asp−− Asp−− Asp−− Asp−−Asp−− Asp−− Asp−− Asp−− Asp−−| | | | | | | | | |Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg* Arginin + ADP + P i + H 2 O >>> arginin-hidroláz >>>>>>> Ornitin + 2 NH 3 + CO 2 + ATPUgyancsak a tilakoidokon kívül helyezkednek el a sokszögű testecskék formájában megjelenőkarboxiszómák, amelyekben a szén-dioxid fixálás szempontjából kulcsenzimként a reduktívpentózfoszfát-ciklushoz kötődő ribulózbiszfoszfát-karboxiláz található. A hexóz-foszfátból folyópentózfoszfát-képződés, a pentózfoszfát-ciklus és a légzőrendszer működése nem igényelenergiát (sötét reakció). A szén-dioxid megkötésének energiaigényes folyamata viszont csakmegvilágított sejtben megy.Fény hatására képződő átmeneti termék köti a szén-dioxidot a Calvin ciklus keretébena vízbontásból származó elektron hasznosításával a ribulózbiszfoszfát-karboxiláz köt CO 2 -tAz átmeneti termék két foszfoglicerinsavra hidrolizálAz oxigént termelő Cyanobacterium-ban tilakoid membránba rögzítve dolgozik a kétfotorendszer. Az Oscillatoria princeps példája mutatja, hogy a mikroszervezet a vízbontásközben felszabaduló elektront használja fel a NADP + redukciójára.hνH 2 O + ADP + Pi + NADP + >>>>>>>>>>>>>>>>>>> O 2 + ATP + NADPH + H +CO 2 + ATP + NADPH + H + >>>>>>>>>>>>>>>>>>> CH 2 O + ADP + Pi + NADP +Σ CO 2 + 2 H 2 O >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> CH 2 O + H 2 O + O 2hν119

A megjelenő NADPH a széndioxid megkötésére szolgál. A karboxiszómájukban működőribulózbiszfoszfát-karboxiláz köti a szén-dioxidot az I. és II. fotorendszer működése során.(FRA = ferredoxint redukáló asszociátum [komplex])AZ OXIGÉN KÉPZŐDÉS VÁZLATA. O-----------------O ADP + P iOH + >>>>>>>>> ATPázPS-II rendszer O-------------- >ATP2 H + O-- ------OH 2 O ------> oP-680 ----O… f é n y ……………………fotono-------OO---- o ------------O1 / 2 O 2 O---------o ------ OO------------o PQO----------------o O 2 H +O-------- o plasztoO--------- o kinonPS-I rendszerO--cit-f o--------------O2 H + O----- o -----------OO plaszto- o--------OO cianin o --------OO o -------------OO--- P 700 o---------O…… fény…………………… fotonO---- o------------OO---------------- o ---OO-------- o vas-kénO---------o P 430O--------------o OO------------ o OO---------- oFerred-O---------- ooxin red NADP + 2 H +O------------ o o o e -O-------------FADH 2 o o o oO--------------- OO----------------------ONADPH120

sötét reakció a Calvin ciklus vázlata fényreakcióribulóz-5-foszfátCO 2 9 ATP; 6 NADPHATP >>>>> foszfoglicerát-kináz aerob körülmények eseténADP > 6 ATP; 3 NADPH; NADH; 2 ferredoxin red ; FM-H 2NADP + P iGAP glicerinaldehid-3-foszfát121

Tápanyag- és fényhiány esetében, főleg a heterociszták közelében akinéták képződhetnek. Ezeka képződmények a heterocisztáknál nagyobbak és a túlélést szolgálják. Mikroszkóppal szemlélvevastag falukkal és feltűnő granuláltságukkal tűnnek ki: cianoficint, karotenoidokat, glükogéntés lipideket halmoznak fel. Polifoszfát-tartalmuk minimális, viszont jelentős a ribonukleinsavtartalmuk.Fotoszintetikus kapacitásuk elhanyagolhatóan csekély. Jól bírják a kiszáradást és afagyasztást. Szigorúan anaerob körülmények között - például tavak üledékében - hosszú ideigéletben maradnak.Az összehasonlíthatóságkönnyítésecéljábólbemutatjuk aklorofill a és bszerkezetétvalamintfényelnyelőképességétamit döntő módonbefolyásol afotoszintézispigmentjeinek aszerkezete (lásd aspektrumot mutatóábrát) amelyek atilakoid membránhozrögzített antennakomplexbenfikobiliszómakéntfejtik ki hatásukat122

A FÉNYENERGIÁT HASZNOSÍTÓ SZERVEZET SZÉNHIDRÁTMETABOLIZMUSAÖSSZEFOGLALÓ ÁBRÁZOLÁSA FÉNYREAKCÓ (1)(2, 3) valamint A SÖTÉTREAKCIÓ (4-15)A TILAKOID-MEMBRÁN SZERVEZŐDÉSE123

Évmilliókon keresztül a tengervíz redukált vas tartalma oxidálódva akadályozta az O 2 -nek akörnyezetben való felszaporodását. Az oxidált vas a tengerfenéken felhalmozódva vasércformájában a vaskorszak ipari alapanyagaként hasznosul.Az oxigén megjelenése a Földtörténet soránMiért toxikus az oxigén?A légkörben megjelenő oxigén proton és elektron jelenlétében aktíválódikSZUPEROXID KÉPZŐDÉS O 2 + e – >>> O 2–HIDROGÉNPEROXID KÉPZŐDÉS O 2 + e – + 2H + >>> H 2 O 2HIDROXIL-GYÖK KÉPZŐDÉS H 2 O 2 + e – + 2H + >>> H 2 O + OH*HIDROXIL-GYÖK eliminációja OH* + e – + 2H + >>> H 2 OSzuperoxid dizmutáz hatásaFémtartalmú(Cu, Zn, Fe, Mn)fehérjeKatalázHem proteinPeroxidázFlavoprotein-oxidázTriplet oxigénSzinglet oxigén3 O 21 O 2Szuperoxid O 2–Peroxid O 22–Külső e – spin2O 2 + 2H + >>> H 2 O 2 + O 2H 2 O 2 + H 2 O 2 >>> 2 H 2 O + O 2H 2 O 2 +NADH+H + >>> 2 H 2 O+NAD +124

Az OXIGÉN JELENLÉTÉBEN KIALAKULT MIKROVILÁGÉletfontosságú reakció-ciklusokA környezetből felvett szénhidrát glikolitikus (hasznosulása energia forrásként) lebontásaszén-dioxid és víz képződéséig (glükolízis és a citrát kör működése által)Krebs ciklus működése aerob körülmények közöttSejtalkotórész szintézis CO 2 -ból:oxálecetsav, almasav, malonsav, metilmalonsav=szukcinátPiruvát dehidrogenáz aktivitás és acetil-CoA képződésA citoplazma redukáló állapotának megőrzése(a HMP úthoz vezető NADPH képződés)Pentózfoszfát út és az aromás vegyületek szintéziseA tioredoxin szerepe a redukált állapot fenntartásában (timin szintézis)Szénhidrogén képződése valamint hasznosulása szénforráskéntEcetsav képződése valamint hasznosulása szénforrásként (lebontása)Glicerin mint egyedüli szénforrás (katabolikus represszív hatása)Hem szerkezete, szintézise, (citokromok, chlorofillok, etc.)Alternatív légzési út feladata és működéseGOMBAVILÁGA mitokondrium szerveződése Neurospora crassa esetébenA mitokondrium megjelenése az élesztő féléknél az aerob anyagcsere függvényében.Katabolizmus szabályozása a prokariótákban és a gombákbanAz intenzív növekedési fázisban képződő glutation aminosavfelvételben játszott szerepeAz öregedés élettani vonatkozásai az eukariótákbanplazmid szerű képletek megjelenése a mitokondriumban125

SZÉNHIDRÁTANYAGCSERE A CITOPLAZMÁBANSZABÁLYOZÁSI FELADATOK MEGOLDÁSAA régebbi elnevezés a görög πρωτος ősi és πλασµα csinálmány szavak összevonásából, azújabb pedig a görög κυτος üreges test felhasználásával született. Közönséges fénymikroszkóponvizsgálva a prokarióta sejt beltartalma homogén fényáteresztő anyagnak tűnik. A festett készítményekenlátható szerkezeti elemek valóságtartalmát a sejt különböző sűrűségű alkotóelemeitmegkülönböztető fáziskontraszt-mikroszkóp technikai eredményei erősítették meg. Azelektronmikroszkóp fejlődése azután egyre részletesebb információt szolgáltatott az élő sejtszerkezeti elemeiről. Láthatóvá vált az örökítő anyagot tartalmazó maganyag, a DNS, afehérjeszintézisért felelős riboszóma, különböző membránnal határolt mikrotestek.Citoplazma a sejtfalától megfosztott mikroszervezet, a protoplaszt mechanikus vagyozmotikus roncsolásával nyerhető. A kolloidkémiailag jellemezhető rendszer amembránroncsoktól centrifugálással szabadítható meg. Kémiailag dezoxiribonukleinsav,ribonukleinsav és nagy mennyiségű fehérje mellett nagy molekulaméretű szénhidrát polimerekjelenléte igazolható. A kismolekulájú frakcióban aminosavak, nukleotidok, szénhidrátok, lipidek,továbbá a sejtfal építéshez, illetve tokpoliszacharid képződéshez szükséges prekurzorkénttöbb mint 60 féle nukleotid-cukorszármazék mutatható ki. Sűrűség-grádiens centrifugálással acitoplazmából különböző sűrűségű frakciókat lehet elkülöníteni.Az új biokémiai vizsgáló módszerek a fehérjefrakciók szétválasztásával az anyagcsereenzimeiről nyert ismereteinket szaporítják. A citoplazma fehérje frakcióját a sejtanyagcserelebontó és felépítő reakcióit katalizáló enzimek összessége alkotja. Az élő sejt roncsolásávalkapott kivonatból nyerhető enzimeket az elmúlt ötven évben laboratóriumi körülmények közöttrészletesen vizsgálva reakciókinetikailag jellemeztek, sokat közülük kristályos formában iselőállítottak. A kapott eredményeket azonban a legtöbb esetben nem sikerült működőképesegységbe összehangolni. A sejtkivonatban mért koncentrációviszonyok a legtöbb esetben nemérték el az enzimek optimális működéséhez szükséges szintet. Ezek az enzimek ugyanis in vivofunkciójuknak megfelelően, fehérje-komplexek, vagy lazább asszociátumok formájábanreakciósorokká rendeződve — a reakció sorrendnek megfelelően egymáshoz molekulárisközelségben — számos esetben szinte a kristályvizükben működnek. A reakciósor köztitermékeiáltalában nem jelennek meg a citoplazma teljes térfogatában, mert a képződő termék a szomszédenzim szubsztrátumaként folyamatosan felhasználásra kerül. A térbeli közelség miatt egy-egyenzim aktív központjában könnyen kialakulhat az a szubsztrátum koncentráció, amely az enzimoptimális működéséhez szükségeltetik. Ez az asszociatív kapcsolat a feltárás gondosanmegválasztott körülményei között, a higulást elkerülve megmarad, ami a vizsgálatukat lehetővéteszi. Az élő sejtben a lebontó és felépítő folyamatok bonyolultan kapcsolódva összefüggő,rugalmas anyagcsere-hálózatot alkotnak. A bonyolult összefüggések egy-egy célvegyületelőállítására különböző alternatív utakat biztosítanak.Az egész lebontó és felépítő rendszer képződését kifinomult mechanizmus szabályozza.A gazdaságosság elvéből következik, hogy egy adott időszakban nincs jelen a teljesenzimkészlet, csupán a célfeladat megoldását szolgáló fehérjék tevékenykednek. A változóéletkörülményekhez való alkalmazkodást a genetikai állományban levő lehetőségek hasznosításasegítheti. A szabályozás színvonala adott esetben a létért való küzdelem porondján a túléléstmeghatározó faktorrá válik. Az élettér betöltéséért folyó versenyben a leggazdaságosabbanműködő lény lesz a győztes, miközben az anyag és az energia gazdaságtalan felhasználóiautomatikusan kihígulnak a populációból. A szelekciós nyomás hatására új mutánsokmegjelenésével a létért folytatott küzdelem folytonos változást indukál.126

Valójában a biokémiai evolúció történései között a redukáló körülmények között először aglükóz képződést katalizáló reakciósor (glükoneogenesis) alakult ki, mert a környezetben az ősiidőkben aligha fordult elő hasznosítható szénhidrát. Később, amikor ezek a vegyületekfeldúsultak a környezetben, akkor kapott fontos élettani szerepet a szénhidrát lebontás útja(glükolízis).— A szénhidrát-anyagcsere fogalma valójában a lebontó és a felépítő folyamatokegyidejű működését jelenti. Erre példa a foszfoglicerát-kináz, amely az ATP energiatartalmáthasznosítva a glicerinsav-foszforsav vegyes anhidrid létrejöttét katalizálja.— A karboxilcsoportredukciójához a vegyes anhidrid csoport kialakulása feltétlenül szükséges. A glikolízis keretébenugyanez az enzim az enzimszintű foszforilációt megvalósítva az ATP képződést segíti.A glükóz-6-foszfát képződését a hexokináz katalizálja ATP energiatartalmának terhére. Ahexózfoszfát képződéshez szükséges ATP a foszfoenolpiroszőlősav piruváttá alakulásakorképződik a piruvát-kináz segítségével. A glükóz-szintézis (glükóz-neogenezis) esetében aglikolízisben is szereplő reverzibilis enzimeken kívül néhány speciális enzim működik. Ezekfeladata a gyakorlatilag irreverzibilisen működő, katabolikus funkciót betöltő enzimek kiváltása.Ilyen feladatot lát el a foszfoenolpiruvát karboxikináz, amelyik oxálecetsavból a GTPenergiatartalmát hasznosítva egy szén-dioxid felszabadulása mellett foszfoenol-piroszőlősavatképez. A másik kritikus ponton a fruktóz-1,6-biszfoszfát-foszfatáz katalizálja a fruktóz-6-foszfátképződését egy anorganikus foszfát felszabadításával, majd az izomeráz segíti elő aglükóz-6-foszfát képződését. Ebből a cukorfoszfátból (G-6-P) képződik a membrán alkotóelemekéntismert inozitol, a sejtfal szintéziséhez szükséges glükózamin és ebből indul ahexózmonofoszfát (HMP) úthoz kapcsolódó pentózfoszfát ciklus, amely többek között a127

nukleinsavak építőelemeiként ismert ribóz képződésére, valamint aromás termékek,aminosavak, vitaminok szintézisére ad lehetőséget. A glükóz-6-foszfát hidrolízisét szükségesetén a glükóz-6-foszfatáz katalizálja.A szabályozás kérdéskörének tárgyalására térve legyen szabad emlékeztetnem az olvasót,hogy az enzimreakciót katalizáló fehérje tevékenysége ugyan reverzibilis, mégis az egyensúly afunkciónak megfelelően eltolódott. Az eltolódás mértékét számszerüsíti a ∆G o /kcal érték.G-6-P izomeráz F-6-PA glükóz-6-foszfát fruktóz-6-foszfát reverzibilis átalakulást katalizáló izomeráz a glükózneogenezist szolgálva kezdettől fogva a glükóz képződés irányába tolódott, amit számszerűen a+ 0.4 ∆G o /kcal érték igazol. — Jól tudott, hogy ugyanez a fehérje teljesíti feladatát a glükózlebontást végző reakciósorban is. A foszforilezést katalizáló fehérje aktivitását, az egyensúlyirányát, a –3.4 ∆G o /kcal érték mutatja. Az izomeráz aktív centrumában időnként megjelenőfruktóz-6-foszfátot a közelben levő, nagy aktivitással működő foszfofruktokináz fruktózdifoszfátképződést katalizálva rögvest eltávolítja.F-6-P + ATP >>>> foszfofrukto-1-kináz >>>>>> F-1,6-P 2 + ADPAz eukariótákban ennek az enzimnek az aktivitását alloszterikus szabályozás határozza meg.Nevezetesen a környezetben jelenlevő citrát, ATP és NADH aktuális koncentrációjukföggvényében csökkentik, míg a felszaporodó ADP fokozza a fehérje katalitikus aktivitását.Glükóz neogenezis körölményei között a fruktóz-1,6-biszfoszfatáz távolítja el a difoszfát foszforcsoportját (- 4.0 ∆G o /kcal) F-1,6-P 2 >>>>>> fruktóz-1,6-biszfoszfatáz >>>>>>> F-6-P + P iGLÜKÓZpentózfoszfát ciklusATP >>>>>F-2,6-P 2 gátló hatású!hexokinázF-6-PADP >>>>>>>>>>>>>>>>ADPATP >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ADPF-2,6-P 2P iF-6-PF-6-P-1-foszfokináz F-1,6-P 2 F-1,6-difoszfatáz[F-2,6-P 2 serkentő hatása érvényesül][F-2,6-P 2 gátló hatása érvényesül]aldoláztriózfoszfátok (GAP+dihidroxiacetonfoszfát)Fruktóz-2,6-biszfoszfát szabályozó szerepe az eukariótákban a glükolízis irányába128

A fruktóz-6-foszfát és a fruktóz-1,6-difoszfát aktuális koncentrációját finoman szabályozza afruktóz-2,6-difoszfát, amely a hexóz lebontást az Embden-Meyerhof-Parnas útra irányítvasegíti a citromsav képződést. Az alloszterikus hatás a szétroncsolt gombafonalakból kinyertsejtmentes fehérjekivonatban is jól észlelhető. A szabályozó szerepet betöltő vegyület (F-2,6-P 2 ) eltünése lecsökkenti a glikolízis működése szempontjából nélkülözhetetelen fruktóz-1,6-difoszfát képződést. Ez a bonyolult szabályozó mechanizmus a szénhidrát leggazdaságosabbfelhasználását biztosítja. A vad törzsnél csak annyi energiagazdag hexóz-foszfát kerülfelhasználásra amennyi szűkséges a citrát kör táplálására, illetve a bioszintetikus folyamatokNADPH igényének a kielégítésére. A 6-foszfoglükonát dehidrogenáz működését gátolva apentózfoszfát ciklus táplálását szabályozza. — A szabályozó szerepet betöltő F-2,6-P 2szintézisét és lebontását egyetlen kettős (kináz-foszfatáz) rendeltetésű Janus arcú fehérjekatalizálja. A fruktóz-6-foszfát-2-kináz cAMP függő protein-kináz által foszforilezve, F-2,6-biszfoszfatáz-ként lebontja a szabályozó szerepet betöltő F-2,6-P 2 -ot. — A szeril-oldallánconfoszforilezett enzim protein-foszfatáz által defoszforilezve viszont mint F-6-P-2-kináz éppena szabályozó hatású F-2,6-P 2 képződését katalizálja. A protein-kináz működését a metabolikusaktivitástól függő cAMP szint serkenti, aminek következményeként glükóz hiány eseténvisszaszorul a glükolízis, előtérbe kerül a glükoneogenezis.129

Acetil-S-CoA képződés szabályozása. Az anaerob illetve aerob körülmények közöttlétező élő szervezet számára nélkülözhetetlen a reakcióképes „aktiv acetát”, az acetil-S-CoAképződése, aminek a szabályozásában a protein-foszforiláz—protein-foszfatáz hatás érvényesül.Acetil-CoA térszerkezetimodeljeecetsavacetil csoport130

Acetil-CoA képződés piruvátból; Piruvát dehidrogenáz enzimkomplex működése[Tiamin pirofoszfát — liponsav — FAD — NAD + faktorok szerepe]A piroszőlősav a karbanion állapotban levő tiaminpirofoszfáthoz kapcsolódik;az addiciós terméken bekövetkező elektron-átrendeződés segíti előa liponsav diszulfid kötésének a felnyílását követő acilezést.A képződő tiolészterről az acil csoport könnyen vándorol a CoA-SH csoportjára és így létre jönaz élő sejt fejlődése szempontjából nélkülözhetetlen acetil-CoA (az aktív acetát)A liponsav visszaoxidálása FADH 2 képződésével jár, amiről az elektronokatNAD + kofaktorral működő oxidoreduktáz távolítja el.TPP —LIPONSAV — FAD szerepe. A piruvát dehidrogenáz működésének szabályozásaA komplex működését az enzimfehérjefoszforilezése akadályozza;A proteinkináz aktivitását befolyásolóhatást ATP, acetil-CoA és NADHfelszaporodás befolyásoljaAz ATP, acetil-CoA és NADHkoncentráció változásának függvényében afehérjekomplexhez kapcsolódó foszfátcsoportot végül is egy foszfatáz távolítja el.FAD H OA képződő peroxidot enzim távolítja el a rendszerbőlredukált liponsav Kataláz H 2 O + [ ½O 2 ]2 2NAD + +2H 2 OPeroxidáz NADH + H +Oxidáz a légköri oxigén terhére regenerálja a redukált flavin faktortoxidált liponsavFADH 2 O 2131

SZÉNHIDRÁTFELVÉTELA mikroorganizmusok a sejttömegük felépítéséhez szükséges szénhidrátokat a citoplazmájukbanműködő enzimrendszereikkel képesek előállítani. Mégis, ha lehetséges, akkor a gazdaságosságelvének megfelelően a környezetükből veszik fel azt, a membránba rögzített hexokináz adtalehetőség kihasználásával.A foszfát csoportot a citoplazma energia gazdag anyagcsere terméke, esetünkben afoszfoenolpiroszőlősav szolgáltatja. A szénhidrátlebontás első lépéseként hexózfoszfát képződésétkatalizálja a mono-szacharidok felvételére szolgáló mechanizmus. Escherichia coli ilyenmódon veszi fel a glükózt, fruktózt, mannózt és redukált származékaikat, a szorbitot és amannitot. Ezek a transzferázok általában specifikusan egy-egy cukor felvételére szolgálnak. Afoszfotranszferáz rendszer valójában egy enzimkomplex, amely a membránba kötött lipid függőtranszfer-fehérjéből és a hordozó fehérje regenerálását biztosító enzimekből áll. A membránbanelhelyezkető (Enz-H 5 ) hexóz-foszfotranszferáz fehérje két alegységből tevődik össze. Az egyika cukorra specifikus "A" fehérje, a másik a lipidhez kötődő "B" fehérje. Ez utóbbi miatt a transzferáztáltalában detergenssel lehet kimozdítani a membránból. A két alegységből álló fehérje invitro csak foszfatidil-glicerin és kétértékű ionok jelenlétében mutat hexokináz aktivitást. In vivoa foszforilezett fehérje (enzim) a membrán külső oldalán reagál a hexózzal, mégpedig annak C-6hidroxil csoportját foszforilezi. A képződő cukorfoszfát azután a membrán belső oldalán hagyjael a most már defoszforilezett transzportfehérjét. A transzportfehérjét a citoplazmában működő,legkevesebb három fehérjéből álló, hidrofób enzimkomplex regenerálja, azaz újra foszforilezi.Az első hidrofób jellegű, két alegységet tartalmazó, 140 kDa méretű dimert közvetlenül afoszfoenolpiroszőlősav foszforilezi. A foszforilezett (Enz-I) dimerről a foszfátcsoportátmenetileg egy viszonylag kisméretű (hőálló HPr) fehérjére kerül, amely foszforilezi a háromalegységet tartalmazó, 36 kDa méretű (Enz-H) fehérje hisztidint tartalmazó aktív szakaszát. Ez afoszforilezett fehérje regenerálja végül a membránba rögzített (Enz-H 5 ) hexóz-permeázt.Abban az esetben, ha a tápközegből elfogyott a felvehető hexóz, akkor az előbb tárgyaltregeneráló rendszer az inaktív adenilát-ciklázt foszforilezi és ezáltal aktiválja. Ennekeredményeként megnő a sejtben található cAMP mennyisége, amely a CAP-hez kötődve azaddig katabolikusan represszált enzimeknek, például az amiláznak a képződését elindítja, delehetővé válik a tápközegben jelenlevő energiaforrásként hasznosítható vegyületek (laktóz,arabinóz, stb.) felvételére és lebontására alkalmas enzimrendszerek képződése is. Az a tény,hogy a hexóz-permeázt regeneráló rendszernek az első enzime is hidrofób jellegű, azt sugallja,132

hogy eredetileg az egész rendszer membránhoz kötve működött, és csak később került egy részea citoplazmába. Ma is élnek olyan prokarióták, például a Rhodobacteriaceae család tagjai,amelyekben az egész permeázrendszer a membránban helyezkedik el, és a membrán belsőoldalán elhelyezkedő (E-I) fehérjét foszforilezi a citoplazmából származó foszfoenolpiroszőlősav.A hexóz-foszfotranszferáz rendszer tehát foszfoenol-piroszőlősav terhére biztosítjaa mikroba hexózfelvételét. Spontán kiáramlás nem csökkenti a transzport hatásfokát, mivel aképződő glükóz-6-foszfát számára a membrán gyakorlatilag átjárhatatlan.A transzportfolyamatban közreműködő fehérjék sok szempontból az enzimekhez hasonlóak. Aszállított anyagra specifikusak és ennek megfelelően specifikusan gátolhatók. Képződésük sokesetben indukálható, illetve derepresszálható. Szerkezetileg hasonló anyagok (analógok, illetvehomológok) átvitelére is alkalmasak, mégpedig a hasonlóságuk mértékétől függően. A glükózaktív felvételekor a citoplazma membránon való áthaladás közben a hexózpermeáz aktívtevékenységének a hatására a citoplazmába megjelenő glükóz-6-foszfát a glikolitikus útonpiroszőlősavig oxidálódva a légköri oxigén hiányában, tehát anaerob körülmények között isenzim szinten ATP képződéséhez vezet.A HMP-út foszforilezett, nagy energiatartalmú kiindulási anyaga a glükóz-6-foszfát (G-6-P),amely egyetlen szénatom széndioxiddá alakulása mellett két redukált kofaktor (NADPH)képződését segíti elő. Ezek a redukált koenzimek a bioszintetikus folyamatok szempontjábólnélkülözhetetlenek; például a membrán felépítéshez, a zsírsav színtéziséhez, a szén-dioxidbeépítéséhez, stb.Valójában a pentózfoszfátok reverzibilis átalakulásával jellemzett ciklus a szénlánc rövidülésévelkezdődik. Működése a mikroba számára esszenciális, mert számos létfontosságúvegyület képződését teszi lehetővé. A glükonsav foszfátból ribulóz-foszfát képződik. Ez az útszolgáltatja a ribonukleinsav- és a dezoxiribonukleinsav szintézis ribóz építőelemeit. Ittképződik az aromás aminosavak bioszintéziséhez szükséges szedoheptulóz-7-foszfát és köztesanyagként megjelenik a glicerinaldehid-3-foszfát (GAP). Arómás szerkezetű vitaminok éskoenzimek képződése egészíti ki az élettani jelemtőségét. (PAB, NAD + , nikotinsav, etc.)NADP + képződése NAD + -bólOH|P=O HO| | + NAD + = NADP + + H 2 OOH HO-P=O|OHA foszforsav ez esetben az adenilsav kettes szénatomjának hidroxilcsoportját acilezi133

Az anaerob körülmények között kialakult, de aerob kürülmények között is nélkülözhetetlenHMP — HEXÓZMONOFOSZFÁT-ÚT és a PENTÓZFOSZFÁT-CIKLUS működése6 G-6-P + 12 NADP + 6 CO 2 + 5 G-6-P + 12 NADPH6 glükóz-6-foszfát (G.6-P)O>>6 NADPH G6P-dehidrogenázI6 glükonolakton-6-foszfátD>>>>>>>>>> 6 HOHA6 glükonát-6-foszfát (6PG)T>6 NADPHV >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>6 CO 26 ribulóz-5-foszfát (Ru5P)RE epimeráz izomerázVE 2 + 2 xilulóz-5-foszfát (Xu5P) 2 ribóz-5-foszfát (R5P)RZtranszketolázIB 2 glicerinaldehid-3-foszfát (GAP) 2 szedoheptulóz-7-foszfát (Se7P)ILItranszaldolázS2 eritróz-4-foszfát (E-4-P) 2 fruktóz-6-foszfát 2 (F6P)ÁT transzketolázALAKizomerázUL 2 GAP DHAP 2tÁ 2 (F-6-P)SaldolázIfruktóz-1,6-biszfoszfát (F-1,6-P 2 )SZ Pi foszfatázAK fruktóz-6 foszfát (F-6- P)ASG6P-F6P izomerázZ5 GLÜKÓZ-6-FOSZFÁTA szigorúan anaerob mikroszervezetekben (Chlorobium sp., Sulfolobus sp.) talált ferredoxinfüggő reduktív citromsav ciklus végzi az archaeozoikum redukáló légkörében jelenlevő széndioxidmegkötését (Proc. Natl. Acad. Sci. 55:928-34, 1966.). A glükózt szintetizáló rendszert areduktív citromsav-ciklusban termelődő oxálecetsav tölti fel. Az oxálecetsavból NADH függőredukcióval almasav képződik, amiből vízkilépéssel képződik a fumársav. Ezt redukált flavinmononukleotid alakítja borostyánkősavvá. — A szukcinil-CoA képződéshez ATP és CoA-SHszűkséges.— Redukált ferredoxin segíti a CO 2 felvételt.— A képződő α-ketoglutarát NADPHsegítségével újabb CO 2 felvételével alakul izocitráttá, amiből cisz-akonitáton keresztül134

citromsav képződik. A citromsav oxálecetsavra és acetátra hasad. Ez utóbbi ATPenergiatartalmát hasznosítva CoA-SH-val lép reakcióba és acetil-CoA-vá alakul. Az acetil-CoAredukált ferredoxin segítségével CO 2 -ot köt. A képződő piruvát ATP energiatartalmáthasznosítva újabb CO 2 felvételével oxálecetsavvá karboxileződik. Az oxálacetátból foszfoenolpiruvát-karboxikinázés GTP segítségével képződik a foszfoenolpiruvát amely táplálja aglükóz képződést katalizáló reakciósort.A GLÜKÓZ METABOLIZMUST BEMUTATÓ VÁZLATON SZEREPLŐ ENZIMEK*(1) Hexokináz [2.7.1.1]; glükokináz [2.7.1.2] Glükóz + ATP >> G-6-P + ADP(2) Glükózfoszfát izomeráz [5.3.1.9] G-6-P F-6-P( 3) Fruktózfoszfát kináz [2.7.1.11] F-6-P + ATP >>> F-1,6-P 2 + ADP( 4) Fruktóz-1,6-difoszfát foszfatáz F-1,6-P 2 >>>> F-6-P + P i( 5) Aldoláz [4.1.2.13] F-1,6-P 2 GAP + dihidroxiaceton-P( 6) Triózfoszfát izomeráz [5.3.1.1] GAP dihidroxiaceton-P( 7) Glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GAP+NAD + +P i glicerinsav-1,3-foszfát + NADH+H +( 8) Foszfoglicerát kináz 1,3-P 2 -glicerát + ADP 3-P-glicerát + ATP( 9 ) Foszfoglicerát mutáz 3-P-glicerát 2-P-glicerát(10) 2-foszfoglicerát-PEP enoláz 2-P-glicerát foszfo-enolpiruvát (PEP)(11) Piruvát kináz [2.7.1.40] PEP + ADP >>> piruvát + ATP(12) Piruvát dehidrogenáz komplex [1.2.4.1] Piruvát +NAD + + CoA-SH>>acetil-CoA+ NADH+H + + CO 2(13) Piruvát dekarboxiláz [4.1.1 1] Piruvát >>> acetaldehid + CO 2(14) Alkohol dehidrogenáz [1.1.1.1] Acetaldehid + NADH+H + etanol + NAD +(15) Aldehid dehidrogenáz Acetaldehid + NAD + >>> ecetsav + NADH+H +(16) Acetil-CoA szintetáz Ecetsav + ATP +CoA-SH >>> acetil-CoA +ADP +P i(17) Tejsav dehidrogenáz Piruvát + NADH+H + tejsav + NAD +(18) Piruvát karboxiláz [6.4.1.1] Piruvát + ATP + CO 2 >>> oxálecetsav + ADP + P i(19) Piruvát karboxikináz Oxálecetsav + ATP >>> PEP + CO 2 + ADP(20) Citrát szintetáz Oxálecetsav + acetil-CoA >>>> citrát + CoA-SH(21) Akonitáz Citrát izocitrát(22) Izocitrát dehidrogenáz Izocitrát + NAD + >> 2-ketoglutarát + NADH+H + + CO 2(23) Ketoglutarát dehidrogenáz 2-ketoglutarát+NAD + +CoA-SH >> szukcinil-CoA+NADH+H + +CO 2(24) Szukcinil tiokináz (szukcinil-CoA szintáz) Szukcinil-CoA+ GDP+P i >>> szukcinát + CoA-SH + GTP(25) Szukcinát dehidrogenáz Szukcinát + FAD>>> fumarát + FADH 2(26) Fumaráz Fumarát + H 2 O almasav(27) Almasav dehidrogenáz Almasav + NAD + oxálecetsav + NADH+H +(28) Izocitratáz Izocitrát >>> szukcinát + glikolaldehid(29) Malát szintetáz Glikolaldehid +acetil-CoA >>> almasav + CoA-SH(30) Oxálacetát hidroláz Oxálecetsav + H 2 O >>> oxálsav + ecetsav(31) Glicerofoszfát dehidrogenáz 1-glicerofoszfát + NAD + > dihidroxiaceton-P + NADH+H +(32) Glicerin kináz Glicerin + ATP >>> 1-glicerofoszfát + ADP(33) Dihidroxiaceton-foszfát dehidrogenáz dihidroxiaceton-P +NADH+H + >>>1-glicerofoszfát + NAD +(34) Glicero-foszfát defoszforiláz 1-glicerinfoszfát >>> glicerin + P i(35) Glükóz-6-foszfát dehidrogenáz G-6-P + NADP + >>>glukonolakton-6-P + NADPH+H +(36) Glükono-laktonáz glukonolakton-6-P +H 2 O >>>> 6-foszfoglukonát(37) 6-foszfoglükonát dehidrogenáz Glukonsav-6-P +NADP + >>>Ru-5-P + CO 2 + NADPH+H +(38) Ribulóz-5-foszfát epimeráz Ru-5-P Xu-5-P(39) Ribóz-5-foszfát ketolizomeráz Ru-5-P R-5-P(40) Xu-5-P,R-5-P transzketoláz Xu-5-P + R-5-P sedoheptulóz-7-P + GAP(41) F-6-P,eritróz-4-foszfát transzaldoláz GAP + sedoheptulóz-7-P eritróz-4-P + F-6-P(42) Xu-5-P,eritróz-4-P transzketoláz eritróz-4-P + Xu-5-P F-6-P + GAP*a vázlaton szereplő számok ( )–ben, a szénhidrát anyagcsere enzimeinek azonosításáraszolgálnak135

A SZÉNHIDRÁT METABOLIZMUS összefoglaló ábrája GLÜKÓZTÓL SZÉNSAVIGH-C=OH-C-OH ATP>>>HO-C-HH-C-OH (1)H-C-OHH 2-C-OH glükózH 2 -C-OPO 3–C=O dioxiaceton-PH 2-C-OHNAD(P) + /NAD(P)H(33) (31)H 2 -C-OPO 3–H-C-OH glicerol-3-PH 2-C-OH(34) (32)ATP/ADPH 2-C-OHH-C-OHH 2-C-OHglicerolCOOH oxalátCOOH(30) H 2OCH 3COOH ecetsavH-C=OH-C-OHO=C —H-C-OH (36) H 2OO=C-O –H-C-OHHO-C-H >>>>>ADPHO-C-HHO-C-HH-C-OHNADP + / NADPH H-C-OHH-C-OH 6-PGH-C-OH(35)H-C—O glükono- H-C-OH–H 2-C-OPO 3 G-6-P–H 2-C-OPO 3 lakton–H 2-C-OPO 3(2) (37) NADP + / NADPHH 2-C-OHCO 2C=OHO-C-HH 2-C-OHC=O Ru-5-PH-C-OH F-6-PH-C-OHH-C-OH–H 2-C-OPO 3 (3) (4)H-C-OH–H 2-C-OPO 3ATP >>>>>>>>>>> Pi (39) (38)H 2-C-OPO 3– >> ADPC=OHO-C-H F-1,6-P 2H-C-OHH-C-OHH 2-C-OPO 3–(5)(6)O=C-HH-C-OH GA-3-P–H 2-C-OPO 3NAD + >>>>(7) >>>NADHO=C-OPO 3–H-C-OH1,3-P 2-glicerátH 2-C-OPO 3–H-C=OH-C-OHH-C-OHH-C-OHH 2-C-OPO 3–O=C-HH-C-OH–H 2-C-OPO 3R-5-P(40)GA-3-P(41)H 2-C-OHC=OHO-C-H F-6-PH-C-OHH-C-OH–H 2-C-OPO 3H 2-C-OHC=OHO-C-HH-C-OHH 2-C-OPO 3–ADP>>> (8)>>>ATPO=C-O —(42)H-C-OH 3-P-glicerát O=C-H–H 2-C-OPO 3 H-C-OH GA-3-P(9)–H 2-C-OPO 3O=C-O –H-C-OPO – 3 2-P-glicerátH 2-C-OH (10)O=C-O –P-E-P |P-enol-piruvát C-OHADP >> | |–H–C-OPO 3O=C-O – (11)C=O >>>> ATP (13) H-C=O NADHCH 3 PIRUVÁT CH 3 acetaldehid(17) (15) (14)(19) (18) (12) CO 2 COOH EcetsavATP/ADP NAD + / NADH (16) CH 3CO 2 O=C-O – NADH/NAD +H-C-OHCH 3 laktátO|| acetil-CoAH 3C-C—S-CoAXu-5-PH 2-C-OHC=OHO-C-H sedoheptulózH-C-OH -7-PH-C-OHH-C-OH–H 2-C-OPO 3H-C=OH-C-OH eritróz-4-PH-C-OHH 2-C-OPO 3–H 2-C-OHC=OHO-C-H Xu-5-PH-C-OH–H 2-C-OPO 3Elvi lehetőségként aXu-5-P reagálhat azEritróz-4-P -tal ésÍgy a glikolizisbenfelhasználható F-6-Pés GAP képződhetnagyobb mennyiségbenHNAD + H-C-OHCH 3 etanolO=C–O —C=O oxalacetát(20)COO —H-C-H citrátH-C-HO=C–O —HO-C-COO —H-C-H(27)COO —NAD + / NADH acetil-CoA (21)O=C–O —HO-C-H(29)COOHH-C=OCOO —H-C-HH-C-H malátGlioxilát (28) H-C-COO —O=C–O —

Az összefoglaló ábra alsó részén bemutatott SzentGyörgyi-Krebs ciklus az aerob anyagcsere utak(az intermedier metabolizmus) központi szereplőjekénta bioszintézisben, de a lebontásban is jelentős feladatotlát el. A klasszikusnak tekintett, acetil-CoA-val tápláltSzentgyörgyi-Krebs körfolyamat ad lehetőséget aszénváz teljes elégetésére. Itt távozik oxidálva az aktív(piros)acatát (acetil-CoA) két szén-dioxid alakjában.citromsav cisz-akonitát izocitrátCoA-SH akonitáz (2) akonitáz (2a)CO 2 NAD(P) +citrát-szintetáz (1) izocitrát-dehidrogenáz (3)acetil-CoANADPHoxálacetátα-ketoglutarátCoA-SHNADH CO 2 NAD +malát-dehidrogenáz (7) α-ketoglutarát-dehidrogenáz (4)NAD +NADHszukcinil-CoAH 2 O FADH 2 FAD (4a)malát fumarát szukcinát GDP Pifumaráz (6) szukcinát-dehidrogenáz (5) GTPA TCA-CIKLUS MŰKÖDÉSÉNEK A TCA-tól térbelileg is független, aSZABÁLYOZOTTSÁGAgyorsító hatású GLIOXILÁT CIKLUSamelyet az izocitrát-liáz (1) indít.Folyamatos nyílvonal gátló hatástA szaggatott vonal aktíváló hatást jelez.Citrát szintetáz működése137

Az elektrondonorként szolgáló energiaforrás – a SZÉNVÁZ – végül is a Krebs-ciklusban alakulszén-dioxiddá, miközben a folyamat közben eltávolított elektronok NADH, illetve FADH 2közvetítésével jutnak a terminális oxidációnak (oxidatív foszforiláció) nevezett citokrómokbólfelépülő légzőrendszerhez. Az elektrondonorként szereplő vegyületről eltávolított elektronokat alégzési lánc a citokrómoxidáz segítségével juttatja a kiszemelt elektronakceptorra, az oxigénre.A citokrómok a légzési lánc fontos csoportját alkotják. Több típusuk ismeretes; ezeket az abckisbetűivel jelölve, adott esetben indexszámmal különböztetik meg. A kb. 100 aminosavbólfelépülő fehérje (reverzibilisen) elektron felvételére, ill.leadására képes hem-vasat tartalmaz.A citokrom c fehérje középpontjában levő hem vasatomjához a hisztidin (18) N-je és a metionin (80) kénatomja kapcsolódik. (A hidrofób tulajdonságú alaprészt afejrészhez egy oligomicinre érzékeny fehérje kapcsolja.)A cytochrom c kivételével ezek a fehérjék általábannehezen távolíthatók el a membránból. A komplex utolsó,rezet is tartalmazó tagja (citokrómoxidáz; citokróm a),közvetlenül képes reagálni az oxigénnel. A vízben oldottmolekuláris oxigént redukálva instabil oxanion képződik,ami a jelenlevő protonnal vízzé egyesül.A légzőrendszer működésecianiddal, aziddal és szénmonoxiddalgátolható.Az elektron útja a cytochrom c-től az oxigénigA terminális oxidáció feladataaz elektron eljuttatása az oxigénreNADH.H + >> 2H + . 1 / 2 O 2 >>> H 2 O138

Az Escherichia coli ATP-áz komplexében egyszabályozó fehérjét is kimutattak, amelymegakadályozza az ATP-hidrolízis túlműödését.citoplazmaAz E. coli citoplazma membránban működőATPszintetáz fehérje összetevőinek jellemzésealegységeinek móltömege:F 1 α 55200 F 1 β 50100F 1 γ 31400 F 1 δ 19400F 1 ε 14900F o a 30300 F o b 17200F o c 8200Az ATP-áz komplex két fehérje-asszociátumból szerveződik: — Az egyik molekulaasszociátum,a három reakcióterű katalitikus aktív centrumot tartalmazó fejrész (F 1 ) ötalegységből épül fel. Viszonylag könnyen eltávolítható a membránból alacsony ionerősségűpufferrel való mosással.— A komplex másik része (F o az alaprész), olyan szorosan kötődik amembránhoz, hogy csak a membrán feloldásával szabadítható abból ki. Ez a fehérje-lipidasszociátum legalább három, de inkább öt alegységből áll. Ebben helyezkedik el a protontátvezető csatorna. Ez a csatorna specifikusan blokkolható kémiai vegyületekkel.Az ATP-szintézis valójában egy körfolyamatba illeszkedő mechanokémiai reakció eredménye.Boyer mechanokémiai elképzelése az ATPszintetáz-ról (fordulatonként 1 ATP képződik)(Az ATP szintetáz központi tengelye)A három reakciótérrel rendelkező fehérje mozgási irányát a protonáramlás határozza meg. Azegyik szektorban ATP helyezkedik el. A szomszéd szektor veszi fel az ADP-t és az anorganikusfoszfátot. A harmadik szektor köztes állapotban vár a protongrádiens által meghatározottprotonmozgás irányától függő feladatára. A citoplazma irányába haladó protonáramlás a fehérjekomplexforgószínpadszerű elmozgatásával olyan konformáció változást okoz, amely elősegítiaz ATP leválását, miközben kedvez a felvett ADP és a foszfát között létrejövő nagyenergiájúkötés kialakulásának. P. D. Boyer és munkatársai húsz év múlva, 1997-ben Nobel-díjbanrészesültek felfedezésükért.Mivel a földi élet kialakulása közben a légkör oxigéntartalma fokozatosan növekedveérte el a mai szintet, nem meglepő, hogy találunk olyan mikrobákat, amelyek citokrómrendszerei a mainál csekélyebb oxigén jelenlétében is működőképesek. Az Escherichia colipéldául egy-két százalék oxigént tartalmazó légkörben is képes aerob légzőrendszerét működtetni.A sejtmembránba rögzített citokróm-a oxidáz mellett olyan eltérő tulajdonságú, nagyoxigénaffinitású citokróm-d oxidáz is működik, amely oxigénszegény tenyésztési körülményekközött is képes működésben tartani a terminális oxidációs rendszert. Ez a transzferrendszer teszilehetővé a mikroszervezet számára azt, hogy az energiaforrásként használt tápanyag lebontásafolyamán bekövetkező szabadenergia-csökkenés jelentős része később felhasználható diszkrétenergia-csomagok (ATP) formájában kerüljön átmeneti raktározásra.139

A NADH-hordozta elektron csak a flavin mononukleotidot tartalmazó flavoproteinen (NADHdehidrogenáz)keresztül léphet a rendszerbe. Ez a vastartalmú fehérje átmenetileg redukálódvajuttatja át az elektront a hosszú ideig felderítetlen, bár az élővilágban mindenütt előforduló ésezért Morton által ubiquinonnak (CoQ) nevezett elektronátvivő vegyületre. Ennek avegyületnek a hidrogén felvételére alkalmas kinon részét (K-vitamin esetében a naftokinonrészét) 6-10 tagú izoprén-polimer rögzíti a membránba. Szerepük különösen fontos, mert ezek avegyületek inga módjára működve, a dehidrogénezéskor leválasztott két elektront a protontólkülönválasztva továbbítják a citokróm enzimkomplex első tagjához, a citokróm-b fehérjéhez.Mivel az ubiquinon az elektronokat a citokróm-b-hez csak egyenként továbbíthatja, nemmeglepő, hogy átmenetileg, rendkívül rövid ideig létező, köztes redoxpotenciálú, félig oxidált,félig redukált intermedier jelenlétével kell számolni. — Az ubiquinon nemcsak a redukáltflavoproteinről, hanem a borostyánkősav-dehidrogenáz kofaktoráról, a FADH 2 -ről is képes azelektront a citokrómok felé továbbítani. A különbség azonban jelentős, mert amíg a NADHdehidrogénezését végző, FMN-tartalmú flavoprotein redukciója közben jelentkezőprotongrádiens egy ATP képződését katalizálja, addig a szukcinátról származó elektron FADenzimáltal katalizált átvitele nem jár ATP-képződéssel.Megjegyzendő, hogy egyes redukált FAD-enzimek (oxidázok) a levegő oxigénjével isképesek visszaoxidálódni hidrogénperoxid képződése közben. Ez a toxikus vegyület azonban amikroorganizmusokban jelenlevő NADPH-igényes peroxidáz hatására vízre és oxigénre bomlik.Koleszterin + FAD-fehérje Oxidáz Kolesztenon + FADH 2 –fehérjeFADH 2 –fehérje + Oxigén Oxidáz FAD–fehérje + H 2 O 2 (hidrogénperoxid)H 2 O 2 Kataláz H 2 O + ½ oxigénEz a reakciósor energetikai szempontból ugyan haszontalan, mégis fontos söntfeladatot lát el,sok esetben méregtelenítést végez.— A Photobacterium fajokban a flavin mononukleotidottartalmazó luciferáz fehérje regenerálja a redukált kofaktorokat látható fény kisugárzása közben.FMNH 2 oxidált luciferáz R-COOH vízfényFMN redukált luciferáz R-CHO oxigénSzámos esetben az energianyerés nem igényel redukált piridin-nukleotid képzést, mert azoxidáció közben eltávolított elektronok közvetlenül kerülhetnek az erre a célra kialakult azoxigénre továbbító citokróm rendszerbe. (etanol + oxigén ecetsav + víz).Oxidatív foszforiláció megy végbe a fototróf prokarióta belső membránjában is, ahol azoxigénlégkör megteremtése kezdődött az elektrondonorként szolgáló vízből.A dehidrogénezési folyamat előrehaladása közben az életműködés szempontjából fontosfaktorok (ATP, NADH, NADPH stb.) meghatározott sztöchiometriai arányban képződnek,jóllehet a mikroorganizmus egyes életszakaszaiban az igények jelentős minőségi és mennyiségieltérést mutatnak. Az enzim-szintű ATP-képződést a redukálható kofaktorok (NAD + , NADP + )mennyisége egyértelműen meghatározza. Ebből következően a redukált kofaktorok visszaoxidálhatóságaaz életben maradás feltételeként jelentkezik.Ennek a problémának a feloldására különböző alternatív elektrontranszport-rendszerekszolgálnak. Az elektronakceptor lehet akár az oxigén is. Feladatuk a túlélés biztosítása. Közösjellemzőjük, hogy tapasztalat szerint toxikus peroxidok képződése nélkül megoldják adehidrogénezési folyamatok közben megjelenő redukált kofaktorok regenerálását. Alternatívlégzésnek nevezik a cianiddal nem, de szalicilsav-hidroxamáttal gátolható rendszert, amelyATP-képződés nélkül juttatja át a redukált kofaktorokról az elektront a tápközegben oldottoxigénre, mint elektronakceptorra.140

AZ OXIDATÍVFOSZFORILÁCIÓ ELEKTRONTRANSZPORTLÁNCAH + >>>>O-----------------OO-----------------O--O-------------ATPázATPNADH-CoQ-reduktázO-----------------H + O-----------------O < ADP + PiO-----------------OO------------------OO-------------- NADHH +

katalizáló, komplex rendszer. A foszforilációt katalizáló ATP-áz komplex és elektrontranszportláncegymástól elszigetelt, optimális távolságban rögzített tagjai működésük sorrendjébenhelyezkednek el a membránban. A reakciólánc térben rögzített tagjainak a redoxipotenciáljaolyan sorrendben válik egyre pozitívabbá, ahogy az elektron a szubsztrátumtól (NADH, FADH 2 )a membránban elhelyezkedő elektrontranszport-fehérjéken keresztül az elektronakceptor(Oxigén) felé halad: flavin enzim (−0,06 Volt/mol) citokróm-b (+0,035 Volt/mol) citokróm-c ( +0,25 Volt/mol) citokróm-a (+0,39 Volt/mol) NO 3 − (+0,42 Volt/mol ) Fe ++ (+0,76 Volt/mol) O 2 (+0,82 Volt/mol) — Az elektrontranszportlánc különbözőhelyein vas-kén fehérje is található, amelynek cisztein építőelemeihez kötődik a Fe 2 S 2 vagyFe 4 S 4 csoport. Oxidatív foszforiláció megy végbe a fototróf prokarióta belső membránjában is,ahol valamikor elindult az oxigénlégkör megteremtése vízből.AZ ELEKTRONTRANSZPORTLÁNCBAN SZEREPLŐ VEGYÜLETEKA ferhérje molekulák egymástól elektrokémiailag elszigetelten úsznak a flexibilis citoplazmamembránban. Az elektronok az elektronegativitás által irányítva törekednek az elektronakceptorfelé. Speciális esetben a proton és az elektron elválasztását katalitikus folyamat keretébenműküdő enzim végzi (ubiquinon reduktáz).Cytochrom b hem csoportCytochrom a hem csoportCytochrom c hem csoport142

Emlékeztetőül álljon itt a (ferredoxin-függő) reduktív citrátkört bemutató ábra, melynek jobbalsó sarkában a fényenergiára támaszkodó szén-dioxid megkötés szempontjából fontos ribulóz-1,5-biszfoszfátot hasznosító Calvin-ciklus vázlata található, amelyben az energiát az ATP, aredukáló erőt a NADPH szolgáltatja.Szén-dioxidot hasznosító, ferredoxin-függő reduktív citromsav ciklus és a glükoneogenezisacetát CITRÁTATPCoA-SH>ADPacetil-CoAFDH 2 NADP +ferredoxincisz-akonitátizocitrátdehidrogenázCO 2 FD NH 3 CO 2NADPHpiruvát >>>>>>>> (Alanin) (Glutamát) α-ketoglutarátNADP + NADPHFDferredoxin CO 2ATP CO 2 FDH 2szukcinil-CoAADPCoA-SH P iATPADPborostyánkősavP iflavinGDP CO 2 GTP reduktázPi flavin-H 2oxálecetsav L-almasav fumársavPEP foszfoenol-piruvát NADH NAD + H 2 O==========================================enoláz2-PG 2-foszfoglicerát (Asp) 3 CO 2 CALVIN ciklusmutázFÉNYENERGIA3-PG 3-foszfoglicerátATP >>>>> foszfoglicerát-kináz 6 3-PGADP

A MITOKONDRIUMA gombák energianyerő folyamatai (a redukált kofaktorok regenerálása) speciálissejtszervecskében, a mitokondriumban (kondrioszóma) folynak. Az Altmann által 1890-ben leírtsejtszervecskét Benda nevezte el mitokondriumnak 1898-ban. Warburg 1925-ben azonosította alégzőenzimet "Atmungsferment", Krebs pedig 1937-ben ismertette a citrát-kör ott működőenzimeit. A mitokondrumot méretéből következően fénymikroszkóppal látni lehet. BorisEphrussi 1949-ben fedezte fel azt, hogy az élesztő oxidatív foszforilációját sejtmagon kívül levőfaktor szabályozza. Lehninger bizonyította l950-ben, hogy a citrát-kör és a zsírsavak ß-oxidációja a mitokondriumban folyik. A mitokondriumban folyó önálló fehérjeszintézistMcLean igazolta 1958-ban. A mitokondriális DNS részletesebb jellemzésére azonban l966-igkellett várni, de csak a nyolcvanas években vált ismertté az élesztő-mitokondriumban találhatóDNS térképe. A mitokondriális DNS első szekvenálását Anderson végezte 1981-ben.Az élesztőben működő mitokondriális körkromoszóma térképeA gének exonjai=fekete szakasz.Citokrom b = CYTb. Citokrómoxidáz=COI,COII, COIIIA belső membeán prokaritajellegű Ez a kettős membránnalburkolt szervecske, saját DNS- ésRNS-készlettel, valamint sajátRNS-polimerázzal rendelkezve acitoplazmában helyezkedik el.A riboszómális fehérjeszintéziseis prokariótákra jellemző módongátolható. 27 féle tRNSA kőrkromoszómát alkotómitokondriális DNS (mtDNS) 5-7replikációs origóból indulva amagból származó enzim általkettőződik – a forgó kör modellszerint – függetlenül a magbanfolyó replikációtól.– A gombasejtössz-DNS tartalmának 5-15 %-atalálható a mitokondriumban. Amitokondriumok száma a fiziológiai igények függvényében változik.A mtDNS által kodoltgéneket hosszú AT gazdag intergenikus szakaszok választják el. A mag-eredetű, 145 kD méretűRNS-polimeráz működését, a transzkripciót 12-13 promoter szekvencia indítja. A 40 kD méretűspecifikus inditó fehérje (mitochondrial transcription factor) segíti a polimeráz megtapadását.Élesztő sejtben a citoplazmamembrán kozelében találhatókAz élesztő mitokondriumaiban működő, kettős spirál szerkezetű DNS — az eubaktériumokhozhasonlóan — szuperfeltekeredett állapotban, fehérjeburok nélkül található. A mérete aSaccharomyces cerevisiae esetében 60-70 ezer bázispár. Más gombáknál széles határok közöttváltozhat A Schizosaccharomyces pombe mitokondrium kromoszómája alig nagyobb mint azemlőssejt mitokondriumának DNS tartalma, amely mindössze 16500 bázispárt tartalmaz. Azeddigi ismereteink szerint a Torulopsis glabrata mitokondrális kroszómája mindössze 18,9 kb-ttaralmaz, az Agaricus bisporus kromoszóma mérete viszont 176 kb méretű.Különlegességük, hogy a mitokondriumban nem működik a "repair" rendszer. Ezért amitokondrium DNS-e sérülékeny. 3-5-ször gyakrabban mutál mint a magi-DNS. Az egyetlen144

gént érintő változást mit — mutációnak, a fehérjeszintézist érintő, például tRNS mutációt pedigsyn — mutációnak nevezzük. Ez nagyobb problémát nem okoz, mert több példányban létezvegyakorlatilag heteroplazmonként a gének a sejt számára mozaikos elrendeződésben működvefolyamatosan kielégítik a gazdasejt igényeit. Jelenlétük csak különleges tenyésztési körülményekközött igazolható. A szükségletnek megfelelően szaporodó több példányban előforduló szervecskékközül minden esetben az életképesebb mitokondrium hosszában megnyúlva osztódik éskerül az utódba. A folyamatosan szaporodó tenyészetben a szelekció következtében 20-30generáció után a heteroplazmon homoplazmonná nemesül a mutált DNS-t tartalmazómitokondrium hátrányos élettani helyzete miatt.SEJTSZERVECSKÉKA kloroplaszt az oxigénképzés mellett a sejt ATP ésNADPH ellátását biztosítja.A mitokondrium viszontNADH felhasználásával atoxikus oxigént redukáljavízzé, miközben az ATPellátást is biztosítja.A CITRÁT CIKLUS ÉS A GLIOXILÁT CIKLUS BIOKÉMIAI REAKCIÓIP-E-PADP-31,39 kJPEP-piruvát kináz (+FDP −citrát)karboxiláz ATP CoA-SHGDP TPP CO 2 NAD + NADHP i CO 2 PIRUVÁT Acetil-S-CoACO 2PEP CO 2 ATP piruvát dehidrogenáz ( −ATP )karboxi piruvát karboxiláz (+acetil-CoA)kinázGTP ADP citrát szintetáz ( −ATP )oxalát és OXÁLACETÁTacatátGlutamáttranszaminázα-ketoglutarátASZPARTÁTNAD(P)H >>>>>NADH CITRÁTmalic enzim almasav dehidogenáz − 28,046 kJ akonitát hidratáz(citoplazma)NAD(P) +

TCA(Szent Györgyi-Krebs)CIKLUS ÉS A GLIOXILÁT CIKLUS SZERVEZŐDÉSE1); citrát szintetáz ( -ATP )2); akonitát hidroláz3); izocitrát dehidrogenáz4); α-ketoglutarát dehidrogenáz komplex CoA-SH, GDP-GTP[szukcinil CoA szintház, glutamát dehidrogenáz, glutamát dekarboxiláz, etc.]5); szukcinát dehidrogenáz [FADH 2 ]6); fumaráz [fumársav + H 2 O = almasav]7); almasav dehidrogenáz [almasav NADH+H + --- NAD + oxálacetát]8); isocitrát liáz [glioxilát és szukcinát]9); malát szintetáz [glioxilát + acetil-CoA almasav]10); piruvát dehidrogenáz [acetil-S-CoA képződés]11); piruvát karboxikináz [oxálacetát utánpótlás]12); „malic” enzim [almasav képződés a citoplazmában!!]146

ATP szintetázA mátrixban felszaporodó redukáltfaktorok dehidrogénezésável (NADH),az oxidoreduktáz aktivitás szolgáltatja aprotont a mátrixba került toxikus oxigénredukálásáhozA mátrixban, a kettős membrán mögöttfolyik az eukarióta szervezet oxidatívenergiakonzerváló folyamata, az ATPszintézis.A belső membrán mögötttalálható matrixban végzi feladatát acitokróm-c, a citokróm b 2 és a citokrómc peroxidáz.Az itt működő enzimek génjeinek egyrészét a mitokondrális DNS hordozza.Más részüket a magi DNS tartalmazzaTzagoloff munkatársainak a vizsgálataiszerint a mitokondrium kromoszómájántaláljuk az oxidatív foszforiláció néhánygénjét, így a belső membránban működőcitokróm-oxidáz I, II, III alegységénekgénjeit.– Ettől eltérve a IV, V, VI, VIIalegység génjeit a magi kromoszómatartalmazza.147

A mitokondriumban működő elektrontranszportláncAz elektron áramlás iránya NADH.H + –tól UQH F feléElektronáramlás útja UQH 2 től Cytochrom c feléfeléfeléA cytochrom rendszer segíti a donorból származó e – célba jutását NADH-tól az oxigénig (H 2 O)A közben kialakuló membrán-potenciál, a protongrádiens ATPázt működtetve katalizálja azADP + P i >>ATP reakció keretében az ATP képződését. [ATP képzés – oxidatív foszforiláció]Az ATP formájában rendelkezésre álló energia: A bioszintetikus folyamatok energiaellátását,a DNS szintézist (replikáció), az RNS szintézist (transzkripció), a fehérjeszintézist (transzláció)és a poszt-transzlációs folyamatok energiaigényét elégíti ki148

Mitokondriális gén határozza meg az Apocitokróm b fehérje szerkezetét. A mtDNS hordozza ariboszóma nagy alegységének a 21 S rRNS génjét és a kis alegység 15 S rRNS információját. Akét alegység fehérjemolekuláinak szerkezetét magi DNS kódolja, kivéve az egyik mitokondriálisriboszómát alkotó fehérje (var-1) mtDNS-en kódolt génjét.A 10 alegységből álló ATPáz komplex 6-os és 8-as alegységének kódját is a mtDNStartalmazza. A többi alegység génjeit a magi DNS hordozza a 9-es alegység kivételével. A 9.alegység génjét ugyanis az élesztők esetében a mtDNS, az Aspergillus és a Neurosporatörzsekben viszont a magi DNS tartalmazza.A mtDNS kódolja a citromsavciklus génjeit, továbbá az összes mitokondriális tRNSszerkezetét. A húsznál több mitokondriális tRNS egyike a komplementer szálról íródik át. Azátírt tRNS 5' végi érését olyan RNáz segíti, amelynek RNS (9SRNS) tartalma mitokondriáliseredetű (RPM1), az enzim fehérje alkotórésze viszont magi eredetű. A belső matrixbanműködik a karbamoil foszfát szintetáz, a citrát szintetáz és a citrát-kör enzimei, az ornitintranskarbamoiláz, az RNS-polimeráz, a mangán-szuperoxid-dizmutáz és az F 1 -ATPázα,β,γ alegységei, de itt folyik a riboszomális fehérjeszintézis is. A belső membrához kötődik acitokróm c 1 , a citokróm b/c 1 komplexnek a V. alegysége, a citokróm c oxidáz IV,V,VI,VIIalegységei, az F 0 -ATPáz proteolipid lánca. Fontos szerepet tölt be az ADP-ATPtranszportfehérje. A külső membránban transzportot segítő porin fehérjék működnek.Az elektrontranszportlánc (citokróm rendszer) elhelyezkedése a mitokondriumbanA mitokondriumban a sűrű membránszerkezet miatt különleges körülmények uralkodnak. Afehérjekoncentráció (500 mg/ml) miatt az enzimek szinte kristályos állapotban működnek. Azenzimek közötti kölcsönhatás szupramolekuláris szerveződést tesz lehetővé. Az enzimreakcióterméke közvetlenül a továbbalakító enzim aktív központjába kerül (channeling). Ez a szoros illeszkedésa molekulák orientációját egyértelműen meghatározza, például a szukcinil-CoA >>> almasav átalakulás közben. Szerveződési kapcsolatba kerül a citrát-kör, a zsírsavoxidáció,a cianid-érzékeny légzési lánc enzimrendszere, valamint a szalicil-hidroxamáttal gátolhatócianidrezisztens légzőrendszer alkotórészei..NADH ox. < (cianidddal gátolható)flavin e e – oxidatív foszforiláció e – 1 / 2 O 2enzim e –NAD + < > red e–alternatív légzés>H 2 O(cianid-rezisztens szalicilhidroxamáttal gátolható)Az elektron útja az oxigénhezA mitokondrális gének sérülése ezt a szoros kölcsönhatást, az anyagcsere szerveződését zavarja.A mitokondriumok közötti verseny azonban a hibák eliminálását segíti.149

A MITOKONDRIUM MŰKÖDÉSI VÁZLATANAD + HS-CoA NADH FAD FADH 2ZsírsavO O HS-CoA (TPP) CO 2 ------------------------>CO 2Piruvát H 3 C-C-C-OH acetil-S-CoANAD + NADHAsp Asp---------------------------glicerin-Parginin-ciklus NAD + OAA ----------------------dioxi aceton-Palmasav-------------------almasavNADH--------------->NADH citromsav-ciklus GDPH + e Pil 3 NADH GTPeFADkt FADH 2r CO 2 ----------------------------------------------------->CO 2o NAD +nH + t mitokondriális kromoszómara FADH 2nDNS-szintézisszp FAD RNS-szintézisH + o fehérjeszintézisrmitokondriális riboszómatCN - és CO érzékeny légzésCN - rezisztens légző rendszer2 e − 2 H +1 / 2 O 2 -------------> 1 / 2 O 2 --->H 2 OH + H +P i -----------------------> P i ATPADP--------------------> ADPATP

A laktóz bontó aktivitás megjelenése a laktóz induktív hatásának és a katabolikusrepresszió felfüggesztésének köszönhető. Ez esetben az érdekelt enzimek struktúrgénje előttelhelyezkedő lac1 génről készült mRNS a CAP (catabolit repressor proteine) képződésétsegíti elő. Ez a fehérje a promoter mellett levő kapcsolódási ponthoz rögzülve akadályozza aRNS polimeráz indulását. A hozzákötődő cAMP hatására viszont segíti a transzlációsfolyamatot.— A promóterhelyhez kötődő RNS polimeráz indulását a lac1 génen kodoltrepresszor fehérje (L) akadályozza. Ez a fehérje-komplex a laktózból készült allolaktózzalkiegészülve szétesik, elhagyja a DNS láncot, és ezzel lehetőséget ad a cAMP által aktiváltCAP tevékenységének kifejtésére. Az RNS polimeráz megkezdi a struktúr-gének átírását, azmRNS szintézisét. —A képződő β-galaktozidáz a permeáz által felvett laktóz hidrolízisére képes.A citoplazmából a laktóz kiáramlása végbemehet aspecifikusan, diffúzió útján a membránpórusain keresztül, de végbemehet a szerkezeti hasonlóság alapján bizonyos homológ vagyheterológ transzport- rendszerek igénybevételével is.151

Példaként hasonlítsuk össze a ß-galaktozid transzportmechanizmus jellemző adatait.Tiometilgalaktozid Tiodigalaktozid Tiofenilgalaktozid laktózK M (mol.liter -1 ) 5 x 10 -4 2 x 10 -5 2,5 x 10 -4 7 x 10 -5V max in(µmol.g -1 perc -1 ) 148 20,4 86 158K ex 0,82 0,59 2,7 -Maximális C in /C ex 65 400 26 1950Ez a galaktozid-permeáz laktózt tartalmazó táptalajon növekedő Escherichia coli-ban képződik,mégpedig koordináltan a laktózt bontó ß-galaktozidázzal és egy transzacetilázzal együtt. Ahárom fehérje képződése nem csak laktózzal (valójában allo-laktóz), hanem más, nemhidrolizálható galaktoziddal – például metil-ß-tiogalaktoziddal – is serkenthető. Ennek hatásáraa transzportmechanizmusban résztvevő fehérjék mennyisége jelentős mértékben fokozódhat.Egyedüli szénforrásként laktózt tartalmazó táptalajon az aktív centrumban szabad SHcsoportokattartalmazó, 30 kDa méretű, ß-galaktozidot kötő fehérje mennyisége az alapszintről(sejtenként 8-10 permeáz) akár ezerszeresére is nőhet. Az ilyen körülmények között növekedősejtek membránjában kb. 8000 permeáz található; ez a sejt összfehérje tartalmának 0,35 %-a. Eza fehérje a membránból detergens kezeléssel kinyerhető, majd a membránból kimozdítottfehérjék elegyéből kromatografálással lehet tisztítani.{Negyedszázaddal ezelőtt az irodalmi adatok szerint a ß-galaktozid permeáz előállításakoréppen ezt a jelenséget, a fehérje ß-galaktozidot kötő képességét és a kötés specifitását hasznosították.Első lépésként nagy mennyiségű ß-galaktozid jelenlétében a membránból kimozdítottfehérjék szulfhidril csoportjait N-etil-maleinimiddel inaktíválták. A ß-galaktozid permeáz aktívcentrumában levő SH-csoportokat az oda kötődő galaktozid molekula megvédte. Ezt követőlegfelszabadították a transzportfehérje aktív központját galaktozidmentes körülmények között. Aszabaddá vált SH-csoportokat izotóppal jelölt N-etil-maleinimiddel inaktiválták. Ezzel aművelettel sikerült specifikusan jelölni a galaktozidot kötő fehérjét, ami megkönnyítette akromatografálással való tisztítását és homogén formában való előállítását.}152

A SZÉNHIDRÁTLEBONTÁS ALTERNATÍV ÚTJAI A MIKROVILÁGBANAz egyes reakció utak aktivitása a mikroorganizmusokban fajok szerint is eltérő lehet, de anövekedés különböző szakaszaiban is az igényeknek megfelelően, eltérő hatásfokkal működhetnek.A tápközeg szénforrásából az anyagcsere úttól függő mértékben tudja a mikroszervezet anövekedéséhez szükséges energiát felszabadítani. Az Escherichia coli glükóz-limitált folytonostenyészete 10,3 g sejt képződésére képes 1 mol ATP terhére, a Lactobacillus casei esetében ezaz érték 24,3 g. A növekedési szakasz nagyobb pentózigénye az előző fejezetben említettpentóz-foszfát ciklus, a HMP-út fokozott működését igényli; a lassuló szakaszban viszontelőtérbe kerül a glikolízis, az EMP-útA felfedezőiről Embden-Meyerhof-Parnas útnak nevezett, fruktóz-biszfoszfátonkeresztül vezető, több mint tíz enzim egymást követő működését igénylő reakciósor aerob ésanaerob körülmények között is alkalmas energianyerésre szubsztrát szintű foszforilációval (ATPnyerésre). A citromsavat termelő Aspergillus niger-ben a növekedési szakaszban az EMP:HMPút aránya 1:1, ami a citromsavtermelő szakaszban 8:2 -re módosul.A kiindulási vegyületként szereplő fruktóz-6-foszfát (F6P) a G-6-P-ból képződik egyizomeráz hatására. Ez a reverzibilisen működő enzim a glükózszintézisben szerepel. A G6P/F6Pegyensúlyi elegyben a reakció 7:3 arányban a G-6-P irányában tolódva a glükóz reszintézisénekkedvez. A következő reakciólépés, amelyet a fruktózfoszfát-kináz katalizál, a nagy szabadenergiacsökkenés miatt (14,6 kJ) irreverzibilis. Az enzim aktivitását alloszterikusan gátolja a citrát, azATP és a NADH. Az ADP viszont alloszterikusan serkenti az enzim működését. Jól látható,hogy az ATP-hiány végeredményben serkent egy reakciót, amely maga ugyan ATP-t emészt, deelindít egy olyan folyamatot, amelyik bőséges ATP-képződést eredményezhet. Az ATPfelhasználásával képződött fruktóz-1,6-biszfoszfát (F-1,6-P 2 ) az aldoláz hatására kéttriózfoszfátra bomlik. A két reakciótermék a glicerinaldehid-foszfát (GAP) és a dihidroxiacetonfoszfát(DHAP) közötti átalakulást a triózfoszfát-izomeráz katalizálja, mégpedig jelentősmértékben a DHAP irányában eltólva az arányokat.FDP : GAP : DHAP = 89 : 0,5 : 10,5Ez az arány felhívja a figyelmünket arra, hogy valójában ezek az enzimek elsősorban a glükózszintézisben érdekeltek. A triózfoszfát képződés adott esetben a foszfolipid-szintézis glicerinfoszfátigényét elégíti ki. Fontosabb azonban a reverzibilisen működő, anaerob körülményekközött is működőképes glikolitikus út táplálása.A HEXÓZBONTÓ UTAK AKTIVITÁSA A MIKROSZERVEZETEKBEN (%-BAN)Mikroorganizmus EMP-út HMP-út KDPG-útCandida utilis8020Streptomyces griseus 97 3Penicillium chrysogenum 77 23Escherichia coli 72 28Bacillus subtilis 74 26Pseudomonas aeruginosa 29 71Acetomonas suboxydans 100Pseudomonas saccharophila 100Hydrogenomonas sp. 100Zymomonas mobilis 100153

A ketodezoxi-foszfoglükonsav út (KDPG), látszólag a HMP-útból ágazik ki.EMP-út vázlatahexokinázizomerázF6P-kinázaldolázGLÜKÓZATP >>>>>ADP >NADH

A foszfoketoláz út (PK) a pentózfoszfát útból ered. Egyes baktériumfajok (a heterofermentálótejsavbaktériumok) képtelenek a F-1,6-P 2 aldolízisére. Bizonyos enzimek (aldoláz,transzketoláz, transzaldoláz) hiánya esetében a túlélés lehetőségét jelenti a képességük, hogy axilulóz-5-foszfátot egy anorganikus foszfát felvételével acetil-foszfátra és GAP-ra hasítják. Azacetil-foszfátban megőrzött energia hidrolitikus folyamatban ATP képződéséhez vezet.Anaerob közegben az acetil-foszfát etanollá redukálódhat két NADH visszaoxidálását biztosítva.GLÜKÓZ>ADPglükóz-6-foszfát>NADPH6-foszfo-glükonátATPfoszfoglicerát-kináz>NAD +glicerinsav-2-foszfát (2PG)acetaldehidenoláz> NAD +tejsav-dehidrogenázETANOL>>>>>>>NAD +TEJSAVA szénhidrát-anyagcsere utak köztitermékeként megjelenő triózfoszfát (GAP) ugyanisenergiaforrásként szerepel. A GAP foszfoenol-piroszőlősavon (P-E-P) keresztül vezető reakcióútondehidrogéneződik, miközben szubsztrát szintű foszforilációval képes kielégíteni amikroba energiaigényét. A GAP >>> piroszőlősav átalakulás két ATP képződését segíti. A155

glikolitikus út működése azonban csak a GAP dehidrogénezése közben képződő redukáltkofaktor (NADH) visszaoxidálása esetén zavartalan, elmaradása leállítja az energianyerőfolyamatot, leállítja az anyagcserét, leáll a mikroba növekedése.Számos példát találunk a mikroszervezetekben az anaerob légzésnek nevezett kofaktorregenerálásifolyamat működésére. Elektronakceptorként szerepelhet anaerob körülményekközött a nitrát, illetve a szulfát, de elektronakceptorként szepelhet valamilyen redukálhatófémion, például a három-értékű vas, vagy a hidrogénion. Ilyen esetben a környezetben fellelhetőelektronakceptorként szereplő vegyületekre kerül az elektron. Az Escherichia coli esetében azelektron citokróm-b közvetítésével a nitrát-reduktázra, vagy a citokróm-c közvetítésével aszulfátredukáló rendszerbe kerül.SO 4 2– szulfát-ion + 8 elektron (8e – )>>>NO 3 – nitrát-ion + 2 elektron (2e – )>>>Fe +++ ferri-ion + elektron (e – )>>>>2 proton (2H + ) + 2 elektron (2e – ) >>>Szulfid-ion + 4 vízNO – 2 Nitrit-ion + vízFe ++ Ferro-ionH 2 H:H Hidrogén gázS 2–Ez utóbbi esetekben az akceptorra jutó elektronok száma lényegesen kevesebb, mint az oxigénthasznosító légzésnél. Ez a mikroba lassú növekedésében is észlelhető. A fermentációra képestörzseknél anaerob körülmények között a szubsztrátszintű foszforiláció biztosítja azenergiaellátást, az ATP képződését. Az endergonikus reakciók folyamán (pozitív szabadenergiaváltozás)közvetlenül ATP képződik, ami azonnal felhasználódik egy újabb lebontásra váróvegyület képződéséhez. A közben képződő redukált nukleotidok bizonyos bioszintetikusfolyamatokhoz használódnak fel. Anaerob körülmények között a kofaktorok regenerálásárakülönböző fermentációs folyamatok alakultak ki, amelyek közös jellemzője, hogy mindegyik apiroszőlősav továbbalakításával oldja meg ezt a feladatot.Clostridium-ok fermentlevébenEnterobacter-ek fermentlevébenEscherichia nemzetségLactobacillus-ok fermentálásakorPropionibacterium-ok hatásáraÉlesztők fermentációs termékekéntTejsav, butanol, izopropanol, aceton képződikEtanol,butándiol,hangyasav, tejsav, hidrogén képződikBorostyánkősav, etanol, tejsav, ecetsav képződikPiruvát redukciójával tejsav képződikPropionsav, ecetsav, hidrogén fejlődikSzén-dioxiddal equivalens mennyiségű etanol fejlődikE fermentációs folyamatok közös jellemzője, hogy az akceptorként szereplő vegyületek atenyészközegben felszaporodva, végül is toxikus hatást (például alkoholmérgezés) fejtenek ki amikroszervezetre, azaz a folyamat leállásával kell számolnunk.Ezek az enzimek, amint látható, a katabolikus folyamat megfelelő enzimeivel minikörfolyamatot képezve, a sejt belső energiakészletétől függően a szubsztrátum gyorsvisszanyerését teszik lehetővé, majd az alloszterikus szabályozási mechanizmussal kiegészülve alehető leggazdaságosabb élettani viszonyokat alakítják ki a mikroszervezetben.Anaerob körülmények között a fermentációra (erjesztésre) képes mikroorganizmusokanyagcseretermékeik redukálásával, sejten belül igyekeznek a redukált kofaktorok regenerálásátmegoldani. Így jelenhet meg primer termékként az etanol, a tejsav, az aceton, a butanol, apropionsav, a vajsav, az izopropanol. A termékek sejten belüli felhalmozódása zavart okozna azanyagcserében, de zavart okoz a belső tér savanyodása is, mert a szubsztrátum dehidrogénezésekora redukált pridin-nukleotid képződés minden esetben egy-egy proton megjelenésével jár. Aproton eltávolítása életfontosságú. A rövid szénláncú savak - így a tejsav is - nem disszociált156

formában zavartalanul halad át a membránon, miközben elősegíti a proton távozását a külsőtérbe. Ebből következik, hogy a savanyú termék, ez esetben a tejsav eltávolítása a reakciótérbőljavítja a mikroba életfeltételeit. A membránon átkerült tejsav, a külső híg oldatban disszociálva,kedvez a protongrádiens kialakulásának.100 mM GLÜKÓZBÓL KÉPZŐDŐ FERMENTÁCIÓS TERMÉK mM-ban *Élesztő E.coli Propionibacterium. Butyrobacterium. C.butylicum C.acetobutylicumVajsav 0,21 29,0 17,2 4,3Laktát 1,37 79,5 107,0Acxetát 15,1 36,5 10,0 88,0 17,2 14,2Formiát 0,49 2,43Szukcinát 0,68 10,7 7,8Butanol 58,6 56,0Etanol 129,9 49,8 7,2Aceton 22,4Izopropanol 12,1szén-dioxid 148,5 88,0 63,6 48,0 203,5 221,0Hidrogén 75,0 74,0 77,6 135,0Butándiol 0,68 0,3Glicerin 32,3 1,42Propionát 148,0 6,4*Részletesebb adatok találhatók az egyes baktériumokkal foglalkozó fejezetekbem157

OBLIGÁT ANAEROB BACILLUSOK BIOLÓGIÁJAA magasabb rendűekben gázgangrénát okozó Clostridium fajok számára a légköri oxigéntoxikus, mivel a flavin enzimrendszerük oxigén jelenlétében működve peroxidot képez, amitnem képesek elbontani. A Clostridium fajokban ugyanis nem működik a citokróm-rendszerelektrontranszportlánca, továbbá a kataláz, és a peroxidáz. Az antibiotikum korszak előtt agázgangrénás folyamatok sebészi megoldása után a számukra toxikus oxigéntúlnyomás hatásátelőnyösen használták az anaerob baktériumok elpusztítására. Elsősorban a bélcsatornában,trágyában élnek. Aerob körülmények közé kerülve endogén spórát fejlesztenek. A spóra ugyaniselviseli az oxigén jelenlététét, csírázni azonban csak anaerob körülmények között képesGyakran találkozhatunk Clostridium fajokkal látszólag aerob körülmények között is, mégpedigProteus fajokkal kevert tenyészetben. Ez utóbbi aerob baktérium olyan intenzíven fogyasztja azoxigént, hogy a környezetében gyakorlatilag oxigén mentes körülményeket teremt.A Clostridium perfringens rövid, vaskos, csilló nélküli, tokos pálcika. Egyedül vagy kettesévelfordul elő. Cukrokból jellegzetes bűzös gázt termel. Penicillinre érzékeny. Patogenitását atoxinok okozzák és a környezetébe kiválasztott enzimek fokozzák. A nekrotizáló és hemolizálótoxinokon kívül foszfatázt, proteázt, kollagenázt, hialuronidázt, dezoxiribonukleázt és egyadenilcikláz aktivitást fokozó enterotoxint is termel. Ez utóbbi az ileumban és a jejunumbanhasmenéssel járó bélgyulladást okoz.A Clostridium septicum karcsú, csillós bacillus. Jellegzetes, vajsav szagú gáztermeléséről lehetfelismerni.A Clostridium botulinum 4-8 csillóval mozgó, karcsú, spórásodó pálcika. A név a főveszélyforrásra, a kolbászra (botulus) utal. Talajban, tófenéken, állatok belében fordul elő.Spórái feltűnően ellenállóak. Szénhidrátból avas szagú gázt fermentál. Az előforduló hat típusközül csak három (A, B, E típus) okoz tragikus kimenetelű megbetegedést. A felnőtt szervezetbekerülő 1 µg toxin már halálos adag, amely általában 18-30 óra között légzés bénulást okoz.(Csak a trivalens antitoxin intravénás adásától lehet segítséget remélni.) A bekötődött toxinugyanis már nem távolítható el a szinapszisokból. Fő veszélyforrás a nyers kolbász, amelyben abacillus elszaporodva felhalmozza a halálos toxint. Egyébként 10 perc főzéssel a toxininaktiválható.A Clostridium tetani, apró (0,4 x 2,5 µm) peritrich csillós pálcika. Obligát anaerob bacilluskéntfőleg a lovak bélcsatornájában él. Onnan kikerülve endospórát képez, és így várja a talajban acsírázás lehetőségét. Erre alkalmas például egy melegvérű lény mélyebb testszövete, ahova nyíltseben keresztül juthat be. A felületi sérülés látszólagos gyógyulása után, a mélyebb rétegbenmeghúzódó spóra kicsírázik és a vegetatív sejt hemolizint, fibrinolizint és egy hőlabiliskolineszteráz gátlót termelve szaporodni kezd. Ez utóbbi fehérje hatására felszaporodó acetilkolinhalálos következményekkel jár (merevgörcs okozta légzésbénulás). Ezt megelőzendő;mélyebbre terjedő sérülés esetén antitestet tartalmazó szérummal oltják a sebesültet. Fertőződésesetén a góc sebészi eltávolítása, oxigén túlnyomás és penicillin kezelés lehet hatásos. Atetanusz toxoiddal aktív immunizálás végezhető, ami tizenöt évig hatásos védelmet jelent afertőződés ellen.158

Clostridiumok ipari hasznosíthatóságaA triviálisan vajsavas baktériumnak nevezett Clostridium fajok már Pasteur figyelmét isfelkeltették, de a szénhidrátból képződő redukált termékek iránt a fejlődő vegyipar is érdeklődéstmutatott. A századforduló körül a háborúra készülő nagyhatalmak szerves vegyiparialapanyagigénye (robbanószergyártás) gyorsította a nagyipari technológia kifejlesztését.Clostridiumok fermentációs aktivitása és a Stickland-reakcióSZÉNHIDRÁT FEHÉRJE>> R-CH-COOH H 3 C-COOH GLUTAMÁTNH 2NADH------->----->NH 3NH 3 NH 3R-C-COOHEMP-út O mezakonátH 3 C-COOHHS-CoA------------- NH 3R-C-S-CoA H 2 C-COOH citramalátO H 2 OR-C-O-P-O 3 H 2O ATPR-COOHPIRUVÁT______________TPPacetátCoA-SH CO 2 CoA-SHacetaldehid acetil-CoA / acetil-fostfátNADH----> NAD + NADHNAD + ------>CoA-SH PiETANOLacetoacetil-CoAacetecetsavNADH------->dekarboxilázNAD + CO 2ß-hidroxibutiril-CoAACETONH 2 ONAD + NAD + NAD +

folyamatait összekapcsolva (Stickland-reakció 1934) a megfelelő savakon kívül ammónia isképződik.A Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) talajban élő, peritrich ostoros (0,8 x 4 µm) pálcika,amely a légköri nitrogén megkötésére is képes. Ipari eljárásban aceton és butanol előállításárahasználják. A butanol, mint membránkárosító oldószer limitálja az elérhető koncentrációt; 2 %felett már toxikus tünetek jelentkeznek.A fermentációs eljárás közben először a megfelelő sav képződik, ami a fermentáció másodikszakszában, a sejtek növekedése nélkül redukálódik alkohollá. A reakcióelegyhez adott kálciumkarbonáthatására ez az átalakulás nem következik be, felszaporodik a vajsav és az ecetsavkálciumsója.Kétnapos fermentáció termékösszetétele (mg / liter koncentráció):CaCO 3 nélkül CaCO 3 jelenlétébenVajsavbutanolecetsavetanolaceton32,2411,5102,144,5222,3630,045,7230,722,413,2Az ipari gyakorlatba vett törzsből céltudatos szelekcióval nyert Clostridium butylicum butanol ésizopropanol előállítására használható. Az elkülönített Clostridium butyricum stabil variáns pedigvajsav- és ecetsav képzésére alkalmas.160

ANYAGFELVÉTELA membrán transzportfolyamataiA mikroszervezet a környezetében előforduló C-H-O-N-P-S atomokat használva és a környezetenergia készletével gazdálkodva sikeresen küzd az életbenmaradásért. Az élő sejt belső terét akörnyezettől a citoplazmamembrán választja el, miközben az életműködéshez szükségesanyagok is a membránon keresztül juthatnak a sejtbe. Az anyagcsere végtermékei, esetenként atúltermelődő köztes vagy melléktermékek - az úgynevezett primer és szekunderanyagcseretermékek - ugyancsak a membránon keresztül kerülnek a környezetbe.A környezetben előforduló és tápanyagként hasznosítható polimerek, óriásmolekulák általábancsak építőelemeikre hidrolizálva juthatnak a sejtbe; kivételt képez a kettős szálú DNS, amelyrészleteiben felderítetlen módon a sejt belsejébe kerülve bizonyos genetikai információk átvitelétteszi lehetővé. A citoplazmamembrán régebben ismeretlen permeábilitási viszonyai nem egyszertéves nézetek kialakulásának és elterjedésének kedveztek. A baktériumot egy enzimekkel töltött,félig áteresztő hártyából készült zsáknak tekintették, amelyben bizonyos enzimek a sejten belülikoncentrációviszonyok miatt nem működhetnek. A "kryptic enzyme" is ide sorolható.Ezzel az elnevezéssel illették például a citromsavat hasznosító enzimrendszert, amelynekműködését ép sejtben nem, csak sejtmentes kivonatban lehetett észlelni. A glükóz jelenlétébennövekedő Bacillus subtilis például nem hasznosítja a tenyészethez adott citrátot, de ha a mikrobaelőzőleg citráton, mint egyedüli szénforráson növekedett, akkor jól metabolizálja azt. A kéttenyészetből nyert sejtmentes kivonat viszont egyformán bontja a citromsavat, ami nemmeglepő, hiszen a citrátkör működőképessége létfontosságú minden szervezet számára. Azeltérést az okozza, hogy a citrát felvételét egy citráttal indukálható, glükózzal represszálhatótranszportmechanizmus teszi lehetővé. Ugyancsak indukálható mechanizmusok szükségesek alaktóz (lásd később részletezve), az arabinóz, a cukorfoszfátok és még sok más vegyületfelvételéhez.A transzportmechanizmusokat két nagy csoportra oszthatjuk:aktív folyamatokra, amelyek a koncentrációgrádienssel szemben is működőképesekés a koncentrációkülönbségtől függő passzív folyamatokra.A két folyamat egyidejű jelenlétével is találkozhatunk. —Passzív transzport esetében energia felhasználása nélkül, az anyag felvétele akoncentrációviszonyoknak megfelelően, a magasabb koncentráció felől az alacsonyabbkoncentráció irányába folyik. Kis molekulák (alkohol, glicerin, acetát, rövid savak) nemdisszociált alakban könnyen átjutnak a membránon különleges hordozó-fehérje segítsége nélkülis. A fermentációs folyamatban képződő savak nem disszociált formában a sejten belülmegjelenő proton kiszállításában fontos szerepet játszanak. —Elősegített transzport esetén már valamilyen hordozó fehérje (karrier fehérje) segíti bizonyosvegyületek szelektív áthaladását a membránon. Két típusát különböztetjük meg ezeknek afehérjéknek. Az egyik bizonyos csatorna kialakításával, a másik viszont mechanikus mozgásávalszállítja a szubsztrátumot a koncentrációgrádiensnek megfelelően a membrán másik oldalára. Ezutóbbi esetben a karrier fehérje tercier szerkezetében a szállítandó molekulának a bekötődéseolyan változást okoz, amely elősegíti, gyorsítja a transzportfolyamatot.Az aktív transzportesetében valamilyen koncentrációgrádiens ellenében folyik az anyagátvitel. A transzportfolyamat, az ozmotikus munka elvégzése ez esetben kémiai energia befektetését igényli.161

Az anyagátvitel elősegítésére szolgáló fehérjék nagy változatosságot mutatnak. Többségükgenetikai adottságként állandó mennyiségben van jelen a membránban, mások viszont azéletviszonyok függvényében az igényeknek megfelelően képződnek. A membrán fizikaiállapota, a hőmérséklet csökkenésével járó merevedése eltérő módon hat a transzportfehérjékre.A csatorna jellegű karrier fehérje szállítóképessége nem érzékeny a környezet hőmérsékletének aváltozására. A mozgékony hordozó működését viszont jelentős mértékben befolyásolja a membránflexibilitásának a változása.AKTÍV TRANSZPORT HORDOZÓ FEHÉRJÉVEL energia terhéreKülső tér O=== ===O O=== ===O O=== ===O O=== ===O O=== ===O Belső térO=== ===O O=== ===O O=== ===O O=== ===O O=== ===O> O O O |T i )inaktív permeáz) az előzőleg megkötött (permeáló) vegyület kötődését befolyásolva, a molekulaleválását okozza. A kötő fehérje (T ) nem lép kovalens kapcsolatba a permeáló vegyülettel (S),csupán laza asszociátumot (T-S töltött permeáz) képez vele.Az aktív transzportfolyamat működési vázlata.k ü l s ő t é r / …citoplazmamembrán… \ b e l s ő t é r\ ………………………… /T-S-----------------------> T-S/…………………………..\S----------> \………………………… / ------------>-S/…………………………. \\…………………………. /T

anyagkiáramlás gyakorlatilag nem következik be. — A felvétel (influx) sebessége (V in ) apermeáló vegyület környezetben mért koncentrációjától (C ex ) függően változik.maxV in • C exV in = -----------------K m + C exAz egyenletben szereplő K m az enzimek Michaelis-állandójához hasonlóan azt a szubsztrátumkoncentrációt jelenti, amely a maximális felvételi sebesség felét eredményezi. A V maxin apermeáló anyag telítési koncentrációjánál mért felvételi sebesség. A tényleges felvétel egyenlő afelvétel és a kiáramlás (efflux) különbségével. Az efflux, a kiáramlás sebessége függ a kérdésesvegyület (C in ) sejten belüli koncentrációjától; a K ex a kilépési sebességi állandó. A ténylegesnettó felvétel tehátmax∆ C in V in . C exA kiáramlás végbemehet aspecifikusan, diffúzió útján a membrán pórusain keresztül, devégbemehet a szerkezeti hasonlóság alapján bizonyos homológ vagy heterológ transzportrendszerekigénybevételével is.IONOK FELVÉTELEA magnézium-, kálium- és foszfátionok a sejten belül viszonylag magas koncentrációbanvannak jelen annak ellenére, hogy ezek az ionok a környezetben kis mennyiségben fordulnakelő. Elektromos töltésű, hidrátburokkal körülvett ionok szállítását a hidrofób membránonkeresztül speciális transzfermechanizmusok segítik. Az egyik elterjedt típus kémiaiszerkezetéből adódóan ioncsatornát képez a membránon keresztül. A csatornaképzőtranszfervegyületek hatékonyabbak, mert a hőmérsékletsem befolyásolja a működésüket.A másik típus viszont elmozdulva a membránban,formálisan átszállítja az iont a membrán egyikoldaláról a másikra. A hordozó típusú transzferázokteljesítőképessége a membrán fluiditására érzékeny.A hőmérséklet csökkenésével megmerevedő hidrofóbrétegben ugyanis nem képes mozogni a hordozófehérjemolekula. Ezeknek a kifelé lipofilmolekuláknak a belsejében hidrofil fészek található.A fészekbe nyúló oxigénatomok koordinatív kötéstlétesíthetnek az ionnal. Szelektivitásukat az ionfészekmérete adja. A kálium ionrádiusza 0,134 nm, anátriumé viszont csak 0,095 nm; ennek ellenére,mivel a nátrium sokkal erősebben köti a vizet, mint akálium, a kialakuló hidrátburok mérete miatt anátrium nem fér el ott, ahol a vizet gyengén kötőkáliumion még elfér. Normál esetben a káliumfelvételnem függ a környezet káliumszintjétől. Ezért lehet aszferoplasztok stabilizálására kálium-kloridothasználni szacharóz helyett. Ismeretesek azonbanolyan mutánsok, amelyek magas ionkoncentrációtigényelnek a növekedésükhöz, a belső káliumszintfenntartásához. Ezek saját erőből ugyanis nem képesekmegtartani az életműködés igényelte magas belsőkáliumszintet. Káliumtranszport szabályozó mechanizmusa (Streptomyces lividans)-ban163

A VAS FELVÉTELének elősegítésére külön vegyületcsoport működik a mikrovilágban, ezek asziderokrómok. A vas az élő szervezetben az életfontosságú elektronáramlásban játszott szerepemiatt nélkülözhetetlen fémion. Nem véletlen, hogy a vas felvételére speciális mechanizmusalakult ki az élővilágban. Az élet megjelenését követően a redukáló körülmények között nemjelentett nagyobb problémát az őstenger vizében bőségesen előforduló ferro-ionok felvétele.Alig egy milliárd év elteltével azonban megjelentek a fényenergiát hasznosító cianobaktériumokés tevékenységük eredményeként a redukáló környezetben megjelent az oxigén. Néhányszázmillió év alatt a képződő oxigén a tenger vizében oldott ferro-ionokat eloxidálta, és aképződő ferri-hidroxid igen gyenge vízoldhatósága miatt vastag üledékként a tenger fenekérekerült. A túlélés előfeltételeként ezért olyan vegyületek jelentek meg, amelyek ilyenkörülmények között is biztosítani tudták a szükséges vasmennyiség begyüjtését.Elvileg a citromsav erre a célra alkalmas kelátképző vegyület lenne, de a vas-citrátközvetítésével folyó felvétel általában nem elégíti ki a mikroba igényeit.R −−− N −−− C −−− R| | |OH OFe +++= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = citoplazmamembránR −−− N −−− C −−− R| | |O O\ /Fe +++−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Fe ++Az Escherichia coli külső membránjában ferricitrát receptorokat, a belső membránban pedigferricitrát permeáz működését igazolták a vizsgálatok.164

A gombákban és a baktériumokban legelterjedtebb karrierként a ferrikróm, egy ferrihidroxamát-hexapeptidfordul elő, amely gyűrűs szerkezetéből következően könnyen szállítja avasionokat a hidrofób membránban. A transzport reakcióval a citoplazmába került ferrihidroxamáta belső redukáló környezetben ferro iont enged elCH 3 CH 3| |C=OC=O| |N--O....... O–N| |CH 2 CH 2| |CH 2 CH 2| |CH 2 CH 2| |CH–CO–NH–CH 2 –CO–NH–CH| |N-HC=O| Fe III |C=ON–-H| |CH 2 –NH–CO–CH–NH–CO–CH 2|CH 2|CH 2CH 2|N–––––O|C=OFERRIKRÓM |CH 3|Az evolúció során a mikrovilágban olyan speciális vasfelvételre szolgáló polimerek képződtek,amelyek a környezet vastartalmának a csökkenése esetén egyre nagyobb mennyiségbenképződve látják el élettani szempontból nélkülözhetetlen feladatukat. Más baktériumoknálhasonló feladatot lát el egy katechol származék, az enterobaktin a Salmonella genusban; azaerobaktin az Aerobacterium nemzetségben, vagy a Mycobacterium-okban előfordulómikobaktin. —A vasfelvétel élettani jelentőségére utal, hogy vasmegkötő kelátképzőkkel, hidroxikinolinokkal,illetve működésképtelen sziderokróm analógoknak tekinthető antibiotikumokkal a bakteriálisfertőzések leküzdhetők.165

NITROGÉN-ANYAGCSERE A MIKROVILÁGBANNitrogén az élő szervezet számára nélkülözhetetlen, biogén elem. Szerves kötésben - az élőszervezet építőelemeként - a fehérjékben, nukleotidokban és a nukleinsavakban található. Afehérje tömegének 10-15 %-át teszi ki. Az élő és élettelen világ közötti szüntelen körforgását amikrovilág katalizálja. Legnagyobb mennyiségben a légkör kevéssé reakcióképes alkotóelemeként,színtelen, szagtalan gázként fordul elő. (Megjegyzendő: a hármas kötés (:N:::N:)disszociációs energiája 940 kJ, míg az oxigén disszociációs energiája csak 493 kJ !)Kisebb mennyiségben a légkörben abiogén eredetű vegyületei (NO, N 2 O, NH 3 ) ismegtalálhatók. Az élettelen környezetben anionként főleg nitrát, kationként pedig ammóniumsóformájában fordul elő. A növényvilág és a mikrovilág a nitrogént általában mindkét sóformájában, kationként és anionként is fel tudja venni. Ezen túlmenően a mikroorganizmusoka légköri nitrogén megkötésére is képesek és ezzel a tevékenységükkel a földfelszínenévmilliárdokkal ezelőtt az élet lehetőségét teremtették meg. Századunkban az emberiség aműtrágyagyártás megindításával beavatkozott a természet évmilliárdok alatt kimunkált rendjébe,megzavarta a nitrogénciklus kiegyensúlyozott működését. A szerves kötésben előfordulónitrogén mineralizációján kívül az elnitrátosodó környezet denitrifikálása is a mikrovilágfeladata. Ezen aktivitása a környezetünk állapotának fenntatása szempontjából alapvetőjelentőségű. A természetben folyó denitrifikáló folyamat hiányában a fotoszintézis által termeltoxigén az elmúlt évmilliók alatt a légkör nitrogéntartalmát már eloxidálta volna.A MIKROVILÁG ÁLTAL KATALIZÁLT FOLYAMATOK:Denitrifikáció 24nitrát ( – NO 3 ) + 5 glükóz =====> 12 N 2 + 30 CO 2 + vízAmmonifikáció glikokoll ====> széndoxid + ammonia + víz ∆G°= 736,7 kJammónia ====> salétromossav ( – NO 2 ) + víz ∆G°= 276 kJNitrifikáció kálium-nitrit =====> kálium-nitrát ∆G°= 73,3 kJNitrátasszimiláció– NO 3 ===> – NO 2 ===> NH 2 -OH =====> NH 32e − 4e − 2e −Nitrogénfixálás N=N ===> H-N=N-H ===> H 2 N--NH 2 ====> 2 NH 32e − 2e − 2e −Asszimiláció NADPH NADP + ATPammónia =================> glutamát ==========> glutaminα-ketoglutarátammóniaA mikroszervezet szerepét vizsgálva a citoplazmában folyó nitrogén-anyagcsere didaktikailaganabolikus és katabolikus folyamatra különíthető. Valójában a két folyamat egymáshoz kötődve,egymást kiegészítve működik, szoros kapcsolatban a szénhidrát anyagcserével. A mikrovilág idesorolt anabolikus folyamatai életfontosságúak az egész élővilág fennmaradása szempontjából.Az esszenciális aminosavak bioszintézisére, a légköri nitrogén megkötésére, bizonyosvitaminok, kobalamin származékok előállítására csak a mikrovilág képes. Nem számíthat másszervezetek segítségére. Az evolúció színpadán egyetlen sejtben kellett kialakítania a gazdaságoséletvitel mechanizmusát, és ezzel a magasabb rendű élet kialakulásában és fenntartásábanszerepe meghatározó jelentőségűvé nemesedett. Az aminosav-anyagcsere részletes megismerése,felderítése a mikrobiológiai biokémia művelőinek érdeme.166

A létért folyó küzdelemben a fehérjeszintézis az élet fennmaradásának az alapja. Ezért nem csaka genetikai információ hibátlan átmásolásában, de a mechanizmus működésének agazdaságosságában is versenyhelyzet jött létre. A leggazdaságosabb életvitel kimunkálásacéljából bonyolult szabályozási mechanizmusok ellenőrzik, irányítják a biokémiai történéseket.A teljes értékű természetes sejtfehérjét felépítő 20 aminosav előállítására csak a prokarióta és abiomérnök képes a nagy szorgalommal előállított hiánymutáns törzsek sejtmentes kivonatában.NITROGÉN-FORGALOM A TERMÉSZETBENA légkör N 2 -tartalma 3,8x10 15 tonnaIpari Biológiai légköri vulkáninitrogénkötés nitrogénkötés DENITRIFIKÁCIÓ folyamatok működéstermészeteshatása-NO 3 4,4 x 10 7 t NO 2+NH 4 N 2 -->2NH 3 NH 3 4 NH 3-616 kJ 4,3 x 10 7 t 4 x 10 7 t N 2 O3 x 10 7 t 7,6 x 10 6 t 2 x 10 5 t-700 kJnövényvilág 1,2 x 10 10 tállatvilág 2 x 10 8 tanorganikum 1,4 x 10 11 tholt szerves 7,6 x 10 11 tédesvízben oldott 3 x 10 7 tnövényvilág 1,7 x 10 8 tholt szerves 9 x 10 11 tállatvilág 8 x 10 8 tanorganikum 1 x 10 11 ttengerben oldott 2 x 10 7 tS Z Á R A Z F Ö L DV I L Á G T E N G E R E K........................................................................................................................................................Üledékes kőzetekben 4 x 10 15 tonna nitrogén fordul előA mikrovilág által katalizált folyamatok:DENITRIFIKÁCIÓ A környezetben előforduló nitrátot a mikroorganizmusok egy részeanaerob körülmények között csupán elektronakceptorként, légzési szubsztrátumként hasznosítja,miközben a jelenlevő szerves anyagot elégetik (Pseudomonas sp., Thiobacillus denitrificans,Micrococcus denitrificans, Serratia sp., Achromobacter sp.). A nitritképződésnek határt szab avegyület toxicitása. A redukció eredményeként megjelenő nitrit spontán alakulhat dinitrogénoxiddá,majd reakcióképes nitrogén-oxiddá, ami a légkör ózontartalmát csökkenti.Abiogén denitrifikáció ugyan kimutatható, ez azonban elhanyagolhatóan csekély menynyiségű.Vannak azonban olyan fajok, amelyek anaerob körülmények között elemi nitrogénnéredukálják a nitrogén-oxidokat. Ezek a mikrobák aktív denitrifikáló aktivitásukkal környezetünkvédelme szempontjából életfontosságú tevékenységet végeznek. A biológiai denitrifikáció aföldi élet szempontjából meghatározó jelentőségű.2 NO 3 =========> 2 NO 2 =========> 2 NO ========> N 2 O ==========> N 24 e − 4 e − 2 e − 2 e −24 HNO 3 + 5 C 6 H 12 O 6 ==========> 12 N 2 + 30 CO 2 + 42 H 2 O167

Ezen folyamat közben jelentős energia (11930 kJ) szabadul fel, amely az idesorolt obligátanaerob szervezetek számára a szénhidrát igen gazdaságos hasznosítását jelenti. Egy molnyiglükóz elégetése oxigén jelenlétében 2872 kJ energiát szolgáltat. Ugyanez anaerob körülményekközött, elektronakceptorként nitrátot hasznosítva, 2386 kJ energiabevételt jelent. Talán nemhaszontalan felidézni, hogy anaerob körülmények között a glükóz tejsavas erjedésekor aszabadenergia változás alig 197 kJ energiát hoz.Anaerob ammóniaoxidáció tapasztalható a Nitrobacter és a Nitrosomonas törzsek nitrifikálóaktivitásának eredményeként szennyvíziszapot tartalmazó tartályokban, ha az ammónia tartalmúszennyvízhez nitrátot adagolnak. A stöchiometrikusan és energetikailag lejátszódó folyamat:5 NH 4 + + 3 NO 3 − =======> 4 N 2 + 9 H 2 O + 2 H + ∆G o = −1483 kJA baktériumok tiszta tenyészetben csak aerob körülmények között fejtik ki oxidációsaktivitásukat. Úgy tűnik, hogy anaerob körülmények között a két faj asszociátuma egymástsegítve a feltételezhető nitrátlégzés terhére végzi az ammónia oxidációját.A nitrit, a hiponitrit és a hidroxilamin redukciója fémionok jelenlétét igényli. Hiányuk aNeurospora crassa-ban például a redukciót különböző mértékben akadályozza. (BBA 25:138)Hiányzó FémEnzim Vas Réz Mangán Molibdén CinkNitrit-reduktáz 22 % 36 % 53 % 100 % 68 %Hiponitrit-reduktáz 51 % 53 % 60 % 100 % 100 %Hidroxilamin-reduktáz 100 % 100 % 57 % 100 % 95 %Ezek a mikrobák az elektronakceptorként szereplő légzési szubsztrátumot, a nitrátot asszimilációsfolyamathoz szükséges enzimek hiányában általában nem hasznosítják nitrogén- forrásként.Nem képesek a nitrátot ammóniává redukálni. Sőt oxigén jelenlétében beszüntetik a denitrifikálótevékenységüket, és elektronakceptorként a gazdaságosabban hasznosítható oxigént választják.AZ AMMÓNIA ASSZIMILÁCIÓJA Az élő szervezet környezetében levő ammóniaasszimilációját leginkább a megfelelő redukált kofaktort igénylő glutaminsav-dehidrogenázsegíti. Ez a reverzbilisen működő enzim adott esetben az ammónia kiválasztását iskatalizálhatja:COOHCOOH| glutaminsav-dehidrogenáz |H-C-HH-C-H| NH 3 |H-C-H __________________ H-C-H| |C=O NAD(P)H NAD(P) + H-C-NH 2| |COOHCOOHA Krebs ciklusban megjelenő α-ketoglutársav helyett némely esetben a piroszőlősav is képesreduktív módon ammóniát felvenni az alanin-dehidrogenáz segítségével:CH 3 CH 38| NH 3 |C=O H-C-NH 2| NADH NAD + |COOHCOOH168

A fenti két aminosavból ezután transzamináz katalizálta reakcióval a szervezet növekedéséhez, afehérjeszintézishez szükséges aminosavak egy részének a képződésére nyílik lehetőség.glutaminsav + α-ketosav ==========> α-aminosav + α-ketoglutársavtranszamináz169

A reakcióban fontos szerepet tölt be az enzim lizil oldalláncánakε−aminocsoportjához kötődő piridoxál foszfát, amely a reakcióbanrészt vevő aminosav aminocsoportjával kialakított Schiff bázis által,átmenetileg kialakuló köztes reakció terméken keresztül segíti elő azegyensúlyi reakció végbemenetelét. Az α−aminocsoport ugyanisleszorítja az ε−aminocsoportot a kötődési helyéről.katalizáltíaörténéseiA piridoxál-foszfát-enzimkomplex segítségévela transzamináz katalizáltabiokémiai folyamattörténései az ábránjól követhetők.Az ammónia biológiai hasznosításának másik útja a glutaminsav amidálása, amit a glutaminszintetázenzimkomplex végez:ATP ADP NH 3glutamát ================> γ-glutamilfoszfát ================> glutaminAz ATP felhasználásával képződő glutamin, mint könnyen hasznosítható aminodonor vesz részta köztes nitrogén-anyagcserében, aminosavak, nukleotidok és az aminocukor bioszintézisében.A glutamin-szintetáz szerepe a légköri nitrogén megkötésében is nélkülözhetetlen. Maga azenzimkomplex fontos szabályozó szerepet tölt be. A 12 alegységből felépülő enzimkomplexműködését alloszterikusan, sokoldalúan (multivalens módon) szabályozzák azok a vegyületek,amelyeknek a bioszintézise glutamint igényel. A glutamin-szintetáz adenilezhető 12 alegységétallosztérikusan, specifikusan gátolhatja az AMP, a CTP, a GMP, a NAD + , a triptofán, ahisztidin, az aszparagin, a karbamil-foszfát, a glicin, az alanin, a glükózamin-6-foszfát és a p-amino-benzoesav. A multivalensen gátolt komplex végül tirozil- oldalláncainak adenilezésévelinaktív formát vesz fel, amely csekély aktivitást mutat.Szükség esetén – a fenti termékek hiányában – az adenilcsoportok enzimkatalizáltalemozdításával a komplex újra aktív formába kerülve megindítja a glutamin-szintézist.170

NITRÁTASSZIMILÁCIÓ. Az élővilág nitrátot ammónia formájában képes hasznosítani.NO 3 − ===========> NO 2 − =========> NO − =======> NH 2 OH =========> NH 32 e − 2 e − 2 e − 2 e −Az asszimilációs folyamat első lépését FAD-ot és molibdént tartalmazó fehérje katalizálja. Aredukcióhoz NADPH hozza az elektronokat. Az első redukciós termék a nitrit, amely eztkövetően két elektron felvételével nitrogénoxiddá, tovább redukálódva hidroxilaminná, majdújabb két elektron, összesen tehát nyolc elektron felvételével a nitrát ammóniává redukálódik.A redukciós folyamat nagy energiaigénye miatt itt is jól működő szabályozási mechanizmus védia mikroba érdekeit. Aerob körülmények között, könnyen hasznosítható nitrogénforrás jelenlétébena nitrátot redukáló enzimrendszer ki sem fejlődik. A nitrátasszimilációra képesszervezetek a tápközegből először az ammóniát veszik fel és csak ennek elfogyasztása utántérnek a nitrát hasznosítására.Ez az út nem tévesztendő össze a nitrátlégzés redukciós lépéseivel, amikor a nitrátcsupán elektronakceptorként szerepel a terminális oxidáció folyamatában. A prokarióták sokesetben anaerob korülmények között képesek nitrátlégzésre, de nitrogénforrásként csupánnitrátot tartalmazó táptalajon NADPH hiány esetében nem képesek növekedni.AMMONIFIKÁCIÓ Ammonifikációnak nevezve foglalható össze a szerves anyagot lebontószaprofita mikrobák tevékenysége, a fehérjék és más nitrogént tartalmazó szerves vegyületek mineralizációja.Ezek a mikrobák elsősorban saját szervezetük felépítését végezve hasznosítják az életterükbentalálható szerves anyagot és csak a feleslegben képződő ammóniát választják ki a környezetbe.HOOC--HCH--NH 2 ========> 2 CO 2 + NH 3 + H 2 O736,7 kJNITRIFIKÁCIÓ Az ammónia energetikailag előnyös oxidációját nitrifikáló baktériumokvégzik. A Nitroso- fajok (Nitrosomonas spp. Nitrosococcus spp.) az ammóniát a szervezetszámára toxikus nitritté oxidálják. Ennek továbbalakítását Nitro- fajok (Nitrobacter spp.) végzikO 2NH 3 ======> HO-N=O + H 2 O∆G = 276 kJO 2KNO 2 ==========> KNO 3 ∆G= 73,3 kJA képződő negatív töltésű nitrátionok a csapadékkal a talaj mélyebb rétegeibe vándorolvaszennyezik a talajvizet. Itt dúsul a fel nem használt műtrágya maradéka is. A talajvíz elnitrátosodásaa fogyasztásra alkalmas vízkészleteink mennyiségét drámaian csökkenti.NITROGÉNKÖTÉS Az élővilág fennmaradása szempontjából fontos szerepet tölt be aprokariótákban működő nitrogenáz enzimkomplex, amelyik a légköri nitrogén megkötéséreképes (N 2 -ből NH 3 képződik). Ez a molibdén tartalmú enzimkomplex megfelelő elektrondonorés bőséges ATP-ellátás esetén anaerob körülmények között végzi reduktív feladatát:N = N =======> H-N=N-H ======> H 2 N - NH 2 =======> 2 NH 32 e − 2 e − 2 e −A fakultatív anaerob Klebsiella, illetve a Rhizobium aerob körülmények között nem kötnitrogént, csak asszimilálható nitrogénforrást tartalmazó táptalajon tenyészthetők. Az oxigénrekülönlegesen érzékeny nitrogénkötő enzimkomplexeket különböző aerob, anaerob, és fakultatívanaerob prokariótákból izolálták. Az Azotobacter vinelandii, Bacillus polymyxa, Clostridiumpasteurianum, Klebsiella pneumoniae, Rhizobium sp., a fototróf baktériumok és aCianobaktériumok különböző képviselőiből nyert enzimkészítményekben és sejtmentes kivona-171

tokban működő nitrogenázokat hasonló felépítésűnek találták. Minden esetben a nitrogén többlépést igénylő redukciója egy több alegységből felépített molibdént és vasat tartalmazó fehérjénkövetkezik be. Joggal kérdezhető: Miért éppen a molibdén, amely vegyületeiben két, három,négy, öt és hat vegyértékü formában fordul elő? — {Megjegyzendő, hogy egyes Ősbaktériumoknitrogént kötő fehérje komplexének aktív centrumában vanádium teljesíti ezt a feladatot, amelyvegyületeiben általában három és öt vegyértékű formában ismert, de ritkábban kéttő, négy illetvehétvegyértékű alakja is előfordul.}Az obligát anaerob Clostridium pasteurianum nitrogénkötő rendszere fermentációs útonnyert energia és elektron felhasználásával működik. Az anaerob erjedéssel képződött piruváttöbb lépésen keresztül ecetsavvá alakul, miközben a TPP-acetál, az acetil-CoA és azenergiagazdag acetilfoszfát őrzi a dekarboxilezés energiatartalmát. Ennek az energiának egyrésze használódik fel a ferredoxin redukciójára, ami azután a nitrogenáz felületén az aktiváltnitrogénmolekula teljes redukcióját biztosítja.szénhidrátN 2 NH 3ATP NADP + NADPH ADPMoFeSnitrogenázCH 3 ferredoxin red e − ATPC=OCOOH TPP CoA-S-CO-CH 3 Pi CH 3COOHCH 3CO 2 TPP-acetál CoA-SH C=O ADPO-PO 3 H 2ferredoxin oxA redukcióhoz szükséges energiát az acetilfoszfát bomlásakor képződő ATP közvetíti.Elektrondonor (ez esetben a piruvát) jelenlétében ez a rendszer olyan aktívan működik, hogynitrogén hiányában - mivel proton mindenhol jelen van - az enzimkomplex hidrogént termel.NADP + azotoflavin oxG-6-P N 2(izocitrát) flavodoxin red ATPnitrogenázMoFeSazotoflavin redNADPH /6-PG flavodoxin ox ADP(oxálacetát) NH 3Az aerob Azotobacter vinelandii nitrogénkötő rendszere számára a redukcióhoz szükségeselektronok a szénforrás teljes elégetése közben jelennek meg NADPH formájában. A négy vasatés nyolc ként tartalmazó, hőlabilis, oxigénre érzéketlen flavodoxin redukciójához szükségeselektronokat ez a NADPH szállítja. Az elektron végül is a hőérzékeny flavodoxinról azazotoflavinon keresztül jut el a molibdoproteinen redukálódó nitrogénre. Az ATP az oxidatívfoszforilálás terméke. Az Azotobacter fajok membránjának igen erős légző aktivitásaakadályozza a sejten belüli redoxpotenciál kedvezőtlen irányú változását.172

A nitrogénkötés fölöttébb energiaigényes folyamat (20-30 ATP szükséges egy nitrogénmolekulamegkötéséhez). Ezt az energiát a mikroba vagy a környezetből szerzi (pl. fényenergia)vagy a saját köztes anyagcseréje szolgáltatja ATP formájában. —A növényekkel szimbiózisban tevékenykedő Rhizobium esetében a nitrogénkötő 220 kDaméretű, négy alegységből felépülő fehérje 24 vasatomot tartalmaz. Ehhez kötődik a kisebbméretű, két molibdénatomot tartalmazó, molibdo-ferredoxinnak nevezett fehérje. A reakcióhozszükséges elektronokat a két alegységből álló, négy vasatomot tartalmazó, azoferredoxinnaknevezett dimer szállítja. A nitrogenáz enzimkomplex mindkét oxigénérzékeny tagja - adinitrogenáz és a dinitrogenáz-reduktáz - SH-csoportokat tartalmaz, ami a reduktívkörülmények fenntartásának kedvez. — Az egyes mikrobák esetében az enzimkomplex körülitér oxigénmentességét különleges szerkezeti elemek, illetve a célnak megfelelő enzimekműködése biztosítja. A Rhizobium törzsek. esetében a bakteroidok körül feldúsuló leghemoglobinköti meg az odakerülő oxigént. A Cyanobacterium fajoknál egyrészt a nitrogénkötő sejtekkülönlegesen vastag fala, másrészt a heterociszták hidrogenáz aktivitása védi a nitrogenázrendszert az oxigén káros hatásától. Ez utóbb említett enzim a nitrogénkötés közben képződőhidrogénnel a bejutó oxigént vízzé redukálja. Valamennyi H 2 egyébként minden esetben, tehátnitrogén jelenlétében is képződik. A nitrogénfixáló baktériumok (például Rhizobiumleguminosarum, Azotobacter sp.) is rendelkeznek hidrogénfelvevő típusú [NiFe]hidrogenázzal, mely révén képesek a nitrogenáz enzim által termelt molekuláris hidrogénvisszavételére, aminek eloxidálásával a sejt csökkenteni tudja a nitrogénfixálás folyamatasorán keletkező energiaveszteséget. (Az USA szójatermő területein a nitrogénfixálásmelléktermékeként évente 2 millió tonna H 2 jut a környezetbe.)A nitrogenáz aktív centrumában képződő ammónia eltávolításáról ezekben amikrobákban egy különleges glutaminszintetáz gondoskodik, amely igen csekély ammóniaszintesetében is működőképes (K M =0,2 mM). A rendszer működése folytonos α-ketoglutársavellátást igényel! A képződő ammónia folyamatos eltávolítása azért szükséges, mert egyrésztrepresszálja a nitrogénkötésben szereplő enzimek képződését, másrészt mint általános sejtméregis károsíthatja az élő sejtet. {Megjegyzendő, hogy az élővilágban általánosan előfordulóglutaminszintetáz egy nagyságrenddel nagyobb koncentráció jelenlétében (K M = 1,5-3 mM)működik kielégítő aktivitással.} —A különleges szintetáz terméke, a glutamin, vas-flavoproteint tartalmazó, NADPH-függőreduktív amináz (glutamát-szintetáz) hatására α-ketoglutársavval reagálva glutaminsavváalakul. Az így képződő glutaminsav azután aminocsoport-donorként résztvesz a sejt életműködéséhezszükséges aminosavak szintézisében. Ez az enzimrendszer szinte mindennitrogénkötő sejtben megtalálható. Sőt a rendszer egyes elemeit nitrogént nem kötő mikroorganizmusokbanis megtalálták; így például az Aerobacter aerogenes-ben is működőképes. Aglutamát képződését az Escherichia coli-ban is egy vas-kén fehérje segíti.A Klebsiella pneumoniae az utóbbi idők géntechnológiai eredményeinek egyik nevezetesszereplője. Ebből az organizmusból a pRD1 plazmid és az EcoRI valamint a HindIII restrikciósenzimek segítségével klónozták a nitrogénfixálásban résztvevő enzimek génjeit (hét operonbantalálható 15 enzim), az úgynevezett nif-régiót. Ezt követőleg a két HindIII-mal kiemelt szakaszt -ami a teljes nif tartományt tartalmazta - a pACYC184 vektorban egyesítve juttatták azEscherichia coli-ból származó mini-sejtbe, ahol a plazmidon levő információ kifejeződött ésmegindult a nitrogénfixálás energiaigényes folyamata.A nif-lokusz géncsomagjairól a vizsgálati módszerek fejlődése egyre részletesebbadatokat szolgáltat. Több laboratóriumban reprodukálható kísérletekkel igazolták. hogy adinitrogenáz géncsomag nif-H és nif-D génje csak a nitrogénkötő mikroorganizmusokból nyert173

DNS-készítményekkel hibridizál. Nem hibridizál azon mikroorganizmusokból nyertkészítményekkel, amelyek a törzsfejlődés folyamán elvesztették ezt az ősi képességüket.A Klebsiella pneumoniae nitrogenáz rendszerének vázlata|||G6P-dehid.| |His-locus| | nif-B| | nif-F| | nif-D| | nif-H| | nif-G| | sikimát| | G S | | Glu-szint.|=========================================================================================================serkentő inaktív gátló............................................................. Gln-szintetáz hatás!nitrogenáz ...:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::.. (adenilezett!)komplex ..::::::::::::::Fe::: -----Fe-----Fe------ ::::Fe::::::::::::::::::::::::S:::::::: -----------------------------::::::::S:::::::::::::::::Fe::-----------------------------------------:::Fe::::::::n(H + ) ::::::::::::::----------------------------------------------::::::::::::::::::Fe:-------------------------------------------------::Fe::::aktív glutamin-szintetázADP:::::::::::---Fe-------------------------------------- Fe-- :::::::::::N=N ::: Fe:::---------------------- Mo ----------------------:::Fe:::: NH 3 ATP:::Fe:::::--------------------- Mo ------------------:::Fe:::::::::::::::::-- Fe---------------------------------- Fe---:::::::::::: COOH COOH::::::::Fe:::::-------------------------------------------:::Fe::::::::: | |n(H 2 ) :::::::::::::::::::-------------------------------------::::::::::::::::::: H-C-NH 2 H-C-NH 2:::::::::::::::Fe::::----Fe-----------------Fe---::::::Fe:::::::::::::: | |:::::::S::::::::::::::::::.................::::::::::::::::S::::: H-C-H H-C-H:::::::::::::::::::::::::::Fe::::::::::::Fe:::::::::::::::::::::: | |H-C-H H-C-H| | |................ O=C-NH 2 COOHATP .........S........... ADP +Pi............................ Fe..............Fe...azoferredoxin -----------------------...Fe.............Fe.....................................S.......... \/........... glutamin NADPH NADP +|elektron α-ketoglutarát 2 Glutranszportfaktor|elektrondonor[ GS]glutaminsav-szintetázaszpartáttranszaminázoxálacetátA géncsomag tartalma (cluster): nif-B gén Mo aktiváló faktor; nif-F gén transzport faktornif-D gén Fe-S-fehérje I.; nif-H gén Fe-S-fehérje II. ; nif-G gén nif-lokuszt ellenőrző fehérjeA nitrogenáz komplex képződésért felelős nif-lokusz géncsomagjainak (nif-B, nif-F, nif-D,nif-H) működését a szabályozó szerepet betöltő nif-G génen keresztül az a glutamin-szintetázbefolyásolja, amelynek az aktivitását az anyagcsere különböző nitrogént tartalmazó termékei(glutamin, aminosavak, glükózamin, nukleotidok) határozzák meg. A nif-lokusz (régió) ahisztidin bioszintézis génjeinek a közelében helyezkedik el. Ettől nem túl távol található aglutamin-szintetáz gén, amit az (inaktív) adenilezett glutamin-szintetáz represszál. – A174

Klebsiella pneumoniae glutamin-szintetázban sérült mutánsaiban nitrogenáz sem képződik. Haazonban glutaminanalógként metionin-szulfoximint adunk a tenyészethez, akkor a nitrogenázképződés megindul és hamarosan megjelenik a képződött ammónia is. {Megjegyzendő, hogy ametionin-szulfoximin a Cianobacterium fajok nitrogénkötő aktivitását is befolyásolja.}A NITROGENÁZ-RENDSZER MŰKÖDÉSEA szénforrás dehidrogénezésével vagy a fényenergia hasznosításával nyerhető, redukáltkofaktorok táplálják az energiaigényes rendszert. (N 2 -kötés; 3 x 2 e - és Σ 20−30 ATP)NADPH NADP +(flavodoxin) ferredoxin ox oxidoreduktáz ferredoxin redvasfehérje red dinitrogenáz-reduktáz vasfehérje oxMgATPMgADPvasfehérje redMgATPvasfehérje oxMgADPMolibdén-vas fehérje ox dinitrogenáz Molibdén-vas fehérje redH-C = C-H N N 2 H + H–HH 2 C = CH 2 H-N N-HA nitrogenáz aktív centrumábanmint nitrogénanalóg, az acetilén H His képes redukálódni.N —— NA képződő etilén mérhető H Hgázkromatográffal, ezért anitrogenáz aktivitás mérésére NH 3 NH 3kiterjedten használják azacetilént szubsztrátumként.Az energiaigényes nitrogénkötési mechanizmus szabályozottsága a létért folytatott küzdelembena fennmaradás, a túlélés feltétele. A bonyolult szabályozási mechanizus kulcsfontosságú elemeugyanaz a glutamin-szintetáz, amelyik a nitrogént nem kötő szervezetekben oly finomanszabályozza a nitrogén-anyagcsere enzimeinek a képződését.Az Escherichia coli 12 alegységből álló glutamin-szintetázának a működését a sejtenbelüli szabad aminosavak mennyiségi viszonyai befolyásolják. Az aminosavakfeldúsulása alloszterikusan gátolja az egyes alegységek működését. A tartósan gátoltalegységek adenilezésével végül is inaktiválódik a glutamin- szintetáz.A nitrogént kötő mikroorganizmusokban az aktív glutamin-szintetáz serkenti a nitrogén fixálásátvégző mechanizmust. Az adenilezett inaktív glutamin-szintetáz viszont visszafogja a nitrogenázkomplex működését. Enzimszinten a glutamin feldúsulása is fontos szabályozó mechanizmustműködtet, de a sejtben felszaporodó ammónia is visszaszorítja a nitrogenáz képződését.175

Kiterjedt vizsgálatok sem tisztázták még eddig teljesen a növényekkel szimbiózisban élőmikrobák bejutásának a módját a merisztémába. Az eddig nyilvánosságra került eredményekszerint a Rhizobium törzsek nem termelnek olyan enzimeket (pektináz, celluláz), amelyek abejutást segítenék. Egyesek a növények által termelt lektinszerű anyagoknak tulajdonítanak ilyenszerepet. Ezek a lektinek olyan növényi eredetű fehérjék, amelyek egyaránt képesek kötődni agyökérszőrök felületéhez és a baktériumok poliszacharid természetű tokanyagához. Agazdasejtből származó lektin és a baktérium poliszacharid külső burka közötti kapcsolat agyökérszőröket spirális felcsavarodásra ingerli. Az is bizonyított, hogy a gazdanövény sejtnedvébenelőforduló anyag hatására a baktérium lektinkötő képessége fokozódik. Bohlool és Schmidtfluoreszcein-izotiocianáttal jelzett lektin specifikus kötődésével igazolták, hogy csak azonbaktériumokhoz kötődött a jelzett fehérje, amelyek képesek voltak a gazdanövény fiatalgyökerein gümők képződését indukálni. A gazdanövényben előforduló, poliszacharidot bontóenzimek kedvezően módosítják a baktérium külső poliszacharid burkát. A szója esetébenpéldául egy galaktózra specifikus lektin kötődik a baktériumnak a növényi sejtfalbontó enzimekáltal enyhén módosított felszínéhez és ezzel megindul a nitrogénkötő csomók, gümőkképződése. – A csomóképződést a rifampicin, illetve a kloramfenikol gátolja. – A gümőképződése erősen függ a környezet hőmérsékletétől. Az őshonos növényeinknél általában 7-10o C között fejlődnek optimálisan. A szójabab esetében 15-18 o C az optimális hőmérséklet.Előfordul, hogy csak a gümő képződik és nem alakul ki a nitrogenáz komplex. Más esetben agümő bakteroidjaiban kifejeződik a nitrogenáz komplex és mégsem köt nitrogént. A talaj-pH iserősen befolyásolja a törzs teljesítményét; általában pH = 3,5-5,3 az optimális. A lóherefélék(Trifolium) esetében ez a tartomány szűkebb; 4,7 pH alatt nem képződik gümő!Az osztódó Rhizobium-sejtek körül fodrozódó gyökérszőrök a baktériumokat szintekörül ölelik. A gyökérszőrökben hamarosan jól látható a növény által kiválasztott anyagbólkialakuló fertőző fonal, amelyen az osztódó baktériumok sorba rendeződve a kéreghez, majd amerisztéma sejtekhez jutnak. Az elektronmikroszkópos felvételek szerint ez a fonal a gyökérszőrsejtmagjával létesít kapcsolatot. Ennek hatására a gyökér kéregsejtjei osztódni kezdenek, afertőző fonal pedig többszörösen elágazva belenő ezekbe a sejtekbe. A fiatal kéregsejtekcitoplazmájában a rizobiumok a gazdasejt által fejlesztett peribakteriális membránnal körülvévekülönféle formát, úgynevezett bakteroid alakot vesznek fel. A gazdaspecifikus nodulin(gümőfehérje) mellett ekkor képződik a baktériumsejtben levő információ alapján a nitrogenázkomplex. Átalakul a citokrómrendszer. Megjelenik a Rhizobium-ban levő információ alapján aleghemoglobin, amelynek a fehérje része a növényből származik.A nitrogénfixálás intenzitása egyrészt a baktériumban levő génektől és azok szabályozásimechanizmusától függ, másrészt jelentős mértékben befolyásolják a nitrogénkötést a környezetitényezők, az energiaellátottság, a megvilágítás, a fotoszintézis teljesítménye. A növény szerepeis meghatározó jellegű. Előfordul, hogy ugyanaz a Rhizobium törzs az egyik növényben nagyaktivitással köti a nitrogént, amíg a másikban ugyancsak gyenge teljesítményt mutat. Ezértmesterséges fertőzéskor többnyire különböző pillangós növényfajokra specifikus Rhizobiumfajok tevékenységét hasznosítva, baktériumkeveréket alkalmaznak és az adott körülményeknekmegfelelő törzs kiválasztását a természetre bízzák. A talaj oltására jól használható a tőzegre vittbaktériumszuszpenzió, amit viszonylag könnyen lehet megfelelő mennyiségben atalajba juttatni. Olyan technológia is ismert, amikor az elvetendő mag felületérejuttatják a baktériumtenyészetet. A csomóképződést számos ismeretlen anyagképződése kíséri. Így például az első fertőződést követő gümők képződéseakadályozza az újabb fertőzés bekövetkeztét. Ez a szabályozó anyag a csomókszámát optimális értéken tartja. —A gümőképződés a talaj nitráttartalmától függ; 1 mM-nál nagyobb koncentrációgátolja a csomóképződést, illetve csökkenti a már képződő gümők méretét. Ennek176

a hatásnak a csökkentése céljából nitráttűrő mutánsokat állítottak elő. Ezek a szója mutánsok 5mM kálium-nitrát jelenlétében is fejlesztettek gümőt, a gümők pedig tízszer gyorsabbannövekedtek, mint a vad növény nitrogénkötő csomói.177

178

A Rhizobium-mal való oltást hat óra múlva követi a csomóképződés. Ha a baktériumokatelőzőleg gyökérszőrkivonattal kezeljük, akkor a csomóképződés már két óra múlva megindul. Akezelés hatására gélelektroforézissel kimutatható egy új fehérje megjelenése a baktériumokban.A tokpoliszacharidban ilyenkor emelkedik a galaktóz és csökken a mannóz mennyisége;egyidejűleg megjelenik a szénhidrát komponensek között az arabinóz és a xilóz. A nitrogénkötésfokozását célzó kutatómunka során nem csak a fixálás szempontjából kiemelkedőteljesítményekre képes törzsek kiválasztását végzik a mindenkori gazdanövénnyel való kompatibilitásszempontjából, de jelentős figyelmet fordítanak a növényvédő szereket tűrőképességükre is.A nitrogénkötésben szerepet játszó asszociációk ismertetésekor fontos kiemelnünk aFrankia fajok szerepét. Frankia törzseket izoláltak a Betulaceae, Eleagnaceae, Rhamnaceae,Rosaceae, Casuarinaceae, Datiscaceae, Myricaceae családba tartozó növényfajok gyökereiből.Ezek a gyökérszövetben kialakuló noduluszokban elburjánzó endofiton szervezetek mikroaerofillaboratóriumi körülmények között in vitro is képesek nitrogénkötésre.179

A RIBOSZÓMÁLIS FEHÉRJESZINTÉZIS ENERGIA IGÉNYE:—Növekedési fázisban a riboszómák száma emelkedik Az eubaktérium, az ősbaktérium,valamint az eukarióta riboszóma kémiai szerkezete és felépítésének szabályozása—A riboszóma rRNS és fehérjetartalmának előállítása—mRNS szintézis és szabályozása a prokariótáknál—mRNS képzés a pre-mRNS-ből az eukariótáknál—Az iniciáció ATP igénye,—A riboszóma továbbhaladásának energia igénye,—tRNS szintézis,—tRNS aciláz szintézise és működtetése—Az építőelemek (aminosavak) szükséges mennyiségben víló jelenléte aminosavtranszport illetve bioszintézis által—Az aminosav-bioszintézishez szükséges enzimek struktúr-génjeinek transzlációjavezérpeptid szintézis által szabályozlott formában—A szintézisben (lebontásban) résztvevő enzimfehérjék és fehérje faktorok előállítása igényszerinti mennyiségbenA CITOPLAZMÁBAN FOLYÓ RIBOSZÓMÁLIS FEHÉRJESZINTÉZIS VÁZLATAamely összefoglalja az életfontosságú folyamat történéseit.*Az ábra az antibiotikumokkal zavarható reakciólépéseket is mutatjaA hírvivő ribonukleinsavba (mRNS) átírt információ a riboszómán folyó mechanokémiairekciók eredményeként fehérje formájában jelenik meg. A fehérjét felépítő aminosavakminőségét és sorrendjét három-három nukleotíd, az úgynevezett triplet kódolja. Az egész élővilágra érvényes kódjeleket fáradságos munkával a prokariótákkal végzett kísérletekben Ochoa,180

Nirenberg és Khorana polinukleotid-foszforiláz és szintetikus oligonukleotidok segítségévelhatározták meg 1961-65 között.Egyedül a tRNS-molekulák képesek értelmezni a DNS-ről átírt mRNS első megközelítésbenértelmetlennek látszó kémiai szerkezetét. Az olvasatért a tRNS meghatározottrészén található triplet antikodon felelős. A leolvasás az RNS szintézissel azonosan 5'-3'irányban folyik. Ily módon a fehérjeszintézis a prokarotákban már a születő mRNS szálon,annak teljes elkészülte előtt megindul. Sőt, a folyamat közben, amint felszabadul a lánckezdőAUG kodon előtt található riboszómakötő szakasz, máris új riboszómakomplex kialakulásaindul meg.Az ép riboszómakötő-szakasszal rendelkező mRNS kapcsolódását a 30S alegységhezegy 20.000 móltömegű IF-3 (iniciációs faktor) fehérje segíti. Ezt követi wgy 8000 móltömegűIF-1 fehérje kapcsoódása és a 115000 móltömegű formil-metionil-tRNS-GTP-IF-2 komplexbekötődése a mRNS-en levő antikodon irányítása szerint. Az így kialakuló komplex az 50Salegységhez közeledve alakítja ki a működőképes 70S riboszómát, miközben az iniciációsfaktorok szabaddá válva egy újabb iniciációs komplex kialakításában vehetnek részt. Aformilmetionil-tRNS ekkor a riboszóma úgynevezett ferhérje kötő helyén található.A riboszómák a mRNS-en 80–100 nukleotidnyi távolságra követik egymást.Elektronmikroszkópos felvételekenriboszómafüzérek, úgynevezettpoliszómák képződése látható. Afelvételeken 15-20 nm méretűszemcsékként észlelhetők. Tömegük63 %-a RNS, 37 %-a fehérje. A 70Sriboszóma egy nagyobb 50S(1,8x10 6 dalton tömegű, 5300 nm 3kiterjedésű) és egy kisebb 30S(1x10 6 dalton tömegű, 2600 nm 3kiterjedésű) méretű alegységbőltevődik össze. Az 50S alegység egynagyobb 1904 nukleotidottartalmazó és egy kisebb 120nukleotidottartalmazóribonukleinsav molekulából, valamint 34 fehérje molekulából áll. A 30S alegység egy 1542nuleotidból álló (16S rRNS) ribonukleinsavat és 21 fehérje molekulát tartalmaz. A kétalegység (30S + 50S) érett mRNS jelenlétében csak a fehérje szintézis idejére kapcsolódikfunkcionális egységbe, az úgynevezett70S riboszómaként. A sejt RNStartalmánakzöme (90%-a) itt található,amely az intenzív növekedés szakaszábana szárazsúly negyven százalékát iselérheti. A riboszómális RNS-molekulák,a riboszóma kis (30S, 0,9-1 mDa) és nagyalegységének (50S 1,8 mDa) alkotórészei(16S, 600 kDa, 1,5 kb; 5S,40kDa,120b;23S,1200kDa,3 kb) is közös nagyprekurzor-molekulaként képződnek éscsak később válnak szét. Ugyanezérvényes az eukariótákban működőméretében nagyobb (80S) riboszómák181

kis (40S, 1,5 mDa) és nagy alegységére (60S, 3 mDa), valamint alkotórészeire (18S,2 kb;5S,120b; 5,8S,160 b; 28S,5 kb).A riboszomális gének többkópiában találhatók a kromoszómán. AzEscherichia coli esetében 7 kódolószakaszt azonositottak. Átírásukra csakaz esetben kerül sor, ha a szintézishezfinoman szabályozott aminosavkészletrendelkezésre áll.Az osztódó baktériumsejtbenáltalában 25.000 riboszóma található, azéhező sejtben ez az ötszázat sem éri el.(Aminosavhiány esetén szabályozószerepű ppGpp és ppGppp szaporodikfel.) A riboszomális RNS szekvenciabázispárjai jellegzetes stabil másodlagosszerkezet kialakulását segítik. A 16S rRNS szekvenciáját az utóbbi időben a törzsek rendszertaniazonosításra, a rokonsági fok meghatározására használják. A PCR-eljárás gyakorlatba vételévelez már egyszerű rutin feladat. — Az E. coli primer felhasználásával, a vizsgálandó törzskromoszomális DNS-állomán0yából könnyen felszaporítható a 16S rRNS-t kódoló DNSszakasz.Ennek szekvenálása megfelelő számítógépes program alkalmazásával az egyes törzsekközötti különbség számszerűsítését teszi lehetővé.Az aminosavak tRNS-hez kötödve vehetnek részt a riboszómális fehéjeszintézisben.A prokariótákban a fehérjeszintézis sok esetben a citoplazmamembrán belső felületéhez közel,illetve annak belső felületén folyik. A membrán közelsége bizonyos védelmet nyújt a fölöslegesfehérjék és nukleinsavak bontását végző proteázok és nukleázok hidrolitikus hatásával szemben.182

Az eukariótákban a sejtmagban készült pre-mRNS-ből egy érési folyamatben képződő mRNSkerül a citoplazmában szerveződő endoplkazmás retikulum membránrendszeréhez kotveműködő riboszomákhoz.Az RNS polimerázról legürdülő mRNS-re 80 bázis távolságra riboszómák kapcsolódnakAz AUG kód hatására induló INICIÁCIÓ szakaszában áll össze a fehérjeszintézist végzőkomplex. A riboszómán a mRNS riboszóma kötőhelyével kompatibilis templát jelenléteirányítja az mRNS-30S riboszóma komplex kialakulását, amit egy 21 kDa tömegű IF-3, egy 9kDa méretű IF-1 és egy 65 kDa tömegű formilmetionin-tRNS, +GTP, +IF-2 komplex(iníciációs faktorok) bekötődése tesz lehetővé. Az így kialakuló komplex kapcsolódik az 50Salegységgel, létrehozva a működőképes 70S riboszómát, miközben az előbbi iníciáló fehérjék(IF-1, IF-2 és IF-3) szabaddá válva újabb komplex kialakításában működnek közre. (Aprokariótákban az iniciációs komplex kialakulásának a lépéseit zavarják az aminoglükozidantibiotikumok, például a streptomycin.Az eukariótákban a Streptomyces griseus termelte cxcloheximid (actidione) gátolja tRNSkapcsolódását a ruboszómához.A következő lépés az ELONGÁCIÓ szakasza, a peptid lánc hosszabbítása. Elsőként ariboszóma aminosav kötőhelyéhez kapcsolódik a mRNS következő antikodonja által igényeltaminosavval acilezett tRNS. A fehérjeszintézis biztonsága szempontjából döntő jelentőségevan ATP felhasználásával tevékenykedő tRNS aciláz megbízható működésének.Aminosav + tRNS + ATPaminoacil tRNS acilázaminoacil-tRNS + AMP + PPAz aminosavra specifikus enzim aktív centruma nyitott állapotban az aminosavat és az ATP-trögzíti. A folyamat következő szakaszában PP lehasadásával kialakul az aminosavadenilát,amely a savanhidrid kötésben rendelkezésre álló –14 kcal mol –1 szabadenergia tartalmathasznosítva az alkalmas helyzetben jelen levő tRNS (ACC kötő triplet) terminális ribóz 3’OHcsoportját acilezi. Az aminoacil-tRNS molekula hidrolízisekor (észterkötés) felszabadulószabadenergia tartalma csupán –7 kcal mol –1 . — A fehérjeszintézis szempontjából meghatározójelentőségű az egyes aminosavakra specifikus aminoacil tRNS aciláz szubsztrátspecifitása. Azaminosav-pool összetétele, a koncentrációviszonyok alakulása szigorú szabályozottságotigényel, mert a tévesen feltöltött tRNS állomány a mikroszervezetben képződő használhatatlanfehérje mennyiségét növeli. Ezeket bár a proteázok lebontják, mégis a létért folyó küzdelembenhátrányt jelent. —183

Alanint hordozó tRNS szerkezeteröntgen krisztallografiai adatok szerintJ.L.Sussman és S.H,Kim Science 192:853 (1976)TRANSZFER-RIBONUKLEINSAV SZERKEZETEAz aminosav kapcsolódásához szükséges energiát az elongációs faktornak nevezett EF-Tu-GTP fehérje komplex szolgáltatja. (Ezt a folyamatot a riboszómához kötődő tetraciklinekgátolják.) A peptid kötés kialakulását az 50S alegység egyik fehérjemolekulája, a transzferázsegíti. (Ennek az enzimnek a működését gátolja a chloramphenicol, másnéven klorocid.) AtRNS 3’ végén levő ribóz 3’-OH-hoz észterkötésben kapcsolt aminosav aminocsoportjaugyanis nukleofilen támadja a peptid kötőhelyen levő aminosavészter karbonil csoportját. Avisszamaradó, most már üres tRNS egyidejűleg elhagyja a peptidkötő helyet.A kémiai reakciót egy mechanokémiai lépés a TRANSZLOKÁCIÓ követi. (Ezt alépést gátolja a makrolid antibiotikum csoport, például az erythromycin.) A transzlokáz enzima másik elongációs faktor, az EF-G-GTP komplexben levő energia felhasználásával a peptidláncot a mRNS-val együtt átemeli a riboszóma aminosav közőhelyéről a peptid kötő helyre.Ezzel lehetővé válik egy újabb, mRNS által kodolt aminoacil-tRNS kapcsolódása az aminosavkötőhelyen.A peptid lánc hosszabítását jelentő ciklusok, (az elongáció és a transzlokáció) aprogram szerint valamelyik termináló kod (UAA, UGA, UAG) megjelenéséig ismétlődnek.Amikor a mRNS termináló kodonja kerül a riboszóma aminosav kötő helyéhez, akkor akodnak megfelelő valamelyik RF (release factor) fehérje kapcsolódik a riboszómához. (Azaminoglikozid antibiotikumok éppen ennek a faktornak a kapcsolódását akadályozzák.) Ha areakcióelegy nem tartalmaz aminoglikozid antibiotikumot akkor az RF fehérje hatására apeptidil transzferáz hidrolizálja az utolsó tRNS és a peptid lánc közötti észterkötést. Szabaddáválik az új fehérje, és ezzel egyidejűleg leválik az üres tRNS, majd szétesik a mRNS-ből,valamint a 30S és 50S riboszómából álló komplex. Ezek az alkatrészek ezután egy újabbiniciációs komplex képzésében vehetnek részt.184

Az aminoglikozid antibiotikumok az R-faktor kötődését akadályozva gátolják ariboszóma szétválását és ezáltal a fehérjeszintézist.Escherichia coli-ban egy 400–500 aminosavat tartalmazó peptidlánc 15-20 másodpercalatt készül el. Egy mRNS egyidőben 4-5 riboszómához kapcsolódhat általában 97nukleotídnyi távolságra. A mRNS életidejét működésben-létének köszönheti, mert ariboszómához kapcsolt mRNS védett a ribonukleáz lebontó hatása ellen. Ezért egy-egymRNS, általában 50 ciklust ér meg, ha folyamatosan szolgálatban van, azaz működőriboszómákkal van kapcsolatban.A készülo peptidláncmozgási lehetoségekapcsolódó szubsztituens kémiaiszerkezete határoz meg. A mellékeltábra bemutatja a peptid láncszerkezetéből következő kapcsolódásoklehetőségét. A peptid lötések (C=O ésH-N) kozött könnyen kialakulóhidrogén kötés segíti a fehérjelánconbelül kialakuló szerkezet létrejöttét.Az apoláros aminosavak (Ile, Val, Leu,Ala, Gly, Phe) jelemléte a fehérjemembránban való elhelyezkedését segíti.Poláros aminosavak bizonyos folyamatokbekövetkeztét segítik.A képződő peptid a riboszómárólletekeredve az aminosav sorrend általmeghatározott szerkezetű fehérjeként veszrészt a gazdaszervezet szükségletei általmeghatározott tevékenységben. Amásodlagos szerkezet kialakulásaszempontjából meghatározó jelentőségű adiszulfid kötések által rögzített állapot. Apeptidlánc számára peptidkötések között azegyes aminosavak α-szénatomja jelenti amozgási lehetőséget, amit ezen szénhezFehérje láncok között kialakuló kapcsolat lehetoségeI.Diszulfid kötés II.Hidrofób kötés III.Elektrosztatikus kötés V.Hidrogén kötésA ribiszómán képződő fehérje a primer szerkezet általmeghatározva, a célfeladatnak megfelelő másodlagosmorfológiai alakban teljesíti feladatát.A másodlagos szerkezet kialakulása szempontjábólmeghatározó jelentőségű a diszulfid kötések által rögzítettállapot.Az ábra a bakteriorodopszin aminosav szekvenciája általmeghatározott másodlagos szerkezet tétbeli formájátmutatja, feltüntetve azon aminosavakat, amelyek egyrészta retinál elhelyezkedése és működése szempontjábólnélkülözhetetlenek, másrészt a fehérje membránba valóelhelyezkedését segítik poláris voltukkal.185

MetHisA HEM –ethordozó membránfehérjékazapolárosaminosavaik miattnehezen vonhatókki tevékenységükszinhelyérőlHEM a hordozó fehérjébenhisztidin és metionin között,lazán kötodve muködikÉrdemes visszaidézni a penicillináz szerkezetét, amely eredetileg membránhoz kötve teljesítifeladatát. A Bacillus cereus esetében a kezdetben membránhoz kötődő enzim, a periplazmikustérben megjelenő proteáz hatására extracelluláris penicillinázként megjelenik akörnyezetben. Gazdaszervezet a hiányt fokozott enzimtermeléssel próbálja komprnzálni.Limitált proteolízisProteáz hatásMembránba rögzítő|apoláros szakasz| |***extracelluláris penicillináz****|H 2 N–Met–(Xxx) 15 –Ser–(Xxx) 22 –Glu–Ser–Lys–Thr–Glu–(Xxx) 258– Lys–COOH|O| foszfatídsavval acilezett szerin-OHHO–P=O|O–CH–CH–CH 2| | |H O O| |O=C C=O| |R R R = páratlan szénatom számú alkil láncok (foszfolipid zsírsav)A membránhoz kötődő penicillináz extracelluláris enzimmé válásának útja.186

AMINOSAV-ANYAGCSERE A CITOPLAZMÁBANAz aminosavak képződése a Krebs-cikluson keresztül, a köztes anyagcsere meghatározottterületein, gazdaságosságra törekedve folyik. A glutaminsav reduktív aminálással α-ketoglutársavból képződik. Az aszparaginsav a reverzibilisen működő glutaminsavoxálecetsav-transzaminázsegítségével képződik a szükséges mennyiségben.Nem véletlen, hogy az ammóniafelvételben kulcshelyzetben levőglutaminsav fordul elő legnagyobbmennyiségben a mikroszervezetsejtmentes kivonatában.A légkörből megkötött nitrogén isglutaminsav közvetítéssel jut azanyagcsere hálózatba.A szerin, a cisztein, a glicin és azalanin képződése a glicerinsavfoszfát,illetve a piruvátképződéséhez kötve, a körfolyamatjellegű működés miatt különösebbszabályozást nem igényel.Citrát-körhöz kapcsolódó aminosav képzodés (Glu, Asp)COOHCOOH| glutaminsav-dehidrogenáz |H-C-HH-C-H| NH 3 |H-C-HH-C-H| | +H 2 OC=O NAD(P)H NAD(P) + H-C-NH 2| |COOHCOOHglutaminsav + oxálecetsav ==========> aszparaginsav + α-ketoglutársavtranszaminázA központi szerepet betöltő aminosavak szabályozás nélküli képződésetranszaminázglicerinsav-3-foszfát G-2-P PEP piruvát glutamát oxálacetátNADH α-ketoglutarát aszpartáthidroxi-piruvát-3-foszfát foszfatázα-ketoglutarát glicin L-ciszteinGlicin(glikokoll)szerin-foszfát P i glioxilát transzamináz L-giutaminsavL-aszparaginsavacetil-CoA >>>>foszfatáz>>>>CoA-SH szerin glutamát α-ketoglutarátacetil-szerin piruvát alanintranszaminázH 2 S >>>>>>> >>>>>acetát H 2 ONH 3 + H 2 SdezaminázciszteinA glikolízishez kapcsolódószerinképződés keretébentörténik a foszfoglicerátdehidrogénezése, és atranszamináz működése.Végül a foszfatáz távolítjael a foszforsavmaradékot.187

Az igények szerint működő, szabályozatlan tioaminosavanyagcsereA környezetből felvehető aminosavak a mikroszervezet számára gazdaságosabb megoldástkínálnak, mint a teljes szintézis. Kizárólag fehérjét tartalmazó táptalajon (pl. húsleves) amikróba szénforrásként is hasznosítja az aminosavakat, amit jól igazol a a tápközegbenmegjelenő ammónia. Az aminosavfelvétel céljára jól működő trsanszportmechanizmusszolgál. A citoplazmában a fehérjeszintézis szempontjából életfontosságú optimális aminosavarányok kialakítása érdekében a felvett aminosavak egy része lebomlik, illetve átalakul. Egyegyaminosav feldúsulása ilyenkor a lebontó folyamatok katalizálására szolgáló specifikusenzimrendszerek képződését váltja ki.Aminosavfelvételre eddig kilencféle fehérjét találtak a mikrobákban. Sok esetben azaktív kötőhelyen a transzportfehérje lizin oldalláncának ε−aminocsoportjához kapcsolódópiridoxál-foszfátot találunk, amellyel az aminosav a transzport idejére Schiff-bázist alkot. Azérdekesség az, hogy olyan mikroorganizmusok membránjában is előfordulnak ezek a fehérjék,amelyek a természetes élőhelyükön sohasem találkoznak aminosavakkal. (például Thiobacillusneopolitanus) Az aminosav-felvételben résztvevő fehérjék specifitása meglehetősen széles. Azelágazó szénláncú aminosavak (leucin, izoleucin, valin) felvételét például egyazontranszportmechanizmus biztosítja. A membránban előforduló, ilyen feladatot ellátó rendszerekteljesítőképessége bőven kielégíti a fehérjeszintézis igényeit, mivel rövidebb oligopeptidekfelvételét is segíteni tudják. Természetes körülmények között nem fordulhat elő afehérjeszintézis leállása aminosav hiány miatt, ha a környezetben felvehető aminosav van.188

AMINOSAVFELVÉTEL A KÖRNYEZETBŐL piridoxál-foszfát jelenlétében(B 6 vitamin piridoxin)k ü l s ő t é rCOOH|R – C –H|NH 2H – C = O|C/ \\ H 2 O 3 P-O-CH 2 -C C – OHNH | |/ H-C C-CH 3H-C=N-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -C-Hpiridoxálfoszfát| \ NCC=OH 2 O 3 P-O-CH 2 -C C-OH /| | transzportfehérjeH-C C-CH 3Nm e m b r á nO| |C \R- C-H O − NH| : /N H 3 N + -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -C-H lizin| | \H– C C=O| /CH 2 O 3 P-O-CH 2 -C C-OH transzportfehérje| |H-C C-CH 3NR —-CH—- COOH|NH 2c i t o p l a z m aA felvételre szolgáló membrán fehérjék specifikusak ugyan, de műkodásüket a kötnyezetaminosavtartalma, az arányok eltolódása befolyásolhatja a felvételt, a pool aminosavtartalmátHa valamelyik aminosav transzportmechanizmusa genetikailag sérült, akkor a kazamin,tripkazin (részlegesen hidrolizált kazein) vagy pepton előnyösebben használhatótáptalajalkotóként, mert a benne előforduló oligopeptidek valamelyike nagy valószínűséggeltartalmazza azt az aminosavat, amelynek a transzportmechanizmusa esetleg nem működik. Azoligopeptideket a terminális aminosavra specifikus transzferrendszerek segítik át a membránon.Laboratóriumi körülmények között gyakran a transzportmechanizmusok spektrumánakszélességéből következő kompetitíven gátló jelenségek észlelhetők. — Nagy mennyiségűargininnel például sikerrel lehet akadályozni a lizin felvételét.189

A gombák exponenciális növekedési fázisában képződő tripeptid, a γ-glutamil-ciszteinil-glicin(a glutation) ATP igényes szereplő az aminosav-felvételben. — A membránhoz kötött γ-glutamil transzferáz átsegíti a membránon a környezetben előforduló aminosavakat (rövidpeptideket) γ-glutamil-származékként.– A citoplazmában széteső tripeptid (a glutation)reszintézise ATP igényes.MembránaminosavcitoplazmaATPADPγ-glutamil-aminosav5-oxoprolimciszteinil-glicinATPAminosavmembránhoz kötöttγ−glutamil transzferázADP + P iglutaminsavKöenyezetGLUTATIONglicin, cisztein ATPATPADP + P iADP + P iγ-glutamil-cisztein190

xxxxCISZTEIN KÉPZŐDÉS METIONIN SEGÍTSÉGÉVELmetionin >>>>> S-adenozilmetionin >>>> metiltranszferáz >>> homocisztein >>> cisztation >>> ciszteinA rendszer akadályozza a cisztein tűlprodukciót. – Megjegyzendő, hogy a metil csoport átviteléhezsszükséges acobalamin jelenléte!Az aminosavakat aktiváló enzimek csekély szintű szubsztrátspecifitása csak meghatározottösszetételű aminosav készlet [pool] esetén tudja biztosítani a tRNS állomány helyes feltöltését.A koncentrációviszonyok, az arányok bármilyen okból bekövetkező eltolódása, hibás tRNSfeltöltést és ennek következményeként hibás, működésképtelen fehérjék szintézisét okozhatja.Nem meglepő tehát, hogy a bioszintézis és a lebontás szabályozottságának bonyolultan, deeredményesen működő mechanizmusa alakult ki az evolúció folyamán. A fölöslegesaminosavak eltávolítása a zavartalan fehérjeszintézis szempontjából ugyanannyira létkérdés a191

mikroba számára, mint a teljes értékű fehérje felépítéséhez szükséges építőelemek (aminosavpool) minőségi és mennyiségi szempontból optimális szinten tartása.A fehérjeszintézishez szükséges aminosavak előállítására a természetben előforduló,úgynevezett vad törzsek általában képesek. Ez a bioszintézis a citoplazmában — a szénhidrátanyagcsere köztes termékeit hasznosítva — nem csekély energia befektetésével, illetveanyagfelhasználással, szigorúan szabályozott körülmények között folyik.Az aminosav készlet optimális minőségi és mennyiségi összetételét a bioszintézis elsőreakcióját katalizáló enzimekre ható visszacsatoló (feed-back) mechanizmus szabályozza.Szükség szerint gátolva vagy serkentve működésüket finoman képes szabályozni a metabolitkéntfelhasználásra kerülő aminosavak koncentrációját, megakadályozni azok túltermelődését. Afehérjeszintézis biztonságát szolgálja a szabályozást finomító második rendszer (attenuátor)működése, amely a feltöltött tRNS mennyiségének függvényében, kellő pontossággal engedélyezia bioszintézisben érdekelt gének anyag- és energiaigényes átírását. A végtermékhiányában, a represszor eltávolításával (derepresszió) a mikroba a struktúrgének átírásának engedélyezésévela bioszintézisben résztvevő enzimek mennyiségét a szükségletnek megfelelőenszabályozza.Áttételesen a lizin, a treonin, a metionin, a valin, az izoleucin, a leucin, az ornitin, az arginin, acitrullin, a prolin, az aszparagin és a glutamin szintézise a központi szerepet betöltő Krebsciklushoz kapcsolódik. Ez a folyamat szolgáltatja a két amino-dikarbonsavat, a glutamin savat ésaz aszparagin savat, valamint az alanint, de innen indul a porfirin-származékok szintézise isfüggetlenül a körfolyamat oxidáló, illetve redukáló irányától. A szukcinil-CoA glikokoll reakcióa δ-aminolevulinsav képződésen keresztül segíti a porfobilinogénből képződő életfontosságúvegyületek megjelenését. (Hem, klorofill, kobalamn, etc.)A citrát ciklus nemcsakkiinduló pontként illeszkedikaz aminosavanyagcseréhez,de a lebontás befejezőfeladatát is ellátja.Az aminosavanyagcsere rövidáttekintése keretében ezért abioszintézis mellett a lebontásútja is megismerhető. Ez atevékenység az aminosavpoolideális (arányos) koncentrációviszonyainak kialakulásátszolgáljaA bioszintázist ismertetendő az aszparagin-savból hat esszenciális aminosav képződik. Abonyolult elágazó rendszer enzim szinten, de a transzkripció szintjén is finoman szabályozottformában, izoenzimekkel, illetve az elágazó szénláncú aminosavak esetében közös enzimekkelbonyolított hálózat működtetésével oldja meg feladatát. A metionin két izoenzim az aszpartátkinázés a szerin-dehidrogenáz képződését szabályozza. Az aszpartát-kináz izoenzim szintéziséta lizin nem csak represszálja, de alloszterikusan is képes szabályozni.192

Esszenciális aminosavak aszpartátból induló bioszintézisének vázlata(Escherichia coli)AszpartátA bioszintézisét mutató vázlat jó példa[Tre] [Met] [Liz]a szabályozott hálózat működ ésére ADP[4] izoenzim képződését Tre gátolja aszpartil foszfát[5] izoenzim képződését Met gátolja>NADP +aszpartát-ß-félaldehid| − Liz] [ − Tre] [ − Met]

xxxxxxxxxxL-LIZINSZABÁLYO-ZOTT BIO-SZINTÉZISEÉS LEBOM-LÁSAA lizin képesrepresszálni abioszintézisértfelelősenzimeketkodoló mRNSképződését, devégtermékkéntis gátolja azazpartilfoszfátképződésértfelelősizoenzimműködését sótaz aszpartátfélaldehidtovábbalakulásátis gátolja.A lizin lebomlását az aminosavoxidáz is katalizálhatja, de járható a ketoglutaarát út is.Mindkettő a penámváz képződésért felelős amionoadipinsavfélaldehid szintézist segíti194

L-lizin bioszintézis az eukariótákbanAz eukarióta lizinanyagcserében is megtalálható a penám váz képződés szempontjábólnélkülőzhetetlen aminoadipinsav félaldehid köztestermék195

A METIONIN végtermék álta szabályozott képződéseTetrahidrofólsav ideális metilező ágensA folsav ptereidin gyürűje redukált állapotban szerepel a cobalamin jelenlét igénylő metilezőreakciókban.Metionin lebomlás Krebs ciklusig196

L-treonin szabályozott képződése és lebomlásaL-leucin szintéziseL-leucin lebomlása a Krebs ciklusigxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAmint az áttanulmányozott vázlatok mutatják az aminosav bioszintézist minden esetbenalloszterikusan szabályouzza a végtermék mennyisége197

L-valin szabályozott képződése és lebomlásaA ketosavak (piruvát, a-ketobutirát) kondenzációját azonos enzim végzi. A közös enzimműködését a valin alloszterikusan befolyásolja. Ez gyakran a valin érzékenységben jelentkezik.A növekedés gátlás oka végeredményben a kondenzáció gátlás okozta izoleucin hiány.L-izoleucin szabályozott képződése és lebomlásaxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx198

A leggyakoribb, legpozitívabb aminosav a guanidino csoportot hordozó arginin, amelyet ErnstSchultze izolált 1886-ban. A mRNS–en 6 bázishármas (CGA, CGU, CGC, CGG, AGA, AGG)kódolja. A pozitív töltés delokalizálódik mert a nitrogén atom szabad elektronpárja a szomszédkettős kötéssel konjugálódik.L-arginin képződésecitrullinbólL-aszpartát terhéreXxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxL-ornitin és L-citrullinszabályozott képződéseornitin karbamoilezésexxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx199

ARGININ, PROLIN lebomlása a Krebs ciklus irányában5-(2,4-diguanidino-3,5,6-trihydroxy-cyclohexoxy)- 4-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-methylamino-tetrahydropyran-2-yl] oxy-3-hydroxy-2-methyl-tetrahydrofuran-3-carbaldehydeSTREPTOMYCIN C 21 H 39 N 7 O 12 581,574 g/molUrea Karbamid |NH 2|O=C|NH 2Guanadin NH 2|C=N–H|NH 2200

AZ AROMÁS AMINOSAVBIOSZINTÉZIS SZABÁLYOZOTTSÁGA(L-triptofán előállítása )A reakciósor piacképes termékének tekinthető L-triptofán bioszintézisének és a szintézisútszabályozottságának felderítése a XX-ik század ötvenes éveiben folyó alapkutató munkaeredménye. A mikrobiális bioszintézis a pentóz-foszfát ciklusból leágazva, foszfo-2-keto-3-dezoxi-heptonát-aldoláz által katalizált reakcióval indul. A rendszer enzimszinten ésgénszinten szabályozva izo-enzimek felhasználásával teljesíti feladatát.A bioszintézis köztes termékeinek a képződése is feed-back szabályozás alatt áll, mert nem csakaz esszenciális aromás aminosavak szintézise, de egyes vitaminok (PAB, nikotinsav, etc.)képződése is innen ágazik el.A szabályozás finomítása céljával a foszfoenol-piroszőlősav és az eritróz-4-foszfátkondenzációját három izoenzim (foszfo-2-keto-3-dezoxi-heptonát aldoláz) katalizálja.Mindegyik aktivitását alloszterikusan valamelyik végtermék és egy köztes-termék, a prefénsav,illetve a tirozinérzékeny enzim esetében a korizminsav is befolyásolja. — Escherichia coli-banezt a feladatot három alloszterikusan szabályozott izoenzim látja el. Az egyik fenilalaninra ésprefénsavra, a másik triptofánra és korizminsavra érzékeny, a harmadik működését pedigtirozin és prefénsav gátolja.Az aromás bioszintézisút elsővégtermékek által szabályozottizoenzimek által katalizáltreakciója (Escherichia coli)a 3-DEZOXI-D-ARABINO-HEPTULONSAV-7-FOSZFÁTképződését segítiA második polivalensen szabályozott alloszterikus enzim a shikiminsav-dehidrogenáz,amelynek működését alloszterikusan négy ligandum, a tirozin, a fenilalanin, a korizminsav és aprefénsav befolyásolja.Az aromásbioszintézisúton ashikiminsav képződésétkatalizáló,shikimát dehidrogenázvégtermékek általtörténő szabályozása201

Az aromás aminosavak pentózfoszfát ciklusból leágazó, szabályozott bioszintézisét katalizálóreakciósort bemutató vázlaton jól követhető a teljes folyamatFOSZFO-ENOLPIRUVÁT + ERITRÓZ-4-FOSZFÁTfoszfo-2-keto-3-dezoxiheptonát-aldoláz [ – Phe] [ – Tir ] [ – Trp ][ – pref] [ – kor] [ – pref]3-DEZOXI-D-ARABINO-HEPTULONSAV-7-FOSZFÁTdehidrokvinát szintetázPi5-DEHIDROKVINÁT5-dehidrokvinát-dehidratázH 2 O3-DEHIDROSHIKIMINSAVNADPHshikimát dehidrogenáz [ – Phe][ – Tir][ – pref][ – kor]NADP +D-SHIKIMINSAVATPshikimát-kinázADPSHIKIMINSAV –FOSZFÁTpiruvil-shikimát-foszfát szintetáz P-E-P5-ENOLPIRUVIL--SHIKIMINSAV-3-FOSZFÁTkorizmát-szintetázPiKORIZMINSAVkorizmát mutázasszociátum{Glutaminantranilát szintetáz____trpE génGlutamát[ – Trp]Piruvát[ – pref] }asszociátumANTRANILÁTP-R-PP}asszociátum antranilát-foszforibozil-transzferáz___ trpD génPREFENSAVPP[ – Phe] N-(RIBOZIL-5'-FOSZFÁT-ANTRANILÁTNAD + [ – Tir] foszforibozil-antranilát izomerázH 2 OENOL-1-o-KARBOXIFENILAMINO-1-pref-dehidratáz pref-dehidrogenáz -DEZOXIRIBULÓZ-FOSZFÁTCO 2 NADH H 2 Oindol-3-glicerin-foszfát szintetáz trpC génCO 2 CO 2INDOL-3-GLICERIN-FOSZFÁTFENIL-PIRUVÁT p-HO-FENIL-PIRUVÁTL-SZERIN α-ketoglutarát L-FENILALANIN L-TIROZIN L-TRIPTOFÁN202

A szerkezeti képlet feltüntetése a tanulmányozó számára segítheti a folyamat követésétCH 2–OPO 3CH 2-OPO 3PEP + eritrózfoszfát Deox.arabino.hept.7-P DehidrokvinátCOOH O=C-H DAHPDehidrokvinátCH—CH 2OHCH 2 H-C-OH P I H-C OH CH| | szintetáz|szintetázC–OPO 3 H-C-OHH-C-OH O COOH|| || /+ || | NAD + NADH[Phe–, tir–, triptofán–](végtermék szabályozás)Enolpiruvinilsikimátszintetáz- 3-P Sikimát-kináz ATPCOOH|HC==C––CHP I| | COOHO 3PO–CH–CH–CH–O–C| ||OH CH 2Korizmát-szintetázp ICOOH|PEP HC==C––CH| |O 3PO–CH–CH–CH–OH|OHCOOH|HC==C––CH| |HO–CH–CH–CH–OH|OH-ShikimátDehidrogenázHO COOH\ /H 2C—C––CH 2| |O=CH–CH–CH–OH|Dehidrokvinát-dehidrázH 2OCOOH|HC==C––CH| |O=CH–CH–CH–OH|OHKORIZMÁT ANTRANILÁT FOSZFORIBOZILANTRANILÁTCOOHAntranil szintetáz COOH Antranilátfoszforibozil| | |HOOC OH OH|Gln Glu OH |HC–C==CH CH 2HC–C==C—NH 2 transzferáz HC=CH–C CH——CH|| | |||| |HC–CH–CH–O–C–COOHHC–CH=CHH 3C–CO–COOH|OH [Phe–][Tir–]Korizmát-mutázHOOC CH 2–CO–COOH\ /HC—C— CH|| ||HC—CH–CH|OHPrefenát-dehidrázH 2OCO 2HC-CH=C-CH 2-CO-COOH|| |HC–CH=CHFenilalanintranszaminázGlutamátα-ketoglutarátHC-CH=C-CH 2-CO-COOH|| |HC–CH=CHL-FENILALANINCO2PRPPPP I| || | |HC=CH–C–NH–CH–O–CH|CH 2OPO 3[Tri – ] (végtermékgátló)Foszforibozil-antranilát-izomerázHOOC OH OH OH| | | |Prefenát-dehidrogenázHC=CH–C C—–CH—CH| || || |HC=CH–C–NH– CH CH 2OPO 3NAD +NADHHC–CH=C–CH 2–CO–COOH|| |C–CH=CH|OHTirozin-transzaminázGlutamátα-ketoglutarátHC–CH=C–CH 2–CO–COOH|| |C–CH=CH|OHL-TIROZINtriptofánszintetázHC=O|H-C-OH|H 2-C-OPO 3Indolglicerofoszfát szintetázCO 2 H 2OOH OH| |HC–CH–C——–C—–CH—CH| || || |HC=CH–C–NH–CH CH 2OPO 3NH 2|HOCH 2–CH-COOHSZERINGAP L-TRIPTOFÁN NH 2|HC–CH–C——–C—–CH 2—CH| || || |HC=CH–C–NH–CH COOH203

Az összefoglaló vázlaton feltüntetett, és zavartalanul folyó bioszintézisút korizminsavnálelágazik. A korizmát szintetáz termékéből a prefénsav képződést két korizmát-mutáz izoenzimkatalizálja a két arómás aminosav, a fenilalanin és a tirozin szintézise irányába. Az egyikizoenzim fenilalaninra, a másik tirozinra érzékeny. Mindegyik asszociátumot képez amegfelelő aminosav szintézisét katalizáló következő enzimmel: a fenilalaninra érzékenyizoenzim a prefenát-dehidratázzal, a tirozinra érzékeny pedig a prefenát-dehidrogenázzalalkot komplexet. Az asszociátumok működését triptofán serkenti. Ez a hatás a kétaminosavnak a fehérjeszintézis szempontjából kedvező arányban való képződését segíti.Az aromás aminosavak szintézisét végző enzimrendszer a három aminosav hiányábannagy mennyiségben képződik. Csak az általuk termelt aminosavak felszaporodása csökkentiezen enzimek képződését. A fölös mennyiségben jelenlevő aminosav, esetünkben a triptofán arepresszor fehérjéhez, az pedig a triptofán operon promoter régiójához kötődvemegakadályozza az RNS-polimeráz működését. Ezzel a triptofán operonban kodolt enzimekszintézisét represszálja.korizmát-mutáz [ - pref]A fenilalanin és a tirozin szintézis utolsó lépését azonos enzim, egy transzamináz katalizálja.204

A triptofán finoman szabályozott képződésekorizminsavból két enzimből álló komplex, az antranilátszintetáz és az antranilát-foiszfo-ribozil-transzferázegyüttműködésével indul.A két alegységből álló antranilát szintetáz, szorosasszociátumot képez az ugyancsak két alegységből állóantranilát-foszforibozil-transzferáz-zal. Az antranilsavszintézishez nélkülözhetetlen glutaminkötőhely ugyaniscsak az ép asszociátumon alakul ki. A komplex azonbana képződött végtermék (triptofán) jelenlétében szétesik.Most kap feladatot a foszfo-ribozil-antranilát izomeráz,amely a foszforibozil-antranilsavból kialakítja az enol-1-o-karboxifenil-amino-1-deoxi-ribulóz foszfát szerkezetet.Ez utóbbit CO 2 és víz eltávolításával az indol-3-glicerolfoszfátszintetáz indol-glicerol-foszfáttá alakítja. Amintlátható létrejött az indolváz.Az utolsó enzimkatalizálta történést a négy alegységbőlálló triptofán-szintetáz katalizálja, amely az indolt aszerin harmadik szénatomjához kapcsolja egyglicerinaldehid-3-foszfát felszabadításával. Az indol-3-glicerol-foszfátból két gén terméke a trpA gén kodolta 2α alegység és a trpB kodolta β 2 (dimer) alegységekbőlálló triptofán szintetáz szerinre cseréli a glicerinaldehid3-foszfátot és így létre hozza azt L-triptofánt Aképződött termék érzékenysége a ß- szénatomhozkapcsolódó delokalizált elektronszerkezetű indoljelenlétével magyarázható205

Yanofsky és munkatársai a triptofán szintézisért felelős enzimek képződésének szabályozásimechanizmusát molekuláris biológiai szinten vizsgálva egy olyan új általános jellegűfelismerésre jutottak, amely az aminosavval töltött tRNS addig csak sejtett szabályozószerepének módjára magyarázatot adott. A triptofán szintetáz mRNS információ előtt egy 160bázis terjedelmű szabályozási feladatot ellátó attenuátor régiónak elnevezett szakasz található.Ennek a szakasznak az a feladata, hogy a promoter régiónak a represszor fehérje távoztávalbekövetkező felszabadulása után meginduló RNS-polimeráz működését megszakítsa azesetben, ha a triptofánnal töltött tRNS a fehérjeszintézis szempontjából még kielégítőkoncentrációban jelen van a rendszerben.A mRNS esetében a kódolt fehérjére vonatkozó információ előtt minden esetben ariboszómához kötődést biztosító szakasz található. A fehérje szintézise az eubaktériumoknálAUG kodonnal (formilmetioninnal) indul. A DNS-szálon akár egy génen belül is egyidejűlegtöbb RNS-polimeráz is működhet, sőt az enzimről folyamatosan letekeredve képződő mRNSfonalakonkörülbelül 40 bázisnyi távolságban már megindul a fehérjeszintézis. Ebből azkövetkezik, hogy meglehetősen kis területen egyidejűleg.változatos biokémiai reakciók (RNS ill.fehérje-szintézis) tömege folyik. Ezt a lehetőséget használja ki az élő szervezet az aminoacilezetttRNS szabályozó szerepének a megjelenítésére. Ennek keretében a promoter régión kötődőRNS-polimeráz, az operátorhoz kötődő represszor fehérje távoztával elindulhat a struktúrgénirányába. Az RNS-polimeráz működése azonban megszakad akkor, ha a megfelelő aminoaciltRNSa fehérjeszintézis szempontjából szükséges koncentrációban jelen van a mikrobasejtben.Az első vázlat a triptofán represszáló hatását ábrázolja. A triptofánnal terhelt represszoraz operátor régióhoz kötődve akadályozza az RNSpolimeráz működését.______________________________________________________________________I promoter I operátor I attenuátor I trpE gén I trpD gén I trpC gén I trpB gén I trpA gén I|----------------represszor --------------|-------------|-------------|------------| ------------|------------|-RNS > triptofánpolimeráz (korepresszor)A második vázlat a derepresszió jelenségét ábrázolja. Triptofán hiányában a korepresszor(esetünkben triptofán) nélküli represszor fehérje lemozdul az operátorról. Ennek következtébenelindulhat a transzlációs folyamat. Az RNS polimeráz elindul a struktúrgének felé. Közbe__________________________________________________________________________I promoter I operátor I attenuátor I trpE gén I trpD gén I trpC gén I trpB gén I trpA gén I-|----------------|------------|--------------|------------ |-------------|------------|------------|-------------|--RNSpolimeráz ---->represszor truktúrgének: E = antranilát-szintetázD = antranilát-transzferázC = IGP-transzferázB = triptofán-szintetáz BA = triptofán-szintetáz Atalálja azonban vezérpeptid információ tartalmát, aminek átírása után folytatja tevékenységét astruktúrgének irányába, Az egyre növekedő RNS-hez tapadva a riboszóma, a szükségesacilezett tRNS jelenlétében megkezdi a vezérpeptid szintézisét. Siker esetén a képződő RNSszálon történő komplememt képzés az RNS-polimeráz eltávolítását okozó termináló hurokképződését okozza. — trip-tRNS hiányában a vezérpeptid szintézise leáll, az RNS-polimerázpedig zavartalanul folytathatja útját a struktúrgének irányába.206

A triptofán operon átírását befolyásoló attenuátor régiószabályozó szerepeMet Lys Ala Ile Phe Val Leu LyspppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAriboszómakötő szakasz G GG lU yAUAAGAGAUUAAACAAGUUUUUUUU - ACCCAUAGACUAACGAAAUGCGUA - U TA C - G C - G rC G - C C - G pA G - C A - U TA G - C C - G rU C - G U–U G pG G - C A C AC G - C U G rA A U G - C gA U–A–A U - A TA ez a komplementer bázisok által stabilizált termináló G - C hC hurok leszorítja a σ faktor nélküli RNS-polimerázt a templátról A - U rA C U SCAAAAACCGACUCUCUCGAACUGCUG...... G - C eezért a triptofán-szintetáz struktúrfehérje génjei nem íródnak át G - C rG UC GA–A–AMet Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys GlypppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUriboszómakötő szakaszUACGAAAUGCGU GA A GUCAGA - UUCACC UU - AGTrp-tRNS hiány miatt a vezérpeptid képződése az UGG kódnál A - U Gleáll, a polimeráz a komplementer kötések átrendeződése miatt C - G Czavartalanul tovább haladva megkezdheti a triptofán-szintetáz C U Gstruktúrgén átírását C - G CA A AG - CCC - GUC - GUC - GCAAUAAGAGAUUAAACAAGUUUUUUUUCGGGCGAGUAAUCCG – C–A–1–A–A–G–U–CCA Met Gln Thr ....AAUGCAAACACAAAAACCGACUCUCUCGAACUGCUG......Elkezdődik a struktúrgének információja előtt elhelyezkedő attenuátor szakaszon kódolt rövidvezérfehérje szintézise. A vezérpeptid információja a promoter régiót követő rövid riboszómakötőszakasz után, a szokásos AUG kodonnal kezdődik és UGA kóddal végződik. AzRNS-polimeráz által szintetizált mRNS-láncon, amelynek szekvenciája több komplementerszakaszt is tartalmaz, a polimerázt 40 bázisnyira követve folyik a vezérfehérje képződése. A kétszintézis (mRNS-képződés és peptidszintézis) közel azonos sebességgel folyik. A vezérpeptidtől30 bázisnyi távolságra, jóval a struktúrgéneket iniciáló kodon elött található az a terminálóhurok, amely képes lenyomni a σ-faktor nélküli, lazán kötődő polimerázt a templátjáról. Atermináló hurok azonban, csak az esetben alakulhat ki, ha a vezérpeptid szintézise zavartalanulmegtörténik. Az RNS-polimeráz tehát leválik az operonról és σ-faktorral kiegészülve újra kezdiműködését a promoter szakasznál. Az anyagveszteség csekély, mert a jelenlevő proteázok a207

funkció nélküli vezérpeptidet lebontják, és az aminosavak visszakerülnek a bioszintetikusfolyamatba. Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, deszekvenciájában közvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos aránybankülönösen nagy gyakoriságot jelent, mivel a prokariotákban általában 100 aminosavra jut egytriptofán.A vezérfehérje gén a triptofán szintézist katalizáló struktúr gének előtt találhatóHa azonban triptofánnal töltött tRNS hiányában megakad a vezérfehérje képződése, akkor avezérszekvencia bázissorrendjében levő komplementer szakaszok által létrehívott újpárkapcsolat kialakulása (73-84 és 108-119 bázisok között) nem engedi kialakulni a terminálóhurkot. Ennek következményeként a polimeráz a kritikus szakaszon tovább haladhat astruktúrgének AUG kezdő kodonja felé. Hamarosan megkezdi az illetékes aminosav képződésétkatalizáló enzimek, ez esetben a triptofán-operonba szerveződött struktúrgének átírását, a mRNSszintézisét.Amikor a végtermék által(feed-back) szabályozott,triptofánt szintetizálórendszer aktív tevékenységea vezérpeptid szintéziséhezelegendő triptofanil-tRNSszintet állít be, a struktúrgénektovábbi átírásamegszűnik.208

A termináló hurok acilezetttrptRNS jelenlétében leválasztja aképződő RNS molekulát és ezzelbefejeződik az RNS-polimeráztevékenységeTriptofán hiány esetében akorepresszor (esetünkben triptofán)nélküli represszor fehérje lemozdulaz operátorról. Így elindulhat azRNS-polimeráz a struktúrgénekfelé. Hamarosan megindul atranszlációs folyamat. Elkezdődik astruktúrgének információja előttelhelyezkedő attenuátor szakaszonkódolt rövid vezérfehérjeszintézise. A vezérpeptid információja a promoter régiót követő rövid riboszómakötő szakaszután, a szokásos AUG kodonnal kezdődik és UGA kóddal végződik. Az RNS-polimeráz általszintetizált mRNS- láncon, amelynek szekvenciája több komplementer szakaszt is tartalmaz, apolimerázt 40 bázisnyira követve folyik a vezérfehérje képződése. A két szintézis (a mRNS- és apeptidszintézis) közel azonos sebességgel folyik. A vezérpeptidtől 30 bázis távolságra, jóval astruktúrgéneket iniciáló kodon előtt található az a termináló hurok, amely képes lenyomni a σ-faktor nélküli, lazán kötődő polimerázt a templátjáról. A termináló hurok azonban, csak azesetben alakulhat ki, ha a vezérpeptid szintézise zavartalanul megtörténik. Az RNS-polimeráztehát leválik az operonról és σ-faktorral kiegészülve újra kezdi működését a promoterszakasznál. Az anyagveszteség csekély, mert a jelenlevő proteázok a funkció nélkülivezérpeptidet lebontják, és az aminosavak visszakerülnek a bioszintetikus folyamatba. Triptofánesetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de szekvenciájában közvetlenülegymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban különösen nagy gyakoriságotjelent, mivel a prokariontákban általában 100 aminosavra esik egy triptofán.Ha azonban triptofánnal töltött tRNS hiányában megakad a vezérfehérje képződése,akkor a vezérszekvencia bázissorrendjében levő komplementer szakaszok által létrejött újpárkapcsolat nem engedi kialakulni a termináló hurkot. Ennek következményeként a polimeráz akritikus szakaszon tovább haladhat a struktúrgének kezdő kodonja felé. Hamarosan megkezdi azilletékes aminosav képződését katalizáló enzimek, ez esetben a triptofán-operonba szerveződöttstruktúrgének átírását, a mRNS szintézisét. — Amikor a végtermék által (feed-back)szabályozott, triptofánt szintetizáló rendszer aktív tevékenysége a vezérpeptid szintéziséhezelegendő triptofanil-tRNS szintet állít be, a struktúrgének további átírása megszűnik..209

Hasonló szabályozó rendszer irányítja a többi aminosav szintézisét katalizáló enzimekstruktúrgénjeinek átírását is. Az aminosavbioszintézist végző enzimek struktúrgénjeinek átírásátbefolyásoló úgynevezett VEZÉR-PEPTIDEK SZERKEZETE:Triptofán szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezeteMet-Lys-Ala- Ile-Phe-Val-Leu--Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-SerHisztidin szintézis enzimeinek képződését akadályozó_vezérpeptid szerkezeteMet-Thr-Arg-Val-Gln-Phe-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Pro-AspFenilalanin szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezeteMet-Lys-His-Ile-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe-Phe-Thr-Phe-ProTreonin és Izoleucuin szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezeteMet-Lys-Arg-Ile-Ser-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Thr-Ile-Thr-Ile-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly*(A vastagítás jelzi a szabályozást végző aminósavval acilezett tRNS ügydöntő szerepét)A vezérpeptidek kémiai szerkezetében az illetékes aminosav több példányban szerepel.Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de szekvenciájábanközvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban különösen nagygyakoriságot jelent, mivel a prokariótákban általában 100 aminosavra esik egy triptofán.Hisztidin esetében 7 szomszédos kodon igényel feltöltött hisztidil-tRNS-t.A fenilalanin-szintézis enzimeinek képződését szabályozó vezérfehérje 7 fenilalanil-tRNSjelenlétét igényli az RNS-polimeráz leválasztásához.Figyelemre méltó a treonin és az izoleucin struktúrgénjeinek átírását szabályozó vezérpeptidszerkezete, amely alternáltan 8 treonin és 4 izoleucinal feltöltött tRNS-t igényel. Ez esetbentehát a treonin és az izoleucin szintézist katalizáló enzimek génjeinek átírását csak azizolucinnal, illetve treoninnal töltött tRNS jelenléte akadályozhatja meg. Ha mindkétaminosavval feltöltött tRNS jelen van a rendszerben.Az ismertetett átírás mechanizmusát több antibiotikum képes gátolni. Az ansaláncú rifamicinszármazék,például rifampicin az RNS polimeráz ß-láncához kötődve akadályozza az RNSszintézismegindulását. A citosztatikus hatású antibiotikumok közé sorolt actinomycin-D aDNS-bázispárok közé ékelődve akadályozza a kettős spirál fellazulását, a két szál szétválását,végeredményben az RNS szintézisét. Megjegyzendő, hogy ez az antibiotikum a DNSreplikációtcsak nagyobb koncentrációban alkalmazva képes gátolni, mivel a helikáz nagyobbenergiával lazítja fel a dupla spirál bázispárjait, mint az RNS-polimeráz. Mindezt felülszabályozza a szuperfeltekeredett állapot lazítását végző DNS-giráz működése, amit anovobiocin antibiotikum, illetve a magnézium kötő kinolon származék, a széles spektrumuciprofloxacin befolyásol.Az optimális aminosav szint fenntartására szolgáló komplex rendszer elemei az élő sejtben:1, a környezetből történő aminosav felvétel transzportmechanizmusa,2, attenuáltan szabályozott, mRNS képződés által befolyásolt enzimállomány,3, alloszterikusan ellenőrzött bioszintézis (feed-back),4, derepresszálható, katabolikusan represszált lebontó rendszer (C és N hiány).A bioszintézisben nélkülözhetetlen enzimek sérülése vagy elvesztése a mikroba aminosavigényeként jelentkezik. Ezek a hiánymutánsok (auxotróf törzsek) jól használhatók a mikrobiálisgenetikai munkákban. A szabályozási mechanizmust érintő genetikai beavatkozással, bizonyosenzimek működésének akadályozásával vagy éppen bizonyos utak serkentésével egy-egyaminosav előállítására gazdaságosan használható mutánsok nyerhetők. Ilyen genetikailag hibástörzsek képességeit glutaminsav, lizin, fenilalanin, triptofán, treonin, izoleucin ipari előállításárahasznosítják.210

ELJÁRÁSOK TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSÁRATriptofán szintézis L-szerinből és indolból.L-szertinből és indolból a triptofán szintetáz aktivitást hasznosítva gazdaságosan lehet nyerniezt az esszenciális aminosavat. A triptofán-szintetáz (EC. 4.2.1.20) minden prototrófmikroorganizmusban előfordul a triptofán bioszintézist végző reakciósor utolsó tagjaként. AzEscherichia coli-ban ez az enzim 140.000 móltömegű piridoxálfoszfát kofaktorral működőtetramer. Két α alegységből és egy β 2 dimerből épül fel. Az érintetlen tetramer komplex invivo az indol-3-glicerol-foszfátból és az L-szerinből L-triptofánt és glicerinaldehid-3-foszfátotalakít. A tetramerből könnyen kiszakadó α alegység az indol-3-glicerol-foszfát szétesésétkatalizálja indolra és glicerinaldehid-3-foszfátra. A β 2 dimer az indolból és L szerinből történőtriptofán szintézist katalizálja, de elősegíti a szerin bomlását piruvátra és ammóniára. Atetramer enzim előállítására alkalmas törzset a triptofánigényes mutánsok közül célszerűkiválasztani. Triptofán-limitáció körülményei között növekedő tenyészetben várható abioszintézisben érdekelt enzimrendszer derepressziója. Miles Escherichia coli-B-bőlelőállított mutánsában az oldható fehérje 16 %-át tette ki ez a fehérje. A sejtekben képződöttenzim nem csak triptofán előállítására, de különböző triptofán analógok szintézisére is sikerrelhasználható. Az enzimstabilitása és aktivitásanagyobb mint a tisztítottformában kinyert β 2 dimeré.Növeli az enzim aktivitását,piridoxál-5-foszfát adagolásaa reakcióelegybe. A mellékeltábrán jóül küvethető a P-5-Pszerepe a kvinoidális köztestereméken keresztül vezetőreakcióban.A triptofán szintetázt nagyhasználható triptofán előállítására.mértékben termelő, triptofánelőállítására alkalmas törzsolyan fenilalanin – és tirozin –igényes mutáns, amely5-metiltriptofán,6-fluor triptofán,4-metil-triptofán,p-fluor-fenilalanin,p-amino-fenilalanintriptofán-hidroxamátjelenlétében is képes nöni,tehát ezekre rezisztens.Az enzimkomplex az elöltsejtbe glutárdialdehiddelrögzíthető és bioreaktorbankét hét felezési idővel211

A termelő törzs kiválasztásakor fontos szempont a szerin szintézis színvonala. Szénforráskénta megvalósított eljárásokban glükózon kívül glicerin, alkohol, növényi olaj azaz zsírsav isszámításba jöhet. A különbség a regenerálandó kofaktorok mennyiségében szembetűnő. Atechnológiai paraméterek optimálása éppen ezt az élettani feladatot van hivatva megoldani.1 / 2 glükóz +NH 3 + 2 NAD + szerin + 2 NADH + 2 H +glicerin + NH 3 + 2 NAD + szerin + 2 NADH + 2 H +zsírsav + NH 3 + 3 FAD + 3 NAD + szerin + 3 FADH + 3 NADH + 3 H +2etanol+NH 3 +ATP+FAD+3NAD + +2NADP + szerin+ADP+FADH 2 +3NADH+2NADPHA szerin bioszintézis látszólag szabályozatlanul folyik, mivel élettani szempontból ez azaminosav központi szerepet játszik az anyagcserében. Bioszintézise a glikolízis köztestermékéből a glicerinsav-3-foszfátból indul 2-keto-3-foszfo-glicerinsavon és foszfo-szerinenkeresztül, de képződhet C 1 töredék felhasználásával glycinből is. A glicerinsav-3-foszfáthexózból, pentózból, triózból származhat, de a Krebs-ciklusban fontos szerepet játszóoxálecetsavból a glükoneogenezis lépéseit hasznosítva is képződhet.Szerin szintézisglicerin>ADP NAD +glükózADPglükóz-6-foszfátfruktóz-6-foszfát>ADPfruktóz-1,6-biszfoszfátNADHα-glicerinfoszfát dihidroxi-aceton-foszfát Glicerinaldehid-3-foszfátNAD + >>>>>> P iNADH >>>> NADPH CO 2 Pi> NADH H 2 C-OHacetaldehid

megjelenését eredményezheti. A derepresszált mutáns előállítására egyszerű lehetőségadódik, mert a tRNS aciláz a szubsztrátspecifitásának függvényében a sejten belül kialakulókoncentrációviszonyoktól függő mértékben az aminosav analóggal tölti fel a tRNS-t. Ennek aza következménye, hogy a sejtfehérje olyan arányban tartalmazza az aminosav analógot,amilyen arányban a tRNS aciláz tévedett. Élettani következményként az elkészült hibásfehérjék arányában az egyed életképessége akár a teljes életképtelenségig csökkenhet.Nagyszámú egyed között - mutagénekkel való kezeléssel fokozható mértékben -előfordulhatnak olyan változatok (variánsok), amelyek nagyobb mennyiségben termelve atermészetes aminosavat, kompetitiven kiszorítják az analógot az acilezési reakcióból, azaz anövekedést gátló aminosav analóg jelenlétében is képesek növekedni. A túltermelésnekkülönböző oka lehet. Adott esetben a bioszintézisben érdekelt enzimek képződnek nagyobbmennyiségben, tehát konstitutívan derepresszált mutánsokká váltak.Más esetben a szabályozási mechanizmus hibájával, a feed-back érzékenység elvesztéséveltalálkozunk.A központi szerepet betöltő aminosavak szabályozás nélküli képződésetranszaminázglicerinsav-3-foszfát G-2-P PEP piruvát glutamát oxálacetátNADH α-ketoglutarát aszpartáthidroxi-piruvát-3-foszfát foszfatázα-ketoglutarátglicinszerin-foszfát P i glioxilát transzaminázacetil-CoA >>>>foszfatáz>>>>CoA-SH L-SZERIN glutamát α-ketoglutarátacetil-szerin piruvát alanintranszaminázH 2 S >>>>>>> >>>>>acetát H 2 ONH 3 + H 2 Sdezaminázcisztein213

Triptofán szintézisre használható a reverzbilisen működő triptofanáz (EC. 4.1.99.1.)amely természetes körülmények között – egyes baktériumokra jellemzően – a triptofánlebontására szolgál. (E. coli indol+ , Klebsiella ndol– , Salmonella indol–, Edwardsiella indol+ ,Providencia indol+ viszont a Proteus és a Shigella lehet indol+ , illetve ndol– is)indol + piruvát + ammónia ——> triptofán + vízEz a reakció végeredményben abaktériumokban előforduló jól ismertkatabolikus α,β-eliminációs reakcióvisszafordítása. Nakazawa (1972) Proteusrettgeri tenyészetét használtaenzimforrásként. A katabolikus enzimképződését nem csak a könnyenmetabolizálható szénforrás, de anitrogénforrás is represszálja. A promoterrégióhoz kötődő aktív glutamin szintetáz ésegy speciális fehérje komplexe serkenti azRNS polimeráz aktivitását az esetben, haegyidejűleg a cAMP-CAP komplex is jelenvan. A glutamin-szintetáz 12 alegységbőlálló óriás enzimkomplex, amelynekműködését glikokoll, alanin, triptofán, hisztidin, karbamoil-foszfát, glükózamin, citidiltrifoszfát,és adenilsavmultivalensen gátolja. Teljeseninaktív állapotban mindenalegységének tirozil oldalláncaadenilsavval van acilezve. A fentiaminonitrogént tartalmazóvegyületek limitált mennyiségbenvaló jelenléte a tápközegbenelőnyösen hat a nitrogénkatabolikusenzim képződésére. Szénhidrátbanés egyéb nitrogénforrásban szegénytáptalajon az enzim képződéséttriptofánnal indukálni lehet. Arekció közben felszabaduló indol azonban gátolja a baktérium növekedését. A gátló hatáspolyoxietilén-alkil-fenoléter adagolásával védhető ki. Ez a detergens mikrocseppekbe zárvamegköti a felszabaduló indolt. Ílyen körülmények között növekedő baktérium oldhatófehérjetartalmának 6 %-a triptofanáz.A kifejlődött tenyészetből elkülönített sejtekhez literenként 80 g nátrium-piruvátot, 80 gammónium-acetátot, 10 mg piridoxál-5-foszfátot, 1 g nátrium-szulfátot és 100 ml metanolbanoldott 60 g indolt adva enyhén alkalikus (8,8 pH) körülmények között, 34 o C-on keverve, kétnap alatt 75 g triptofán képződik. Az egyensúlyi reakciót teljessé lehet tenni, ha areakcióelegyből a triptofánt kivonjuk, például inozinnal, ami a képződő triptofánnalvízoldhatatlan komplexet ad. Az eljárást sikerrel használják triptofán analógok, például 5-hidroxitriptofán előállításra.214

L-TRIPTOFÁN NYERÉSE RACÉM HIDANTOIN SZÁRMAZÉKBÓLA teljességre törekedve nem hagyható figyelmen kívül egy bakteriális enzim a hidantoinázipari alkalmazása L-triptofán előállítására. Ez az 5-hidroximetil-hidantoinnal indukálhatóenzim (Sano. 1977. Agric. Biol.Chem. 41:819) a racém indolil-metil-hidantoinból elsőlépésben az L-triptofán N-karbamoil származékát állítja elő, majd második lépésként távolítjael a karbamoil csoportot. Az átalakítandó szubsztrátum gyakorlatilag teljes mértékbeneladható termékké alakítható, mert az indolil-metil-hidantoin 8-9 pH tartományban spontánracemizálódik. Az indukált baktériumsejtek membránjának átjárhatóságát a reakcióelegyhezadott toluol fokozza, de az elegy baktériumos fertőződését is megakadályozza.H H O H H| | || | |H–C=C–C——C– CH 2 − C– C – N-H H–C=C–C——C—CH 2 —C— COOH| || || | | | || || |H–C=C–C–N–C-H H-N —– C=O H–C=C–C–N– C–H H–N—C=O| | | | |H H Η 2 Ο H H NH 2hidantoinázN-karbamoil-L-triptofánrac-indolilmetil-hidantoinformamidpH = 9 D-indolilmetil-hidantoin L-triptofánBioszintézis prekurzorok felhasználásával. Az egyik jól ismert módszer antranilsavadagolással valósítható meg. Ez esetben az antranilsav adagolás a triptofánra érzékenyalloszterikusan feed-back szabályozott reakciót kerüli meg, ha a másik szubsztrátum az 5-foszforibozil-1-pirofoszfát kellő mennyiségben rendelkezésre áll. Ilyen eljárásokat dolgoztakki Hansenula anomala, Candida utilis, Bacillus subtilis antranilsav auxotróf törzseithasználva. A növekedő szakasz után kezdődik az antranilsavat tartalmazó tápoldat adagolásvigyázva arra, hogy az antranilsav szint 0,5 % alatt maradjon.sejt tömeg+ oL-triptofánA táptalaj összetétele (H. anomala)o5 % glükóz0,3 % ammónium-nitrát 50g -- o 5g --0,05 % káliumdihidrogén-foszfát o0,2 % dinátriumhidro-foszfát + o + ++0,1 % nátriumdihidrogén-foszfáto+0.05 % magnézium-szulfáto+0,01 % nátrium-klorido o+0,001 % ferro-szulfáto+0,1 % élesztőkivonato+2 % kalcium-karbonáto+0,2 % antranilsav induláskor,omajd naponta adagolva24 48 72 96 120 ho215

L-TRIPTOFÁN BIOSZINTÉZIS SZÉNHIDRÁTBÓL ÉS AMMÓNIÁBÓL.Leggazdaságosabb előállítási módja a mutánsok felhasználásával végzendő teljes bioszitézis.Az iparilag használható mutáns előállításához az eddigi tapasztalatok alalpján aCorynebacterium glutamicum vad törzsből indulva fenilalanint és tirozint igénylő, kétszeresenauxotróf korizmát-mutáz hiányos törzset izoláltak. Ez a törzs limitált fenilalanin és tirozinjelenlétében tenyésztve képes volt csekély mértékben triptofánt termelni, mivel a felszaporodókorizminsav továbbalakulását nem tudta megakadályozni a triptofánra érzékeny,alloszterikusan szabályozható antranilát szintetáz. A következő feladat éppen a feed-backmechanizmus hatástalanítása volt.Ennek a feladatnak a teljesítéseérdekében egymás után végzettműveletekben 5-metil-triptofánnal,5 fluor-triptofánnal, 4-metiltriptofánnalés triptofánhidroxamáttalszemben rezisztensmutánsokat izoláltak. Ezek közülválasztották ki a jobban termelőketés azokkal végezték tovább aklasszikus genetikai tevékenységet,az előállított mutánsok vizsgálatát.Ezek között a triptofán analógra rezisztens Tir − Phe − mutánsok legjobbjai már 0,5% triptofánttermeltek mélyfermentációs körülmények között. Logikailag várható, hogy fokozódik atriptofán termelés, ha a fenilalanin és tirozin érzékeny alloszterikus enzimek feed-backérzékenységét is sikerül megszüntetni. A további genetikai beavatkozásokban p-fluorfenilalaninra,majd p-amino-fenilalaninra rezisztens mutánsokat állítottak elő. Végül tirozinhidroxamátra,illetve fenilalanin-hidroxamátra rezisztens módosulatokat választottak ki.Szisztematikusan mindíg a legjobbnak látszó mutánssal végezték a következő genetikaimódosítást. — A munka eredményeként olyan genetikailag stabilnak tekinthető törzshözjutottak, amely 12 g triptofán/liter termelésére volt képes. A táptalaj 10 % redukáló cukrot, 2% ammónium-szulfátot, 1 % kukoricalekvárt és 2 % kalcium-karbonátot tartalmazott. Amutáns triptofán termelőképessége ezen kezelések ellenére sem vesztette el teljesen afenilalanin és tirozin érzékenységét. A technológia kialakításakor ezen két aminosav aktuáliskoncentrációját a táptalajban analitikai mérésekkel limitáló szintre kell beállítani.Aminosav forrásként előnyösen használható a szójafehérje hidrolízátuma fenilalaninkiegészítéssel. A két aromás aminosav egymáshoz viszonyított arányának meg kell egyezni amutáns fehérje-összetételében mért aránnyal. A táptalaj szuboptimális aromás aminosavtartalma meghatározó jelentőségű. Ettől való eltérés lefelé elmaradást okoz a növekedésben,felfelé pedig a triptofán termelés csökkenésével jár. A beállított táptalaj összetétel csak afermentációs paraméterek szigorú állandósága esetében hozhat eredményt. A hőmérsékletben,a levegőzésben és a keverésben, vagy az induló sejtszámban való változtatás az aminosavakfelhasználását is változtatja, ami végül a triptofán termelésben való eltérés okozója lehet.Meghatározó jelentősége van a technológiai előírások betartásának és a fermentációsberendezés, műszaki színvonalának. A glükózból folyó triptofán szintézis oxigén igényérőlfogalmat alkothatunk a vázlat alapján. A szintézis energia és anyagigénye független a törzstől,ezért az Escherichi coli adatai nem különböznek a C. glutamicum -étól. Egyetlen triptofánképződéséhez 3 glükóz és 2 ammónia szükséges, miközben 1 piruvát, 4 szén-dioxid képződik,miközben nyolc redukált kofaktor és öt ADP regenerálása terheli az anyagcserét. A piruvátelégetés is az anyagcsere feladata. Mindent összevetve triptofán molekulánként 11 NAD(P)Hvisszaoxidálását kell gazdaságosan megoldani.216

L-triptofán lebomlásaArómás aminosavakfenilalanin, tirozinlebomlása acetoacetil-CoAirányába217

HISZTIDIN BIOSZINTÉZISA bonyolult önszabályozó rendszer szép példájaként tanulmányozható a katalitikus folyamatokbanoly fontos szerepet játszó imidazol gyűrűt tartalmazó aminosav, a hisztidin bioszintézise.A huszadik aminosav, a hisztidin képződése ribózon kívül nukleotidot is igényel. Az élőszervezetben folyó enzimreakciókban kitüntetett szerepet játszó imidazol-gyűrű ugyanis azATP-ből származik. A glutaminamido-transzferáz-cikláz egyik terméke pedig a purin szintézisköztes terméke.L-hisztidin bioszintézis vázlata5-foszforibozil-1-pirofoszfátATP >>>> ATP-foszforibozil transzferáz {G-gén} [ − His]N 1 -5'-foszforibozil-ATPPP > hisztidinol-foszfát transzamináz {C-gén}>>>>>>>α-ketuglutarátL-hisztidinol-foszfátP i>NADH

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAz imidazol gyűrű élettani jelentősége219

A glutamin-szintetáz működését az Escherichia coli-ban egyébként mindazok azanyagcseretermékek (triptofán, aszparagin, GMP, glükózamin, PABA) összeadódó módonbefolyásolják, amelyeknek a bioszintézisében a glutaminszint alakulása meghatározójelentőségű. Az alloszterikus kötőhely foglaltsága esetén az alegység gátoltságát fokozza annakadenileződése. Az így inaktiválódó glutamin-szintetáz központi szabályozó szerepet játszik amikroba nitrogén-anyagcseréjének alakulásában. Az inaktív enzimkomplex gátolja a nif-génekátírását, az aktív komplex viszont éppen serkenti azt.Az aminosavak lebontását katalizáló - sok esetben katabolikusan represszált -enzimrendszerek képződése indukálható. Tevékenységük általában acetil-CoA formájában őrzi alebontott vegyületből még hasznosítható építőelemeket. A glutamin, az arginin, a hisztidin és aprolin lebontva értékesebb termékhez vezet, amely glutaminsavon keresztül hasznosulhat. Azoptimális hisztidin szint kialakításában a lebontó folyamatok is fontos szerepet kapnak. Alebontást végző négy enzim képződését elindító - az ábrán szereplő két független operátorrégióban elhelyezkedő - négy struktúrgén (hut enzimek) átírását a represszor fehérjéhezkapcsolódó hisztidin indukálja, de végső soron a belső energiaszint, a katabolikus represszióklasszikus mechanizmusán keresztül serkenti. Ez nem meglepő, hiszen a hisztidin lebontásagazdaságosan hasznosítható ammónia, glutaminsav és formamid képződésével jár.A HISZTIDIN LEBOMLÁSAH H H H H H HH-C===C–C–C–COOH hisztidáz H-C===C–C=C–COOH urokanáz O=C––––C–C–C–COOH| | H NH 2 | | | | H HN=C–N-H N=C–N–H N=C–N–HH H H 4-imidazolon-5-propionsavH H H H H H HH 2N-C=O + HOOC-C-C-C-COOH FGS-hidroláz HOOC-C-C-C-COOHIPS-hidroláz| H H | H H N-formimino- L-glutaminsavNH 2 H-N=C-NH 2Alapállásként a folyamatosan képződő hisztidin nélküli represszor fehérje az operátor régióhozkötődve akadályozza lebontó enzimek struktúrgénjeinek átírását. Hisztidin fölösleg esetében arepresszor fehérje (|repr|) hisztidinnel kapcsolódva lemozdul a szabályzó kötőhelyről, és elsőlépésként engedélyezi a hisztidin lebontást végző enzimek génjeinek átírását. Az átírásazonban csak a katabolikus represszió energia és N hiány okozta felfüggesztésekor indul. Acitoplazmában megnövekvő cAMP szint hatására az energia hiányt megjelenítő cAMP/CAPkomplex aktiválja az átírás folyamatát.A hut-enzimgének átírásának gátlása illetve serkentése___________|CAP|_______________________________|CAP|________________________| promoter |operátor| IPS hidroláz | FGS hidroláz | |represszor| |promoter| operátor | Urokanáz | Hisztidáz||repr||repr|cAMPcAMP___________|CAP|______________________________|CAP|________________________| promoter |operátor| IPS hidroláz | FGS hidroláz | |represszor| |promoter| operátor | Urokanáz | Hisztidáz| _RNS-polimeráz >>>>>|repr||repr|HisHisA mikroba növekedése szempontjából előnyös optimális építőelem-készletet a citoplazmábanfolyó bioszintézis és a lebontó-aktivitás finoman szabályozott egyensúlya alakítja. Azegyensúlyra azért is szükség van, mert a gazdaságos életvitel érdekében a citoplazmában találhatópeptidázok mindazokat a fehérjéket lebontják, amelyek hibásan készülve működéskép-220

telenek vagy pedig jelenlétük az életműködés szempontjából az adott fejlődési fázisban márszükségtelen. A így nyert építőelemek más irányban kerülnek felhasználásra.Az optimális aminosav szint fenntartására szolgáló komplex rendszer elemei az élő sejtben:1, a környezetből történő aminosav felvétel transzportmechanizmusa,2, attenuáltan szabályozott, represszálható bioszintézisért felelős enzimállomány,3, alloszterikusan ellenőrzött bioszintézis (feed-back),4, derepresszálható, katabolikusan represszált lebontó rendszer (C és N hiány).A bioszintézisben nélkülözhetetlen enzimek sérülése vagy elvesztése a mikroba aminosavigényeként jelentkezik. Ezek a hiánymutánsok (auxotróf törzsek) jól használhatók a mikrobiálisgenetikai munkákban. A szabályozási mechanizmust érintő genetikai beavatkozással, bizonyosenzimek működésének akadályozásával vagy éppen bizonyos utak serkentésével egy-egyaminosav előállítására gazdaságosan használható mutánsok nyerhetők. Ilyen genetikailag hibástörzsek képességeit glutaminsav, lizin, fenilalanin, triptofán, treonin, izoleucin ipari előállításárahasznosítják.Az aminosavbioszintézist végző enzimek struktúrgénjeinek átírását befolyásolóúgynevezett VEZÉR-PEPTIDEK SZERKEZETE:Triptofán szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezeteMet-Lys-Ala- Ile-Phe-Val-Leu--Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-SerHisztidin szintézis enzimeinek képződését akadályozó_vezérpeptid szerkezeteMet-Thr-Arg-Val-Gln-Phe-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Pro-AspFenilalanin szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezeteMet-Lys-His-Ile-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe-Phe-Thr-Phe-ProTreonin és Izoleucuin szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezeteMet-Lys-Arg-Ile-Ser-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Thr-Ile-Thr-Ile-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly*(A vastagítás jelzi a szabályozást végző aminósavval acilezett tRNS ügydöntő szerepét)A vezérpeptidek kémiai szerkezetében az illetékes aminosav több példányban szerepel.Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de szekvenciájábanközvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban különösen nagygyakoriságot jelent, mivel a prokariótákban általában 100 aminosavra esik egy triptofán.Hisztidin esetében 7 szomszédos kodon igényel feltöltött hisztidil-tRNS-t.A fenilalanin-szintézis enzimeinek képződését szabályozó vezérfehérje 7 fenilalanil-tRNSjelenlétét igényli az RNS-polimeráz leválasztásához.Figyelemre méltó a treonin és az izoleucin struktúrgénjeinek átírását szabályozó vezérpeptidszerkezete, amely alternáltan 8 treonin és 4 izoleucinal feltöltött tRNS-t igényel. Ez esetbentehát a treonin és az izoleucin szintézist katalizáló enzimek génjeinek átírását csak azizolucinnal, illetve treoninnal töltött tRNS jelenléte akadályozhatja meg. Ha mindkétaminosavval feltöltött tRNS jelen van a rendszerben.Az ismertetett átírás mechanizmusát több antibiotikum képes gátolni. Az ansaláncú rifamicinszármazék,például rifampicin az RNS polimeráz ß-láncához kötődve akadályozza az RNSszintézismegindulását. A citosztatikus hatású antibiotikumok közé sorolt actinomycin-D aDNS-bázispárok közé ékelődve akadályozza a kettős spirál fellazulását, a két szál szétválását,végeredményben az RNS szintézisét. Megjegyzendő, hogy ez az antibiotikum a DNSreplikációtcsak nagyobb koncentrációban alkalmazva képes gátolni, mivel a helikáz nagyobbenergiával lazítja fel a dupla spirál bázispárjait, mint az RNS-polimeráz. Mindezt felülszabályozza a szuperfeltekeredett állapot lazítását végző DNS-giráz működése, amit anovobiocin antibiotikum, illetve a magnézium kötő kinolon származék, a széles spektrumuciprofloxacin befolyásol.221

222

A MIKROSZERVEZET NUKLEINSAVTARTALMANukleinsavak az élő szervezetből különleges kémia szerkezetük miatt viszonylag könnyen,szelektíven nyerhetők. Dodecilszulfát nátriumsójával, vagy vízzel telített fenollal a sejtfehérjetartalmú alkotórészeitől könnyen elválasztható, sőt az alkalmazott technológiaoptimálásával az RNS, illetve a DNS célzott kinyerése is megvalósítható. A mikroba DNStartalmaszigorúan állandó. Az RNS tartalom azonban, amely a riboszómák nukleinsavalkotórészét (rRNS), a transzfer ribonukleinsavat (tRNS) és a hírvivő ribonukleinsav (mRNS)tartalmat foglalja magába, a szükségletnek megfelelően periodikusan változik. A nukleinsavkészítménylúgos kezelésével az RNS frakció hidrolizálható, miközben a DNS érintetlen marad.A DNS kémiai stabilitása nem csak a cukorkomponens minőségével, de a duplahélixszerkezetének merevségével is magyarázható.Az RNS és a DNS nemcsak a cukorkomponensben különbözik (ribóz - dezoxiribóz), dea pirimidinbázisok minőségében is eltérnek. Az RNS-ben uracil és citozin, a DNS-ben timin éscitozin kapcsolódik a pentóz glikozidos szénatomjához. Bizonyos kémiai átalakulások anukleinsavak érési folyamata közben is bekövetkezhetnek (6-metil-adenin, 5-metil-citozin, 5-metil-uracil). A legnagyobb különbség azonban a két nukleinsav másodlagos szerkezetébenészlelhető, amennyiben a DNS két komplementer szál szoros asszociátuma; az RNS viszontegyetlen ribózfoszfát-kopolimer fonal, amelyen meglevő komplementáris szakaszok egymásodlagos szerkezet kialakulását teszik lehetővé. Az így kialakuló jellegzetes szerkezet (lásdtRNS), bizonyos fokú stabilitást kölcsönöz a molekulának. Az aminosav-bioszintézisbenrésztvevő enzimek képződését finoman szabályozó attenuátor mechanizmus működésében azátmeneti bázispár képződésnek fontos szabályozó szerepe van .Az egyszálú RNS rugalmas szerkezete ugyanis kémiailag könnyen támadható,enzimekkel lebontható. A foszfodiészteráz a 3'-hidroxicsoport mellett, a foszfoészteráz-b az 5'-hidroxicsoport mellett bont. Az exonukleázok a lánc 3'-hidroxi végétől indulva nukleotid-5-foszfátokat hasítnak le. A b-típusú exonukleázok 5'-hidroxi végéről indulva nukleozid-3-foszfátokat tesznek szabaddá. Az endonukleázok a láncon belül bontanak. A ribonukleáz-b apirimidinbázis mellett, a ribonukleáz-T pedig a guanin csoport mellett hasít.A magállomány kémiailag purin- és pirimidinbázisokat, foszforsavat és dezoxiribózttartalmaz. Ez utóbbi kolorimetrikusan meghatározható pentóz csak a sejt örökítő anyagábanfordul elő. Oswald már 1930-ban valószínűsítette a DNS genetikai szerepét. Az örökítő anyagjellegét Avery és munkatársai által 1944-ben leírt kísérleti eredményei igazolták. A DNSfinomszerkezetének a felderítése James Dewey Watson és Francis Crick érdeme (1953), amit agenetikai kód felfedezése és az információáramlás módjának részletes felderítése követett. Ez amagállomány elektronmikroszkópos felvételeken jól látható, de speciális festési módszerekkel,például bázikus fukszinnal festve fénymikroszkóppal is kimutatható. Nyugvó sejtekben egy-egyfesthető képlet, osztódás előtt álló sejtekben két elkülönülőben levő maganyag látható. Ezt amaganyagot baktériumkromoszómaként emlegeti a szakzsargon. Ma már elfogadott, hogy akromoszómán kívül több-kevesebb extrakromoszomális elem, plazmid is létezik amikroszervezetekben. Ezek egy része beépülhet a kromoszómába. A baktériumkromoszómakémiailag két, egymással komplement szerkezetű fonalas molekula szoros asszociátuma,amelynek savanyú jellegét a külső felületen elhelyezkedő poliaminok közömbösítik. A kettőshélix a lehető legtömörebb, szupercsavart állapotban helyezkedik el a citoplazmában. Ez afonalas szerkezetű maganyag a sejttérfogat egytizedét foglalja el, szárazanyagban azonbanmindössze 2-3 %-ot teszi ki, elméleti hossza (teljesen kitekeredve) viszont a sejt méretének akárezerszerese is lehet. Például az Escherichia coli kromoszóma 3x10 9 Da tömegű (Dalton =1,67x10 -24 g), 5,4x10 6 nukleotidot tartalmaz és négyszázszor hosszabb (1,5 mm), mint az E. colisejt hossztengelye.223

A maganyag a sejtfal és a membrán kíméletes eltávolítása után nyúlós anyagkéntnyerhető ki. A fonalas szerkezetű vegyület molekuláris méretéből következik törékenyszerkezete, mechanikus érzékenysége. Ezért a DNS készítmények általában molekulatördelékettartalmaznak. A kromoszómafonal két szála közötti kapcsolatot az adenin és a timin, valamint a224

guanin és a citozin párok között kialakuló hidrogénhidak tartják fenn, amely kapcsolatviszonylag enyhe hőhatásra fellazul. A függetlenné váló két szál a hőmérséklet óvatoscsökkentésével újra összekapcsolódik, mégpedig arra a termodinamikailag legstabilabb változatmegjelenítésére törekedve, amikor minden bázis megtalálja a párját. Ez a folyamatvégeredményben egydimenziós kristályosodásnak tekinthető. Gyors hűtéssel ez a folyamatakadályozható. A DNS-molekula fizikai állapotára következtethetünk a hődenaturálás közbenmért ultraibolyafény-elnyelés változásából. A duplaspirál állapot megszűnése a fényelnyelésugrásszerű növekedését (40 %-os emelkedés) eredményezi. Egyszálú DNS esetén ez az értéknem változikA DNS olvadási hőmérsékletének nevezzük azt a hőmérsékletet, amikor az UV-elnyelésnövekedése eléri a maximális érték 50 %-át. Ez az érték a bázispárok fajra jellemző minőségétőlés mennyiségétől függ. A G/C pár hármas hidrogénhídjának lazulása magasabb hőmérsékletenkövetkezik be, mint a két hidrogénhíddal rögzített A/T páré. A genotípust meghatározó DNS amikroorganizmusok rendszertani csoportosításában, összehasonlításában nagy segítséget jelent.A renaturálódási készséget használja ki a DNS hibridizációs technika. A referencianukleinsavhoz keverik az összehasonlítandó nukleinsavból készült, célszerűen izotóppal jelzettfragmentumokat. A denaturált keveréket 0,3 M konyhasó oldatban 65 o C-on tartva kialakul ahibridkeverék, amely asszociálódva grádiens centrifugálással frakcionálható. A radioaktivitás ésaz UV-elnyelés mértéke az analógiáról, adott esetben a rokonság mértékéről tájékoztat. Ezen azúton DNS/RNS hibridek is előállíthatók. Az élő sejtben (replikáció közben) egy speciális fehérjesegíti a termodinamikailag stabil asszociátum kialakulását, megakadályozva az egyszálú DNSidő előtti összecsapódását. A T-4 bakteriofágban ennek a fehérjének a génjét is sikerültmegtalálni.A sejten belül feleslegessé vált nukleinsavakat nukleázok bontják építőelemekké. Afelszabaduló nukleotidok új nukleinsav képződéséhez használódnak fel vagy pedig a lebontóenzimek távolítják el a sejtből. A nem működő mRNS eltávolítása megakadályozza a feleslegesfehérjék képződését. A nem működő riboszómák eltávolítása, a felesleges enzimek lebontásamegakadályozza szükségtelen vegyületek spontán képződését, az energia értelmetlen pazarlását.Ez a finoman szabályozott állandó fehérje- és nukleinsav lebontó aktivitás segíti elő aleggazdaságosabb életműködést. A létért folytatott küzdelemben a szabályozó rendszer egy-egyapróbb hibája már hátrányos helyzetet jelent, kihíguláshoz vezet. Tudománytörténeti érdekesség,hogy a ribonukleáz volt az első enzim, amelynek teljes szintézisét 1969-ben elvégezték.A prokariota kromoszóma RNS-sel stabilizált, többszörösen feltekert (szupercsavart)állapota a replikáció megindulásakor, annak első lépéseként fellazul, kitekeredik. Ez a folyamatspeciális destabilizáló fehérjék segítségével folyik. A két szál szétválását segítő fehérjék areplikáció ideje alatt folyamatosan mintegy kétezer bázispárnyi területet biztosítanak az új DNSfonalatszintetizáló enzimek működéséhez. A DNS-polimeráz III zavartalanul tudja felépíteni amegfelelő dezoxiribonukleotid-trifoszfátok felhasználásával 5'-3' irányban az egyik szálkomplementer fonalát. A másik szál szintézise bonyolultabb, mert ott elméletileg 3'-5' iránybankellene történni a szintézisnek, ilyen enzimet azonban nem találtak. Itt a szintézis az RNSprimázáltal elhelyezett primer RNS darabokból indul 5'-3'irányban az előző RNS primerdarabig.A rövid DNS-darabok között maradó RNS-fragmentumokat ezután folyamatosan a DNSpolimerázI cseréli a komplementernek megfelelő nukleotidokra.A DNS-polimeráz működése Sanger módszerét alkalmazva lehetőséget ad a DNS bázissorendjénekfelderítésére (szekvenálásra). Ha a reakció elegybe a négy (dATP, dGTP, dCTP,dTTP) dezoxiribonukleotid-trifoszfát mellé valamelyik bázis 2",3"-didezoxi-nukleotidtrifoszfátját(ddNTP) adják, akkor ez a bázis — beépülve a láncba — a láncnövekedést leállítja.A beépült didezoxinukleotid ugyanis képtelen a következő foszfodiészter kötést kialakítására.Sanger kísérleti reakcióelegye tehát tartalmazza; a szekvenálandó DNS-darabot, egy225

ádioaktívan jelölt olyan (primer) DNS darabot, amely a vizsgálandó DNS végévelkomplementer, a dezoxiribonukleotid-trifoszfátokat és meghatározott arányban valamelyiknukleotid didezoxi-analógját (ddNTP). A polimeráz hozzáadásakor a meglevő primert folytatvaelindul a komplementer szintézise. Amikor egy ddNTP beépül, a lánc növekedése megáll. Aképződő lánc hossza attól függ, hogy milyen messze van a DNS végétől az a bázis, amelynek ahelyére a didezoxi származék beépült. Párhuzamosan természetesen mind a négy ddNTP-velmeg kell csinálni a kísérletet. A láncdarabok elegyét akrilamid-gélen futtatva a méret szerintisorrendbe rendeződő fragmentumok a radioaktív jelölésnek köszönhetően láthatóvá tehetők.Kellő számú kísérleti adatból a DNS-szál bázissorrendje, illetve ebből a kódolt fehérje aminosavsorrendje nagy biztonsággal megállapítható.Az in vivo DNS replikációs folyamat igen bonyolult mechanokémiai jelenség. Egyetlen4,5 millió bázispárt tartalmazó Escherichia coli kromoszóma kettős spirál szerkezete közelfélmillió csavarodást jelent, nem beszélve a szupercsavart állapot többszörös feltekeredettségéről.Ez azt jelenti, hogy 30 perces osztódási ciklust feltételezve percenként legalább 13.000fordulatot végeznek a szálak. In vitro ezt a sebességet nem lehet elérni. A tisztított DNSpolimerázpercenként 1000 nukleotid beépítésére képes. Ezzel szemben egyetlen osztódásiciklushoz szükséges két kromoszóma elkészítéséhez 2 x 4,5 millió bázispár kialakítása szükséges,amely percenként 350.000 nukleotid beépítését jelenti. Nem kétséges, hogy replikációközben a DNS-szálak számtalanszor elszakadnak, amit a javító mechanizmus menetközben újraösszekapcsol. A replikáció közben előforduló hibák javításában fontos szerepet tölt be apolimeráz I. A DNS bioszintetizáló és hibajavító mechanizmusa ugyanis nem törődik a DNSszálinformációtartalmával. Teljes aktivitását az eredeti szöveg hibátlan másolására, illetve emásolatok változatlan formában való fenntartására fordítja.226

227

A DNS megkettőződésének a vázlata228

Külön enzimek szolgálnak a kettős szálú DNS feldarabolására. Ezek a restrikciósendonukleázok csupán meghatározott szekvencia mellett hasítanak. A DNS a hasítás helyénpalindrómát alkot, azaz ugyanaz a szekvencia olvasható az ellenkező irányban is.A A G C T T G G C C A T C C G G A THind III | | | | | | Hae III | | | | Hpa II | | | | | | | |T T C G A A C C G G T A G G C C T AEnnek az a következménye, hogy a hasított szál komplementer végződésű (ragadós végű),amelynek összeillesztését az adenilsavval acilezett ligáz végzi.Az adenilsav a ligáz lizin oldalláncának ε-aminocsoportját acilezi, miközben nikotinsavamid-mononukleotid(NMN) szabadul fel. A nagyenergiájú foszfoamid-kötés segíti abemetszett DNS 5'-végéhez kötni az adenilsavat. A kialakuló pirofoszfát-kötést éri a láncvégi 3'-hidroxicsoport nukleofil támadása, aminek a végeredménye a DNS lánc zárása.NAD + ligázligáz-AMP + felmetszett DNSfelmetszett-DNS-AMPligáz-AMP + NMNfelmetszett-DNS-AMPösszekapcsolt DNS + AMPA restrikciós enzimek, és a ligáz használata egy adott DNS-darabhoz tetszőlegestartalmú, komplementer végződésű idegen DNS hozzáépítését — mesterséges gének előállítását— teszi lehetővé. A DNS-replikáció bonyolult folyamata könnyen megzavarható kémiai ésfizikai beavatkozással. Az úgynevezett citosztatikus hatású antibiotikumok — amelyek a DNSlánchozkötődve zavarják a replikációt — a rákkemoterápiában kerülnek felhasználásra. Mások,például a bleomicinek a DNS-lánc kémiai hasításával zavarják a sejtek osztódását.Ismeretesek olyan vegyületek, amelyek a replikációs folyamat enzimeinek a működését zavarvafejtik ki antibakteriális hatásukat. A novobiocin például a giráz működését gátolva a DNSszuperfeltekeredését zavarja.229

RNS-SZINTÉZIS A PROKARIÓTÁKBANA DNS-ben elhelyezett információ elolvasása már egy másik mechanizmus, a transzlációfeladata. A transzláció azonban nem közvetlenül a DNS-szálról, hanem az átíró (transzkripció)folyamatban készülő mRNS-kópiáról történik. Az átíró mechanizmus nem törlődik a DNS-benrögzített szöveg olvasatával, csupán a hű másolat készítésével. Megkülönbözteti azonban a DNSegyes génszakaszait és ezzel élettani szabályozó szerepet tölt be. Az RNS-polimeráz bármelygén átírására képes, működését azonban csak külön parancsra, illetve a tiltó parancs felfüggesztéseesetén kezdi meg. A DNS-hez kapcsolódó termék-represszor komplex lehetetlennéteszi az RNS szintézisét. Végtermék hiányában a komplex fellazulva, nem az átíró enzimetaktiválja, hanem kötőhelyéről eltávozva megteremti a lehetőséget a DNS-en rögzített információátírására, azaz nem akadályozza a promoter régióhoz kötődő RNS-polimeráz tovahaladását.A tRNS-gén is lényegesen hosszabb pre-tRNS molekulát kódol. Előfordul, hogykülönböző aminosavra specifikus tRNS (például a szerin-tRNS és a treonin-tRNS) egy géntermékeként jelenik meg és bonyolult érési folyamatban, endonukleázok és exonukleázokközreműködésével, egyes bázisok módosításával válik használhatóvá a DNS-ről készült RNSmásolat. A bázisok távozásával szabadul fel az aminosavak kötésére szolgáló C-C-Aszekvencia.A szerin és treonin tRNS prekurzora.pGG-G UC U U OH A G CU A C U A ψA A C U U TU U A C C-GU-A G A U-AA-U G C G-C GC-G A C C-G U GU-C C C U U A C-G-C A A--AN CGACU ACGGGCG CGACUAU GUGGG UC | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GU GCUCA UGCCCGCUCCAAGAUGUGCUGAUAU C ACC C GA-A U G-C A G U--UG U C-GA GA G-C G-CG-CC-GG-CU-AT U C-Gψ U A AC A G DG D CD-GA kövérített bázisok távoznak az érési folyamat közben. D=dihidrouridin, ψ=pszeudouridinAz átíró rendszer, az RNS polimeráz öt fehérjéből álló, félmillió daltonnál nagyobbméretű holoenzim. A fehérjekomplexhez hatodikként átmenetileg különböző méretű σ faktorkapcsolódhat, amely az indítójel felismerése után a DNS-hez kötődést segíti. Az RNS-polimerázezt követőleg az úgynevezett szoros kötődés helyére csúszik.A szoros kötődés hatására a két DNS-szál egy rövid szakaszon (7 bázispár) szétválik.5' TATAATG3' ATATTAGJellemző erre a szakaszra az AT bázispár gyakori előfordulása, amely a dupla hélixen jellegzetesduzzanatot okoz. Gyakorlati jelentősége az, hogy a kumulált két hidrogénhidas kötéskönnyebben nyílik fel. A σ faktor, kilépve az átmeneti komplexből, részt vesz a következő RNS230

polimeráz indításában. Ettől a helytől 6-7 bázispárnyi távolságra van a kezdő purin bázispárahonnan E. coli esetében pppG-vel indul az átírás, a templátnak megfelelően — ribonukleotidtrifoszfátokból5'-3' irányban, a stop jel felé. Ebből következik, hogy a DNS két száláról csakellenkező irányban folyhat átírás.Bázispárok természetesen a ribonukleinsav-lánc esetében is kialakulnak, ha megfelelőkomplementer szakasz található térközelben. A tRNS kémiai stabilitását éppen a térbeliszerkezetének, a kiegészítő szakaszok között kialakuló kapcsolatoknak köszönheti.Az Escherichia coli 16S RNS kiegészítő szekvenciák által rögzített szerkezeteAz átmenetileg szétváló szakaszt befedő, σ-faktor nélküli polimeráz másodpercenként kb. 50bázisnyi sebességgel halad előre az általában 6-8 egymásután elhelyezett AT bázispárttartalmazó stop jelig. Néhány esetben más termináló jel létét is észlelték, amely bizonyospalindrom szakaszokat felismerő ρ−faktor jelenlétében fejti ki hatását. Az átírás a DNSreplikációmár ismert elvét követi. A komplementer szál ribonukleotid-trifoszfát építőelemekbőlkészül azzal a különbséggel, hogy az RNS timin helyett uracilt tartalmaz az adenin komplement-231

er párjaként. Bázispárképzésre lehetőséget adó kiegészítő szekvenciák a mRNS szálon iselőfordulnak, különösen a szál végén a termináló kód környékén. Ez lehetőséget ad az RNSvisszahajló szakaszának a megkötésére, megvédve a ribonukleázok lebontó aktivitásától. Alebontó aktivitás egyébként olyan jelentős, hogy nem létezik szabad RNS bioszintetikus funkciónélkül. A rRNS érési folyamatában a riboszóma fehérjekomponenseinek is lényeges szerepükvan. A bioszintézis egyik utolsó lépésében alakul ki a riboszóma mRNS és tRNS kötőképessége.Ily módon nem következhet be a mRNS és a tRNS kötődése éretlen riboszómához.A struktúrgénátírását akadályozza a laktóz hidrolízisénél említet katabolius represszíótokozó CRP fehérje, amelynek a távozását cAMP segíti. Hasonló módon az indukálható enzimesetében az induktor megjelenése segíti elő az enzim képződését.- E. coli esetében a Lacrepresszort A laktóz metabolizmus köztes anyaga, az allo-laktóz mozdítja el a DNS-ről, másesetben a galaktóz indukálja a laktózbontó aktivitás megjelenését. A DNS-ről történő átíráskor akülönböző RNS-fajták esetében általában a végső cél szempontjából látszólag szükségtelenszekvenciákat tartalmazó hosszabb, úgynevezett prekurzor-RNS láncok képződnek. Ebből érésifolyamat közben alakulnak ki a biológiai feladat megoldására alkalmas mRNS molekulák.A ribonukleázok lebontó aktivitásával szemben a riboszómához kötődés is védelmetjelent. Ennek érdekében a mRNS esetében a kódolt fehérjére vonatkozó, AUG kodonnal indulóinformáció előtt a riboszómához való kötődést biztosító szakasz található.A DNS-szálon akár egy génen belül is egyidejűleg több RNS-polimeráz is működhet, sőt azenzimről folyamatosan letekeredve képződő mRNSfonalakonkörülbelül 40 bázisnyi távolságban mármegindul a fehérjeszintézis. Ebből az következik,hogy meglehetősen kis területen változatosbiokémiai reakciók (RNS-szintézis, fehérjeszintézis)tömege folyik egyidejűleg.Érzékeny szabályozási lehetőségként alakult ki az élőszervezet számára az aminoacilezett tRNSszabályozó szerepének a megjelenése. Ennekkeretében a promoter régión kötődő RNS-polimeráz,az operátorhoz kötődő represszor fehérje távoztávalelindulhat a struktúrgén felé. Az RNS-polimerázműködése viszont megszakad akkor, ha a megfelelőaminoacil-tRNS a fehérjeszintézis szempontjábóloptimális koncentrációban van jelen a mikrobasejtben.232

PURIN NUKLEOTIDOK BIOSZINTÉZISE ÉS A SZABÁLYOZÁSI MECHANIZMUSribóz-5-foszfátATP >>>>>> ribóz-foszfát pirofoszfokináz [ − IMP ] [ − AMP] [ − ADP]AMP Gly >>>>>>ADP >>>>>>GTP >>>>>>>

234

A PIRIMIDIN-NUKLEOTIDOK KÉPZŐDÉSECO 2glutamin >>>>>>>>>>> +

A dezoxiribonukleozidok a megfelelő nukleozid-trifoszfátokból képződnek. Redukáló ágenskéntdihidroliponsav, illetve tioredoxin- vagy glutaredoxin-reduktáz rendszer jöhet számításba. Areduktáz rendszer elektron-igényét NADPH elégíti ki.A glutation reduktáz élettani jelentősége a dezoxiribonukleinsav ellátás szolgálatábanH 2 OH 2 OA DNS-szintézishez szükséges dTTP — az N 5 ,N 10 -metilén-tetrahidrofolát segítségével.— adezoxi-uridilsav metilezésével képződik. A folyamathoz 5,6-dimetil-benzimidazol-kobamidkoenzim és Mg 2+ szükséges.236

ENDOSPÓRA KÉPZŐDÉS ÉS A SPÓRA CSÍRÁZÁSABacillus subtilisStreptomycetaceae családbanMaduromycetaceae családbanThermomonosporaceae családbanActinoplanaceae családbanSporangiumot képző Actinomycetes csoportbanMicropolysporaceae családbanThermoactinomyces csoportbanKonidium képzés a gombákbanRhizopus nigricans aszexuális spóraképzéseNeurospora crassa aszexuális spóraképzéseAspergillus nidulans konidium képzéseIvaros szaporodáashoz kötött spóraképzés a járomspórás és a tömlős gombáknálMucor hiemalis esetén tárgyalvaNeurospora crassa aszkusz képzéseA csészegomba ivaros ciklusaBazidiumos gomba életciklusai Puccinia graminis (gabonarozsda) spóraképzéseGombaspórák tulajdonságai,Tömlős-gombaspórák csírázása Asdpergillus niger esetében tárgyalvaZymomycota (Saccharomyces cerevisiae) ivaros spóraképzéseTúlélést szolgáló akinéta sejtek képződése a Cyanobaktériumoknál* Érdeklődők számára elérhető a ’mikrobanaár’ és a ’gombák birodalma’ segédlet237

Különböző élőhelyekről származó, Gram-pozitívan festődő, endospórát képző, aerob, valamintfermentációs uton energiát nyerő, fakultatív anaerob és szigorúan (obligát) anaerob fajoktartoznak a csoportba. Spórás formában a talajban több száz fajuk található. A mikroszkópinatív készítményben a spórák erős fénytörésükkel tűnnek fel. Festett készítményben viszontéppen festhetetlenségükkel hívják fel a szemlélő figyelmét.A spórák elhelyezkedése szerint megkülönböztethetünk centrális és excentrikus spórásbacillusokat. Az endospórák mérete sok esetben meghaladja a bacillus átmérőjét. A plektridiumalaknál a pálcika középső része vastagabb a spóra mérete miatt. A Clostridiumok dobverőreemlékeztető alakot mutatnak.Az endospóra nem tekinthető szaporító szervnek, mivel egyetlen vegetatív sejtbőlegyetlen, a faj túlélését szolgáló endospóra képződik. Ez a képlet kedvező körülmények közékerülve csírázik, majd vegetatív sejtként folytatja szaporodását. A spóra és a vegetatív sejtközötti különbség nem csak a fizikai, kémiai károsító hatásokkal szembeni ellenállóképességbennyilvánul meg, de a kémiai összetételben is jelentős eltérés észlelhető, amint azt Kornbergtáblázata bemutatja (Ann. Rev. Biochem. 37:51 1968).Bacillus megaterium kémiai összetételeössz-fehérjeoldható fehérjeDNSRiboszomális RNStRNSsavoldható foszfor10 15 vegetatív sejt910 g680 g91 mol P380 mol P95 mol P500 mol P10 15 spóra330 g165 g40 mol P140 mol P35 mol P52 mol P[A fehérjét gramban, a foszfortartalmú vegyületek mennyiségét P(foszfor) molban mutatja atáblázat. A spóra DNS-tartalma 3 x 10 9 dalton. A vegetatív sejtben mért magasabb érték abbóladódik, hogy az élő sejtszám meghatározásakor a növekedő, de még szét nem hasadtsejtpárokat egy baktériumnak számolják.]A spórában a fehérjeszintetizáló rendszer működőképes. Az energianyerő folyamatok, és amembránhoz kötött citokróm-rendszer leépül, csak az oldható flavoprotein rendszer maradműködőképes. Nem ATP az energiatároló, hanem a glicerinsav-3-foszfát, amely energiabefektetésnélkül alakulhat foszfoenolpiruváttá. Csírázáskor az első fehérjék képződéséhez szükségesépítőelemeket a fehérjeburok lebontása, az energiát pedig a glikolízis szolgáltatja.A spóra elektronmikroszkópos képén középre tömörülve helyezkedik el a DNS. Az eztburkoló vékony membránon kívül jól látható a peptidoglükán spórafal. Kémiai összetételében avegetatív alak sejtfalával egyezik. Az azzal készült, színezett antitesttel jól festhető.A következő elkülöníthető réteg a kéreg (kortex), ugyancsak peptidoglükán, de a sejtfalnállényegesen sűrűbb állományú. A kéregképződés zavara a vízmentesítést is nehezíti. Az előbbemlített antitesttel nem festhető. A kéreg muraminsav állományának mindössze 6 %-a vankeresztkötésben, de nem tetrapeptid hanem L-alanin kapcsolja a szomszéd lánchoz. Amuraminsav nagyobb hányada muramil-laktámként (tejsavamid kötés!) található a kéregben.Különösen érzékeny a kéreg szerkezete a lizozim jelenlétére, mert feltűnően gyorsan bontja akéregben előforduló muraminsav-származékokat.A következő réteget egy keratinhoz hasonló fehérje alkotja. A spóra fehérjetartalmának80 %-a itt található. Ez a vastag réteg biztosítja a kémiai ellenállóképességet, a feltűnő UV- ésröntgenrezisztenciát. A nagyszámú diszulfid-kötés redukálása nélkül nem érdemes kísérletezni afal feloldásával. A csírázó spóra elsőként felépülő fehérjéi a kéregből felszabadulóaminósavakből képződnek.238

Bacillus subtilis endospóra képzésekorai fázis (60 perc)megkettőződő DNSúj σB-faktor 30 kDatíz új fehérje képződéseközépső szakasz (120perc)a maganyag szétválásaújabb σE-faktor24 kDahat új fehérje képződikelőspóra(180 perc)megjelenéseújabb faktorok:σG 17 kDa ésσK 27 kDa éshat újabb fehérjeképződésekésői fázis (240 perc)tizennégy fehérjeképződésespóra érés (300 perc)érett spóra (600 perc)A külső fehérje burkot 20 % szénhidrátot tartalmazó lipid (lipoprotein), az exosporiumveszi körül. A túlélés szempontjából nem esszenciális, de jelenléte előnyös az előbbi fehérjeburok képződése szempontjából.A spórák feltűnő hőtűrése nem magyarázható enzimeik hőstabilitásának fokozódásával.Sokkal fontosabb ebből a szempontból a spórák csekély víztartalma és nagy kálcium-pikolinát239

tartalma (J. Gen. Microbiol. 16:418. 1957). A spóra tömegének 15 %-a dipikolinát. Ez a lizinprekurzor, mint kelátképző kálciumot képes megkötni. Ez okozza a fénytörő képesség feltűnőnövekedését.H-C—C—C=O|| || OH-C N| | OH-C==C—C=OCaO=C—C—C-HO || ||N C-HO | |O=C—C==C-HA kálcium dipikolinát szerkezeti képleteKálciumhiányos körülmények között képződő spórák hőérzékenyek maradnak, de csökken ahőrezisztencia, ha genetikai hiba miatt nem képződik elegendő dipikolinsav. A spóra viztartalmaa száraz gyapjú víztartalmával egyezően mindössze 15 %. Church kimutatta, hogy a spóradipikolináttartalmával nő a hőrezisztenciája (Nature 183:124. 1959).A sporulációt kiváltó szabályozó mechanizmus működését nem ismerjük pontosan.Kiváltó okként szerepel az anyagcserezavar, a tápanyaghiány, az intracelluláris GTPkoncentrációcsökkenése, szigorúan anaerob szervezetek esetében a légköri oxigén jelenléte.A spóraképződés 9-10 óra alatt lejátszódó endotróf folyamat, anyag- és energiaigényét azanyasejt biztosítja. A spóraképződés desztillált vízben is zavartalanul végbemegy.A genetikai állományban jelenlevő, spórázást irányító gének a vegetatív fázisban inaktívállapotban várják az endospóraképzés kezdetét. Nem ismeretes, mi az a szignál, amely aktiváljaezeket a géneket. Kétségtelen, hogy a spóraképződés első jelenségei között szerepel az RNSpolimerázszerkezetének a megváltozása egy proteáz hatására. Nem tudjuk, hogy az átalakítástvégző proteáz milyen jelzésre képződik.A vegetatív sejtben működő (holo) RNS-polimeráz σΑ faktora 43 kd méretű. A spórázó Bacillussubtilis sejtben az idő előrehaladtával, ennél kisebb tömegű σ faktorok (7 féle 32-17 kDaméretig) jelenlétét igazolták.A vegetatívan szaporodó Bacillus subtilis esetében a teljes fejlődési ciklusban működőgének átírását az RNS polimeráz (holo-enzim) a 43ooo moltömegű σA faktor jelenlétébenvégzi. A vegetatív ciklusban a teljes aktivitással működő RNS polimerázhoz egy 21ooomoltömegű δ fehérje kötödését tapasztalták. A tápanyaghiány (oxigén-hiány) esetében azelősporulációt irányító 30ooo moltömegű σB, és a sporulációs folyamatot irányító 32ooomoltömegű σC kerül a σA faktor helyére.Működésük hatására a sejt jól megkülönböztethetően két irányban fejlődik. A σBfaktor által írányított polimeráz által átírt mRNS egy inaktív peptidáz képződését, valamint ap31 fehérje megjelenését segíti. Az inaktív peptidáz a spórásodási program szerint aktíválódvaa p31 fehérjének az N terminális végéről 29 aminosavat eltávolít, és ezzel megjelenik a.24ooo moltönegű σE faktor, amely a szétválás irányába fejlődő két részben, tehát az előspóra,illetva az anyasejtnek tekinthető részben levő gének átírását végzi. (Közben mindkét sejt DNStartalma láthatólag csökken.)Az anyasejt és az előspóra élettani elválása a negyedik órára fejeződik be. A σE faktorhatására az előspórában megjelenő 17ooo moltömegű σG faktor, a spóra késői fejlődésétvégző gének átírását segíti elő. Az anyasejtnek nevezett sejtrészben képződő 27ooomoltömegű σK faktor a sporuláció befejező szakaszát végző enzimek megjelenését, végül isaz anyasejt maradékának a lízisét végző enzimek képződését irányítja.Az endospóraképzés első órájában 10 különleges, addig nem ismert fehérje képződik. Amásodik órában 6 új fehérje képződését igazolták. A harmadik órában újabb 6 fehérje jelenikmeg. A továbbiakban még 14 fehérje képződését bizonyították. A sporulációt befolyásolófeltérképezett mutációk száma meghaladja az ötvenet. Ez nem jelent ötven különböző enzimet,240

mert több esetben azonos gén különböző helyen sérült variánsaival találkozunk. Eddig mintegyhúsz gén ismert, de számuk meghaladhatja a százat is.A sporuláció egyes szakaszait érintő mutációk a vegetatív növekedést nem befolyásoljákés egymástól függetlenül jelennek meg. A sporulációban sérült mutánsok a vegetatív szakaszbannem különböztethetők meg vad társaiktól.A spórázási folyamat első, mikroszkóppal jól látható jele a baktériumsejt egyik végeközelében megjelenő, membránból betüremlő válaszfalkezdemény. Ezt megelőzi a DNSmegkettőződése. A maganyag egy része ezután a sejt egyik végébe, a válaszfal kezdeményhezvándorol. A válaszfalkezdemény a leendő spóra DNS-tartalmát körülfogva zsákot képez, majdteljesen lefűződve alakítja ki az előspórát.Folyamatosan egyidejűleg alakulnak ki a spórafal jól megkülönböztethető rétegei(peptidoglükán, kortex, keratin). A folyamat indulásától számított ötödik órában kialakulóspóraköpeny erős fénytörése miatt fáziskontraszt mikroszkóppal jól szemlélhető testecskekéntvizsgálható. Az ezt követő érési folyamatban a készülő spóra hőtűrése ugrásszerűen megnő. Ahőrezisztencia kialakulása a hetedik órára fejeződik be. Ezt követi az anyasejt lízise, illetve alipoprotein tartalmú exosporium kialakulása. Sok esetben az anyasejt maradéka tartósanmegtalálható a spóra körül, más esetben az anyasejt szétesésével a spóra kiszabadul.VEGETATÍV ALAK KIALAKULÁSA ENDOSPÓRÁBÓLA spóra csírázása az előbbi folyamattal ellentétesprogram lefuttatásával újra vegetatív formába juttatja vissza amikroszervezetet. Fáziskontraszt mikroszkópi képen afénytörőképesség fokozatos csökkenése, a spórák sötétedése,duzzadása észlelhető. A program egyes lépéseiről kevesettudunk. Mindenek előtt elkészül a vegetatív életre szolgáló RNSpolimerázamely a vegetatív sejt felépítéséhez szükségesenzimek információit képes átírni. A viszonylag rövid (60 perc)csírázási folyamat három szakasza különböztethető meg.Aktiválás. Az indító jel itt sem ismert. Általában akedvező életkörülmények indítják a folyamatot (tápanyagbandús, nedves, meleg környezet). A Bacillus subtilis csirázásátsiettetni lehet L-alanin adagolásával. Néha a külső keményfehérjeburok mechanikus roncsolása (üvegporral valódörzsölése), illetve néhány perces hőkezelés (60-80 o C) isgyorsíthatja a folyamatot. Egyes esetekben előnyös hatásúnaktalálták a mangán-ion jelenlétét. Az anaerob bacillusok spóráinakcsírázása csak oxigénmentes körülmények között indul meg.Csírázás. A peptidoglükánkéreg hidrolízise meglepőengyorsan megy végbe. Jól észlelhető a dipikolinát-tartalomrohamos csökkenése. Ezzel egyidejűleg megszűnik az erősfénytörés és a csírázó sejt jelentősen megduzzad.Kinövés. A DNS-tartalom megkettőződésével a sejtátnövi a spóraburok maradékát és osztódni kezd. Kezdetben azépítőelemek a lebomló fehérjeburokból származnak. A csírázásifolyamatban először a fehérjeszintézis, majd az RNS-szintézisindul.241

Bacillus anthracis., Tudománytörténeti szempontból a csoport legismertebb tagja alépfene kórokozója. Ez volt az első eset, amikor a baktérium jelenléte és a megbetegedés közöttiösszefüggést sikerült tudományosan igazolni; R. Koch 1877-ben tiszta tenyészetben előállítottaa feltételezett kórokozót, majd egészséges állatba oltva, bizonyította a törzs patogenitását. Négyévvel később Pasteur Poully-le-Fort-ban nyilvános kísérletben bizonyította az immunizálásdrámai hatását. Huszonnégy bárányt, egy kecskét és hat ökröt oltott 42-43 o C-on való tenyésztéssellegyengített anthrax bacillussal. Két héttel később virulens tenyészettel oltotta őket,előzetesen nem kezelt állatokat használva kontrollként. Két nap mulva a nem vakcinált állatokkivétel nélkül elpusztultak, a vakcináltak viszont életben maradtak. A vakcináció fogalma (tehén= vacca) Edward Jenner óta, - aki a tehénhimlő okozta varrból származó nedv felületialkalmazásával az emberi hímlő elleni sikeres védelem lehetőségét igazolta - már ismert volt.Pasteur kísérleteivel ennek a módszernek a tudományos magyarázatát adta.A kórokozó B. anthracis nagyméretű (1-1,5 x 4-8 µm) pálca. Magasabb széndioxidtartalmúlégkörben D-glutaminsav polimert tartalmazó tokot fejleszt. Ilyenkor a telep nyálkásbevonatú. Jó növekedés esetén az osztódó sejtek nem válnak szét, hosszú láncokat alkotvakötegekbe rendeződve helyezkednek el természetes élőhelyükön. Fiziológiás körülményekközött, az élő állatban nem, csak savanyú miliőben spórázik. Laboratóriumi körülmények közötta spórázás 48 órás korban, a logaritmikus növekedési fázis végén kezdődik. A spóra a sejtközepső részén helyezkedik el. Fizikai és kémiai hatásnak jól ellenáll; tíz perc forralás, 0,1 %szublimát nem károsítja. Száraz talajban évekig megtartja életképességét, fertőző tulajdonságát.Csak három óráig tartó 140 o C-on végzett szárazhőkezelés pusztítja el. — A Közel-Keletrőlszármazó kecskeszőr már több esetben okozott fertőzést. A légzőszerveken keresztül aszervezetbe kerülő spórából kicsírázó Bacillus a nyirok rendszeren keresztül a vérárambakerülve elszaporodik és megkezdi a toxin termelését, amely valójában három fehérje (ödémafaktor, protektív antigén, letális faktor) keveréke. A vaccináláshoz felhasznált készítménymindhárom faktor felhasználásával készül.Bacillus subtilis. Kutató laboratóriumok kedvelt kísérleti alanya, apatogén apró sejtespálcika. A sejtek osztódáskor nem mindig válnak szét, ezért gazdag táptalajon tenyésztvehosszabb-rövidebb fonalakat alkot. Asporogén mutánsaikat ipari eljárásokban amiláz és proteáztermelésre használják. A baktériumfiziológia kedvelt kísérleti szervezete, mivel könnyentenyészthető, DNS-készítményekkel jól transzformálható, lizozimmal protoplasztálható és aprotoplasztok polietilénglikol segítségével fuzionáltathatók. Az első protoplasztfúziót Alföldi ésmunkatársai végezték a Szegedi Biológiai Központban.Bacillus cereus var. mycoides. Nagysejtes, jól spórázó bacillus, amely ugyancsakfonalas kötegeket alkot. Szilárd táptalajon gombákra emlékeztető telepet alkot. Környezetébenkristályrácsot alkotva kalcium-karbonát képződés figyelhető meg.Extracelluláris penicillináz termelésre használható. Az eredetileg membránhoz kötődő penicillinázproteolizissel válik el a membrántól, mégpedig az enzim és a membránhoz rögzítő lipofilrész közötti kötés felszakadásával.Bacillus licheniformis nevét az agar táptalajon növekedő telep zuzmóra emlékeztetőkülleméről nyerte.Bacillus megaterium (µεγας τερας). Nitrátot és glükózt tartalmazó táptalajon jól fejlődőkülönösen nagyméretű talajlakó.Bacillus thüringiensis. Sejtjében a spóraképzéssel egyidőben egy fehérje természetűtoxin képződik, amely mikroszkóppal jól észlelhető, nagyméretű kristályt alkot. Ez a kristály ahernyók belébe kerülve, elpusztíja azokat. A mutagén kezeléssel előállított, toxint nem termelőmutánsok gyakorlatilag megkülönböztethetetlenül hasonlókká válnak a B. cereus törzshöz. Afehérjekristály génjének beépítése a dohánynövény krormoszómájába az Agrobacteriumtumefaciens Ti plazmidja segítségével a levelet rágó hernyó pusztulását okozza242

MOZGÁSSZERV A MIKROVILÁGBAN —Eubacterium mozgásszerveképződése,működése,szabályozó mechanizmusaEscherichia coli példáján bemutatvaCaulobacter crescentus ostormozgató mechanizmusának ismertetéseA receptor működéseFoszforiláz — foszfatáz rendszer szabályozó szerepeA sejtfal járulékos tartozékaként említendő a prokariota mozgásszerv, az ostor(flagellum), amely lehet: monotrich (az egyik végén egy ostor),amphitrich (mindkét végén egy-egy ostor),lophotrich ( több ostor),amphilophotrich (mindkét végén több ostor),peritrich (egyéb helyen taláható ostorok).A fenti elnevezések görög szóösszetételek (τριχιας szőrös, περι köröskörül).A prokariota ostor 3-12 µm hosszú, vékony (12-15 nm), mozgékony, csöves szerkezetűfonal. Az ostort globuláris fehérjeegységekből kialakult, fonalas polimerekből összefonódott,csavart szerkezet jellemzi. Az ostor mechanikus hatásra könnyen leválasztható és különvizsgálható. Enyhén savanyú körülmények között (pH 3) detergenssel a flagellum roncsokból afehérje felszabadítható és kémiailag vizsgálható. A mechanikusan eltávolított flagellumviszonylag gyorsan, egyetlen generációs ciklus alatt regenerálódik.Bacillus pumilus esetében hat fonalból épülő szekezet fogja körül a belső üregescsatornát. Az ostor elhelyezkedése genetikailag meghatározott, jellemző taxonómiai bélyegkéntelfogadott. Közönséges mikroszkóppal, áteső fényben, natív készítményben a flagellum nemlátható. Rögzített készítményben, tanninsavas fuchsinnal kezelve azonban láthatóvá tehető.243

Elektronmikroszkóppal megfigyelhető az alaptestből eredő mozgásszerv anatómiai felépítése (J.Bacteriol. 94:458.1967; 95:2374.-1968). Két csapágyszerű képletenkeresztül nyúlik a sejtmembrán belsőoldalán képződő ostor. Az egyikcsapágyszerű képlet a külsőlipopoliszacharid membránba vanrögzítve, a másik csapágy acitoplazma membránba ágyazódik. Aforgást biztosító alaptestből (motor)induló fonal egy elhajló csőtengelyenkeresztül jut a sejten kívüli térbe. Amozgásszerv rögzítésében a sejtfal isfontos szerepet nyer. Lizozimmalkészített szferoplaszton az ostoranatómiailag jelen van, demozgásképtelen.Az Escherichia coliostorainak mozgása másodpercenként20 µm távolság megtételét teszilehetővé. A vizsgálatok szerint 11 génkódolja az alaptestet felépítő fehérjéketés egy gén a fonal építőelemét, aflagellin nevű globuláris fehérjét (40kDa). A flagellin cisztein nélkülifehérje, kevés aromás aminosavmellett jelentős mennyiségbentartalmaz glutaminsavat ésaszparaginsavat. Kémia szerkezetük amozgásképesség szempontjábólmeghatározó jelentőségű. Tirozin helyett beépülő p-fluorfenilalanin mozgásképtelenné teszi azostort. Egyetlen aminosav cseréje mutagén kezeléssel a flagellinben felfüggeszti az ostorműködését. A fehérje különlegessége, hogy ε-N-metillizint tartalmaz. A kész fehérje utólagosmetilezése ellenállóvá teszi az ostort bizonyos proteolitikus hatással szemben. Az ostorfehérje acitoplazmában redukált körülmények között képződik, de oxidáló környezetben végzi feladatát.A két ostorral rendelkező Spirillum esetében megfigyelhető, hogy miközben az ostorok 40fordulatot végeznek a baktérium teste ellenkező irányban 12 fordulatot tesz. A megtett útmásodpercenként 50 µm.Az ostor mozgató mechanizmusát részletesen a nyeles baktériumokon vizsgálták. ACaulobacter fajok főleg édesvízben előforduló, kissé görbült, hegyesedő végű pálcák.Előszeretettel tapadnak elhalt baktériumokhoz. Különlegessége ennek a csoportnak, hogymorfológiailag különbözik az irreverzibilisen rögzített nyeles sejtté alakult őssejt a rajzósejttől.A laboratóriumi körülmények között növekedő tenyészet kétféle sejtet tartalmaz, egy rögzítettosztódó, úgynevezett „anya”-sejtet és egy „mozgékony” alakot. Mivel a két sejtcsoport közöttiélettani különbség a mozgékonyságban jelentkezik, az anya és a leánysejt egyszerűenszétválasztható. Az anyasejt és az utód könnyű elkülöníthetősége a tenyészet szinkronizálásátmegkönnyítette. Az elkülönített rajzó sejtek szinkronizált fejlődése lehetővé tette azegyedfejlődési ciklus szubcelluláris differenciálódási jelenségeinek a részletes vizsgálatát. Amozgékony rajzó sejten poláris ostort, az ostor körül pilusokat látni, de itt találjuk a DNS- és244

RNS-fágok receptorait is. A fejlődési folyamat későbbi szakaszában az ostor elvesztésével afágérzékenység is megszűnik. A nyeles sejt fággal nem pusztítható el. A nyél kifejlesztését amembrán és a peptidoglükán falszintézis fokozódása kíséri. A nyél anatómiai felépítésében jólkimutatható a külső és belső membrán között elhelyezkedő peptidoglükán réteg. (Amembránszintézis esetleges genetikai hibája megakadályozza a nyélképződést!)Nem véletlen, hogy az elmúlt évtizedekben Shapiro, Poindexter, Newton és mások éppen aCaulobacter crescentus (ATCC l5252) baktériumon végezték az ostormozgás molekulárisbiológiai vizsgálatát. Kutatómunkájuk eredményeként ma a fejlődési folyamat kitüntetett enzimeitkódoló gének térképét is ismerjük. (Microbial Develop. l984 Cold Spring Harbor Lab.)xxxxxxxxxxxxx-a fejlődési ciklus történései---60 perc alatt történnek-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-pilin szintézis-xxxxxxxxxxx-metil-akceptor képződésxxxxxxxxxx-észteráz képződés-xxxxxxxx-nyélképzés-xxxxxxxxxxxxxxx-ostorkötő képződés-xxxxxxx-flagellin B-xxxxxx-flagellin A-xxxxxxx-flagellin A-xxxxxx-DNS replikáció-xxxxxxxxxxxx-foszfolipid szintézis-xxxxxxxxMérhető etiltranszferáz aktivitás100 11 53 12Mérhető metilészteráz aktivitás100 10 100 -Mérhető metilakceptor aktivitás100 1 50 6A kifejlődött nyeles sejtben hamarosan megindul a pilin nevű fehérje szintézise, valamint aDNS-állomány megkettőződése. Később, időben jól követhetően indul meg a mozgásszervfehérje építőelemeinek a szintézise. Az ostor hasonló szerkezetű, de kromatográfiával elkülönít-245

hető (flagellin-A, flagellin-B) alegységekből épül fel. Az ostor mozgását beindító kemotaktikusfolyamat működésében résztvevő enzimek (metiltranszferáz, metilészteráz, metilakceptoraktivitás) szintézise is ebben a szakaszban folyik. Ez utóbbi enzimek aktivitása az elkészült rajzósejtben éri el a maximális szintet. Növekedés szempontjából kedvező körülmények között afejlődési program várakozás nélkül fut tovább. Az elkészült rajzó sejt a nyeles sejtről leválvamegtapadásra alkalmas helyet keres, azt megtalálva elveszti ostorát és nyelet fejleszt majd pediga DNS megkettőződésével kezdetét veszi egy új szaporodási ciklus; amely (peptont ésélesztőkivonatot tartalmazó tápközegben) 50-60 percig tartó fiziológiai folyamat.Caulobacter crescentus ostormozgató mechanizmusának elektronmikroszkópos fotójaAz ostor mozgásához - a rotor forgásához - a membrán külső és belső felülete között kialakulópotenciálkülönbség (proton-grádiens) szolgáltatja a mozgató erőt. A proton a tengely mellett asejt belseje felé haladva kerül ( –NH 2 + H + >>>> –NH + 3 ) a motor aminocsoportjára, ahonnan azálló gyűrűn (stator) levő –COO – csoport a potenciálkülönbségből következően magához rántja,elmozdítja a forgórészelemet. Egyetlen fordulathoz 256 proton szükséges. Nem véletlen, hogyaz ostormozgás sebességét az elektrontranszport-rendszer teljesítménye, az oxigénellátottságmértéke, végeredményben a kialakuló protongrádiens mértéke számszerűen határozza meg.(Mikroszkóppal megfigyelhető a fedőlemezzel fedett natív készítményen a bekövetkezőoxigénhiányt követően az ostormozgás leállása, illetve a mikroszrvezetek vándorlása afedőlemez széle felé, az oxigén irányába.)Egyenes vonalú egyirányú haladás esetén a rotor másodpercenként 60-100 fordulatot végez azóramutató járásával ellenkező irányban. Az óramutató járásával egy irányban forgó rotor abaktériumsejtet bukdácsoló mozgásra, helyben maradásra készteti. A rotor forgásának irányát akemoreceptor fehérje (CheY) állapota határozza meg. Foszforilezett állapotban (CheY-P) a rotorforgása az óramutató járásával egyező irányú, ami bukdácsoló mozgásra készteti a sejtet.246

Defoszforilezett állapotban viszont a kemoreceptor fehérje (CheY)járásával ellenkező irányba mozdítja, ami egyenes vonalú mozgást gerjeszt.A kemotaxis fehérjék (Che) irányító hatásaBukdácsoló mozgásEgyenesvonalú mozgás(a célpontban) (a cél felé haladás közben)CheZ(foszfatáz) PiCheY-PCheYa rotort az óramutatóCheACheA-Pinaktív foszfokinázATP ADPaktívált foszfokinázATP ADPCheB_____________________________________foszfatázCheW mediatorPi(inaktív foszfokinázt aktíváló fehérje)CheB-PCheB-P -vel aktívált metilészterázHO-CH 3CH 3OC=OCOOHH-C-HH-C-HH-C-HH-C-H-CO-NH–CH–CO-:::-CO-NH–CH–CO-:::a CheR kemoreceptor (kemotaxis) fehérje glutamil-láncaiS-adenozil homociszteinCheR transzmetilázS-adenozil metionin>>>>>AMPhomociszteinmetiltranszferázmetionin>>>>>>PP

a karboxi-metilezettsége befolyásolja. A metilezett kemoreceptor fehérje mennyisége az S-adenozil-metionin függő transzmetiláz (CheR-fehérje, 30 kDa) és a CheB-P fehérjekarboximetil-eszteráz aktivitásának az arányától függ. A kemoreceptor fehérjéhez kötődőaktiváló vegyület (tápanyag) serkenti a fehérje metileződését. Az aktivátor távozása viszont ametilészteráz működésének kedvez. Ez a metilezett kemoreceptor fehérje (CheR) intracellulárismediátort (CheW) termel, amely az inaktív foszfokinázt aktiválja.A prokarióta haladási irányát végül is a környezetében jelenlevő aktiváló vegyületkoncentrációja, illetve a kemoreceptor fehérjén eltöltött idő hossza határozza meg. Az aktiválóanyag forrásánál, a receptor fehérje csaknem állandó metilezettsége a CheY-P állapotnakkedvez, azaz a mikroszervezet helyben maradva bukdácsol, mert az ostor az óramutató járásávalegy irányban végzi a forgó mozgását.A sejtburokba rögzített kemoreceptor (Kr)és a mozgásszerv kapcsolatának vázlata248

MIKROSZKOPIKUS GOMBÁK VILÁGAA Mucor rouxii sejtfal összetétele különböző életciklusban a szárazanyag százalékábanélesztő alak Fonalas alak sporangium hordozó SpóraKitin 8,4 9,4 18,0 2,1Kitozán 27,9 32,7 20,6 9,5Mannóz 8,8 1,6 0,9 4,8Glükuronsav 12,2 11,8 25,0 1,9Glükóz - - 0,1 42,6Más cukor 4,3 5,4 3,0 4,8Fehérje 10,3 6,3 9,2 16,1Lipid 5,7 7,8 4,8 9,3Foszfát 22,1 23,3 0,8 2,6Melanin - - - 10,3A FIZIOLÓGIAI FOLYAMATOK A CITOPLAZMÁBANHifacsúcs vázlatos rajza(elektronmikroszkópos felvételek alapján)fontosabb reakció utak vázlatait.Áteső fényben a citoplazma sejtfallalkörülzárt üres tér. Fáziskontrasztmikroszkóppal – nagyobb nagyításban –szerkezeti elemek jelenlétét észleljük.Elektronmikroszkóppal viszont azábrán bemutatott, sejtmaggal,vakuólákkal, vezikulummal, membránszerveződésekkel, mitokondriumokkalés riboszómákkal tele beltartalmatszemlélhetünk. A citoplazmábanfolynak az élet fenntartásáhozszükséges felépítő és lebontófolyamatok. A gombák – a vad törzsek– nitrátból és valamilyen szénforrásból(Czapek-Dox táptalajon) is képesek aszervezetük felépítéséhez szükségesanyagok teljes választékát (fehérjék,zsírok, szénhidrátok, vitaminok)előállítani. Sőt a szubsztrátszintűfoszforilációval az élet fenntartásáhozszükséges energia (ATP) nyerése islehetséges. A citoplazmában zajlóanyagcsere folyamatok a gombakörnyezetéből felvehető vegyületekbőlszerzett elektronok felhasználásávalállítja elő az élettani folyamatokszempontjából fontos redukáló miliőt.Nézzük tehát a citoplazmában folyó249

TRANSZPORT FOLYAMATOK AZ ÉLESZTŐSEJTBENAz előzőekbnen már tárgyalt, enzimszinten érvényesülő szabályozási folyamatokon kívül,igen fontos szabályozó szerepet tölt be a gombasejtekben kialakult anyagátvitelimechanizmusok szelektív működése. A citoplazmában a fehérje képződés jól elkülöníthető,membránnal elválasztott szerkezeti egységekben folyik, amelyek közötti anyagvándorlásmeghatározó módon befolyásolja az anyagcsere teljesítményét.A pórusokkal rendelkező kétrétegű membránnal határolt sejtmag (Nukleusz) szoroskapcsolatban működik az őt körülvevő hálózattal (Endoplazmás Retikulum). A riboszómáknagyobbik hányada az ER citoplazma felé néző, külső membránjához kötődve végzi élettanifeladatát. Az itt készülő termékek tovább alakulása a hálózattal szoros kölcsönhatásban levő,ugyancsak membránnal határolt Golgi-apparátus ciszternáiban folyik. Természetesen asejtmag pórusain kiáramló, érett mRNS-ről is készül fehérje, a citoplazma fehérje-elemeihezkötődő szabad riboszómákon. További szerkezeti elemek az energia ellátás szempontjábólfontos mitokondriumok, endoszómák, peroxiszómák. Fontos élettani, gyüjtő szerepet tölt be agombasejtben, a nagyméretű, kétrétegű Vakuola.Ezek a szerkezeti elemek, részben elektron-mikroszkóppal, illetve a folyamatok soránképződő fehérjét zölden fluoreszkáló peptiddel fuzionáltatva, fénymikroszkóppal iskimutathatók. (Molecular Biology of Cell 1997,8:233-242)Nem kétséges, hogy a sejten kívüli térbe juttatott, valamint a szerkezeti elemek közöttianyagvándorlást, jól igazolható egységek, sok esetben egyrétegű membránnal határoltvezikulumok segítik Különösen gazdag a post-transzlációs változtatásokat, és a tramszportfolyamatokat katalizáló specifikus fehérjékben, a Golgi apparátust és az endoplazmásretikulumot (ER) határoló membrán.250

A fehérje forgalmat a vezikulumokat burkoló, a kiszemelt célszervecskén található targetnekmegfelelő membránfehérje irányítja.(a)—A Golgi apparátusban készült, onnan távozó membrán fehérjébe csomagolt vezikulum(SEC, szecernáló) közvetlenül a citoplazma membránon keresztül távozhat a környezetbe.(b)—Más esetben a Golgiból kiváló vezikulum, (PGE; endoszoma) viszi a képződményt azelővacuolába (PVC).(c)—De előzetes vakuoláris testecske(PVC) alakjában jelenhet meg a Golgiapparátusban készült fehérje, amelybőlkialakulhat a (d) membránon át távozó(már említett SEC) szerveződés. Azelőzetes testecske (PVC) általában többvakuolát tartalmazó (MBV) testté alakul,amely az összegyűjtött anyagot a kétrétegűmembránnal elkülönített, nagyméretűvacuolába, más esetben a plazmalemmánkeresztül a környezetbe juttatja.(e)— A nagyméretű vakuolába kerülvevégzi feladatát a Golgi apparátusbanképződő (ALP) alkalikus foszfatáz.(f)—Megjegyzendő, hogy tápanyag hiánymiatt éhező sejtekben, a Golgi apparátustólfüggetlen (API; autophagic)szerveződésből is bekerülhetnek — kettősmembránnal határolt vezikulumokba zárva— bizonyos önemésztő enzimek, anagyvakuolában felhalmozódó anyagokmobilizálása céljából.(g)—A külvilág felöl a kétrétegűplazmalemmát (citoplazma membrán)körülölelő sejt-fal különíti el környezetétől az élesztőt. A fontosabb termékeknek aplazmalemmán való áthaladására speciális transzport fehérje szerveződések szolgálnak /a-Faktor, Galectin-1, különböző membrán-fehérjék/. A kiválasztandó fehérje kapcsolódva az a-faktor fehérjéhez alkalmassá válik a membránon való áthaladásra.251

Eukaiótákban a bőséges energia tartalékra támaszkodó intenzív növekedési fázisban termelődőglutation-fölösleg által elősegített aminosav transzport fedezi a fehérjeszintézis aminosavszűkségletét. A γ-glutamil transzferáz élettani igény szerint könnyen cseréli a ciszteinhezkapcsolódó aminosavat, amit azután a citoplazmában tevékenykedő peptidáz szabadít fel a tRNSfeltöltését végző aminosav aciláz számára.H H H H O H H H H H H O H H H| | | | || | | | | | | || | | |HOOC—C—C—C—C--C—N—C—C—SHHOOC—C—C—C—C—N—C—C–SH| | | | | H CH 3 | | | | HH 2 N H H H H | | H 2 N H H H |O=C—— N—C—CH—CH 3O=C —– N— C—H| | | |H COOH H COOHACV tripeptid glutation tripeptid (G-SH)δ -adenil-ciszteinil-valinγ −glutamil-ciszteinil-glicinKiegyenlített növekedést biztosító ATP szint serkenti a glutation szintézist. Az optimális glükóz-6-foszfát szint pedig a glutation reduktáz NADPH igényét kielégítve biztosítja a citoplazmábana redukáló körülményeket, így a glutationt is aktív (redukált) formában tartja.NADP + NADPH + H +G-6-P 6-P-G G–S–S–Gglükóz-6-foszfát dehidrogenázNADPHglutation reduktázA glutation reduktáz élettanilag fontos szerepet játszik aa dezoxiribonukleinsav ellátás folyamatában NADP +2 G–SH oxigénvíz252

SZÉNHIDRÁTMETABOLIZMUS A CITOPLAZMÁBANSzubsztrátszintű foszforiláció mechanizmusa fonalas gombákban (vázlat)GLÜKÓZGlükonsavATP ∆g° FAD + glükóz-oxidáz FADH 2exokináz -16 kJ ???ADP NADP + NADPHG-6-P6-PGG6P dehidrogenáz (-NADPH)G6P-izomeráz +1,6 kJ NADP + CO 2F-6-P6-PG dehidrogenáz(−ATP,−citrát) ATP P i NADPHF6P-kináz bisz-foszfatáz Ru-5-P(+ADP,+AMP) epimeráz |F-1,6-P 2 | -14.2 kJ ADP Xu-5-Paldoláz +23,98 kJ foszfoketolázP iDHAP GAPizomerázAcetil-PNAD + P iGAP dehidrogenáz + 6,279 kJNADH1,3-PGADPPG kináz-18,84 kJATP CoA-SH P i3-PGPG mutáz | + 4,43 kJ foszfotranszacetiláz2-PGPG enoláz |−−>H 2 O + 1,8 kJP-E-PADPpiruvát kináz-31,39 kJ(+FDP −citrát)ATP TPP CO 2 NAD + NADH CoA-SHPIRUVÁTΑcetil-S-CoATPP piruvát dehidrogenáz ( −ATP )Piruvátdekarb oxiláz NADHCO 2tejsavdehidrogenázACETALDEHIDNADH NAD +TEJSAVzsírsavszintézisalkoholdehidrogenázterpénszintézisNAD + ETANOL253

254

100 mmol glükózból képződő fermentációs termék pékélesztő tenyészetbenVajsav 0,21 mmol Etanol 129,9 mmolTejsav 1,37 mmol Butándiol 0,7 mmolEcetsav 15,15 mmol Glicerin 32,3 mmolHangyasav 0,49 mmol szén-dioxid 148,5 mmolBorostyánkősav 0,68 mmolAnaerob is működőképes hexózmonofoszfát-út és a pentózfoszfát-ciklus vázlata6 G-6-P + 12 NADP + ------------------------------------------> 6 CO 2 + 5 G-6-P + 12 NADPH6 glükóz-6-foszfát (G6P)O 6 NADPH G6P-dehidrogenázI6 glükonolakton-6-foszfátD------> 6 HOHA6 glükonát-6-foszfát (6PG)T 6 NADPHV ---------------------> 6 CO 26 ribulóz-5-foszfát (Ru5P)RE epimeráz izomerázVE 2 + 2 xilulóz-5-foszfát (Xu5P) 2 ribóz-5-foszfát (R5P)RZtranszketolázIB 2 glicerinaldehid-3-foszfát (GAP) 2 szedoheptulóz-7-foszfát (Se7P)ILItranszaldolázS2 eritróz-4-foszfát (E-4-P) 2 fruktóz-6-foszfát 2 (F6P)ÁT transzketolázALAKizomerázUL 2 GAP DHAP 2Á 2 (F-6-P)SaldolázIfruktóz-1,6-biszfoszfát (F-1,6-P 2 )SZ Pi foszfatázAK fruktóz-6 foszfát (F-6- P)ASG6P-F6P izomerázZ5 GLÜKÓZ-6-FOSZFÁTA törzsfejlődés színpadán a környezetből felvehető anyagok jelenléte lehetőséget adott egyegyenzim elvesztésére, bizonyos reakció utak átrendezésére, elgyengülésére, amivégeredményben a diverzitás fokozódásához vezet. A sejtpartikulában folyó reakció utakenzimei – szinte kristályos formában – szoros asszociációban teljesítik feladatukat.255

Az EUKARIÓTA sejt citoplazmájában folyó szénhidrátanyagcsereMŰKÖDŐ ENZIMEK:1); hexokináz2); foszfoglükomutáz3); UDPG-pirofoszforiláz4); trehalóz-foszfát szintház5); trehalóz-foszfát foszfatáz6); trehaláz7); glükogén szintház8); glükogén foszforiláz9); α(1-4),(1-6) glükozidáz10); foszfoglükóz izomeráz11); mannitol-foszfát dehidrogenáz12); mannitol-foszfát foszfatáz13); mannitol dehidrogenáz14); foszfofrukto-1-kináz15); fruktóz-1,6-bisfoszfatáz16); aldoláz17); triózfoszfát izomeráz18); GAP dehidrogenáz19); foszfoglicerát mutáz20); enoláz21); piruvát kináz22); piruvát karboxiláz23); foszfoenolpiruvát karboxikináz24); fruktóz-6-foszfát-2-kináz25); fruktóz-2,6-bisfoszfatáz26); malát dehidrogenáz27); „malic”enzim28); laktát dehidrogenáz29); piruvát dekarboxiláz30); alkohol dehidrogenáz31); piruvát dehidrogenáz256

257

SZÉNHIDRÁTMETABOLIZMUS A CITOPLAZMÁBAN1); xilóz-5-foszfát foszfoketoláz2); dihidroxiaceton szintház3); alkohol oxidáz4); dihidroxiaceton reduktáz5); dihidroxiaceton kináz6); glicerol foszforiláz7); glicerinfoszfát oxidoreduktáz8); GAP- dihidroxiaceton-foszfát izomeráz9); hexokináz (pentokináz)258

Izoprén-oligomerek bioszintézise a fontosabb köztestermékek bemutatásávalacetoacetil-CoA-szintetáz2 acetil-CoA>>>>>>>>>>>>> CoA-SHacetoacetil-CoA CoA-SH COOHH-C-Hβ-hidroxi-β-metilglutaril-CoA HO-C-CH 3>>>>>>>>>>> 2 NADP + H H OH H3 R-mevalonát HO-C--C--C---C--COOHmevalonát-kináz

A plazmalemma (gombamembrán) építőeleme a szkvalénből képződő ergoszterinxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx260

SZKVALÉNSzkvalénből a szterán váz kialakítása, azergoszterin képződése, a fölösleges metilcsoportok eltávolítása oxigén jelenlétét igényli!A táptalajban jelenlevő, energiaforráskénthasznosítható glicerid, illetve ásványolaj mindenesetben a mikroszervezet válaszreakcióját váltjaki. A hasznosítást elősegítendő a mikrobák hosszabb-rövidebb adaptációs idő után a lebontólipolitikus vagy hidroxilező enzimek hatásos működését befolyásoló, detergens jellegűanyagokat választanak ki. A mikroszervezetek egy része extracelluláris lipázt termel, másesetben a membrán külső oldalához kapcsolva működnek ezek az enzimek.Ásványolajat hasznosító szervezetek feszínén a szénhidrogén hidroxilezésére alkalmasenzimkomplexek (oxigenázok) szaporodnak fel. A lipolitikus aktivitás eredményekéntfelszabaduló zsírsavak acil-CoA formájában jutnak a sejtbe, ahol a katabolikus folyamatok (ßoxidáció)fűtőanyagaként vagy szénforrásként kerülnek hasznosításra.A zsírsavak megtalálhatók membránt alkotó foszfolipidek építőelemeiként is. A membránépítőelemeinek a képződését a membrán közelében rögzített enzimek katalizálják. Itt képződneka 14-18 szénatomszámú zsírsavak és a membránt felépítő foszfolipidek.A vízben nem oldódó trigliceridből a membránhoz kötött diglicerid aciltranszferáz választja leaz első zsírsavat, amely egy átészterezési folyamat keretében CoA-S-acilát formájában jelenikmeg a citoplazmában.A diglicerid a foszfatid-foszforiláz hatására ATP felhasználásával foszfatiddá alakulva résztvehet a sejtmembrán felépítésében vagy pedig az α-glicerinfoszfát acil-transzferáz egy újabbzsírsavat választ le róla CoA-acilát formájában.A folyamat végén visszamaradó α-glicerinfoszfát egy NAD-függő-dehidrogenáz segítségéveldihidroxiaceton-foszfáttá oxidálódva kapcsolódhat az anyagcserébe.261

A ZSÍRSAV SZINTÉZIS ÉS LEBOMLÁS ÖSSZEHASONLÍTÁSAZsírsavlebontó komplex (transeszteráz*) Savhordozó (ACP) fehérje komplex1); Malonil transzferáz (működését a jelenlevő zsírsavak alloszterikusan gátolják)2); β-ketoacil-CoA szintház3); D-β-ketoacil-CoA reduktáz4); D-β-hidroxi-acil-CoA dehidratáz5); acil-CoA reduktáz6); acil-CoA dehidrogenáz7); L-β-hidroxi-acil-CoA dehidrogenáz8); ketoacil-CoA tioláz* a transeszteráz az igényeknek megfelelően segít felhasználni a képződött zsírsavat262

PLAZMALEMMA és az ENDOPLAZMATIKUS RETIKULUMA citoplazma és a sejtfal között található az elektronmikroszkópos felvételeken jóllátható háromrétegű membrán, amit plazmalemmának neveznek. A sejtfaltól megszabadítottprotoplasztból könnyen nyerhető és vizsgálható.Gombaprotoplaszt előállítására a Helix pomatia gyomornedve eredményesenhasználható. Ez a helikáznak nevezett készítmény több mint harminc enzim keveréke (glükanáz,mannanáz, glükuronidáz, kitináz, stb.). Jó eredménnyel használható a novozim nevű készítmény,amely egy gombatenyészet (Trichoderma nemzetség) által termelt enzimkeverék. Aplazmalemma felépítésében és feladatában a prokariota membránhoz hasonlítható. Az észlelhetőkülönbség a foszfolipidet és fehérjét tartalmazó plazmalemma jelentős szterin-tartalmából (főlegergoszterin) következik. Ez az amfipátiás, poláros és apoláros molekularészt tartalmazó vegyület1:5 - 1:10 arányban szerepel a membrán építőelemei között. Nem véletlen, hogy a szterinszintézise szinte minden gombában kimutatható. A membrán szterin tartalmával függ össze agombák szaponin és polién érzékenysége. A polién a szterinhez asszociálódva károsítja amembrán szerkezetét.Régebbi irodalom a gombák között tárgyalja az Oomycetes csoportot, amelynek hírhedtképviselője a szőlőperonoszporát okozó Plasmopara viticola. Ezek membránja nem tartalmazszteroidot, amiből következik hogy az oomycetes csoport növekedését nem gátolják a poliéntípusú fungisztatikumok, hiszen nincs amihez kötődjenek. Rézérzékenységük színtelen algajellegükből következhet.A gombasejtekben sok membránnal körülvett kisebb-nagyobb vezikulum és vakuólumfigyelhető meg. Különösen sok apró vezikulum található a növekedő csúcsi részében. Ez a belsőmembránrendszer valószínűleg hasonló szerepet tölt be, mint a magasabb rendű szervezetekGolgi-apparátusa.263

A vakuólumok bioszintetikus enzimrendszerei az endoplazmás retikulum vázlataEzek a kisméretű vezikulumok részben a plazmalemmából lefűződő transzport feladatot ellátó(endocitózis) lizoszómáknak tekinthetők, de – kapcsolatot teremtve a belső és a külső tér között– szekréciós feladatot (exocitózis) is elláthatnak. Az öregebb, vastagabb falú micéliumban avakuólumok száma csökken, méretük viszont jelentősen megnő. A sejtfal építőelemeit és azenzimeket az endoplazmás retikulumból származó vezikulumok szállítják a plazmalemmához.A vezikulumokat a potenciál grádiens hajtja a növekedő csúcs, a csúcsi test felé. A csúcson –25mV, 7-8 mm-rel hátrább –127 mV membránpotenciál mérhető. A vezikulumok a hifacsúcson aplazmalemmával összeolvadva végül is a periplazmás térbe kerülnek, ahol az általuk szállítottépítőelemek elhelyezkednek a sejtfalban.A periplazmás térbe nyúlnak a membránbólfelpödrődött, lomaszómaként ismert képletek. Az endoplazmás retikulumban képződővezikulumok az öregedő fonalakban összetapadva egyre nagyobb méretű, úgynevezettszekunder lizoszómákat, nagyméretű vakuólumokat alkotnak. Ezek a vakuólumok aplazmalemmáról lefűződő és a környezetből származó tápanyagokat hordozó vezikulumoktartalmát is magukba fogadhatják és ezzel bizonyos anyagok képződését, illetve raktározásátteszik lehetővé.Az építőelemek behelyezkedését elősegítendő, a sejtfal apikálisan növekedő szakaszán asejtfal építőelemeit fellazító, ugyancsak vezikulumok által szállított hidrolázok működnek. Az újépítő elem az így fellazított sejtfalelemek közé csúszva, oda beilleszkedve foglalja el helyét. Agombasejtfal növekedő szakaszán a felépítő és a lazító hatás közel egyensúlyban van. A fella-264

zuló sejtfalat a belső nyomás tágítja, és az így képződő lazult fonalak közé épül be az újabbépítőelem. Ugyanez figyelhető meg a micélium elágazásakor. A micélium valamelyikszeptumában megjelenő csúcsi test elindítja a folyamatot, fellazítja a sejtfalat. A belső nyomáshatására kitüremlő ágacskával megindul a másodlagos hifa növekedése.Az eukariotákban folyó felépítő és lebontó folyamatok, a biokémiai mechanizmusok, améretekből adódóan sokkal inkább partikulákhoz kötötten, különböző méretű vezikulumokban,illetve ezek felületén rögzített enzimek irányításával folynak. Természetesen a glicerid illetveásványolaj szénforráson növekedő gomba ilyenkor a acetil-CoA-ból építi fel szervezetét. Azéletműködéshez szúkséges építőelemeket a glükoneogenezis szolgáltatja. A zsírsav lebontásból(ß-oxidációból) származó nagymennyiségű FADH 2 visszaoxidálása, az elektron oxigénrejuttatása, a mitokondriumban működő, cianidra érzéketlen, hidroxamáttal viszont gátolhatóalternatív oxidációs mechanizmus feladata.NADH ox. < (cianidddal gátolható)flavin e e – oxidatív foszforiláció e – 1 / 2 O 2enzim e –NAD + < > red e–alternatív légzés>H 2 O(cianid-rezisztens szalicilhidroxamáttal gátolható)Az elektron útja az oxigénhezA prokariótákban a bioszintézisben, vagy lebontásban szereplő enzimek génjei általában egyoperonban, egymás mellett helyezkednek el és a transzláció során képződő fehérjékgyakorlatilag enzimasszociátumot (komplexet) alkotva, a képződött reakciótermékeiketközvetlenül juttatják a reakciósorban résztvevő következő enzim aktív központjába. Aprokariotáknál előfordul egy-egy enzimsor átmeneti felszaporodása, túltermelődése. Azeukariotáknál ez elvétve tapasztalható.Az eukarioták vezikulumai nem csak a reakcióút szorosan asszociálódó enzimeitfoglalják magukba, de hierarchikus rendszerbe szerveződve a termék felhasználási helyérejuttatásában is tevékenykednek. A vezikulumokban működő enzimek ebből következőenhosszabb életűek, viszont szabályozott képződésük is több időt igényel. A sejtpartikulában folyóreakciósor enzimei – szinte kristályos formában, saját kristályvizükben – szorosasszociációban teljesítik feladatukat. Ez az eukariotákat jellemző működési mechanizmusnéhány példán jól demonstrálható.265

A MITOKONDRIUMA gombák energianyerő folyamatai (a redukált kofaktorok regenerálása) speciálissejtszervecskében, a mitokondriumban (kondrioszóma) folynak. Az Altmann által 1890-ben leírtsejtszervecskét Benda nevezte el mitokondriumnak 1898-ban. Warburg 1925-ben azonosította alégzőenzimet "Atmungsferment", Krebs pedig 1937-ben ismertette a citrát-kör ott működőenzimeit. A mitokondrumot méretéből következően fénymikroszkóppal látni lehet. BorisEphrussi 1949-ben fedezte fel azt, hogy az élesztő oxidatív foszforilációját sejtmagon kívül levőfaktor szabályozza. Lehninger bizonyította l950-ben, hogy a citrát-kör és a zsírsavak ß-oxidációja a mitokondriumban folyik. A mitokondriumban folyó önálló fehérjeszintézistMcLean igazolta 1958-ban. A mitokondriális DNS részletesebb jellemzésére azonban l966-igkellett várni, de csak a nyolcvanas években vált ismertté az élesztő-mitokondriumban találhatóDNS térképe. A mitokondriális DNS első szekvenálását Anderson végezte 1981-ben.Az élesztőben működő mitokondriális körkromoszóma térképeA gének exonjai=fekete szakasz.Citokrom b = CYTb. Citokrómoxidáz=COI,COII, COIIIA belső membeán prokaritajellegű Ez a kettős membránnalburkolt szervecske, saját DNS- ésRNS-készlettel, valamint sajátRNS-polimerázzal rendelkezve acitoplazmában helyezkedik el.A riboszómális fehérjeszintéziseis prokariótákra jellemző módongátolható. 27 féle tRNSA kőrkromoszómát alkotómitokondriális DNS (mtDNS) 5-7replikációs origóból indulva amagból származó enzim általkettőződik – a forgó kör modellszerint – függetlenül a magbanfolyó replikációtól.– A gombasejtössz-DNS tartalmának 5-15 %-atalálható a mitokondriumban. Amitokondriumok száma a fiziológiai igények függvényében változik.A mtDNS által kodoltgéneket hosszú AT gazdag intergenikus szakaszok választják el. A mag-eredetű, 145 kD méretűRNS-polimeráz működését, a transzkripciót 12-13 promoter szekvencia indítja. A 40 kD méretűspecifikus inditó fehérje (mitochondrial transcription factor) segíti a polimeráz megtapadását.Élesztő sejtben a citoplazmamembrán kozelében találhatókAz élesztő mitokondriumaiban működő, kettős spirál szerkezetű DNS — az eubaktériumokhozhasonlóan — szuperfeltekeredett állapotban, fehérjeburok nélkül található. A mérete aSaccharomyces cerevisiae esetében 60-70 ezer bázispár. Más gombáknál széles határok közöttváltozhat A Schizosaccharomyces pombe mitokondrium kromoszómája alig nagyobb mint azemlőssejt mitokondriumának DNS tartalma, amely mindössze 16500 bázispárt tartalmaz. Azeddigi ismereteink szerint a Torulopsis glabrata mitokondrális kroszómája mindössze 18,9 kb-ttaralmaz, az Agaricus bisporus kromoszóma mérete viszont 176 kb méretű.Különlegességük, hogy a mitokondriumban nem működik a "repair" rendszer. Ezért amitokondrium DNS-e sérülékeny. 3-5-ször gyakrabban mutál mint a magi-DNS. Az egyetlen266

gént érintő változást mit — mutációnak, a fehérjeszintézist érintő, például tRNS mutációt pedigsyn — mutációnak nevezzük. Ez nagyobb problémát nem okoz, mert több példányban létezvegyakorlatilag heteroplazmonként a gének a sejt számára mozaikos elrendeződésben működvefolyamatosan kielégítik a gazdasejt igényeit. Jelenlétük csak különleges tenyésztési körülményekközött igazolható. A szükségletnek megfelelően szaporodó több példányban előforduló szervecskékközül minden esetben az életképesebb mitokondrium hosszában megnyúlva osztódik éskerül az utódba. A folyamatosan szaporodó tenyészetben a szelekció következtében 20-30generáció után a heteroplazmon homoplazmonná nemesül a mutált DNS-t tartalmazómitokondrium hátrányos élettani helyzete miatt.SEJTSZERVECSKÉKA kloroplaszt az oxigénképzés mellett a sejt ATP ésNADPH ellátását biztosítja.A mitokondrium viszontNADH felhasználásával atoxikus oxigént redukáljavízzé, miközben az ATPellátást is biztosítja.A CITRÁT CIKLUS ÉS A GLIOXILÁT CIKLUS BIOKÉMIAI REAKCIÓIP-E-PADP-31,39 kJPEP-piruvát kináz (+FDP −citrát)karboxiláz ATP CoA-SHGDP TPP CO 2 NAD + NADHP i CO 2 PIRUVÁT Acetil-S-CoACO 2PEP CO 2 ATP piruvát dehidrogenáz ( −ATP )karboxi piruvát karboxiláz (+acetil-CoA)kinázGTP ADP citrát szintetáz ( −ATP )oxalát és OXÁLACETÁTacatátGlutamáttranszaminázα-ketoglutarátASZPARTÁTNAD(P)H >>>>>NADH CITRÁTmalic enzim almasav dehidogenáz − 28,046 kJ akonitát hidratáz(citoplazma)NAD(P) +

TCA(Szent Györgyi-Krebs)CIKLUS ÉS A GLIOXILÁT CIKLUS SZERVEZŐDÉSE1); citrát szintetáz ( -ATP )2); akonitát hidroláz3); izocitrát dehidrogenáz4); α-ketoglutarát dehidrogenáz komplex CoA-SH, GDP-GTP[szukcinil CoA szintház, glutamát dehidrogenáz, glutamát dekarboxiláz, etc.]5); szukcinát dehidrogenáz [FADH 2 ]6); fumaráz [fumársav + H 2 O = almasav]7); almasav dehidrogenáz [almasav NADH+H + --- NAD + oxálacetát]8); isocitrát liáz [glioxilát és szukcinát]9); malát szintetáz [glioxilát + acetil-CoA almasav]10); piruvát dehidrogenáz [acetil-S-CoA képződés]11); piruvát karboxikináz [oxálacetát utánpótlás]12); „malic” enzim [almasav képződés a citoplazmában!!]268

ATP szintetázA mátrixban felszaporodó redukáltfaktorok dehidrogénezése (pl. NADH),az oxidoreduktáz aktivitás szolgáltatja aprotont a mátrixba került toxikus oxigénredukálásáhozA kettős membrán mögött, a mátrixbanfolyik az eukarióta szervezet oxidatívenergiakonzerváló folyamata, az ATPszintézis.A belső membrán mögött találhatómatrixban végzi feladatát a citokróm-c,a citokróm b 2 és a citokróm c peroxidáz.Az itt működő enzimek génjeinek egyrészét a mitokondrális DNS hordozza.Más részüket a magi DNS tartalmazzaTzagoloff és munkatársainak avizsgálatai szerint a mitokondriumkromoszómán találjuk az oxidatívfoszforiláció néhány génjét. Nevezetesena belső membránban működő citokrómoxidáz I, II, III alegység génjeit (a IV, V,VI, VII alegység génjei a magikromoszómán találhatók).269

A mitokondriumban működő elektrontranszportláncAz elektron áramlás iránya NADH.H + –tól UQH F feléElektronáramlás útja UQH 2 től Cytochrom c feléfeléfeléA cytochrom rendszer segíti a donorból származó e – célba jutását NADH-tól az oxigénig (H 2 O)A közben kialakuló membrán-potenciál, (protongrádiens) ATPázt működtetve katalizálja azADP + P i >>ATP reakció keretében az ATP képződését. [ATP képzés – oxidatív foszforiláció]Az ATP formájában rendelkezésre álló energia:A bioszintetikus folyamatok energiaellátását:a DNS szintézist (replikáció); az RNS szintézist (transzkripció); a Fehérjeszintézist (transzláció)és a poszt-transzlációs folyamatok energiaigényét elégíti ki270

Mitokondriális gén határozza meg az Apocitokróm b fehérje szerkezetét. A mtDNS hordozza ariboszóma nagy alegységének a 21S rRNS génjét és a kis alegység 15S rRNS információját. Akét alegység fehérjemolekuláinak szerkezetét magi DNS kódolja, kivéve az egyik mitokondriálisriboszómát alkotó fehérje (var-1) mtDNS-en kódolt génjét.A 10 alegységből álló ATPáz komplex 6-os és 8-as alegységének kódját is a mtDNStartalmazza. A többi alegység génjeit a magi DNS hordozza a 9-es alegység kivételével. A 9.alegység génjét ugyanis az élesztők esetében a mtDNS, az Aspergillus és a Neurosporatörzsekben viszont a magi DNS tartalmazza.A mtDNS kódolja a citromsavciklus génjeit, továbbá az összes mitokondriális tRNSszerkezetét. A húsznál több mitokondriális tRNS egyike a komplementer szálról íródik át. Azátírt tRNS 5' végi érését olyan RNáz segíti, amelynek RNS (9SRNS) tartalma mitokondriáliseredetű (RPM1), az enzim fehérje alkotórésze viszont magi eredetű. A belső matrixbanműködik a karbamoil foszfát szintetáz, a citrát szintetáz és a citrát-kör enzimei, az ornitintranskarbamoiláz, az RNS-polimeráz, a mangán-szuperoxid-dizmutáz és az F 1 -ATPázα,β,γ alegységei, de itt folyik a riboszomális fehérjeszintézis. A belső membrához kötődik acitokróm c 1 , a citokróm b/c 1 komplexnek a V. alegysége, a citokróm c oxidáz IV,V,VI,VIIalegységei, az F 0 -ATPáz proteolipid lánca. Fontos szerepet tölt be az ADP-ATPtranszportfehérje. A külső membránban transzportot segítő porin fehérjék működnek.Az elektrontranszportlánc (citokróm rendszer) elhelyezkedése a mitokondriumbanA mitokondriumban a sűrű membránszerkezet miatt különleges körülmények uralkodnak. Afehérjekoncentráció (500 mg/ml) miatt az enzimek szinte kristályos állapotban működnek. Azenzimek közötti kölcsönhatás szupramolekuláris szerveződést tesz lehetővé. Az enzimreakcióterméke közvetlenül a továbbalakító enzim aktív központjába kerül (channeling). Ez a szoros illeszkedésa molekulák orientációját egyértelműen meghatározza, például a szukcinil-CoA >>> almasav átalakulás közben. Szerveződési kapcsolatba kerül a citrát-kör, a zsírsavoxidáció,a cianid-érzékeny légzési lánc enzimrendszere, valamint a szalicil-hidroxamáttal gátolhatócianidrezisztens légzőrendszer.NADH ox. < (cianidddal gátolható)flavin e e – oxidatív foszforiláció e – 1 / 2 O 2enzim e –NAD + < > red e–alternatív légzés>H 2 O(cianid-rezisztens szalicilhidroxamáttal gátolható)Az elektron útja az oxigénhezA mitokondrális gének sérülése ezt a szoros kölcsönhatást, az anyagcsere szerveződését zavarja.A mitokondriumok közötti verseny azonban a hibák eliminálását segíti.271

A MITOKONDRIUM MŰKÖDÉSI VÁZLATANAD + HS-CoA NADH FAD FADH 2ZsírsavO O HS-CoA (TPP) CO 2 ------------------------>CO 2Piruvát H 3 C-C-C-OH acetil-S-CoANAD + NADHAsp Asp---------------------------glicerin-Parginin-ciklus NAD + OAA ----------------------dioxi aceton-Palmasav-------------------almasavNADH--------------->NADH citromsav-ciklus GDPH + e Pil 3 NADH GTPeFADkt FADH 2r CO 2 ----------------------------------------------------->CO 2o NAD +nH + t mitokondriális kromoszómara FADH 2nDNS-szintézisszp FAD RNS-szintézisH + o fehérjeszintézisrmitokondriális riboszómatCN - és CO érzékeny légzésCN - rezisztens légző rendszer2 e − 2 H +1 / 2 O 2 -------------> 1 / 2 O 2 --->H 2 OH + H +P i -----------------------> P i ATPADP--------------------> ADPATP

A SEJTFAL ÉPÍTŐELEMEINEK KÉPZŐDÉSE.A fehérje-poliszacharid komplex építését a plazmalemma belső oldalán elhelyezkedő1,3-glükán-szintetáz végzi a citoplazmában képződő UDP-glükóz építőelemekből. Külön enzimszolgál az 1,4 és az 1,6 kötések kialakítására. A mérhető enzimszint a növekedési ciklusokbaneltérő értéket mutat, legalacsonyabb a sarjsejt leválásakor. Sejtmentes körülmények közöttvégzett vizsgálatok szerint a Saccharomyces cerevisiae-ből izolált glükán-szintetáz aktivitásátfokozni lehetett Mg-ionnal, az UDP és a glükonsavlakton viszont gátolta az enzim működését.A glükoprotein alkotórész szintézise több lépés összehangolt működését igényli. Apékélesztő sejtfalában a fehérje hidroxi-aminosavaihoz (Ser/Tre) O-ß-glikozidos kötésselkapcsolódó mannóz-oligomerek közvetlenül GDP-mannózból származnak.Fehérjéhez kötődő mannóz-oligomer képződése pékélesztőbenDolichoil-PGDP-mannózDolichoil-P-mannózFehérje-Ser/TreFehérje-(Ser/Tre)-mannóz3 x GDP-mannózFehérje-(Ser/Tre)-Man-Man-Man-ManEzek a glikoproteinek olyan fehérjetartalmú poliszacharidok, amelyekben a cukor- molekulák,illetve az oligomerek a fehérjelánc hidroxiaminosavaihoz O-glikozidos, az aszparaginhoz pedigN-glikozidos kötéssel kapcsolódnak. Fő feladatuk a fal fibrilláris elemeinek az összetapasztása.Legismertebb képviselőjük az élesztőben előforduló, lúgban oldódó mannán, amelynek akülönböző hosszúságú, maximum 150 mannozil egységet tartalmazó polimer főláncában amannóz egységek ß-1,6 kötéssel, a manno-oligoszacharid oldalláncok pedig α-1,3, illetve ß-1,3kötéssel kapcsolódnak.A glikoprotein építőelemek képződése a citoplazmában indul, ahonnan dolichoil-foszfáthozkötődve kerül a membránon keresztül a periplazmába, ahol polimannózzá szerveződveglükózaminon keresztül kapcsolódik a fehérje aszparagin eleméhez. A fehérjelánc azendoplazmás retikulumban képződik. A fonalas gombákban a fehérjének az aszparaginoldalláncai lépnek reakcióba a l7-20 izoprénből felépülő dolichoil-pirofoszforil oligoszachariddal.Az aszparagin karboxamid csoportjához N-glikozidos kötéssel kapcsolódó poliszacharidlánc felépítéséhez szükséges UDP-N-acetil-glükózamint és a guanozil-difoszfáthoz kötöttmannóz (GDP-mannóz) egységeket az intermedier anyagcsere szolgáltatja. Eddig a folyamatbanrésztvevő több, mint 23 gén szerepét bizonyították.A kitin szintézisét végző enzim a sejtben képződő N-acetilglükózaminil-uridin-difoszfátbólépíti fel a polimert. Ezt az enzimet, a kitin-szintetázt a plazmalemmához kötve, illetve aprotoplasztokból nyert membránfrakcióban is megtalálták. Itt valószínűleg kisméretű (40-70nm) mikrovezikulumokban (kitoszóma) látens formában halmozódik fel, majd proteolitikushatásra felszabadulva, részt vesz a kitinfonalak továbbépítésében.273

POLIMANNÓZ KÉPZŐDÉSE ÉS KÖTŐDÉSEA FEHÉRJE ASZPARAGIN ÉPÍTŐELEMÉHEZG-6-P > F-6-P > Mannóz-6-PglutaminglutaminsavGlükózamin-6-PM-1-P- acetil-CoACoA-SHN-acetil-glükózamin-6-Pc i t o p l a z m a |N-acetil-gükózamin-1-PUTPGTPN-acetil-glükózamin-UDP============== Dolichoil-P UMP ================ ========Dol-PP-N-acetil-glükózaminN-ac-glükózamin-UDPm e m b r á nDol-PP-(N-acetil-glükózamin) 2GDP-ManDol-PP-(N-acetil-glükózamin) 2 -Man3 x GDP-ManDol-PP-(N-acetil-glükózamin) 2 -Man 4 Dolichoil-PDol-PP-Man-Man-Man-Man-Man2 Dol-PP-(N-acetil-glükózamin) 2 -Man 9Dolichoil-PDol-P-glükóz 3|3 x G-1-PDol-PP-(N-ac-glükózamin) 2 -mannóz 9 -glükóz 3=========================Fehérje-(Aszparagin)Dolichoil-PP=============Fehérje-(Asn)-(N-acetil-glükózamin) 2 -mannóz 9 -glükóz 3p e r i p l a z m a3 x glükózFehérje-(Asn)-(N-acetil-glükózamin) 2 -mannóz 93 x GDP-mannózFehérje-(Asn)-(N-acetil-glükózamin) 2 -mannóz 1250 - 300 x GDP-mannózFehérje-(Asn)-(N-acetil-glükózamin) 2 -mannóz 60-300A 12-17 mannozil egységből álló belső szakasz N-glikozidos kötéssel egy N,N -diacetil kitobiózegységen keresztül a peptidlánc aszparagin tagjához kapcsolódik. A külső régióban foszfátészterekkapcsolhatják az oligomereket egymáshoz. A fehérje hidroxi-aminosavaihoz (szerin éstreonin) rövidebb, maximum négy mannóz egységből álló oligomerek kapcsolódhatnak.Az enzim működésének szabályozása a sejtciklusoknak megfelelően feltétlenül indokolt, mégiseddig a szabályozás mikéntjéről megbízható adatokkal nem rendelkezünk. Lehet, hogy ugyanaz274

a proteáz, amely az aktiválást, a vezikulumból való kiszabadítást végzi tovább hatva inaktiváljaaz enzimet. Mások a citoplazmában képződő gátló fehérje hatására gyanakodnak.Az élesztőre jellemző fehérje-mannán sejtfal szerveződése275

A DIMORFIZMUS jelenségének a kiváltásához látszólag mindössze egyetlen paramétermegváltozása elegendő, mégis tisztában kell lennünk azzal, hogy bonyolult biokémiai ésszabályozási mechanizmusok működésének az eredőjeként jelenik meg a markáns változás.Sok esetben a tápközeg összetételétől függ a növekedés formája. A Candida albicansmiceliális alakjában a sejtfal glükoprotein-mannán építőelemét diszulfidkötések merevítik.Cukortartalmú tápközegben a glükózbontás (NADPH képződés) fokozza a redukáló aktivitást,ami a diszulfidhidak felnyílását okozva elősegíti az élesztő formában való növekedést.A cisztin-reduktázhoz hasonlóan különböző thioreduxin reduktázok például aproteindiszulfid-reduktáz végzi el ezt a feladatot a redukált flavin enzim segítségével. A flavinenzim redukált állapota a NADPH felesleg függvénye. Ez a jelenség glükóz hiányábanciszteinnel (redukáló ágens) is kiváltható.Micéliumos alakÉlesztőszerű alakGlikoprotein-mannán| proteindiszulfid reduktáz |Glikoprotein-mannánSSH|SSH| |Glikoprotein-mannánGlikoprotein-mannánFlavin enzim redFlavin enzim ox.H NH 2 H| | |H–C—C—COOHH–C–SH| | 2 |S H H–C–NH 2| |S H cisztin reduktáz COOH| |H–C—C—COOH A redukáló környezet hatása a diszulfid kötésekre| |H NH 2 A flavin enzim redukált állapota a NADPH felesleg függvényeAz élő szervezetben uralkodó oxidáló illetve redukáló állapotról számszerüsítve tudósít azszulfhidril csoportot tartalmazó vegyületpárok (így a glutation) oxidált illetve redukáltállapota, például a G-SH : G-S-S-G arány alakulása.Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx276

277

AZ ÉLESZTŐFÉLÉK (ZYMOMYCOTA) SZAPORODÁSI VISZONYAIA csoport elnevezése tudománytörténeti. Az alkoholos erjedés enzimeinek hordozóikéntmegismert élesztőgombákat a görög erjedés szóval különböztették meg a szénhidrátot nemerjesztő aerob gombáktól. A sejtmagot tartalmazó mikroszkopikus szervezetek közül azélesztők élettani vizsgálatát, elsősorban az évezredes múltra visszatekintő gyakorlatihasznosításuk, az élvezeti cikként népszerű alkoholos italok előállításában játszott szerepükindokolta. Az idesorolt családok közös ismérve az ellentétes polaritású sejtek összeolvadásávalképződő, régebben aszkusznak nevezett zimosporangiumban fejlődő zimospóra. Atömlősgombákat jellemző posztmeiózisos mitózis a valódi élesztőféléknél hiányzik, azimosporangium néhány kivételtőleltekintve négy zimospórát tartalmaz. Atömlősgombák elméleti és gyakorlatiszempontból jelentős csoportját képezőélesztőfélék szaporodási viszonyainakmegismerése indokolt. A fejlődésiciklusokat bemutató rajz a tagozatrajellemző haplo-diplobion szaporodás és aspóraképzés vázlatát mutatja. A sarjadzóélesztők morfológiailag ismegkülönböztethető életciklusban,haploid illetve diploid formábanlétezhetnek. A diploid formábanszaporódók álhifáinak sejtjei hosszabbak,mint az aktívan növekedő, invazívhaploid alak sejtjei. Komplett táptalajon aMata/Matα diploidok estében mindigpolárisan jelenik meg a sarj sejt, ezzelszemben a haploidok axiálisansarjadzanak. A homozigóta diploidok(Mata/Mata, illetve Matα/Matα) álhifát alkotó sejtjei is hosszabbak, azonban axiálisansarjadzanak. Az élesztőfélék közül a Saccharomyces cerevisiae szaporodási folyamatairólrendelkezünk a legtöbb ismerettel. A faj genetikailag tiszta állományú törzsei vagy a-ivarúak(MATa-gén) vagy α-ivarúak (MATα-gén). Az itt szerepet játszó gének közül eddig 32működését ismerjük. A vegetatív sarjadzást a jól ismert Cdc28 cyclin függő kináz indítja el aCln1, Cln2, Cln3 cyclinek segítségével. Hatására különböző folyamatok indulnak:DNS szintézisAz irányító testecske kettőződéseEgyéb cyclinek képződése: például Clb5, Clb6A fehérje foszforilációt befolyásoló proteinfoszfatáz képződése278

Az anafázis/metafázis átmenet befolyásolja aG1 fázis hosszát. A fázis átmenetet (anövekedés sebességét), gátolva az anafázisindulását a cAMP befolyásolja. Magas glükózkoncentráció viszont, megnövelve a cAMPfoszfodiészteráz szintet, radikálisan csökkenti acAMP koncentrációt. Ha ellentétes ivarú törzsnincs jelen, akkor a sarjadzó sejtekgénállománya mitózisos osztódással képződik.A folyamatot az interfázis G-1 szakaszában acdc28-gén (cell division cycle) működése indítjael. Mindenekelőtt a maghártyán levő, centriolumszerű képlet kettőződik. Ez a képlet azosztódásban irányító szerepet tölt be. Akövetkező lépés a DNS-replikáció, amit aAz élesztő mitózisos osztódásamikrotubulusokból szerveződő osztódási orsókialakulása követ. A kromoszómák szétválását ez a szerkezet segíti elő. A folyamat általában90-120 percet igényel. Ez a szétválás már sarjadzás közben történik. A szülő sejt és a leánysejtközött csupán a szaporodási heg számában van különbség. A folyamatot befejezi a sejtosztódásra érett méretre növekedése.Optimális sejtsürűség esetén, nem fermentálható szénforráson, nitrogén hiányos körülményekközött, a fejlődési ciklus G 1 fázisában kapcsol át a mitotikusan osztódó sejt metabolizmusa asporuláció irányába. Laboratóriumi körülmények között az átkapcsolás kálium acetátszénforrást tartalmazó táptalajon provokálható.Glükóz adagolás represszálja a folyamatot. Aszilárd táptalajon és vizes szuszpenzióban is bekövetkező sporulációs folyamat genetikaiindítása a metabolizmus szintjén is drámai változást okoz. A trikarbonsav és a glioxilát ciklusfokozott működése növeli a glutaminsav képződést. Feltűnően csökken az 2-ketoglutrátdehidrogenáz aktivitás. A glioxilát ciklus terhére meginduló glükoneogenezis enzimeinek afokozott képződésén kívül, megkezdődik a trehalóz felhalmozás, amely a spóra fizikai éskémiai (hő, só, oldószer) ellenállóképességét növeli. A hexózmonofoszfát út fokozottműködése elégíti ki a zsírsav szintézishez szűkséges NADPH igényt. A pentózfoszfát ciklusműködésének köszönhető, a spórafal ellenállóképességét növelő ditirozin tartalmú chitozánburok arómás építőelemeinek a képződése .α−faktor H 2 N-Trp-His-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr-COOH (α I -S feromon)CH 3 CH 3 CH 3| | |H 2 C C CH 2 C CH 2 C/ \ // \ / \ // \ / \ // \S CH CH 2 CH CH 2 CH CH 3(a I -S feromon) |a-faktor H 2 N-Tyr-Ile-Ile-Lys-Gly-Val-Phe-Trp-Asp-Pro-Ala-Cys-COO-CH 3Amennyiben a tenyészetben kellő számban heterotallikus tulajdonságú ellentétes ivarú — aMATa gén, illetve α alléljét tartalmazó — sejt van, akkor megindul a szexuális szaporodásiciklus, amely több mint 5 óra alatt fejeződik be. Első lépésként az általuk kiválasztottferomonszerű (S = substantia) vegyületek kölcsönösen leállítják a cdc28-gén működését. Az α-ivarú sejtek az α I -S, az a ivarú sejtek pedig a feromon a I -S változatát állítják elő. A feromonokdodeka- és tridekapeptidből és ezek oxidált formájából álló fehérjék.279

Egyidejűleg mindkét ivari ciklusra készülő sejt feromont kötő fehérjét (Guanin nukleotidot kötőα, β és γ fehérjét tartalmazó hetero-trimer) termel. A feromon hatására az élesztősejtekmegkezdik az agglutinációs faktorok (a-AF=hőstabil glükopeptid, illetve az α-AF=hőérzékenyglükopeptid) termelését. Az ellentétes agglutinációs faktort termelő törzsek ezután páronkéntSaccharomyces cerevisiae ivaros és ivartalan szaporodásának vázlataösszetapadva élettani folyamataikat szinkronizálják. Az α I -S hatására az a-ivarú sejtek, az a I -Sferomon hatására pedig az α-ivarú sejtek a citoszkeleton átrendeződésével nyúlványtfejlesztenek, gametangiummá alakulnak. (A sejtek saját feromonjaikkal szemben érzéketlenek.)280

A gametangiummá alakuló sejtek összeérő sejtfala feloldódik, majd a két sejt plazmájaösszefolyik, bekövetkezik a plazmogámia. A két sejtmag a KAR-gén hatására egymás felé úszik,majd összeolvadva (kariogámia) a sejt valódi zigótává (2n gonatokonta) úgynevezettblasztozigótává alakul.Elegendő tápanyag jelenlétében a zigóta sarjadzása diploid sejttenyészet (diplofázis)kialakulását teszi lehetővé. A diploid sarjadzással készülő sejtekben a MAT gén a és α allélja isjelen van, ezért szexuálisan inaktív, újabb ivaros szaporodásra képtelen. A tápközegszéntartalékának kimerülésekor, vagy nitrogén éhezés estében a diploid sejtek meiospóra anyasejttéalakulnak. Ez az átalakulás egyedüli szénforrásként acetátot tartalmazó táptalajon 4 óránbelül bekövetkezik..A meiózisos folyamat első lépéseként az I-profázis keretében a DNS-állomány megkettőződik,létrejön a 4n állapot. Ezt követi a II-profázis, amelyben a kromoszóma állomány kétleánymagra különül. További szétválással alakul ki a négy haploid prospóra génkészlete. Ezzelegyidejűleg megindul a többrétegű spórafal képződése, valamint a spóraplazma sűrűsödése. AII-telofázis végére mind a négy haploid zimospóra (két a ivarú és két α ivarú) érése befejeződik.A kiszabaduló spórák megkezdhetik vegetatív szaporodásukat (sarjadzás).A sarjadzó gombák életciklusa, a heterozigóta diploid meiospóra anyasejtből(2ngonatokonta) fejlődő aszkospóra képződéssel válik teljessé. A vegetatívan szaporodóhaploidok, illetve a homozigóta diploidok nyílvánvalóan aszkuszt nem képezhetnek. Abonyolult folyamatot az irodalom több (’early’, ’mid’, ’mid-late’, ’late’) szakaszra osztvatárgyalja. A folyamat a meiozis inditásával kezdődik, mégpedig többek között, atranszkripciós folyamatot aktiváló, sporuláció-specifikusnak tekintett, Ime1 fehérjeközreműködésével. A vizsgálatok szerint az IME1 a meiozis idején sok esetben, de nemmindig, jelentős mértékben kifejeződik. Optimális sejtsürűség esetén, nem fermentálhatószénforráson, nitrogén hiányos körülmények között, a fejlődési ciklus G 1 fázisában kapcsol áta mitotikusan osztódó sejt metabolizmusa a sporuláció irányába. Laboratóriumi körülményekközött az átkapcsolás kálium acetát szénforrást tartalmazó táptalajon provokálható. Glükózadagolás represszálja a folyamatot. Az acetát metabolizmusa széndioxid képződéssel jár. A–tápközegben, a pH érték egyidejű emelkedésével HCO 3 ionok szaporodnak fel. Pufferolttáptalajon, a pH emelkedés visszaszorítása a sporulációs folyamatot gátolja. Bikarbonátadagolással, viszont a viszonylag híg tenyészet sporulációja is kiváltható.A sporulációért felelős gének vizsgálata eddig megbízható eredményt nem hozott.Ohkuni és munkatársai közlése szerint (1998.Yeast 14:623-631) malát-dehidrogenáz hiányosmutánsban bikarbonát adagolás hatására az IME1 és az IME2 mRNS képződés szignifikánsanemelkedik. A később átíródó Ime2, a körülményektől függően pozitív és negatív hatást iskifejthet a sporuláció különböző szakaszaiban. Guttmann-Raviv vizsgálatai szerint (2002.Molecular and Cellular Biology 22:2047-2056) a feltűnően rövid életidejű, bomlékony Ime2,asszociálódva az Ime1-gyel in vitro a fehérje C terminális szakaszának foszforilezettségétbefolyásolja. A MAP kináz jelátviteli (signal transduction cascade) szerepe bizonyított asporuláció késői fázisának bekapcsolásakor is. A kísérleti adatok szerint az Ime1 stabilitása invivo az Ime2 protein kináz aktivitásától függ. Az IME1 átírása azonban az IME2 mellett mássporulációt befolyásoló gének átírását is befolyásolja, amelyek a meiozis indításában fontosszerepet játszhatnak.A szilárd táptalajon és vizes szuszpenzióban is bekövetkező sporulációs folyamatgenetikai indítása a metabolizmus szintjén is drámai változást okoz. A trikarbonsav és aglioxalát ciklus fokozott működése növeli a glutaminsav képződést. Feltűnően csökken az 2-ketoglutrát dehidrogenáz aktivitás. A glioxalát ciklus terhére meginduló glükoneogenezisenzimeinek a fokozott képződésén kívül, megkezdődik a trehalóz felhalmozás, amely a spórafizikai és kémiai (hő,só,oldószer) ellenállóképességét növeli. A hexózmonofoszfát út fokozott281

működése elégíti ki a zsírsav szintézishez szűkséges NADPH igényt. A pentózfoszfát ciklusműködésének köszönhető, a spórafal ellenállóképességét növelő ditirozin tartalmú chitozánburok arómás építőelemeinek a képződése .A spórázás folyamatában érdekelt gének sérülése esetén a folyamat megrekedvekülönleges sejtvonalak kialakulására vezet. A KAR-gén sérülése esetén a folyamat a prozigótaállapotig jut el. Az így létrejövő dikarion sejtvonal vegetatív úton sarjadzással szaporodhat. Az iselőfordul, hogy a diploid sejtek (blasztozigóta) tovább alakulásának gátlása a kedvezőtlenné válókörnyezeti hatás ellenére a diploid élesztő vonal fennmaradását okozza. Ha az elindult ivarosfolyamat valamilyen okból nem végződik zigótaképzéssel, akkor adaptálódásnak nevezettfolyamat keretében visszaalakulhat haploid sarjadzó sejtté.Sok esetben a szexuális folyamat zavartalan lefolyásának előfeltétele az ölő (killer)tulajdonság jelenléte. Az úgynevezett "killer-gén" egy olyan toxikus fehérje képződését segíti,amely a környezetben levő idegen élesztő törzseket elpusztítja. Az ölő toxin elleni védelmet, asaját toxinnal szembeni rezisztenciát három működőképes kromoszómális gén biztosítja. Azölő anyagot termelő sejtekben két nem szegmentált kettős szálú RNS vírus — a V-1 és a V-2 —található. Azonban nem csak ez a két virion szükséges az ölő toxin képződéséhez, hanem magikromoszómális gének aktív tevékenysége is nélkülözhetetlen. A MAK gének többsége a V-2,néhány pedig a V-1 RNS fonal képződését segíti elő. Megjegyzendő továbbá, hogy a V-2 öröklődésea fentieken kívül még néhány kromoszómán kódolt gén jelenlétét igényli. Bármelyikükhiánya a virion-RNS széttörését okozza. AV-1 virion 4,6 kb méretű dsRNS fonala kódolja akapszid fehérjét és az RNS-függő polimerázt. A V-1 virionból kizáródó +RNS szálról a gazdariboszómáin képződik a tok fehérje és a RNS függő fúziós fehérje, amit a V-2 vírus csomagolóanyagként használ. Az RNS fonalak aszinkron módon a fejlődési folyamat különbözőperiódusában a virionon belül szintetizálódnak a magi gének által kódolt fehérjék aktívközreműködésével. A V-2 virionban levő kisebb méretű 1,8 kb méretű dsRNS fonal +RNS szálakódolja a preprotoxin fehérjét, amit a gazdasejt magi DNS (KEX gének, killer expression) általkódolt fehérjék által irányított érési folyamat aktivál. A környezetbe való kiválasztást a SECgének segítik. Az aktív toxin (killer faktor) az idegen gomba glükán sejtfalán levő receptorhozkötődve kálium és proton kiáramlást okozó pórust képez.Néhány élesztőfaj esetében magi kromoszómában rögzített killer tulajdonság isismeretes. A Kluyveromyces marxianus var. lactis killer fenotipusát két plazmid, acitoplazmában található 8,9 kb méretű pGKL1 és a 13,4 kb méretű pGKL2 plazmid hordozza.Az 1-es plazmid kódolja a toxint és az immunitást jelentő fehérjét; a 2-es plazmid pedig a DNSpolimerázt és az DNS függő RNS polimerázt. Maga a toxin – amely idegen törzs esetében asejtciklust a G1 fázisban állítja meg – heterotrimer glükoprotein. Az α-alegység S-S hidakkalmerevített glükoprotein. A β ás a γ alegységet is S-S hidak kapcsolják egymáshoz.Megjegyzendő, hogy a Killer fenotipust eredményező RNS vírusok, illetve plazmidok hatása sokesetben a tömlős és bazídiumos gombáknál is jelentkezik.A Saccharomyces cerevisiae homotallikus törzsei a genom programozott átrendeződésemiatt a párosodási típusuk megcserélésére, a III. kromoszómán lokalizált MATa és MATαallélok egymásba alakulására képesek. A homotallikus törzsekből képződő telep — mivel asarjadzás közben képződő a illetve α sejtek zömmel konjugálnak — a/α sejteket tartalmaz . Azátalakulást a IV. kromoszómán lokalizált endonukleázt kódoló homotallia gén (HO gén)irányítja. Párosodási típus váltásra csak a többször próbált anyasejt képes. A sarjadzástközvetlenül megelőzve játszódik le az allélcserélődés folyamata.Amikor a sejtek glükózt tartalmazó komplett táptalajba kerülnek, gyorsan megindul asejtszaporodás. A sarjadzást megelőzi a glükóz anyagcserét és a transzportot befolyásológénekről készülő mRNS szintézise. Ezt a folyamatot nem befolyásolja a cAMP aktuális282

koncentrációja. A glükolizis sebessége (rate) kapcsolatban van — kvázi start jelül szolgál — aCLN3, BCK2, CDC28 gének kifejeződésévelStacionar fázisA táptalaj elfogyasztása után a tenyészet szaporodása leáll. Eredetileg glükózt tartalmazótáptalajon a glikolizis eredményeként fermentatív úton etanol halmozódik fel, ami később, amitokondriumban működő elektron transzport lánc által, a trikarbonsav-ciklus és a glioxalátciklussegítségével használódik fel a sejt szaporodásához. A nyugalmi fázisban a sejt afelhalmozott trehalóz és glükogén tartalékot metabolizálja endogén légzés keretében. Ez azélettani jelenség alkalmas reaktorban, az oldott oxigén koncentráció csökkenését mérve jóldemonstrálható.Fontos élettani kérdés: Milyen hosszú időt képes a sejt elviselni vizes szuszpenzióban,szaporodás nélküli nyugalmi fázisban, a komplett táptalajba kerülés előtt. A túlélés hosszaszempontjából — összehasonlítva a fermentálható szénforráson növekedő sejtekkel —előnyösebb az a szénforrás, amely légzéssel metabolizálódik. A glicerint tartalmazó táptalajonnövekedő tenyészet sejtjeinek túlélőképessége vizes szuszpenzióban lényegesen nagyobb minta glükózon nyert sejteké. A két tenyészet sejtjeinek fehérjetartalma minőségében is eltér. Aglicerinen növekedő sejtekben például a glükóz-neogenezis jelentős aktivitással működik.Fermentálható szénforrást tartalmazó táptalajon az életidő megnövekedésében azadenilát cikláz és a protein kináz aktivitásának a változása döntő szerepet játszik. A cAMPkoncentráció változása több szempontból is meghatározó jelentőségű. Elsősorban hatása aszénanyagcsere szabályozásában jelentkezik, ami az élettartam hosszát közvetlenül illetveközvetve befolyásolhatja. A protein kináz aktivitásának a változása viszont a repairmechanizmus befolyásolásán keresztül növeli a túlélőképességet.283

A GOMBÁK ÖREGEDÉSEA fonalas gombák anatómiai felépítését, valamint telepképző tulajdonságukat ismervenem meglepő az élettani öregedés – szeneszcencia – jelentkezése. Az öregedés első leírásátRizet és Marcou l953-ban közölt dolgozata képviseli. Mégis a biokémiai ismeretek korabeliszínvonala miatt ez a felvetés a szakma művelőinek a figyelmét nem keltette fel. Azalapismeretek hiánya ugyanis nem adott lehetőséget egy elfogadható munkahipotéziskialakítására. Az egyszerű mikroszkópi vizsgálat is felhívja a figyelmet arra, hogy a spórábólkihajtó primer fonal, majd az ebből kinövő, dúsan elágazó szekunder és tercier hifákanyagcsereviszonyai, az apikális növekedésből adódóan jelentősen különbözhetnek. A festődésiviszonyok, a vakuolák mennyisége és mérete, a tartalék tápanyagok elhelyezkedése, a légzésiaktivitás különbözősége, mind azt sugallják, hogy egy gombatenyészetben számolnunk kell azeltérő anyagcsereviszonyok egyidejű jelenlétével. Egy gomba tenyészetében (tallusz) egyidejűlegjelen van az öreg és a fiatal hifa, mégpedig a tenyészet korától függő mértékben. Egy-egykonidiospórából kifejlődő gombatelep morfológiai képe, a koncentrikus körökben elhelyezkedő,szabad szemmel is megkülönböztethető, azonos korú és azonos élettani állapotban levőteleprészek látványa erre az élettani eltérésre hívja fel a vizsgáló figyelmét.A gondos vizsgálatok igazolták, hogy a fajok és törzsek szerint változó mértékűnövekedőképesség genetikai okokra visszavezethető tulajdonság. A jelenség lényege az, hogya gombatelepek növekedésüket az esetben is befejezik, ha a növekedési feltételeikváltozatlanul kedvezőek. Bertrand vizsgálatai szerint a Podospora anserina egyik törzse 22napig fejlődve 15 cm hosszú hifát fejleszt; egy másik törzs viszont csak 285 nap múlvaszüntette be a növekedést több méter hifa fejlesztése után. A jelenség különlegessége abbanjelentkezik, hogy a látszólag legfiatalabb, az éppen növekedő fonal tovább oltása sem javítjaaz életképességet. Ugyanakkor a telep látszólag öregebb részéből még életképes, növekedniképes micélium emelhető ki. A vizsgálatok céljából több méter hosszú, speciális üvegcsövekbenvégeztek növekedési kísérleteket, de hasonló eredményeket kaptak akkor is, ha atovábboltást minden esetben a növekedő telep pereméről végezték. A kísérleti adatok végül isazt mutatták, hogy genetikailag leginkább a telep közepén levő micéliumrész képviseli akonidióspórában rögzített, kiinduló állapotnak tekintett tulajdonságokat. Ennek nem mondellent az a tapasztalat, hogy az agar táptalajon kifejlődött telep közepén – hosszabb időelteltével – végül megindul a telep szétesése, autolízise. Ebben a folyamatban szerepe lehet atenyészetből kiválasztott toxikus anyagcseretermékeknek is.A szeneszcencia elsõ jele a szilárd táptalajon való növekedés lassulása. A hifavégekmegduzzadása, majd a szétesése. Közvetlenül az elhalás elõtt a gomba sok esetben sötétpigmentet választ ki. A micélium ismételt átoltása nem segít, sõt a szeneszcencia aszubkultúrában felgyorsul. A folyamat különlegessége; az öregedési jelenségek átvitele. Aöregedés a sejtmag átvitele nélkül is megjelenhet a "megfertőzött" gombatenyészetben. Invitro kísérletekben, az öregedő hifából nyert tisztított mitokondrium készítményekkel issikerült fertőzni a juvenilis állapotban levő gombatenyészetet. Az öregedő (szeneszcens)tenyészet mitokondriumában plazmidszerű részecskék megjelenését tapasztalták. Nem világosazonban a kapcsolat a plazmidok kiszabadulása és a juvenilis tenyészet fertőződése között. AmtDNS deléciót szenved. A juvenilis törzs 90 kb méretû érintetlen mtDNS-t tartalmaznak. Aszeneszcens törzsben viszont cirkuláris senDNS plazmidszerű replikációra képes elemekjelennek meg. A senDNS kivágódása után újrarendezõdik a mitokondriális genom. Az eredetimtDNS-bõl 30 kb-nyi szakasz marad változatlan. Jelentõsen csökken a citokróm a3 és acitokróm b aktivitás. Az α−senDNS a legismertebb 2539 kb mértû monomer a citokrómoxidáz1 alegység elsõ intronja, amely a reverztranszkriptázzal jelentõs mértékben homológ.284

Az öregedési folyamatot valószínűleg ez a plazmid indítja el. A β−senDNS a COI gén 3' végiszakaszát érintõ 1,1 kb méretű kivágódásból származik.Esser szerint azonban az élettartamra és az öregedésre ható tényezők a sejtmagban iselőfordulhatnak. Vizsgálatai szerint az "i gén" és a "viv gén" képes megnövelni a gombaélettartamát, sőt, a mitokondriummal való fertőzhetőséget is akadályozza. A nukleocitoplazmatikuskölcsönhatás befolyásolja a szeneszcencia megnyilvánulását. A plazmidjellegű gyűrűs DNS kiszakadása a mitokondrium-genom instabilitásával, a DNS-javítórendszercsökkenő működésével magyarázható.Az öregedéssel kapcsolatos biokémiai történések a légző rendszer megváltozásában isészlelhetők. A cianiddal gátolható citokróm rendszer aktivitásának a visszaszorulása, azalternatív légzési lánc működésének az erősödése és a szuperoxid dizmutáz aktivitásának anövekedése jellemzi a változást. Az öregedés tüneteinek a megjelenését a növekedés visszaszorításais akadályozza. A katabolikus repressziót nem okozó, tehát limitált növekedést okozószénforráson fejlődő tenyészetben az öregedés jelei nem tapasztalhatók. Előnyös amitokondriális DNS átírását zavaró (interkalátor) vegyületek, (etidium-bromid, akridin,akriflavin, actinomycin-D) "plazmidtörlők" jelenléte. A közönséges körülmények között 25napig növekedő gomba életkora 0,1 mM etidium bromidot tartalmazó táptalajon 250 naprahosszabbodik. Ezek az interkalátorok a preszeneszcens állapotban is hatásosak. Az öregedéstokozó plazmidokat azonban ezek a vegyületek nem irtják ki, mivel ezek a DNS-szakaszok ajuvenilis időszakban a mitokondriális genomba (temperált fághoz hasonlóan) integrálódvafordulnak elő.A gombák öregedését a membrán stabilitását fokozó vegyületek is késleltetni tudják.Ezek a vegyületek (antioxidánsok, detergensek, aszkorbinsav) megvédik a mitokondriummembránját és a lizoszóma-membránt a lipid-peroxidázok, a szabadgyökök és az oxigénkárosító hatásától. Ezen vegyületek jelenlétében nem csökken olyan nagy mértékben a citokrómrendszer aktivitása. Érdekes szerepet kap az inozit, ez a hatértékű telített gyűrűs alkohol amembrán stabilitásban. A metabolizálható szénforrás hiányában bekövetkező inozit hiány – amezoinozit tartalom csökkenése – elsősorban a lizoszómák felszakadása miatt a proteolitikusaktivitás hirtelen megnövekedését okozza. Ezzel szemben a mitokondrium-membrán stabilitásiviszonyaiban az inozit hiány csak lényegesen később okoz problémát.A Neurospora törzsek szeneszcenciája is mitokondriális plazmidok megjelenésével jár.Itt is észlelhető a lassuló növekedés. Szubkultúrában felgyorsul az öregedés. A hifavégekduzzadása majd szétesése nem jár pigmentképződéssel. Az utolsó szakaszban csökken afertilitás, a konídiumok csirázó képessége is csökkenA kérdés beható vizsgálatát az ipari gyakorlatban felhasznált fonalas gombáktenyészeteiben játszódó folyamatok feltárása is indokolja. Nevezetesen a levegőztetett folyékonytáptalajban növekedő tenyészetekben a szabad szemmel is jól látható pelletek formájábannövekedő mikrokolóniák külső felületi rétege élettanilag az eredeti tenyészettől eltérő tulajdonságúnaktűnik. A pellet külső felületén és belső részében jelentős mértékben eltérhet a tápanyagellátottság és a gázcsere lehetősége.285

A GOMBASEJT mozgató szervének szerveződése és működéseEukarióta flagellum vázlataMivel a valódi gombákban csak Chytridiomycotanemzetségeiben fordul elő mozgásszerv, ezért indokoltnéhány sorban összefoglalni az eukariótákra jellemzőszervecskéről megjegyzendőket. A flagellum anatómiailagés működése szempontjából nem függ a sejt haploid, vagydiploid voltától. Az úszó mozgást a flagellumon végigfutóhullámmozgás váltja ki. A mozgatás energiaigényét aflagellum közelében elhelyezkedő kinetoszómákbanA gombasejtek mozgásszervefelhasználódó ATP fedezi. A flagellum elvesztésekor akinetoszóma is eltűnik.A szaporítósejtek mozgásszerve központi csapkodó mozgással hajtja előre az ellentétespolaritású (haploid) sejtet kereső ivarsejtet. Külső morfológiai szempontból sima felületű(wiplash) periferikus és szőrös felszínű (tinsel) ostor különböztethető meg. Keresztmetszetébenjól látható a citoplazmamembrán alkotta csőben elhelyezkedő 9 pár periferikusfibrillum (mikrotubulus) és a központi tubulusban működő két fibrillum. Az ostor mozgását amikrofilamentumhoz tapadó mikrofibrillum-párok egymás melletti elmozdulása idézi elő. Aflagellum alapteste a plazmalemmán keresztül nyúlik a citoplazmábaEukarióta flagellum vázlataközponti fibrillumpárPeriferikus mikrotubuluspárMembrán burokMikrofilamentumokmikrotubulusok286

MIKROBIÁLIS ELJÁRÁSOK KIDOLGOZÁSAAz ipari tevékenység céljára kiválasztott szervezetek természetes, vagy célzottan előállítottöröklött genetikai állományát a bonyolult élettani összefüggések ismeretében kialakítotteljárásban lehet hasznosítani. A példaként felsorolt eljárások kidolgozásakor minden esetben —nem a mikroorganizmus növekedése, hanem — a céltermék képződése szempontjából optimálisfizikai és kémiai körülmény meghatározása volt a feladat.L-glutaminsav Micrococcus glutamicus biotinban hiányos minimál táptalajon 29 °C-onnövekedő tiszta tenyészetében glükózból, illetve melaszból képződik. (A biotin hiány a zsírsavszintézist befolyásolva a membránt alkotó foszfolipid képződést zavarja. Ez a membránáteresztő képességét növelve elősegíti a glutaminsav megjelenését a környezetben).L-lizin termelésre a Corynebacterium glutamicum melaszt és szójalisztet tartalmazó táptalajon,29 °C-n növekedő lizin analógra rezisztens, Thr – , Met – , Ala – , Leu – mutánsa használható. A lizinkiválasztást lizin permeáz katalizálja.Szitoszterinből kiindulva androszt-4-én-3,17-dion nyerésére gazdaságosan kivitelezetteljárásban a Mycobacterium phlei 9α-oxigenáz hiányos mutáns törzse használható. (A szterinváz bontásának kulcs lépése a 9α−hidroxilezés, amely a ∆ 1 dehidrogénezést követően a szterinváz irreverzibilis felbomlását jelenti)Hőtűrő proteáz előállítására használható a 35 °C-on növekedő Bacillus subtilis módosítottproteáz gént tartalmazó mutánsa.A ß-laktám szerkezetű penicillin gondos pH ellenőrzés, limitált glűkóz szint, és szigorúhőmérséklettartás mellett, a termelő Penicillium chrysogenum törzs idegen mikro-organizmustólmentes, limitált glükóz ellátás miatt idiofázisban lévő tenyészetében felszaporodik.(A tenyészetß-galaktozidáz hiányos volta miatt a laktózt a képződő glükózaminidáz tetramer nagyon lassanbontja, ami a penicillin képződés szempontjából ideális limitált glükóz szintet eredményez.).Citromsav az Aspergillus niger állandó ellenőrzés mellett fenntartott törzsének, idegenmikroorganizmust nem tartalmazó, Mn mentes körülmények között, 24 °C-on nőtt, intenzívenlevegőztetett, idiofázisban tartott tenyészetében glükózból (melaszból) képződik. (A Mn menteskörülmények elősegítik a citrát-permeáz képződését, ami elősegíti a citrát távozását acitoplazmából)287

CITROMSAV TERMELÉS MIKROBIOLÓGIAI ELJÁRÁSSALTörténeti bevezetés. Az élelmiszeripar számára nélkülözhetetlen citromsav üzemi termelése volt az elsőrészletesen vizsgált és nagy méretben bevezetésre került aerob biotechnológiai eljárás. Bár Wehmer alapvetőfelismerése több mint száz esztendős, mégsem állítható, hogy a citromsav előállítására szolgáló eljárásokfejlesztése befejeződött. Wehmer 1893-ban egy kálcium-oxalátot előállító Penicillium glaucum tenyészlevébenmelléktermékként észlelte a citromsav megjelenését. Felfedezésének gyakorlati jelentőségét felismerve későbbfőtermékként citromsavat termelő gombákat keresett és talált, majd ezeket a mikroszkopos gombákat új genusként,a Citromyces nemzetség tagjaiként írta le 1903-ban. A részletes rendszertani vizsgálatok későbbkideritették, hogy a törzsek a Penicillium nemzetségbe sorolandók.A század elején a citromsavgyártásban az olasz termelők monopol helyzetben voltak. Termelésükmeghaladta az évi 10000 tonnát. Egy tonna citromsavat kálcium-só formájában 40 tonna citrom préslevéből nyertek.(Megjegyzendő, hogy most évenként közel félmillió tonna citromsavat használ fel a az élelmiszer- a mosószer- ésszerves vegyipar.) Wehmer érezte felfedezésének ipari jelentőségét, a gyakorlati megvalósításban azonban nem volteredményes.Az első Aspergillus niger-rel végzett citromsavtermelésre vonatkozó szabadalmat Zahorsky B. jelentettebe ( US. Pat. 1065358) 1913-ban. A citromsav termelés ipari megvalósíthatóságát biztosító felfedezés Currie J.M. nevéhez kapcsolódik (1917 J. Biol. Chem. 32:15). Thom C. és Currie J. M. az Aspergillus nemzetségsavtermelő képességét vizsgálva (J. Agric. Res. 7:1) megállapították, hogy ezek a gombák savanyú kémhatásútáptalajon (pH=2,5-3,5) is növekednek, és ez a savanyú környezet a citromsavképződésnek is kedvez. Ílyensavanyú (pH=1,5-2) körülmények között a baktériumos fertőzés már nem zavarhatja a folyamatot, sőt pH=2 alatt,a növekedés részleges gátlása fokozza a citromsav képződést. A felismert és nagyipari méretben is biztonságosanmegvalósítható körülmények viszonylag rövid (1-2 hét) idő alatt a szénhidrát tartalomra számolva 60 % feletticitromsav képződést hoztak.Az első citromsavat termelő üzem 1919-ben készült el Belgiumban. Ezt követte a Chas. Pfizer & Co.üzemének a felépítése az USA-ban. Angliában a Rowntree & Co Ltd. - saját szabadalmát használva (Brit.Pat.266414, 266415) - 1927-ben indította meg a citromsavtermelést. Csehországban a citromsav teremelés - 1928-ban - a Kaznejovban épült üzemben indult meg felületi tenyésztéssel, melaszt hasznosító német szabadalom(Montan und Industriewerke 1924 Ger. Pat. 461356) alapján. Később nagy kapacitású citromsav üzemek épültekNémetországban, a Szovjetunióban és más európai országokban. Ezek az üzemek mind felületi tenyésztésseltermelték a citromsavat, mégpedig olyan olcsón, hogy a citromléből folyó citromsav előállítás elsorvadt. Az olcsóipari termék már nem csak az élelmiszeriparban, de a vegyipar más területén is felhasználásra került.A második világháború után fokozódott az érdeklődés a citromsav iránt. A piac igényeit csak újabbüzemek építésével lehetett kielégíteni. Ezek az üzemek azonban már új technológiát alkalmaztak, a sűllyesztett,levegőztetett, először a penicillin előállításához sikerrel alkalmazott ú.n. mélyfermentációs eljárást.A szakirodalomban a XX. század első felében is számos közlemény foglalkozott a zárt kevertfermentorban megvalósítható citromsavtermelés lehetőségével (Bleyer B. 1924 Ger. Pat. 434729, Kluyver A.J. etal. 1925. Biochem. Z. 161:361). Sőt a Kluyver laboratórium (Perquin. L.H. C. 1938 Dissertation. Techn. Univ.Delft) és a Johnson laboratórium (Shu és Johnson J. J. 1947, J. Bact 54:161, 1948, J. Bact. 56:577) kutatásiertedményei a termelés biztonságát is megalapozták, mégis csak az ötvenes évektől észlelhetjük az ugrásszerűváltozást. A XXI-k században a termelési ár következtében Kína vette át a vezető szerepet a citrát piacon.Citromsav termelésre használható mikroszervezetek viszonylag szűk körét jelöli meg a szakirodalom. Nemismeretes azonban, hogy ez a széleskörű vizsgálatok hiányából, vagy az anyagcsereút néhány nemzetségrejellemző öröklött hibájából következik. A fonalas gombák közül a Penicillium ( P. glaucum, P. janthinellum var.kaensanii, P. restrictum var. kuensanii, P. citrinum.) és Aspergillus ( A. niger, A. avamori, A. clavatus, A.fenecis, A. fonsecaens, A. fumaricus, A. luchensis, A. saitoi, A. usumi, A. ventii) nemzetségen kívül a Botrytiscinerea, a Mucor piriformis, az Ustulina vulgaris és a Trichoderma viride, egy-egy törzse képes számottevőcitromsav termelésre. Ez utóbbi törzs érdekessége, hogy cellulózból is képes citromsavat termelni. A törzsekrendszertani vizsgálatát és az irodalomban megadott termelési adatokat szabadalmi érdekek befolyásolják. Tényazonban, hogy nagyipari alkalmazásra világszerte mindezideig csak az Aspergillus niger ATCC-1015 jelűtörzsből nyert Wisconsin 72-4 (ATCC 11414) törzs leszármazottai kerültek. Mivel az előállítási eljárásszabadalmilag nem védhető, ezért a törzsszelekciós és törzsnemesítő tevékenység mindmáig az egyes üzemekféltve őrzött titka maradt és csak az árviszonyok alakulásából következtethetünk az elérhető termelési szintekre.A megjelent csekély számú irodalmi adat szerint a nagyüzemi termelés alapját képező oltóanyag előállításaállandó szelekciós tevékenységet igényel.288

A citromsavtermelés élettani, biokémiai háttere. Az Aspergillus niger fonalas gombában a glükózmetabolizmusa glükóz-6-foszfátból (G-6-P) két úton folyhat: egyrészt a jól ismert Empden-Meyerhof-Parnas(EMP) szekvenciát követve, másrészt a pentóz-foszfát ciklus irányában a hexóz-monofoszfát (HMP) úton. Nemhagyhatjuk figyelmen kívül a glükóz oxidáz működését, amely a glükózból pH=2,5-4 tartományban glükonsavatkészítve a szénforrás jelentős hányadát képes elvonni a citrát ciklus működését tápláló glikolízistől.A G-6-P képződést a hexokináz katalizálja PEP vagy ATP energiatartalmának terhére. A G-6-P és F-1,6-P 2 képződéshez szükséges ATP a foszfoenolpiroszőlősav piruváttá alakulásakor képződik a piruvát-kinázsegítségével. A HMP irányba történő reakció teljesítőképessége az elágazásnál működő glükóz-6-foszfátdehidrogenáz aktivitásától és a NADP + aktuális koncentrációjától függ. Ezért növekedő tenyészetben (trofofázis)a bioszintetikus folyamatok NADPH igénye miatt az EMP/HMP arány akár 2:1-re módosulhat, miközben acitromsavat termelő törzsek idio-fázisában az EMP/HMP út aránya 4:1. Jelentősebb szabályozó szerepe van afruktózfoszfát-1-kináz-nak, amelyik az ATP energiatartalmát használva a F-6-P—> F-1,6-P 2 átalakulástkatalizálja.Fruktóz-2,6-biszfoszfát szabályozó szerepét bemutató vázlatA fruktóz-6-foszfát és a fruktóz-1,6-biszfoszfát aktuális koncentrációját finoman szabályozza a fruktóz-2,6-biszfoszfát (F-2,6-P 2 ), amely a hexóz lebontást az EMP útra irányítva segíti elő a citromsav képződést. Azalloszterikus hatás a szétroncsolt gombafonalakból kinyert sejtmentes fehérjekivonatban is jól észlelhető. Aszabályozó szerepet betöltő vegyület, a F-2,6-P 2 eltünése lecsökkenti a glikolízis működése szempontjábólnélkülözhetetelen fruktóz-1,6-biszfoszfát képződést. Ez a bonyolult szabályozó mechanizmus a szénhidrátleggazdaságosabb felhasználását biztosítja. Ezért a vad törzsnél csak annyi energiagazdag hexóz-foszfát kerülfelhasználásra amennyi szűkséges a citrát kör táplálására, illetve a bioszintetikus folyamatok NADPH igényéneka kielégítésére. — A szabályozó szerepet betöltő F-2,6-P 2 szintézisét és lebontását egyetlen fehérje katalizálja,mégpedig foszforilezett szeril-oldalláncot tartalmazó fehérje formájában (F-2,6-biszfoszfatázként) lebontja aszabályozó szerepet betöltő F-2,6-P 2 -ot; Defoszforilezve viszont F-6-P-2-kináz-ként viselkedve éppen aszabályozó hatású F-2,6-P 2 képződését katalizálja. Ezt a kettős rendeltetésű Janus arcú fehérjét egy protein-kinázfoszforilezi, a foszfát eltávolítását pedig egy protein-foszfatáz végzi. A protein-kináz működését a metabolikusaktivitástól függő cAMP szint serkenti. A protein-kináz cAMP jelenlétében aktíválódva a F-6-P-2-kinázt F-2,6-biszfiszfatázzá alakítja, aminek következményeként visszaszorul a glükolízis, sőt előtérbe kerül a glükózneogenezis. — Nem véletlen, hogy jelentősebb citromsavképzés csak nagyobb koncentrációban adott glükózjelenlétében várható, amikor a növekvő metabolikus aktivitás csökkenti a cAMP szintet. — Nyilvánvaló, hogy aglükóz felvételét segítő hexokináz aktivitása határozza meg a citrát képződés sebességét. (A glükóz hasznosításátlassító 2-dezoxiglükóz rezisztencia kifejlesztése csökkenti a citrát képződést.) A glikolitikus út működése ésteljesítőképessége szempontjából kulcshelyzetben levő alloszterikus tulajdonságú enzimnek – a fruktóz-6-foszfát-1-kináz-nak – a működését a vad törzsek esetében gátolja a citromsav, de gátló hatású az enzimszubsztrátuma, a sejt energia tartalékát képviselő ATP is. Az enzim aktivitását fokozza az AMP, ADP, éa aszervetlen foszfát. A citromsavat termelő mutánsban éppen itt észlelhető döntő különbség, mégpedig azért, merta magasabb glükóz koncentráció jelenlétében a fruktózfoszfát-2-kináz hatására képződő szabályozó szerepetbetöltő F-2,6-P 2 által aktívált fruktóz-6-foszfát-1-kináz működését nem, vagy alig befolyásolja a citromsav.289

Ammónia jelenlétében nyomnyi gátlást sem lehet megfigyelni. Ebből következőleg nem áll le a glikolíziscitromsav túltermelés esetében sem.H-C=O COOH A CITROMSAV bioszintéziseGLÜKÓZ H-C-OH H-C-OH Aspergillus niger tenyészetébenHO-C-HHO-C-HHexokinázH-C-OH FAD FADH 2 H-C-OHH-C-OH H-C-OHATP------> H 2C-OH H 2C-OHGLÜKONSAVADP H 2C-OPO 3H 2fruktózfoszfát (−ATP, −citrát, +ADP, +AMP, +NH 3, + F-2,6-P 2 , P i)1-kináz H 2C-OPO 3H 2ADP H 2C-OPO 3H 2 H 2C-OHGAP dehidrogenáz2 NADH H 2C-OPO 3H 2glicerinsav-3-A CITOPLAZMÁBAN FOLYÓ GLÜKÓZ BONTÁS-foszfát-kinázglicerinfoszfátmutázHO-C=O2 ATP>>>>>ATP H-C-Hkarboxi- piruvát-- kináz ( − ATP ,+ F DP , + Mg , + Mn , + ,NH + 3 K)0kináz PIRUVÁT HO-C=O TPP CO 2 NAD + NADHADP< CO 2 C=O O=C−S--CoA ADP HO-C=O CoA-SHC=OO=C-OHOXÁLACETÁT NADH NAD+ H-C=H citrát szintetáz H-C-HATP H 2O malátdehidrogenáz HO-C=O HO-C-COOHhidratáz CoA-S-CO-CH 3 H-C-HCOOHO=C-OHCOOH H 3C–COOH MALÁT MALÁTCITRÁT csereCITRÁTOxalát acetátDiffuziómelléktermékek citrát permeáz MITOKONDRIUMban folyó reakciók________________plazma lemma______________________________________plazmalemma_______________________________CITRÁTA környezetet bemutató alloszterikus szabályozó elemek zárójelben szerepelnek;a serkentő +, illetve a gátló − hatás jelölésével290

A glikolízist katalizáló enzimek termodinamikailag meghatározott irányban működve, szabályozás nélkül –önfenntartó módon – a hexózból két molekula piroszőlősavat hoznak létre. — Közben a glükóz felvételéhez és aF-1,6-biszfoszfát képződéséhez szűkséges ATP szubsztrátszintű foszforilezéssel készülhet a Gs-1,3-biszfoszfátglicerinsav-3 foszfáttá alakulásakor, illetve a foszfoenolpiruvátból való piroszőlősav képződés közben.A folyamat szempotjából kritikus pontot jelent a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz kofaktorellátottsága. A NAD + hiány ugyanis áttételesen a citromsavképződést csökkentheti. A citokróm rendszerműködése (a terminális oxidáció) az ATP szint emelésével jár, ami viszont a fruktóz-1,6-biszfoszfát képződésétalloszterikusan gátolná. Megoldást jelent az alternatív oxidáz működése (lásd később), amely ATP képződésnélkül vezeti át az elektront az oxigénre, miközben az energia hő formájában szabadul fel, ami a rendszerhűtésével távolítandó el.A reakciósor másik jól szabályozott pontja az eukariota sejtekben az acetil-CoA-t szolgáltatótiaminpirofoszfátot igénylő enzimkomplex a piroszőlősav-dehidrogenáz. Az enzim működését a vad törzsekbengátolja az ATP és a citrát, de növeli az aktivitását a F-1,6-P 2 , valamint néhány egy-, illetve kétértékű ion (K + ,NH 3 , Mg 2+ , Mn 2+ ). — Az Aspergillus niger törzsekből kinyert piruvát-dehidrogenáz készítményekben a citrátalloszterikus szabályozó szerepét nem csak a citromsavat termelő mutánsból, de néhány citromsavtermelésrealkalmatlan vad törzsből készült enzimkészítményben sem sikerült kimutatni, viszont a F-1,6-P 2 aktiváló hatásaminden enzimkészítménynél jelentkezett.A fentiek ismeretében nem meglepő, hogy az Aspergillus-ok közül került ki a citromsavtermelésrealkalmas mutáns, mert a képződő citromsav csupán egy ponton, a fruktóz-6-foszfát-1-kináz alloszterikusszabályozásánál fejthet ki gátló hatást. Ennek a szabályozási pontnak a kikapcsolásával, klasszikus genetikaimódszerek alkalmazásával létrehozható a citromsavat túltermelő mutáns.A citromsav képződését oxálecetsavból acetil-CoA felhasználásával a mitokondriumban működő citrátszintetáz katalizálja. Ezt az enzimet vad és mutáns Aspergillus törzsekből izolálták, tisztították és igen alaposanmegvizsgálták, különös tekintettel a szabályozottságára. Ezek a munkák, csak a CoA-SH szabályozó szerepétigazolták, ami élettanilag várható is volt, hiszen az acetil-CoA elszívása más esszenciális bioszintetikusfolyamatok leállásához vezetne. A piroszőlősav-dehidrogenáz komplex zavartalanul biztosítja a citrát szintetázműködése közben felszabaduló CoA-SH feltöltését. Az eddig megbeszélt enzimrendszer a citromsavtermelésszakaszában (idio-fázis) szinte teljes mértékben - a micélium növekedése nélkül - a citrát képződést szolgálja.A citromsavképződéshez nélkülözhetetlen acetil-CoA a mitokondriumban jön létre a tiaminpirofoszfátotigénylő piroszőlősav-dehidrogenáz komplex által. Képződését a sejten belüli ATP szint szabályozza.Piruvát + CoA-SH + NAD + acetil-CoA + CO 2 + NADH + H +A reakció a szabadenergia csökkenés (G o =−33,5 kJ) miatt gyakorlatilag irreverzibilis.Az oxálecetsav képződését az Aspergillus-okban a konstitutív piruvát-karboxiláz katalizáljapiroszőlősavból és szén-dioxidból egy ATP energiatartalmát hasznosítva.Piruvát + CO 2 + ATP oxál-acetát + ADP + PA szabadenergia változás csekély volta miatt (2,1 kJ) a reakció reverzibilis. Az enzim működését másmikroorganizmusokban a feldúsuló acetil-CoA kapcsolja be.A foszfoenolpiroszőlősav —> oxálecetsav átalakulást katalizáló foszfoenolpiruvát-karboxi-kinázjelenlétét is sikerült bizonyítani (Bloom S. J., Johnson M. J. 1962 J. Biol. Chem. 237:2718). Az enzim ADPjelenlétében szén-dioxid felvételét segíti elő.foszfoenol-piruvát + CO 2 + ADP oxál-acetát + ATPA citoplazmában működő malát dehidrogenáz a NADH jelentős részét visszaoxidálja, a képződőalmasav pedig koszubsztrátumként a mátrixban képződő citrát transzportját segíti elő a mitokondriumból acitoplazmába..oxál-acetát + NADH malát + NAD +291

ÖSSZEFOGLALVA a fentiek alapján megállapítható, hogy citromsav termelésre használható Aspergillus nigertörzs genetikailag meghatározott képességei lehetőséget adnak olyan technológia kidolgozására, amelynekelőírásait betartva gazdaságos üzemi eljárás keretében nyerhető az élelmiszeripar és a mosószeriparszempontjából is fontos vegyület.1) aktív citrát-szintetáz működése 2) gátolt izocitrát-dehidrogenáz aktivitás3) fokozott oxál-acetát képzés a citoplazmában 4) aktív izocitrát-liáz működés5) fokozott malát képzés a citoplazmában 6) F-1,6-P 2 által serkentett piruvát-kináz7) A fruktóz foszfo-1-kináz citrát érzékenységének F-2,6-P 2 általi felfüggeszthetősége8) a mitokondriumban képződő citromsav az almasavval cserediffundálva kerül a citoplazmába,9) a citoplazmából az energiaigényes citrát permeáz juttatja a tápközegbe a főterméket a CITROMSAVAT.Kérdés, hogy mennyiben befolyásolják a citrát feldúsulást a ciklus enzimei, amelyek a továbbalakulásárólgondoskodhatnak. Elfogadhatónak látszott az az elmélet, hogy a feldúsulás oka az akonitáz és az izocitrátdehidrogenázcsökkent működése. A kísérleti adatok ezt megerősíteni látszottak. Később kiderült, hogy ezek azenzimek rendkívül érzékenyek, és a kísérleti módszerek alkalmatlanok voltak a kimutatásukra. Mattey igengondos munkával bizonyította, hogy a mitokondriumokban található egy akonitáz, amely 90:3:7 citrát : ciszakonitát: izocitrát egyensúlyt állít be (Mattey M. 1977 FEMS Microbiol. Lett. 2:71). Az Aspergillus nigertörzsekben több izocitrát dehidrogenáz működik Ezek az enzimek katalizálják az izocitromsav átalakulását α-ketoglutársavvá egy szén-dioxid felszabadulása mellett. A NAD + függő izocitrát-dehidrogenáz aktivitásaalacsony, alig kimutatható. A NADP + függő izocitrát-dehidrogenáz-ból viszont kettő található amitokondriumban a citrát ciklus tagjaként. Mindkét enzim működését azonban gátolja a citromsav. A harmadikNADP + függő izocitrát-dehidrogenáz a sejtplazmában található, működését azonban nem befolyásolja acitromsav. Az idio-fázisra jellemző NADP + hiány esetén természetesen ez az enzim sem működik.A citrát ciklus enzimeinek a jelenlétére vonatkozólag meglehetősen eltérő adatok találhatók azirodalomban. Sok szerző szerint a termelő törzsben nem található meg az α-ketoglutársav dehidrogenáz., viszontműködik az izocitrát-liáz által elindított glioxilát ciklus. Sőt ez a ciklus nem csak acetát jelenlétében aktív, dekülönlegessége, hogy a glükóz nem represszálja, sőt glükóz szénforráson is aktív. Ez az izocitrat-liáz talángyenge volt a Wehmer által izolált Penicillium glaucum törzsben, ahol először figyeltek meg citrát képződéstglükózból az oxalát képződés melléktermékeként. Az α-ketoglutársav-dehidrogenáz hiánya egyébként nem jelentproblémát, mert a citrát ciklus többi tagja oxálecetsavból reduktív folyamat keretében is képződhet elegendőmennyiségben, sőt a malát-dehidrogenáz esetében ez az út termodinamikailag előnyösebb (Kubicek C. P., RőhrM. 1977 Eur. J. Appl. Microbiol. 4:167) A fumaráz enzim által katalizált reakcióban a szabadenergia változásolyan csekély, hogy a reakció teljesen reverzibilis. A borostyánkősav-dehidrogenáz működését az oxálecetsavbefolyásolja. Az eddig tárgyaltakból látható, hogy az alloszterikus enzimek hibás működése, a konstitutívpiroszőlősav karboxiláz nagy aktivitása, valamint a NADP + függő mitokondriális izocitrát dehidrogenáz-okcitráttal való gátolhatósága lehetőséget ad a citromsav képződésére és a környezetbe való felszaporodására.Kérdés hogyan oldja fel a jóltermelő törzs anyagcsere rendszere az ATP (gátló) szabályozó hatását. Areakciósorban szereplő alloszterikus enzimek (fruktózfoszfát-kináz, a piruvát-kináz, a piroszőlősav dehidrogenázés a citrát-szintetáz) ATP érzékenysége ugyanis a citromsavat termelő mutánsokban is változatlanul jól mérhető.A citromsav képződés glükózból nem igényel ATP-t, sőt némi felesleg marad (egy ATP) minden citromsavmolekula képződésénél. A glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogénezésekor, valamint az actil-CoA képződésekormegjelenő NADH visszaoxidálása viszont az oxidatív foszforilezés eredményeként az ATP szintet a kritikus értékfölé emelné, ami a citromsav képződés drasztikus csökkenésében jelentkezne.NADH ox. < (cianidddal gátolható)flavin e e – oxidatív foszforiláció e – 1 / 2 O 2enzim e –NAD + < > red e–alternatív légzés>H 2 O(cianid-rezisztens szalicilhidroxamáttal gátolható)Az elektron útja az oxigénhezRöhr és Kubicek vizsgálatai szerint a citromsavat termelő törzsekben a NADH visszaoxidálására szolgálóalternatív légzésnek nevezett út egy flavin enzim segítségével ATP képződés nélkül juttatja az elektront a légkörioxigénre víz képződés közben (Kubicek C. P., Rőhr M. 1978 Eur. J. Appl. Microbiol. 5:263). A NADH hordoztaenergia ez esetben hőtermelés formájában jelentkezik. Ezért a technológiai folyamatban a hőelvezetés — arendszer hűtése — fontos szerepet nyer. Ennek a hőmennyiségnek a hasznosítása üzemi szinten a termék árát iskedvezően befolyásolhatja. Ez a cianid rezisztens, de szalicil-hidroxamáttal gátolható elektron transzportmechanizmus magasabb oxigén szintet igényel mint a terminális oxidációban működő citokróm-oxidáz. Ebből292

következően nem meglepő, hogy az oldott oxigén szint átmeneti csökkenése a citromsav képződés leállásával jár,miközben a növekedésben, szárazanyag tartalom változásában károsító hatás nem jelentkezik. — Battivizsgálatai szerint a citrát képződés sebessége könnyen visszaállítható, ha a levegőztetés újraindítása előtt atenyészet pH-ját nátrium-hidroxiddal pH=4 körüli értékre emeljük. Néhány órai növekedés után újra indul acitromsav termelés. — Fokozni lehet a citromsav képződést az oxigén parciális nyomásának a növelésével, alevegő oxigéntartalmának emelésével. Döntő jelentőségű az eljárás eredményessége szempontjából a táptalajalacsony foszfát tartalma. A foszfát szint emelése ugyanis a növekedést serkenti, ez igényli a NADPH képződésfokozását, és előnyben részesíti a cukorsavak képződését. A foszfátszint csökkentése nem könnyű feladat agazdasági szempontból előnyös természetes eredetű tápanyagok felhasználásakor.Sok problémát jelentett a nyomelemek szerepének a tisztázása. Jelenlétük általában káros, ezért atechnológiai folyamatban gondoskodni kell a természetes eredetű anyagokat tartalmazó táptalaj előzetesionmentesítéséről. A Clark D.S. és munkatársai által összeállított táblázat (Biotechnol. Bioeng. 8:463 1966)bemutatja az Aspergillus niger számára a citromsavtermelés szempontjából még elviselhető fémion mennyiséget.Fémion Mennyisége -mg/L Citrát képződés g/LAluminiumKalciumKobaltréz (cupri )vas (ferro)MagnéziumNikkelCinkMangánAl IIICa IICo IICu IIFe IIMg IINi IIZn IIMn II 5800,13100200.15188739090867588867515Összes ionÖssz. ion kivéve Mnadott koncentrációbanadott koncentrációban1474A fémionok között a mangán szerepének a biokémiai magyarázata nem könnyű feladat, mivel a szénhidrátanyagcsere hálózatában tárgyalt néhány enzim stabilitását, aktiválását éppen a mangán ion segíti elő. Mégismindent összevetve a citromsav termelés szempontjából előnyös a mangán hiány. Ez esetben a tenyészetmikroszkópi képe megváltozik, abnormális göcsörtös hifák alkotják a mikro-kolóniákat, mikro-pelleteket.Mangán hiány hatására a pentózfoszfát ciklus aktivitása általában emelkedik, a trikarbonsav ciklus enzimeinek aszintje pedig lényegesen alacsonyabb értéket mutat. Ugyanakkor nagyobb mennyiségben találjuk a gombasejtben(pool) az aminosavakat, a piroszőlősavat, oxálecetsavat és az ammónium iont. Alacsony a sejt fehérje ésnukleinsav tartalma, csökken a triglicerid és a foszfolipid szint. Szignifikánsan emelkedik viszont a sejtfal kitintartalma, miközben a sejtfal ß-glukán és galaktomannán tartalma határozottan csökken.Az ionmentesítés egyik előnyös módjaként komplexképző káliumferro-cianidot adnak a táptalajhoz. Eza komplexképző vegyület a növekedési aktivitás visszafogása, tehát az idiofázis fenntartása szempontjából iselőnyös. A mangán citromsav termelést csökkentő hatása cikloheximiddel jelentősen csökkenthető. Akörnyezetbe kiválasztott citromsav mennyiségét 0,001 mM mangán (55µg/L) 45 %-ra 0,01 mM (0,55 mg/L)mangán 28 %-ra csökkenti. 20 µg/ml cikloheximid jelenlétében a gátló hatás alig jelentkezik, 10-15 %-ot sem érel. Ugyanakkor a mitokondriumban folyó fehérjeszintézist gátló klóramfenikol nem befolyásolja a mangáncitromsavképzést befolyásoló hatását. Megjegyzendő, hogy az utóbbi időben előállították a jól termelő törzsmangán rezisztens variánsát. Az ipari alkalmazására a gyártási titok fátyla borul.— Érdekes eredményeket hozotta rövidszénláncú alkoholok hatása. Mayer vizsgálatai szerint, a plazmalemma szerkezetében okozott változáselőidézésével a tenyészethez adott metanol (1-3%) jelentősen képes növelni a képződő citromsav mennyiségét. Aszénlánc növelésével (etanol, propanol) az előnyös hatás csökken.A citromsav termelés szempontjából meghatározó jelentőségű az oltóanyagot előállító laborat,óriumszerepe. A termelő üzemek piaci aktivitása olyan alacsonyra szorította a termék árát, hogy csak a legjobbantermelő törzsekre kimunkált technológiát alkalmazó cégek maradhatnak versenyben. A sikeres cégek központitörzsfejlesztő laboratóriumai monopol helyzetük megőrzése céljából nem hozzák nyilvánosságra eredményeiket.A termelő üzemek minden esetben a központi laboratóriumból kapják az oltóanyagot, amelyből a gyártási eljárásvégén csak csökkent termelő képességű törzs nyerhető vissza.Az oltóspóra előállítása, az állandó ellenőrző mérések alapján kiválasztott kiváló képességű mutánsfelszaporítása (egészségi szempontból a légúti fertőzés megakadályozása érdekében) különleges biztonságotjelentő körülmények között, hermetikusan zárt légkondicionált gumikesztyűs boxokban folyik. Ezekből a zárttermosztátokból az oltásra használható spóratömeg aszeptikusan zárt formában kerül a felhasználó üzembe. Az293

oltóanyag előállítására szolgáló zárt rendszer kizárja annak a lehetőségét, hogy az oltóanyag a környezetünkbennagy gyakorisággal előforduló vad Aspergillus törzzsel fertőződjön. A gyártás szempontjából ez annálveszélyesebb minél korábbi lépésben kerül a vad törzs az oltóanyagba. A vad törzsek ugyanis rövid idő alatt,könnyen túlnövik a magas termelőképesség miatt hátrányos helyzetben levő nemesített varánst, és ezzel a főfermentációban a citromsavtermelés jelentősen csökkenhet. Az oltó-spóratermelés utolsó fázisát már az üzemvégzi, mivel az itt bekerülő egy-két idegen spóra már nem okoz végzetes tragédiát.A citromsav képződést hátrányosan befolyásolhatja az oxálecetsav hasadásával járó oxálsav képződés,amely reakciót a vas ionok serkentik. Ezért az ionmentesítés a citromsavtermelésre kifejlesztett eljárásszempontjából előnyös.COOHCOOH| Fe ++ |C=OCOOH|H-C-H CH 3| H 2 O |COOHCOOHoxálsav képződés CaCO 3 jelenlétébenA másik glükózt fogyasztó reakció a fonalas gombák glükóz-oxidáz aktivitása. Ez a flavin enzim közvetlenülképes glükonsavvá oxidálni a tápközegbe adott glükózt. A citromsavtermelés szempontjából optimális savanyúkörülmények között (pH=3,5 alatt) azonban ez a specifikus glükóz-oxidáz nem működik. — A fonalas gombákglükonsav termelő képességét Currie és munkatársainak gyakorlati eredményeire támaszkodva nagyipariméretben is hasznosítják. A Penicillium luteum és az Aspergillus niger törzsekkel optimális körülmények között50-60 óra alatt 90 %-nál jobb hatásfokkal folyik a glükóz oxidációja. 1937-ben Moyer és munkatársai olyanaktív Aspergillus niger törzset izolált, amely egy nap alatt literenként 200 g glükózt oxidált 95 % elméletihatásfokkal, ha a reakcióelegy kalcium-karbonátot is tartalmazott.ΟΗ Ο Ο| || ||H-C C C-OH| | |H-C-OH O H-C-OH H 2O H-C-OH| glükóz-oxidáz | O |HO-C-H HO-C-H HO-C-H| | |H-C-OH H-C-OH H-C-OH| FAD FADH 2 | |H-C H-C H-C-OH| | |H-C-OH H-C-OH H-C-OH| | |H H HA kofaktor visszaoxidálása hidrogénperoxid képződése közben egy oxigén molekulát fogyaszt. Ezt a toxikusterméket a mikroorganizmusban működő kataláz azonnal bontja.O 2 + FADH 2 FAD + H 2 O 2H 2 O 2 H 2 O +1 / 2 O 2A glükonsav−δ−lakton ugyan spontán hidrolizálhat glükonáttá, az Aspergiullus-ban azonban egy specifikuslaktont hidrolizáló enzim működése észlelhető. A glükóz-oxidázt az Aspergillus niger sejtmentes kivonatából D.Müller izolálta 1928-ban (Biochem Z. 199: 136). Később Franke W. és munkatársai (Zbl Bakt. I. 191-94, 1963),valamint Keilin D. és Hartree E. F. (Biochem. J. 42:221, 1948) megállapították, hogy ez a FAD tartalmúflavoprotein a D-glükóz ß-anomerjét 150-szer gyorsabban képes oxidálni, mint az α -D-glükózt. Lehet, hogy arendszer egy mutarotáz aktivitással rendelkező fehérjét is tartalmaz.Van Dijken J. P. és Veenhuis M. vizsgálatai szerint a glükóz-oxidáz (Eur. J. Appl. Microbiol. 9:275,1980) az Aspergillus niger sejtplazma peroxiszómáiban található. Nem ismert azonban sem az enzim, sem azáltala előállított glükonsav élettani szerepe. Az enzim 10,5 % szénhidrátot tartalmazó 186000 moltömegűglükoprotein. Prosztetikus csoportként két szorosan kötött FAD-ot tartalmaz. A hőérzékeny (50 o C) enzimpH=5,5.-nél működik optimálisan.294

A glükóz-oxidáz egyes gombatenyészet szűrt levében is megjelenik. Néhány szerző köztük Kecholaty W."Penatin" néven (Arch. Biochem 273, 1943), Coulthard és munkatársai "Notatin" néven (Nature 150:634, 1942)Roberts és munkatársai "Penicillin-B" néven (J. Biol. Chem. 147:47,1943) a negyvenes évek elejénantibiotikumként írták le ezt az enzimet. Megtévesztette a szerzőket a glükózt tartalmazó táptalajon felszabadulóhidrogénperoxid dezinficiáló hatása. Azóta ezt a hatást az élelmiszeripar a tojásfehérjepor előállításánál akészítményben levő 0,5 % glükóz eloxidálására használja. Az enzim specifikus volta miatt a glükóz kvantitatívmérésére is használható. Gyorsasága, megbízhatósága miatt ez a tapasztalat analitikai módszerré fejlesztvebevonult a klinikai gyakorlatba. A glükonsav képződés szempontjából előnyös az 1-1,5 M glükóz koncentráció, atápközeg csekély foszfát tartalma (80-90 mM) és a nitrogén éhezés (20-30 mM). A fémionok közül a mangánjelenléte (1-10 mM) kritikus. A reakció oxigénigénye igen nagy.A reakcióelegy hidrogén-ion koncentrációjameghatározó jelentőségű (pH=4,5-6,5). Savanyú körülmények között (pH=3) az enzim nem működik.CITROMSAVGYÁRTÁSI FOLYAMATOKKEMÉNYÍTŐ TARTALMÚ IPARI MELLÉKTERMÉKBŐLIgen egyszerű tradicionális japán módszert használnak különféle keményítőt tartalmazó iparimelléktermék hasznosítására. Ez az eljárás az Aspergillus niger poliszacharidbontó képességét is hasznosítja.Kihozatalban ezek az eljárások nem közelítik meg a nagyipari eredményeket. Ismertetését indokolja, hogyélelmiszeripari mellékterméket hasznosít olyan egyszerű módon, amely egy iparilag elmaradott területen ismegvalósítható. A keményítőt tartalmazó hulladékot vízben áztatják úgy, hogy a víztartalma elérje a 70 %-ot. Amassza pH-ját 5,5-re állítva sterilezik, majd tálcákra szétterítve Aspergillus niger konídiummal lefújják afelületét. 30 o C-on hagyják fejlődni. A gomba amiláz először elcukrosítja a poliszacharidot. A következő fázisbankezdődik a savtermelés. Néhány napos fejlődés után az összemorzsolt tenyészetből a képződött citromsavatellenáramú módszerrel meleg vízzel extrahálják. A vizes extraktumból kalcium-citrát formában leválasztotthasznos termék azután tovább tisztítható.FELÜLETI TENYÉSZETBENA század első felében épült üzemek a termelés klasszikus módszerével az Aspergillus niger mutáns felületitenyészetével nyerik a citromsavat. Az évi citromsav szükséglet 30 %-át még ezzel az elavult, élőmunkaerőigényes, de még működőképes technológiával állítják elő.Nagyméretű termosztálható és csiramentesen levegőztethető helyiségekben állnak egymás fölött anagytisztaságú aluminiumból, vagy saválló acélból készült tálcák. Az egymás felett elhelyezett tálcákat erősszerkezetű építmény tartja, hiszen egy-egy tálca tartalma meghaladhatja az egy tonnát. Egy-egy tálca 5-10 m 2felületet biztosít, mélysége 15 cm. A 9-10 naponként ismétlődő tisztítási, takarítási folyamat megkívánja, hogy atálcákat tartó egység körüljárható legyen. Az eljárás nem nélkülözheti az élőmunkaerőt, a takarító személyzetet.A vízszintezett tálcák megfelelő töltő és ürítő csőrendszerrel és 12 cm magasságban túlfolyóval vannakfelszerelve. A tálcában oltáskor a táptalaj 10-12 cm mélységű réteget alkot. A csíramentesre szűrt levegőbevezetését úgy oldják meg, hogy minden tálca szigorúan azonos mennyiségű levegőt kapjon. A levegő ugyanisnem csak az oxigénellátást biztosítja, de fontos szerepe van a tenyésztés közben képződő hő elvezetésében is. Afolyadék felszínen történő párolgás a táptalaj keveredését, homogén eloszlását is segíti.A munkamenet első feladata a fermentáló helyiség és az eszközök kitisztítása és sterilezése. Az eljárástidegen penészek, tejsavbaktérium és élesztő elszaporodása veszélyezteti. Szódás lemosás után az egész rendszertkéndioxiddal, vagy formalin gázzal fertőtlenítik, majd ammóniával való közömbösítés után steril levegő fúvássalkiszellőztetik. A hermetikusan zárt helyiségekbe menet közben nem lehet belépni.Az eljárás legkényesebb része a táptalaj előkészítése. Szénforrásként a szacharóz, glükóz, fruktózegyformán jól használható. Gyakran használják a cukorgyári mellékterméket (melasz) szénforrásként, de épülteküzemek a lebontott keményítő hasznosítására is. Mindenekelőtt a szénhidráttartalmú koncentrátumot annyirahígítják csapvízzel, hogy a hasznosítható cukor koncentrációja 20 % körül legyen. Annyi ammónium-szulfátot,vagy ammónium-nitrátot kevernek el benne, hogy az ammónium ion tartalma 0,5-1,5 g legyen literenként. A pH-tfoszforsavval 6-6,5 értékre állítják, majd 45 percig 120 o C-on sterilezik. A még meleg oldathoz adják akáliumferro-cianidot (10-100 mg/liter), amely egyrészt a nemkívánatos fémionok komplexbe vitelével acitromsav termelés szempontjából kedvező körülményt teremt, másrészt mint egy metabolizmust gátló szer, agomba növekedését visszafogva elősegíti a citromsav termelést.Az eljárás érzékeny pontja a komplexképző szükséges mennyiségének a megállapítása. Ezt afelhasználásra kerülő nyersanyaggal végzett kísérletekben kell meghatározni. Az így előkészített steril táptalajt40 o C-ra hűtik, hozzákeverik az oltóanyagot, majd a csővezetéken keresztül a csiramentesített helyiségben levőtálcákra vezetik. Az oltóspóra mennyiségét úgy állítják be, hogy a tálcákra m 2 -ként legalább 100-150 µgkonídium kerüljön. A konídiumok — lévén hidrofóbok — lassan a táptalaj felszínére gyűlve kezdenek csírázni.Egy nap alatt a tápoldat felszínén egy vékony micélium hártya képződik. A 30-ik órától számítható az idiofázis.A teljesen kifejlődött micélium gyűrött fehéres rétegként úszik a tápoldat felületén. Az oltóanyagot általában azüzem területén készítik a központi laboratóriumból kapott spóraszuszpenzióval oltva. Szilárd táptalajként jólhasználható a sterilezett nedves kukoricaőrlemény, esetleg korpa, amelyen 3-7 napos korára fejeződik be a295

spóraképződés, amely homogén szuszpenzió formájában használható a termelő szakasz oltására. A citromsavtermelésre szolgáló tálcák feltöltése után megindítják a levegőztetést. Kezdetben az átfújt levegő mennyiségecsekély, szerepe inkább a hőmérséklet tartásban van. A levegőt kezdetben annyira kell előmelegíteni, hogy atáptalaj hőmérsékletének a csökkenése kevesebb legyen mint 1 / 2 o C óránként. A tálcán levő beoltott táptalaj 30-40 óra alatt érheti el a citromsav termelés szempontjából optimális 30 o C-os hőmérsékletet. A csírázást és anövekedést a magasabb hőmérséklet elősegíti. A micéliumtömeg kifejlődése után a levegő mennyiségét növelnikell. Percenként a táptalaj térfogat négyszeresének megfelelő steril levegőt fújnak át a tenyésztő helyiségeken.Citromsav elõállítása melaszból felületi tenyésztéssel1:Tisztított melasz tartály;— 2:Melaszmérleg;—3:Táptalajfõzõ-tartály;—4:K 4 Fe(CN) 6 oldat —5:Nitrogénforrás(célszerûen mûtrágya);—6:Sterilezhetõ tenyésztõ kamra;—7:Levegõszûrõ;–8:Páratartalom szabályzó;—9:Levegõelõmelegítõ,—10.Fermentlé gyüjtõ tartály;— 11:Micéliumaprító;— 12:Szûrésre elõkészített tenyészetgyüjtõ-tartálya;—13: vákuum dobszûrõ a micelium elkülönítésére;—14:a szûrt micélium mosó tartálya;—15:Micélium mentes fermentlé gyüjtõtartûlya;—16:kalcium oxalát kicsapására szolgáló tartály;—17Mésztejettároló tartály;—18:kalcium-oxalát – elválasztása – kiszûrése a reakció elegybõl,—19: kénsav tartály;—20:Gipszkiválást segítõ tartály;—21:A csapadék vákuum szûrõvel történõ elkülönítése;—22:Nyers-savösszegyüjtésére szolgûló tartály;—23:ioncserélő a CaSO 4 nyomok eltávolítása;—24:bepárló készség;—25:kristályosító tartályxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA termelő szakaszt az alternatív légzés működése miatt jelentős hőmennyiség felszabadulása jellemzi (óránként600-1100 kJ/m 2 ; citromsavra számolva 12500 kJ/kg termék), aminek az elvezetéséről az átfújt levegőmennyiségének és hőmérsékletének a változtatásával feltétlenül gondoskodni kell. A táptalaj keveredését az ahőmérséklet különbség biztosítja ami a párolgás miatt a tálcák felszíne és a mélyebb rétegek között kialakul. 6-8napi levegőztetés alatt a szubsztrátum elfogy. A citromsavképződés megindulásakor a kémhatás pH=2 alácsökken. Átlagban 0,2-0,4 kg m 2 óra citromsav képződésre számíthatunk. A citromsav termelés legintenzívebbszakaszában óránként és m 2 -ként 1 kg citromsav képződik. Az erős levegőztetés miatt a táptalaj víztartalma tíznap alatt 30-40 %-kal csökken. A termelési ciklus befejeződésekor a leválasztott szűrlet literenként 200-250 gcitromsavat tartalmaz. (100 g glükózból 75 g citromsav remélhető) Ez az oldat a leeresztő vezetéken keresztülkönnyen elkülöníthető. A visszamaradó szivacsos szerkezetű micélium tömeget ezután vízben homogenizáljákmajd szűrőprésen szűrik. Ezzel a mosóvízzel a megtermelt citromsav 15 %-át még ki lehet nyerni. A296

visszamaradt micélium tömeget állattakarmányozási célra megszárítják. Ez a szárított micélium tonnánként 150-200 kg tápanyagként hasznosuló citromsavat tartalmaz.CITROMSAVTERMELÉS LEVEGŐZTETETT, KEVERT REAKTORBANA század második felében elindított citromsavtermelő üzemek már a modernebb süllyesztett tenyésztésitechnológiát használják, annak ellenére, hogy ez az eljárás sokkal érzékenyebb és igényesebb a technológiaifegyelem szempontjából. A technikai berendezések fejlesztése a penicillin gyártás üzemi méretben történőmegvalósítása céljából elkerülhetetlen volt. A mélyfermentációs folyamat a felületi tenyésztési módnálérzékenyebb a fémionokra és a komplexképző káliumferro-cianid mennyiségére. Nagyobb a beruházási igénye,de előnyösebb az élőmunkaerő igény szempontjából. Lehetőséget ad a technológia dinamikus fejlesztésére,amitől a termelési költségek további csökkenése várható.Az ipari gyakorlatban kétféle bioreaktort használnak: az 50-150 m 3 hasznos térfogatú keverősfermentort, illetve a 200-1000 m 3 térfogatú csőfermentort, amelyben a keverést a levegőáramlás biztosítja.Ezekből a nagytérfogatú fermentorokból a hő elvezetését csak jól kialakított belső hőcserélőkkel lehetelfogadhatóan megoldani. Az eljárás nagyon kényes az alkalmazott szerkezeti anyagra. A technológia igényeszerinti savas közeg miatt jó minőségű saválló acélból készülnek a bioreaktorok.A szakaszos eljárás (batch process) táptalajábana hasznosítható szénhidrát 20-25 %. A termékönköltségi árának csökkentése céljábóltermészetes anyagokat (melasz, hidrolizáltkukoricaliszt, keményítőhidrolizátum)használnak szénforrásként. Ebből következőenaz ionmentesítés az eljárás fontos elemét jelenti.Erre a feladatra előnyösen használható akationcserélő gyanta. Az ionmentesítés utánnyert szűrt savanyú oldatot ammóniumszulfáttalkiegészítve folyamatosan működőhőcserélőben szűkség esetén azelőkisérletekben meghatározott mennyiségűkáliumferro-cianiddal kiegészítve sterilezik,majd 50o C -ra visszahűtve az előrekisterilezett fermentorba vezetik. Kémhatásátammónia gázzal pH=2,5-3 közé állítják,figyelve arra, hogy a táptalaj ammónia-Citromsavtermelés melaszbólnitrogéntartalma nem haladhatja meg 1-1,5 ezreléket. A fermentáció oltásához kis térfogatú inokulum készülékethasználnak, amelyben csökkentett szénhidrát tartalmú táptalajon tenyésztik az oltóanyagot. A kedvező pelletméret kialakulása miatt fontos, hogy oltáskor a főfermentációban az élőcsíraszám 5-15 x 10 6 legyen literenként.Ez a pelletesedés meghatározó jelentőségű. A laza szerkezetű, szálas kolóniák nagy nedves térfogatot jelentenek.A keverő nem képes az oxigénellátást megoldani a sűrű micélium szövedékbe. A kompakt kis labdacsokból (1mm-nél kisebb pellet) álló tenyészet száraz tömege nagyobb. Egységnyi fermentor térfogatban nagyobbmennyiségű gomba jól keverhető és levegőztethető formában termeli a citromsavat.A nagyméretű csőfermentorokban a légbuborékok miatt csekélyebb térfogattömegű tenyészet folytonosfelfelé áramlása tartja fenn a termelés szempontjából optimális anyagáramlást. A bevezetett levegő mennyiségekezdetben 0,1 térfogat percenként amit az igény szerint 0,4 tf %-ra emelnek. A citromsav termelés szempontjábólennél nagyobb mennyiségű levegő kedvezőbb lenne, gyakorlati okoból azonban ezt az értéken nem szoktáktúlhaladni. A probléma gazdaságosan megoldható a szén-dioxid mentesített, oxigénnel dúsított levegővisszaforgatásával. A tenyészet hőmérsékletét 28-32 o C-on a tenyésztési körülményeket pedig pH= 2,2-2,6 közötttartják. A tenyészet növekedéséhez 2-3 nap szükséges. Ezután indul a citromsavtermelés, amelynek sebessége azötödik napon éri el a csúcsot, majd ellaposodva 10-12 nap alatt fejeződik be. A termelés kinetikáját vizsgálva jólelkülöníthető a növekedési fázistól (trofofázis) a termelő (idiofázis) szakasz. A növekedési fázisban nincscitromsavtermelés, az idiofázisban viszont nincs növekedés. Jó eredmény érhető el a tápanyag folytonosadagolásával (feed batch process). Ez esetben oltáskor a fermentor a hasznos térfogat 60 %-ra van töltve ésinduláskor a cukortartalom nem éri el a 10 %-ot. Így hamarabb éri el a tenyészet a citromsavtermelésszempontjából előnyös idiofázist Az alacsonyabb szénhidrátartalmú fermentlében jobb a pellet képződés. Asavtermelés megindulásakor kezdik adagolni a hiányzó táptalajt, mégpedig úgy, hogy az eredetileg bevitt és azadgolt táptalaj összes szénhidrát-tartalma k.b. 18 %-ot érjen el. 15 nap fermentációs idő alatt 130 kg / m 3citromsav szintet lehet ezzel a módszerrel elérni.A mélyfermentáció leállásakor a micélium elválasztása nem könnyú feladat. A szűrési segédanyagmegválasztásakor figyelembe kell venni, hogy a kiszűrt micélium takarmányként kerül hasznosításra. Ezért297

előszeretettel használnak cellulóz tartalmú növényi vagdalékot a szűrés meggyorsítás céljából, amit a tenyészettelösszekeverve juttatnak a vákuum dobszűrőn szűrendő elegy számára szolgáló tárolóedényébe.A sejtmentes szűrletből az oxálsavat mégsavanyú pH-nál kis fölöslegben adottmésszel kálcium-oxalát formájábanlecsapják. A kalcium-oxalát csapadékotújabb szűréssel eltávolítják. Eközben acitromsav monokalcium-citrát alakbanoldatban marad. Az oxálsavmentesítettfermentléből a sok szennyező anyagjelenléte miatt a citromsav közvetlenkristályosítása nem gazdaságos.Előnyösebb a monokalciumcitrátottrikalciumcitrát.tetrahidrátformájábanleválasztani, majd a csapadékbólkénsavval nyerni a szabad savat. Ezutóbbi oldatból ioncserélő gyantán valótisztítás és aktív szenes derítés utánbepárlással nyerhető a tiszta kristályostermék. Kényes feladat a trikalciumcitrátleválasztása. A hőmérséklet, a pH és amészadagolás sebességének az optimalizálása vezet eredményre. Legjobb, ha nagy kristályok képződnek, mert azapró kristályok sok szennyezést zárhatnak magukba. Előnyösen 90 o C-on, semleges körülmények között 180-200kg kálciumoxidot adnak m 3 -ként a monokalcium-citrátot tartalmazó szűrlethez, amelyből a trialcium-só melegenkristályosodik. A kristályosítási anyalúg betöményítve állattápszerbe keverhető Ca tartalmú maradék.A kiszűrt trikalcium-citrát.tetrahidrátból kis feleslegben adott 60 %-os kénsavval 50 o C-on szabadíthatófel a citromsav. A kalciumszulfát zömét dobszűrőn elkülönítik, a csekély szerves színező anyagot aktívszenesszűréssel távolítják el. A maradék kalciumszulfát eltávolításához egy erős kation cserélő (Dowex-50) és egyközepes erősségű anion cserélő (Dowex-2) gyantát használnak. Az így nyert oldat 200-250 g citromsavattartalmaz literenként, amit vákuumban 40 o C-on karamellizálódás nélkül töményítenek. A végső kristályosítástmonohidrát formában 20-25 o C-on végzik. A kiszűrt kristályokat 36.5 o C alatt szárítják. (40 o C felett a citromsavvízmentes savként kristályosodik). Az anyalúgot az utolsó aktívszenes tisztítási lépésbe töltik. Ismeretes azirodalomba más kinyerési módszer is. Ilyen amikor a nyers terméket dikálcium só alakjában választják le. Másokszerves oldószerrel extrahálják. Ezeknek előnyösebb volta nem ítélhető meg.Citromsav monohidrát kinyerése a tenyészlé szűrletébőlCitromsavtartalmú szűrletMésztejKálcium-oxalát(szűrhető cspadék)Kalciumcitrát (oldatban)Kálcium-oxid90°C-on kristályosítás60%-os kénsav50°C-onTrikalcium citrát(kristályos alakban)Citromsav (oldatban)KálKálcium szulfátCsapadék40°C-on vákuumban töményítveDerítés, tisztítás(aktív szén, ioncserélő)20°C-on kristályosításSzárítás 36 °C-onCitromsav monohidrát298

BSc mikrobiális fiziológiabeszámoló március 12 név…………………………………..1.//-Hogyan jellemezné a kurzus keretében megismerendő élőlényt?Az ÉLŐLÉNY önszerveződő fejlődésre képes fizikai-kémiai rendszerként–fennmaradása érdekében folyamatosan munkát végezve– a szabályozási folyamatok hálózatát maradéktalanul kihasználva– a környezetben észlelhető rendezetlenség felszámolására törekedve– létezésének alapelemeit utódaira átörökíti.–Tapasztalatait öröklött képességei által irányítva–rituális cselekvés sor (utánzás, tanulás) keretében utódainak átadja.2.//-A citoplazmamembrán feladata és ebből következő összetétele?A környezettől való elhatárolódást de kapcsolattartást is szolgálólipid, ferhérje és szénhidrát tartalmú flexibilis határhártya.3.// -Az eubaktérium és az ősbaktérium membrán összehasonlítása (funkció és felépítés);A feladat azonos: elhatárolás és kapcsolattartás. A flexibilis természetű kétrétegűmembrán lipid jellegű építőeleme azonban különbözőAz Eubaktérium membrán zsírsav-glicerin észterből szerveződik.Az Ősbaktérium membrán oligoizoprén alkohol glicerin-éterét igényli. (fitanil-éter)Az izoprén alkohol-láncok a körülményektől függve kovalens kötésben funkcionálhatnak, míga zsírsavak között ilyen kapcsolat nem alakul ki.4.// - Hogyan készül az izoprén alkohol glicerinéter származéka, a fitanil-éter?Három acetil-S-CoA felhasználásával készült mevalonsav ATP igénybevételével készültpirofoszforsav észterének dekarboxilezésével kialakult izomér párok (dimetilallil-PP ésizopentenil-PP) két lépésben kondenzálnak transz telitetlen tetraizoprenil pirofoszforsavészterré, amely NADPH igényes telítés után glicerin foszfáttal reagálva alakul foszfoglicerinfitaniléterré.5.// -Hogyan készül az Eubaktérium-membrán foszfoglicerin észter építőeleme?Az acetil-S-CoA-nak a foszforsav-szénsav vegyesanhidrid által készült biocitin segítségéveltörténő karboxilezésével nyert malonil-S-CoA a zsírsav szintézis építő elemeként a Pan-enzfehérje asszociátum enzimeinek egymást követő működésével CO 2 felszabadulása mellett kétszénatommal növeli a zsírsav hosszát. A kialakuló ketocsoport NADH igényelte redukciójátkövető vízkilépés eredményezi a transz helyzetű telitetlen intermediert, amelynek NADPHfelhasználásával történő telítése fejezi be a zsírsav hosszát növelő kőrfolyamatot.6.//-Milyen két lehetőséget ismer az Ősbaktériumban folyó acetil-S-CoA képződésre?.a.) A szénmonoxid-dehidrogenáz acetil-CoA szintetáz komplex (CODH/ACS) aszéndioxidból (metanopterinen) képződő metánt cobalamin segítségével veszi fel, amita reverzibilisen működő Nikkel tartalmú szénmonoxid dehidrogenáz terméke egészítki acetil-tioészterré.b.) A glükóz neogenezis köztes termékét a piruvátot tiaminpirofoszfát dekarboxilezi, aképződő acetál vaskén fehérje közvetítésével ferredoxin-oxidoreduktázt redukálvaképes acilezni a CoA-SH csoportját.299

7.// -Milyen lehetőséget ismer az Eubaktériumban folyó acetil-S-CoA képződésre anaerob,illetve aerob élettani körülmények fennállása esetében?a.) Redukáló körülmények között a széndioxid hangyasavként tetrahidrofolsavra kötve alakulmetánná. A köztestermék, a metil csoport cobalamin segítségével kerül a szintetáz E-2komplexre, amit a reverzibilisen működő Molibdén tartalmú szénmonoxiddehidrogenáz terméke egészít ki acetil-tioészterré. (Eubactériumban működő CODH/ACSkomplex acetil-S-CoA képzése)b.) Aerob körülmények között a piruvátot dekarboxilező tiaminpiiofoszfátról a TPP-acetál aliponsav diszulfid kötését megbontva átmenetileg alkil-tioésztert képez, majd innen távozvaacilezi a CoA tioetanolamin csoportját. A redukált liponsav dehidrogénezését FADkofaktorral működő enzim végzi. A FADH 2 regenerálását végül NAD kofaktorral működőoxidoreduktáz fejezi be.8.// -Mit tud a Gram negativ festődésű baktériumok külső membránjának szerveződéséről?– A membrán külső felületén levő A-lipid, a membránba nyúló telített zsírsavakkal illetve 3-hidroximirisztinsavval acilezett glükózamin-1,6-diszacharid-pirofoszfát kopolimer, amelyhezdiszacharid egységenként ketodezoxioktonát közvetítésével a heptózon kívül a dúspoliszacharid réteg kapcsolódik.– A membránt a peptidoglükán sejtfalhoz kötő peptid, láncvégi ciszteinje tioéterként kötődik akülsőmembrán sejtfal felöli felületén található zsírsavakkal acilezett foszfogliceridhez. Sőt acisztein aminocsoportját is zsírsav acilezi, amelynek apoláris lánca a kölsőmembránba sűlyed.9.// - Miben különbözik az Eubaktérium és az Ősbaktérium sejtfal szerkezete?– Mindkettőben a glikozidos kötéssel kapcslódó hexózokból épülő glükán láncokat rövidpeptidek rögzítik.– Az Ősbaktériumok pseudomurein sejtfalában a glükán láncot L-Glu, L-Ala, L-Lysaminosavakból készült peptid lánc rögzíti, — az Eubaktériumokban viszont egymást követőenL-Ala, D-Gln, L-Lys, (L-DAP), D-Ala, Gly aminosavakból felépülő rövid peptid teljesíti ezt afeladatot.– A metanogén sejtfalban az uronsav karboxilcsoportjához kacsolódik a peptid lánc,— azEubaktérium peptidoglükán sejtfalában a muraminsav, az N-acetilglükózamin tejsavéterszármazékának a karboxil csoportja ad lehetőséget az aminosavval való kapcsolatra.10.// - Az Eubaktériumok okozta károsító hatás leküzdésére milyen lehetöségről tud?a.)-A glükánlánc glükozidos kötéseit hidrolizáló lizozim a magasabb rendűek védelmétszolgálja a kórokozó prokarióták leküzdésével.b.) - A ß-laktám szerkezeti elemet hordozó antibakteriális termékek, például a penicillin, aperiplazmikus térben tevékenykedő D-alanin transzpeptidáz inaktíválásával azEubaktérium-sejtfal képződését akadályozza.300

11.// -Hogyan történik az ATP képzés redukáló körülmények között, az ősbaktériumokban?a) formát-dehidrogenáz által katalizált formilmetanofurán (CHO-MF) képződésb) a formilcsoport a formil-transzferáz segítségével kerül a metanopterinre(O=CH–H4MPT)c) ciklohidroláz alakítja az 5,10-metenil-tetrahidrometanopterin köztiterméket(HC=H4MPT)d) (F420)szal oxidoreduktáz 5,10-metilén-tetrahidrometanopterinné(H 2 C=H4MPT) redukáljae) metilén-reduktáz közvetített e– -nal készül a metil-tetrahidrometanopterin (H 3 C–H4MPT).f) pterinről cobamid segítségével a metil-transzferáz viszi a -CH 3 -t a CoM-re (CoM-S-CH 3 ).g) Végül a baktérium fehérje tartalmának több mint 10 %-át képviselő heterodiszulfid-metilreduktázkomplex katalizálja a metánképződéssel együtt az ATP szintézist, valamint a CoBközbelépésével képződött diszulfid (CoM-S-S-CoB) F 430 által végzett redukcióját.12.// Mit tud a kén szerepéről anaerob körülmények között (elektron akceptor szerep)?1.) A vulkánikus eredetű terméskén S 8 formában vizes szuszpenziót alkot, hidratálódva adiszproporcionálódása S 8 + 8 H 2 O 6 H 2 S + 2 H 2 SO 4 (∆G°=+48kJ) nem előnyös, deaz élő szervezet a légzés és az asszimiláció (cisztein, metionin) szempontjából hasznosítja.2.) -az ATP energiáját hasznosítva az AMP-kénsav vegyesanhidrid a periplazmikushidrogenáz szolgáltatta elektronok (Σ=8e – ) felvételével a környezetbe kerülő kénhidrogénnéredukálódik.3.) Az APS ribóz C3-OH foszforilezése után, a képződött PAPS-ból ferredoxin és NADPHáltal végzett redukciók eredményeként megjelenő H 2 S a Cys és Met aminosavak képződésétsegíti. .301

BScmikrobifiziologia.pdf - BiomÃ©rnÃ¶ki TanszÃ©k - Debreceni Egyetem

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?