专家点评Cell Stem Cell | 重症先天性中性粒细胞减少症的遗传机制以及基因治疗策略
点评 | 余佳（北京协和医学院）、宋春青（西湖大学）
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重症先天性中性粒细胞减少症（SCN）是一种罕见的骨髓衰竭性疾病，以患者外周血中性粒细胞的绝对值减少为主要特征，部分患者还可同时伴有单核细胞升高以及淋巴细胞减少（图1）。
超过20个基因被报道与SCN相关，其中ELANE基因突变（>100种基因突变，位于ELANE基因的编码区和剪接位点）是SCN最常见的致病原因，但是这些ELANE基因突变导致SCN的致病机制却并没有阐释清楚【1】。
临床上，虽然G-CSF治疗可以显著提高SCN患者外周血中性粒细胞的数量，但是长期接受G-CSF治疗可增加患者向骨髓增生异常综合征（MDS）/急性髓细胞白血病（AML）转化的风险【2】。因此，探索ELANE基因突变导致SCN的致病机制并寻找SCN的治疗策略是该领域的研究难点。
2021年1月28日，哈佛医学院波士顿儿童医院Daniel E. Bauer研究组与麻省大学医学院Peter E. Newburger研究组在Cell Stem Cell杂志上发表了题为Dissecting ELANE neutropenia pathogenicity by human HSC gene editing 的文章（第一作者为饶书权博士，并列第一作者为姚瑶博士和Josias Soares de Brito博士）。该研究开发了一种采用Sendai virus和Lentivirus来递送Cas9蛋白和sgRNA的双递送系统，并成功在hematopoietic stem and progenitor cells（HSPCs）中对ELANE基因的编码区进行了功能筛选，揭示了位于ELANE基因不同区域的移码突变与重症先天性粒细胞减少症疾病表型的关系，同时在细胞模型和小鼠模型中阐释了移码突变的致病机制，提出了新的治疗重症先天性中性粒细胞减少症的策略，为该病的基础和临床研究提供重要参考。
高通量 CRISPR/Cas功能筛选通过在全基因组范围或者目标区域内干扰基因功能来筛选目的表型，是剖析基因功能和探索疾病机制的重要工具。由于原代细胞不能稳定表达Cas蛋白，如何实现在原代细胞中开展高通量 CRISPR/Cas功能筛选一直是领域的难点。
在该工作中，研究者首先与西奈山医学院Benhur Lee教授合作，充分利用Sendai virus载体容量大、病毒滴度高以及在真核细胞内表达时间长等特点，开发了利用Sendai virus和Lentivirus来分别递送Cas9蛋白和sgRNA的双递送系统。研究者在HSPCs中利用该系统对ELANE基因的整个编码区进行了CRISPR/Cas9功能筛选，发现靶向ELANE基因晚期外显子的sgRNAs能显著导致中性粒细胞的发育障碍，而靶向ELANE基因早期外显子的sgRNAs与中性粒细胞的发育无显著关联。
由于CRISPR/Cas9基因编辑主要导致编码区的移码，因此研究者推测位于ELANE基因早期外显子的移码突变可能会触发无义介导的mRNA降解【4】，而位于ELANE基因晚期外显子的移码突变则会避免无义介导的mRNA降解，因此对中性粒细胞的发育具有不同的影响。
随后，研究者挑选出多个分别靶向ELANE基因早期和晚期外显子的候选sgRNAs，并在细胞模型和小鼠移植模型中来验证上述假说。
与预期相符，靶向ELANE基因早期外显子的sgRNAs，可以有效触发无义介导的mRNA降解，导致ELANE mRNA和蛋白水平下降，但并不影响中性粒细胞的正常发育；而靶向ELANE晚期外显子的sgRNA则具有完全相反的效果。基于上述结果，研究者提出了第一种采用CRISPR/Cas9治疗重症先天性中性粒细胞减少症的策略，即通过CRISPR/Cas9在ELANE基因的早期外显子引入移码突变来降解突变的ELANE mRNA。
另一方面，研究者们则探讨了位于ELANE基因晚期外显子的移码突变导致中性粒细胞发育障碍的致病机制，并意外发现晚期外显子缺失1个碱基的移码（frame -1）与缺失两个碱基的移码（frame -2）具有完全相反的效果，即只有frame -1会导致中性粒细胞减少症，而frame -2并不影响中性粒细胞的正常发育。
深入研究发现，位于ELANE基因晚期外显子的frame -1会导致开放阅读框缩短，能正常表ELANE突变蛋白；相反，frame -2会延长开放阅读框，ELANE mRNA的翻译效率下降，从而下调ELANE突变蛋白的表达。于是，研究者提出了第二种治疗重症中性粒细胞减少症的策略，即通过在ELANE基因晚期外显子引入frame -2移码突变，来降低ELANE mRNA的翻译效率。
综上，该研究开发了一种新的CRISPR/Cas9递送系统，并首次在HSPCs中对ELANE基因编码区进行了功能筛选，阐明了位于ELANE基因早期和晚期外显子不同类型的移码突变对中性粒细胞发育的影响，并深入揭示了移码突变导致中性粒细胞发育障碍的分子机制，同时提出了两种不同的治疗重症中性粒细胞减少症的基因治疗策略（图2）。
该项工作的基因治疗部分曾在2019年美国血液学年会（2019 ASH Meeting）上做主题报告（Plenary talk），遗传学部分曾在2020年美国人类遗传学大会（2020 ASHG Meeting）上做主题报告（Plenary talk）。论文第一作者饶书权博士同时获得Epstein Award（2020 ASHG Meeting）和Meritorious Abstract Travel Award（2020 ASGCT Meeting）。
饶书权为北京协和医学院基础医学研究所沈岩/许琪组毕业的博士，现为哈佛医学院波士顿儿童医院Daniel E. Bauer研究组博士后。饶书权博士长期致力于常见疾病和罕见疾病的分子遗传学研究，综合运用生物信息学、干细胞培养/移植以及基因编辑等技术手段，探索疾病的发病机制和基因治疗途径。近五年以第一作者和/或通讯作者在Cell Stem Cell、Genome Medicine、Signal Transduction and Targeted Therapy、American Journal of Human Genetics、Schizophrenia Bulletin、British Journal of Psychiatry、Human Genetics等国际学术期刊上发表论文10余篇，被引用300余次。联系邮箱：shuquan.rao@gmail.com.
专家点评
余佳（北京协和医学院）
疾病的遗传学研究是阐释其发病机制和研发治疗方法的基础。重症先天性粒细胞减少症（SCN）是一种罕见的遗传性疾病，有超过50%的SCN患者是由于ELANE基因显性遗传突变所致。尽管分子遗传学研究发现超过100余种ELANE基因突变与SCN有关，包括点突变和移码突变等各种突变类型，但是这些突变导致SCN的致病机制目前尚不清楚。
饶书权博士及其合作团队利用新开发的基因编辑递送工具，在HSPCs中对ELANE基因编码区进行了CRISPR/Cas功能筛选，系统揭示了位于ELANE基因不同区域移码突变与中性粒细胞发育的关系，并由此提出了两种新的基因治疗策略。
该研究的创新点包括：
1）开发了利用Sendai virus和Lenti-virus来递送Cas9蛋白和sgRNA的双递送系统，并成功在HSPCs中对ELANE基因编码区进行了功能性筛选；
2）揭示了ELANE基因移码突变主要是通过非折叠蛋白反应导致早幼粒细胞和中幼粒细胞凋亡，并最终导致成熟的中性粒细胞减少的新机制；
3）发现位于ELANE基因晚期外显子的缺失一个碱基与缺失两个碱基的移码突变具有完全相反的功能；其中缺失一个碱基的移码突变可以编码致病性截断蛋白，而缺失两个碱基的移码突变由于翻译抑制而不具有致病性；
4）基于上述结果，提出了两种新的基因治疗重症中性粒细胞减少症的策略，一是在ELANE基因早期外显子引入移码突变来触发无义介导的mRNA降解，二是在ELANE晚期外显子引入缺失两个碱基的移码突变来抑制ELANE mRNA的翻译效率，来实现降低ELANE突变蛋白的表达，消除非折叠蛋白反应的目的；
5）在人源HSPCs中通过引入缺失一个碱基的移码突变，并在小鼠模型中成功模拟了中性粒细胞减少症，为重症中性粒细胞减少症的研究提供了新的疾病模型。
这项研究为进一步研究重症中性粒细胞减少症的致病机制提供了理论基础，对指导疾病的基因治疗具有重要的意义，是一篇值得一读的转化医学佳作。
专家简介：
余佳，北京协和医学院长聘教授（首批），国家杰青。研究方向聚焦“RNA代谢与细胞命运调控”，在造血发育、干细胞定向分化及肿瘤发生领域取得一系列原创成果，作为通讯作者（含共同）在Cell Stem Cell、Developmental Cell、Cell Res、Nat. Commun (2017, 2019)、EMBO J （2015，2020）、Genome Res、Autophagy、Nucleic Acids Res（2013, 2014, 2017, 2020）、Cancer Res （2010, 2015, 2020）发表多篇论文，被引用3000余次。
专家点评
宋春青（西湖大学）
先天性中性粒细胞减少症（SCN）是遗传性骨髓衰竭综合征中的一组异质性疾病，是由瑞典儿科医师Kostmann于1956年首次报道，又名Kostmann综合征，以外周血中性粒细胞绝对值减少及骨髓粒细胞生成停滞在早/中幼粒细胞阶段为主要特征，为常染色体隐性遗传，发病率1～2／100万。并且该疾病具有强烈的向骨髓增生异常综合征（MDS）/急性髓细胞白血病（AML）转化的风险。
目前发现与SCN相关的异常基因有20多个，而ELANE是SCN最常见的致病基因，并且突变位点有100处之多，因此研究ELANE基因突变与SCN疾病发生的关系对深入理解SCN发生并为SCN提供针对性治疗具有重要意义。
哈佛医学院波士顿儿童医院Daniel E. Bauer研究组与麻省大学医学院Peter E. Newburger研究组合作，针对靶点基因ELANE的整个编码区设计了186个导向RNA(sgRNA), 采用Sendai virus和Lentivirus 双系统分别递送Cas9蛋白和sgRNA到原代造血干/祖细胞（HSPC）中，进行以CRISPR为基础的功能筛选。
作者发现含有靶向ELANE基因末端外显子sgRNAs的HSPC不能发育为成熟的中性粒细胞，而携带靶向ELANE基因早期外显子sgRNAs的HSPC细胞可以发育为成熟的中性粒细胞。随后，基于ELANE末端外显子的移码突变作者建立了SCN发生的小鼠模型，并发现CRISPR诱导的-1移码突变抑制了中性粒细胞成熟，而CRISPR诱导产生的-2的末端外显子indel促进了中性粒细胞成熟。
综上，作者的一系列工作为携带ELANE基因突变的SCN患者提供了潜在的可供选择的基因治疗策略。
专家简介：
宋春青研究员于2014年在北京生命科学研究所/中国农业大学获得博士学位，随后在麻省大学医学院RNA治疗研究所进行博士后研究，研究肝癌发生的分子机制和利用基因编辑技术纠正基因突变相关的遗传病。2019年10月全职加入西湖大学任特聘研究员。实验室的研究方向为肝脏疾病的分子机制解析及CRISPR基因治疗。
原文链接：
参考文献
1.Germeshausen M, Deerberg S, Peter Y, Reimer C, Kratz CP, Ballmaier M: The spectrum of ELANE mutations and their implications in severe congenital and cyclic neutropenia. Hum Mutat 2013, 34(6):905-914.
2.Rosenberg PS, Zeidler C, Bolyard AA, Alter BP, Bonilla MA, Boxer LA, Dror Y, Kinsey S, Link DC, Newburger PE et al: Stable long-term risk of leukaemia in patients with severe congenital neutropenia maintained on G-CSF therapy. Br J Haematol 2010, 150(2):196-199.
3.Skokowa J, Dale DC, Touw IP, Zeidler C, Welte K: Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Primers 2017, 3:17032.
4.Lindeboom RGH, Vermeulen M, Lehner B, Supek F: The impact of nonsense-mediated mRNA decay on genetic disease, gene editing and cancer immunotherapy. Nat Genet 2019, 51(11):1645-1651.
