GPC绝对分子量测试/多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪 联接与应用技MALLS/GPC(SEC)
一 、前言
近十几年来，光散射技术（Light scattering）在高分子特征分析领域的应用得到 了迅速的发展。将光散射技术和凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC） 或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）分离技术相结合，不但可以测得 大分子的绝对分子量，分子旋转半径与第二维里系数，还可测得分子量分布，分辨分 子量大小不同的族群以及分子的形状，分枝率及聚集态等。目前，该技术已成为一种 非常有效的工具，在美国，日本及欧洲已广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
二 光散射简介
早在十九世纪初，人们就开始对光散射原理进行研究。自六十年代激光被发明以来， 光散射的原理与技术便得以迅速发展，至今已成为检测微小粒子形状，粒径大小，分 子量，界面电位及粒子间效应的重要工具。随着电脑技术的日新月异，许多过去需花 费数小时甚至数日才能完成的实验，如今只需数分钟即可完成，而其准确性及重现性 也大幅度提高了。 光散射现象，如图 1 所示，当一束光通过一间充满烟雾的房间就会产生散射。利用 在不同角度，不同时间所测得的光散射强度，再借助各种光学理论及软件，硬件设备， 就可以测得微粒的许多特性。
入射光
图 1 光散射现象 散射光
在光散射发展的历程中，以下是一些具有代表性的人物：
▲James C lerk Maxwel l (1833-1879)
解释了光是一种电磁波，并正确地计算出光的速度。
▲ Lord Rayleigh(1842-1919)
研究了远小于波长的微粒散射现象，发现了散射强度与波长的四次方成反比，并解 释了蓝天被太阳光穿透大气层所产生的散射现象。
▲ Abert E instein(1879-1955) 研究了液体的光散射现象。
▲Chandrasekhara V.Raman (1888-1970)
印度籍物理大师，提出了 Raman 效应，其著作多次发表于印度文期刊，直至第二次 世界大战结束后才逐渐被人所知。
▲ Peter Debye（1884-1966）
延续了 Einstein 的理论，描述了分子溶解于溶剂中所产生的光散射现象，提出用 Debye plot, 求得重量平均分子量 Mw。
三 光散射理论
激光照射到样品时，会在各个方向产生散射光，于是我们可以在一个角度或多个角 度收集散射光的强度。
1. 光散射所透露的信息
在任何方向的光散射强度与分子量和溶液的浓度成正比； 散射光角度的变化与分子 的尺寸大小有关。当分子小于 10nm 时，各个角度的散射强度都相同； 当分子介于 10 至 30nm 时，散射强度则由低角度向高角度呈直线下降的趋势； 而当分子大于 30nm 时，散射强度则随角度增大呈曲线下降的趋势。
2. 基本理论
由 Maxwell，Einstein，Debye 及 Zimm 等人陆续发展起来，有关溶剂中分子量的 光散射现象可由下列公式表达：
式中：
常数 K*=4 π2 (dn/dc)2n02 (NA λ04)
n0 是溶剂的折光指数。
C 是溶质分子的浓度（g/mol）。
NA 是阿佛加德罗常数。
λ0 是入射光的波长。
DN/DC 是溶液折射率与浓度变化的比值，它说明了随溶质浓度变化的溶液折光指数 变化。
R( )是单个角度的散射光（大于溶剂的散射光数量） 除以入射光强度所得的分数 即不同角度光散射强度。
Mw 是重均分子量。
A2 是第二维里系数
P( 是光散射强度的函数
将 P( 代入式（ ）展开得：
在上式中，R( )是测得值，K*c、 λ0、 为输入值，均为已知值； 而 Mw、A2 、rg
为未知值。
3. Z imm P lot
将 K* C/ R θ对 sin2 (q/2)+kc作图，可得到著名的 Zimm 曲线，如图 2 所示，其中 K
为调整横坐标的设定值
在纵座标上交点的倒数即为 Mw。实验的方法为配制一组不同浓度的溶液，依次在
不同的角度测量其散射光强度，由计算机程序按照上列的公式绘出 Zimm Plot，并求得
Mw，<rg2>及 A2值，这是极少数能直接测得绝对分子量的方法之一。但由于结果仅为单
一平均值，因此较适用于成分单一，分布较窄的分子，对于分布较宽或有不同族群分
布的样品，则较难看出全貌。
四 光散射与 GPC/SEC
GPC/SEC 可以将溶剂中的分子按重量或尺寸大小依次洗脱出来。利用此项技术将光
散射仪器与 GPC/SEC 联用，除了可以分出不同的族裙，还可测得不同族群的分布，并
且不需要另外标准样品做标准曲线。由于光散射信号直接与分子量大小有关，因此可
以直接测出重均绝对分子量，并获得其它许多有关的信息。
Chromatography with LS Set-up
1 Debye plot
通常 GPC/SEC 的样品注射浓度就很低，再经过色谱柱得到进一步的稀释，图 4 中
光散射信号上的任何一点，其浓度都极低（趋近于零）。根据公式，当 2 A2C → 0，
将 K* C/ Rθ对 sin2(q/2)+kc 作图 6，其纵坐标交点即为 1/Mw，由直线的斜率可得
到<rg2>，图 4 光散射信号的每点都可以得到上述结果，由此可以求得分子量及旋转半径<rg2>的分布，如图 7 所示：
2 分子形状
不论是分布较宽或是多峰分布的样品，皆可通过测量分子量及分子旋转半径得到分
子形状的数据。
球形分子
ri3 ∞ Mi→log ri = k + 1/3 log Mi
无规则线团状分子
ri2 ∞ Mi→log ri = k + 1/2 log Mi
棒状分子
ri1 ∞ Mi→log ri = k + 1/1 log Mi
将 log ri， log Mi作图，有直线的斜率可以获知分子的形状，如图 9 所示：
logM
3 需要量多少个角度
在低角度的时候，有杂质所产生的噪音信号干扰会很大，如图 10 所示，所以只取
低角度，加上九十度两个角度，其误差就会相对很大；若只取九十度则只能求得分子
量，无法测得旋转半径，所以最起码要加上一组高角度来修正，则误差会较少很多。
图 10 杂质较多的 GPC 层析图
图 11 三个检测角度
五 应用
光散射强度与分子的大小及分子量有直接的关系，而 SEC/GPC 能分离不同尺寸及分 子量的分子，结合此两种特性，可以得到许多有用的信息，并广泛地应用于高分子， 生化及动力学等研究领域。
图 12 十八角度检测器
1 高分子聚合物特性
利用多角度激光光散射系统（Multi-Angle Laser Light Scattering_ MALLS） 结 合 SEC/GPC，不必依赖泵的流速，校正曲线及其它任何的假设，即可直接求得重均绝对分子量及分子量分布等数据。
MALLS 利用色谱柱分离出的样品在各个角度的光散射量（如图 13），由 RI 检测器 得到的洗脱液浓度及 dn/dc 值，即可计算出各个切片的分子量。MALLS 测得绝对分子量 所需的各种物性均可由实验直接求得，无需作任何假设。而 GPC 的色谱柱又有分离杂 质的功能，可以避免传统的光散射需极小心准备样品的麻烦。图 14 显示高分子混合物 经 SEC 分离后 MALLS 及 RI 的洗脱体积对照图。由此图看出 RI 对大分子量浓度低的物 质较不敏感，而对低分子量高浓度者较敏感。
图 14 这是由 ASTRA 软件得到的 miniDAWN（上）和 Optilab 示差检测器（下）信号。
2． 蛋白质及其聚合体
在各种工业应用中，决定蛋白质的绝对特性不仅严格而且必要，例如在生化工程
应用上，以蛋白质为基质的产品必须很纯而且无任何聚集存在。而测定蛋白质的分子
量和是否有聚集态存在，光散射法是最理想的工具之一。
以往，在水相中用低角度光散射测量法（LALLS）受到溶剂中不纯的物质干扰相当
大。而 MALLS 的多角度测量大大降低了背景噪音的干扰，并能提供完整的信息和良好
的重现性结果。图 16 显示蛋白质混合物的 MALLS 和 RI 的信号。样品在 0.1M NaCl 中
含 0.05M 的磷酸盐缓冲液中进行 RI 为 Wyatt Optilab 903，流速为 0.1mL/min ,色谱
柱为 Shodex KW-803 和 KW-804。虽然此样品为标准样品，但 MALLS 仍很清楚地检测到
聚集现象，此现象在 RI 几乎无法辨认。
3．分枝
高分子聚合物的分枝程度和分布是影响其物理和化学性质的一个重要因素。采用
多角度激光光散射系统（MALLS）与 GPC/SEC 系统联用是唯一决定分枝系数 gM的方法。
虽然也有其他确定分枝的方法，但都不能直接且需要众多假设及“虚拟因子”。
由传统的 RI 或 Viscometer (粘度检测器) 测定的高枝化分子的分子量与绝对值有
很大的差别，若欲做有效的色谱柱校正，则需以一系列与待测物成分相同的标准品作
校正。若标准样品与待测物的成分或组分不同，则会产生很大的误差。例如分子量相
同的球形高分子的洗脱时间比无规则线团状分子要长。
因为 MALLS 所求得分子量和大小为绝对值，因此计算分枝系数 gM不需要任何假设。
由 MALLS 直接所求得的分子大小会直接影响分枝率。对分子量相同的长链状分子而言，
其值越小，则分枝程度越大。分枝比的定义为分枝分子的旋转半径与长链分子的旋转
半径之比，即 gM=<r2>b/<r2>l由 MALLS 测得。
图 17 为由 MALLS 测得的分枝状和长链形的高分子（PS）的旋转半径和分子量对照
图。由图中可看出，虽然其分子量相同，但分布明显不同。图 18 为 rg对 Mw做图。
图 17 PS 线形与枝化分子的对照图
图 18 旋转半径对分子量图（分子构型图），可以看出样品（藻酸钠）在辐射后分子构型的变化。
6. 动力学/反应速率
MALLS 还可以用于如抗原，抗体等反应迅速的溶液系统，粒子和蛋白质聚集现象的检测。因为 MALLS 内部同时装有数个固定的检测器，所以不需移动任何仪器硬件来扫描样品，即可及时多方位同时捕捉反应速率的现象。使用 MALLS，可研究抗原-抗体反应，反应发生时就可决定聚集粒子的大小。当改变温度，浓度或催化剂时，MALLS 可记录下反应发生时，分子的特殊变化。
图 19 浓度变化对蛋白聚集的影响
使用 DAWN 检测器研究了浓度对分子量为 75KD 单分子蛋白质聚集作用的影响。图 19 描述了这种特殊蛋白质从 30ug/ml 到 1mg/ml 范围内得到的浓度相关性。如图所示， 该蛋白质在低浓度作为单一分子而在浓度大于 700ug/ml 时聚集为六聚体。该结果与gluteraldehyde 高度交联技术所得结合完全相符。
图 20 温度变化对 PMMA 分子量和大小的影响
7. 低分子量的测定
DAWN HELEOS 或 mini DAWN TREOS 的固定光电二极管检测器可以捕捉到很微弱的光散射信号，使得分子量的测定成为可能。使用 DAWN 系列标准配制的任何一款激光器，都可以轻易地测量分子量低于 2000D 的聚合物，并具有相当的准确性。
由于 DAWN HELEOS 或 mini DAWN TREOS 具有三个以上的多角度同时捕捉散射信号的能 力，即使极微弱的信号，如只比背景值略高的低分子量样品所散射出的信号也可以从不同的角度去捕捉，累计在一起就可以计算出相当准确的结果。这是单角度或者两角度检测器所无法做到的。
图 21 为分子量分别为 580、1400 及 2000D 的聚苯乙烯样品分子量对洗脱体积的对应图。样品量浓度分别为 7.1mg/ml，2.9mg/ml 及 2.2mg/ml。经 ASTRA GPC 软件分析得出如表 2 的平均分子量。
图 22 为分子量分布图。
图 21 低分子量样品与洗脱体积图
图 22 低分子量样品分子量图
表 2 样品平均分子量
一般传统光散射仪给人们的印象是不易测得分子量较低的样品，甚至低于 10000D就比较困难了。但是采用最新的多角度激光光散射仪就可以轻易且相当准确的测量分子量低到几百 D 的样品。
六 结论
传统的光散射法只能确定平均分子量，旋转半径及第二维里系数，而 GPC/SEC 又 受泵流速的限制，再加上寻找与待测物结构相似的标准品不易，对低浓度高分子量的部分，如 microgel, trimer, dimer 等信号不敏感，导致误差增大，色谱柱容易老化。 而多角度激光光散射仪(MALLS)与 GPC/SEC 结合，正可以互相补充，不但可以直接测得绝对分子量，还可以对样品的组成，从低浓度高分子量到高浓度低分子量，都能解析的很清楚，更可以得到许多有用的信息，如分子的形状，分枝状况，聚集态及动力学参数，反应速率等，其功能与应用普及性正与日俱增。
文章来自美国怀雅特技术公司