实验技术|蛋白免疫印迹WB（下）
科研就像赛跑，你比别人跑的快，就比别人多发几篇SCI~
前两期，给朋友们带来了
做了很久的WB，走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，才是实验成功的基石。
蛋白免疫印迹（WB）是基于抗原抗体的特异性结合作用，以检测复杂样品中的某种蛋白，并对其进行半定量分析的一种方法。
主要用于靶标蛋白特异性表达的定性或半定量分析，蛋白与蛋白或蛋白与DNA相互作用的后续分析，以及蛋白修饰的鉴定分析。
常见问题分析
1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
原因有很多：
a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；
c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2.我做的蛋白质分子量很小（10 kDa），请问怎么做WB？
a)可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可；
b)也可选择孔径0.22 μm的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。
3.我的目的带很弱，如何加强？
a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；
b)也可以将一抗稀释比例降低；
c)还可以延长曝光时间。
4.DAB好还是ECL好？
DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
5.胶片是一片空白，是怎么回事？
如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；
c) ECL底物没覆盖到相应位置；
d) 一抗选择不当二抗失活；
e) 二抗失活。
6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？
一般5×10^6就足够。
8.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5 mm的。
9.大分子量蛋白200 kDa，在做WB要注意什么？
a) 做200kDa蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；
b) 转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
c) 转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦!
10.免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？
免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
11.WB中抗体的可以重复应用吗？
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4℃保存，避免反复冻融。
12.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？
无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
原因分析及解决办法
此次给大家带来的干货到此结束啦
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实验技术WB
1.蛋白样品准备
2.蛋白定量
3.上样
4.凝胶电泳
5.转膜
6.封闭
7.孵育一抗
8.孵育二抗
9.显影
10.常见问题
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