Análisis morfométrico del proceso de diferenciación in vitro de neuronas del hipocampo. 

Gisselle Correa ^1,2 y Marines Longart ¹.

¹ Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados, Caracas y

² Decanato de Estudios Profesionales, Universidad Simón Bolívar. Sartenejas, Baruta, Venezuela.

Autor de correspondencia: Marines Longart. Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados. Apartado 17606. Caracas 1015A, Venezuela. Tlf: +58-212-9035191, Fax: +58-212-9035118. Correo electrónico: mlongart@idea.gob.ve 

Resumen.

Los cultivos neuronales del sistema nervioso central se han venido usando ampliamente para el estudio de los mecanismos que conducen el proceso de diferenciación neuronal, así como también se han empleado como modelos in vitro para evaluar drogas y desarrollar nuevas terapias, de allí la importancia profundizar en la caracterización de dicho proceso. En este estudio, se prepararon cultivos primarios de células del hipocampo para estudiar los tipos celulares desarrollados, el desarrollo de dendritas y axones, la densidad de vesículas sinápticas y el desarrollo de los conos de crecimiento. Mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos y marcadores no inmunológicos, se observaron los cambios experimentados por las estructuras de interés durante diferentes estadios temporales (1-21 días). Observamos una mayor proporción de neuronas sobre glias, desarrollo normal de las redes neuronales (conformadas por dendritas y axones), incremento en la longitud de dendritas y el establecimiento de sinapsis. Las vesículas sinápticas también experimentaron un incremento en su densidad a medida que aumentaba el tiempo de cultivo. Finalmente, se estudiaron los cambios morfológicos de los conos de crecimiento observándose que al inicio del cultivo en su mayoría se encontraban cerrados, pero a medida que maduraban las neuronas la proporción de conos de crecimiento abiertos aumentó. Este trabajo representa un avance en la caracterización morfométrica de los cultivos neuronales puesto que recoge de manera simultánea y cuantitativa los principales aspectos que marcan el proceso de diferenciación neuronal. En este estudio, la medición de estas características morfológicas hizo posible establecer parámetros cuantitativos que ayudarán a distinguir las principales etapas de la diferenciación neuronal.

Palabras clave: axones, dendritas, diferenciación, inmunofluorescencia, polaridad. 

Morphometric analysis of the differentiation process of hippocampal neurons in vitro.

Abstract.

Neuronal cultures of the central nervous system are widely used to study the molecular mechanisms that rule the differentiation process. These cultures have also been used to evaluate drugs and to develop new therapies. From this we can infer the relevance of performing an extended characterization that involves the main aspects driving such process. To carry out such characterization in the present study we prepared primary cultures from hippocampal cells to study cell identity, development of neuronal processes (dendrites and axons), density of synaptic vesicles and development of growth cones. Using immunofluorescence techniques, specific antibodies and non-immunological probes, we studied the changes experienced by the structures under study during different temporal stages (1-21 days). We observed a major proportion of neurons over glia, normal development of neuronal networks (formed by dendrites and axons), increase in the length of dendrites and axons and establishment of synaptic connections. Synaptic vesicles also showed an increase in their densities as long as the time of the culture progressed. Finally, we studied the morphological changes of the growth cones and observed that those were mostly closed at the beginning of the culture period. As neurons matured we observed an increase in the proportion of open growth cones. This work represents an advance in the morphometric characterization of neuronal cultures, since it gathers the main aspects that outline the neuronal differentiation process. In this study, measurement of these morphological features made possible to establish quantitative markers that will allow establishing more precisely the different stages of neuronal differentiation.

Key words:  axons, dendrites, differentiation, immunofluorescence, polarity. 

Recibido: 30-10-09. Aceptado: 03-06-10.

INTRODUCCIÓN 

Uno de los principales atractivos de los cultivos primarios de células nerviosas es la posibilidad de acceder de manera inmediata a neuronas vivas para su observación y manipulación. Adicionalmente, los cultivos neuronales de densidades determinadas (baja y mediana densidad) son menos complejos que los tejidos de los cuales provienen, convirtiéndolos en la preparación ideal para investigar aspectos importantes de la biología neuronal (1-5). Las líneas celulares clonales se han usado como modelos para el estudio de la fisiología neuronal, sin embargo, éstas células deben ser estimuladas con factores neurotróficos y cultivadas en las condiciones adecuadas para simular el comportamiento fisiológico de células nerviosas como la generación de procesos (dendritas y axones) y la formación de conexiones neuronales (6), lo que presenta limitaciones al establecer una comparación directa entre el comportamiento de las células nerviosas in vivo y estos modelos. Por otra parte, aspectos de la biología neuronal como son la diferenciación, tráfico y localización subcelular de proteínas, así como ensayos con drogas de potencial terapéutico son estudiados mayormente en cultivos primarios de células del sistema nervioso, razones que justifican el amplio uso de estos cultivos. 

En principio, los cultivos neuronales primarios pueden prepararse de cualquier región del cerebro, sin embargo, el hipocampo representa una de las regiones del cerebro más utilizada debido a que su población neuronal es bastante homogénea. La población neuronal del hipocampo está representada por las neuronas piramidales las cuales a su vez representan de 85% a 90% de la población total de neuronas del SNC (7, 8). Adicionalmente, las neuronas piramidales en cultivo expresan muchas de las características fenotípicas propias de estas células, como son el desarrollo de un axón simple, una larga dendrita apical y numerosas dendritas basales más cortas (8, 9); en general estas células mantienen su identidad en cultivos in vitro, lo que hace a estos cultivos excelentes modelos para el estudio del funcionamiento del SNC (9-12). 

Investigaciones sobre el desarrollo de células individuales del tejido nervioso requieren del estudio de la distribución diferencial de marcadores específicos. Las condiciones de cultivo in vitro permiten el crecimiento de células a baja o mediana densidad, para facilitar la observación de neuronas individuales (7, 9, 13, 14). El estudio de estas células en cultivos homogéneos y de densidad controlada, hace posible monitorear los cambios experimentados durante el período de cultivo. 

La interpretación del funcionamiento del sistema nervioso tanto en condiciones normales como patológicas es un tema controversial y de gran interés científico. Sin embargo, la gran diversidad y complejidad de las estructuras y los procesos involucrados en su funcionamiento han hecho difícil un total entendimiento de su fisiología. No obstante, gracias a la implementación de los cultivos celulares se ha facilitado enormemente el estudio de las estructuras, ofreciendo una mayor comprensión de este complejo sistema (2-5, 15-19). 

El desarrollo de todo tejido involucra procesos de proliferación, migración, adhesión, diferenciación y sobrevivencia, eventos delimitados espacial y temporalmente durante el desarrollo in vivo. Dichos procesos, sumados a la regeneración del tejido nervioso se encuentran influenciados por la acción conjunta de factores neurotróficos que activan cascadas de señalización celular que conducen a la proliferación y eventual diferenciación del tejido (1, 20-22). El efecto de los factores neurotróficos involucrados en su desarrollo y en el proceso de diferenciación ha sido y continúa siendo estudiado en cultivos homogéneos de distintos tipos neuronales. Estos cultivos no sólo están siendo empleados para el estudio de la regulación de procesos celulares que conllevan a la degeneración del tejido nervioso, sino también para el desarrollo de terapias de transplante para tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (19, 23, 24). 

En el presente trabajo se planteó el establecimiento de cultivos primarios de células del hipocampo de ratas, para el estudio de la morfología de las neuronas, así como los cambios experimentados por éstas, a medida que avanzaba el proceso de maduración neuronal. Específicamente, se estudió la proporción de tipos celulares originados (neuronas y glia), el desarrollo de las neuritas (dendritas y axones), la acumulación de vesículas sinápticas y los cambios experimentados por los conos de crecimiento, durante el desarrollo de dichos cultivos. Otros autores han analizado algunas de estas características de manera independiente. Sin embargo, en el presente estudio se presenta una descripción más integral del desarrollo neuronal ya que se estudian y cuantifican las características morfológicas y la expresión de marcadores celulares, lo que permite una mejor descripción del desarrollo anatómico funcional de estas neuronas.

En el presente trabajo se estudian y cuantifican, de manera conjunta, parte de las características morfológicas y su comportamiento durante el desarrollo in vitro, permitiendo establecer una relación entre el tiempo de aparición de estos marcadores, sus parámetros morfométricos y la maduración de la neurona; representando así una buena descripción integral del desarrollo anatómico-funcional neuronal. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Animales 

Para la preparación de los cultivos neuronales se utilizaron embriones de rata Sprague-Dawley de 19 días (E19). Los embriones se removieron por cesárea después de sacrificar a la madre por exposición a CO₂ y decapitación. Los animales se mantuvieron y sacrificaron según regulaciones del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA). Se tomaron precauciones para reducir el número de animales así como su sufrimiento.

Disociación, cultivo y mantenimiento de las células del hipocampo 

Todos los reactivos empleados en esta sección, a menos que se indique lo contrario, se obtuvieron de Gibco-Invitrogen (Grand Island, NY). Los cultivos neuronales de hipocampo se prepararon a partir de embriones de rata E19 según protocolos previamente descritos (26, 27). 

En general, se extrajeron los hipocampos y se transfirieron al medio de disección [Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) suplementada con 10 mM HEPES pH 7,4 y una mezcla de Penicilina-Streptomicina (100 U/mL-100 µg/mL)]. Después de 3 lavados con el medio de disección, los hipocampos se transfirieron a una solución de Tripsina al 0,25% en HBSS y se incubaron a 37°C durante 15 minutos. Se lavaron nuevamente y se disociaron mediante trituración mecánica en 2 mL del medio de cultivo (medio Neurobasal^TM, suplementado con B27, 0,5 mM Glutamina, 0,0125 mM Glutamato y Penicilina-Streptomicina). Las células resultantes se resuspendieron a una concentración final de 5 × 10⁴ cel/mL en medio de cultivo y se colocaron en placas de 24 pozos (0,5 mL/pozo); que contenían cubreobjetos de vidrios previamente tratados con una mezcla de Poli-D-Lisina (0,0375 mg/mL, Fisher CB40210) y laminina (0,0021 mg/mL, Fisher CB40232). Las células se mantuvieron en incubadora (37°C, CO₂ 5%, el resto de los gases representa el 95% y se encuentra en equilibrio con los gases encontrados en el aire) hasta su uso. Cada 3 días se reemplazó la mitad del volumen del medio de cultivo, por medio fresco sin glutamato.

Caracterización morfológica por inmunofluorescencia 

Para el marcaje de los conos de crecimiento se realizó la fijación del cultivo mediante un protocolo de fijación para citoesqueleto, para ello las células se incubaron en una solución de fijación-permeabilización (formaldehído al 3,7%, glutaraldehído al 0,075%, Tritón X-100 al 1%, en PBS), durante 2 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, se incubaron en la solución de fijación (formaldehído al 3,7%, glutaraldehído al 0,075%, en PBS) por 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se colocaron en la solución de permeabilización (Tritón X-100 al 1%, en PBS) por 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con NaBH₄ al 1% en PBS, durante 5 minutos. Para el marcaje de neuronas, glías, dendritas, axones y vesículas sinápticas las células se fijaron con PFA-PBS al 4%, por 20 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, se realizaron varios lavados con PBS en un tiempo total de 20 minutos y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,25% en PBS, por 10 minutos a temperatura ambiente. A partir de este momento los tratamientos fueron similares para los distintos tipos de marcaje. Se procedió al bloqueo con suero normal de cabra al 10% (NGS, Sigma, Saint Louis, MO) en PBS y se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Seguidamente se realizó la incubación con los anticuerpos primarios diluidos en NGS al 2% en PBS y se dejaron a 4°C durante toda la noche. Después de varios lavados con PBS, se agregaron los anticuerpos secundarios en NGS (2%) en PBS, por 1h a temperatura ambiente, en caso de usar pruebas fluorescentes estas se incluyeron junto con el anticuerpo secundario. Después de lavar con PBS se montaron en el medio para fluorescencia Mowiol-Dabco [(glicerol al 25%, Mowiol al 10% (Calbiochem, San Diego, CA) 6 mL de H₂O destilada, 0,2 M Tris, pH 6,8; DABCO al 2,5% (Sigma)]. 

Anticuerpos y pruebas fluorescentes no inmunológicas 

Para la cuantificación de neuronas y células gliales se realizaron experimentos de triple marcaje, para ello se marcaron los núcleos celulares con la prueba fluorescente DAPI (1:10000, Molecular Probes-Invitrogen, Eugene, OR), las neuronas con MAP2 (1:5000, anticuerpo policlonal preparado en conejo, Millipore, Billerica, MA) y células gliales con GFAP (1:1000, anticuerpo monoclonal preparado en ratón, Sigma). El desarrollo de las dendritas y la determinación de su longitud se realizaron mediante el marcaje con MAP2 (1:5000, anticuerpo policlonal preparado en conejo, Millipore). El desarrollo de los axones se analizó con el anticuerpo SMI35 (1:5000, anticuerpo monoclonal preparado en ratón, Covance, Princeton, NJ). Para determinar la distribución de las vesículas sinápticas sobre las dendritas y su densidad en áreas de estos procesos (usados como referenciales) se realizó doble marcaje con sinaptofisina (1:500, anticuerpo monoclonal preparado en ratón, Sigma) y MAP2 (1:5000). Para el estudio de los conos de crecimiento se realizó el doble marcaje con MAP2 (1:5000) y la prueba fluorescente Faloidina-Rodamina (1:40, Molecular Probes-Invitrogen), la cual marca los filamentos de actina enriquecidos en los conos de crecimiento. Los anticuerpos secundarios fueron anti-ratón o anti-conejo Alexa 488 (1:200, Molecular Probes-Invitrogen) y anti-ratón o anti-conejo Alexa 594 (1:600, Molecular Probes-Invitrogen).

Adquisición de imágenes 

Las células se observaron periódicamente para seguir el desarrollo y asegurar la homogeneidad de los cultivos. Para ello se obtuvieron imágenes en un microscopio invertido Axiovert 100 (Zeiss) equipado para contraste de interferencia diferencial (DIC)  e inmunofluorescencia. Los objetivos fueron: Plan-Neofluar 10 X A.N 0,3; Plan Achromat 32X A.N 0,4 y Plan-Apochromat 100X A.N 1,4 (para inmersión en aceite). Las células se fotografiaron con una cámara digital (Nikon, Cool pix 900) adaptada al microscopio, este microscopio se utilizó para los primeros experimentos de doble marcaje fluorescente usando los filtros XF25 Vivid Classic (excitación 494 nm, emisión 518 nm) y 488015 (excitación BP 546/12 nm, emisión LP 590 nm). Adicionalmente, para los experimentos de triple marcaje fluorescente se usó el microscopio invertido Axio Observer Z1 (Zeiss-Germany), equipado con los filtros 488049 (excitación G365 nm, emisión 445/50 nm), 489038 (excitación 470/40 nm emisión 525/50) y el 488020 (excitación 546/12 nm emisión 575-640). Las células se fotografiaron con una cámara digital (Nikon modelo Cool pix 5400) adaptada al microscopio, utilizando los objetivos Plan Neofluar 40X A.N 0,6 y Plan Apochromat 100X A.N 1,4 (para inmersión en aceite). Las fotografías obtenidas fueron analizadas con la ayuda del Software ImageJ (NIH, Bethesda, Estados Unidos). 

Cuantificación 

El proceso de extracción y cultivo de las neuronas del hipocampo se realizó a partir de 4 disecciones independientes, con réplicas por cada período y prueba. Cada condición se fotografió en diez campos aleatorios para realizar los análisis correspondientes. La proporción de los distintos tipos celulares se determinó mediante la cuantificación de las imágenes provenientes del triple marcaje de los núcleos celulares marcados con DAPI, células con marcaje positivo para MAP2 y células con marcaje positivo para GFAP. Para ello se utilizó la superposición de imágenes obtenidas a un aumento de 40X. 

La longitud promedio de dendritas por célula se obtuvo mediante la división de la longitud total de estos procesos marcados con MAP2 entre el total de neuronas contadas. El mismo criterio se utilizó para determinar la longitud de los procesos axonales, la cual sólo se pudo realizar en los estadios iniciales del cultivo, Para ambos casos, se utilizó una correlación de µm/píxel en el programa ImageJ a partir de una escala preestablecida. Adicionalmente se determinó el número promedio de dendritas por célula, para lo cual se contó el número total de dendritas y se dividió por el número total de neuronas analizadas. 

Para la determinación de la densidad de vesículas sinápticas sobre las dendritas y con la ayuda del doble marcaje con los anticuerpos Sinaptofisina y MAP2, se cuantificó la cantidad de vesículas presentes en 10 áreas de 5 µm² de procesos dendríticos. Estas áreas fueron escogidas de manera aleatoria, por cada campo fotografiado y se utilizó la escala preestablecida mediante una correlación de µm/píxel en el programa ImageJ. 

Por último, para estudiar la morfología de los conos de crecimiento, mediante la determinación de la proporción de conos abiertos y cerrados, se realizó un doble marcaje con Anti-MAP2 para los procesos neuronales y el trazador no inmunológico Faloidina-Rodamina. 

Todas las cuantificaciones se realizaron de manera independiente por cada marcaje, para cada disección y período de tiempo, los resultados mostrados representan el promedio con su error estándar (X ± SEM). La cuantificación se realizó a partir de cuatro experimentos independientes, con dos réplicas cada uno. 

RESULTADOS 

Establecimiento de cultivos primarios y estudio del desarrollo de la morfología neuronal in vitro 

A partir del extracto celular de neuronas del hipocampo de los embriones se logró obtener un cultivo celular homogéneo, de mediana densidad, en donde se pueden observar células de manera independiente. Como se puede observar en las micrografías obtenidas por DIC (Fig. 1), las células en cultivo muestran un crecimiento progresivo de las neuritas, así como también un aumento en la complejidad de la red neuronal. Sin embargo, en todos los períodos se pueden observar células individuales, lo que garantiza la precisión de las observaciones con el marcaje inmunofluorescente. Las neuronas se mantuvieron en buen estado hasta 21 días en cultivo, posterior a este tiempo se comenzó a observar un deterioro del cuerpo celular y la fragmentación de los procesos, razón por la cual no se emplearon cultivos posteriores a este periodo.

Fig. 1. Imagenes representativas del cultivo primario de neuronas del hipocampo obtenidas por contraste de interferencia diferencial. A) 24 horas. B) 72 horas. C) 15 dias. D) 21 dias. Escala = 30 mm.

Tipos celulares presentes en los cultivos 

La extracción del hipocampo y la disociación de las células de manera mecánica no permiten seleccionar el tipo celular a cultivar. Por tal motivo, se utilizaron condiciones de cultivo, sustrato y un medio de cultivo, los cuales favorecen el crecimiento selectivo de neuronas (26, 27). En cuanto a la proporción de los diferentes tipos celulares se observó una tendencia hacia el aumento del porcentaje de neuronas el cual osciló entre 46,9 ± 4,40% y 68,51 ± 5,81%; mientras que, el porcentaje de células positivas para GFAP experimentó variaciones entre 11,83 ± 7,51% y 26,93 ± 10,25%. La proporción de células positivas para MAP2 experimentó el pico más alto a las 24 horas, con un leve decrecimiento a las 48 horas, a partir del día 3 la proporción de neuronas se recuperó (57,66 ± 11,23%), estabilizándose a partir del día 7, sin embargo es importante señalar que a pesar que se observó que estas variaciones no fueron lineales éstas no son significativas, lo que se concluye luego de la aplicación de un t-test entre ambos estadios, con el cual se obtuvo un p-valor igual a 0,3118 (P>0,05). Para las células positivas para GFAP, a excepción del día 3 donde se observa el pico más alto (26,93 ± 10,25%), la proporción de células gliales fue bastante estable (Fig. 2). Es importante señalar que los porcentajes de células positivas para MAP2 y GFAP no suman el 100%, quedando una población celular entre 17,47 y 37,73% que no fue marcada por estos anticuerpos.

Fig. 2. Imagenes representativas de experimentos de triple marcaje con los anticuerpos MAP2, GFAP y la prueba fluorescente DAPI. A) 48 horas. B) 72 horas. C) 21 dias. D) Cuantificacion de de celulas neuronales (MAP2+) y gliales (GFAP+). Las barras representan el porcentaje con el error estandar de los dos tipos celulares. Los porcentajes se obtuvieron a partir de cuatro experimentos independientes, con dos replicas cada uno. Escala = 50 mm.

Longitud y número de los procesos neuronales por célula 

Para el estudio de los procesos neuronales (dendritas y axones), se determinó el número promedio de dendritas por célula y la longitud de los axones y las dendritas; para ello se realizó un doble marcaje inmunológico utilizando los anticuerpos MAP2 (dendritas) y SMI35 (axones). En los marcajes realizados en cultivos de 24-48 horas en la mayoría de las neuronas se observó que uno de los procesos presentaba una doble expresión de los marcadores axonales (verde) y dendríticos (rojo) (cabezas de flecha, Fig. 3A-ab). A las 72 horas, se comenzó a observar de manera más marcada el marcador axonal mientras que comenzó a disminuir la expresión del marcador dendrítico y a los 7 días el marcaje de los axones fue completamente distinto del dendrítico. Paralelamente, se midió la longitud de las dendritas y se observó un aumento de esta a medida que se incrementaba el tiempo de cultivo; los valores de la longitud de dendritas variaron de 93,90 ± 5,01 µm (24 h) a 499,32 ± 35,27 µm (21 d) por célula, observándose el mayor valor a los 15 días (575,57 ± 72,91 %) (Fig. 3B). Por su parte, la cantidad de dendritas fluctuó de 3 a 6 dendritas por célula a lo largo del período de cultivo. Con respecto al desarrollo de los axones la longitud de los mismos sólo se pudo determinar durante los períodos iniciales del cultivo (24-72 h). Esta longitud mostró también un aumento de 30 µm (24 h) a 300µm (72 h) por célula. En los cultivos de 7 a 21 días se imposibilitó la medición precisa de los axones debido al incremento de la complejidad de la red axonal en estas etapas del desarrollo in vitro.

Fig. 3. A) Imagenes representativas del doble marcaje con MAP2 (rojo) y SMI35 (verde). Se muestra la pre-polarizacion o ambiguedad en la definicion de axones y dendritas (cabezas de flecha) y la definicion de la polarizacion o definicion de axones (Flechas). a) 48 horas b) 72 horas c) 7 dias d) 21 dias. B) Longitud promedio de dendritas por celula. C) Numero promedio de dendritas por celula. La cuantificacion se realizo a partir de cuatro experimentos independientes, con dos replicas cada uno. Escala = 10 mm.

Densidad de vesículas sinápticas 

La determinación de la densidad de vesículas sinápticas sobre los procesos dendríticos, fue monitoreada a través del desarrollo de los cultivos. Se observó una tendencia homogénea donde se evidencia un aumento gradual de las vesículas sinápticas, a medida que transcurría el tiempo de cultivo (Fig. 4A). La cuantificación de la densidad de vesículas entre 24 y 48 horas no llegó a superar la unidad, esto se debe a que en estos períodos pocas veces no se pudo observar vesícula alguna. A partir de los 3 días, la densidad de vesículas en el área mencionada aumentó de 2 a 4 vesículas por 5 µm² (Fig. 4B).

Fig. 4. Fotografias del doble marcaje MAP2 (rojo)-Sinaptofisina (verde) para medir la cantidad de vesiculas sinapticas presentes en 5 mm² de procesos dendriticos. Grafica de la cantidad de vesiculas sinapticas presentes en 5 mm². A) Doble marcaje del cultivo, a) 24 horas, a' f) aumento de la zona marcada, b) 72 horas b' f) aumento de la zona marcada, c) 15 dias c' f) Aumento de la zona marcada. B) Grafica la cantidad de vesiculas sinapticas presentes en 5 mm². La cuantificacion se realizo a partir de cuatro experimentos independientes, con dos replicas cada uno. Escala = 10 mm.

Cambios en la morfología de los conos de crecimiento durante el cultivo 

Se realizó la observación de la morfología de los conos de crecimiento durante el tiempo de cultivo (1-21 días) para determinar si existía relación entre los cambios morfológicos de dichas estructuras, con la maduración del cultivo. 

Como característica morfológica considerada en esta determinación fue el estado de los conos de crecimiento (abiertos y cerrados). La proporción de los conos de crecimiento cerrados disminuyó de manera progresiva a medida que avanzaba el tiempo de cultivo, esta osciló entre 79,98 ± 4,64 (24 horas) y 23,78 ± 1,07 (21 días). Por otra parte, la proporción de conos de crecimiento abiertos aumentó considerablemente en el mismo tiempo de cultivo, observándose valores entre 20,03 ± 4,64 (24 horas) y 76,23 ± 1,07 (21 días) (Fig. 5).

Fig. 5. Fotografias del doble marcaje MAP2 (verde)-Faloidina-Rodamina (rojo) para observar morfologia diferencial de los conos de crecimiento segun la edad del cultivo. Se observa el cambio en las proporciones de conos de crecimiento abiertos (Flechas amarillas) y cerrados (Flechas blancas). A) Doble marcaje del cultivo, a) 24 horas, b) 15 dias. B) Grafica mostrando el porcentaje de conos de crecimiento abiertos y cerrados en los diferentes estadios temporales. Las barras rojas representan la proporcion de conos de crecimiento cerrados y las amarillas, la proporcion de conos de crecimiento abiertos. La cuantificacion se realizo a partir de cuatro experimentos independientes, con dos replicas cada uno. Escala = 10 mm.