DE69838723T2

DE69838723T2 - Erythroblasten-diagnostische Durchflusszytometrie-Methode und Reagenzien

Info

Publication number: DE69838723T2
Application number: DE69838723T
Authority: DE
Inventors: Tomohiro Himeji-shi Tsuji; Takashi Kakogawa-shi Sakata; Yoshiro Himeji-shi Ikeuchi; Shin'ichiro Kobe-shi Oguni
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1998-12-07
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2018-12-08
Also published as: ATE378589T1; JP3886271B2; EP1004880A3; DE69838723D1; EP1004880B1; US6664110B1; JP2000162209A; EP1004880A2

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die durchflusszytometrische Diagnose von Blutbestandteilen mit einer Form; insbesondere betrifft die Erfindung die Unterscheidung und das Zählen von Erythroblasten in peripheren Blut- oder anderen Körperflüssigkeitsproben durch Durchflusszytometrie.
Beschreibung des Standes der Technik
Im Bereich der klinischen Untersuchung kann das Sortieren und Zählen von Erythroblasten für die Krankheitsdiagnose wichtige Informationen liefern.
Die Erythropoiese findet im Knochenmark statt und normalerweise sind Erythroblasten vor ihrer Freisetzung in die Zirkulation als Reticulocyten im letzten Stadium der Reifung zu roten Blutzellen im peripheren Blut nicht vorhanden. Folglich weist das Auftreten von Erythroblasten in peripherem Blut in einem der unterscheidbaren erythropoietischen Stadien, die Reticulocyten vorangehen, auf die Möglichkeit des Vorliegens einer Erkrankung hin, wie akuter myelocytischer Leukämie, hämolytischer Anämie, Eisendefizienzanämie und perniciöser Anämie. Dementsprechend kann das Sortieren und Zählen von Erythroblasten äußerst nützlich sein bei der Diagnose von derartigen Erkrankungen. Konventionellerweise werden beim Zählen und Sortieren von Erythroblasten im Allgemeinen Blutausstriche hergestellt, welche dann in geeigneter Weise gefärbt werden für das Zählen und Sortieren durch mikroskopische Untersuchung.
Auf der anderen Seite sind verschiedene voll automatisierte Leukocyten-Sortier-/Zählvorrichtungen verfügbar, die die Prinzipien der Durchflusscytometrie anwenden. „Flow Cytometers – History and Measurement Principle," Sysmex Journal International, Vol. 6 No. 1 (1996) stellt eine Einführung in die Durchflusscytometrie dar, wie sie in der vorliegenden Erfindung anwendbar ist.
Soweit jedoch Erythroblasten im peripheren Blut aufgetreten sind, weisen die Ergebnisse, die von durchflusscytometrischen Vorrichtungen ausgegeben werden und diagrammatisch analysiert werden, durch abnormale „flags" (die auf untypische Verteilungen der durchflusscytometrischen Daten hinweisen) nur auf die Möglichkeit des Vorhandenseins von Erythroblasten hin, und ermöglichen nicht das genaue Sortieren/Zählen von Erythroblasten. Solche flags erweisen sich oft als falsch positive Ergebnisse.
Des Weiteren offenbaren, abgesehen von dem Voranstehenden, die japanische offengelegte Patentschrift Nr. 4-268453 (1992) und U.S. Pat.-Nr. 5,559,037 Erythroblasten-Sortier-/Zählverfahren.
Jedes davon ist ein Verfahren, in welchem Erythroblasten analysiert werden durch Behandlung von Proben mit einem geeigneten hämolytischen Agens, das nur die Zellmembranen von Erythrocyten stört (Zellmembranen durchlässig gegenüber einen Farbstoff macht) und mit einem Lösungsmittel, das die Zellmembranen von Leucocyten nicht verletzt (welches keine Durchlässigkeit der Zellmembranen gegenüber einem Farbstoff bewirkt), und danach (oder zur selben Zeit) Färben von nur den Erythroblasten, deren Zellmembranen beschädigt worden waren, mit einem Fluoreszenzfarbstoff, wonach die Erythroblasten von Leucocyten unterschieden werden durch Messen der Fluoreszenzintensität.
Wenn frisches Blut unmittelbar nach der Probenentnahme verwendet wird, sind mit diesen Verfahren genaue Messungen möglich. Mit dem Verstreichen der Zeit nach der Probenentnahme werden jedoch nicht nur Erythroblasten, sondern auch Leucocytenmembranen leicht beschädigt, und es ist wahrscheinlich, dass ein Teil der Leucocyten durch den Fluoreszenzfarbstoff gefärbt werden wird, da ihre Zellmembranen vor der Zumischung des hämolytischen Agens beschädigt worden sind. Es besteht insbesondere das Problem, wenn Lymphocytenzellen beschädigt sind, dass es schwierig ist, beschädigte Lymphocyten genau von Erythroblasten zu unterscheiden, so dass Erythroblasten nicht genau sortiert und gezählt werden können.
In manchen Proben, in welchen Lymphoblasten auftreten, welche in Bezug auf ihre Größe ähnlich sind zu Erythroblasten, oder in Proben von Chemotherapiepatienten, in welchen Zellmembranen von Leucocyten anfällig sind, durch das hämolytische Agens zerstört zu werden, ist ein genaues Zählen/Sortieren von Erythroblasten schwierig, selbst unmittelbar, nachdem Blut entnommen wurde.
EP 882983 A , veröffentlicht am 9. Dezember 1998, beschreibt ein Reagens zur Klassifizierung und zum Zählen von Leucocyten, enthaltend zumindest einen Farbstoff. Der Farbstoff kann ein Mitglied einer Klasse sein mit einer Strukturformel, welche den Farbstoff NK-321 umfasst, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Das Dokument offenbart NK-321 nicht. Das Agens umfasst auch ein hämolytisches Agens zum Lysieren von Erythrocyten.
EP 0499693 offenbart ein Verfahren und Reagenz zum Differenzieren und Zählen von Erythroblasten von anderen Zellen auf Basis einer Zwei-Schritt-Färbung unter Verwendung von drei verschiedenen Farbstoffen. Erythroblasten werden mit Propidiumiodid oder Etidiumbromid gefärbt. Leucocyten werden mit einem Farbstoff gefärbt, der aus einer Liste ausgewählt ist, umfassend Carbocyanine und Benzoxazoliodide.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reagenz zur Verfügung zu stellen, das geeignet ist, Erythroblasten in peripherem Blut oder kreislaufbezogenen Proben genau mit einer hohen Präzision zu unterscheiden und zu zählen, selbst in Proben, in denen nach der Probenentnahme Zeit verstrichen ist, oder in denen Leucocyten vorhanden sind, die leicht beschädigt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Reagens und ein Verfahren zur Unterscheidung und zum Zählen von Erythroblasten zur Verfügung, wie in Ansprüchen 1, 6 und 11 dargestellt. Wenn das Reagens, welches den ausgewählten Fluoreszenzfarbstoff enthält, mit der Probe gemischt wird, tritt ein detektierbarer Unterschied in der Fluoreszenzintensität zumindest zwischen Leucocyten und Erythroblasten bei der Bestrahlung mit einem Laser in der durchflusscytometrischen Analyse auf.
Das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Reagens enthält vorzugsweise des Weiteren ein zu dem hämolytischen Agens hinzugefügtes Tensid, ausgewählt, um die durchflusscytometrische Unterscheidung von Erythroblasten in der Körperflüssigkeitsprobe anhand ihres Reifestadiums zu ermöglichen.
Das Reagens ist nützlich in einem Verfahren der durchflusscytometrischen Untersuchung von Körperflüssigkeitsproben, um Erythroblasten in der Probe zu unterscheiden und zu zählen.
Das Verfahren umfasst die vorbereiteten Schritte von: (a) Mischen der Körperflüssigkeitsprobe mit einem hämolytischen Agens ausgewählt zum Auflösen von Erythrocyten in der Körperflüssigkeitsprobe in einem Ausmaß, dass sie mit der durchflusscytometrischen Untersuchung nicht interferieren, und zum Konditionieren von Leucocyten und Erythroblasten in der Assay-Probe, um für die Färbung geeignet zu sein, und (b) Färben von Leucocyten und Erythroblasten in der Probe, die in besagtem Schritt (a) zubereitet wurde, durch Mischen der Probe mit zumindest einem der ausgewählten Fluoreszenzfarbstoffe, um Leucocyten und Erythroblasten differenziell zu färben; und das Verfahren umfasst des Weiteren die Schritte: (c) durchlusscytometrische Analyse der in besagtem Schritt (b) vorbereiteten Probe durch Messen von zumindest einem Streulichtparameter und zumindest einem Fluoreszenzparameter, und (d) Unterscheiden und Zählen von Erythroblasten unter Verwendung von Intensitätsunterschieden in gestreutem Licht und Fluoreszenz, wie in Schritt (c) gemessen.
Das vorhergehende und andere Ziele, Merkmale und Aspekte sowie Vorteile der vorliegenden Erfindung werden noch deutlicher werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den beigefügten Abbildungen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Beispiel eines Scattergramms aus roter Fluoreszenz-Intensität/Intensität von vorwärts gestreutem Licht mit geringem Winkel, für eine Blutprobe, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung analysiert wurde;
2-6 sind Scattergramme aus roter Fluoreszenz-Intensität/Intensität von vorwärts gestreutem Licht mit geringem Winkel, jeweils für eine Blutprobe aus einem Patienten, in dem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren, und jeweils analysiert mit den entsprechenden Reagenzien von Beispielen 1-5;
7 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gemessen wurden, korreliert mit Ergebnissen erhalten durch manuelle mikroskopische Untersuchung.
8 ist ebenfalls ein Scattergramm aus roter Fluoreszenz-Intensität/Intensität von vorwärts gestreutem Licht mit geringem Winkel, einer Blutprobe aus einem Patienten, in welchem in der peripheren Zirkulation Erythroblasten aufgetreten waren, analysiert mit dem Reagens aus Beispiel 6, welches die Unterscheidung von Erythroblasten in drei Reifestadien-Populationen demonstriert; und
9 ist eine Abbildung, die zu 8 korrespondiert und die Blutzellpopulationen, die in der Probe mit dem Beispiel 6-Reagens diskriminiert worden waren, diagrammatisch darstellt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Assay-Proben der vorliegenden Erfindung sind Körperflüssigkeiten enthaltend Leucocyten und Erythroblasten, und umfassen als solche Proben aus der peripheren Blutzirkulation, Knochenmarksflüssigkeit, Urin und durch Aphärese erhaltene Proben.
Ein Verfahren zur Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet ein hämolytisches Agens ausgewählt zum Auflösen von Erythrocyten in Körperflüssigkeitsproben in einem solchen Maß, dass das hämolytische Agens nicht mit dem durchflusscytometrischen Assay interferiert, und zum Konditionieren von Leucocyten und Erythroblasten in der Körperflüssigkeitsprobe, um geeignet zu sein für die Färbung.
Ein geeignetes hämolytisches Agens ist eine wässrige Lösung mit einem pH von 2,0 bis 5,0, einem osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder weniger und enthaltend zumindest eine organische Säure, die zumindest einen intramolekularen aromatischen Ring enthält, oder deren Salz. Ein anderes geeignetes hämolytisches Agens ist eine wässrige Lösung mit einem pH von 2,0 bis 4,5 und einem osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder weniger. Solch ein hämolytisches Agens gemäß der Erfindung kann des Weiteren ein Tensid in einer Konzentration im Bereich von 10 bis 10.000 mg/l enthalten.
Die wesentlichen Ziele sind, Erythrocyten aufzulösen, welche üblicherweise in einer Konzentration vorhanden sind, die 1.000-fach höher ist als jene von Leucocyten und mit dem Analysieren von Erythroblasten interferieren, und in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltene Leucocyten und Erythrocyten differenziell zu färben, wobei der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist, um einen Unterschied hervorzurufen, der detektierbar ist durch Durchflusscytometrie in Bezug auf Fluoreszenz-Intensität zwischen den Leucocyten und Erythroblasten.
Obwohl es geringe individuelle Unterschiede gibt, wird üblicherweise das Aufbrechen der Zellmembranen von Erythrocyten in einer Lösung mit einem osmotischen Druck von 150 mOsm/kg oder weniger erfolgen, und das intrazelluläre Hämoglobin wird austreten (d.h. es erfolgt Hämolyse), so dass die Zellen optisch transparente „Geister" werden. Optisch transparente Erythrocyten behindern dementsprechend nicht die Analyse von Leucocyten und Erythroblasten. Die Hämolyse schreitet umso schneller fort, desto geringer der osmotische Druck und pH-Wert der Lösung und umso größer die Menge an Tensid ist. Unter Berücksichtigung von individuellen Unterschieden in den Erythrocyten wird in der vorliegenden Erfindung das hämolytische Agens bei einem osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder weniger eingesetzt. Um diesen osmotischen Druck zu erreichen, kann das hämolytische Agens durch ein Elektrolyt wie NaCl oder KCl, einen Zucker oder einen Puffer, wie nachfolgend beschrieben eingestellt werden.
Wenn der pH-Wert zu gering ist, werden nicht nur Erythrocyten, sondern auch Leucocyten und Erythroblasten Gegenstand einer umfangreichen Beeinträchtigung, und es wird daher schwierig, den unten beschriebenen analysierbaren Unterschied in Fluoreszenzintensität zu erhalten.
Damit die Erythrocyten-Hämolyse effizient ausgeführt werden kann, ist es bevorzugt, dass der pH im sauren Bereich liegt, nämlich ein pH von 2,0-5,0, und vorzugsweise ein pH von 2,5-4,5 ausgewählt wird.
Genauso beeinträchtigt eine allzu hohe Konzentration des Tensids im hämolytischen Agens den durchflusscytometrischen Assay auf Basis des nachstehend beschriebenen Unterschieds an Fluoreszenz-Intensität nicht nur für Erythrocyten, sondern auch für Leucocyten und Erythroblasten.
Um das Zählen und Unterscheiden von Erythroblasten anhand des Reifestadiums zu ermöglichen, ist es geeignet, eine Konzentration des Tensids 10-10.000 mg/l einzustellen. Es ist noch geeigneter, eine Konzentration von etwa 100-5.000 mg/l auszuwählen. Dies ermöglicht dementsprechend das Sortieren der Reifestadien, die in der Erythroblastenpopulation vorhanden sind in zumindest zwei Gruppen.
Es ist bevorzugt, einen Puffer zu verwenden, um die Lösung bei einem gleich bleibenden pH zu halten, und ein Puffer mit einem pK_S, der den pH in der Nähe von ± 2,0 einstellt, kann verwendet werden. Z. B. kann der Puffer ausgewählt werden aus Zitronensäure, Äpfelsäure, Diglycolsäure und Malonsäure.
Des Weiteren löst ein hämolytisches Agens, das intramolekular zumindest eine organische Säure mit zumindest einem aromatischen Ring oder deren Salz enthält, Erythrocyten noch effizienter (d. h. in einer kürzeren Zeitdauer) auf. Beispiele von bevorzugten organischen Säuren oder deren Salzen umfassen Salicylsäure, Natriumsalicylat und Phthalsäure.
Unter diesen Bedingungen wird das Zerstören der Zellmembranen und die Hämolyse von Erythroblasten genauso auftreten, wie die von Erythrocyten, jedoch werden Eigenschaften der Erythroblasten Nuklei beibehalten, die nahezu gleich sind zu jenen von lebenden Zellen.
Auf der anderen Seite ist die Schädigung von Leucocyten-Zellmembranen nicht abschließend, und es konnte optisch bei der mikroskopischen Untersuchung kein bemerkbarer Unterschied zu lebenden Zellen erkannt werden.
Ein bevorzugtes hämolytisches Agens für die vorliegende Erfindung löst Erythrocyten bei hypotonem osmotischem Druck auf und enthält einen Auflösungs-resistenten Farbstoff-Löslichkeits-Vermittler, und ein Tensid, um das Aglutinieren der Erythrocyten-„Geister” zu verhindern, das Aglutinieren von Blutplättchen zu verhindern und das Zusammenziehen der „Geister" und die erythrocytische Hämolyse zu fördern.
Wie oben festgestellt, ist das Vorhandensein einer großen Menge Tensid in dem hämolytischen Agens ein Problem, insbesondere, da ein Tensidüberschuss die nukleären Eigenschaften der Erythroblasten verändert und den Unterschied der Fluoreszenz-Intensität zwischen Erythroblasten und Leucocyten, der nachstehend definiert wird, verringert.
Dementsprechend wird für das in der vorliegenden Erfindung verwendete hämolytische Agens das Tensid so eingestellt, dass es den Unterschied in der Fluoreszenz-Intensität zwischen Erythroblasten und Leucocyten nicht verringert und im Unterschied zu konventionellen hämolytischen Agenzien enthält das Tensid keine Bestandteile, die Zellkomponenten auflösen.
Die voranstehenden Bedingungen für die durchflusscytometrischen Analysereagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung führten unerwarteter Weise zu einem klaren Unterschied in Fluoreszenz-Intensität zwischen Erythroblasten und Leucocyten, der herkömmlicherweise für unmöglich gehalten wurde, und ermöglichte des Weiteren die Unterscheidung und das Zählen von Erythroblasten anhand ihres Reifestadiums.
Zur Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten in Körperflüssigkeitsproben durch Durchflusscytometrie gemäß der vorliegenden Erfindung wird zumindest ein Fluoreszenzfarbstoff aus den folgenden verwendet:
Unter den obigen Farbstoffen ist die NK-Serie von Nippon Kandoh Shikiso Kenkyosho Co., Ltd. Die anderen sind Produkte, die kommerziell erhältlich sind.
Der ausgewählte Fluoreszenzfarbstoff kann in dem hämolytischen Agens aufgelöst sein, und kann gleichzeitig mit dem hämolytischen Agens auf die Körperflüssigkeitsprobe einwirken gelassen werden (und kann mit dem hämolytischen Agens gemischt sein), oder er kann zu der Probe nach dem Auflösungsvorgang (dem entsprechenden Schritt) hinzugefügt werden in einem geeigneten Lösungsmittel (Wasser, niedriger Alkohol, Ethylenglycol, DMSO, etc.).
Obwohl die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs unterschiedlich ist in Abhängigkeit von dem verwendeten Farbstoff, liegt sie im Allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 100 mg/l, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg/l und noch bevorzugter 0,3 bis 3,0 mg/l. Diese Konzentrationen beziehen sich auf den Zustand, in welchem die Färbelösung mit dem hämolytischen Agens gemischt ist.
Wenn die Blutzellen in der Probe, die mit dem voranstehenden hämolytischen Agens behandelt worden waren, gefärbt wurden mit dem oben stehenden Farbstoff, wurden Leucocyten stark gefärbt und strahlten bei der Messung mit einem Durchflusscytometer eine intensive Fluoreszenz aus. Auf der anderen Seite wurden Erythroblasten schwach gefärbt und strahlten eine schwache Fluoreszenz aus. Der Mechanismus, der den Unterschied an Fluoreszenz-Intensität zwischen Leucocyten und Erythroblasten hervorruft, ist nicht klar, es wird jedoch angenommen, dass die Aufnahme des Farbstoffs in den Erythroblasten-Nucleus gehemmt ist, da der Nucleus (DNA) kondensiert ist.
Als Tenside, die die Unterscheidung und das Zählen von Erythroblasten in jedes der Erythroblasten-Reifestadien ermöglichen, wird zumindest eines der Tenside aus der nachstehenden Gruppe verwendet. [Chem. 22]
worin R₁, R₂ und R₃ entweder gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoffatome, C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen sind; R₄ eine C_8-18-Alkylgruppe, C_8-18-Alkenylgruppe oder eine C_6-18-Aralkylgruppe ist, und X- ein Anion ist; [Chem. 23]
worin R₁ eine C_8-18-Alkylgruppe ist und X- ein Anion ist; [Chem. 24]
worin R₁ und R₂ entweder gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoffatome, C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen sind, R₃ eine C_8-18-Alkylgruppe, C_8-18-Alkenylgruppe oder eine C_6-18-Aralkylgruppe ist, und n 1 oder 2 ist;
[Chem. 25]

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)-H worin R₁ eine C_9-25-Alkylgruppe, Alkenylgruppe oder Alkynylgruppe ist, R₂ -O-,
oder -COO- ist, und n 10 bis 40 ist;

[Chem. 26]
[Chem. 27]
[Chem. 28]
[Chem. 29]
[Chem. 30]
[Chem. 31]
[Chem. 32]
[Chem. 33]
[Chem. 34]
Im Allgemeinen können in den voranstehenden Formeln Octyl, Heptyl, Hexyl und Benzyl angegeben werden als Beispiele von C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen. Eine C_1-3-Alkylgruppe wie Methyl oder Ethyl ist bevorzugt.
Octyl und Benzyl können als Beispiele angegeben werden von C_8-18-Alkylgruppen und C_8-18-Alkenylgruppen. C_10-18 geradkettige Alkylgruppen wie Decyl, Dodecyl und Tetradecyl sind bevorzugt.
Decyl, Dodecyl und Tetradecyl können als Beispiele von geradkettigen C_8-18-Alkylgruppen angegeben werden. Nonyl, Dodecyl, Hexadecyl und Oreyl können als Beispiele von C_9-25-Alkylgruppen, Alkenylgruppen oder Alkynylgruppen angegeben werden.
Unter den oben angegebenen Tensiden können jene, die als „MEGA-8 bis „CHAPSO" aufgezählt werden, gekauft werden von Dojindo Laboratories.
Die Tensidkonzentration ist 10-10.000 mg/l, vorzugsweise 100-5.000 mg/l, und noch bevorzugter 1.000-3.000 mg/l. Diese Konzentrationen sind die des Tensids, wie es im hämolytischen Agens enthalten ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Reagens mit einer einfachen Zusammensetzung verwendet werden, erhalten durch Auflösen einer organischen Säure, wie Salicylsäure, einem Farbstoff und einem Tensid in gereinigtem Wasser, und Einstellen des pH unter Verwendung von NaOH, HCl oder dergleichen. Die Proben werden mit dem Reagens gemischt und bei 15-50°C, vorzugsweise 20-40°C, reagieren gelassen für eine Zeitdauer von 3-120 Sekunden, vorzugsweise 5-40 Sekunden.
Die dementsprechend vorbereitete Assay-Probe wird mit dem Durchflusscytometer analysiert, unter Messung von zumindest einem Streulichtparameter und zumindest einem Fluoreszenzparameter.
Ein Streulichtparameter gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet gestreutes Licht, welches gemessen werden kann durch ein übliches kommerzielles Durchflusscytometer, und kann vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel (z. B. worin der Winkel des aufgefangenen Lichts in der Nähe von 0-5°C ist), und vorwärts gestreutes Licht mit einem hohen Winkel (z. B. worin der Winkel des aufgefangenen Lichts in der Nähe von 5-20°C ist) oder orthogonales/seitwärts gestreutes Licht sein.
Vorzugsweise wird ein Streuungswinkel gewählt, der die Leukocyten-Größeninformation wiedergibt. Dabei ist vorwärts gestreutes Licht mit geringem Winkel bevorzugt.
Fluoreszenz als Parameter in der vorliegenden Erfindung ist Licht, das von dem Farbstoff, der an die oben beschriebenen Zellkomponenten gebunden ist, ausgestrahlt wird, und eine geeignete Wellenlänge des empfangenen Lichts wird ausgewählt in Abhängigkeit von dem verwendeten Farbstoff. Das Fluoreszenzsignal reflektiert die cytochemischen Eigenschaften der Zellen.
Die Lichtquelle des Durchflusscytometers ist nicht besonders limitiert; eine Lichtquelle mit einer geeigneten Wellenlänge, um den Farbstoff anzuregen, wird ausgewählt. Z. B. kann ein Argon-Innenlaser, ein He-Ne-Laser oder ein roter Halbleiter-Laser verwendet werden. Der Halbleiter-Laser ist besonders bevorzugt, da er relativ wenig teuer ist im Vergleich mit Gas-Lasern, wodurch es möglich ist, die Kosten der Vorrichtung erheblich zu verringern.
Unter Verwendung des gemessenen gestreuten Lichts und dem Unterschied an Fluoreszenz-Intensität werden Erythroblasten aus der Assay-Probe unterschieden und gezählt; des Weiteren werden Erythroblasten anhand des Reifestadiums unterschieden und gezählt. In der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verwendung von gemessenem gestreuten Licht und einem Unterschied an Fluoreszenzintensität, um Erythroblasten aus der Assay-Probe zu unterscheiden und die unterschiedenen Erythroblasten zu zählen, ein Verfahren: (1) worin das Scattergramm z. B. gezeichnet wird, indem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für Fluoreszenz, wie z. B. in 1 gezeigt, Verteilen der Zellen durch Bildung von Erythroblasten (NRBC), Leukocyten (WBC) und Hämoglobinentleerte Erythrocyten (Ghost) Populationen (d. h. Cluster); dann (2) unter Verwendung von geeigneter Analysier-Software Setzen dieser Populationen in Populationsregionen und durch Analysieren der Anzahl von Zellen, die in diesen Regionen enthalten sind, Berechnen der Anzahl und des Anteils von Erythroblasten. Des Weiteren ist in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Unterscheidung und zum Zählen von Erythroblasten anhand ihres Reifestadiums ein Verfahren: (1) worin das Scattergramm Z. B. gezeichnet wird unter Verwendung von Fluoreszenz als X-Achse und vorwärts gestreutes Licht mit geringem Winkel als Y-Achse, wie z. B. in 8 gezeigt, Verteilen der Zellen durch Bilden von Populationen (d. h. Clustern) gemäß dem Reifestadium; dann (2) unter Verwendung einer geeigneten Analysier-Software das Setzen dieser Populationen in Populationsregionen und durch Analysieren der Anzahl von Zellen, die in diesen Regionen enthalten sind, Berechnen der Anzahl und des Anteils von Erythroblasten in den Reifestadien.
Die folgenden Beispiele werden das Voranstehende erklären und weitere Ziele, Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung in weiterem Detail erklären.
Beispiel 1

Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde vorbereitet.

Inhaltsstoff	Menge	Quelle
Salicylsäure	10 mM	kommerzielles Produkt
NK-2825	0,3 mg/l	Nippon Kandoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.
BC-20TX [Polyoxyethylen(20) cetylether]	3 g/l	Nikko Chemicals, Inc.
gereinigtes Wasser	1 l

Der pH wurde mit NaOH auf 3,0 eingestellt (osmotischer Druck: 30 mOsm/kg).
1,0 ml des Reagens von Beispiel 1 wurden zu 30 μl eines mit Anti-Coagulans behandelten Bluts eines Patienten hinzugefügt, in welchem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren und die Zubereitung wurde bei 35°C für 10 Sekunden reagieren gelassen. Anschließend wurden Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel in einem Durchflusscytometer gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein 633 nm roter Halbleiter-Laser. Die gemessene Fluoreszenz war Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder höher.
2 zeigt ein Scattergramm, in welchem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für rote Fluoreszenz-Intensität. Die Blutzellen bilden drei Populationen: mononucleäre Leucocyten (Lymphocyten, Monocyten), Granulocyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile) und Erythroblasten.
Beispiel 2

Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Inhaltsstoff	Menge	Quelle
Salicylsäure	10 mM	kommerzielles Produkt
NK-321	0,3 mg/l	Nippon Kandoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.
BC-16 [Polyoxyethylen (16) oleylether]	3 g/l	Nikko Chemicals, Inc.
gereinigtes Wasser	1 l

Der pH wurde mit NaOH auf 3,0 eingestellt (osmotischer Druck: 32 mOsm/kg).
1,0 ml des Reagens von Beispiel 2 wurden zu 30 μl eines mit Anti-Coagulans behandelten Bluts eines Patienten hinzugefügt, in welchem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren und die Zubereitung wurde bei 35°C für 10 Sekunden reagieren gelassen. Anschließend wurden Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel in einem Durchflusscytometer gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein 633 nm roter Halbleiter-Laser. Die gemessene Fluoreszenz war Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder höher.
3 zeigt ein Scattergramm, in welchem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für rote Fluoreszenz-Intensität. Die Blutzellen bilden drei Populationen: mononucleäre Leucocyten (Lymphocyten, Monocyten), Granulocyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile) und Erythroblasten.
Beispiel 3
Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Inhaltsstoff Menge Quelle

Salicylsäure 10 mM kommerzielles Produkt

NK-1836 3 mg/l Nippon Kandoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.

gereinigtes Wasser 1 l
Der pH wurde mit NaOH auf 3,0 eingestellt (osmotischer Druck: 25 mOsm/kg)
1,0 ml des Reagens von Beispiel 3 wurden zu 30 μl eines mit Anti-Coagulans behandelten Bluts eines Patienten hinzugefügt, in welchem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren und die Zubereitung wurde bei 35°C für 10 Sekunden reagieren gelassen. Anschließend wurden Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel in einem Durchflusscytometer gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein 633 nm roter Halbleiter-Laser. Die gemessene Fluoreszenz war Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder höher.
4 zeigt ein Scattergramm, in welchem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für rote Fluoreszenz-Intensität. Die Blutzellen bilden drei Populationen: mononucleäre Leucocyten (Lymphocyten, Monocyten), Granulocyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile) und Erythroblasten.
Beispiel 4
Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Inhaltsstoff Menge Quelle

Salicylsäure 10 mM kommerzielles Produkt

DiIC1 (5) 3 mg/l Nippon Kandoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.

gereinigtes Wasser 1 l
Der pH wurde mit NaOH auf 3,0 eingestellt (osmotischer Druck: 25 mOsm/kg)
1,0 ml des Reagens von Beispiel 4 wurden zu 30 μl eines mit Anti-Coagulans behandelten Bluts eines Patienten hinzugefügt, in welchem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren und die Zubereitung wurde bei 35°C für 10 Sekunden reagieren gelassen. Anschließend wurden Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel in einem Durchflusscytometer gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein 633 nm roter Halbleiter-Laser. Die gemessene Fluoreszenz war Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder höher.
5 zeigt ein Scattergramm, in welchem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für rote Fluoreszenz-Intensität. Die Blutzellen bilden drei Populationen: mononucleäre Leucocyten (Lymphocyten, Monocyten), Granulocyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile) und Erythroblasten.
Beispiel 5

Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Inhaltsstoff	Menge	Quelle
Salicylsäure	10 mM	kommerzielles Produkt
Zitronensäure	10 mM	kommerzielles Produkt
NK-1836	0,3 mg/l	Nippon Kandoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.
gereinigtes Wasser	1 l

Der pH wurde mit NaOH auf 3,0 eingestellt (osmotischer Druck: 40 mOsm/kg)
1,0 ml des Reagens von Beispiel 5 wurden zu 30 μl eines mit Anti-Coagulans behandelten Bluts eines Patienten hinzugefügt, in welchem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren und die Zubereitung wurde bei 35°C für 10 Sekunden reagieren gelassen. Anschließend wurden Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel in einem Durchflusscytometer gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein 633 nm roter Halbleiter-Laser. Die gemessene Fluoreszenz war Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder höher.
6 zeigt ein Scattergramm, in welchem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für rote Fluoreszenz-Intensität. Die Blutzellen bilden drei Populationen: mononucleäre Leucocyten (Lymphocyten, Monocyten), Granulocyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile) und Erythroblasten.
Durch das Analysieren der cytometrischen Plots, die in den voranstehenden Ausführungsformen hergestellt wurden und in den korrespondierenden Abbildungen illustriert wurden, wurde ein Fenster etabliert für jede Population und Zellzahlen und Zellverhältnisse wurden innerhalb dieser Fenster berechnet.
7 ist ein Korrelationsdiagramm, das die Ergebnisse zeigt, wobei ein manuelles Verfahren (May-Grünwald-Giemsa-Färbung, 500-Zählung) und ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.
Beispiel 6

Ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Inhaltsstoff	Menge	Quelle
Salicylsäure	10 mM	kommerzielles Produkt
NK-2825	0,3 mg/l	Nippon Kandoh Shikiso Kenkyusho Co., Ltd.
LTAC [Dodecyltrimethyl ammoniumchlorid	0,3 g/l	Nikko Chemicals, Inc.
gereinigtes Wasser	1 l

Der pH wurde mit NaOH auf 3,0 eingestellt (osmotischer Druck: 40 mOsm/kg)
1,0 ml des Reagens von Beispiel 6 wurden zu 30 μl eines mit Anti-Coagulans behandelten Bluts eines Patienten hinzugefügt, in welchem Erythroblasten in der peripheren Zirkulation aufgetreten waren und die Zubereitung wurde bei 40°C für 5 Sekunden reagieren gelassen. Anschließend wurden Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel in einem Durchflusscytometer gemessen. Die verwendete Lichtquelle war ein 633 nm roter Halbleiter-Laser. Die gemessene Fluoreszenz war Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 660 nm oder höher.
8 zeigt ein Scattergramm, in welchem die X-Achse für vorwärts gestreutes Licht mit einem geringen Winkel verwendet wird und die Y-Achse für rote Fluoreszenz-Intensität. Die Blutzellen bilden vier Populationen: Leukocyten, Phase I-Erythroblasten, Phase II-Erythroblasten und Phase III-Erythroblasten (9 zeigt die entsprechende Verteilung. NRBC: rote Blutzellen mit Nucleus, WBC: weiße Blutzellen, und „Ghosts").
Nach der Durchführung einer May-Grünwald-Giemsa-Färbung in der Blutprobe von Beispiel 6 wurde eine visuelle Untersuchung mit einem Mikroskop durchgeführt. Die Erythroblasten wurden unterschieden in Proerythroblasten, basophile Erythroblasten, polychromatophile Erythroblasten und orthochromatophile Erythroblasten, und verglichen mit den oben angegebenen Ergebnissen, erhalten mit dem Durchflusscytometer.

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse des Durchflusscytometers und der visuellen Untersuchung.

Vorliegende Erfindung		Optische Untersuchung
Phase I	0,7 %	Proerythroblasten + basophile Erythroblasten	0 %
Phase II	17,6 %	polychromatophile Erythroblasten	18 %
Phase III	81,7 %	orthochromatophile Erythroblasten	82,0 %

Aus der obigen Tabelle ergibt sich, dass die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung und der optischen Untersuchung gut übereinstimmen.
Beim Analysieren der cytometrischen Plots hergestellt im Beispiel 6 und in den 8 und 9 dargestellt, wurde ein Fenster etabliert für jede Population, und Zellzählungen und die Zellverhältnisse wurden innerhalb der Fenster berechnet.

Claims

Reagens zur Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten in einer Körperflüssigkeitsprobe, das ein zum Lösen von Erythrozyten ausgewähltes Hämolysemittel und einen fluoreszierenden Farbstoff zur Färbung von sowohl Leukozyten als auch Erythroblasten umfasst, wobei der Farbstoff ausgewählt ist aus:
DilC1 (5); und NK-321, worin das Hämolysemittel eine wässrige Lösung mit einem pH von 2,0-5,0 und einem osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder weniger ist und zumindest eine organische Säure mit zumindest einem aromatischen Ring innerhalb eines Moleküls oder ihr Salz umfasst.
Reagens nach Anspruch 1, worin das Hämolysemittel eine wässrige Lösung mit einem pH von 2,5-4,5 ist.
Reagens nach Anspruch 1 oder 2, worin die organische Säure aus Salicylsäure, Natriumsalicylat und Phthalsäure ausgewählt ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Hämolysemittel eine wässrige Lösung ist, die ein Tensid in einer Konzentration von 10 bis 10.000 mg/l enthält.
Reagens nach Anspruch 4, worin das Tensid aus Folgendem ausgewählt ist:
worin R₁, R₂ und R₃ entweder gleich oder unterschiedlich Wasserstoffatome, C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen sind, R₄ eine C_8-18-Alkylgruppe, C_8-18-Alkenylgruppe oder eine C_6-18-Aralkylgruppe ist und X^- ein Anion ist;
worin R₁ eine C_8-18-Alkylgruppe ist und X^- ein Anion ist;
worin R₁, R₂ entweder gleich oder unterschiedlich Wasserstoffatome, C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen sind, R₃ eine C_8-18-Alkylgruppe, C_8-18-Alkenylgruppe oder eine C_6-18-Aralkylgruppe ist und n = 1 oder 2 ist; R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H worin R₁ eine C_9-25-Alkylgruppe, -Alkenylgruppe oder -Alkinylgruppe ist, R₂ -O-,
oder -COO- ist und n = 10 bis 40 ist;

worin das Tensid eine durchflusszytometrische Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten in den Körperflüssigkeitsproben basierend auf ihrem Reifestadium ermöglicht.
Reagens zur Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten in einer Körperflüssigkeitsprobe, das ein zum Lösen von Erythrozyten ausgewähltes Hämolysemittel und einen fluoreszierenden Farbstoff zur Färbung von sowohl Leukozyten als auch Erythroblasten enthält, wobei der Farbstoff ausgewählt ist aus:

DilC1 (5); und NK-321, worin das Hämolysemittel eine wässrige Lösung mit einem pH von 2,0-4,5 und einem osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder weniger ist.
Reagens nach Anspruch 6, worin das Hämolysemittel zumindest eine organische Säure mit zumindest einem aromatischen Ring innerhalb eines Moleküls oder ihr Salz umfasst.
Reagens nach Anspruch 7, worin die organische Säure aus Salicylsäure, Natriumsalicylat und Phthalsäure ausgewählt ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin das Hämolysemittel eine wässrige Lösung ist, die ein Tensid in einer Konzentration von 10 bis 10.000 mg/l enthält.
Reagens nach Anspruch 5, worin das Tensid aus Folgendem ausgewählt ist:
worin R₁, R₂ und R₃ entweder gleich oder unterschiedlich Wasserstoffatome, C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen sind, R₄ eine C_8-18-Alkylgruppe, C_8-18-Alkenylgruppe oder eine C_6-18-Aralkylgruppe ist und X^- ein Anion ist;
worin R₁ eine C_8-18-Alkylgruppe ist und X^- ein Anion ist;
worin R₁, R₂ entweder gleich oder unterschiedlich Wasserstoffatome, C_1-8-Alkylgruppen oder C_6-8-Aralkylgruppen sind, R₃ eine C_8-18-Alkylgruppe, C_8-18-Alkenylgruppe oder eine C_6-18-Aralkylgruppe ist und n = 1 oder 2 ist; R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H worin R₁ eine C_9-25-Alkylgruppe, -Alkenylgruppe oder -Alkinylgruppe ist, R₂ -O-,
oder -COO- ist und n = 10 bis 40 ist;

worin das Tensid eine durchflusszytometrische Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten in den Körperflüssigkeitsproben basierend auf ihrem Reifestadium ermöglicht.
Verfahren zur Unterscheidung und Zählung von Erythroblasten in einer Körperflüssigkeitsprobe durch Durchflusszytometrie, folgende Schritte umfassend: Testen einer Körperflüssigkeitsprobe durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Reagens, das zur unterschiedlichen Färbung von Leukozyten und Erythroblasten in der Körperflüssigkeitsprobe ausgewählt ist, wobei das Reagens einem der Ansprüche 1 bis 10 entspricht.