ES2716865T3 - Diferenciación dirigida de células precursoras de oligodendrocitos a un destino celular mielinizante - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Diferenciación dirigida de células precursoras de oligodendrocitos a un destino celular mielinizante

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/444.666, presentada el viernes, 18 de febrero de 2011.

Antecedentes de la invención

La esclerosis múltiple (EM) afecta aproximadamente a 400.000 personas en Estados Unidos y a 2,5 millones en todo el mundo. La EM es una enfermedad inflamatoria en la que se dañan las vainas de mielina que rodean los axones del cerebro y la médula espinal. En la EM, así como en otras enfermedades desmielinizantes, el ataque inflamatorio autoinmunitario contra la mielina y los oligodendrocitos provoca la desmielinización. El estrechamiento o la pérdida de la mielina que rodea a los axones afecta a la capacidad de los mismos para conducir eficazmente las señales, y da lugar a un daño neuronal progresivo.

La remielinización es el proceso mediante el que se generan nuevas vainas de mielina alrededor de los axones. La remielinización persiste durante la edad adulta en el SNC e implica la generación de nuevos oligodendrocitos mielinizantes (C. Ffrench-Constant, M. C. Raff, Nature, 319, 499 (1986)). A pesar de la controversia sobre su potencial intrínseco de linaje in vitro e in vivo (M. C. Nunes et al., Nat Med, 9, 439 (2003); S. Belachew et al., J Cell Biol, 161, 169 (2003); T. Kondo, M. Raff, Science, 289, 1754 (2000); Jackson, 2006; Zhu, 2011; Richardson, 2011; R. J. Franklin, C. Ffrench-Constant, Nat Rev Neurosci, 9, 839 (2008)), hay pruebas convincentes que indican que una amplia población en proliferación de células positivas en antígeno nervioso/glial-2 (NG2), receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (subunidad alfa, PDGFRa), denominadas células NG2-gliales o precursoras de oligodendrocitos (OPC), es la principal fuente de nueva formación de oligodendrocitos maduros necesarios para la remielinización (P. J. Horner et al., J Neurosci, 20, 2218 (2000); M. C. Nunes et al., Nat Med, 9, 439 (2003); J. M. Gensert, J. E. Goldman, Neuron, 19, 197 (1997); M. S. Windrem et al., Nat Med, 10, 93 (2004); R. J. Franklin, C. Ffrench-Constant, Nat Rev Neurosci, 9, 839 (2008); Richarson, 2011).

Se puede producir remielinización tras la pérdida de mielina en enfermedades como la EM, restableciéndose así la función neurológica de los axones. Sin embargo, aunque se puede producir remielinización en las primeras etapas de la EM, los oligodendrocitos no pueden reconstruir completamente la vaina de mielina, y los ataques inflamatorios repetidos, en última instancia, conducen a remielinizaciones menos eficaces hasta que se acumulan placas alrededor de los axones dañados. Una causa principal del fracaso de la remielinización es la incapacidad progresiva de las células precursoras de oligodendrocitos somáticos para diferenciarse en los sitios de la lesión. Por lo tanto, la remisión en la EM depende en gran medida de que las OPC migren a sitios de lesión, y posteriormente, se diferencien a un destino celular maduro capaz de realizar la reparación (J. R. Patel, R. S. Klein, f EBs Lett, 585, 3730 (2011); D. Kremer et al., Ann Neurol, 69, 602 (2011); A. Chang et al., N Engl J Med, 346, 165 (2002)). Los estudios dirigidos a evaluar la presencia y las densidades relativas de las OPC en sitios de lesiones de EM desmielinizadas crónicamente indican que no se trata de un fallo en la repoblación o migración de las OPC, sino, más bien, en la inhibición de la diferenciación de las OPC en sitios de lesión, que contribuye a la progresión de la enfermedad (D. M. Chari, W. F. Blakemore, Glia, 37, 307 (2002); D. M. Chari et al., J Neurosci Res, 73, 787 (2003); G. Wolswijk, J Neurosci, 18, 601 (1998); A. Chang et al., N Engl J Med, 346, 165 (2002); T. Kuhlmann et al., “Brain”, 131, 1749 (2008)).

No se conoce ninguna cura para la EM. Para tratar los ataques inflamatorios agudos, normalmente, se administran corticosteroides intravenosos. Otros tratamientos para la EM implican la administración de un inmunomodulador. Aunque los inmunomoduladores pueden reducir la frecuencia y la gravedad de los ataques o la acumulación de lesiones, no potencian la remielinización de los axones dañados.

Breve sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un agente modulador de receptores de neurotransmisores para su uso en un método de estimulación del aumento de la mielinización de los nervios en un sujeto humano que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el método administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de dicho agente modulador de receptores de neurotransmisores, en el que dicho agente es un antagonista de receptor muscarínico.

La invención proporciona, por tanto, un agente modulador de receptores de neurotransmisores para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el método administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de un antagonista de receptor muscarínico.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un agente modulador de receptores de neurotransmisores para su uso en un método para potenciar el efecto terapéutico de un agente inmunomodulador en el tratamiento de una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el método administrar a un sujeto humano que tiene la enfermedad desmielinizante el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores, en el que dicho agente modulador de receptores de neurotransmisores es un antagonista de receptor muscarínico.

En algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico es un compuesto modulador de receptor muscarínico que figura en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico se selecciona entre benztropina, carbetapentano, clemastina, ipratropio, atropina, oxibutirina, propiverina, escopolamina y sales de los mismos.

En algunas realizaciones, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina).

En algunas realizaciones, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el virus linfotrópico de linfocitos T humano (HTLv ). En algunas realizaciones, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple. En algunas realizaciones, la enfermedad desmielinizante es esclerosis múltiple recurrente y remitente (EMRR). En algunas realizaciones, la enfermedad desmielinizante es esclerosis múltiple progresiva secundaria (EMPS). En algunas realizaciones, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple progresiva primaria (EMPP). En algunas realizaciones, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple con recaídas progresivas (EMP).

En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b.

En algunas realizaciones, el método comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz u óptima de uno o ambos de entre el agente de modulación de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al sujeto una dosis subterapéutica de uno o ambos de entre el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis óptima del agente modulador de receptores de neurotransmisores y una dosis subterapéutica del agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis óptima del agente inmunomodulador y una dosis subterapéutica del agente modulador de receptores de neurotransmisores.

En algunas realizaciones, el método comprende administrar sistémicamente uno o ambos de entre el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el método comprende administrar el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador de forma secuencial. En algunas realizaciones, el método comprende administrar el agente modulador de receptores de neurotransmisores simultáneamente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo la composición:

un antagonista de receptor muscarínico; y

un agente inmunomodulador.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un kit para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el kit:

un antagonista de receptor muscarínico; y

un agente inmunomodulador.

En algunas realizaciones, la composición o el kit comprende un antagonista de receptor muscarínico como el descrito en el presente documento y un agente inmunomodulador como el descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico se selecciona entre benztropina, carbetapentano, clemastina, ipratropio, atropina, oxibutirina, propiverina, escopolamina y sales de los mismos, el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab. En algunas realizaciones, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina, clemastina, salmeterol o una sal de los mismos, y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b.

En algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico se formula como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima, el agente inmunomodulador se formula como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima. En algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico se formula como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima,y el agente inmunomodulador se formula como una dosis subterapéutica. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se formula como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima, y el antagonista de receptor muscarínico se formula como una dosis subterapéutica. En algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico se formula como una dosis subterapéutica, y el agente inmunomodulador se formula como una dosis subterapéutica.

DEFINICIONES

Como se usa en el presente documento, la expresión “agente modulador de receptores de neurotransmisores” se refiere a un agente que inhibe o activa la actividad de un receptor de neurotransmisor. En algunos casos, el término se refiere a un compuesto que modula la actividad de un receptor muscarínico (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico), un receptor de la dopamina (por ejemplo, un antagonista del receptor de la dopamina), un receptor de la histamina (por ejemplo, un antagonista del receptor de la histamina), un receptor beta-adrenérgico (por ejemplo, un antagonista del receptor beta-adrenérgico) o un receptor de opioides (por ejemplo, un modulador del receptor de opioides). Para cualquier compuesto que se identifique como un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un compuesto descrito en la Tabla 1 del presente documento), también se contempla la posibilidad de usar cualquiera de las sales farmacéuticamente aceptables, profármacos, mezclas racémicas, isómeros conformacionales y/u ópticos, polimorfos cristalinos y variantes isotópicas del compuesto. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es una molécula pequeña, por ejemplo, una molécula que tiene un peso molecular inferior a 800 kDa. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es una molécula pequeña que puede atravesar la barrera hematoencefálica.

Como se usa en el presente documento, la expresión la “célula precursora de oligodendrocitos” o la “OPC” se refiere a una célula progenitora indiferenciada con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en un oligodendrocito mielinizante. Un “destino de células mielinizantes maduras” se refiere a una célula que es capaz de formar mielina, por ejemplo, un oligodendrocito mielinizante. “Diferenciación” se refiere al proceso mediante el que un tipo de célula especializada se forma a partir de un tipo de célula menos especializada, por ejemplo, un oligodendrocito mielinizante de una OPC. En algunos casos, una OPC se identifica por su morfología y/o por la presencia de un biomarcador, por ejemplo, PDGFR-a o NG2. En algunos casos, un oligodendrocito mielinizante se identifica por su morfología y/o por la presencia de un marcador, por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG), 2'3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP), galactocebrosida (GalC), antígeno O1 (O1) o antígeno O4 (O4).

Como se usa en el presente documento, las expresiones “estimulación del aumento de la mielinización” o “estimular el aumento de la mielinización” se refieren a la inducción de una mayor cantidad de mielina alrededor de un axón, por ejemplo , mediante la administración de un agente que induce la diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos en un destino de células mielinizantes maduras, en comparación con la cantidad de mielina que rodea el axón en ausencia del agente que se está administrando. En algunos casos, un agente estimula “el aumento” de la mielinización cuando la cantidad de mielina que rodea al axón en una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido cerebral de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante) posterior a la administración de un agente que induce la diferenciación de las OPC en un destino de células mielinizantes maduras es de al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con la cantidad de mielina que rodea el axón en la muestra antes de la administración del agente. La cantidad de mielina que rodea a un axón se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, usando la formación de imágenes mediante resonancia magnética (IRM). En algunos casos, un agente estimula el aumento de la mielinización cuando una o más características de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple) mejoran tras la administración de un agente que induce la diferenciación de OPC en un destino de células mielinizantes maduras en comparación con la característica de las enfermedades antes de la administración del agente. Como un ejemplo no limitante, se dice que un agente estimula el aumento de la mielinización en un sujeto con esclerosis múltiple cuando la frecuencia y/o la gravedad de los ataques inflamatorios disminuyen después de la administración de un agente en comparación con la frecuencia y/o la gravedad de los ataques inflamatorios antes de la administración del agente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “enfermedad desmielinizante” se refiere a una enfermedad o afección del sistema nervioso caracterizada por el daño o la pérdida de la vaina de mielina de las neuronas. Una enfermedad desmielinizante puede ser una enfermedad que afecte al sistema nervioso central o una enfermedad que afecte al sistema nervioso periférico. Los ejemplos de enfermedades desmielinizantes incluyen, pero sin limitación, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el HTLV. En algunos casos, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a animales tales como mamíferos, incluyendo, pero sin limitación, primates (por ejemplo, seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, el término “compuesto” se refiere a cualquier molécula, ya sea natural o sintética, por ejemplo, péptido, proteína, oligopéptido (por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud), molécula orgánica pequeña, polisacárido, péptido, péptido circular, peptidomimético, lípido, ácido graso, ARNip, polinucleótido, oligonucleótido, etc., para evaluar la capacidad de inducir la diferenciación de las OPC. El compuesto que se va a ensayar puede estar en forma de una colección de compuestos de ensayo, tal como una colección combinatoria o aleatoria que proporciona un intervalo de diversidad suficiente. Los compuestos de ensayo están unidos opcionalmente a una pareja de fusión, por ejemplo, los compuestos de dirección, compuestos de rescate, compuestos de dimerización, compuestos estabilizantes, compuestos direccionables y otras fracciones funcionales. Convencionalmente, los compuestos se detectan mediante la identificación de un compuesto de ensayo (denominado “acierto de detección”) con alguna propiedad o actividad deseable, por ejemplo, la actividad inductora, y los aciertos de detección se confirman y validan usando ensayos in vitro e in vivo. A menudo, los métodos de detección de alto rendimiento (HTS) se emplean para dicho análisis.

Un “agonista” se refiere a un agente que estimula, aumenta, activa o potencia la activación de un receptor de neurotransmisores (por ejemplo, receptor muscarínico, receptor de la dopamina, receptor de la histamina, receptor beta-adrenérgico y/o receptor de opioides).

Un “antagonista” se refiere a un agente que bloquea parcial o totalmente la estimulación, disminuye, previene, inactiva o retrasa la activación de un receptor de neurotransmisores (por ejemplo, receptor muscarínico, receptor de la dopamina, receptor de la histamina, receptor beta-adrenérgico y/o receptor de opioides).

Como se usa en el presente documento, las expresiones “cantidad o dosis terapéuticamente eficaz” o “cantidad o dosis terapéuticamente suficiente” o “cantidad o dosis suficiente o eficaz” se refieren a una dosis que produce los efectos terapéuticos para los que se administra cuando se administra por sí misma. La dosis exacta dependerá del fin del tratamiento, y será comprobada por un experto en la materia usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, “Pharmaceutical Dosage Forms” (vol. 1-3, 1992); Lloyd, “The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding” (1999); Pickar, “Dosage Calculations” (1999); y Remington: “The Science and Practice of Pharmacy”, 20a edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams y Wilkins).

Como se usa en el presente documento, los términos “administrar” o “administración” se refieren a cualquier tipo de administración, incluyendo, pero sin limitación, la administración oral, administración como un supositorio, contacto tópico, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutánea, Administración intratecal, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo, una minibomba osmótica, al sujeto.

Como se usa en el presente documento, los términos “tratar” o “tratando” o “tratamiento” se refieren a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o la mejora de una lesión, patología, afección o síntoma (por ejemplo, dolor), incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como moderación; remisión; disminución de los síntomas o hacer los síntomas, la lesión, la patología o la dolencia más tolerables por el paciente; reducción de la frecuencia o duración del síntoma o de la afección; o, en algunas situaciones, prevención de la aparición del síntoma o de la afección. El tratamiento o la mejora de los síntomas puede basarse en cualquier parámetro objetivo o subjetivo; incluyendo, por ejemplo, el resultado de un examen físico.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dosis subterapéutica” se refiere a una dosis de uno o varios agentes farmacológicamente activos, ya sea como una dosis administrada de agente farmacológicamente activo o el nivel real de agente farmacológicamente activo en un sujeto, que funcionalmente es insuficiente para producir el efecto farmacológico deseado en sí mismo, o que cuantitativamente es inferior a la dosis terapéutica establecida para ese agente farmacológico en particular (por ejemplo, como lo publicado en una referencia consultada por un experto, por ejemplo, dosis para un agente farmacológico publicadas en “the Physicians' Desk Reference”, 66a ed., 2012, PDR Network, LLC; o Brunton, et al., “Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 12a edición, 2011, McGraw-Hill Professional) cuando se administra por sí sola. Una “dosis subterapéutica” se puede definir en términos relativos (es decir, como una cantidad porcentual (inferior al 100 %) de la cantidad de agente farmacológicamente activo administrado convencionalmente). Por ejemplo, una cantidad de dosis subterapéutica puede ser del aproximadamente 1 % al aproximadamente 75 % de la cantidad de agente farmacológicamente activo administrado convencionalmente. En algunos casos, una dosis subterapéutica puede ser del aproximadamente 75 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 %, 10 % o menos, de la cantidad de agente farmacológicamente activo administrado convencionalmente.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Los agentes moduladores de receptores de neurotransmisores inducen de forma dependiente de la dosis la diferenciación de las OPC. (A) Estructuras químicas de moléculas diferenciadoras de las OPC identificadas representativas. Los valores de CE⁵⁰ calculados se determinaron usando el programa informático de ajuste de curvas Graphpad Prism 5.0 apropiado. (B) Diferenciación de las OPC inducida por compuestos dependientes de la dosis. Se sembraron OPC en placas de 384 pocillos a 1.000 células por pocillo en medios de o Pc que contenían PDGF-aa basal (2 ng/ml) y se trataron con diluciones en serie de compuestos. Tras seis días de tratamiento con los compuestos, las células se fijaron y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia usando un anticuerpo anti-proteína básica mielina (MBP). La adquisición de imágenes y la cuantificación de la tinción de MBP se realizó usando el sistema de formación de imágenes OPERA. (C) Actividad inductora de la diferenciación de las OPC máxima de los compuestos identificados en comparación con el control de DMSO.

Figura 2. Los agentes moduladores de los receptor de neurotransmisores inducen la diferenciación de las OPC en un destino celular de oligodendrocito mielinizante. (A) Análisis de transferencia Western de OPC tratadas con compuestos a concentraciones de CE⁹⁰ durante 6 días. Se aisló la proteína total de los sedimentos celulares y se probó para determinar la proteína básica de mielina (MBP) y la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) usando anticuerpos específicos. (B-C) Análisis cuantitativo de RT-PCr (qRT-PCR) de OPC tratadas con compuestos a concentraciones de CE⁹⁰ durante 6 días. Se aisló el ARN total de los sedimentos celulares y se transcribió de manera inversa. La expresión de MBP y MOG se cuantificó usando sondas específicas y qRT-PCR basada en Taqman. La expresión se normalizó con respecto a los controles internos de p-actina y GAPDH. Se representa el cambio en la expresión génica frente a las células de control tratadas con DMSO para MBP (B) y MOG (C). Los resultados se muestran como la media /- la desviación típica, n=3.

Figura 3. Análisis de inmunofluorescencia de OPC tratadas con compuesto usando marcadores específicos de oligodendrocitos maduros. Tinción de inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos para MBP, MOG y 2',3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP). Los núcleos se identificaron usando DAPI. El tratamiento con compuesto de las OPC a concentraciones de CE⁹⁰ durante 6 días induce la expresión robusta de marcadores de oligodendrocitos maduros.

Figura 4. Análisis de inmunofluorescencia de OPC tratadas con compuesto usando marcadores específicos de oligodendrocitos maduros. Tinción de inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos para galactocereberosida (GalC), marcador de oligodendrocito O1 (O1) y marcador de oligodendrocito O4 (O4). Los núcleos se identificaron usando DAPI. El tratamiento con compuesto de las OPC a concentraciones de CE⁹⁰ durante 6 días induce la expresión robusta de marcadores de oligodendrocitos maduros.

Figura 5. Los agentes moduladores de receptores de neurotransmisores representativos benzatropina y trifluoperazina mejoran los síntomas en un modelo de ratones con EAE recidivante inducido por p Lp . Se inmunizaron ratones SJL con péptido proteolipídico (PLP) y toxina pertussis, y se controlaron diariamente con puntuación en la escala clínica convencional de la EAE (0-5). Los compuestos se administraron diariamente durante el estudio en solución salina a 10 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (0,1 ml), a partir del día de la aparición de los síntomas clínicos de la EAE (día 10). Se administró una dosis subóptima de micofenolato de mofetilo a 20 mg/kg en solución salina estéril (pH 5) en combinación con benzatropina y trifluoperazina, respectivamente, a partir del día del máximo en los síntomas clínicos de la EAE (día 14) tras la inyección de PLP. Se muestran la puntuación clínica media de la EAE y el error típico de la media (ETM) para cada grupo de estudio. Los ratones del grupo de control del vehículo, n = 6 (Fig. 5A-E, recuadros sin rellenar) muestran la aparición de la fase aguda (puntuación clínica media máxima de la EAE de 2 ± 0,8 en el día 11) seguida de una remisión (puntuación clínica media máxima de la EAE de 0,3 ± 0,3 en el día 19) y la recaída de los síntomas de la EAE (puntuación clínica media máxima de la EAE de 1,5 ± 0,4 en el día 25). El micofenolato de mofetilo, n = 6 (recuadros rellenos de la Fig. 5A) muestra una reducción parcial en la gravedad de la recaída (puntuación máxima media de la EAE 0,7 ± 0,3 en el día 25, valor de p < 0,05). La benzatropina, n = 5 (recuadros rellenos de la Fig. 5B) y la trifluoperazina, n = 6 (recuadros rellenos de la Fig. 5D) muestran una reducción significativa en la gravedad de la recaída (puntuación clínica máxima de la EAE de 0,2 ± 0,2 (día 25) y 0,4 ± 0,4 (día 26) respectivamente, valor de p < 0,001). La benzatropina y la trifluoperazina en combinación con el micofenolato de mofetilo, n = 6 para ambas (Fig. 5C y Fig. 5E, respectivamente, recuadros rellenos) muestran una supresión completa de la recaída (puntuación clínica media máxima de la EAE de 0 ± 0 para ambas en el día 25, valor de p < 0,001).

Figura 6. El antagonismo de los receptores muscarínicos induce la diferenciación de las OPC, pero no es el único mecanismo farmacológico de todos los agentes inductores de la diferenciación identificados. (A) El agonista de receptor muscarínico carbacol antagoniza la diferenciación de las OPC inducida por los compuestos en algunos casos. Se sembraron OPC en placas de 384 pocillos a 1.000 células por pocillo en medios que contenían compuestos a concentraciones de CE⁹⁰ y se trataron con diluciones en serie de carbacol a 1:3. Tras 6 días de tratamiento, se fijaron las células y se tiñeron para MBP. Se tomaron imágenes de las placas usando el sistema de detección de alto contenido OPERA, y se cuantificó la tinción de MBP como se describe. El tratamiento con carbacol produce una inhibición dependiente de la dosis de la actividad de diferenciación de la benzatropina, el carbapentano y la clemastina, mientras que no se observa ningún efecto sobre la actividad de diferenciación del salmeterol, GBR12935 y trifluoperazina. (B) El flujo de entrada de calcio (Ca2+) inducido por el carbacol es bloqueado por la actividad antagonista de receptor muscarínico de algunos compuestos. Se sembraron en placas de 384 pocillos a 5.000 células por pocillo en medios de OPC que contenían PDGF-aa basal. Las células se equilibraron con colorante Fluo-3AM® sensible a Ca2+ en HBSS durante 30 min. Se añadieron múltiples concentraciones de compuestos inductores de la diferenciación de las OPC (3 veces la CE⁹⁰, CE⁹⁰ y CE⁵⁰), seguidas de la adición de diluciones en serie 1:3 del agonista de receptor muscarínico Carbacol. Se midió de inmediato el flujo de entrada de Ca2+ usando el sistema FLIPR TETRA®. Se muestran los datos representativos para el tratamiento con carbacol a 100 uM y el tratamiento con compuesto a CE⁹⁰. Las unidades de luz relativas (ULR) que indican el flujo de entrada de Ca2+ se representan en el eje Y, y el tiempo (en segundos) tras la adición del carbacol, en el eje X. GBR12935, la trifluoperazina y el salmeterol (parte superior) no muestran efectos sobre el flujo de entrada de Ca2+ inducido por el carbacol, mientras que la clemastina, la benzatropina y el carbapentano (parte inferior) inhiben el flujo de entrada de Ca2+ inducido por el carbacol.

Figura 7. Una detección de alto rendimiento identificó el antagonista de receptor muscarínico benztropina como un inductor de la diferenciación de las OPC. (A) Se cultivaron OPC de rata tratadas con benztropina [1,5 uM] y hormona tiroidea de control positivo [1 uM] en condiciones de diferenciación basal (2 ng/ml de PDGF) durante 6 días y se tiñeron para MBP (verde). También se muestra la estructura de la benztropina. (B) Las OPC tratadas con benztropina [1,5 uM] se analizaron para determinar la expresión de MBP y MOG después de 6 días en cultivo usando qRT-PCR. (C) Las OPC se trataron junto con benztropina [2,3 uM] y carbacol [0 uM, 0,6 uM y 4,7 uM] durante 6 días en condiciones de diferenciación basal y se tiñeron para MBP.

Figura 8. La benztropina disminuye la gravedad clínica de la enfermedad en el modelo de EAE inducida por PLP para la EM. (A) La benztropina disminuyó la gravedad clínica de la enfermedad en el modelo de EAE inducida por PLP cuando se administró profilácticamente (a partir del día de la inyección de PLP), así como terapéuticamente (al inicio de los síntomas de la EAE), y mostró una eficacia comparable al FTY720 (1 mg/kg) e interferón-p (10.000 U/ratón). (B) La cuantificación de imágenes confocales de cortes de médula espinal de ratones con EAE tratados con benztropina y teñidos con anticuerpos específicos de GST-n (un marcador de oligodendrocitos maduros) y NG2 (un marcador de las OPC) mostró el aumento de las células positivas en GST-n en comparación con ratones tratados con vehículo, sin cambio en el número de células positivas en NG2. (C) Imágenes confocales representativas de cortes de médula espinal de ratones con EAE tratados con benztropina y teñidos con anticuerpos específicos de GST-n (oligodendrocitos maduros) y NG2 (OPC).

Figura 9. El tratamiento con benztropina induce la remielinización in vivo en el modelo de cuprizona. (A) Las imágenes representativas de la región del cuerpo calloso del cerebro en varios puntos de tiempo muestra el aumento de la remielinización observada en ratones tratados con benzatropina en comparación con los ratones tratados con vehículo 2 semanas después de la retirada de la cuprizona y del inicio de la administración del fármaco. (B) La cuantificación de las zonas mielinizadas de la región del cuerpo calloso muestra un aumento significativo (de aproximadamente el doble) en la tinción de la mielina en ratones tratados con benztropina en comparación con los controles de vehículo 2 semanas después del tratamiento farmacológico. Los datos se representan en términos de intervalos de umbrales en la escala del gris (0-50) como se describe. Las barras de error representan las desviaciones típicas de al menos 6 regiones del cuerpo calloso.

Figura 10. La combinación con benztropina mejora la eficacia y permite una reducción en la dosis de FTY720 e interferón-p. (A) Las puntuaciones clínicas de la EAE para ratones tratados con FTY720 (1 mg/kg) en combinación con benztropina (BA; 2,5 mg/kg) muestran una gravedad clínica significativamente menor en comparación con los ratones tratados con FTY720 (1 mg/kg) o benztropina (2,5 mg/kg) solo. (B) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con Interferón-p (IFN; 10.000 U/ratón) en combinación con la benztropina (BA, 2,5 mg/kg) muestran una gravedad clínica significativamente menor en comparación con los ratones tratados con interferón-y (IFN; 10.000 U/ratón) o benztropina (2,5 mg/kg) solo. (C) Puntuaciones clínicas de la EAE para ratones tratados con FTY720 (0,1 mg/kg) o FTY720 (0,1 mg/kg) o benztropina (BA; 2,5 mg/kg). (D) Puntuaciones clínicas de la EAE para ratones tratados con interferón-p (IFN; 3.000 U/ratón) o interferón-p (IFN; 10.000 U/ratón) o benztropina (BA; 2,5 mg/kg. (E) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con FTY720 (0,1 mg/kg) en combinación con benztropina (BA; 2,5 mg/kg) muestran una disminución comparable en las puntuaciones de gravedad clínica en comparación con FTY720 (1 mg/kg), facilitando la reducción en la dosis de FTY720. (F) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con interferón-p (IFN; 3.000 U/ratón) en combinación con benztropina (BA; 2,5 mg/kg) no muestran una disminución comparable en las puntuaciones de gravedad clínica con el interferón-p (IFN; 10.000 U/ratón). Las barras de error indican la desviación típica de la media dentro de cada grupo de 8 ratones.

Figura 11. Exploración para identificar inductores de la diferenciación de las OPC. (A) Se mantuvieron OPC como células proliferativas positivas en A2B5 en condiciones de crecimiento basales (medio neurobasal, suplemento B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales, L-Glutamina, 30 ng/ml de PDGF). Se sembraron las o Pc en medio de diferenciación basal (medio neurobasal, complemento de B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales, L-Glutamina, 2 ng/ml de PDGF), tratadas con DMSO (< 0,1 %) u hormona tiroidea (1 uM), se fijaron tras 6 días en cultivo y se tiñeron usando anticuerpos para CNP, O4 o MBP. Las OPC positivas en A2B5 se diferencian en oligodendrocitos inmaduros que expresan CNP y O4, pero no MBP, al retirarse el PDGF. La adición de la hormona tiroidea induce la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos maduros que expresan MBP. (B) Estrategia de detección usando OPC positivas en A2B5 cultivadas en condiciones de diferenciación basales y tratadas con compuestos durante 6 días para identificar moléculas pequeñas que inducen la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos que expresan MBP maduros.

Figura 12. Confirmación del acierto principal. (A) Ensayo de la respuesta a la dosis usado para confirmar los aciertos principales de detección y determinar la potencia (CE⁵⁰). La (CE⁵⁰) se define como la concentración que produce un aumento medio máximo en el porcentaje de células totales que expresan la MBP según lo detectado mediante inmunotinción. Se cultivaron OPC en medio de diferenciación y se trataron con benztropina o control (DMSO < 0,01 %) durante 6 días. Se fijaron las células y se sometieron a inmunotinción usando anticuerpos para MBP. Las barras de error representan las desviaciones típicas de 3 experimentos repetidos. (B) Las imágenes representativas muestran la actividad dependiente de la dosis de benztropina.

Figura 13. La benztropina induce la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos maduros. Se sembraron OPC en medio de diferenciación (medio neurobasal, complemento de B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales, L-Glutamina, 2 ng/ml de PDGF) y se trataron con DMSO (< 0,01 %), Benztropina [1,5 uM] u hormona tiroidea [1 uM]. Después de 6 días en cultivo, las células se analizaron para determinar la expresión de MBP y MOG mediante transferencia Western.

Figura 14. El tratamiento con compuestos induce la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos maduros. Se sembraron OPC en medio de diferenciación (medio neurobasal, complemento de B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales, L-Glutamina, 2 ng/ml de PDGF) y se trataron con DMSO (< 0,01 %), benztropina [1,5 uM] u hormona tiroidea [ 1 uM] durante 6 días. Se fijaron las células y se sometieron a inmunotinción para MBP, MOG, CNP, GalC, O1 u O4. Las imágenes representativas de células tratadas con DMSO, benztropina y hormona tiroidea muestran la expresión de marcadores de oligodendrocitos maduros en células tratadas con benztropina y hormona tiroidea, pero no en células tratadas con DMSO.

Figura 15. Perfil de expresión génica de OPC diferenciadas en oligodendrocitos mediante el tratamiento con benztropina. Se sembraron OPC en medio de diferenciación y se trataron con DMSO (< 0,1 %), benztropina [2,3 uM] u hormona tiroidea [ 1 uM] durante 6 días. Las OPC del mismo pase también se sedimentaron y se congelaron. Se aisló ARN total de las células y se realizó un análisis de expresión génica usando matrices de genoma de rata de Affymetrix. El análisis de agrupamiento global de los conjuntos de sondas de expresión de ARNm que mostraron un cambio > 2 veces mayor en la expresión a través de las muestras ilustra el agrupamiento de muestras tratadas con benztropina con muestras tratadas con hormona tiroidea, mientras que los perfiles de expresión génica de las células tratadas con DMSO se agrupan con las OPC. Los datos se representan como el cambio frente a los controles tratados con DMSO. Se observó un aumento de la expresión de los genes de oligodendrocitos maduros en las células tratadas con compuesto en comparación con las células tratadas con DMSO.

Figura 16. Los perfiles de expresión génica de las células tratadas con benztropina muestran una regulación a la baja de los genes de OPC y una regulación al alza de los genes de oligodendrocitos maduros. (A) Expresión aumentada (cambio en veces) de los genes de oligodendrocitos maduros en células tratadas con compuesto en comparación con las células tratadas con DMSO. (B) Disminución de la expresión (cambio en veces) de los genes de OPC en células tratadas con compuesto en comparación con las células tratadas con DMSO.

Figura 17. El momento del tratamiento del compuesto determina la eficiencia de la diferenciación. (A) Se sembraron OPC en medio de diferenciación en el día 0 y se trataron con compuestos en varios días. Las células se fijaron y se sometieron a inmunotinción para MBP el día 6 después de la siembra. (B) Se sembraron OPC en medio de diferenciación el día 0 y se trataron con compuestos 12 horas después. Las células se fijaron en varios días después del tratamiento de compuesto y se sometieron a inmunotinción para MBP. (C) El tratamiento con benztropina dentro de las 48 horas posteriores a la siembra en el medio de diferenciación indujo una diferenciación eficaz de las OPC en los oligodendrocitos maduros. El tratamiento con compuesto 72 horas o más después de la siembra en placas en medio de diferenciación redujo la eficacia de la diferenciación de las OPC. (D) El tratamiento con benztropina durante un mínimo de 5 días fue necesario para inducir una diferenciación eficaz de las OPC en los oligodendrocitos maduros.

Figura 18. El carbacol antagoniza la diferenciación de las OPC inducida por la benztropina. Se sembraron OPC en medio de diferenciación basal y se trataron simultáneamente con benztropina [2,3 uM] y carbacol [0 uM, 0,6 uM o 4,7 uM] durante 6 días y se tiñeron para MBP (verde).

Figura 19. La benztropina no tiene efecto en la señalización del receptor de la histamina. Se sembraron OPC en medio de diferenciación basal (medio neurobasal, complemento de B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales, L-Glutamina, 2 ng/ml de PDGF) y se trataron simultáneamente con varias concentraciones de benztropina y (A) histamina o (B) el agonista del receptor de la histamina trifluorometiltoluidida de histamina (HTMT).

Figura 20. La benztropina no tiene efecto sobre la señalización de los receptores de dopamina D2 y D3. Se sembraron OPC en medio de diferenciación basal (medio neurobasal, complemento de B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales, L-Glutamina, 2 ng/ml de PDGF) y se trataron simultáneamente con diversas concentraciones de benztropina y el receptor de la dopamina agonista quinpirol (A) o (B) antagonista haloperidol. Las barras de error indican las desviaciones típicas de 3 mediciones repetidas.

Figura 21. Los antagonistas muscarínicos inducen la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos. Se sembraron OPC en medio de diferenciación (2 ng/ml de PDGF) y se trataron con diversas concentraciones de compuestos durante 6 días. Se fijaron las células y se sometieron a inmunotinción para MBP. Los antagonistas muscarínicos selectivos oxibutinina, atropina, ipratropio, propiverina y escopolamina indujeron la diferenciación de las OPC de una manera dependiente de la dosis. Se indican los valores de CE⁵⁰ para la diferenciación inducida por compuestos.

Figura 22. Las OPC expresan receptores muscarínicos y colina acetil transferasa. Se aisló el ARN total de las OPC tratadas con DMSO (< 0,1 %) u hormona tiroidea [1 uM] durante 6 días o de cerebro de rata entero. El ARN se transcribió de forma inversa a ADNc, y se detectó la expresión génica de los receptores muscarínicos M¹ , M² , o M³ mediante PCR usando cebadores específicos de los genes.

Figura 23. El antagonismo de la vía de señalización muscarínica M¹/M³ mediante la benztropina prepara a las OPC para la diferenciación. (A) Se trataron OPC con benztropina [10 uM] para los tiempos indicados y se aglomeraron para el análisis de transferencia Western de la proteína total. La benztropina inhibe las proteínas de señalización cadena abajo de los receptores muscarínicos M¹/M³ al regular a la baja la fosforilación de Akt, la p42MAP quinasa, y aumentar la fosforilación de p38MAP quinasa y CREB. (B) Se sembraron OPC en condiciones de diferenciación basal y se trataron con benztropina [1,5 uM], hormona tiroidea [1 uM] o DMSO (<0,1 %). Las OPC del mismo pase también se sedimentaron y se congelaron. Se aisló ARN total de las células, se transcribió de manera inversa al ADNc de la primera hebra y se usó como molde para la qRT-PCR. Se usaron sondas marcadas con FAM específicas para detectar los niveles de expresión de varios genes, con sondas para betaactina y GAPDH como controles internos. La expresión génica muestra una regulación a la baja en los genes del ciclo celular, tales como la Ciclina D1, Ciclina D2, c-Fos, c-Jun que indica una salida del ciclo celular. (C) Vía de señalización cadena abajo de los receptores muscarínicos M¹/M³.

Figura 24. La benztropina antagoniza los receptores muscarínicos M¹/M³ , pero no los receptores muscarínicos M²/M⁴. Se sembraron OPC en medio de diferenciación durante 12 horas. Los medios se cambiaron a solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfónico (HEPES), y las células se trataron con benztropina a diversas concentraciones durante 1 hora. Se añadió Carbacol y se midió el flujo de calcio durante 186 segundos usando el sistema FLIPR TETRA®. (A) El Carbachol indujo un aumento dependiente de la dosis en los niveles de Ca2+ intracelular. (B) La dosis de benztropina bloqueó de manera dependiente el flujo de entrada del calcio inducido por el Carbachol a través del antagonismo de los receptores muscarínicos M¹/M³. (C) La atropina, un antagonista muscarínico, sirve como control positivo. (D) Las OPC se sembraron en medio de diferenciación durante 12 horas. Se realizó un ensayo de cAMP-HTRF usando el kit cAMP dynamic 2. La benztropina no tuvo efecto en los niveles de cAMP. Se añadió IBMX como estabilizante de cAMP, y la forskolina fue un control positivo.

Figura 25. Actividad dependiente de la dosis de la benztropina profiláctica en el modelo de EAE. Se indujo EAE en ratones usando PLP y toxina pertussis. Se inyectó benztropina disuelta en solución salina a varias dosis a través de una inyección i.p. diariamente usando el modo profiláctico seguido de una puntuación de los síntomas clínicos. La dosis profiláctica se define como la administración de un compuesto que comenzó el día de la inyección de PLP. Las barras de error indican la desviación típica de la media dentro de cada grupo de 8 ratones.

Figura 26. El tratam iento con benztropina induce la remielinización in vivo en el modelo de EAE inducida por PLP para la EM. La benztropina no bloquea la infiltración de los linfocitos en ratones con EAE, pero conduce a un aumento significativo de la tinción con LFB, lo que indica la presencia de mielina en zonas infiltradas por linfocitos en comparación con los ratones tratados con vehículo. Se indujo EAE en ratones inyectando PLP y toxina pertussis, y los ratones se trataron con benztropina (10 mg/kg) o con controles de vehículo en la primera aparición de los síntomas de la EAE. Se aislaron las médulas espinales de ratones representativos de las puntuaciones medias del grupo durante la fase de recaída de la EAE, se seccionaron y se tiñeron con Luxol Fast Blue y H&E (panel izquierdo) y Luxol Fast Blue solamente (panel derecho). Las flechas apuntan a regiones de infiltración de linfocitos.

Figura 27. La benztropina no tiene efecto en la activación ni en la proliferación de los linfocitos T in vitro. Se aislaron esplenocitos totales de ratones y se estimularon con CD3 y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión de los marcadores de activación de linfocitos T CD69 y CD25 y la proliferación de los linfocitos T usando CFSE. (A) Células no estimuladas. (B) Células tratadas con DMSO. (C) El micofenolato suprime la activación y proliferación de los linfocitos T en comparación con el DMSO. (D) La benztropina no tiene efecto sobre la activación de los linfocitos T. (E) El micofenolato suprime la proliferación de los linfocitos T. (F) La benztropina no tiene efecto sobre la proliferación de los linfocitos T. Los números representan el porcentaje de poblaciones cerradas positivas en el marcador dado.

Figura 28. La benztropina no muestra efectos inmunosupresores in vivo después de la inducción de EAE en ratones. Se indujo EAE en ratones inyectando PLP y toxina pertussis. Se inyectaron benztropina (10 mg/kg) y solución salina (control del vehículo) por vía intraperitoneal en el modo terapéutico durante 14 días. Se aislaron esplenocitos totales de los ratones, se estimularon con PMA e ionomicina, y se analizaron para detectar diferentes poblaciones de células inmunitarias y la secreción de citocinas después de 48 horas. Se bloqueó el transporte de proteínas en las células usadas para el análisis de citocinas usando monoeiosina. El tratamiento con benztropina no tuvo efecto sobre el número de esplenocitos totales (A), número de linfocitos B (B), número de los linfocitos T CD4+ (C), número de los linfocitos T CD8+ (D), número de linfocitos T CD4+/CD44Hi (E) y número de los linfocitos T CD8+/CD44HÍ (F). La benztropina tampoco tuvo efecto en la producción de citocinas medida como el número de los linfocitos T CD4+ productores de IL2 (G), el número de los linfocitos T CD4+ productores de IL10 (H), el número de los linfocitos T CD4+ productores de TNF-a y el número de linfocitos T CD4+ productores de TNF-y. Las barras de error indican la desviación típica de la media dentro de cada grupo de 5 ratones. Las gráficas representativas de la dispersión por citometría de flujo (K) muestran números similares de células CD4+, CD8+ y CD44+ en bazos aislados de ratones tratados con vehículo y ratones tratados con benztropina.

Figura 29. La benztropina no muestra efectos inmunosupresores in vivo en ratones normales. Se inyectaron por vía intravenosa benztropina (10 mg/kg) y solución salina (control del vehículo) en ratones normales durante 14 días. Se aislaron esplenocitos totales de los ratones, se estimularon con PMA e ionomicina, y se analizaron para detectar diferentes poblaciones de células inmunitarias y la secreción de citocinas después de 48 horas. Se bloqueó el transporte de proteínas en las células usadas para el análisis de citocinas usando monoeiosina. El tratamiento con benztropina no tuvo efecto sobre el número de esplenocitos totales (A), número de linfocitos B (B), número de los linfocitos T CD4+ (C), número de los linfocitos T c D8+ (D), número de linfocitos T CD4+/CD44Hi (E) y número de los linfocitos T CD8+/CD44Hi (F). La benztropina tampoco tuvo efecto en la producción de citocinas medida como el número de los linfocitos T CD4+ productores de IL2 (G), el número de los linfocitos T CD4+ productores de IL10 (H), el número de los linfocitos T CD4+ productores de TNF-y y el número de linfocitos T CD4+ productores de IFN-y. Las barras de error indican la desviación típica de la media dentro de cada grupo de 5 ratones.

Figura 30. La benztropina no suprime las respuestas inmunitarias dependientes e independientes de los linfocitos T. Se inyectaron los ratones con la proteína hemocianina de lapa californiana conjugada con 2,4,6, trinitrofenilhapteno (TNP-KLH), lipopolisacárido conjugado con 2,4,6, trinitrofenilhapteno (TNP-LPS) o conjugado de TNP (2,4,6-trinitrofenil)-FICOLL (TNP-Ficoll) en adyuvantes apropiados y tratado con vehículo o benztropina (10 mg/kg). Se aisló suero en diversos puntos de tiempo y se midieron los niveles de IgG e IgM mediante ELISA. (A, B) La benztropina no mostró ningún efecto sobre las respuestas de los linfocitos B independientes de los linfocitos T inducidas por TNP-LPS medidas como niveles de IgM e IgG en suero. (C, D) La benztropina no mostró ningún efecto sobre las respuestas de los linfocitos B independientes de los linfocitos T inducidas por TNP-Ficoll medidas como niveles de IgM e IgG en suero. (E, F) La benztropina no mostró ningún efecto sobre las respuestas de los linfocitos B dependientes de los linfocitos T inducidas por TNP-KLH medidas como niveles de IgM e IgG en suero. Las barras de error representan las desviaciones típicas de 3 ELISA replicados realizados en muestras de 5 ratones en cada grupo de tratamiento.

Figura 31. Cuantificación de la tinción de mielinización en el modelo de cuprizona. (A) Se realizó la tinción con Luxol Fast Blue en secciones de la región del cuerpo calloso de los cerebros aislados de ratones tratados con benztropina (10 mg/kg) o con control del vehículo después de 7 semanas de exposición a cuprizona. (B) Las imágenes se convirtieron a una escala del gris de 256 tonos. (C) Los 256 tonos del gris se dividieron en 5 apartados de 50 tonos cada uno. El número de objetos en la región del cuerpo calloso en cada apartado se contó con Image-Pro plus. (D) Imágenes representativas de la representación de Image-Pro de la cuantificación de objetos en cada apartado.

Figura 32. Análisis de transferencia Western de la actividad de la caspasa escindida en OPC diferenciadas.

Se sembraron OPC en medios de diferenciación basal y se trataron con benztropina [1,5 uM], hormona tiroidea [1 uM] o DMSO [0,1 %] durante 6 días. Se aisló la proteína total y se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo específico para la expresión de la caspasa 3 y la caspasa 3 escindida. No se detectó expresión de caspasa 3 escindida en las células tratadas con compuesto o en las OPC no tratadas.

Figura 33. La combinación con benztropina mejora la eficacia y permite una reducción en la dosis de FTY720 e interferón-p. Se indujo EAE en ratones usando PLP y toxina pertussis. Se inyectaron benztropina (2,5 mg/kg) y FTY720 (varias dosis) e interferón (varias dosis) mediante inyecciones intraperitoneales en el modo terapéutico al inicio de los síntomas de la EAE. (A) Las puntuaciones clínicas de la EAE para ratones tratados con FTY720 a dosis de 1 mg/kg, 0,1 mg/kg y 0,01 mg/kg muestran una actividad dependiente de la dosis para FTY720. (B) Las puntuaciones clínicas de la eAe para ratones tratados con interferón-p a dosis de 10.000 U, 3.000 U y 1.000 U por ratón muestran una actividad dependiente de la dosis para el interferón-p. (C) Combinaciones de benztropina (2,5 mg/kg) con FTY720 (1 mg/kg, 0,1 mg/kg y 0,01 mg/kg). (D) Combinaciones de benztropina (2,5 mg/kg) con interferón-p (10.000 U, 3.000 U y 1.000 U por ratón). (E) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con FTY720 (0,01 mg/kg) en combinación con benztropina (BA; 2,5 mg/kg) no muestran una gravedad clínica significativamente menor en comparación con los ratones tratados con FTY720 (0,01 mg/kg) o benztropina (2,5 mg/kg) solo. (F) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con interferón-p (IFN; 1.000 U/ratón) en combinación con la benztropina (BA, 2,5 mg/kg) no muestran una gravedad clínica significativamente menor en comparación con los ratones tratados con interferón-p (IFN; 1.000 U/ratón) o benztropina (2,5 mg/kg) solo. Las barras de error indican la desviación típica de la media dentro de cada grupo de 8 ratones.

Figura 34. Los compuestos identificados disminuyen la gravedad clínica en el modelo de EAE. Se indujo EAE en ratones inyectando PLP en adyuvante completo de Freund (CFA) y toxina pertussis, y los animales se calificaron diariamente para determinar la gravedad clínica de la enfermedad en una escala de 0-5. (A) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con benztropina (10 mg/kg) en el modo terapéutico (inyecciones a partir de la primera aparición de los síntomas de la EAE el día 8-10) mostraron una disminución significativa de la gravedad clínica en la fase de recaída de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con vehículo. (B) Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con benztropina (10 mg/kg) en el modo profiláctico (inyecciones a partir del día 0) mostraron una disminución significativa de la gravedad clínica tanto en la fase aguda como en la de recaída de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con vehículo. (C) La benztropina mostró una eficacia dependiente de la dosis en la disminución de las puntuaciones de gravedad clínica en el modelo de la EAE, siendo la dosis de 12,5 mg/kg la más eficaz, y la de 0,1 mg/kg no mostrando ningún efecto. Las puntuaciones clínicas de la EAE para los ratones tratados con (D) trifluoperazina (10 mg/kg), (E) clemastina (10 mg/kg) o (E) salbutamol (10 mg/kg) en el modo terapéutico mostraron una gravedad clínica significativamente menor en la fase de recaída de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con vehículo. Las barras de error indican la desviación típica de la media dentro de cada grupo de 8-10 ratones.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los compuestos que modulan varias clases de receptores de neurotransmisores, en particular, antagonistas de los receptores muscarínicos, potencian la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en un destino de células mielinizantes maduras (por ejemplo, oligodendrocitos mielinizantes). Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para inducir la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos mielinizantes.

Sin pretender quedar ligado a una teoría en particular, Se cree que, en las enfermedades desmielinizantes tales como la esclerosis múltiple, las OPC están presentes y son capaces de migrar a las regiones desmielinizadas, lo que sugiere que la disminución progresiva de la remielinización en estas enfermedades no se debe a defectos en la población o del reclutamiento de OPC, sino que se debe a una diferenciación deficiente de las OPC (revisado en Chong y Chan, J. Cell Biol. 188:305-312 (2010)). Por consiguiente, la presente invención proporciona además la estimulación de la mielinización aumentada de los nervios en un sujeto que la necesita administrando, a un sujeto, un antagonista de receptor muscarínico. La presente invención también proporciona el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante mediante la administración, a un sujeto, de un antagonista de receptor muscarínico.

II. Agentes que estimulan el aumento de la mielinización de los nervios

A. Agentes moduladores de los receptores de neurotransmisores

Un agente modulador de receptores neurotransmisores es un agente que induce la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en un destino de células mielinizantes maduras (por ejemplo, oligodendrocitos mielinizantes) y/o estimula el aumento de la mielinización. En algunos aspectos de la divulgación, un agente modulador de receptores de neurotransmisores se selecciona entre un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista de receptor de la dopamina, un antagonista de receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico y/o un modulador de receptor de opioides. Como se muestra en la sección de ejemplos a continuación, se ha demostrado que los miembros ilustrativos de cada una de estas clases de compuestos inducen la diferenciación de las OPC en un destino celular de oligodendrocito mielinizante, y por lo tanto, que estimulan un aumento de la mielinización. Basándose en los datos que muestran esta actividad de los antagonistas de los receptores muscarínicos, antagonistas del receptor de la dopamina, antagonistas del receptor de la histamina, antagonistas del receptor beta-adrenérgico y moduladores del receptor de opioides, otros compuestos de cada una de estas clases y que tienen mecanismos farmacológicos similares a los de los compuestos ilustrativos, tales como los compuestos enumerados en la Tabla 1, se predicen útiles para inducir la diferenciación de las OPC en un destino de células mielinizantes maduras (por ejemplo, oligodendrocitos mielinizantes) y/o la estimulación de una mayor mielinización.

En algunos casos, un compuesto que se identifica como un agente que estimula el aumento de la mielinización tiene actividad “selectiva” hacia una de estas clases de receptores de neurotransmisores (es decir, tiene un efecto agonista o antagonista frente a uno de entre un receptor muscarínico, un receptor de la dopamina, un receptor de la histamina, un receptor beta-adrenérgico o un receptor de opioides, o un subtipo de cualquiera de estos receptores, y tiene un efecto más débil o esencialmente ningún efecto contra los otros receptores). En algunos casos, un compuesto que se identifica como un agente que estimula el aumento de la mielinización tiene actividad contra dos o más de estas clases de receptores de neurotransmisores o subtipos de receptores de neurotransmisores.

Tabla 1. A entes moduladores de los rece tores de neurotransmisores

1. Antagonistas de los receptores muscarínicos

Un receptor muscarínico es un receptor de acetilcolina acoplado a proteína G. Hay cinco subtipos conocidos de receptores muscarínicos: receptores M¹, receptores M² , receptores M³ , receptores M⁴ y recepto de receptor muscarínico es un agente capaz de inhibir una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor muscarínico. Como ejemplo no limitante, un antagonista puede unirse competitiva o no competitivamente a (1) un receptor muscarínico, (2) un agonista o agonista parcial (u otro ligando) del receptor muscarínico y/o (3) una molécula de señalización cadena abajo para inhibir la función de los receptores muscarínicos. Como se muestra en los ejemplos, la benztropina, el carbetapentano, la clemastina, el ipratropio y la atropina han resultado antagonizar la función de un receptor muscarínico y/o son antagonistas conocidos de un receptor muscarínico. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico es un compuesto seleccionado entre benztropina, carbetapentano, clemastina, ipratropio, atropina y sales, profármacos, mezclas racémicas, isómeros conformacionales y/u ópticos, polimorfos cristalinos y variantes isotópicas de los mismos. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los moduladores de los receptores muscarínicos enumerados en la Tabla 1 para antagonizar un receptor muscarínico. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el antagonista de receptor muscarínico es un compuesto modulador de receptor muscarínico que figura en la Tabla 1. Los compuestos descritos en la Tabla 1 se pueden obtener fácilmente.

En algunas realizaciones, el agente modulador de los receptores de neurotransmisores es la benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina). En algunas realizaciones, el agente modulador de los receptores de neurotransmisores es la clemastina o una sal de la misma (por ejemplo, fumarato de clemastina).

2. Antagonistas de los receptores de dopamina

Un receptor de la dopamina es un receptor acoplado a la proteína G, para el que el neurotransmisor dopamina es el ligando endógeno primario. Hay cinco subtipos conocidos de receptores de dopamina: receptores D¹ y D⁵ , los receptores de tipo Di, activan la adenilil ciclasa, mientras que los receptores D² , D³ y D⁴, los receptores de tipo D² , inhiben la adenilil ciclasa y activan los canales del K+. Un antagonista de receptor de la dopamina es un agente capaz de inhibir una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor de la dopamina. Como un ejemplo no limitante, un antagonista puede unirse competitiva o no competitivamente a (1) un receptor de la dopamina, (2) un agonista o agonista parcial (u otro ligando) del receptor de la dopamina y/o (3) una molécula de señalización de cadena abajo para inhibir la función del receptor de la dopamina. Como se muestra en los ejemplos, se ha demostrado que la benztropina, GBR12935 y la trifluoperazina antagonizan la función de un receptor de la dopamina y/o son antagonistas conocidos de un receptor de la dopamina. Por lo tanto, en algunos casos, el antagonista del receptor de la dopamina es un compuesto seleccionado entre benztropina, GBR12935, trifluoperazina y sales, profármacos, mezclas racémicas, isómeros conformacionales y/u ópticos, polimorfos cristalinos y variantes isotópicas de los mismos. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los moduladores de los receptores de dopamina enumerados en la Tabla 1 para antagonizar un receptor de la dopamina. Por lo tanto, en algunos casos, el antagonista de receptor de la dopamina es un compuesto modulador de los receptores de la dopamina que figura en la Tabla 1. Los compuestos descritos en la Tabla 1 se pueden obtener fácilmente.

En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina). En algunos casos, el agente modulador de los receptores de neurotransmisores es trifluoperazina o una sal de la misma (por ejemplo, hidrocloruro de trifluoperazina).

3. Antagonistas de los receptores de la histamina

Un receptor de la histamina es un receptor acoplado a la proteína G, para el que el neurotransmisor histamina es el ligando endógeno primario. Hay cuatro subtipos conocidos de receptores de la histamina: receptores H¹, receptores H² , receptores H³ y receptores H⁴. Un antagonista de receptor de la histamina es un agente capaz de inhibir una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor de la histamina. Como un ejemplo no limitante, un antagonista puede unirse competitiva o no competitivamente a (1) un receptor de la histamina, (2) un agonista o agonista parcial (u otro ligando) del receptor de la histamina y/o (3) una molécula de señalización para inhibir la función del receptor de la histamina. Como se muestra en los ejemplos, se ha demostrado que la clemastina antagoniza la función de un receptor de la histamina. Por lo tanto, en algunos casos, el antagonista del receptor de la histamina es la clemastina o una sal, profármaco, mezcla racémica, isómero conformacional y/u óptico, polimorfo cristalino o una variante isotópica de los mismos. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los moduladores de receptores de la histamina enumerados en la Tabla 1 para antagonizar un receptor de la histamina. Por lo tanto, en algunos casos, el antagonista de receptor de la histamina es un compuesto modulador de los receptores de la histamina que figura en la Tabla 1. Los compuestos descritos en la Tabla 1 se pueden obtener fácilmente.

En algunos casos, el agente modulador de los receptores de neurotransmisores es la clemastina o una sal de la misma (por ejemplo, el fumarato de clemastina).

4. Moduladores de los receptores beta-adrenérgicos

Un receptor beta-adrenérgico es un subtipo del receptor adrenérgico, un receptor acoplado a la proteína G, para el que las catecolaminas (por ejemplo, epinefrina y norepinefrina) son el ligando endógeno primario. Hay tres subtipos conocidos de receptores beta-adrenérgicos: receptores p¹, receptores p² y receptores p3. Un antagonista de receptor beta-adrenérgico es un agente capaz de inhibir una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor beta-adrenérgico. Como un ejemplo no limitante, un antagonista puede unirse competitiva o no competitivamente a (1) un receptor beta-adrenérgico, (2) un agonista o agonista parcial (u otro ligando) del receptor beta-adrenérgico /o (3) una molécula de señalización cadena abajo para inhibir la función del receptor betaadrenérgico. Como un ejemplo no limitante, el pindolol es capaz de antagonizar la función de un receptor betaadrenérgico. Un agonista de receptor beta-adrenérgico es un agente capaz de inducir o estimular una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor beta-adrenérgico. Como se muestra en los ejemplos, el pindolol, el salmeterol, el salbutamol y el albuterol han demostrado agonismo de la función de un receptor betaadrenérgico y/o son agonistas conocidos de un receptor beta-adrenérgico. Por lo tanto, en algunos casos, el modulador del receptor beta-adrenérgico es un compuesto seleccionado entre pindolol, salmeterol, salbutamol, albuterol y sales, profármacos, mezclas racémicas, isómeros conformacionales y/u ópticos, polimorfos cristalinos y variantes isotópicas de los mismos. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los moduladores de los receptores beta-adrenérgicos enumerados en la Tabla 1 para modular un receptor beta-adrenérgico. Por lo tanto, en algunos casos, el modulador del receptor beta-adrenérgico es un compuesto modulador de los receptores beta-adrenérgico enumerado en la Tabla 1. Los compuestos descritos en la Tabla 1 se pueden obtener fácilmente.

En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es el salmeterol o una sal del mismo (por ejemplo, xinfoato de salmeterol). En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es el salbutamol o una sal del mismo (por ejemplo, hemisulfato de salbutamol).

5. Moduladores de los receptores de opioides

Un receptor de opioides es un receptor acoplado a la proteína G, para el que los opioides son el ligando endógeno primario. Un antagonista de receptor de opioides es un agente capaz de inhibir una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor de opioides. Como un ejemplo no limitante, un antagonista puede unirse competitiva o no competitivamente a (1) un receptor de opioides, (2) un agonista o agonista parcial (u otro ligando) de un receptor y/o (3) una molécula de señalización cadena abajo para inhibir la función de un receptor. Un agonista de receptor de opioides es un agente capaz de inducir o estimular una o más respuestas características de un receptor o subtipo de receptor de opioides. Por ejemplo, un agonista puede activar un receptor de opioides. Como se muestra en los ejemplos, el carbetapentano, el Snc-80 y el BD-1047 modulan la función de un receptor de opioides. Por lo tanto, en algunos casos, el antagonista de receptor de opioides es un compuesto seleccionado entre carbetapentano, Snc-80, BD-1047 y sus sales, profármacos, mezclas racémicas, isómeros conformacionales y/u ópticos, polimorfos cristalinos y variantes isotópicas de los mismos. Como alternativa, se puede usar cualquiera de los moduladores de los receptores de opioides enumerados en la Tabla 1 para modular un receptor de opioides. Por lo tanto, en algunos casos, el modulador de receptor de opioides es un compuesto modulador de receptor de opioides enumerado en la Tabla 1. Los compuestos descritos en la Tabla 1 se pueden obtener fácilmente.

B. Identificación de agentes moduladores

Se puede usar una serie de diferentes protocolos de detección para identificar agentes que estimulan el aumento de la mielinización de los nervios. En términos generales, los métodos de detección incluyen la detección de una pluralidad de agentes para identificar un agente que aumente el número de células en una muestra que tengan un destino celular mielinizante diferenciado (por ejemplo, oligodendrocito mielinizante maduro). En algunos casos, un agente potencia o aumenta la diferenciación de las OPC cuando aumenta el porcentaje de OPC (por ejemplo, en una muestra que comprende una pluralidad de OPC) que se diferencian en un destino de células mielinizantes maduras en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, o más en comparación con el porcentaje de OPC que se diferencian en el destino de células mielinizantes maduras en ausencia del agente.

1. Ensayos de marcadores

En algunos casos, los agentes que estimulan el aumento de la mielinización de los nervios se identifican mediante la detección para la inducción de marcadores de oligodendrocitos mielinizantes maduros. En algunos casos, las muestras que comprenden una pluralidad de OPC se ponen en contacto con un agente candidato, se incuban en condiciones adecuadas para la diferenciación de las OPC, y se evalúa la presencia o ausencia de uno o más marcadores de oligodendrocitos mielinizantes maduros. Los ejemplos de marcadores de oligodendrocitos mielinizantes maduros incluyen, pero sin limitación, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG), 2'3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP), GalC, O1 u O4.

Los marcadores de oligodendrocitos mielinizantes maduros pueden detectarse usando cualquier número de técnicas analíticas establecidas. Por ejemplo, la detección se puede realizar detectando los niveles de ácido nucleico (por ejemplo, mediante hibridación in situ o RT-PCR) o proteína (por ejemplo, mediante inmunoensayo o análisis de transferencia Western), seguido de la visualización y/o cuantificación usando uno cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. En algunos casos, un marcador de oligodendrocitos mielinizantes maduros se detecta mediante hibridación in situ. Las técnicas de hibridación in situ se describen en general en “In Situ Hybridization: A Practical Approach” (Wilkinson, D. G., ed.), Oxford University Press, 1992. En algunos casos, un marcador de oligodendrocitos mielinizantes maduros se detecta mediante inmunoensayo. Las técnicas y los protocolos de inmunoanálisis se describen en general en Price y Newman, “Principles and Practice of Immunoassay”, 2.a edición, Grove's Dictionaries, 1997; y Gosling, “ Immunoassays: A Practical Approach”, Oxford University Press, 2000. En algunos casos, el inmunoensayo es un ensayo de inmunofluorescencia.

Se puede usar una fracción detectable en los ensayos descritos en el presente documento. Se puede usar una amplia variedad de fracciones detectables, dependiendo la elección del marcador de la sensibilidad necesaria, la facilidad de conjugación con el anticuerpo, las necesidades de estabilidad y las disposiciones disponibles de instrumentación y eliminación. Las fracciones detectables adecuadas incluyen, pero sin limitación, radionúclidos, tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™, rodamina, Texas red, isotiocinato de tetrarodimina (TRITC), Cy3, Cy5, etc.), marcadores fluorescentes (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), ficoeritrina, etc.), compuestos fluorescentes autoinactivados que son activados por proteasas asociadas a tumores, enzimas (por ejemplo, luciferasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.), nanopartículas, biotina, digoxigenina y similares.

2. Células y reactivos

Las detecciones principales para la identificación de agentes que inducen la diferenciación de las OPC y/o estimulan el aumento de la mielinización de los nervios se pueden realizar en ensayos basados en células usando estirpes celulares cultivadas u OPC derivadas de un sujeto (por ejemplo, de un mamífero).

Las OPC pueden derivarse de cualquiera de una variedad de fuentes. En algunos casos, las OPC se extraen de un tejido, por ejemplo, tejido cerebral, tejido de la médula espinal o tejido del nervio óptico. El tejido puede ser de un roedor (por ejemplo, rata o ratón), pollo, perro, gato, conejo, vaca, oveja, cabra o primate (por ejemplo, un mono, un chimpancé o un ser humano). En algunos casos, las OPC se derivan de tejido fetal. En algunos casos, Las OPC se derivan de tejido adulto. Como alternativa, las OPC pueden derivarse del cultivo de células madre (por ejemplo, células madre neuronales o células madre embrionarias) o de otras células que pueden inducirse para dar lugar a OPC (por ejemplo, células estromales de médula ósea).

Los ejemplos de condiciones adecuadas para la diferenciación de las OPC se describen en el apartad de ejemplos que figura a continuación. Las condiciones del cultivo celular se describen con más detalle, por ejemplo, en Picot, “Human Cell Culture Protocols” (Methods in Molecular Medicine) 2010 ed., y en Davis, “Basic Cell Culture” 2002 ed. Las OPC se cultivan con factor de crecimiento, por ejemplo, PDGFaa. Como un ejemplo no limitante, las OPC proliferaron en cultivo sobre placas de cultivo celular recubiertas con poli-D-lisina usando los medios de OPC (medios neurobasales, complemento de B27 sin vitamina A, aminoácidos no esenciales) que contienen 30 ng/ml de PDGFaa. Para la diferenciación, se siembran las OPC en placas de cultivo celular recubiertas con poli-D-lisina usando medios de OPC que contienen 2 ng/ml de PDGFaa, y se tratan con compuestos disueltos en DMSO (< 1 % de concentración final). Las OPC que se diferencian se incuban a 37 °C, CO² al 5 % durante 6 días. Al final de los 6 días, se fijan las células con paraformaldehído al 4 % para el análisis de inmunofluorescencia o se recogen para el análisis bioquímico.

3. Agentes candidatos

Los agentes que son examinados para detectar la capacidad de potenciar la diferenciación de las OPC pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o una entidad biológica, tal como un polipéptido, azúcar, ácido nucleico o lípido. Por lo general, los compuestos de ensayo serán moléculas químicas y péptidos pequeños. Se puede usar esencialmente cualquier compuesto químico como un posible modulador o ligando en los ensayos de la divulgación, aunque la mayoría de las veces se usan compuestos que pueden disolverse en soluciones acuosas u orgánicas (en especial, basadas en DMSO). Los ensayos están diseñados para detectar grandes colecciones de compuestos químicos mediante la automatización de las etapas del ensayo y el suministro de compuestos de cualquier fuente conveniente para los ensayos, que normalmente se ejecutan en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtitulación de placas de microtitulación en ensayos de robótica). Se apreciará que hay muchos proveedores de compuestos químicos, entre los que se incluyen Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza) y similares.

En algunos casos, los agentes tienen un peso molecular inferior a 1.500 Da, y en algunos casos, inferior a 1.000, 800, 600, 500 o 400 Da. Se puede desear un tamaño relativamente pequeño de los agentes, porque las moléculas más pequeñas tienen una mayor probabilidad de tener propiedades fisicoquímicas compatibles con buenas características farmacocinéticas, incluyendo la absorción oral que los agentes con mayor peso molecular. Por ejemplo, los agentes con menor probabilidad de éxito como fármacos basados en la permeabilidad y la solubilidad fueron descritos por Lipinski et al. de la siguiente manera: los que tienen más de 5 donantes de enlaces H (expresados como la suma de OH y NH); los que tienen un peso molecular superior a 500; los que tienen un LogP superior a 5 (o MLogP superior a 4,15); y/o los que tienen más de 10 aceptadores de enlaces H (expresados como la suma de N y O). Véase, por ejemplo, Lipinski et al., Adv Drug Delivery Res 23:3-25 (1997). Las clases de compuestos que son sustratos para transportadores biológicos suelen ser excepciones a la regla.

En algunos casos, los agentes son de una colección combinatoria de compuestos químicos o de péptidos que contiene un gran número de posibles compuestos terapéuticos (posibles compuestos moduladores o ligandos). Dichas “colecciones combinatorias de compuestos químicos” o “colecciones de ligandos” se exploran luego en uno o más ensayos, como se describe en el presente documento, para identificar aquellos miembros de la colección (especies o subclases químicas particulares) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como “compuestos líder” convencionales o pueden usarse ellos mismos como agentes terapéuticos potenciales o reales.

Una colección combinatoria de compuestos químicos es una colección de diversos compuestos químicos generados mediante cualquiera de entre la síntesis química o la síntesis biológica, mediante la combinación de un número de “componentes básicos” químicos. Por ejemplo, una colección combinatoria lineal de compuestos químicos tal como una colección de polipéptidos se forma combinando un conjunto de componentes básicos químicos (aminoácidos) de todas las formas posibles para una longitud de compuesto dada (es decir,el número de aminoácidos de un compuesto polipeptídico). Se pueden sintetizar millones de compuestos químicos a través de dicha mezcla combinatoria de componentes básicos químicos.

La preparación y exploración de colecciones combinatorias de compuestos químicos son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas colecciones combinatorias de compuestos químicos incluyen, pero sin limitación, colecciones de péptidos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991) y Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)). También se pueden usar otras químicas para generar colecciones de diversidad química. Dichas químicas incluyen, aunque no de forma limitante: peptoides (por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, la publicación PCT n.° W o 93/20242), biooligómeros aleatorios (por ejemplo, publicación PCT n.° WO 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 90:6909-6913 (1993)), Polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc.

114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con armazón de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc.

114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de colecciones de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303 (1993)) y/o peptidil fosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), colecciones de ácidos nucleicos (véase Ausubel, Berger y Sambrook, todas supra), colecciones de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. n.° 5.539.083), colecciones de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 1522 (1996) y la patente de EE.UU. n.° 5.593.853), colecciones de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 de enero, página 33 (1993); isoprenoides, la patente de Estados Unidos n.° 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, la patente de Estados Unidos n.° 5.549.974; pirrolidinas, patentes de Estados Unidos n.° 5.525.735 y n.° 5.519.134; compuestos de morfolino, la patente de Estados Unidos n.° 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514, y similares).

Los dispositivos para la preparación de colecciones combinatorias están disponibles en el mercado (véase, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Además, hay numerosas colecciones combinatorias disponibles en el mercado (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N. J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

En algunos casos, los agentes candidatos son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. En algunos casos, los agentes candidatos tienen un bajo peso molecular (es decir,un peso molecular no superior a 800 kDa). En algunos casos, los agentes candidatos se examinan para detectar uno o más criterios distintos, tales como la toxicidad o la farmacocinética cerebral.

4. Validación

Los agentes que se identifican inicialmente mediante cualquiera de los métodos de detección anteriores se pueden ensayar además para validar la actividad aparente. En algunos casos, los ensayos de validación son ensayos in vitro.

En algunos casos, dichos estudios se realizan con modelos animales adecuados. El formato básico de dichos métodos consiste en administrar un compuesto líder identificado durante un análisis inicial a un animal que sirve como modelo de enfermedad para los seres humanos y luego determinar si la enfermedad (por ejemplo, una enfermedad desmielinizante) está efectivamente modulada y/o si la enfermedad o afección se mejora. En general, los modelos animales usados en los estudios de validación son mamíferos de cualquier tipo. Los ejemplos específicos de animales adecuados incluyen, pero sin limitación, primates, ratones, ratas y pez cebra.

III. Uso de agentes moduladores de los receptores de neurotransmisores

Los agentes moduladores de los receptores de neurotransmisores descritos en el presente documento se pueden usar en diversos métodos terapéuticos y/o profilácticos. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para inducir la diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en un destino de células mielinizantes maduras (por ejemplo, oligodendrocitos mielinizantes). En algunos casos, el método comprende poner en contacto las OPC con un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento y cultivar las OPC en condiciones adecuadas para la diferenciación de las mismas. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores se selecciona entre un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista de receptor de la dopamina, un antagonista de receptor de la histamina, un modulador de receptor betaadrenérgico y/o un modulador de receptor de opioides. En algunos casos, la OPC se cultiva en presencia del agente modulador de receptores de neurotransmisores durante al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días o más en condiciones adecuadas para la diferenciación de las OPC. La diferenciación en un destino de células mielinizantes maduras puede determinarse detectando la presencia de uno o más marcadores biológicos de oligodendrocitos mielinizantes maduros. Los ensayos de marcadores para detectar la presencia o el nivel de oligodendrocitos mielinizantes se describen en el presente documento, por ejemplo, en el apartado II (B) anterior.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para estimular el aumento de la mielinización de los nervios en un sujeto en necesidad del mismo. En algunos casos, el método comprende administrar al sujeto un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento; estimulando así el aumento de la mielinización de los nervios en el sujeto. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es un compuesto seleccionado entre un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista de receptor de la dopamina, un antagonista de receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico y/o un modulador de receptor de opioides.

En algunos casos, un sujeto en necesidad de un método para estimular el aumento de la mielinización de los nervios es un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante. Por lo tanto, en otro aspecto más, la presente divulgación proporciona métodos para tratar y/o mejorar un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante. En algunos casos, un sujeto que necesita un método para estimular un aumento de la mielinización de los nervios es un sujeto con riesgo de tener una enfermedad desmielinizante. Por lo tanto, en otro aspecto más, la presente divulgación proporciona métodos para prevenir una enfermedad desmielinizante o retrasar la aparición de una enfermedad desmielinizante.

En algunos casos, el método comprende administrar al sujeto un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado entre un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista de receptor de la dopamina, un antagonista de receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico y/o un modulador de receptor de opioides. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es un compuesto enumerado en la Tabla 1 (por ejemplo, un compuesto modulador de receptor muscarínico, compuesto modulador de receptor de la dopamina, compuesto modulador de receptor de la histamina, compuesto modulador de receptor betaadrenérgico o compuesto modulador de receptor de opioides enumerados en la T abla 1). En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina, cerbetapentana, clemastina, el pindolol, ipratropio, atropina, GBR12935, Snc-80, BD-1047, salmeterol, albuterol o trifluoperazina, o una de sus sales. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina, o una de sus sales. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina).

En algunos casos, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el virus linfotrópico de linfocitos T humano (HTLV).

En algunos casos, la enfermedad desmielinizante es esclerosis múltiple (EM). Existen varios subtipos de EM, que incluyen la esclerosis múltiple recurrente y remitente (EMRR), esclerosis múltiple secundaria progresiva (EMSP), esclerosis múltiple primaria progresiva (EMPP) y esclerosis múltiple con recaídas progresivas (EMP). En algunos casos, el sujeto tiene EMRR. En algunos casos, el sujeto tiene EMSP. En algunos casos, el sujeto tiene EMPP. En algunos casos, el sujeto tiene EMP. Inicialmente, se puede diagnosticar que un sujeto tiene un subtipo de EM (por ejemplo, EMRR) y, posteriormente, el subtipo de EM que afecta al sujeto puede convertirse en otro subtipo de EM (por ejemplo, de EMRR a EMSP). Se contempla que los métodos de la presente divulgación se pueden aplicar para tratar a un sujeto cuyo subtipo de EM se convierte en otro subtipo de EM.

En algunos casos, un sujeto que lo necesita (por ejemplo, un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante o que está en riesgo de tener una enfermedad desmielinizante) recibe un agente modulador de receptores de neurotransmisores en combinación con al menos otra terapia. En algunos casos, la al menos otra terapia es un agente inmunomodulador. Como se usa en el presente documento, un “agente inmunomodulador” se refiere a un fármaco modificador de la enfermedad que altera el curso de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el HTLV).

En algunos casos, un agente inmunomodulador es un fármaco modificador de la enfermedad que altera el curso de la esclerosis múltiple (por ejemplo, EMRR, EMSP, EMPP o EMP). Por ejemplo, un fármaco que modifica la enfermedad puede reducir la frecuencia o la gravedad de una recaída de la EM y/o reducir el desarrollo de lesiones o cicatrices en regiones de desmielinización. En algunos casos, un agente inmunomodulador es un inmunosupresor (es decir, un agente que suprime o previene una respuesta inmunitaria). En algunos casos, un agente inmunomodulador es un agente que modula una respuesta inmunitaria (por ejemplo, estimulando la inducción de linfocitos T supresores). Los ejemplos de agentes inmunomoduladores para el tratamiento de la EM incluyen, pero sin limitación, interferones (por ejemplo, interferón-p, por ejemplo, interferón beta-1a o interferón beta-ib), acetato de glatiramer, mitoxantrona, fingolimod (FTY720) o anticuerpos monoclonales (por ejemplo, natalizumab, rituximab, daclizumab o alemtuzumab). Por lo tanto, en algunos casos, el método de la presente divulgación comprende administrar a un sujeto que tiene EM un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un compuesto seleccionado de un antagonista del receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un antagonista del receptor beta-adrenérgico y un modulador del receptor de opioides) en combinación con fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, natalizumab, rituximab, daclizumab o alemtuzumab.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para potenciar el efecto terapéutico de un agente inmunomodulador en un sujeto en necesidad del mismo. Se ha encontrado que, sorprendentemente, en modelos de enfermedad desmielinizante en ratones, la administración de una combinación de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador produce una disminución significativamente mayor en la gravedad clínica de la enfermedad desmielinizante en comparación con la disminución de la gravedad clínica de la enfermedad desmielinizante que puede lograrse con el agente modulador de receptores de neurotransmisores o el agente inmunomodulador solo. Por lo tanto, en algunos casos, el método comprende administrar a un sujeto un agente inmunomodulador y un agente modulador de receptores de neurotransmisores; potenciando así el efecto terapéutico del agente inmunomodulador en el sujeto. En algunos casos, el sujeto tiene una enfermedad desmielinizante o está en riesgo de tener una enfermedad desmielinizante.

Además, también ha encontrado que, sorprendentemente, la administración de un agente modulador de receptores de neurotransmisores, en combinación con un agente inmunomodulador a una dosis que, por sí misma, es insuficiente para ser terapéutica para el tratamiento de una enfermedad desmielinizante, produce u efecto terapéutico que es mayor que el efecto terapéutico de administrar cada agente solo. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que lo necesita mediante la administración de un agente inmunomodulador y un agente modulador de receptores de neurotransmisores, en los que el agente inmunomodulador se administra a una dosis subterapéutica. En algunos casos, el sujeto tiene una enfermedad desmielinizante o está en riesgo de tener una enfermedad desmielinizante.

En algunos casos, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el HTLV. En algunos casos, la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple, por ejemplo, esclerosis múltiple recurrente y remitente (EMRR), esclerosis múltiple secundaria progresiva (EMSP), esclerosis múltiple primaria progresiva (EMPP) o esclerosis múltiple con recaídas progresivas (EMP). En algunos casos, inicialmente, se diagnostica que un sujeto tiene un subtipo de EM (por ejemplo, EMRR) y, posteriormente, el subtipo de EM que afecta al sujeto se convierte en otro subtipo de EM (por ejemplo, de EMRR a EMSP).

En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores se selecciona entre un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador del receptor beta-adrenérgico y un modulador del receptor de opioides, y el agente inmunomodulador se selecciona entre fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, natalizumab, rituximab, daclizumab y alemtuzumab. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es un compuesto modulador de receptor muscarínico, un compuesto modulador de receptor de la dopamina, un compuesto modulador de receptor de la histamina, un compuesto modulador del receptor betaadrenérgico o un compuesto modulador del receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, y el inmunosupresor es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, natalizumab, rituximab, daclizumab o alemtuzumab. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol o trifluoperazina, o una sal de los mismos, y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, natalizumab, rituximab, daclizumab o alemtuzumab. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es benztropina y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b.

Las dosis terapéuticas para los agentes inmunomoduladores fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona y natalizumab se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kappos et al., N Engl J Med 362:387-401 (2010); Cohen et al., N Engl J Med 362:402-15 (2010); Gottesman et al., Mult Scler 12:271-80 (2006); Hurwitz et al., Clin Ther 30:1102-12 (2008); Gaindh et al., Expert Opin Biol Ther 8:1823-29 (2008); Koch-Henriksen et al., Neurology 66:1056-60 (2006); Benatar, Lancet 360:1428 (2008); Jacobs et al., Ann Neurol 39:285-94 (1996); Lancet 352:1498-1504 (1998); Johnson et al., Neurology 45:1268-76 (1995); Johnson et al., Neurology 50:701-08 (1998); Comi et al., Ann Neurol. 69:75-82 (2011); Calabresi Nat Clin Pract Neurol 3:540-1 (2007); y Polman et al., N Engl J Med 354:899-910 (2006).

En algunos casos, el agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, el agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) se administra a una dosis subterapéutica, por ejemplo, a una dosis que es inferior a aproximadamente un 75 %, inferior a aproximadamente un 70 %, inferior a aproximadamente un 60 %, inferior a aproximadamente un 50 %, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 25 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 15 %, inferior a aproximadamente un 10 % o inferior a aproximadamente un 5 % de la dosis que se administra convencionalmente para el agente inmunomodulador.

Fingolimod (FTY720) se administra convencionalmente a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,5 mg al día a aproximadamente 1,5 mg al día (por ejemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,4 o aproximadamente 1,5 mg al día). Véase, por ejemplo, Kappos et al., N Engl J Med 362:387-401 (2010). Por lo tanto, en algunos casos, una dosis subterapéutica de fingolimod es de aproximadamente 0,005 mg al día a aproximadamente 0,375 mg al día (por ejemplo, aproximadamente 0,005, aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,02, aproximadamente 0,03, aproximadamente 0,04, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,06, aproximadamente 0,07, aproximadamente 0,08, aproximadamente 0,09, aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,15, aproximadamente 0,2, aproximadamente 0,25, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,35 o aproximadamente 0,375 mg al día).

El interferón beta-1a se administra convencionalmente a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 30 |jg a la semana. Véase, por ejemplo, Jacobs et al., Ann Neurol 39:285-94 (1996). Por lo tanto, en algunos casos, una dosis subterapéutica de interferón beta-1a es de aproximadamente 0,3 jg a la semana a aproximadamente 23 jg a la semana (por ejemplo, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,75, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22 o aproximadamente 23 jg a la semana).

El interferón beta-1b se administra convencionalmente a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 250 jg cada dos días a aproximadamente 500 jg cada dos días. Véanse, por ejemplo, Gottesman et al., Mult Scler 12:271-80 (2006). Por lo tanto, en algunos casos, una dosis subterapéutica de interferón beta-1b es de aproximadamente 2 jg cada dos días a aproximadamente 190 jg cada dos días (por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180 o aproximadamente 190 jg cada dos días).

En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, antagonista de receptor muscarínico, antagonista de receptor de la dopamina, antagonista de receptor de la histamina, modulador de receptor beta-adrenérgico o modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1) se administra una dosis subterapéutica, por ejemplo, a una dosis que es inferior a aproximadamente un 75 %, inferior a aproximadamente un 70 %, inferior a aproximadamente un 60 %, inferior a aproximadamente un 50 %, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 25 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 15 %, inferior a aproximadamente un 10 % o inferior a aproximadamente un 5 % de la dosis que se administra convencionalmente para el agente modulador de los receptores de neurotransmisores. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores que se administra a una dosis terapéuticamente eficaz o a una dosis subterapéutica es la benztropina, la clemastina, el salmeterol, el salbutamol, la trifluoperazina o una de sus sales. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores que se administra a una dosis terapéuticamente eficaz o a una dosis subterapéutica es la benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina). Como un ejemplo no limitante, una dosis terapéuticamente eficaz de benztropina puede ser de aproximadamente 1 mg al día a aproximadamente 10 mg al día (por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 mg al día). Por lo tanto, en algunos casos, una dosis subterapéutica de benztropina puede ser de aproximadamente 0,01 mg al día a aproximadamente 0,75 mg al día (por ejemplo, aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,10, aproximadamente 0,015, aproximadamente 0,20, aproximadamente 0,25, aproximadamente 0,30, aproximadamente 0,35, aproximadamente 0,40, aproximadamente 0,45, aproximadamente 0,50, aproximadamente 0,55, aproximadamente 0,60, aproximadamente 0,65, aproximadamente 0,70 o aproximadamente 0,75 mg al día).

En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y se administra un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es la benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina) y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b. En algunos casos, la benztropina se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 1 mg al día a aproximadamente 10 mg al día; el fingolimod se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,5 mg al día a aproximadamente 1,5 mg al día; el interferón beta-1a se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 30 |jg a la semana; y/o el interferón beta-1b se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 250 jg cada dos días a aproximadamente 500 jg cada dos días.

En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y se administra un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) se administra a una dosis subterapéutica, por ejemplo, a una dosis que es inferior a aproximadamente un 75 %, inferior a aproximadamente un 70 %, inferior a aproximadamente un 60 %, inferior a aproximadamente un 50 %, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 25 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 15 %, inferior a aproximadamente un 10 % o inferior a aproximadamente un 5 % de la dosis que se administra convencionalmente para el agente inmunomodulador. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es la benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina) y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b. En algunos casos, la benztropina se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 1 mg al día a aproximadamente 10 mg al día; el fingolimod se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 0,005 mg al día a aproximadamente 0,375 mg al día; el interferón beta-1a se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 0,3 jg a la semana a aproximadamente 23 jg a la semana; y/o el interferón beta-1b se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 2 jg cada dos días a aproximadamente 190 jg cada dos días.

En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, antagonista de receptor muscarínico, antagonista de receptor de la dopamina, antagonista de receptor de la histamina, modulador de receptor beta-adrenérgico o modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis subterapéutica, por ejemplo , a una dosis que es inferior a aproximadamente un 75 %, inferior a aproximadamente un 70 %, inferior a aproximadamente un 60 %, inferior a aproximadamente un 50 %, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 25 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 15 %, inferior a aproximadamente un 10 % o inferior a aproximadamente un 5 % de la dosis que se administra convencionalmente para el agente modulador de los receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es la benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina) y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b. En algunos casos, la bentropina se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 0,01 mg al día a aproximadamente 0,75 mg al día; el fingolimod se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,5 mg al día a aproximadamente 1,5 mg al día; el interferón beta-1a se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 30 jg a la semana; y/o el interferón beta-1b se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 250 jg cada dos días a aproximadamente 500 jg cada dos días.

En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, antagonista de receptor muscarínico, antagonista de receptor de la dopamina, antagonista de receptor de la histamina, modulador de receptor beta-adrenérgico o modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, el salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis subterapéutica, por ejemplo , a una dosis que es inferior a aproximadamente un 75 %, inferior a aproximadamente un 70 %, inferior a aproximadamente un 60 %, inferior a aproximadamente un 50 %, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 25 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 15 %, inferior a aproximadamente un 10 % o inferior a aproximadamente un 5 % de la dosis que se administra convencionalmente para el agente modulador de los receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) se administra a una dosis subterapéutica, por ejemplo , a una dosis que es inferior a aproximadamente un 75 %, inferior a aproximadamente un 70 %, inferior a aproximadamente un 60 %, inferior a aproximadamente un 50 %, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 25 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 15 %, inferior a aproximadamente un 10 % o inferior a aproximadamente un 5 % de la dosis que se administra convencionalmente para el agente inmunomodulador. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores es la benztropina o una sal de la misma (por ejemplo, mesilato de benztropina) y el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a o interferón beta-1b. En algunos casos, la bentropina se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 0,01 mg al día a aproximadamente 0,75 mg al día; el fingolimod se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 0,005 mg al día a aproximadamente 0,375 mg al día; el interferón beta-1a se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 0,3 |jg a la semana a aproximadamente 23 |jg a la semana; y/o el interferón beta-1b se administra a una dosis subterapéutica de aproximadamente 2 jg cada dos días a aproximadamente 190 jg cada dos días.

En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y se administra un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) a una dosis terapéuticamente eficaz. para el tratamiento o la prevención de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple). En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor betaadrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y se administra un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) a una dosis subterapéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple). En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis subterapéutica y se administra un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) a una dosis terapéuticamente eficaz. para el tratamiento o la prevención de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple). En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores (por ejemplo, un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico o un modulador de receptor de opioides enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina o una de sus sales) se administra a una dosis subterapéutica y se administra un agente inmunomodulador (por ejemplo, fingolimod, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab) a una dosis subterapéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple).

IV. Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el virus linfotrópico de linfocitos T humano (HTLV)). En algunos casos, la composición comprende una mezcla de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado de un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista del receptor de la dopamina, un antagonista del receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico y un modulador de receptor de opioides y un agente inmunomodulador seleccionado entre interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, fingolimod (FTY720), natalizumab, rituximab, daclizumab y alemtuzumab. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado entre benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina y sales de los mismos, y un agente inmunomodulador seleccionado entre interferón beta-la, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, fingolimod (FTY720), natalizumab, rituximab, daclizumab y alemtuzumab. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende benztropina o una de sus sales y un agente inmunomodulador seleccionado entre interferón beta-1a, interferón beta-1b y fingolimod (FTY720).

En algunos casos, uno o ambos del agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador se formulan como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima. En algunos casos, uno o ambos del agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador se formulan como una dosis subterapéutica. En algunos casos, el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima y el agente inmunomodulador se formula como una dosis subterapéutica. En algunos casos, el agente inmunomodulador se formula como una dosis terapéuticamente eficaz u óptima y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis subterapéutica. Los intervalos de dosificación adecuados para las dosis terapéuticamente eficaz y la dosis subterapéutica de los agentes moduladores de receptores de neurotransmisores y los agentes inmunomoduladores se han descrito anteriormente.

Un agente para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos de la presente divulgación (por ejemplo, un agente que estimula el aumento de la mielinización como se describe en el presente documento o un agente inmunomodulador como se describe en el presente documento) pueden estar en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquiera de las sales farmacéuticamente aceptables, profármacos, mezclas racémicas, isómeros conformacionales y/u ópticos, polimorfos cristalinos y variantes isotópicas de los agentes moduladores de receptores de neurotransmisores.

Una combinación de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador se puede incorporar en una variedad de formulaciones para la administración terapéutica o profiláctica. Más particularmente, una combinación de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador puede formularse en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, una sola composición, mediante formulación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados, y puede formularse en preparados en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, grageas, geles, suspensiones, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles. Por tanto, la administración de un agente se puede realizar de varias maneras, que incluyen la administración oral, bucal, parenteral, intravenosa, Intradérmica (por ejemplo, subcutánea, intramuscular), transdérmica, etc. Por otra parte, el agente se puede administrar de una forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, en una formulación en depósito o de liberación sostenida.

Formulaciones

Se hallan formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención en Remington: “The Science and Practice of Pharmacy”, 21a Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2003). Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden fabricar de una forma que es conocida por los expertos en la materia, es decir, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsionado, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Los siguientes métodos y excipientes son simplemente ilustrativos y no son limitantes en modo alguno.

En algunos casos, un agente se prepara para la administración en una formulación de liberación sostenida, liberación controlada, liberación prolongada, liberación temporizada o liberación retardada, por ejemplo, en matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Diversos tipos de materiales de liberación sostenida han quedado establecidos y son bien conocidos por los expertos en la materia. Las formulaciones de liberación prolongada actuales incluyen comprimidos recubiertos con película, sistemas multiparticulados o de microgránulos, tecnologías de matriz que usan materiales hidrófilos o lipófilos y comprimidos a base de cera con excipientes de formación de poros (véase, por ejemplo, Huang, et al. Drug Dev. Ind. Pharm. 29:79 (2003); Pearnchob, et al. Drug Dev. Ind. Pharm. 29:925 (2003); Maggi, et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 55:99 (2003); Khanvilkar, et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 228:601 (2002); y Schmidt, et al., Int. J. Pharm. 216:9 (2001)). Los sistemas de administración de liberación sostenida pueden, dependiendo de su diseño, liberar los compuestos con el transcurso de horas o días, por ejemplo, durante 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 horas o más. Normalmente, las formulaciones de liberación sostenida se pueden preparar usando polímeros de origen natural o sintéticos, por ejemplo, vinilpirrolidonas poliméricas, tales como polivinilpirrolidona (PVP); polímeros hidrófilos de carboxivinilo; hidrocoloides hidrófobos e/o hidrófilos, tales como metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa; y carboxipolimetileno.

Las formulaciones de liberación sostenida o prolongada también se pueden preparar usando ingredientes naturales, tales como minerales, incluyendo dióxido de titanio, dióxido de silicio, óxido de cinc y arcilla (véase, Patente de Estados Unidos n.° 6.638.521). Las formulaciones de liberación prolongada a modo de ejemplo que se pueden usar en la administración de un compuesto incluyen las que se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 6.635.680; 6.624.200; 6.613.361; 6.613.358, 6.596.308; 6.589.563; 6.562.375; 6.548.084; 6.541.020; 6.537.579; 6.528.080 y 6.524.621. Las formulaciones de liberación controlada de particular interés incluyen las que se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 6.607.751; 6.599.529; 6.569.463; 6.565.883; 6.482.440; 6.403.597; 6.319.919; 6.150.354; 6.080.736; 5.672.356; 5.472.704; 5.445.829; 5.312.817 y 5.296.483. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente otras formulaciones de liberación sostenida aplicables.

Las formulaciones farmacéuticas se pueden proporcionar como una sal y pueden formarse con muchos ácidos, incluyendo, pero sin limitación, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solución acuosa u otros disolventes protónicos que son las correspondientes formas de base libre. En otros casos, el preparado puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, sacarosa al 0,1 %-2 %, manitol al 2%-7 % a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con el tampón antes de su uso.

Para la administración oral, se puede formular fácilmente un agente combinando con vehículos farmacéuticamente aceptables que son bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos posibilitan que los compuestos se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, emulsiones, suspensiones lipófilas e hidrófilas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, suspensiones y similares, para su ingestión oral por un paciente que se va a tratar. Los preparados farmacéuticos para su uso oral se pueden obtener al mezclar los compuestos con un excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como una polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Los preparados farmacéuticos que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los principios activos mezclados con carga, tal como lactosa, aglutinantes, tales como almidones y/o lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para dicha administración.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin, pueden usarse soluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o grageas para la identificación o para caracterizar combinaciones distintas de dosis de compuesto activo.

Los agentes se pueden formular para su administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Para la inyección, el compuesto se puede formular en preparaciones al disolver, suspender o emulsionar el mismo en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se desea, con aditivos convencionales, tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes. En algunos casos, un agente se puede formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Las formulaciones para su inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para su administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los agentes activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los agentes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosa adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la emulsión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. Como alternativa, el principio activo se puede encontrar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes de su uso.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosa o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes penetrantes adecuados para la barrera que va a permearse. Para la administración tópica, los agentes se formulan en pomadas, cremas, salvias, polvos y geles. En un caso, el agente de administración transdérmica puede ser DMSO. Los sistemas de administración transdérmica pueden incluir, por ejemplo, parches. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación agentes penetrantes adecuados para la barrera que va a permearse. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica. Las formulaciones de administración transdérmica a modo de ejemplo que pueden hallar uso en la presente divulgación incluyen las que se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 6.589.549; 6.544.548; 6.517.864; 6.512.010; 6.465.006; 6.379.696; 6.312.717 y 6.310.177.

Para la administración bucal, los agentes pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas para chupar, formuladas de una forma convencional.

Además de las formulaciones descritas previamente, un agente también puede formularse como un preparado de liberación prolongada. Dichas formulaciones de larga duración pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los agentes pueden formularse con materiales poliméricos adecuados o hidrófobos (por ejemplo en forma de una emulsión en aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados poco solubles, por ejemplo, una sal muy poco soluble.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes adecuados en fase sólida o de gel. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitación, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad terapéuticamente eficaz. La presente divulgación también contempla composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos moduladores de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento con una cantidad eficaz de otros agentes terapéuticos como parejas de combinación, en particular, los usados para tratar enfermedades desmielinizantes, tales como agentes inmunomoduladores. Una cantidad eficaz del agente y/o componente de combinación será, por supuesto, dependiente del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la dolencia y la forma de administración. La determinación de una cantidad eficaz se encuentra claramente dentro de las capacidades de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento. En general, una cantidad eficaz o efectiva de un agente se determina al administrar en primer lugar una dosis baja o una cantidad pequeña, y después aumentar en incrementos la dosis o las dosificaciones administradas hasta que se observa un efecto terapéutico deseado en el sujeto tratado, sin efectos secundarios tóxicos o con efectos secundarios tóxicos mínimos. Los métodos aplicables para determinar una dosis y pauta posológica apropiadas para su administración se describen, por ejemplo, en “The Pharmacological Basis of Therapeutics” de Goodman y Gilman, 11a Ed., Brunton, Lazo y Parker, Eds., McGraw-Hill (2006), y en Remington: “The Science and Practice of Pharmacy”, 21a Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2003). En algunos casos, uno o ambos de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador se formulan en una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, uno o ambos de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador se formulan en una dosis subterapéutica. En algunos casos, un agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula en una dosis terapéuticamente eficaz y un agente inmunomodulador se formula en una dosis subterapéutica. En algunos casos, un agente inmunomodulador se formula en una dosis terapéuticamente eficaz y un agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula en una dosis subterapéutica.

El preparado farmacéutico está preferentemente en una forma farmacéutica unitaria. En dicha forma, el preparado se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades concretas de preparación, tales como comprimidos envasados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. Asimismo, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, un comprimido, una oblea o una pastilla para chupar, o puede ser el número adecuado de cualquiera de estas en forma envasada.

Adm inistración

La administración de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y/o un agente inmunomodulador se puede realizar de varias maneras, que incluyen la administración oral, bucal, parenteral, incluyendo intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, transdérmica, transmucosa, intranasal, etc. Cuando se administran simultáneamente un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador, el agente modulador de receptores de neurotransmisores puede administrarse por la misma o diferente vía de administración que el agente inmunomodulador. En algunos casos, un compuesto (por ejemplo, un agente modulador de receptores de neurotransmisores y/o un agente inmunomodulador) se administra sistémicamente.

Las dosis y la frecuencia de administración dependerán de diversos factores generalmente apreciados por los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, la gravedad de la enfermedad de un paciente. En general, las dosis diarias pueden variar de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal total, de aproximadamente 0,01 a 50 mg/kg o de aproximadamente 0,01 mg/kg a 10 mg/kg. Sin embargo, las dosis en el intervalo de 10 a 500 mg/kg al día pueden ser eficaces y bien toleradas. El principal factor determinante para definir la dosis apropiada es la cantidad de un determinado compuesto necesaria para ser terapéuticamente eficaz en un determinado contexto. Se pueden requerir administraciones repetidas para lograr una tolerancia inmunitaria más duradera. Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con niveles de dosis y el patrón seleccionado por el tratamiento médico.

En algunos casos, un compuesto (por ejemplo, un agente modulador de receptores de neurotransmisores y/o un agente inmunomodulador) se administra a un sujeto en necesidad del mismo durante un período prolongado de tiempo. Los métodos se pueden llevar a cabo durante al menos 20 días, en algunos casos durante al menos 40, 60, 80 o 100 días, y en algunos casos durante al menos 150, 200, 250, 300, 350 días, 1 año o más. En algunos casos, un compuesto (por ejemplo, un agente modulador de receptores de neurotransmisores y/o un agente inmunomodulador) se administra a un sujeto que lo necesite en el momento o después del inicio de uno o más síntomas de una enfermedad desmielinizante. En algunos casos, se administra un compuesto (por ejemplo, un agente modulador de receptores de neurotransmisores y/o un agente inmunomodulador) a un sujeto que lo necesita antes del inicio de los síntomas de una enfermedad desmielinizante (es decir, profilácticamente).

Adm inistración simultánea

En algunos casos, los métodos de la presente divulgación son una administración simultánea de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador. Los agentes administrados simultáneamente pueden administrarse juntos o por separado, simultáneamente o en diferentes momentos. Cuando se administran, el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador pueden administrarse independientemente una, dos, tres, cuatro veces al día, o más o menos a menudo, según sea necesario. En algunos casos, los agentes se administran una vez al día. En algunos casos, los agentes se administran al mismo tiempo o tiempos, por ejemplo, como una mezcla. Uno o más de los agentes pueden administrarse en una formulación de liberación sostenida.

En algunos casos, la administración simultánea incluye administrar un principio activo en 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, o 24 horas de un segundo principio activo. La administración simultánea incluye administrar dos principios activos simultáneamente, de forma aproximadamente simultánea (por ejemplo, en aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, o 30 minutes entre sí), o secuencialmente en cualquier orden. En algunos casos, la administración simultánea puede realizarse mediante la formulación simultánea, es decir, la preparación de una única composición farmacéutica que incluye ambos agentes activos (es decir, el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador se administran como una sola formulación). En otros casos, los agentes activos pueden formularse por separado (es decir, el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador se administran como formulaciones separadas). En otro caso, los agentes activos y/o adyuvantes pueden estar enlazados o conjugados entre sí.

En algunos casos, uno o ambos de un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador pueden administrarse profilácticamente para prevenir la recurrencia no deseada de los síntomas de la enfermedad desmielinizante (por ejemplo, para prevenir o retrasar la recurrencia de ataques clínicos en la EM), o terapéuticamente para lograr una reducción deseada de los síntomas de la enfermedad desmielinizante y mantener dicha reducción en los síntomas de la enfermedad desmielinizante durante un período de tiempo sostenido.

V. Kits

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona kits para su uso en el tratamiento de una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el virus linfotrópico de linfocitos T humano (HTLV)). En algunos casos, el kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado de un antagonista de receptor muscarínico, un antagonista de receptor de la dopamina, un antagonista de receptor de la histamina, un modulador de receptor beta-adrenérgico y/o un modulador de receptor de opioides. En algunos casos, el kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado de un compuesto enumerado en la Tabla 1. En algunos casos, el kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado entre benztropina, clemastina, salmeterol, salbutamol, trifluoperazina y sales de los mismos. En algunos casos, el kit comprende benztropina o una sal de la misma.

En algunos casos, un kit comprende además un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores y un agente inmunomodulador para el tratamiento de la EM (por ejemplo, interferón-p, por ejemplo, interferón beta-1a o interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, fingolimod (FTY720), natalizumab, rituximab, daclizumab o alemtuzumab). En algunos casos, el kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores seleccionado entre benztropina, clemastina, el salmeterol, salbutamol, trifluoperazina y sales de los mismos, y un agente inmunomodulador seleccionado entre interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona, fingolimod (FTY720), natalizumab, rituximab, daclizumab y alemtuzumab. En algunos casos, el kit comprende benztropina o una de sus sales y un agente inmunomodulador seleccionado entre interferón beta-1a, interferón beta-1b y fingolimod (FTY720).

En algunos casos, un kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento y un agente inmunomodulador en una sola formulación. En algunos casos, un kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento y un agente inmunomodulador en formulaciones separadas. Las formulaciones adecuadas para el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador se describen en el presente documento. En algunos casos, un kit proporciona un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento y uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, un agente inmunomodulador) independientemente en formulaciones farmacéuticas uniformes en el transcurso del tratamiento. En algunos casos, un kit proporciona un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento y uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, un agente inmunomodulador) independientemente en dosis graduadas en el transcurso del tratamiento, ya sea crecientes o decrecientes, pero, en general, aumentando hasta un nivel de dosis eficaz, de acuerdo con las necesidades de un individuo. En algunos casos, un kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento en una dosis terapéuticamente eficaz y un agente inmunomodulador en una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, un kit comprende un agente modulador de receptores de neurotransmisores como se describe en el presente documento en una dosis terapéuticamente eficaz y un agente inmunomodulador en una dosis subterapéutica.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Exploración de moléculas pequeñas para identificar inductores de diferenciación de OPC

Se realizó la exploración de moléculas pequeñas a gran escala para identificar moléculas pequeñas que potenciaran la diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en un destino mielinizante maduro. Se usaron imágenes de alto contenido para detectar la diferenciación en los pocillos de OPC derivadas del nervio óptico de rata. Se expandieron las OPC derivadas de nervio óptico de rata en masa en los medios de OPC que contenían 30 ng/ml de PDGFaa. Para detectar molécula pequeña inductoras de la diferenciación de OPC, se colocaron OPC (cultivadas durante menos de 15 pasadas) en placas de cultivo de 384 pocillos recubiertas con poli-D-lisina en medios de OPC que contenían 2 ng/ml de PDGFaa, y se trataron inmediatamente con compuestos a concentración final de 6 pM (DMSO al 0,6 %). Las células tratadas con el compuesto se incubaron a 37 °C, CO² al 5 % durante 6 días. Al final de los 6 días, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia. Se añadió anticuerpo monoclonal de proteína básica anti-mielina (aa 129-138, clon monoclonal 1, Millipore) (dilución 1:1000) en solución de tampón de bloqueo (BSA al 3 %, Triton X-100 al 0,3 % en PBS) a células fijadas y lavadas, y se incubó a 4 °C durante la noche. Se retiró la solución del anticuerpo primario y las células se lavaron con PBS antes de la incubación con una solución tampón de bloqueo que contenía anticuerpo secundario de IgG anti-ratón de cabra Alexa fluor488 (Invitrogen) (dilución 1:1000) y DAPI (2 ug/ml) durante 1 h a 25 °C. La solución del anticuerpo secundario se lavó con PBS y se fotografiaron las placas usando un sistema de detección de alto contenido OPERA (Perkin Elmer). Se usó un algoritmo de análisis de imágenes basado en la puntuación de la celda para identificar y puntuar las células positivas en MBP. Los aciertos se identificaron como compuestos que inducían > 400 células/campo y > 5 % de células/campo positivos en MBP. Los valores medios para los controles negativos en DMSO fueron sistemáticamente < 0,5 % de positivos en MBP. Se seleccionó un total de 6.058 compuestos de colecciones de selección de moléculas pequeñas disponibles en el mercado (LOPAC, Tocris, Enzo). Se identificó un total de 104 aciertos primarios. Estos consistieron en varios agentes inductores de la diferenciación de OPC conocidos (por ejemplo, retenoides, esteroles, análogos de nucleósidos, inhibidores de la Rho quinasa), así como varios agentes inductores de la diferenciación de las OPC no identificados previamente (por ejemplo, agentes moduladores de neurotransmisores).

Los aciertos primarios identificados se evaluaron posteriormente mediante la determinación de los valores de CE⁵⁰ en múltiples experimentos repetidos usando el formato de ensayo primario para determinar la diferenciación de las OPC. Las células se trataron con compuestos diluidos en serie en DMSO (10 diluciones de 1:3 en un intervalo de 71 pM a 4 nM). La tinción y la generación de imágenes se realizaron como se describe para la detección primaria. Los valores de CE⁵⁰ se determinaron usando las ecuaciones de ajuste de curva apropiadas en Graphpad Prism 5.0. La Figura 1A muestra la CE⁵⁰ para seis aciertos identificados (carbetapentano, clemastina, benztropina, trifluoperazina, salmeterol y GBR12935), siendo todos ellos fármacos que atraviesan la barrera hematoencefálica aprobados por la FDA. La Figura 1 también muestra la capacidad de estos seis aciertos identificados para inducir la diferenciación de las OPC (medida por el porcentaje de células positivas en la proteína básica de mielina (MBP)) a concentraciones variables (Figura 1B). Para cada uno de estos agentes, cuando se cultivó la muestra de OPC con un agente a la potencia máxima, el porcentaje de células positivas en MBP resultantes fue de al menos el 10 % (Figura 1C). Para la GBT12935, el porcentaje de células positivas en MBP resultantes fue superior al 15 %. Estos resultados muestran que el carbetapentano, la clemastina, la benztropina, la trifluoperazina, el salmeterol y GBR12935 potencian la diferenciación de las OPC.

Ejemplo 2: Validación de los aciertos del rastreo de moléculas pequeñas

Se seleccionaron varias clases de agentes moduladores de receptores de neurotransmisores que se identificaron mediante la detección primaria según el estado de aprobación de la FDA, la toxicidad conocida y la farmacocinética cerebral para su evaluación en ensayos de validación in vitro e in vivo posteriores. Se evaluó la capacidad de los compuestos para inducir la diferenciación robusta de las OPC en un destino de oligodendrocitos mielinizantes completamente maduros in vitro usando RT-PCR cuantitativa, transferencia Western y técnicas de análisis de inmunofluorescencia. Se evaluó la capacidad de los compuestos para inducir la remielinización in vivo (en presencia de una lesión inflamatoria) mediante un modelo de ratón de encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE) inducida por proteínas proteolípidas (PLP) de esclerosis múltiple recurrente.

se realizaron RT-PCR cuantitativa (“qRT-PCR”) y análisis de transferencia Western en muestras de OPC que habían sido cultivadas con DMSO (control negativo), T3 (control positivo), benztropina, carbetapentano, clemastina, trifluoperazina, GBR12935 o salmeterol para medir los niveles de expresión de MBP y MOG, marcadores para oligodendrocitos mielinizantes. Como se muestra en la Figura 2A, las muestras de OPC cultivadas con benztropina, carbetapentano, clemastina, GBR12935 o salmeterol fueron todas positivas para la expresión de MBP y MOG. La qRT-PCR mostró una doble inducción de la expresión, o superior, de MBP y MOG para muestras de OPC cultivadas con benztropina, carbetapentano, clemastina, trifluoperazina, GBR12935 o salmeterol (Figura 2B-C).

La inmunofluorescencia también se usó para confirmar que los aciertos eran capaces de inducir la maduración de los oligodendrocitos. Como se muestra en las Figuras 3 y 4, el análisis de inmunofluorescencia confirmó la presencia de múltiples marcadores de oligodendrocitos mielinizantes maduros (MBP, MOG, CNP, GalC, O1 y O4) tras el tratamiento de cultivos in vitro con benztropina, carbetapentano, clemastina, trifluoperazina, GBR12935 o salmeterol.

Dos de los compuestos, la trifluoperazina y la benztropina, se ensayaron in vivo en ratones con encefalitis autoinmunitaria experimental inducida por proteína proteolipídica (PLP), un modelo de esclerosis múltiple. Se inmunizaron ratones SJL de 10 semanas de vida con emulsión de PLP y toxina pertusis para inducir la eA e . Los síntomas de la EAE se desarrollaron en ratones en el transcurso de los 10 días posteriores a la inmunización. Los animales que desarrollaron EAE mostraron déficits neurológicos que iban desde alteraciones en los movimientos de la cola hasta parálisis en las 4 extremidades, y los síntomas más graves duraron aproximadamente 4 días, seguidos de un período de remisión. Los compuestos se administraron diariamente mediante inyección intraperitoneal de 100 ul en solución salina estéril a 10 mg/kg solo o en combinación con micofenolato de mofetilo en solución salina estéril a pH 5 a 20 mg/kg. La administración del compuesto se inició al inicio de la enfermedad (día 10), mientras que la administración del micofenolato de mofetilo se inició el día 14. Los ratones se puntuaron diariamente en una escala patrón de la EAE de 0 a 5. Se indujeron síntomas similares a la EM en del 65 al 100 % de los ratones. El micofenolato de mofetilo, usado a una dosis subóptima, mostró una disminución de la gravedad de la recaída (Figura 5A). La trifluoperazina mostró una modesta disminución en el tiempo de la recuperación tras la fase aguda (Figura 5D-E). Cada una de la trifluoperazina y la benztropina solas redujeron significativamente la intensidad de la recaída medida como puntuaciones de EAE significativamente inferiores para los animales tratados con compuesto en comparación con los controles del vehículo (Figura 5B, D). En presencia de micofenolato de mofetilo no se observó recaída en los animales tratados con compuestos (Figura 5C, E). Por lo tanto, la trifluoperazina y la benztropina previnieron la recaída y mejoraron la función motora y cognitiva en comparación con los controles.

En otro conjunto de experimentos, se ensayaron cuatro compuestos (benztropina, clemastina, trifluoperazina y salbutamol) in vivo en un modelo de EAE. Como se muestra en la Figura 34A, los ratones tratados con benztropina (10 mg/kg) en un modo profiláctico mostraron una disminución significativa de la gravedad clínica tanto en la fase aguda como en la de recaída de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con vehículo. En un modo terapéutico, cada una de benztropina (Figura 34C), trifluoperazina (Figura 34D), clemastina (Figura 34E) y salbutamol (Figura 34E) mostró una gravedad clínica significativamente menor en la fase de recaída de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con vehículo.

También se investigaron los mecanismos farmacológicos de los agentes inductores de la diferenciación de las OPC identificados. Se determinó que existen múltiples mecanismos farmacológicos para inducir la diferenciación de las OPC con agentes identificados. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 6A, el agonismo del receptor muscarínico con carbacol inhibió la diferenciación de las OPC inducida por la benztropina, el carbetapentano y la clemastina, lo que sugiere que en el mecanismo al menos algunos agentes inductores de la diferenciación de las OPC es el antagonismo del receptor muscarínico. Otros antagonistas de los receptores muscarínicos, la atropina y el ipratropio, también inducen la diferenciación de las OPC. Sin embargo, el carbacol no inhibió la diferenciación de las OPC inducida por el salmeterol, GBR12935 o la trifluoperazina, lo que sugiere que estos agentes inducen la diferenciación de las o Pc por uno o más mecanismos farmacológicos.

Ejemplo 3: Estrategia basada en células madre para el tratam iento de la esclerosis múltiple

Los estudios dirigidos a evaluar la presencia y las densidades relativas de las OPC en sitios de lesiones de EM desmielinizadas crónicamente indican que no se trata de un fallo en la repoblación o migración de las OPC, sino, más bien, en la inhibición de la diferenciación de las OPC en sitios de lesión, que contribuye a la progresión de la enfermedad (D. M. Chari, W. F. Blakemore, Glia, 37, 307 (2002); D. M. Chari et al., J Neurosci Res, 73, 787 (2003); G. Wolswijk, J Neurosci, 18, 601 (1998); A. Chang et al., N Engl J Med, 346, 165 (2002); T. Kuhlmann et al., “Brain”, 131,1749 (2008)). Por tanto, la identificación de moléculas pequeñas de tipo farmacológico que inducen selectivamente la diferenciación de las OPC en sitios de lesiones desmielinizadas tendría un impacto significativo en el desarrollo de nuevos tratamientos eficaces para la EM (D. Kremer et al., Ann Neurol, 69, 602 (2011)).

Proliferaron OPC de roedor y humanas primarias in vitro cuando se cultivaron en medios exentos de suero que contenían PDGF (C. Ffrench-Constant, M. C. Raff, Nature, 319, 499 (1986); M. C. Raff et al., J Exp Biol, 132, 35 (1987)). Al retirarse el PDGF, las OPC inmaduras dejan de proliferar, pero tampoco logran diferenciarse eficazmente en un destino positivo en la proteína básica de mielina madura (MBP) (Fig. 11). La adición de triyodotrionina (T3), un inductor conocido de la diferenciación de las OPC (M. C. Nunes et al., Nat Med, 9, 439 (2003); N. Billon et al., Dev Biol, 235, 110 (2001); N. Billon et al., EMBO J, 21,6452 (2002); Y. M. Tokumoto, D. G. Tang, M. C. Raff, EMBO J 20, 5261 (2001); Fernandes, 2004; L. Calza, M. Fernandez, L. Giardino, J Mol Endocrinol, 44, 13 (2010)), en el momento de la retirada de mitógenos se produce la diferenciación de las OPC en oligodendrocitos positivos en MBP tras 6 días de cultivo (Fig. 11). Desafortunadamente, T3 tiene múltiples efectos fisiológicos que lo hacen poco atractivo como agente terapéutico basado en la diferenciación de las OPC.

Para identificar pequeñas moléculas de tipo farmacológico que inducen la diferenciación de las OPC, los presentes inventores desarrollaron un ensayo de generación de imágenes de alto contenido que se basa en la expresión de MBP de inducción en las OPC primarias derivadas del nervio óptico de rata cultivadas durante 6 días en condiciones de diferenciación basales. El ensayo se adaptó a un formato de 384 pocillos y se usó para seleccionar colecciones de compuestos biológicamente activos conocidos, así como una colección de ~50 K moléculas de tipo farmacológico estructuralmente diversas. Esto llevó a la identificación de múltiples inductores previamente identificados de la diferenciación de las OPC, incluyendo los retinoides, corticoesteroides, análogos de nucleósidos, inhibidores de la Rho-quinasa e inhibidores de ErbB (M. J. Latasa et al., Glia, 58, 1451 (2010); C. E. Buckley et al., Neuropharmacology, 59, 149 (2010); L. Joubert et al., J Neurosci Res, 88, 2546 (2010); A. S. Baer et al., Brain 132, 465 (2009); A. S. Paintlia et al., Mol Pharmacol, 73, 1381 (2008); C. Ibanez et al., Prog Neurobiol, 71,49 (2003); L. Giardino, C. Bettelli, L. Calza, Neurosci Lett, 295, 17 (2000)), que tienen potencial terapéutico limitado debido a actividades fuera de la diana, toxicidad o falta demostrada de eficacia in vivo. Sorprendentemente, entre los inductores más efectivos de la diferenciación de las OPC estaba la benztropina (CE⁵⁰ ~350 nM), para la que no se informó previamente la actividad de diferenciación de las OPC (Figuras 7A y 12). Se escogió investigar más a fondo la actividad de este compuesto, ya que es un fármaco aprobado por la FDA que está disponible por vía oral y que es bien tolerado, que atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, tiene el potencial de pasar rápidamente a los estudios de prueba de concepto como un nuevo tratamiento para la EM.

La diferenciación in vitro inducida por la benztropina de las OPC en roedores se confirmó evaluando los niveles de transcripción y traducción de los marcadores específicos de los oligodendrocitos MBP y glicoproteína oligodendroglial de mielina (MOG) mediante RT-PCR y análisis de transferencia Western, respectivamente (Figuras 7B y 13). Además, la actividad de diferenciación de las OPC in vitro se evaluó mediante el análisis de inmunofluorescencia usando múltiples marcadores expresados específicamente en oligodendrocitos maduros (incluyendo MBP, MOG, 2',3'-cícliconucleótido 3'-fosfodiesterasa (CNP), galactocebrosidasa (GalC), marcador de oligodendrocitos O1 (O1) y marcador de oligodendrocitos O4 (O4) tras seis días de tratamiento con compuesto (Figura 14). Además, se encontró que los perfiles globales de expresión génica de las OPC tratadas durante 6 días con benztropina se agrupan con los obtenidos a partir de células de control positivo tratadas con T3 (Figura 15). La regulación a la baja de los genes específicos de las OPC necesarios para la proliferación (por ejemplo, Idr2, Egr1, Sox11; V. A. Swiss et al., PLoS One, 6, e18088 (2011)) y la regulación al alza de los genes específicos de mielinatingoligodendrocitos maduros (por ejemplo, metabolismo de lípidos, proteínas relacionadas con la mielina (V. A. Swiss et al., PLoS One, 6, e18088 (2011)) se observó después del tratamiento de las OPC con benztropina (Figura 16). Para determinar la etapa de diferenciación de las OPC en la que está activa la benztropina (Gard, Neuron, 3, 615 (1990); A. L. Gard, S. E. Pfeiffer, Dev Biol, 159, 618 (1993); D. Avossa, S. E. Pfeiffer, J Neurosci Res, 34, 113 (1993); R. Aharoni et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 102, 19045 (2005)), se trataron OPC durante diferentes duraciones comenzando en múltiples puntos de tiempo (Figura 17). Se observó la inducción máxima de la expresión de MBP cuando se añadió el compuesto en el transcurso de las 48 horas de la retirada de PDGF, y se dejó incubar durante 5 días (Figura 17), lo que indica que este fármaco probablemente actúa en las OPC positivas en A2B5 inmaduras y no en una etapa de diferenciación “previa al oligodendrocito” intermedia.

La benztropina se usa clínicamente para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, y se cree que su actividad farmacológica es el resultado de la actividad anticolinérgica que disminuye el desequilibrio entre la dopamina y la acetilcolina (A. J. Eshleman et al., Mol Pharmacol, 45, 312 (1994); R. Katsenschlager et al., Cochrane Database Syst Rev, CD003735 (2003); J. T. Coyle y S. H. Snyder, Science, 166, 899 (1969)). Además de su actividad anticolinérgica, la benztropina es un antihistamínico de acción central y un inhibidor de la recaptación de la dopamina (GE Agoston et al., J Med Chem, 40, 4329 (1997); J.L. Katz et al., J Pharmacol Exp Therap, 309, 605 (2004); D. Simoni et al., J Med Chem, 48, 3337 (2005)). Con el fin de determinar el mecanismo de acción de la benztropina, se evaluó la capacidad de los agonistas selectivos de los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) (por ejemplo, carbacol) o los receptores histaminérgicos (por ejemplo, histamina e histamina triflorometiltoluidina (HTMT)) para bloquear la actividad de la benztropina. Se observó una potente inhibición de la diferenciación de las OPC inducida por la benztropina en presencia de carbacol (Figuras 7C y 18), mientras que la histamina o la HTMT no mostraron ningún efecto observable (Figura 19). Además, ni el antagonista de receptor de la dopamina haloperidol, ni el agonista de receptor de la dopamina quinpirol afectaron a la inducción de la diferenciación de las OPC por la benztropina (Figura 20). El quinpirol tampoco indujo una diferenciación significativa cuando se usó solo (datos no mostrados). Por lo tanto, a continuación, se evaluó un panel de antagonistas de mAChR (atropina, oxibutinina, escopolamina, ipratropio y propiverina), y se encontró que todos inducían la diferenciación de las OPC de una manera dependiente de la dosis (Figura 21). Las OPC expresan mAChR, predominantemente los subtipos M¹, M³ , y M⁵ (F. Ragheb et al., J Neurochem, 77, 1396 (2001)). Se confirmó la expresión de estos receptores, así como la enzima sintetizadora de acetilcolina, colina acetiltransferasa, en las o Pc mediante RT-PCR (Figura 22). La activación inducida por el Carbacol de mAChR desencadena la activación dependiente de la proteína quinasa-C de la vía MAPK/ERK que conduce a la modulación de la expresión de c-Fos (F. Ragheb et al., J Neurochem, 77, 1396 (2001)). El análisis de transferencia Western de las OPC tratadas con benztropina coincidió con la inhibición general de esta vía (es decir, disminución de fosfo-p42/44 MAPK y fosfo-Akt y estimulación de la fosforilación de p38 MAPK y CREB) (Figura 23A). Además, los niveles de transcripción de ciclina D1, ciclina D2, c-Fos y c-Jun se redujeron significativamente en las OPC tratadas con benztropina, coincidiendo con un mecanismo que implica una inhibición general de la progresión del ciclo celular dependiente de MAPK/ERK (Figura 23B).La activación de mAChR de M¹ and M³ se acopla a los eventos de transducción de señales cadena abajo a través de la fosfolipasa C, lo que resulta en un aumento de las concentraciones de calcio intracelular (F. Ragheb et al., J Neurochem, 77, 1396 (2001)) (Figura 23C). La activación de mAChR de M² y M⁴ inhibe la adenilaciclasa, lo que conduce a una disminución de los niveles de AMPc intracelular (C. C. Felder, FASEB J, 9, 619 (1995); M. Lopez-Ilasaca et al., Science, 275, 394 (1997)). En las OPC, la benztropina inhibe el flujo de entrada de calcio inducido por el carbacol, pero no tiene efecto sobre los niveles de AMPc (Figura 24). Conjuntamente, estos resultados sugieren que la benztropina induce la diferenciación de las OPC mediante un mecanismo que implica un antagonismo directo de los receptores muscarínicos M¹/M³. La acetilcolina es un regulador conocido de la proliferación de las OPC y, como tal, los subtipos de receptores muscarínicos representan una clase razonable de dianas terapéuticas para la modulación de la proliferación y diferenciación de las OPC (F. De Angelis et al., Dev Neurobiol, (2011)).

A continuación, se examinó la actividad de la benztropina en el modelo de la EM recurrente-remitente de roedores con encefalomielitis autoinmunitaria experimental inducida por la proteína proteolipídica mielina (PLP) (D. A. Sipkins, J Neuroimmunol, 104, 1 (2000); T. Owens, S. Sriram, Neurol Clin, 13, 51 (1995)). Este modelo se usa lo más comúnmente para evaluar la eficacia potencial de los agentes inmunomoduladores, pero también se puede usar para determinar la efectividad de los agentes promielinizantes que funcionan potenciando la diferenciación de las OPC M. Fernandez et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 101, 16363 (2004); X. Lee et al., J Neurosci, 27, 220 (2007); revisado en R. J. Franklin, C. Ffrench-Constant, Nat Rev Neurosci, 9, 839 (2008)). Se administró profilácticamente benztropina (10 mg/kg) usando una pauta de inyección intraperitoneal (IP) diaria iniciada al inicio de la inmunización de ratones SJL de 8 semanas de vida con PLP. La benztropina redujo drásticamente la gravedad de la fase aguda de la enfermedad y prácticamente eliminó la observación de una fase de recaída en comparación con los controles tratados con vehículo (Figuras 8A y 25). A continuación, se evaluó la eficacia al administrar el fármaco terapéuticamente, comenzando las inyecciones diarias al primer signo de aparición de la enfermedad. El tratamiento con benztropina en este modo nuevamente condujo a una recuperación funcional, con disminuciones significativas de la gravedad clínica en las fases de remisión observadas, y la aparición de recaída casi se eliminó (Figura 8A). De hecho, el tratamiento con benztopina de este modo demostró una disminución en la gravedad clínica observada que superó a la observada para los fármacos inmunomoduladores para la EM FTY720 o interferón-p (administrados a dosis casi máximas toleradas) (Figura 8A).

En experimentos paralelos, durante las fases de recaída (día 23-25), se aislaron las médulas espinales de ratones tratados con benztropina o vehículo y las secciones teñidas de múltiples regiones de cada médula espinal con azul Luxol Fast Blue (LFB) (para visualizar la mielina) o H&E (para visualizar las células inmunitarias infiltrantes). Las secciones de los ratones tratados con vehículo y con benztropina mostraron una infiltración significativa por las células inmunitarias reactivas con H&E (Figura 26). En los ratones tratados con vehículo, las zonas de infiltración correspondieron a zonas con desmielinización significativa (Figura 26). Por el contrario, en los ratones tratados con benztropina, se tiñó un gran número de zonas infiltradas de células inmunitarias de forma positiva con LFB, coincidiendo con un mecanismo de células madre frente a un mecanismo inmunomodulador (Figura 26). Además, se evaluó la remielinización mejorada con fármacos mediante microscopía confocal, examinando las regiones de infiltración de linfocitos T en secciones de médula espinal teñidas con marcadores de oligodendrocitos maduros (GST-n) y OPC inmaduras (NG2) (Figura 8B). El análisis de imágenes cuantitativo de múltiples campos aleatorios por grupo indica que el tratamiento con benztropina provoca un aumento significativo en el número de oligodendrocitos maduros positivos en GST-n de ~500 a ~1.100 por campo (Figura 8C), mientras que el número de células positivas en NG2 no difirió significativamente con el tratamiento (Figura 8C). El aumento observado en los números de oligodendrocitos maduros en los sitios de infiltración de linfocitos T coincide con un mecanismo de recuperación clínica inducida por la benztropina que implica la estimulación de la diferenciación de las OPC, lo que lleva a una mejor remielinización mejorada, en el contexto de un entorno inflamatorio. De forma destacable, no se observó toxicidad general en los ratones tratados con el fármaco, ni se observó en este análisis histológico (es decir, no se observó desmielinización inducida por el fármaco) después de 4 semanas de inyecciones diarias a 10 mg/kg.

Los procesos inmunológicos primarios implicados en la EM y la EAE están mediados por los linfocitos T, y los paradigmas de tratamiento primario se basan en fármacos inmunomoduladores (T. Kopadze et al, Arch Neurol, 63, 1572 (2006); J. M.Greer et al., J Immunol, 180, 6402 (2007), M. P. Pender y J. M. Greer, curr Allergy Asthma Rep, 7, 285 (2007)). Con el fin de determinar si la eficacia de la benztropina en el modelo de EAE se debe, al menos en parte, a una actividad inhibidora de los linfocitos T, se evaluaron los efectos de la benztropina sobre la activación y la proliferación de los linfocitos T. La benztropina no tuvo efecto en la activación ni en la proliferación de los linfocitos T in vitro, según se determinó al evaluar las poblaciones de CD4+/CD69+ y CD4+/CD25+, y al usar un ensayo de CFSE, respectivamente (Figura 27). Se evaluó el efecto de la benztropina sobre el sistema inmunitario in vivo en ratones SJL en los que se había inducido y no se había inducido EAE con PLP. En animales enfermos o sanos, la benztropina no tuvo efecto en el número de esplenocitos circulantes, células CD4+, células CD8+, células CD4+/CD44Hi y células CD8+/CD44Hi (Figuras 28 y 29). Se observó una disminución menor pero significativa en el número de linfocitos B después del tratamiento con benztropina (Figuras 28 y 29). El tratamiento con benztropina no tuvo efecto en la producción de citocinas, según lo determinado mediante la evaluación de las poblaciones de linfocitos T CD4+/IL2+, CD4+/IFN-Y+, CD4+/IL-10+ y CD4+/TNF-a+ aisladas de ratones normales o enfermos tratados con un fármaco o con vehículo (Figuras 28 y 29). También se ensayaron los efectos de la benztropina en las respuestas dependientes de los linfocitos T inducidas por TNP-LPS y TNP-Ficoll y en las respuestas independientes de los linfocitos T producidas por TNP-KLH. La benztropina no tuvo efecto sobre la producción de IgG ni de IgM en respuesta a ninguno de estos antígenos (Figura 30).

Además, se evaluó la capacidad de la benztropina para inducir la diferenciación de las OPC y mejorar la remielinización in vivo usando el modelo de desmielinización inducida por cuprizona independiente de los linfocitos T. En este modelo, los ratones se alimentan con el quelante de cobre bis(ciclohexilidenhidracida) (cuprizona), que produce un estrés oxidativo/nitrativo que causa disfunción mitocondrial y conduce a la desmielinización del SNC (P. Mana et al., Am J Pathol, 168, 1464 (2006); M. Lindner et al., Glia, 56, 1104 (2008); P. Mana et al., J Neuroimmunol, 210, 13 (2009); L. Liu et al., Nat Neurosci, 13, 319 (2010); A. J. Steelman, J. P. Thompson, J. Li, Neurosci Res, 72, 32 (2012)). Las lesiones desmielinizadas observadas en este modelo recuerdan a las lesiones de la EM de patrón III e implican una contribución mínima de las células inmunitarias hematógenas (L. Liu et al., Nat Neurosci, 13, 319 (2010); C. Lucchinetti et al., Ann Neurol 47, 707 (2000); L. T. Remington et al., Am J Pathol, 170, 1713 (2007)). La inclusión de cuprizona al 0,2 % (p/v) en la dieta de los ratones C57BL/6 induce un programa de desmielinización que avanza con una serie de eventos definidos durante un curso de tiempo característico, en el que el cuerpo calloso muestra una desmielinización máxima después de 6-7 semanas de alimentación (T. Skripuletz et al., Am J Pathol, 172, 1053 (2008)). La remielinización espontánea se observa 2-4 semanas después de la retirada de cuprizona (T. Skripuletz et al., Am J Pathol, 172, 1053 (2008)). Al administrar fármacos en el momento en que se reintroduce una dieta sin cuprizona, se puede examinar la eficacia de los agentes promielinizantes mediante la evaluación de la cinética relativa de la remielinización dependiente de las OPC (T. Skripuletz et al., Am J. Pathol, 172, 1053 (2008)). Tras 7 semanas de exposición, tras la retirada de la cuprizona, se administró benztropina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal a ratones C57BL/6 de 15 semanas de vida. Los ratones tratados con fármaco o vehículo se sacrificaron en grupos de 5 semanas durante 5 semanas, después del tratamiento con fármaco, y se evaluó la remielinización cuantitativamente tiñendo las regiones del cuerpo calloso de cerebros recogidos con LFB (Figura 9A, B). Se observó claramente una desmielinización significativa tras siete semanas de tratamiento con cuprizona, en comparación con los animales de control. Coincidiendo con la mejora de la diferenciación de las OPC y la aceleración de la remielinización, se observó un aumento significativo en la tinción de mielina en el cuerpo calloso en la semana 2 después del tratamiento con benztropina, en comparación con la remielinización espontánea observada en los controles de vehículo (Figura 9A, B). Como cabía esperar, en puntos de tiempo posteriores, la remielinización espontánea fue relativamente completa, y no se observaron diferencias significativas entre los animales tratados con el fármaco y el vehículo. La falta de diferencia en estos últimos puntos de tiempo indica que, incluso después de 5 semanas de tratamiento a dosis eficaces, la benztropina no es tóxica para los oligodendrocitos maduros. Estos datos sugieren nuevamente que la benztropina mejora el proceso de remielinización in vivo, al inducir directamente la diferenciación de las OPC. La benztropina también podría potenciar la remielinización al ejercer un efecto protector sobre un tipo de célula intermedia “previa al oligodendrocito” o mediante un proceso que implica una combinación de ambos efectos. La activación de la caspasa-3 se debe a las vías apoptóticas intrínsecas y extrínsecas, y sirve como un indicador general de muerte celular inducida por estrés. No se encontró que el tratamiento con benztropina inhibiera la activación de la caspasa-3 en los días 2, 4 y 6 de diferenciación, según lo determinado mediante transferencia Western y el análisis de inmunofluorescencia (Figura 32). Sin embargo, la caspasa-3 escindida apenas fue detectable en las OPC en cualquier punto de tiempo en los controles tratados con d Ms O, lo que indica que la diferenciación de las OPC fallida probablemente no se deba a la muerte celular inducida por el estrés.

Para el tratamiento de la EM, lo más probable es que se introduzca clínicamente un fármaco inductor de la diferenciación de las OPC como parte de una terapia de combinación con un fármaco inmunosupresor. Usando el modelo de EAE inducida por PLP, por lo tanto, se evaluó la eficacia clínica de la benztropina al combinarse con cualquiera de los dos fármacos inmunomoduladores aprobados para el tratamiento de la EM, interferón-p y FTY720 (L. Kappos et al., N Engl J Med, 355, 1124 (2006); M. Fujino et al., J Pharmacol Exp Ther, 305, 70 (2003); L. Jacobs et al., Arch Neurol, 39, 609 (1982); M. Huber et al., J Neurol, 235, 171 (1988)). El primero reduce la proliferación de los linfocitos T y altera la expresión de las citocinas (A. Noronha, A. Toscas, M. A. Jensen, J Neuroimmunol, 46, 145 (1993); A. Noronha, A. Toscas, M. A. Jensen, Ann Neurol, 27, 207 (1990)), mientras que este último es un agonista SIP que regula el tráfico de los linfocitos T (V. Brinkmann et al., J Biol Chem, 277, 21453 (2002); V. Brinkmann et al., Nat Rev Drug Discov, 9, 883 (2010)). Se determinó si la combinación de un fármaco inductor de OPC con interferónp o FTY720 mejoraría la eficacia y/o disminuiría la dosis del agente inmunosupresor necesaria para lograr el máximo beneficio. Inicialmente, los tres fármacos se administraron individualmente en un intervalo de concentraciones, para determinar las dosis subóptimas y las dosis eficaces/toleradas máximas de cada uno en los modelos (Figuras 25 y 33 A, B). Luego se administró benztropina con cualquiera de los dos tratamientos de modulación inmunitaria existentes para la EM, y como se describe a continuación, estas combinaciones produjeron beneficios significativos en el modelo de la EAE. La adición de 2,5 mg/kg de benztropina a 1 mg/kg de FTY720 (Figura 10A) o 10.000 U/ratón de interferónp (Figura 10B) produjo una disminución significativa en la gravedad clínica observada, en comparación con la observada cuando cualquiera de FTY720 o interferón p se administró solo. Además, la combinación de 2,5 mg/kg de benztropina con una dosis subóptima de FTY720 (0,1 mg/kg) produjo una disminución significativa de la gravedad clínica que fue mayor que la observada cuando cualquiera de los fármacos se administró solo, y fue comparable a la eficacia clínica observada cuando se administró FTY720 solo cerca de la dosis máxima tolerada observada de 1 mg/kg (Figura 10C). Esta observación puede ser clínicamente relevante, ya que el tratamiento con FTY720 se asocia con la bradicardia, que depende de la dosis.

Se ha identificado un fármaco aprobado por la FDA de acción central que, cuando se administra solo en el modelo más clínicamente relevante de la EM, disminuye significativamente la gravedad de la enfermedad. La benztropina mejora la remielinización, lo que lleva a la recuperación funcional, al estimular directamente la diferenciación de las OPC mediante un mecanismo que implica el antagonismo de los receptores muscarínicos M¹/M³ expresados en las OPC inmaduras. La evidencia de que este fármaco funciona estimulando directamente la remielinización, y no inhibiendo la desmielinización, se obtiene por la ausencia observada del efecto de la benztropina en la biología de los linfocitos T in vitro e in vivo y por la actividad promielinizante observada de la benzotropina en el modelo de desmielinización inducida por cuprizona independiente de los linfocitos T. La inclusión de benztropina en las pautas de tratamiento que implicaban fármacos inmunomoduladores aprobados existentes produjo una mejor recuperación funcional y disminuciones significativas de las dosis de estos últimos que se requieren para lograr un nivel equivalente de eficacia. Hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, estos resultados proporcionan la primera evidencia in vivo que respalda la idea de que se puede lograr un beneficio al tratar los síntomas similares a los de la EM usando la combinación de un inmunomodulador con un potenciador de la remielinización.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un agente modulador de receptores de neurotransmisores para su uso en un método de estimulación del aumento de la mielinización de los nervios en un sujeto humano que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el método administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de dicho agente modulador de receptores de neurotransmisores, en el que dicho agente es un antagonista de receptor muscarínico.

2. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de la reivindicación 1, en el que el antagonista de receptor muscarínico es benztropina, carbetapentano, clemastina, ipratropio, atropina, oxibutinina, propiverina, escopolamina o una de sus sales.

3. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el método comprende además administrar al sujeto un agente inmunomodulador.

4. Un agente modulador de receptores de neurotransmisores para su uso en un método para potenciar el efecto terapéutico de un agente inmunomodulador en el tratamiento de una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el método administrar a un sujeto humano que tiene la enfermedad desmielinizante el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores, en el que dicho agente modulador de receptores de neurotransmisores es un antagonista de receptor muscarínico.

5. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de la reivindicación 4, en el que:

el antagonista de receptor muscarínico es benztropina, clemastina, carbetapentano, ipratropio, atropina, oxibutinina, propiverina, escopolamina o una de sus sales.

6. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que:

(a) cada uno de entre el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se administra a una dosis terapéuticamente eficaz;

(b) el agente modulador de receptores de neurotransmisores se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y el agente inmunomodulador se administra a una dosis subterapéutica;

(c) cada uno de entre el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se administra a una dosis subterapéutica;

(d) el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se administran sistémicamente;

(e) el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se administran secuencialmente; o

(f) el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se administran simultáneamente.

7. Una composición para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo la composición:

un antagonista de receptor muscarínico; y

un agente inmunomodulador.

8. La composición de la reivindicación 7, en el que:

el antagonista de receptor muscarínico es benztropina, clemastina, carbetapentano, ipratropio, atropina, oxibutinina, propiverina, escopolamina o una de sus sales.

9. La composición de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que:

(a) cada uno de entre el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis terapéuticamente eficaz;

(b) el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis terapéuticamente eficaz y el agente inmunomodulador se formula como una dosis subterapéutica; o

(c) cada uno de entre el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis subterapéutica.

10. Un kit para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad desmielinizante, comprendiendo el kit:

un antagonista de receptor muscarínico; y

un agente inmunomodulador.

11. El kit de la reivindicación 10, en el que:

el antagonista de receptor muscarínico es benztropina, clemastina, carbetapentano, ipratropio, atropina, oxibutinina, propiverina, escopolamina o una de sus sales.

12. El kit de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que:

(a) cada uno de entre el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis terapéuticamente eficaz;

(b) el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis terapéuticamente eficaz y el agente inmunomodulador se formula como una dosis subterapéutica;

(c) cada uno de entre el agente inmunomodulador y el agente modulador de receptores de neurotransmisores se formula como una dosis subterapéutica;

(d) el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador están en la misma formulación; o

(e) el agente modulador de receptores de neurotransmisores y el agente inmunomodulador están en formulaciones separadas.

13. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de las reivindicaciones 1 a 3, la composición de la reivindicación 7 o el kit de la reivindicación 10, en los que la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria desmielinizante idiopática, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía periférica autoinmunitaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, neuropatía óptica hereditaria de Leber o mielopatía asociada con el HTLV.

14. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de las reivindicaciones 3 a 5, la composición de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, o el kit de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en los que el agente inmunomodulador es fingolimod (FTY720), interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatiramer, mitoxantrona o natalizumab.

15. El agente modulador de receptores de neurotransmisores para el uso de las reivindicaciones 3 a 5, la composición de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, o el kit de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en los que el agente inmunomodulador es un agonista de S1P.