KR101221589B1 - Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물 - Google Patents

Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 치료 적용을 위한 면역 조절제로서 안정화된 올리고리보누클레오티드의 치료학적 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 증가된 누클레아제 및 RNase 안정도를 가지며, TLR7 및/또는 TLR8을 통한 면역 조절 활성을 갖는 RNA 기재 올리고리보누클레오티드를 제공한다.

Description

ＴＬＲ７ 및 ＴＬＲ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ＲＮＡ〔ＳＩＭＲＡ〕 화합물 {STABILIZED IMMUNE MODULATORY RNA (SIMRA) COMPOUNDS FOR TLR7 AND TLR8}
본 발명은 면역 조절제로서 올리고리보누클레오티드를 사용하는 면역학 및 면역치료 응용 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 안정화된 면역 조절성 RNA(SIMRA) 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물 및 방법은 톨형(Toll-like) 수용체 8 (TLR8), TLR7과 TLR8, 및 TLR7 (TLR7)을 통한 면역 반응을 조절하는 데 효과적이다.
면역 반응은 반응에 관여되는 세포의 서브셋(subset)에 근거하여 선천성 반응 및 후천성 반응 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 지연 타입 과민반응 및 세포독성 T 림프구(CTL)의 활성화와 같은 전통적인 세포 매개 기능에 관련된 T 헬퍼(Th) 세포는 Th1 세포인 반면, B-세포 활성화에 대해 헬퍼 세포로서 관련된 Th 세포는 Th2 세포이다. 면역 반응의 타입은 항원 노출에 대한 반응으로 생성된 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)에 의해 영향받는다. 사이토카인은 T 헬퍼 1(Th1) 및 T 헬퍼 2(Th2) 세포의 균형을 맞춤으로써 면역 반응을 조절하기 위한 수단을 제공하며, 이는 일어나는 면역 반응의 방법에 직접적인 영향을 준다. 상기 균형이 보다 많은 수의 Th1 세포 쪽으로 치우치면, 세포 매개된 면역 반응이 일어나고, 이것은 세포독성 T 세포(CTL)의 활성화를 포함한다. 상기 균형이 보다 많은 수의 Th2 세포로 치우치면, 체액 또는 항체 면역 반응이 일어난다. 각각의 이러한 면역 반응은 상이한 일련의 사이토카인이 Th1 및 Th2 세포로부터 분비되게 한다. Th1 및 Th2 세포에 의해 분비된 사이토카인에서의 차이는 이들 두 서브셋의 상이한 생물학적 기능의 결과일 수 있다.
Th1 세포는 항원에 대한 신체 고유의 반응(예를 들어, 바이러스 감염, 세포내 병원균 및 종양 세포)에 관여한다. 항원에 대한 초기 반응은 항원 제시 세포(예를 들어, 활성화된 마크로파지 및 수상돌기 세포)로부터의 IL-12의 분비 및 이에 수반되는 Th1 세포의 활성화일 수 있다. Th1 세포의 활성화 결과는 특정 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-감마 및 그 밖의 사이토카인)의 분비 및 수반되는 항원 특이적 CTL의 활성화이다. Th2 세포는 박테리아, 기생충, 항원 및 알레르겐에 반응하여 활성화되는 것으로 공지되어 있으며, 특정 사이토카인(예를 들어, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 및 그 밖의 사이토카인) 및 케모카인의 분비를 통해 신체의 후천성 면역 반응(예를 들어, IgE 생성 및 호산구 활성화)을 매개할 수 있다. 이러한 특정 사이토카인의 분비는 B-세포 증식과 항체 생성 증가를 유도할 수 있다. 또한, 이러한 특정 사이토카인은 그 밖의 사이토카인의 방출을 촉진하거나 억제할 수 있다(예를 들어, IL-10은 Th1 세포로부터 IFN-γ 분비를 억제하고, 수상돌기 세포로부터 IL-12 분비를 억제한다). 궁극적으로, 선택된 자극에 반응하여 방출되는 사이토카인 및 케모카인과 Th1 및 Th2 세포 간의 균형은 신체의 면역 시스템이 질병에 대해 반응하는 방법에 있어서 중요한 역할을 한다. 예 를 들어, IFN-α는 C형 간염을 억제할수 있고, MIP-1α 및 MIP-1β(또한, 각각 CCL3 및 CCL4로서 공지되어 있음)은 HTV-1 감염을 억제할 수 있다. Th1/Th2 면역 반응의 적합한 균형이 면역 시스템을 사용할 기회를 제공하여 다양한 질병을 치료하고 예방한다.
Th1 면역 반응은 예를 들어, 박테리아 또는 합성 DNA 함유 비메틸화 CpG 디누클레오티드의 도입에 의해 포유동물에서 유도될 수 있으며, 이러한 면역 반응은 패턴 인식 수용체(PRR)로서 공지된 특정 면역 세포에 대한 수용체에 특이적인 올리고누클레오티드 서열(예를 들어, 비메틸화 CpG)를 제공하는 것으로부터 기인된다. 이러한 특정 PRR이 톨형 수용체(TLR)이다.
톨형 수용체(TLRs)는 미생물 감염에 반응하여 선천성 면역 반응을 유도함에 있어서 긴밀하게 관여된다. 척추동물에 있어서, 톨형 수용체로 불리우는 10개 단백질의 패밀리(TLRl 내지 TLRl0)는 병원균 관련된 분자 패턴을 인식하는 것으로 공지되어 있다. 상기 10개 중, TLR3, 7, 8, 및 9는 세포 내측 엔도솜(endosome)에 편재되어, 핵산(DNA 및 RNA) 및 소분자, 예컨대, 누클레오시드 및 핵산 대사물질을 인식하는 것으로 공지되어 있다. TLR3 및 TLR9은 바이러스 및 박테리아, 및 합성 DNA에 각각 존재하는 dsRNA 및 비메틸화된 CpG 디누클레오티드와 같은 핵산을 인식하는 것으로 공지되어 있다. 박테리아 DNA는 면역 시스템 및 항종양 활성을 활성화시키는 것으로 나타나 있다[참조: Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73; Messina, J, et al., J. Immunolo. (1991) 147:1759-1764]. CpG 디누클레오티드를 함유하는 안티센스 올리고누클레오티드를 사용하는 다른 연구에서는 면역 반응의 촉진화를 보여주었다[참조: Zhao Q, et al., Biochem.Pharmacol. 1996, 26, 173-82]. 이후, 연구에서는, TLR9이 박테리아 및 합성 DNA에 존재하는 비메틸화 CpG 모티브(motif)를 인식하는 것으로 나타났다[참조: Hemmi H, et al., Nature. (2000) 408:740-5]. 또한, CpG 함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 또 다른 변형은 TLR9를 통한 면역 반응의 조절제로서 작용하는 능력에 영향을 미칠 수 있다[참조예: Zhao et al, Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al, Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu etal, Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; and Kandimalla et al, Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813]. 또한, 구조 활성 관련성 연구에서는 비메틸화 CpG 디누클레오티드로부터 초래되는 것들과는 차별되는 특이적 면역 반응 프로파일을 유도하는 신규한 DNA 기재 작제물 및 합성 모티브를 확인하였다[참조: Kandimalla ER, et al, Proc Natl Acad Sci USA. (2005) 102:6925-30, Kandimalla ER, et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100:14303-8. Cong YP, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 310:1133-9. Kandimalla ER, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 306:948-53. Kandimalla ER, et al., Nucleic Acids Res. (2003) 31:2393-400. Yu D, et al., Bioorg Med Chem. (2003) 11:459-64. Bhagat L, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 300:853-61. Yu D, et al., Nucleic Acids Res. (2002) 30:4460-9. Yu D, et al., J Med Chem. (2002) 45:4540-8. YuD, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2002) 297:83-90. Kandimalla ER, et al., Bioconjug Chem. (2002) 13:966-74. Yu D, K et al., Nucleic Acids Res. (2002) 30:1613-9. Yu D, et al., Bioorg Med Chem. (2001) 9:2803-8. Yu D, et al., Bioorg Med Chem Lett. (2001) 11:2263-7. Kandimalla ER, et al., Bioorg Med Chem. ( 2001) 9:807-13. Yu D, et al., Bioorg Med Chem Lett. (2000) 10:2585-8, Putta MR, et al., Nucleic Acids Res. (2006) 34:3231-8]. 그러나, 최근까지, TLR7 및 TLR8에 대한 천연 리간드는 공지되어 있지 않다.
TLR 7 및 8은 바이러스 및 합성 단일 가닥 RNA, 및 다수의 누클레오티드를 포함하는 소분자를 인식하는 것으로 나타났다[참조: Diebold, S.S., et al. Science v: 303, 1529-1531 (2004)]. 디볼드(Diebold) 등의 문헌(Science, v303: 1529-1531 (2004))에서는 인플루엔자 바이러스에 대한 IFN-α반응이 인플루엔자 게놈 RNA의 엔도솜 인식 및 TLR7 및 MyD88에 의한 시그널화를 필요로 한다는 것을 나타내고 있으며, TLR7에 대한 리간드로서 ssRNA를 확인하였다. 인간에 있어서, ssRNA는 TLR7에 의해서가 아니라 TLR8에 의해서 인식되는 반면, 뮤린 TLR7은 ssRNA 을 인식할 수 있다[참조: Lund JM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Apr 13; 101(15):5598- 603; Heil F. et al. Science. 2004; 303: l526-9; Diebold SS, et al., Science. 2004; 30:1529-31; Triantafilou K, et al, Eur J Immunol. 2005 Aug; 35(8):2416-23]. 특정 합성 화합물인, 이미다조퀴놀론 이미퀴모드(imidazoquinolones imiquimod) (R-837) 및 레시퀴노드(resiquimod) (R-848)가 TLR7 및 TLR8의 리간드이다[참조: Hemmi H et al., (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al, (2002) Nat Immunol 3:499]. 또한, 특정 구아노신 유사체, 예컨대, 7-데아자-G, 7-티아-8-옥소-G (TOG), 및 7-알릴-8-옥소-G (록소리빈(loxoribine))은 높은 농도에서 TLR7를 활성화시키는 것으로 나타났다[참조: Lee J et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100:6646-51]. 그러나, 이러한 소분자, 예를 들어, 이미퀴모드는 또한 다른 수용체를 통해 작용하는 것으로 공지되어 있다[참조: Schon MP, et al., J. Invest Dermatol., 2006, 126, 1338-47].
TLR7 또는 TLR8 인식을 위한 임의의 공지된 특이적 ssRNA 모티프의 결여 및 가능하게는 넓은 범위의 자극성 ssRNA 분자는, TLR7 및 TLR8이 자가 및 바이러스 RNA 둘 모두를 인식할 수 있음을 시사한다. 최근에는, 특정 GU-풍부 올리고리보누클레오티드가 N-[l-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄에틸설페이트 (DOTAP) 또는 그 밖의 지질 제제로 착화된 경우, 면역자극성이고, TLR7 및 TLR8를 통해 작용하는 것으로 나타났다[참조:Heil et al. Science, 303: 1526-1529 (2004); Lipford et al. WO03/086280; Wagner et al. WO98/32462]. 그러나, RNA 분자는 오랫동안, 예를 들어, 리보자임 및 siRNA로서 사용되었고, 리보자임 및 siRNA로서 사용된 RNA는 GU 디누클레오티드를 함유한다. 또한, 다수의 이러한 RNA 분자는 지질의 존재 하에서 TLR 자극을 통해 면역 반응을 일으키는 것으로 나타났다[참조: Kariko et al., Immunity (2005) 23: 165-75; Ma Z et al., Biochem Biophys Res Commun., (2005) 330, 755-9]. 그러나, 이러한 RNA 분자의 불안정성이 많은 분야에서 이러한 분자를 사용하고 적용함에 있어서의 발전을 방해한다.
리보오스 또는 데옥시리보오스 당을 함유하는 올리고누클레오티드 및 올리고데옥시누클레오티드는 진단적 프로빙, PCR 프라이밍, 유전자 발현의 안티센스 억제, siRNA, 아프타머(aptamer), 리보자임, 및 톨형 수용체(TLR)에 기초한 면역치료제를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌, 광범위한 분야에서 사용되어 왔다. 보다 최근에, 많은 문헌에서는, 단독 사용을 위한 면역 조절제로서 또는 애주번트로서 알레르기, 천식, 자가면역성, 암 및 감염성 질환과 같은 많은 질병에 대한 면역치료 적용에서 올리고데옥시누클레오티드의 용도를 입증하였다.
DAN 올리고누클레오티드가 TLR9에 의해 인식되고, RNA 올리고누클레오티드가 TLR7 및/또는 TLR8에 의해 인식된다는 사실은 DNA와 RNA 간의 구조적 형태에서의 차이에 의한 것으로 보인다. 그러나, DNA와 RNA 간의 화학적 차이가 또한 DNA가 RNA보다 훨씬 더 화학적으로, 그리고 효소적으로 안정하게 한다.
RNA는 거의 존재하지 않거나, 존재할 경우 자가-ssRNA가 항원 제공 세포에 도달하도록 보장하는, 편재하는 세포외 리보누클레아제(RNAse)에 의해 급격히 분해된다. 핵산의 엑소누클레아제 분해는 3'-누클레아제 분해가 우세하며, 작은 비율의 5'-엑소누클레아제 작용을 갖는다. 엑소누클레아제 분해작용 이외에, RNA는 또한 RNAse의 엔도누클레아제 활성에 의해 분해될 수 있다. RNA-기재 분자는 지금 까지는 지질과 착화되어서 누클레아제 안정성을 제공하였다.
그러나, 자가면역 반응성을 억제하는 본질적 기능을 제공하면서, 이러한 리보누클레아제는 또한 이들이 합성 및 천연 ssRNA 둘 모두를 신속하게 분해시킬 것이기 때문에 면역치료를 위해 이용하고자 계획된 임의의 합성 ssRNA에 대해 상당한 문제점을 제공한다. 이러한 장애를 극복하기 위해, ssRNA 분자를 분해로부터 보호하는 것이, 리포좀에서 ssRNA를 캡슐화시키고, 이것을 폴리에틸렌이민과 축합시키거나, 이를 N-[1 -(2,3 디올레오일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸아미노늄 메틸-설페이트(DOTAP)와 같은 분자에 착화시킴으로써 시도되었다. 그러나, 이러한 보호 조치는 여전히 불안정한 ssRNA에 적용되는 2차적인 조치이며, ssRNA(천연 또는 합성)의 생체내 효능 및 면역 조절 활성에 대한 이러한 보호 조치에 대한 효과는 여전히 불명료하다.
따라서, 네이키드(naked) RNA가 TLR7 및/또는 TLR 8에 대한 리간드로서 지속적으로 인식되도록 RNA를 유지하면서, 생체내 유용한 분자가 될 수 있도록 그 안정성을 개선시키는 것이 문제로 남아있다. 이상적으로, 이러한 문제는 새로운 면역치료제로서 작용할 수 있는 본래 안정한 RNA 기재 분자의 설계를 통해 해결될 수 있는 데, 이는 많은 임상적으로 관련된 응용, 예컨대, 동시 투여되는 경우에 백신접종의 효과를 개선시키거나, 면역 반응을 유발시키거나, 증진시키는 경우가 유리한 질병, 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증성 질환, 감염성 질환, 피부 질환, 알레르기, 천식 또는 병원균에 의한 질병을 치료 및/또는 예방하는 것에서의 용도를 발견할 것이다.
발명의 요약
제 1 양태에서, 본 발명은 하기 추가로 규정된 신규한 부류의 안정화된 면역 조절성 RNA ("SIMRA") 화합물 및 면역 반응을 유도하고/거나 증가시키는 이의 사용 방법을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다. 본 발명에 따른 신규한 화학 물질은 면역 반응 유도에 실질적으로 더욱 효과적이며, 분해에 실질적으로 덜 민감한, 면역 반응 유도 및/또는 증강 화합물을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역치료 적용에 SIMRA에 의해 생성된 사이토카인 프로파일을 변형시킬 수 있다.
제 1 양태의 구체예에서, 본 발명은 TLR8에 대한 효능제 (agonist)로서 SIMRA 화합물을 제공한다.
제 1 양태의 추가의 구체예에서, 본 발명은, TLR7 및 TLR8에 대한 효능제로서 SIMRA 화합물을 제공한다.
제 1 양태의 추가의 구체예에서, 본 발명은 TLR7에 대한 효능제로서 SIMRA 화합물을 제공한다.
제 1 양태의 추가의 구체예에서, 본 발명은 애주번트로서 SIMRA 화합물을 제공한다.
제 2 양태에서, 본 발명은 약제 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 본 발명의 처음 세 양태에 기술된 조성물중 어느 하나를 포함한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 SIMRA 화합물을 척추동물에 투여하는 것을 포함하여, 척추동물에서 면역반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다.
제 4 양태에서, 본 발명은 면역 반응 유도 및/또는 증강이 이로운 질환 또는 질병 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증 질환, 감염 질환, 피부 질환, 알레르기, 천식 또는 병원균에 의해 초래된 질환을 갖는 척추동물을 치료학적으로 치료하는 방법으로서, 이러한 질환 또는 질병에 걸린 환자에 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 SIMRA 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
제 5 양태에서, 본 발명은 척추동물에서 면역 반응 유도 및/또는 증강이 이로운 질환 또는 질병 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증 질환, 감염 질환, 피부 질환, 알레르기, 천식 또는 병원균에 의해 초래된 질환을 예방하는 방법으로서, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 척추동물에 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 SIMRA 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
제 6 양태에서, 본 발명은 사이토카인 또는 케모카인 (예를 들어, 면역 세포, PBMC)를 생성할 수 있는 세포를 분리하고, 이러한 세포를 표준 세포 배양 조건하에서 배양하고, 생체외에서 이러한 세포를 SIMRA로 처리하여 분리된 세포가 증가된 수준의 사이토카인 또는 케모카인을 생성하거나 분비하도록 하고, 처리된 세포를 질환의 예방 또는 치료를 위해 사이토카인 또는 케모카인 치료가 필요한 환자에 투여하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 SIMRA 화합물의 직렬 합성을 위한 합성 개략도이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 2는 본 발명의 SIMRA 화합물의 평행 합성을 위한 개략도이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 3은 본 발명의 SIMRA 화합물의 직렬 합성에 적합한 대표적인 알킬 링커의 그룹을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 SIMRA 화합물의 평행 합성에 적합한 대표적인 소분자 링커의 그룹을 나타낸다.
도 5A는 천연 포스포디에스테르 RNA 20-머가 1% 인간 혈청중에 10분 미만에서 완전히 분해됨을 보여준다. 도 5B는 동일한 서열의 포스포로티오에이트 백본 변형된 RNA가 동일한 조건하에 비교적 안정적이며, 약 50%의 고유의 올리고가 10분 말기에도 존재함을 보여준다. 도 5C는 3'-말단을 통해 부착된 두개의 포스포로티오에이트 백본 변형된 RNA가 더욱 안정적이며, 고유 RNA의 약 78% 이상이 10분 후에도 유지됨을 보여주며, 이는 누클레아제 분해에 대한 분자의 증가된 안정성을 나타낸다. 도 5D는 3'-3'-결합된 포스포로티오에이트 백본 변형된 RNA의 5'-말단에 링커 또는 캡을 부착하면 5'-링커 또는 캡이 없는 RNA와 비교하여 안정도를 완만하게 증가함을 보여주며, 이는 주요 분해가 3'-말단에서 발생함을 나타낸다. 도 5E는 본 발명의 추가적인 포스포로티오에이트 백본 변형된 면역 조절성 화합물의 안정도를 나타낸다.
도 6은 ELISA에 의해 측정된, 본 발명의 SIMRA 화합물의 피하 투여 후 2시간에 C57BL/6 마우스로부터의 혈청중의 IL-12 수준을 나타내며, 이는 SIMRA 화합물 (예를 들어, SEQ ID NO 11)이 생체내에서 IL-12 분비를 유도할 수 있음을 입증한다.
도 7은 본 발명의 SIMRA 화합물 100mg/kg 투여량으로 투여된 마우스로부터의 혈청중의 사이토카인 프로파일을 나타내며, 이는 SIMRA 화합물 (예를 들어, SEQ ID NO 11)이 생체내 투여 후 사이토카인 생성을 유도함을 입증한다.
도 8A 및 8B는 본 발명의 SIMRA 화합물로 처리된 인간 PBMC로부터의 사이토카인/케모카인 프로파일을 나타내며, 이는 SIMRA 화합물 (예를 들어, SEQ ID NO 11)이 인간 PBMC에서 사이토카인 분비를 유도함을 보여준다.
도 9는 본 발명의 SIMRA 투여 후 4시간에 종양 세포 주입된 마우스에서 ELISA에 의해 측정된 혈청 IL-12 농도를 나타내며, 이는 종양 함유 포유동물에 SIMRA 화합물 투여 후 IL-12의 양이 증가됨을 보여준다.
도 10은 본 발명의 SIMRA 화합물 투여 후 마우스 종양 모델에서 종양 결절의 수를 나타내며, 이는 SIMRA 화합물이 생체내 투여 후 종양 결절의 수를 감소시킴을 보여준다.
도 11A 내지 11D는 본 발명의 SIMRA 화합물로 처리된 인간 PBMC 및 pDC로부터의 사이토카인/케모카인 프로파일을 나타낸다. 도 11A 내지 11D는 SIMRA 화합물이 록소리빈 또는 7-데아자-G 보다 더욱 견고하고 구별되는 사이토카인/케모카인 프로파일을 유도함을 보여준다. 도 11A 내지 11D는 추가로 SIMRA 화합물의 백본, 링커, 결합 및/또는 캡에 대한 변형이 독특하고 별개의 사이토카인/케모카인 프로파일을 생성하는 SIMAR를 초래한다는 것을 보여준다.
도 12는 SIMRA 화합물의 투여 후 24시간에 시아노몰구스 원숭이에서 혈액 프로파일에서의 변화를 나타내며, 이는 SIMRA 화합물이 선택된 면역 세포에서 효과를 유도할 수 있음을 보여준다.
도 13A 및 13B는 SIMRA 화합물 투여 후 24시간에 ELISA에 의해 측정된 시아노몰구스 원숭이에서 혈장 사이토카인/케모카인 농도를 나타내며, 이는 SIMRA 화합물 (예를 들어, SEQ ID NO 11 및 30)이 생체내에서 사이토카인/케모카인 프로파일에 영향을 끼칠 수 있음을 보여준다.
도 14는 0시간과 비교하여 투여 후 24시간에 유세포 분류기에 의해 측정된, 시아노몰구스 원숭이에서 T-조절 세포 수, 총 T-세포 수, 단핵구 수, NK 세포 수 및 B-세포 수에서의 변화를 나타내며, 이는 SIMRA 화합물이 생체내 면역 반응 조절에 효과적임을 보여준다. 더욱 특히, 이들 데이타는 SIMRA 화합물이 선택된 면역 세포에 대한 효과를 유도할 수 있음을 보여준다.
도 15는 유세포 분류기에 의해 측정된, 0시간과 비교하여 투여 후 24시간에 시아노몰구스 원숭이에서 면역 세포에 대한 활성 마커 CD69의 변화를 나타낸다. 도 15는 SIMRA 화합물이 생체내에서 상이한 면역 세포 군집을 활성화시키는데 효과적임을 보여준다. 더욱 특히, 이들 데이타는 SIMRA 화합물이 선택된 면역 세포에 대한 효과를 유도할 수 있음을 보여준다.
본 발명은 면역치료 적용을 위한 면역 조절제로서의 올리고리보누클레오티드의 치료학적 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 TLR7 단독, TLR7과 TLR8, 또는 TLR8 단독을 통해 면역 반응을 조절하는 생체내 안정도가 증가된 RNA-기재 올리고누클레오티드 (SIMRA 화합물)를 제공한다. 예를 들어, TLR7 및/또는 TLR8의 안정한 효능제 또는 SIMRA 화합물로 수지상 세포 및 기타 항원-제시 세포를 활성화시켜 다양한 선천성 및 후천성 면역 반응 메카니즘을 개시시킴으로써, 생성된 사이토카인 프로파일이 병원균, 감염된 세포 또는 종양 세포의 파괴 및 항원-특이적 항체 및 CTL 반응의 전개를 유도할 수 있다. 본원에 언급된 공개된 특허, 특허 출원 및 참고 문헌은 이들 각각이 참조로서 인용됨을 특정하고 개별적으로 기재한 것과 동일한 범위로 참조로서 인용된다. 인용된 참조의 교시 내용과 본 명세서 간의 대립시 본 명세서를 기준으로 한다.
본 발명은 면역치료 적용 예컨대, 비제한적으로, 성인과 소아, 및 가축물의 암, 자가면역 질환, 천식, 호흡기 알레르기, 음식 알레르기, 피부 알레르기, 및 박테리아, 기생충 및 바이러스 감염의 치료에 사용된 SIMRA 화합물에 의해 초래된 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 추가로, 면역치료를 위한 최적의 면역 조절 효과 수준을 갖는 SIMRA 화합물, 및 이러한 화합물을 제조하고 이용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 SIMRA 화합물은 질환의 예방 및 치료를 위한 SIMRA 화합물의 면역 조절 효과를 저하시키지 않는, 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 제제와 함께 애주번트로서 유용하다.
정의
용어 "2'-치환된 리보누클레오시드" 또는 "2'-치환된 아라비노시드"는 일반적으로, 리보누클레오시드 또는 아라비노누클레오시드를 포함하며, 여기서 오탄당 부분의 2'번 위치에서 히드록시기가 치환되어 2'- 치환된 또는 2'-O-치환된 리보누클레오시드를 생성한다. 특정 구체예에서, 이러한 치환은 1개 내지 6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하는 저급 히드로카르빌기, 할로겐 원자 또는 탄소 원자가 6 내지 10개인 아릴기로 이루어 지며, 여기서, 이러한 히드로카르빌 또는 아릴기는 비치환되거나 예를 들어, 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시, 또는 아미노기로 치환될 수 있다. 2'-O-치환된 리보누클레오시드 또는 2'-O-치환된-아라비노시드의 예는 비제한적으로, 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 2'-O-알킬 및 2'-프로파르길 리보누클레오시드 또는 아라비노시드, 2'-O-메틸리보누클레오시드 또는 2'-O-메틸아라비노시드 및 2'-O-메톡시에톡시리보누클레오시드 또는 2'-O-메톡시에톡시리보누클레오시드를 포함한다.
직접적으로 사용된 경우, 용어 "3'"은 일반적으로, 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드의 특정 영역 또는 위치로부터 동일한 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 3' (당의 3' 위치 방향으로)에 존재하는 또 다른 영역 또는 위치를 나타낸다.
본원에 직접적으로 사용된 경우, 용어 "5'"는 일반적으로, 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드의 특정 영역 또는 위치로부터 동일한 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 5' (당의 5' 위치 방향으로)에 존재하는 또 다른 영역 또는 위치를 나타낸다.
용어 "약"은 일반적으로, 정확한 수치가 중요치 않다는 것을 의미한다. 따라서, 올리고리보누클레오티드에서 리보누클레오시드 잔기의 수는 중요하지 않으며, 1개 또는 2개 더 적은 리보누클레오시드 잔기를 갖거나, 1개 내지 수개의 추가의 리보누클레오시드 잔기를 갖는 올리고리보누클레오티드도 상기 기술된 각 구체예의 각각의 동등물로서 고려된다.
용어 "애주번트"는 일반적으로 면역원성 제제 예컨대, 백신 또는 항원에 첨가되는 경우, 이러한 혼합물에 노출시 수용 숙주에서 제제에 대한 면역 반응을 증강시키거나 효력을 증가시키는 물질을 나타낸다.
용어 "기도 염증"은 일반적으로, 비제한적으로, 천식을 포함하는 감염성 알레르기에 의해 초래된 호흡관 염증을 포함한다.
용어 "알레르겐"은 피검체에 노출시 알레르기 반응을 유도해내는 분자 일반적으로, 단백질의 항원 또는 항원부를 나타낸다. 전형적으로, 피검체는 예를 들어, 당업계에 공지된 방법 또는 힐 및 플레어 테스트 (wheal and flare test)에 의해 나타나는 바와 같이 알레르겐에 대해 알레르기를 일으킨다. 피검체의 단지 작은 서브셋이 분자에 노출시 알레르기 (예를 들어, IgE) 면역 반응을 나타내는 경우에도 상기 분자는 알레르겐으로 불린다.
용어 "알레르기"는 일반적으로, 음식물 알레르기 및 호흡기 알레르기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "항원"은 일반적으로, 항체 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 인지되고 선택적으로 결합되어, 면역 반응을 유도하는 물질을 나타낸다. 항원은 펩티드, 단백질, 누클레오시드, 누클레오티드 및 이의 조합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항원은 천연 항원 또는 합성 항원일 수 있으며, 일반적으로, 그러한 항원에 특이적인 면역 반응을 유도한다.
용어 "자가면역 질환"은 일반적으로 "자가" 항원이 면역 시스템에 의해 공격받는 질환을 의미한다.
3' 또는 5' 분해 차단 또는 "캡" 또는 "캡핑"은 올리고누클레오티드의 3' 또는 5' 말단이 또 다른 분자 (예를 들어, 링커 또는 또 다른 비-RNA 누클레오티드)에 부착하여 누클레아제 분해 (예를 들어, 3' 엑소누클레아제 분해)를 효과적으로 억제함을 의미한다.
용어 "담체"는 일반적으로 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 비히클, 미소구체, 리포좀, 캡슐화물 또는 약제학적 제형에 사용되는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포함한다. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특징은 특정적용에 대한 투여 경로에 따라 좌우되는 것으로 이해되어야 한다. 이들 물질을 함유하고 있는 약제학적으로 허용가능한 제형의 제법은 문헌에 기술되어 있다 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed., A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990).
용어 "공동-투여"는 일반적으로 면역 반응을 조절하기 위해 충분히 근접한 시간에 2개 이상의 상이한 물질을 투여하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 공동-투여는 2개 이상의 상이한 물질의 동시 투여를 의미한다.
용어 "상보적인"은 일반적으로, 핵산에 하이브리드화되는 능력을 가진 것을 의미한다. 이러한 하이브리드화는 보통 염기 스태킹(base stacking) 뿐만 아니라 그 밖의 수소결합 모드가 하이브리드화를 유도할 수 있지만, 바람직하게는, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 휴그스틴(Hoogsteen) 염기쌍을 형성하기 위한 상보적인 가닥 사이의 수소 결합의 결과이다.
용어 "유효량" 또는 "충분량"은 일반적으로, 유익한 결과와 같은 목적하는 생물학적 효과에 영향을 미치기에 충분한 양을 의미한다. 따라서, "유효량" 또는 "충분량"은 투여되는 상황에 의존적일 것이다. 유효량은 1회 또는 그 초과의 투여로 투여될 수 있다.
용어 "면역 조절성 올리고리보누클레오티드"는 일반적으로 척추동물 예컨대, 물고기, 가금류 또는 포유동물에 투여되는 경우 면역 반응을 유도하거나 억제하는 올리고리보누클레오티드를 의미한다.
용어 "～과 함께"는 일반적으로, 동일한 환자에서 동일한 질환을 치료하는 과정중에 있음을 의미하며, SIMRA 화합물, 및 SIMRA 화합물의 면역 조절 효과를 저하시키지 않는, 질환 또는 질병 치료에 유용한 제제를 동시 투여 및 수초에서 수일의 간격을 두고 투여하는 것을 포함한다. 그러한 병용 처리는 또한 SIMRA 화합물 및/또는 독립적으로 제제의 1회 초과의 투여를 포함할 수 있다. SIMRA 화합물 및 제제의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
용어 "개체" 또는 "피검체"는 포유동물 예컨대, 인간을 나타낸다. 포유동물은 일반적으로, 인간, 인간외 영장류, 래트, 마우스, 고양이, 개, 말, 소, 젖소, 돼지, 양 및 토끼를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "직렬 합성(linear synthesis)"은 면역 조절성 올리고리보누클레오티드의 한쪽 말단에서 개시하여 다른 말단으로 직렬로 진행하는 합성을 말한다. 직렬 합성은, 동일하거나 동일하지 않은(길이, 염기 조성 및/또는 혼입된 화학적 변형의 측면에서) 단량체 단위가 면역 조절성 올리고리보누클레오티드에 혼입되도록 한다.
용어 "변형된 누클레오시드"는 일반적으로, 변형된 헤테로시클릭 염기, 변형된 당 잔기, 또는 이의 조합물을 포함하는 누클레오시드이다. 일부 구체예에서, 변형된 누클레오시드는 본원에 기술된 것으로서 비-천연 피리미딘 또는 푸린 누클레오시드이다. 본 발명의 목적을 위해서, 변형된 누클레오시드, 피리미딘 또는 퓨린 유사체, 또는 비천연 발생 피리미딘 또는 퓨린이 혼용되어 사용될 수 있으며, 비천연 발생 염기 및/또는 비천연 발생 당 부분을 포함하는 누클레오시드를 나타낸다. 본 발명의 목적을 위해서, 염기는 구아닌, 시토신, 아데닌 또는 우라실이 아닌 경우 비천연인 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 변형된 누클레오시드는 2'-치환된 리보누클레오시드, 아라비노누클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노시드이며, 이는 올리고리보누클레오티드의 선택된 위치로 치환되어 TLR7 또는 TLR8 활성을 간섭하지 않으면서 안정도를 향상시킬 수 있다.
용어 "조절" 또는 "자극"은 일반적으로 변화 예컨대, 반응의 증가 또는 반응에서의 정성적 차이를 나타내며, 이는 반응의 유도 및/또는 증강으로부터 발생할 수 있다.
용어 "링커"는 일반적으로 당, 염기 또는 백본을 통해 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 올리고리보누클레오티드에 부착될 수 있는 부분을 나타낸다. 링커는 두개 또는 그 초과의 누클레오시드를 부착시키는데 사용될 수 있거나, 올리고리보누클레오티드에서 5' 및/또는 3' 말단 누클레오티드에 부착될 수 있다. 이러한 링커는 비-누클레오티드 링커 또는 누클레오티드 링커일 수 있다.
용어 "비-누클레오티드 링커"는 일반적으로, 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 올리고리보누클레오티드에 부착될 수 있는 누클레오티드 결합부 이외의 화학 부분을 나타낸다. 바람직하게는, 이러한 비누클레오티드 링커는 약 2 옹스트롬 내지 약 200 옹스트롬의 길이를 가지며, 시스 또는 트랜스 형일 수 있다.
용어 "누클레오티드 결합"은 일반적으로, 인접한 누클레오시드 사이에 인, 비인 (non-phosphate), 하전된 또는 중성 기 (예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트)로 이루어진 이들의 당을 통해 두개의 누클레오시드를 연결시키는 화학 결합 (예를 들어, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5')을 나타낸다.
용어 "회문식 서열"은 자가-상보적 또는 역으로도 반복됨을 뜻한다 (즉, ABCDEE'D'C'B'A'와 같은 서열, 여기서, A와 A', B와 B' 등은 이용가능한 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 염기이다). 생체내에서, 이러한 서열은 분자내 또는 분자간 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다.
용어 "펩티드"는 일반적으로 펩티드가 합텐인지의 여부에 상관없이 생물학적 반응 예를 들어, 항체 생성 또는 사이토카인 활성에 영향을 끼치는 충분한 길이의 폴리펩티드 및 조성물을 나타낸다. 용어 "펩티드"는 변형된 아미노산 (천연 또는 비천연 발생)을 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 변형은 비제한적으로, 포스포릴화, 글리코실화, 페길화, 지질화, 및 메틸화를 포함한다.
용어 "PBMC"는 일반적으로 말초혈액 단핵 세포를 나타낸다.
용어 "생리학적으로 허용되는"은 일반적으로, SIMRA 화합물의 유효성을 간섭하지 않으며, 생물학적 시스템 예컨대, 세포, 세포 배양물, 조직 또는 유기체와 양립되는 물질을 나타낸다. 바람직하게는, 생물학적 시스템은 살아있는 유기체 예컨대, 척추동물이다.
용어 "SIMRA"는 일반적으로, TLR7 및/또는 TLR8에 의해 리간드로서 인지된 안정화된 면역 조절성 RNA 화합물을 나타내며, 여기서 화합물은 단일-가닥 RNA (ssRNA) 및/또는 이중-가닥 RNA (dsRNA), 및 이의 3' 말단을 보호(안정화)하기 위한 변형을 함유할 수 있으며 (예를 들어, 3' 분해를 차단함으로써, 3' 말단을 캡핑함으로써, 또는 두개 또는 그 초과의 올리고리보누클레오티드의 3' 말단을 연결시킴으로써), 단 SIMRA는 비변형된 올리고리보누클레오티드보다 생체내에서 더 안정적이며, 따라서, 이의 면역 조절에 영향을 끼친다. SIMRA는 변형된 올리고리보누클레오티드를 함유할 수 있다. SIMRA 화합물은 또한, 이의 5' 말단을 보호하기 위한 변형을 함유하여 (예를 들어, 5' 분해를 차단하거나 5' 말단을 캡핑함으로써) 올리고리보누클레오티드의 안정도를 추가로 향상시킬 수 있다. SIMRA는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 핵산은 예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 대안적 결합부를 통해 연결된 리보누클레오시드의 중합체이다. SIMRA는 리보오스 당 잔기에 공유적으로 부착된 퓨린 (아데닌 (A) 또는 구아닌 (G) 또는 이의 유도체 (예를 들어, 7-데아자-G 및 아라-G)) 또는 피리미딘 (시토신 (C) 또는 우라실 (U), 또는 이의 유도체) 염기 또는 이의 유도체로 이루어질 수 있다.
용어 "치료"는 유익하거나 목적하는 결과를 수득하고자 하는 방안으로서, 증상의 완화 또는 질환 진행의 지연 또는 개선을 포함할 수 있다.
용어 "바이러스 질환"은 일반적으로, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS) 및 헤르페스 조스터를 포함하나 이에 제한되지 않는 병인체로서 바이러스를 갖는 질환을 나타낸다.
제 1 양태에서, 본 발명은 SIMRA 화합물을 제공한다. 본 발명자들은 3' 말단을 보호하기 위한 면역 조절 올리고리보누클레오티드의 변형 (예를 들어, 3' 분해를 차단함으로써, 3' 말단을 캡핑함으로써, 또는 두개 또는 그 초과의 올리고리보누클레오티드의 3' 말단을 연결시킴으로써)이 놀랍게도 이의 면역 조절 능력에 영향을 끼친다는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 보호는 놀랍게도 올리고리보누클레오티드의 안정도를 향상시켜, 지질 결합 또는 기타 보호 수단의 필요성을 제거하였다. 또한, 5' 분해 차단 또는 5' 말단 캡핑이 올리고리보누클레오티드의 안정도를 추가로 개선시킬 수 있다.
본 발명에서, 신규한 SIMRA 화합물로의 TLR8의 활성화 및 면역 반응의 유도 (예를 들어, 사이토카인 프로파일의 변화)가 입증되었다. 게다가, 이러한 인간 TLR8 활성화 RNA에서 특정 화학적 변형부(들)의 혼입은 또한 TLR7을 활성화시킬 수 있으며, 이는 면역 반응을 유도하고, 사이토카인/케모카인 프로파일을 변화시킨다. 따라서, 본 발명자들은 놀랍게도, TLR8 및/또는 TLR7의 활성화를 통해, 이들과 결합된 사이토카인/케모카인 프로파일이 면역 조절성 올리고리보누클레오티드의 일부로서 변형된 염기, 변형된 당, 백본, 링커, 결합부 및/또는 캡을 포함하는 변형된 화학 구조를 이용함으로써 조절될 수 있음을 발견하였다.
일 구체예에서, 본 발명은 3' 말단에 결합된 2개 이상의 RNA-기재 올리고누클레오티드, 비-누클레오티드 링커에 대한 누클레오시드간 결합부 또는 작용기화된 누클레오염기 또는 당을 포함하는 면역 조절 화합물을 제공한다. 본 발명의 이러한 구체예는 하나 이상의 접근가능한 5' 말단을 가질 수 있다. 이러한 구조는 리피드 결합 또는 다른 보호 필요 없이 SIMRA 화합물에 대한 안정도 (예를 들어, 엑소누클레아제 활성의 억제)를 추가로 제공하는 것으로 측정되었다. SIMRA의 5'-말단은 SIMRA 화합물이 TLR7 및/또는 TLR8을 통한 면역 반응 조절을 억제하는 방식으로 변형되지 않는다.
이러한 양태의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 두개 이상의 올리고리보누클레오티드를 포함하며, 여기서 면역 조절성 화합물은 표 1의 구조식 I-X로 상세하게 나타낸 구조를 갖는다.
표 1: 올리고리보누클레오티드 구조식 I-X
Figure 112008077243768-pct00001
Figure 112008077243768-pct00002
도메인 A, B, C 및 D는 독립적으로 약 2 내지 약 35개의 리보누클레오티드일 수 있으며, 일부 구체예에서는, 약 2 내지 약 20개, 또는 약 2 내지 약 12개, 또는 약 2 내지 약 11개, 또는 약 2 내지 약 8개 리보누클레오티드 길이이다. 도메인 A, B, C 및/또는 D는 동일하거나 상이할 수 있다. 도메인 A, B, C 및 D는 독립적으로, 자가-상보적 도메인, 호모 또는 헤테로 리보누클레오티드 서열, 또는 링커를 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 2'-5' RNA일 수 있다. "n"은 1 내지 무한대일 수 있다.
"X"는 3' 또는 5'결합, 포스페이트기, 비-RNA 누클레오티드, 또는 지방족, 방향족, 아릴, 시클릭, 키랄, 아키랄 (achiral), 펩티드, 탄수화물, 지질, 지방산, 모노- 트리- 또는 헥사폴리에틸렌 글리콜, 또는 헤테로시클릭 부분일 수 있는 비-누클레오시드 링커, 또는 이의 조합을 통해 연결될 수 있는 도메인 A, B, C, 및/또는 D를 연결하거나 캡핑시키는 링커이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 비누클레오티드 링커에 의해 연결된 2개 이상의 올리고리보누클레오티드를 포함하는 SIMRA 화합물로서, 면역 조절 올리고리보누클레오티드의 서열이 적어도 부분적으로 자가-상보적일 수 있는 SIMRA 화합물을 제공한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 올리고리보누클레오티드의 상보적 서열은 세포간 수소 결합을 허용하여, 올리고리보누클레오티드 이차 구조를 제공한다. 추가적인 올리고리보누클레오티드는 함께 결합하여, 본 발명에 따른 올리고리보누클레오티드의 사슬 또는 멀티머를 생성시킬 수 있다.
유사한 고려가 상이한 염기 서열의 면역 조절성 올리고리보누클레오티드간의 분자간 염기 쌍에 적용된다. 따라서, 다수의 면역 조절성 올리고리보누클레오티드가 함께 사용되는 경우, 다수의 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 반드시는 아니나, 적어도 부분적으로 서로 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 다수의 면역 조절 올리고리보누클레오티드는 제 1 서열을 갖는 면역 조절성 올리고리보누클레오티드 및 제 2 서열을 갖는 면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 포함하며, 여기서, 제 1 서열 및 제 2 서열은 50% 이상 상보적이다. 예를 들어, 50% 이상 상보적인 두개의 8-머간에서와 같이, 이들은 4, 5, 6, 7 또는 8 G-C, A-U 및/또는 G-U 불안정 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 염기쌍은 반드시는 아니나, 상보적 면역 조절성 올리고리보누클레오티드의 한 말단에 위치한 염기를 포함할 수 있다. 상보성 정도는 면역 조절 올리고리보누클레오티드 사이의 정렬에 의존적일 수 있으며, 이러한 정렬은 단일- 또는 다중-누클레오시드 오버행을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상보성 정도는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 심지어 100%이다.
당업자에 의해 인지될 바와 같이, 기술된 면역 조절성 화합물은 도메인의 서열이 상보적이어서 분자간 수소 결합을 허용하기 때문에 이차 구조를 가질 수 있다. 게다가, 구조식 I 내지 X로부터 가정할 수 있는 바와 같이, 추가적으로 결합된 RNA-기재 올리고누클레오티드는 분자간 수소 결합을 통해 결합하여 사슬 또는 멀티머를 생성시킬 수 있으며, 여기서 임의의 수의 결합된 RNA-기재 올리고누클레오티드가 통합될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 3' 또는 5' 말단에서 결합된 또는 누클레오시드 결합부 또는 작용기화된 누클레오염기 또는 당 내지 비-누클레오티드 링커를 통해 결합된 2개 이상의 RNA-기재 올리고누클레오티드를 포함하는 면역 조절성 화합물을 제공하며, 여기서, 링커 (예를 들어, 캡)은 하나 이상의 5' 말단에 부착된다. 이러한 구조는 SIMRA 화합물에 대한 안정도 (예를 들어, 엑소누클레아제 활성의 억제)를 추가로 제공하는 것으로 입증되었다. SIMRA의 5'-말단은 SIMRA 화합물이 TLR7 및/또는 TLR8을 통한 면역 반응 조절을 억제하는 방식으로는 변형되지 않는다.
일부 구체예에서, 올리고리보누클레오티드는 각각 독립적으로, 약 2 내지 약 35개의 리보누클레오시드 잔기를 갖는다. 따라서, 특정 구체예에서, 올리고리보누클레오티드는 독립적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 리보누클레오티드 길이일 수 있다. 바람직하게는, 올리고리보누클레오티드는 약 4 내지 약 30개 리보누클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는, 약 4 내지 약 20개 리보누클레오시드 잔기 또는 약 4 내지 약 11개의 리보누클레오시드 잔기이다. 일부 구체예에서, 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 약 1 내지 약 18개, 또는 약 1 내지 약 11개, 또는 약 5 내지 약 14개 리보누클레오시드 잔기를 갖는 올리고리보누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 올리고리보누클레오티드는 11개 누클레오티드를 갖는다. 면역 조절성 올리고리보누클레오티드에 있어서, 바람직한 구체예는 약 1 내지 약 35개 리보누클레오티드, 바람직하게는, 약 5 내지 약 26개 누클레오티드, 더욱 바람직하게는, 약 13 내지 약 26개 리보누클레오티드를 갖는다. 바람직하게는, 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르, 포스포티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 리보누클레오시드간 결합을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 각 리보누클레오시드 단위는 헤테로시클릭 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로스, 아라비노스, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노스, 2'-O-치환된 아라비노스 또는 헥소스 당 기를 포함한다. 리보누클레오시드 잔기는 공지된 수많은 리보누클레오시드간 결합중 어느 하나에 의해 상호간에 결합될 수 있다. 그러한 리보누클레오시드간 결합으로는 비제한적으로, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 다리결합된 포스포르아미데이트, 다리결합된 메틸렌 포스포네이트, 다리결합된 포스포로티오에이트, 및 설폰 리보누클레오시드간 결합을 포함한다. 리보누클레오티드에 대한 컨쥬게이션 가능한 부위는 하기 화학식 XI에서 나타내었으며, 여기서 B는 헤테로시클릭 염기이다.
Figure 112008077243768-pct00003
본 발명의 SIMRA 화합물은 자연 발생 리보누클레오시드, 변형된 리보누클레오시드 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 신규한 SIMRA 화합물은 인간 TLR8에 의해 인지되며, 이러한 인간 TLR8 활성화 RNA에서 특정 화학적 변형부(들)의 혼입은 이들을 인간 TLR7에 의해 인지되게 하고, 면역 반응을 유도시킨다. 이러한 화학적 변형으로는 비제한적으로, 구아닌 유사체 예컨대, 7-데아자-G, 아라-G, 6-티오-G, 이노신, 이소-G, 록소리빈(loxoribine), TOG(7-티오-8-옥소)-G, 8-브로모-G, 8-히드록시-G, 5-아미노포르마이신 B, 옥소포르마이신, 7-메틸-G, 9-p-클로로페닐-8-아자-G, 9-페닐-G, 9-헥실-구아닌, 7-데아자-9-벤질-G, 6-클로로-7-데아자구아닌, 6-메톡시-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자-G(PPG), 2-(디메틸아미노)구아노신, 7-메틸-6-티오구아노신, 8-벤질옥시구아노신, 9-데아자구아노신 및 1-(B-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린을 포함한다. 화학적 변형은 비제한적으로, 아데닌 유사체 예컨대, 9-벤질-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)아데닌, 2-아미노-N2-O-, 메틸아데노신, 8-아자-7-데아자-A, 7-데아자-A, 비다라빈 (Vidarabine), 2-아미노아데노신, N1-메틸아데노신, 8-아자아데노신, 5-요오도투베르시딘 (Iodotubercidin)을 포함한다. 화학적 변형은 또한, 비제한적으로, 시토신 유사체를 포함한다. 화학적 변형은 또한, 비제한적으로 우라실 유사체 예컨대, 4-티오-U를 포함한다.
본 발명에 따른 "면역 조절성 올리고누클레오티드"는 비-누클레오티드 또는 누클레오티드 링커를 통해 작용기화된 리보오스 또는 작용기화된 리보누클레오염기에서 또는 3'- 또는 2'-말단에서 결합된 2개 이상의 올리고리보누클레오티드를 포함하는 SIMRA 화합물이다. 링커의 여러 예는 하기에 제시되어 있다. 비공유 결합은 비제한적으로, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, π-스태킹 상호작용 및 수소 결합을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 올리고리보누클레오티드로의 부착을 허용하는 작용기를 갖는 유기 부분이다. 이러한 부착은 바람직하게는, 안정한 공유 결합에 의해서 달성된다. 비제한적 예로서, 링커는 누클레오티드의 적합한 위치에 부착될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 링커는 3'-히드록실에 부착된다. 이러한 구체예에서, 링커는 바람직하게는, 히드록실 작용기를 포함하며, 이는 바람직하게는 포스페이트-기재 결합 예컨대, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 비-포스페이트 기재 결합에 의해 3'-히드록실에 부착된다.
일부 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 비제한적으로, 폴리펩티드, 항체, 지질, 항원, 알레르겐 및 올리고사카라이드를 포함하는 소분자, 거대분자 또는 생분자이다. 일부 다른 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 소분자이다. 본 발명의 목적을 위해, 소분자는 1,000Da 미만의 분자량을 갖는 유기 부분이다. 일부 구체예에서, 소분자는 750Da 미만의 분자량을 갖는다.
일부 구체예에서, 소분자는 지방족 또는 방향족 탄화수소이며, 이중 하나는 선택적으로, 올리고리보누클레오티드를 연결하거나 여기에 부착된 선형 사슬에 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 또는 티오우레아를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 소분자는 시클릭 또는 아시클릭 (acyclic)일 수 있다. 소분자 링커의 예로는 비제한적으로, 아미노산, 카르보히드레이트, 시클로덱스트린, 아다만탄, 콜레스테롤, 합텐 및 항생물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러나, 비-누클레오티드 링커를 기술하기 위한 목적으로, 용어 "소분자"는 누클레오시드를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 알킬 링커 또는 아미노 링커이다. 알킬 링커는 분지형 또는 비분지형, 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 포화된 또는 불포화된, 키랄, 아키랄 또는 라세미체 혼합물일 수 있다. 알킬 링커는 약 2 내지 약 18개 탄소 원자를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 알킬 링커는 약 3 내지 약 9개 탄소 원자를 가질 수 있다. 일부 알킬 링커는 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오에테르를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 이러한 알킬 링커는 1 프로판올, 1,2 프로판디올, 1,2,3 프로판트리올, 1,3 프로판디올, 트리에틸렌 글리콜 헥사에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜링커 (예를 들어, [-O-CH2-CH2-]n (n = 1-9)), 메틸 링커, 에틸 링커, 프로필 링커, 부틸 링커 또는 헥실 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이러한 알킬 링커는 펩티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 표 2에 기술된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
표 2: 대표적인 비-누클레오티드 링커
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일부 구체예에서, 소분자 링커는 화학식 HO-(CH2) o -CH(OH)-(CH2) p -OH의 글리세롤 또는 글리세롤 유사체이며, 여기서, o 및 p는 독립적으로, 1 내지 약 6, 1 내지 약 4, 또는 1 내지 약 3의 정수이다. 일부 기타 구체예에서, 소분자 링커는 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체이다. 일부 이러한 유도체는 화학식 HO-(CH2) m -C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2) m -OH를 가지며, 여기서, m은 0 내지 약 10, 0 내지 약 6, 2 내지 약 6, 또는 2 내지 약 4의 정수이다.
본 발명에 따른 일부 비-누클레오티드 링커는 표 1에 도시된 바와 같이 두개 초과의 올리고리보누클레오티드의 부착을 허용한다. 일부 예에서, 소분자 링커 글리세롤은 3개의 히드록실기를 가지며, 여기에 올리고리보누클레오티드가 공유적으로 부착될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 일부 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 3' 말단에서 비누클레오티드 링커에 결합된 2개 초과의 올리고리보누클레오티드 (예를 들어, 도메인 C 등, 추가적인 도메인은 도메인 A, B, C 및 D에 대해 상기 규정된 바와 같이 올리고리보누클레오티드를 포함함)를 포함한다.
본 발명의 이러한 양태의 추가적 구체예에서, SIMRA는 3' 또는 5' 말단에서, 또는 표 1에 도시된 바와 같이 2개 또는 그 초과의 링커 내지 누클레오시드간 결합 또는 작용기화된 누클레오염기 또는 당을 통해 결합된 3개 또는 그 초과의 올리고리보누클레오티드를 함유할 수 있다. 이러한 양태의 본 발명의 올리고리보누클레오티드는 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 이러한 양태의 링커는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 도 1 및 2에 개략적으로 도시되고 실시예에 기술된 바와 같이 자동화된 합성기 및 포스포르아미다이트 방법을 이용하여 편리하게 합성될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 직렬 합성법에 의해 합성된다 (도 1 참조).
대안적인 합성 양식은 "평행 합성(parallel synthesis)"이며, 여기서, 합성은 중심 링커 잔기로부터 밖으로 진행된다(도 2 참조). 고형 지지체에 부착된 링커가 미국 특허 제5,912,332호에 기술된 바와 같이 평행 합성에 사용될 수 있다. 달리는, (조절된 공극 유리 지지체에 부착된 포스페이트와 같은) 일반적인 고형 지지체를 사용할 수 있다.
면역 조절성 올리고리보누클레오티드의 평행 합성은 직렬 합성에 비해 몇가지 장점을 갖는다: (1) 평행 합성은 동일한 단량체 단위의 혼입을 허용한다; (2) 직렬 합성과는 달리, 양쪽 (또는 모든) 단량체 단위가 동시에 합성되므로, 합성 단계의 수 및 합성에 요구되는 시간이 단량체 단위의 것과 동일하다; 및 (3) 합성 단계의 감소는 최종 면역 조절성 올리고리보누클레오티드 생성물의 순도 및 수율을 증가시킨다.
직렬 합성 또는 평행 합성 프로토콜에 의한 합성 말기에, 변형된 누클레오시드가 혼입되는 경우, 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 진한 암모니아 용액으로 또는 포스포르아미다이트 공급업자에 의해 권고되는 바에 따라 편리하게 탈보호될 수 있다. 생성물인 면역 조절성 올리고리보누클레오티드는 바람직하게는 역상 HPLC에 의해 정제되고, 탈트리틸화되며, 탈염되고 투석된다.
표 3a는 본 발명에 따른 비제한적이고 대표적인 RNA-기재 면역 조절 올리고리보누클레오티드를 나타낸다.
표 3a. 안정화된 RNA-기재 면역 조절 올리고누클레오티드 (SIMRA) 서열의 예
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I = 이노신; U1 = dU; T1 = 리보T; G1 = 7-데아자-G; G2 = 아라-G; G3 = 6-티오-G; G4 = 1(β-d-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린; O = 록소리빈; X = 글리세롤; X1 = 1,3,5-펜탄트리올; X2 = X3 = C3 링커 또는 프로판디올; X4 = 트리(에틸렌글리콜); X5 = 1,5 펜탄디올; X6 = 2'-데옥시-아베이직; X7 = C3 아미노링커; X8 = 시스,시스-시클로헥산트리올; X9 = 시스,트란스-시클로헥산트리올; 밑줄 = 2'-O-Me-리보누클레오티드; P = 포스포로티오에이트; 소문자 = 포스포디에스테르 백본.
표 3b는 본 발명에 따른 일부 올리고리보누클레오티드에 의해 형성될 수 있는 비제한적인 대표적인 이차 구조를 나타낸다.
표 3b. SIMRA 화합물 일부에 의해 형성될 수 있는 구조의 예
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제 2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 SIMRA 화합물 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 제형을 제공한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 척추동물에서 TLR7 및/또는 TLR8 매개된 면역 반응을 생성시키는 방법으로서, 척추동물에 본 발명에 따른 SIMRA 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 척추동물은 포유동물이다. 바람직한 구체예에서, SIMRA 화합물은 면역 자극이 필요한 척추동물에 투여된다.
제 4 양태에서, 본 발명은 질환 또는 질병을 갖는 환자를 치료학적으로 처리하는 방법으로서, 환자에 본 발명에 따른 SIMRA 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 양태에서, 치료할 질환 또는 질병은 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 기도 염증, 염증 질환, 알레르기, 천식 또는 병원균에 의해 초래된 질환이다. 병원균은 박테리아, 기생충, 진균류, 바이러스, 비로이드 및 프리온을 포함한다.
제 5 양태에서, 본 발명은 질환 또는 질병을 예방하는 방법으로서, 환자에 본 발명에 따른 SIMRA 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 예방할 질환 또는 질병은 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 감염성 질환, 알레르기, 천식 또는 병원균에 의해 초래된 질환이다. 병원균은 박테리아, 기생충, 진균류, 바이러스, 비로이드 및 프리온을 포함한다.
제 6 양태에서, 본 발명은 면역 세포, T-조절 세포, B-세포, PBMC, pDC 및 림프구 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 사이토카인 또는 케모카인을 생성시킬 수 있는 세포를 분리하고; 이러한 세포를 표준 세포 배양 조건하에 배양하고, 이러한 세포를 분리된 세포가 증가된 수준의 사이토카인 또는 케모카인을 생성하거나 분비하도록 생체외에서 SIMRA로 처리하고, 처리된 세포를 질환의 예방 또는 치료를 위해 사이토카인 또는 케모카인 치료에 필요한 환자에 투여하거나 재투여하는 것을 포함하여, 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태는 활성화된 면역 세포를 생성하기 위한 표준의 입양 세포 면역치료 기법에 따른다.
본 발명의 이러한 양태의 일부 구체예에서, 사이토카인 또는 케모카인을 생성할 수 있는 세포는 질환 또는 질병이 있거나 없는 피검체로부터 분리될 수 있다. 이러한 분리는 동정 및 선택을 포함할 수 있으며, 하기 특정 실시예에서 제시된 공정을 포함하여, 표준 세포 분리 공정을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 분리된 세포는 표준 세포 배양 공정 및 표준 세포 배양 조건에 따라 배양될 것이며, 이는 하기 특정 실시예에 제시된 배양 공정 및 조건을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구체예의 추가의 양태에서, 분리된 세포는, 하나 이상의 SIMRA의 부재하에 배양된 분리된 세포와 비교하여, 사이토카인 및/또는 케모카인의 생성 및/또는 분비를 유도하거나, 증가시키거나 증대시키기에 충분한 기간 동안 및 충분한 양의 하나 이상의 SIMRA의 존재하에 배양될 것이다. 이러한 시간은 수분 내지 수시간 내지 수일일 수 있다. 이러한 분리된 SIMRA-처리된 세포는 도너로의 재투여 후 또는 제 2 환자로의 투여 후의 용도를 발견할 수 있으며, 여기서 이러한 도너 또는 제 2 환자는 사이토카인 및/또는 케모카인의 유도되거나, 증가되거나 증대된 생성 및/또는 분비가 필요한 도너 또는 환자이다. 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증 질환, 감염성 질환, 알레르기, 천식 또는 병원균에 의해 초래된 질환을 갖는 도너로의 재투여 또는 제 2 환자로의 투여. 이러한 재투여 또는 투여는 카테터 또는 주입 투여 또는 다른 유효한 경로를 포함하는 다양한 방식을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태는 면역 반응을 증가시키는데 제한되거나 불완전한 능력을 가질 수 있거나 면역이 손상된 (예를 들어, HIV로 감염된 환자 및 골수 이식 환자) 환자에서 용도를 찾아볼 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, SIMRA 화합물은 단독으로 및/또는 SIMRA 화합물의 면역 조절 효과를 저하시키지 않는, 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하기에 유효한 다른 제제와 함께 직접적인 면역 조절 효과를 유도함으로써 다양하게 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하기에 유용한 제제(들)는 비제한적으로, 백신, 항원, 항체, 바람직하게는, 모노클로날 항체, 세포독성 제제, 알레르겐, 항생제, siRNA, 안티센스 올리고누클레오티드, TLR 효능제 (예를 들어, TLR9의 효능제 및/또는 TLR3의 효능제), 화학요법제 (전통적인 화학요법제 및 현대적인 표적 치료제), 표적 치료제, 활성화된 세포, 펩티드, 단백질, 유전자 치료 벡터, 펩티드 백신, 단백질 백신, DNA 백신, 애주번트 및 공동-자극 분자 (예컨대, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 트랜스-활성화 인자, 펩티드 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드), 또는 이의 조합물을 포함한다. 예를 들어, 암 치료에서, SIMRA 화합물은 하나 이상의 화학치료 화합물, 표적 치료제 및/또는 모노클로날 항체와 함께 투여될 수 있음이 고려된다. 대안적으로, 제제는 항원 또는 알레르겐을 엔코딩하는 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 대안적으로, SIMRA 화합물은 다른 애주번트와 함께 투여되어 SIMRA 화합물에 대한 면역 반응의 특이성 또는 정도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 단독의 또는 다른 제제와의 SIMRA 화합물의 투여는 비제한적으로, 비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 비내, 에어로졸, 안내, 기관내, 직장내, 질, 유전자총, 피부 패치 또는 안약 또는 구강세정 형태를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. SIMRA 화합물의 치료학적 조성물의 투여는 질환의 증상 또는 대리 마커를 감소시키는데 효과적인 투여량 및 기간 동안 공지된 공정을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 질환 및/또는 질병을 치료하기 위한 유효량의 SIMRA는 증상을 완화시키거나 저하시키거나, 종양, 암, 또는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 지연시키거나 개선시키는데 필요한 양일 수 있다. 백신 애주번트로서 사용하기에 유효한 양은 백신 또는 항원에 대한 피검체의 면역 반응을 부스팅하는데 유용한 양일 수 있다. 공동 투여된 항원에 대한 변역 반응을 조절하는 조성물 투여에 있어서, 유효량의 SIMRA 화합물 및 항원은 항원이 단독으로 투여되는 경우 달성된 면역 반응과 비교하여 목적하는 조절을 달성하는데 효과적인 양이다. 임의의 특정 적용에 유효한 양은 치료할 질환 또는 상태, 투여될 특정 올리고누클레오티드, 피검체의 크기, 또는 질환 또는 상태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 특정 올리고누클레오티드의 유효량을 경험에 의해 측정할 수 있다.
전신 투여되는 경우, 치료학적 조성물은 바람직하게는, 약 0.0001 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 SIMRA 화합물의 혈중 수준을 달성하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 국소화된 투여에 있어서, 이 보다 훨씬 더 적은 농도가 효과적일 수 있으며, 더 높은 농도에도 내약성이 있다. 바람직하게는, SIMRA 화합물의 전체 투여량은 일일당 환자 체중 kg당 약 0.001mg 내지 약 200mg이다. 단일 치료 요법으로서 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물이 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것이 바람직할 수 있다.
SIMRA 화합물은 선택적으로, 하나 이상의 알레르겐 및/또는 항원 (자가 또는 이종), 면역원성 단백질 예컨대, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 또는 임의의 기타 면역원성 담체 단백질에 연결될 수 있다. SIMRA는 또한, 비제한적으로, TLR 효능제 (예를 들어, TLR2 효능제 및 TLR9 효능제), 프레운드 불완전 애주번트 (Freund's incomplete adjuvant), KLH, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 알룸, 및 QS-21 및 이미퀴모드를 포함하는 사포닌, 또는 이들의 조합물을 포함하는 기타 화합물 (예를 들어, 애주번트)와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 면역계의 모델 연구에 유용하다. 본 방법은 또한, 인간 또는 동물 질환의 예방학적 또는 치료학적 처치에 유용하다. 예를 들어, 본 방법은 소아 및 가축 백신 적용에 유용하다.
하기 예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 추가로 설명하고자 하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
면역 조절성 올리고리보누클레오티드 합성
면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 자동화된 DNA/RNA 합성기에서 포스포르아미다이트 화학법을 이용하여 화학적으로 합성하였다. TAC 보호된 (U 제외) 2'-O-TBDMS RNA 모노머, A, G, C 및 U를 시그마-알드리히로부터 구입하였다. 7-데아자-G, 이노신 및 록소리빈 모노머를 켐진스 코포레이션 (ChemGenes Corporation)으로부터 구입하였다. 0.25M 5-에틸티오-1H-테트라졸, PAC-언히드라이드 캡 A 및 캡 B는 글렌 리서치 (Glen Research)로부터 구입하였다. 디클로로메탄 (DCM)중의 3% 트리클로로아세트산 (TCA) 및 5% 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥시드 (뷰케이지 시약 (Beaucage reagent))를 자체 제조하였다.
면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 표준 RNA 합성 프로토콜을 사용하여 1-2μM 스케일로 합성하였다.
절단 및 염기 탈보호
면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 고형 지지체로부터 절단하고, 용액을 엑소 시클릭-아민의 보호기를 제거하도록 65℃에서 추가로 가열하였다. 생성된 용액을 스피드백 (SpeedVac)에서 완전하게 건조시켰다.
IE HPLC 정제
면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다.
칼럼: 디오넥스 DNAPac 100 칼럼 (22X250)
칼럼 히터: 크롬테크 (ChromTech) TL-105 HPLC 칼럼 히터, 온도는 80℃로 고정
완충제 A: 20mM 트리스-HCl, pH 7.0, 20% 아세티니트릴
완충제 B: 3.0M NaCl, 20mM 트리스-HCl, pH 7.0, 20% 아세토니트릴
유속: 10ml/min
구배:
0-2min: 0% B
2-11min: 0% B에서 35% B
11-41min: 35% B에서 90% B
41-45min: 100% B
미정제 면역 조절성 올리고리보누클레오티드 용액을 HPLC로 주입하였다. 상기 구배를 수행하고, 분획을 수집하였다. 90% 초과의 목적하는 생성물을 함유하는 모든 분획을 혼합한 후, 용액을 로토밥 (RotoVap)에 의해 농축하여 거의 건조시켰다. RNAse-비함유 물을 첨가하여 최종 부피를 10ml가 되게 하였다.
C-18 역상 탈염
워터스 (Waters)로부터 구입한 CC-18 셉-팍 (Sep-Pak) 카트리지를 먼저 10ml 아세토니트릴 및 이어서 10ml의 0.5M 나트륨 아세테이트로 컨디셔닝시켰다. 10ml의 면역 조절성 올리고리보누클레오티드 용액을 로딩하였다. 그 후, 15ml의 물을 사용하여 염을 세척 제거하였다. 면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 물중의 1ml의 50% 아세토니트릴에 의해 최종적으로 용리시켰다.
용액을 30분 동안 스피드박 (SpeedVac)에 위치시켰다. 나머지 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과시키고, 동결 건조시켰다. 그 후, 고형물을 물에 재용해시켜 목적하는 농도게 되게 하였다.
최종 용액을 0℃ 미만에서 저장하였다.
모세관 전기영동
장치: 벡맨 (Beckman) 5010
모세관: 62cm ssDNA 모세관
샘플 제조: 0.2 OD의 SIMRA 화합물을 200ul의 RNAse-비함유 물중에 용해시켰다.
주입: 5KV에서 5초 동안 동전기 주입
수행 시간: 50분 동안 30℃에서 14KV
이온 교환 HPLC 분석
칼럼: 디오넥스 DNAPac 가드 칼럼 (Dionex DNAPac guard column) (22X250)
칼럼 히터: 크롬 테크 (ChromTech) TL-105 HPLC 칼럼 히터, 온도는 80℃로 고정
완충제 A: 100mM 트리스-HCl, pH 8.0, 20% 아세티니트릴
완충제 B: 2.0M LiCl, 100mM 트리스-HCl, pH 8.0, 20% 아세토니트릴
유속: 2ml/min
구배:
0-2min: 0% B
2-10min: 0% B에서 100% B
11-15min: 100% B
PAGE 분석
0.3 OD의 면역 조절성 올리고리보누클레오티드를 20% 폴리아크릴아미드 겔상 에 로딩하고, 약 5시간 동안 4와트의 일정 전력으로 수행하였다. 겔은 단파장 UV 광으로 관찰하였다.
인간 세포 배양 프로토콜
인간 PBMC 분리
건강한 혈액 기증자 (CBR 라보라토리스(CBR Laboratories, Boston, MA))로부터의 새로 추출한 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 피콜 밀도 구배 원심분리법 (Ficoll density gradient centrifugation method: Histopaque-1077, Sigma)에 의해 분리하였다.
인간 pDC 분리
건강한 혈액 기증자 (CBR 라보라토리스)로부터의 새로 추출한 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 피콜 밀도 구배 원심분리법 (Histopaque-1077, Sigma)에 의해 분리하였다. pDC를 제조업자의 지시에 따라 BDCA4 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성 선택에 의해 PBMC로부터 분리하였다.
사이토카인 ELISA
인간 PBMC를 5x106 세포/ml를 사용하여 48-웰 플레이트에 위치시켰다. pDC를 1X106 세포/ml를 이용하여 96-웰 디쉬에 위치시켰다. DPBS (pH 7.4; 메디아테크 (Mediatech))에 용해된 SIMRA를 세포 배양물에 최종 농도 100.0㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션시키고, 상청액을 루미넥스 멀티플렉스 (luminex multiplex) 또는 ELISA 검정을 위해 수집하였다. 실험은 삼중 웰로 수행하였다. IFN-α, IL-6 또는 TNF-α의 수준을 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 사이토카인 항체 및 기준을 포함하는 요구되는 시약을 파르밍겐 (PharMingen)으로부터 구입하였다.
루미넥스 멀티플렉스 검정을 루미넥스 100 장치상의 바이오소스 인간 멀티플렉스 사이토카인 검정 키트 (Biosource human multiplex cytokine assay kit)를 이용하여 수행하고, 데이타는 어플라이드 사이노메트리 시스템즈 (Applied Cytometyr Systems: Sacramento, CA)에 의해 공급된 스타스테이션 (StarStation) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
TLR을 발현하는 HEK293 세포의 분석 프로토콜
HEK293/인간 TLR7 또는 HEK293/인간 TLR8 세포 (Invivogen, San Diego, CA)를 5% CO2 인큐베이터에서 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 250㎕/웰 DMEM중에서 48-웰 플레이트에서 배양하였다.
리포터 유전자 형질전환
마우스 TLR9 또는 인간 TLR3, 7 또는 8 (Invivogen, San Diego, CA)를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 250㎕/웰 DMEM중에서 48-웰 플레이트에서 배양하였다. 80% 컨플루언스에서, 배양물을 배양 배지중에 4㎕/ml의 리포펙타민 (Invitrogen, Carlsbad, CA)의 존재하에 400ng/ml의 SEAP (인간 배아 알칼리성 포스파타아제의 형태로 분비됨) 리포터 플라스미드 (pNifty2-Seap) (Invivogen)으로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 플라 스미드 DNA 및 리포펙타민을 무혈청 배지중에서 별도로 희석하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 희석된 DNA 및 리포펙타민을 혼합하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 100ng의 플라스미드 DNA 및 1㎕의 리포펙타민을 함유하는 25㎕의 DNA/리포펙타민 혼합물의 분취물을 세포 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 배양을 4시간 동안 계속하였다.
IMO-처리
트랜스펙션 후, 배지를 새로운 배양 배지로 대체하고, SIMRA를 배지에 첨가하고, 배양을 18시간 동안 계속하였다. SIMRA 처리 말기에, 30㎕ 배양 상청액을 각각의 처리물로부터 취하고, 제조업자의 프로토콜 (Invivogen)에 따라 SEAP 검정에 사용하였다.
SEAP 검정
간단하게는, 배양 상청액을 p-니트로피닐 포스페이트 기질과 인큐베이션하고, 생성된 황색물을 405nm에서 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 데이타는 PBS 대조군에 대한 NF-κB 활성에서 배수 증가로서 나타났다 (Putta MR et al, Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8).
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00015
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00016
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00017
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00018
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00019
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00020
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00021
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00022
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00023
인간 TLR8을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00024
인간 TLR7을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00025
인간 TLR7을 발현하는 HEK293 세포의 NF-kB 활성의 배수 변화
Figure 112008077243768-pct00026
ELISA에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IFN-α (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00027
ELISA에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IFN-α (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00028
루미넥스 멀티플렉스에 의한 인간 PBMC 검정에서 IFN-α (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00029
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IFN-α (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00030
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IFN-α (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00031
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 pDC 검정에서 IFN-α (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00032
루미넥스 멀티플렉스에 의한 인간 PBMC 검정에서 IL-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00033
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IL-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00034
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IL-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00035
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IL-12의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00036
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IL-12의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00037
루미넥스 멀티플렉스에 의한 인간 PBMC 검정에서 IP-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00038
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IP-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00039
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IP-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00040
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 pDC 검정에서 IP-10의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00041
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IL-8의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00042
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 IL-8의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00043
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 MCP-1의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00044
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 MCP-1의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00045
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 MIP-1α의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00046
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 MIP-1α의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00047
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 MIP-1β의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00048
루미넥스 멀티플렉스에 의해 측정된 바와 같은 인간 PBMC 검정에서 MIP-1β의 수준 (pg/ml)
Figure 112008077243768-pct00049
인간 세포-기재 검정에서 사이토카인 분비
Figure 112008077243768-pct00050
인간 세포-기재 검정에서 사이토카인 분비
Figure 112008077243768-pct00051
인간 세포-기재 검정에서 사이토카인 분비
Figure 112008077243768-pct00052
마우스 모델에서 RNA 기재 올리고누클레오티드의 생체내 항암 활성
BALB/c 마우스를 3마리 마우스 군으로 분할하였다. 배양된 CT26.CL25 세포를 정맥내 (i.v.) 주입하였다 (4x105 세포/마우스). 본 발명에 따른 RNA 기재 올리 고누클레오티드 (SIMRA 화합물) 또는 대조군을 마우스에 50mg/kg의 용량으로 피하 (s.c.) 투여하였다. 1차 용량 투여 후 4시간째에, 마우스로부터 혈청을 취하고, IL-12 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. 마우스에 CT26.CL25 세포를 정맥내 투여한 후 24시간, 72시간 및 144시간 후에 추가로 피하 투여하였다. 14일에, 마우스를 희생시키고, 폐를 수집하였다. 도 10은 폐에서 발견된 종양 결절의 수를 나타낸다.
인간외 영장류에서 RNA 기재 올리고누클레오티드의 생체내 면역 반응
시아노몰구스 원숭이를 군당 4마리로 3군으로 나누었다 (염수군은 2마리). 본 발명에 따른 RNA 기재 올리고누클레오티드 (SIMRA 화합물) 또는 대조군을 5mg/kg의 용량으로 원숭이에 피하 투여하였다. 다른 투여량 (예를 들어, 1mg/kg) 또한 요망되는 효과를 가질 수 있다. 투여 후 8, 16 및 24시간에, 혈청을 원숭이로부터 취하고, 사이토카인 및 케모카인 수준 및 면역 반응의 변화를 측정하였다. 결과는 도 12 내지 15에 도시되어 있다.
등가물
상기 발명은 명확성 및 이해를 목적으로 일부 상세하게 기술되었으나, 형태 및 상세 내역에 있어서의 다양한 변화가 본 발명의 진정한 범위 및 첨부된 청구범위로부터 벗어나지 않은채 수행될 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.
삭제
SEQUENCE LISTING <110> KANDIMALLA, EKAMBAR R. AGRAWAL, SUDHIR PUTTA, MALLIKARJUNA REDDY WANG, DAQING YU, DONG LI, YUKUI LAN, TAO <120> STABILIZED IMMUNE MODULATORY RNA (SIMRA) COMPOUNDS FOR TLR7 AND TLR8 <130> IDR-043US1 <140> 11/697,422 <141> 2007-04-06 <150> 60/790,466 <151> 2006-04-07 <150> 60/863,926 <151> 2006-11-01 <150> 60/827,835 <151> 2006-10-02 <160> 127 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ugcugcuucu g 11 <210> 2 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 cugugcuucu c 11 <210> 3 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ucugugcuuc u 11 <210> 4 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> inosine <220> <221> 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<223> dU <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> dU <400> 9 ugcugcuucu g 11 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> riboT <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> riboT <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> riboT <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> riboT <400> 10 tgctgcttct g 11 <210> 11 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 7-deaza-G <400> 11 ugcugcuucu g 11 <210> 12 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 7-deaza-G <400> 12 guccuucaac u 11 <210> 13 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Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> loxoribin <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> loxoribin <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> loxoribin <400> 17 uncuncuucu n 11 <210> 18 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> inosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> inosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> inosine <400> 18 uncuncuucu n 11 <210> 19 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> inosine <400> 19 nuccuucaac u 11 <210> 20 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-Me-ribo-U <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 7-deaza-G <400> 111 ugcugccuuu g 11 <210> 112 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 7-deaza-G <400> 112 guccuuugcu g 11 <210> 113 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 7-deaza-G <400> 113 guccuuugcu g 11 <210> 114 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 ugcugcuugu g 11 <210> 115 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gcugccuuug 10 <210> 116 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ugcugcuugu g 11 <210> 117 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 ugcugcuugu g 11 <210> 118 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(6) <223> inosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(11) <223> inosine <400> 118 cccnnncccn n 11 <210> 119 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 tttttttttt ttttt 15 <210> 120 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 tttttttttt ttttt 15 <210> 121 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> dU <400> 121 uuuuuuuuuu uuuuu 15 <210> 122 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> inosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> inosine <400> 122 ccnnccnncc c 11 <210> 123 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> inosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> inosine <400> 123 ccnnccnncc 10 <210> 124 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base 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Claims (25)

  1. 3' 부착을 통해 연결된 2개 이상의 올리고리보누클레오티드를 포함하는 RNA-기재 화합물로서, 상기 올리고리보누클레오티드 각각은 5 내지 26개의 리보누클레오티드 길이이고, 상기 화합물은 지질과 결합되지 않은, RNA-기재 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 올리고리보누클레오티드들은 이들의 3' 말단에서 서로 직접 연결된 RNA-기재 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 올리고리보누클레오티드들의 3' 말단이 비-누클레오티드 링커 (non-nucleotidic linker)에 연결된 RNA-기재 화합물.
  4. 제 3항에 있어서, 비-누클레오티드 링커가 알킬 링커 또는 아미노 링커이며, 여기서 알킬 또는 아미노 링커는 선택적으로 분지형 또는 비분지형이고, 시클릭 또는 아시클릭 (acyclic)이고, 치환되거나 비치환되고, 포화되거나 불포화되고, 키랄, 아키랄 또는 라세미체 혼합물일 수 있는 RNA-기재 화합물.
  5. 제 4항에 있어서, 알킬 링커가 2 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있는 RNA-기재 화합물.
  6. 제 4항에 있어서, 알킬 링커가 3 내지 9개의 탄소 원자를 가질 수 있는 RNA-기재 화합물.
  7. 제 4항에 있어서, 알킬 링커가 1,2,3-프로판트리올, 글리세롤, 1,2,4-부탄트리올, 2-히드록시메틸-1,3-프로판디올, 1,1,1-트리스(히드록시메틸)에탄, 2-아미노-2-(히드록시메틸)1,3-프로판디올, 트리스(히드록시메틸)니트로메탄, 1,1,1-트리(히드록시메틸)프로판, 1,2,6-헥산트리올, 1,3,5-헥산트리올, 1,3,5-펜탄트리올, 3-메틸-1,3,5-펜탄트리올, 1,2,3-헵탄트리올, 2-(히드록시메틸)1,4-부탄디올, 1,3-디(히드록시메틸)페놀, 1,3,5-트리(히드록시메틸)벤젠, 1,3-디(히드록시에톡시)-2-히드록시-프로판, 1,3-디(히드록시프로폭시)-2-히드록시-프로판, D-갈락탈, 1,3,5-트리스(2-히드록시에틸)시아누르산 또는 1,3,5-트리스(4-히드록시페닐)벤젠으로부터 선택되는 RNA-기재 화합물.
  8. 제 1항에 있어서, RNA-기재 올리고리보누클레오티드 중 하나 이상이 변형된 올리고리보누클레오티드를 포함하는 RNA-기재 화합물.
  9. 제 8항에 있어서, 변형된 올리고리보누클레오티드가 7-데아자-G, 아라-G, 6-티오-G, 이노신, 이소-G, 록소리빈(loxoribine), TOG(7-티오-8-옥소)-G, 8-브로모-G, 8-히드록시-G, 5-아미노포르마이신 B, 옥소포르마이신, 7-메틸-G, 9-p-클로로페닐-8-아자-G, 9-페닐-G, 9-헥실-구아닌, 7-데아자-9-벤질-G, 6-클로로-7-데아자구아닌, 6-메톡시-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자-G(PPG), 2-(디메틸아미노)구아노신, 7-메틸-6-티오구아노신, 8-벤질옥시구아노신, 9-데아자구아노신, 9-벤질-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)아데닌, 2-아미노-N2-O-, 메틸아데노신, 8-아자-7-데아자-A, 7-데아자-A, 비다라빈 (Vidarabine), 2-아미노아데노신, N1-메틸아데노신, 8-아자아데노신, 5-요오도투베르시딘 (Iodotubercidin), 1-(B-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린 및 4-티오-U, 또는 이의 조합물을 포함하는 RNA-기재 화합물.
  10. 제 1항에 있어서, RNA-기재 화합물이 5' 캡 (cap)을 추가로 포함하는 RNA-기재 화합물.
  11. 제 10항에 있어서, 5' 캡이 비-누클레오티드 링커인 RNA-기재 화합물.
  12. 제 1항에 있어서, 하기 RNA-기재 화합물인 RNA-기재 화합물:
    5'-UGCUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCGU-5';
    5'-CUGUGCUUCUC-X-CUCUUCGUGUC-5';
    5'-UCUGUGCUUCU-X-UCUUCGUGUCU-5';
    5'-UICAAICUUIC-X-CIUUCIAACIU-5';
    5'-GUGUGUGUGUG-X-GUGUGUGUGUG-5';
    5'-UGCUGCUU-X-UUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUUCUGUGU-X-UGUGUCUUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUUCUGUGUCUG-X-GUCUGUGUCUUCGUCGU-5';
    5'-U1GCU1GCU1U1CU1G-X-GU1CU1U1CGU1CGU1-5';
    5'-T1GCT1GCT1T1CT1G-X-GT1CT1T1CGT1CGT1-5';
    5'-UG1CUG1CUUCUG1-X-G1UCUUCG1UCG1U-5';
    5'-G1UCCUUCAACU-X-UCAACUUCCUG1-5';
    5'-GUCCUUCAACU-X-UCAACUUCCUG-5';
    5'-UG1CUG1CUUCUG1-X-G1UCUUCG1UCG1U-5';
    5'-G1UCCUUCAACU-X-UCAACUUCCUG1-5';
    5'-OUCCUUCAACU-X-UCAACUUCCUO-5';
    5'-UOCUOCUUCUO-X-OUCUUCOUCOU-5';
    5'-UICUICUUCUI-X-IUCUUCIUCIU-5';
    5'-IUCCUUCAACU-X-UCAACUUCCUI-5';
    5'-X2 UGCUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCGUX2-5';
    5'-X2UGCUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCGUX2-5';
    5'-UGCUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUACUG-X-GUCAUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUGCUG-X-GUCGUCGUCGU-5';
    5'-UGCUGCUUAUG-X-GUAUUCGUCGU-5';
    5'-UG1CUG1CUUG1UG1-X-G1UG1UUCG1UCG1U-5';
    5'-X2UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX2-5';
    5'-UGCUGCUUCUG-X1-GUCUUCGUCGU-5';
    5'-X7UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX7-5';
    5'-UGUUGUGUGAC-X-CAGUGUGUUGU-5';
    5'-CUGGCGGCCUU-X-UUCCGGCGGUC-5';
    5'-X3UG1CUG1CUUGUG1-X-G1UGUUCG1UCG1UX3-5';
    5'-UGCUGCUUG2UG-X-GUG2UUCGUCGU-5';
    5'-G2GCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGG2-5';
    5'-UGCUGCCUUUG-X-GUUUCCGUCGU-5';
    5'-GUCCUUGCUUG-X-GUUCGUUCCUG-5';
    5'-GUCCUUUGCUG-X-GUCGUUUCCUG-5';
    5'-X3UGCUGCUGCUG-X-GUCGUCGUCGUX3-5';
    5'-XUGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX-5';
    5'-X7UGCUGCUGCUG-X-GUCGUCGUCGUX7-5';
    5'-UUGCCCUUGCC-X-CCGUUCCCGUU-5';
    5'-UUGCUGUUGCU-X-UCGUUGUCGUU-5';
    5'-CUUUGGUGUGU-X-UGUGUGGUUUC-5';
    5'-UUGGUUGUUUG-X-GUUUGUUGGUU-5';
    5'-CUUUGGUGUGU-X-UGUGUGGUUUC-5';
    5'-X3UUGGUUGUUUG-X-GUUUGUUGGUUX3-5';
    5'-X3GUCCUUGCUUG-X-GUUCGUUCCUGX3-5';
    5'-PUGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUP-5';
    5'-X4UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX4-5';
    5'-X5UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX5-5';
    5'-X6UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX6-5';
    5'-UG1CUG1CUUCUG1-X1-G1UCUUCG1UCG1U-5';
    5'-X3UGCUGCUUGUG-X1-GUGUUCGUCGUX3-5';
    5'-UG3CUGCUUCUG-X-GUCUUCGUCG3U-5';
    5'-UGG4UGCUUCUG-X-GUCUUCGUG4GU-5';
    5'-UUG1G1UUG1UUUG1-X-G1UUUG1UUG1G1UU-5';
    5'-UG1CUG1CCUUUG1-X-G1UUUCCG1UCG1U-5';
    5'-G1UCCUUG1CUUG1-X-G1UUCG1UUCCUG1-5';
    5'-G1UCCUUUG1CUG1-X-G1UCG1UUUCCUG1-5';
    5'-UG1CUG1CUUCUG1-X8-G1UCUUCG1UCG1U-5';
    5'-UUG1CUG1UUG1CU-X-UCG1UUG1UCG1UU-5';
    5'-UG1CCUUG1AACU-X-UCAAG1UUCCG1U-5';
    5'-UUCUG1CUUCUG1-X-G1UCUUCG1UCUU-5';
    5'-UUCUG1CUUCUG1-X5-G1UCUUCG1UCUU-5';
    5'-G1UCCUUCUCUG1-X-G1UCUCUUCCUG1-5';
    5'-UG1UURUG1UG1AC-X-CAG1URUG1UUG1U-5';
    5'-X2UUGGUUGUUUG-X-GUUUGUUGGUUX2-5';
    5'-X2GUCCUUGCUUG-X-GUUCGUUCCUGX2-5';
    5'-X6UUGGUUGUUUG-X-GUUUGUUGGUUX6-5';
    5'-X6GUCCUUGCUUG-X-GUUCGUUCCUGX6-5';
    5'-X2UGCUGCUUGUG-X8-GUGUUCGUCGUX2-5';
    5'-AGAAGCUUCUG-X-GUCUUCGAAGA-5';
    5'-UGAAGCUUCUG-X-GUCUUCGAAGU-5';
    5'-X6UUGGUUGUUUG-X-GUUUGUUGGUUX6-5';
    5'-X6GUCCUUGCUUG-X-GUUCGUUCCUGX6-5';
    5'-UCUGAAUUCAG-X-GACUUAAGUCU-5';
    5'-GUUUGCACAAC-X-CAACACGUUUG-5';
    5'-GCACACUUGUU-X-UUGUUCACACG-5';
    5'-CACUGUUGAGA-X-AGAGUUGUCAC-5';
    5'-CACUGUUGACA-X-ACAGUUGUCAC-5';
    5'-AACUGUUGACC-X-CCAGUUGUCAA-5';
    5'-CAACGACCUGU-X-UGUCCAGCAAC-5';
    5'-AGCACAACUGU-X-UGUCAACACGA-5';
    5'-UGCUGAGUGUU-X-UUGUGAGUCGU-5';
    5'-AGUGUUUUCUG-X-GUCUUUUGUGA-5';
    5'-CAACGAACCCU-X-UCCCAAGCAAC-5';
    5'-G1UCCUUG1CUUG1-X8-G1UUCG1UUCCUG1-5';
    5'-G1UCCUUG1CUUG1-X-G1UUCG1UUCCUG1-5';
    5'-UUCUG1CUUCUG1-X8-G1UCUUCG1UCUU-5';
    5'-UUCUG1CUUCUG1-X-G1UCUUCG1UCUU-5';
    5'-X2UUCUG1CUUCUG1-X-G1UCUUCG1UCUUX2-5';
    5'-X2G1UCCUUG1CUUG1-X-G1UUCG1UUCCUG1X2-5';
    5'-UG1CUG1CCUUUG1-X-G1UUUCCG1UCG1U-5';
    5'-UG1CUG1CCUUUG1-X9-G1UUUCCG1UCG1U-5';
    5'-G1UCCUUUG1CUG1-X-G1UCG1UUUCCUG1-5';
    5'-G1UCCUUUG1CUG1-X9-G1UCG1UUUCCUG1-5';
    5'-X6UGCUGCUUGUG-X-GUGUUCGUCGUX6-5';
    5'-X5GCUGCCUUUG-X9-GUUUCCGUCGUX5-5';
    (5'-UGCUGCUUGUG)2-X-CCGUUGACAG-3';
    (5'-UGCUGCUUGUG)2-X-ACACGCGUGU-3';
    5'-CCCIIICCCII-X-IICCCIIICCC-5';
    5'-TTTTTTTTTTTTTTT-X-(G1UCUUCG1UCG1U)2-5';
    3'-TTTTTTTTTTTTTTT-X-(G1UCUUCG1UCG1U)2-5';
    5'-U1U1U1U1U1U1U1U1U1U1U1U1U1U1U1-X-(G1UCUUCG1UCG1U)2-5';
    5'-CCIICCIICCC-X-CCCIICCIICC-5'; 또는
    5'-CCIICCIICCX2CCIICCIICC-3';
    여기서, I는 이노신이고; U1은 dU이고; T1은 리보T이고; G1은 7-데아자-G이고; G2는 아라-G이고; G3는 6-티오-G이고; G4는 1(β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린이고; O는 록소리빈이고; X는 글리세롤이고; X1은 1,3,5-펜탄트리올이고; X2 및 X3는 C3 링커 또는 프로판디올이고; X4는 트리(에틸렌글리콜)이고; X5는 1,5 펜탄디올이고; X6는 2'-데옥시-아베이직(abasic)이고; X7은 C3 아미노링커이고; X8은 시스,시스-시클로헥산트리올이고; X9는 시스,트란스-시클로헥산트리올이고; 밑줄은 2'-O-Me-리보누클레오티드이고; P는 포스포로티오에이트이다.
  13. 약제학적 유효량의 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 따른 RNA-기재 화합물을 포함하는 면역 반응을 발생시키기 위한 약제학적 조성물.
  14. 약제학적 유효량의 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 따른 RNA-기재 화합물을 포함하는, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증 질환, 감염성 질환, 피부 질환, 알레르기, 천식, 박테리아 감염, 기생충 감염 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  15. 약제학적 유효량의 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 따른 RNA-기재 화합물을 포함하는, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증 질환, 감염성 질환, 피부 질환, 알레르기, 천식, 박테리아 감염, 기생충 감염 또는 바이러스 감염을 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  16. 제 13에 있어서, 하나 이상의 화학요법 화합물, 표적 치료제, 항체, 백신 또는 항원을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제 14항에 있어서, 하나 이상의 화학요법 화합물, 표적 치료제, 항체, 백신 또는 항원을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제 15항에 있어서, 하나 이상의 화학요법 화합물, 표적 치료제, 항체, 백신 또는 항원을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 백신은 DNA 백신인 약제학적 조성물.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 백신은 DNA 백신인 약제학적 조성물.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 백신은 DNA 백신인 약제학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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