WO2014041233A1 - Biocatalizadores y sus aplicaciones - Google Patents

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WO2014041233A1
WO2014041233A1 PCT/ES2013/070646 ES2013070646W WO2014041233A1 WO 2014041233 A1 WO2014041233 A1 WO 2014041233A1 ES 2013070646 W ES2013070646 W ES 2013070646W WO 2014041233 A1 WO2014041233 A1 WO 2014041233A1
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WO
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polypeptide
virus
enzyme
cross
linking agent
Prior art date
Application number
PCT/ES2013/070646
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English (en)
French (fr)
Inventor
Fernando Ponz Ascaso
Florentina SÁNCHEZ SÁNCHEZ
María del Carmen MANSILLA MANSILLA
María del Sol CUENCA MARTÍN
Marta AGUADO ALONSO
José María SÁNCHEZ MONTERO
Original Assignee
Instituto Nacional De Investigación Y Tecnología Agraria Y Alimentaria - Inia
Universidad Complutense De Madrid
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/34011—Potyviridae
    • C12N2770/34023—Virus like particles [VLP]

Definitions

  • the present invention belongs to the area of immobilization of biocatalysts and relates to biocatalysts in which an enzyme is immobilized on a support based on a protein of a viral capsid, wherein said immobilization results in an increase in the specific enzymatic activity of the immobilized enzyme.
  • Nanotechnology has aroused a recent interest in enzymatic immobilization due to its potential applications in Biotechnology and Biomedicine.
  • Enzymatic immobilization entails advantages associated with the manipulation, separation of the enzyme from the reaction mixture, reuse of the enzyme, cost reduction and the possibility of increasing the thermal stability and the pH range of the enzyme.
  • the factors that determine the efficiency of biocatalysts are given by surface area, resistance to mass transfer, and effective enzymatic loading.
  • Various nanomaterials have been described in relation to biocatalysts: nanoparticles, nanofibers, nanotubes, and nanoporous matrices.
  • enzymatic immobilization provides a number of advantages, such as: decrease in autolysis (protease) or aggregation problems, since rotational and translational movements are limited,
  • enzymatic immobilization poses a number of disadvantages, such as the decrease in the enzymatic activity of the immobilized enzyme, the difficulty in interpreting the data if the enzyme preparation is not homogeneous, and the possibility of unwanted protein-protein contacts.
  • enzymatic immobilization raises a number of advantages: increased enzymatic stability, increased enzymatic productivity due to the possibility of reuse, ease of recovery of the enzyme, purification of products and, in general, of operation and process control.
  • disadvantages it should be noted that generally the enzyme activity decreases, diffusion problems increase, the cost of the process increases and the fact that the working pH range may be different from that of the native biocatalyst.
  • enzymes immobilized on a variety of supports such as silicon nanotubes, phospholipid bilayers, self-assembled monolayers, polymeric matrices, in Langmuir-Blodgett films, polystyrene latex particles, particle particles have been described gold assembled in polymers and zeolite or films thermally evaporated lipids, magnetic and non-magnetic nanoparticles, among others.
  • the invention relates to a biocatalyst comprising
  • polypeptide A comprising a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity
  • the invention relates to a virus of the Potyviridae family comprising a B polypeptide, wherein said B polypeptide comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a capsid protein of said virus. the Potyviridae family by means of a cross-breeding agent.
  • the invention in another aspect, relates to a VLP of a virus of the Potyviridae family comprising a polypeptide B, wherein said polypeptide B comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a capsid protein of said virus of the family Potyviridae by means of an agent of entrecruzami ento.
  • the invention in another aspect, relates to a method of obtaining said biocatalyst, which comprises contacting a polypeptide A, which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, with a polypeptide B, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in the presence of a cross-linking agent, under conditions suitable for the formation of said biocatalyst.
  • a polypeptide A which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • a polypeptide B which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity
  • the invention in another aspect, relates to a method of obtaining said virus from the Potyviridae family comprising a polypeptide B, wherein said polypeptide B comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a protein of the capsid of said virus of the family Potyviridae, which comprises contacting a virus of the family Potyviridae, with said polypeptide B, in the presence of a cross-linking agent, under conditions suitable for the formation of said virus.
  • the invention in another aspect, relates to a method of obtaining said VLP from a virus of the Potyviridae family comprising a B polypeptide, wherein said B polypeptide comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a capsid protein of said virus of the Potyviridae family, which comprises contacting a VLP of a virus of the Potyviridae family, with said polypeptide B, in the presence of a crosslinking agent, under conditions suitable for the formation of said VLP.
  • the invention relates to a method for immobilizing an enzyme comprising conjugating a polypeptide A, which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, with a polypeptide B, comprising an enzyme or a fragment of the same that conserves its enzymatic activity, by means of an agent of entrecruzami ento.
  • a polypeptide A which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • a polypeptide B comprising an enzyme or a fragment of the same that conserves its enzymatic activity
  • polypeptide A comprising a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, or of
  • VLP comprising capsid proteins of a family virus
  • B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • the invention in another aspect, relates to a process for the enzymatic conversion of a substrate into a product comprising contacting said substrate with said biocatalyst, prior virus or VLP, wherein the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity present in polypeptide B of the biocatalyst, or of the virus or of the VLP, is an enzyme that catalyzes a specific enzymatic reaction for the conversion of said substrate into said product, under suitable conditions for said enzymatic reaction to take place.
  • Figure 1 shows a diagram of the bioconjugation process.
  • the first column represents activation, while the second column is a representation of conjugation.
  • Figure 2 shows the stability analysis of the viral particles, expressed either as A 2 5o A 2 67 (A, CE) or as a variation of the absorption spectrum with respect to the control (B), as a function of pH (A, B), the pH of the conjugation buffer (C), the proportion of acetonitrile (D) and the temperature (E).
  • Figure 3 shows the color variation observed in the conjugates Cl, C2, C3, C4 and C5 (from left to right) after blocking, due to the formation of Schiff bases.
  • Figure 4 shows the result of the SDS-PAGE.
  • Lane 1 Rainbow marker.
  • Lanes 2-5 18, 45, 90 and 180 ng of commercial CALB.
  • Lane 6 shows Cl.
  • Lane 7 Sample C2.
  • Lane 8 Sample C3.
  • Lane 9 Sample C4.
  • Lane 10 Sample C5. The arrow indicates the fragments 33 kDa in size.
  • Figure 5 shows the kinetics curves of commercial lipase and the conjugates Cl, C2, C4 and C5, represented as velocity ( ⁇ / min) versus substrate concentration ( ⁇ ).
  • Figure 6 shows images of the conjugates Cl (A), C2 (B), C3 (C), C4 (D) and C5 (E) by electron microscopy and negative staining. The increase is shown in each case (A: x40K, B: x40K, C: xl5K, D: x50K, E: x40K).
  • the authors of the present invention have developed a protein immobilization system, particularly enzymatic which, among other advantages associated with the immobilization of an enzyme, results in an increase in the specific enzymatic activity of the immobilized enzyme with respect to the activity of the free enzyme .
  • the inventors of the present invention have immobilized Candida Antarctic Lipase B (CALB) on the TuMV turnip mosaic virus capsid protein (Turnip mosaic virus). The results obtained show that the enzyme thus immobilized experiences a significant increase in its specific enzymatic activity with respect to the enzyme without immobilization (Example 1). Definitions
  • activation is used in the present invention in the context of activating a molecule, and refers to the reversible transition of a molecule into a physical or chemical state, so that said state has a greater tendency to follow a reaction. determined chemistry
  • specific activity referring to an enzyme, refers to the activity of an enzyme per milligram of protein. This parameter is related to the purity of an enzyme, and is usually expressed in units of ⁇ min "1 mg " 1 .
  • crosslinking agent or “crosslinking agent” or “crosslinking agent”, also known as “cross-linker” refers to a bifunctional reagent that causes covalent intermolecular junctions between two molecules.
  • Crosslinking agents comprise reactive groups at the ends that are specific to certain functional groups.
  • the reactive groups of the bifunctional agents are separated from each other by a spacer chain (also called “spacer arm”) of a given length, which allows to determine the distance at which the two residues that are crosslinked.
  • the molecules containing reactive groups susceptible to conjugation by crosslinking agents are proteins and / or peptides.
  • Table 1 shows a list of the functional groups present in the crosslinking agents and their corresponding target functional groups with which they react.
  • the crosslinking agents can be homobifunctional or heterobifunctional.
  • Homobifunctional crosslinking agents are those comprising equal reactive groups at opposite ends, separated from each other by a spacer arm. Homobifunctional crosslinking agents allow the crosslinking reaction to proceed in a single stage. Homobifunctional agents include, but are not limited to, glutaraldehyde, diaminoalkanes, di (N-succinimidyl) carbonate, di (N-succinimidyl) suberate, dimethyl adipimate dihydrochloride, dimethyl pimelimidate dihydrochloride, dimethyl suberimidate dihydrochloride, BS (bis (3) ), disuccinimidyl glutarate (DSG), ethylene glycolbis (sulfosuccinimidylsuccinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl suberate (DSS), dithiobis (succinimidyl propionate) (DTSP, Lomant reagent), ethylene glycolbis (succinimid)
  • Heterobifunctional crosslinking agents are those that comprise different reactive groups at opposite ends, separated from each other by an arm spacer The use of heterobifunctional crosslinking agents requires that the crosslinking reaction proceed in two sequential steps, so that the less labile reactive end is reacted first.
  • Heterobifunctional agents include, but are not limited to, succinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-l-carboxylate (SMCC), SA PAH, n-sulfosuccinimidyl-6- [4'-azido-2'-nitrophenylamino] hexanoate (sulfo - SANPAH), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester (sulfo MBS), ⁇ - ⁇ -maleimidobutyryloxysuccinimide ester (GMBS), ⁇ - ⁇ -maleimidobutyryloxyspidoxysulfyl ester (GMS) N- (8-maleimidocaproic azido) hydrazide (EMCH), N- (8-maleimidocaproyloxy) succinimide
  • crosslinking agents according to the invention can be homobifunctional or heterobifunctional.
  • the cross-linking agent is of the homobifunctional type.
  • the crosslinking agent is glutaraldehyde.
  • the crosslinking agents include, but are not limited to, amino-a-amino crosslinking agents, amino-a-sulfhydryl crosslinking agents, carboxyl-a-amino crosslinking agents, crosslinking agents. photoreactive crosslinking, sulfhydryl-a- crosslinking agents carbohydrate, sulfhydryl-a-hydroxyl crosslinking agents and sulfhydryl-a-sulfhydryl crosslinking agents.
  • amino-a-amino crosslinking agents include, but are not limited to:
  • DMA dimethyl adipimidate 2 HCl
  • DMP dimethyl pimelimidate 2 HCl
  • DMS dimethyl suberimidate 2 HCl
  • DTBP dimethyl 3,3-dithiobispropionimidat 2 HCl
  • HS-ester agents such as bis (succinimidyl) penta (ethylene glycol) (BS (PEG) 5), bis (succinimidyl) nona (ethylene glycol) (BS (PEG) 9), bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), bis [2 -
  • amino to sulfhydryl crosslinking agents include, but are not limited to:
  • NHS-haloacetyl agents based on the NHS ester and iodoacetyl, bromoacetyl or other haloacetyl, such as sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (sulfo-SIAB), succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB), succinimidyl 3- (bromoacetyl) propionate (SBAP) and succinimidyl iodoacetate (SIA), NHS-maleimide agents, based on H-hydroxysuccinimide and maleidimide, such as sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (sulfo-SMCC), ethylene glycol functionalized with n units with succinimidyl and maleimido (SM (PEG) n), succinimidyl 4- (
  • NHS-pyridyldithiol agents based on N-hydroxysuccinimide and pyridyldithiol, such as 2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide (PEG12-SPDP), 2-pyridyldithiol-tetraoxatetradecane-N-hydroxysuccinimide (PEG4-3 SPDP), '- (2-Pyridyldithio) propionamido] hexanoate (sulfo-LC-SPDP), succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl 6- [3 (2-pyridyldithio) propionamido] hexanoate (LC-SPDP), sulfosuccinimidyl-6- [alpha-methyl-alpha- (2-pyridyld
  • Carboxyl to amino crosslinking agents include, but are not limited to dicyclohexylcarbodiimide (DCC), l-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC or EDAC), N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-hydroxysulfoccinimide (S-NHS ).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC or EDAC l-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • S-NHS N-hydroxysulfoccinimide
  • Photoreactive crosslinking agents include, but are not limited to:
  • amino and photoreactive agents such as N-5-azido-2- nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB-NOS), NHS-diazirine (SDA), sulfo-NHS-diazirine (sulfo-SDA), NHS-LC-diazirine (LC-SDA), sulfo-HHS-LC-diazirine (sulfo-LC-SDA), NHS-SS-diazirine (SDAD), sulfo-NHS-SS-diazirine (sulfo-SDAD) and N-sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2 '- nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH), and
  • Sulfhydryl carbohydrate crosslinking agents include, but are not limited to, N-beta-maleimidopropionic acid hydrazide-TFA (BMPH), N-epsilon-maleimidocaproic acid hydrazide-TFA (EMCH), N-kappa acid hydrazide-TFA Maleimidoundecanoic acid (KMUH), 4- (4-N-maleimidophenyl) butyric acid hydrazide-HCl (MPBH) and 3- (2-pyridyldithio) propionyl hydrazide (PDPH).
  • BMPH N-beta-maleimidopropionic acid hydrazide-TFA
  • EMCH N-epsilon-maleimidocaproic acid hydrazide-TFA
  • KMUH N-kappa acid hydrazide-TFA
  • KMUH N-kappa acid hydrazide-TFA
  • Sulfhydryl to hydroxyl crosslinking agents include, but are not limited to, p-maleimidophenyl isocyanate (BMPI).
  • Sulfhydryl to sulfhydryl crosslinking agents include, but are not limited to, 1,8-bismaleimidodyethylene glycol (BM (PEG) 2), 1,1-bismaleimidotriethylene glycol
  • the molecules containing reactive groups susceptible to conjugation by crosslinking agents are proteins and / or peptides.
  • the protein functional groups to which the cross-linking agents are directed include amino groups, ⁇ -amino groups of Usinas, ⁇ -amino terminal groups, sulfhydryl groups (-SH or thiol groups) of cysteines, carbohydrate groups ( in the case of glycoproteins) and carboxyl groups.
  • Cross-linking agents of proteins through amino, ⁇ -amino Usinas and ⁇ -amino terminal groups include, but are not limited to, imidoesters and N-H-hydroxysuccinimide esters (HS-esters).
  • Crosslinking agents of proteins through sulfhydryl groups include, but are not limited to, maleimides, haloacetyls (such as iodoacetyl) and pyridyl disulfide (pyridi 1 dithium 1 is).
  • Crosslinking agents of proteins through carbonyl groups (such as aldehydes or ketones) by oxidative treatment of glycoprotein carbohydrates include, but are not limited to, reagents comprising hydrazides (-H-H 2 -).
  • Protein crosslinking agents through carboxyl groups include, but are not limited to, carbodiimides.
  • biocatalyst refers to a biological catalyst that participates in a chemical reaction of a living being.
  • the biocatalyst decreases the activation energy necessary for a given chemical reaction, facilitating and accelerating said reaction, without being consumed in said reaction.
  • biocatalyst refers to an enzyme.
  • immobilized biocatalyst refers to enzymes, cell extracts comprising said enzymes, cells comprising said enzymes, or combinations thereof, which are in such a state that they allow reuse. It is related to the physical confinement of an enzyme or cell in a certain region of space, so that its catalytic activity is retained and can be reused.
  • the immobilized biocatalyst is an enzyme.
  • catalysis refers in the present invention to the process in which the speed of a chemical reaction is increased by the intervention of a catalyst, so that said catalyst is not modified during catalysis.
  • capsid refers to the external protein structure of a virus that encapsulates the genetic material of the virus.
  • the capsid is formed by identical protein subunits called “capsomeres”, encoded by the genome of the virus itself.
  • capsomer may consist of one or several different proteins.
  • three types of the capsid are distinguished: helical (common in plant and bacteriophage viruses), icosahedral (usual in animal pathways, less frequent in plant viruses and phages) or complex (it consists of two parts, head and tail, or even three parts, head, neck and tail).
  • conjugation also called “cross-linking” or “bioconjugation” refers to the process of obtaining a conjugate, in particular a protein conjugate formed by at least two proteins, by chemical bonding by non-peptide covalent bond. Chemical conjugation methods are well known in the art. The conjugation can be carried out directly or through a crosslinking agent, through one or more functional groups in the protein, such as aminos, carboxyls, phenyls, thiols or hydroxyls.
  • enzyme refers to a protein that catalyzes chemical reactions.
  • An enzyme allows a chemical reaction, thermodynamically possible but at a low speed, to be kinetically favorable.
  • the enzyme acts on a molecule called “substrate”, turning it into a different molecule called “product”, in a reaction called “enzymatic reaction”.
  • Some examples of enzymes useful in the present invention are, lipases, amylases, proteases, peptinases, invertases, cellulases, lipases, lactose, catalase, chymosin, xylanase and phytase.
  • the maximum speed (Vmax, or speed at which an enzyme is capable of catalyzing a reaction)
  • the affinity constant Km, or substrate concentration at which the speed stands out
  • the reaction rate is half the maximum speed, it represents the affinity ratio of an enzyme and its substrate, so that at a lower value of Km, higher affinity of the enzyme for a substrate) and the catalytic constant (Kcat, or number of molecules of substrate transformed into product, per active center and per unit of time).
  • the preferred substrates for enzymes are those for which the Km values are low and the Kcat values high compared to substrates for which it shows no affinity.
  • fragment of an enzyme that retains its enzymatic activity refers to a fragment of any length of an enzyme that retains at least 100%, at least 95%, at least the 90%, at less than 85% or at least 80%> of the enzyme activity of the enzyme from which said fragment was obtained.
  • the present invention contemplates functionally equivalent variants of an enzyme of interest, which retain at least 100%>, at least 95%, at least 90%, at least 85%> or at least 80%> of Enzyme activity of the enzyme of interest and have a sequence substantially homologous to the amino acid sequence of the enzyme of interest.
  • amino acid sequence is "substantially homologous" to a given amino acid sequence when it has a degree of identity of at least 70%, advantageously at least 75%), typically at least 80% >, preferably of at least 85%>, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, 96%), 97%), 98%) or 99% ), with respect to said determined amino acid sequence.
  • the degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by standard sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as, for example, BLAST (Altschul SF et al. 1990 Basic local alignment search tool J Mol Biol. 1990 215 (3): 403-10).
  • BLAST Altschul SF et al. 1990 Basic local alignment search tool J Mol Biol. 1990 215 (3): 403-10.
  • the person skilled in the art will understand that the amino acid sequences referred to in this description can be chemically modified, for example, by chemical modifications that are physiologically relevant, such as phosphoryl
  • lipase refers to an enzyme (EC 3.1.1.3) that is capable of hydrolyzing ester bonds present in insoluble lipid substrates in aqueous solvents.
  • the enzyme lipase catalyzes the hydrolysis (i.e., the separation of the hydroxyl group and the hydrogen atom from the compounds to give fragments by the addition of water) of the glycerol lipids and simple fatty acids.
  • the enzymatic behavior changes and this enzyme can synthesize different lipids. Its enzymatic versatility makes it of interest in the food, pharmaceutical, cosmetic industry, etc. allowing the synthesis of esters of carbohydrates, amines and amides.
  • Lipases are characterized by their enantio selectivity and have a catalytic mechanism known as interfacial activation.
  • the term "lipase B of Candida antárctica” or "CALB” refers to a 33 kDa lipase enzyme belonging to the family of ⁇ / ⁇ hydrolases whose structure consists of a nucleus of 8 beta sheets flanked on both sides by alpha-helices. It is an enzyme of great efficiency and high selectivity, of great interest in applications such as kinetic resolutions, aminolysis, esterification, transesterification, hydrolysis in water, transesterification in organic solvents and selective enantium transformations. It is highly stereospecific both in hydrolysis and in the synthesis of esters.
  • the active center contains residues Ser 105, Asp 187 and His 224.
  • the nucleotide sequence encoding CALB and its corresponding sequence of amino acids has been described (Uppenberg J et al. 1994 Structure 2: 293-308).
  • the CALB gene sequence is hosted in the NCBI sequence databases with reference EU915210 (partial CDs, version corresponding to September 28, 2008 of GenBank).
  • the NCBI database collects two entries for the amino acid sequence of CALB, corresponding to a sequence of 342 amino acids (CAA83122, in the June 12, 2006 update of GenBank) and a partial sequence of 321 amino acids (ACI06118, in the update of September 28, 2008).
  • polypeptide refers to an amino acid chain of any length where the different amino acids are linked together by peptide bonds or by disulfide bridges.
  • a polypeptide is a polymer of amino acid residues preferably bound exclusively by peptide bonds, whether produced naturally or synthetically.
  • a polypeptide produced by the expression of a non-host DNA molecule is a "heterologous" peptide or polypeptide.
  • polypeptide as used herein encompasses peptides and oligopolypeptides, so that said peptides or oligopeptides may or may not have undergone post-translational modifications.
  • the post-translational modification can be, for example, phosphorylation, methylation and glycosylation.
  • the polypeptide is a protein.
  • Potyviridae refers to a family of plant infectious viruses. Viruses that belong to this family comprise a positive single-stranded RNA genome (also called (+) ssRNA, ((+) single stranded RNA) and are included in Group IV of the Baltimore classification.
  • This family of viruses comprises the genera Potyvirus (type species: potato Y virus, PVY), Rymovirus (type species: ryegrass mosaic virus, RMV), Bymovirus (type species: yellow barley mosaic virus, BYMV), Macluravirus (type species: virus of the mature mosaic), Ipomovirus (type species: sweet potato mottle virus), Tritimovirus (type species: wheat striated mosaic virus), Brambyvirus, although the genome of these viruses is monoistronic, it encodes between 7 and 10 proteins with various functions (proteases such as S-PRO, P-PRO, C-PRO, HEL helicases, VPg genomic proteins, POL polymerases, CP capsid proteins).
  • the hosts of these viruses comprise herbaceous and woody mono and dicotyledonous plants. ⁇ Potyvirus) or It is well restricted to grasses (Bymorivus and Rymovirus).
  • Potyvirus refers to a genus of Potyviridae family whose type species is the potato Y virus (Potato Y virus, PYV). Viruses of this genus are filamentous and flexible, of dimensions 680-900 x 11-15 nm and helical symmetry.
  • the genome of these viruses consists of a single molecule of single-stranded positive RNA ((+) ssRNA), which encodes a precursor polypoprotein which, when processed, gives rise to seven proteins: a serine protease (Pl), auxiliary component (HC ), P3, cylindrical inclusion (CI), nuclear inclusion A (N ⁇ a), nuclear inclusion B (Nlb), capsid protein (CP) and two small proteins 6K1 and 6K2.
  • the capsid protein has a size between 30 and 35 kDa.
  • protein refers to an amino acid chain of any length where the different amino acids are linked together by peptide bonds between the carboxyl and amino groups of adjacent amino acid residues or by disulfide bridges, optionally including modifications, for example , post-translational modifications, which alter the physical and chemical properties, folding, stability, activity, and finally, the function of proteins.
  • the amino acid sequence of a protein adopts a spatial arrangement or determined conformation that is responsible for the function associated with the protein. Proteins that do not have attached peptide groups (eg prosthetic groups or co-factors) are also included in this definition.
  • the number of amino acid residues in a protein can vary markedly, for example, the polymer chain of amino acid residues linked by peptide bonds can typically contain 50 or more amino acid residues.
  • proteins useful in the present invention are, without limitation, proteins with enzymatic activity.
  • turnip mosaic virus also called “TuMV” (Turnip mosaic virus) is a Potyvirus of the Potyviridae family. It is a filamentous and flexible virus, with dimensions 720-850 nm x 12-15 nm. Its genome consists of positive single stranded RNA. It is a non-enveloped virus, of the helical symmetry capsid.
  • the capsid protein (CP) is approximately 33 kDa and each virus comprises about 2000 copies of said protein.
  • This virus causes diseases in plants, among others, crucifixes.
  • the virus can be transmitted by aphids. Symptoms in plants infected by this virus include local chlorotic lesions, mosaic, mottling and roughness.
  • virus also called “viral particle” or “virion” refers to infectious agents whose multiplication capacity necessarily requires cellular infection. They consist of genetic material, either DNA or RNA type, a protein shell called “capsid” and, in some types of viruses, an external lipid bilayer that surrounds the virus outside the cell called “enveloped.”
  • virus-like particle “pseudovirus” or “VLP” (virus-like particle) refers to particles lacking viral genetic material comprising a number of copies of capsid proteins distributed in an arrangement similar to that of The viral capsid. They result from the expression of viral structural proteins, such as capsid proteins or envelope proteins, and from their self-assembly.
  • the VLPs are constituted by viral capsid protein.
  • the VLPs are constituted by viral capsid proteins of a virus of the Potyviridae family.
  • VLPs are constituted by the viral capsid proteins of a Potyvirus.
  • the VLPs are constituted by the viral capsid proteins of the TuMV virus.
  • enzyme route refers to a succession of enzymatically catalyzed chemical reactions, wherein an initial substrate can give rise to one or more end products through one or more intermediate products, wherein the intermediate product resulting from catalysis by one of the enzymes involved in said route is in turn the substrate of another of the enzymes involved in said route.
  • biocatalyst of the invention which comprises
  • polypeptide A comprising a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity
  • polypeptide A is linked to polypeptide B by a cross-linking agent.
  • the biocatalyst of the invention therefore comprises two polypeptides, a polypeptide A comprising a viral capsid protein of a virus of the Potyviridae family and a B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked both polypeptides by means of a cross-linking agent.
  • Polypeptide A of the biocatalyst of the invention comprises a viral capsid protein of a virus of the Potyviridae family.
  • the polypeptide A comprises a unit of a viral capsid protein of a virus of the Potyviridae family.
  • polypeptide A comprises more than one unit of a viral capsid protein of a virus of the Potyviridae family.
  • the viral capsid protein units comprised in said polypeptide A may be part of a viral polyprotein precursor of a virus of the Potyviridae family, so that proteolytic cleavage of said viral polyprotein gives rise to viral proteins.
  • polyprotein refers in the present invention to a polypeptide comprising the protein sequences of the structural proteins of a virus.
  • the viral capsid proteins of a virus of the Potyviridae family comprised in polypeptide A can be assembled either in a virus of the Potyviridae family or in a virus-like structure or VLP, lacking genetic material. Therefore, in one embodiment of the invention, the capsid protein of a virus of the Potyviridae family is part of the viral capsid of said virus.
  • the capsid protein of a virus of the Potyviridae family that forms part of the biocatalyst polypeptide A of the invention is a Potyvirus capsid protein.
  • the capsid protein of a virus of the Potyviridae family that is part of the biocatalyst polypeptide A of the invention is a turnip mosaic virus capsid protein (TuMV, Turnip mosaic virus).
  • TuMV turnip mosaic virus capsid protein
  • the capsid protein of a virus of the Potyviridae family is part of a VLP.
  • the present invention contemplates that the viral capsid proteins of a virus of the Potyviridae family comprised within polypeptide A can be assembled either in a virus or in a virus or VLP-like structure lacking genetic material.
  • the viral or VLP particles can in turn interact with each other giving rise to three-dimensional biological support structures (scaffolds) on which the B-polypeptide of the invention binds.
  • These three-dimensional structures are formed by protein-protein interactions between the capsomeres, which include ionic and covalent bonds, and even possible metal bonds with metals present in the medium that help stabilize these structures.
  • three-dimensional means that the support Biological of the invention has three dimensions, that is, three coordinates are needed to locate a molecule within it.
  • the three-dimensional form of this biological support can be of any 3D form.
  • Polypeptide B of the biocatalyst of the invention comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • Polypeptide B is bound to polypeptide A in a region other than the active center of the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity comprised in said polypeptide B.
  • polypeptide B comprises a unit of an enzyme or a fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • polypeptide B comprises two or more units of an enzyme, or a fragment thereof that retains its enzymatic capacity, arranged in tandem.
  • polypeptide B comprises a unit of two or more different enzymes, or fragments thereof that retain their enzymatic activity, arranged in tandem.
  • polypeptide B comprises two or more units of two or more different enzymes, or fragments thereof that retain their enzymatic activity, arranged in tandem.
  • the biocatalyst of the invention may comprise one or more units of the B polypeptides described above.
  • the biocatalyst comprises one or more units of a B polypeptide, wherein said B polypeptide comprises a unit of an enzyme or a fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • Any enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity may be part of the B-polypeptide of the biocatalyst of the invention including, without limitation to, oxidoreductases (EC1) such as dehydrogenases, peroxidases or oxidases, tranferases (EC2) such as transaminases, acyltransferases, glycosyltransferases, polymerases, sulfotransferases or kinases, hydrolases (EC3) such as glycosidases, lipases, lysases, amylases, lysases, amylases, lysases, amylases, lysases, amylases (EC4) such as decarboxylases or dehydrates, isomerases (EC5) such as racemases, epimerases or mutases and ligases (EC6) such as synthetases.
  • EC1 oxidoreductases
  • Preferred enzymes that may be part of the B-polypeptide of the biocatalyst of the invention include, but are not limited to, lipases, amylases, proteases, peptinases, invertases, cellulases, lipases, lactase, catalase, chymosin, xylanase and phytase.
  • the enzyme is a lipase, in particular the lipase B of Candida Antarctic.
  • the biocatalyst of the invention further comprises at least one C polypeptide, such that said C polypeptide comprises an enzyme, or a fragment thereof that retains its enzymatic activity, other than the enzyme, or the fragment thereof. which retains its enzymatic activity, comprised in polypeptide B, wherein said polypeptide C is linked to polypeptide A by a cross-linking agent, and wherein said cross-linking agent can be the same or different from the cross-linking agent that binds polypeptide A with polypeptide B.
  • polypeptide C comprises a unit of an enzyme, or a fragment thereof that retains its enzymatic activity, different from the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide B.
  • the Polypeptide C comprises two or more units of an enzyme, or of a fragment thereof that retains its enzymatic activity, different from the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide B, arranged in tandem.
  • polypeptide C comprises a unit of two or more enzymes, or a fragment thereof that retains its enzymatic activity, different from the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide B, arranged in tandem. .
  • polypeptide C comprises two or more units of two or more enzymes, or a fragment thereof that retains its enzymatic activity, different from the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide B, arranged in tandem.
  • the biocatalyst of the invention may comprise one or more units of the polypeptide C described above.
  • the biocatalyst comprises one or more units of a C polypeptide, wherein said C polypeptide comprises a unit of an enzyme or a fragment thereof that retains its enzymatic activity, different from the enzyme or fragment of the which retains its enzymatic activity of the B polypeptide.
  • the viral capsid proteins of a virus of the Potyviridae family comprised in polypeptide A can be assembled either in a virus or in a virus-like structure or VLP lacking genetic material.
  • the present invention contemplates both that the B and / or C polypeptides are exposed on the surface of the virus or the VLP, and that they are included within the virus or the VLP.
  • the enzymes comprised in the B and C polypeptides of the biocatalyst of the invention are enzymes integrating a route, wherein the product resulting from the reaction catalyzed by one of the enzymes, for example the enzyme or fragment thereof it retains its enzymatic activity of polypeptide B, be it the substrate of the reaction catalyzed by another of the enzymes, for example the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide C, or where the product resulting from the reaction catalyzed by one of the enzymes, for example the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide C, is the substrate of the reaction catalyzed by another of the enzymes, for example the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of polypeptide B.
  • Polypeptide A which comprises a viral capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • polypeptide B which comprises an enzyme or fragment of the which retains its enzymatic activity
  • the biocatalyst of the invention are linked together by a crosslinking agent.
  • the crosslinking agent according to the invention is a protein crosslinking agent.
  • the cross-linking of polypeptides A and B comprised in the biocatalyst of the invention is such that said cross-linking does not nullify the biological functionality of such polypeptides A and B. In particular, cross-linking does not nullify the capacity of the viral capsid protein.
  • polypeptide A included in polypeptide A to assemble and form part of a viral capsid of a virus of the Potyviridae family or of a VLP, nor does it nullify the biological functionality of the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity comprised in polypeptide B.
  • cross-linking occurs at a different site from the enzyme's active center of the enzyme or the fragment thereof that retains the enzymatic activity.
  • One possible method comprises the binding of a primary antibody that recognizes the B polypeptide of interest followed by the binding of a labeled secondary antibody and detection of the associated labeling to the secondary antibody.
  • Another possible method comprises the use of specific proteases of polypeptide B and measurement of the decrease in their associated activity.
  • Another possible method comprises the polypeptide mapping and its observation by microscopy.
  • the marking can be performed, in a non-limiting example of the invention, by immunodecoration and its observation by SEM (scanning electron microscopy, scanning electron microscopy). Additional methods include, but are not limited to, Western blot, electrophoretic mobility retardation assays (EMSA), microscopy, etc.
  • polypeptide A which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • polypeptide B which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity
  • Cross-linking agents according to the invention comprise homobifunctional or heterobifunctional protein binding agents, such as those described above, which comprise suitable reactive groups to the target functional groups present in polypeptides A and B of the biocatalyst of the invention.
  • crosslinking agents can bind different functional groups present in proteins that include, but are not limited to, ⁇ -amino groups, ⁇ -amino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups, hydroxyl groups, phenolic groups and imidazole groups.
  • the protein functional groups that are linked by the cross-linking agent are located in exposed regions of the protein accessible to said cross-linking agent.
  • the selection of the suitable crosslinking agent is given by factors such as the solubility of the reagent, the nature of the reactive groups, the homobifunctional or heterobifunctional character of the crosslinking agent, the presence of photoreactive or thermoreactive groups, the length of the spacer arm of the crosslinking agent, the divisible or non-divisible nature of the product, the need for additional marking and the reaction conditions necessary for conjugation.
  • Preferred crosslinking agents according to the invention include, but are not limited to, non-spacer arm agents such as N-hydroxysuccinimide (HS) esters or isocyanates, maleimides or bromine / iodoacetamides, carbodiimides such as ECD (l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) ) carbodiimide hydrochloride, homobifunctional crosslinking agents such as glutaraldehyde, di (N-succinimidyl) carbonate, di (N- succinimidyl) suberate, dimethyl adipimate dihydrochloride, dimethyl pimelimidate dihydrochloride, dimethyl suberimidate, dihydrochlorination heterobonding agents such as dihydrochloride dihydrochlorination agents such as , copper-catalyzed alkaline azide-addition cycle (CuAAC), oxime / hydrazone ligation, oxidative coupling to
  • the protein functional groups to which the crosslinking agents are directed are amino groups, in particular amino groups of Usina amino acid residues, histidine residues or the amino terminal end of the protein, present in the viral capsid protein comprised in polypeptide A and / or present in the enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity comprised in polypeptide B.
  • the protein binding crosslinking agent is a homobifunctional agent.
  • the crosslinking agent is glutaraldehyde (CHO (CH 2 ) 3CHO). This homobifunctional reagent can form polymers of different molecular weights in solution, and it is these polymers that react with the amino groups of the proteins to produce crosslinking.
  • Viruses of the invention contemplates that the viral capsid proteins of a virus of the Potyviridae family comprised in polypeptide A can be assembled to form a virus.
  • the present invention relates to a virus of the family Potyviridae, hereinafter "virus of the invention", which comprises a polypeptide B, wherein said polypeptide B comprises an enzyme or fragment thereof that retains its Enzymatic activity, linked to a capsid protein of said Potyviridae family virus by a cross-linking agent.
  • virus of the invention which comprises a polypeptide B, wherein said polypeptide B comprises an enzyme or fragment thereof that retains its Enzymatic activity, linked to a capsid protein of said Potyviridae family virus by a cross-linking agent.
  • the enzyme is a lipase, even more particularly, lipase B from Candida Antarctica.
  • the Potyviridae family virus in a Potyvirus in a Potyvirus.
  • the Potyviridae family virus is turnip mosaic virus (TuMV).
  • the pathway of the invention exhibits on its surface the B-polypeptide, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a capsid protein of said virus by a cross-linking agent.
  • the virus of the invention contains within it the polypeptide B, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a protein of the capsid of said virus by means of a cross-linking agent. Therefore, the present invention also relates to the use of a virus as described above for the immobilization of an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of interest.
  • the virus of the invention further comprises at least one polypeptide C, comprising an enzyme other than the enzyme comprised in polypeptide B, wherein said polypeptide C is linked to a protein of the virus capsid by a crosslinking agent.
  • the crosslinking agent that binds polypeptide C to the virus capsid protein is the same agent that binds polypeptide B to the virus capsid protein.
  • the crosslinking agent that binds polypeptide C to the virus capsid protein is different from the agent that binds polypeptide B to the virus capsid protein.
  • VLP of the invention VLP of the invention
  • the present invention contemplates that the viral capsid proteins of a virus of the Potyviridae family comprised in polypeptide A can be assembled forming a virus-like structure or VLP, lacking genetic material.
  • the present invention relates to a VLP of a virus of the Potyviridae family, hereinafter "VLP of the invention", which comprises a B polypeptide, comprising an enzyme or fragment thereof that retains its activity enzymatic, linked to a capsid protein of said virus by a cross-linking agent.
  • VLP of the invention comprises a B polypeptide, comprising an enzyme or fragment thereof that retains its activity enzymatic, linked to a capsid protein of said virus by a cross-linking agent.
  • the capsid proteins of a virus of the Potyviridae family comprised by the VLP are capsid proteins of a Potyvirus.
  • the capsid proteins of a virus from the Potyviridae family are turnip mosaic virus (TuMV) capsid proteins.
  • the VLP of the invention comprises a polypeptide B comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • the enzyme is a lipase.
  • the enzyme is Lipase B from Candida Antarctica.
  • the VLP of the invention exhibits on its surface the polypeptide B, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, linked to a capsid protein of said VLP by a cross-linking agent.
  • the VLP of the invention contains within it the polypeptide B which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity linked to a capsid protein of said VLP by means of a cross-linking agent. Therefore, the present invention relates to the use of a VLP as described above for the immobilization of an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity of interest.
  • the VLP of the invention further comprises at least one polypeptide C, which comprises an enzyme other than the enzyme comprised in polypeptide B, wherein said polypeptide C is linked to a capsid protein of the VLP by a crosslinking agent.
  • the crosslinking agent that binds polypeptide C to the VLP capsid protein is the same agent that binds polypeptide B to the VLP capsid protein.
  • the crosslinking agent that binds polypeptide C to the VLP capsid protein is different from the agent that binds polypeptide B to the VLP capsid protein.
  • the invention in another aspect, relates to a method for obtaining a biocatalyst of the invention, hereinafter "method of obtaining the biocatalyst of the invention", which comprises contacting a polypeptide A, which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, with a B-polypeptide, comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in the presence of a cross-linking agent, under conditions suitable for the formation of said biocatalyst.
  • a polypeptide A which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • B-polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity
  • biocatalyst of the invention may require an additional step comprising the activation of polypeptide A and / or polypeptide B, prior to the conjugation stage.
  • polypeptide A is activated in a first stage with the cross-linking agent to form a complex [polypeptide A-cross-linking agent], and, in a second stage, The above resulting complex is conjugated with polypeptide B.
  • polypeptide B is activated in a first step with the cross-linking agent to form a complex [B-agent polypeptide of cross-linking], and, in a second stage, the above resulting complex is conjugated with polypeptide A.
  • the protein conjugation is carried out by methods such as, but not limited to, the mixed anhydride method, the carboxy diimide (CDI) method or the N-hydroxysuccinimide ester method ( NHS)
  • the mixed anhydride method one of the proteins is reacted with algal chloroformate, and the acid anhydride formed is reacted with the free amino groups of the protein at approximately pH 9.
  • Agents such as l-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) are used in the carboxy diimide method; N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and p-toluenesulfonate of l-cyclohexyl-3- (2-morpholinylethyl) carbodiimide (CMC).
  • DCC N-dicyclohexylcarbodiimide
  • CMC p-toluenesulfonate of l-cyclohexyl-3- (2-morpholinylethyl) carbodiimide
  • N-hydroxysuccinimide ester method the protein with the carboxyl group is coupled to NHS in the presence of DCC, the NHS ester obtained is purified and reacted with the protein.
  • the cross-linking agent employed in the method of obtaining the biocatalyst of the invention is a cross-linking agent for protein binding, as described above.
  • the conjugation by a cross-linking agent of polypeptide A, which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, and of polypeptide B, comprising comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, as understood the person skilled in the art is carried out under conditions under which neither the ability to assemble in viral particles and / or VLPs by the protein of the viral capsid comprised by polypeptide A, nor the biological functionality of the Enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity comprised of polypeptide B.
  • the reaction conditions under which conjugation occurs are such that they allow the maintenance of the native structure of the proteins to be bound so, in general, both the activation reaction and the conjugation reaction occur in the presence of a buffer solution and with mild pH conditions.
  • conjugation by a crosslinking agent occurs between a polypeptide A and a polypeptide B
  • polypeptide B comprises an enzyme of interest
  • An enzyme is considered to retain its enzymatic activity after conjugation if it maintains at least 100%, at least 95%, at least 90%, at least 85% or at least 80% enzymatic activity with respect to its Enzymatic activity before conjugation.
  • polypeptide B comprises a lipase enzyme.
  • Methods for determining the enzymatic activity of a lipase are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, the method set forth in Example 1 of the invention, in which is used paranitrophenyl acetate as a substrate, as well as the methods described by Fuci ⁇ os et al. (2005 J Biotechnol 1 17: 233-241) or the test described in Example 12 of patent application WO2006 / 096834.
  • the appropriate molar ratio of protein and crosslinking agent is determined experimentally as is known to those skilled in the art.
  • usual molar ratios of crosslinking agent: polypeptide are 1: 0.001, 1: 0.01, 1: 0.1, 1: 1, 1: 10, 1: 100, 1: 1000.
  • Preferred proportions of crosslinking agent: polypeptide are 1: 0.01-1: 0.1 in the case that the crosslinking agent is glutaralehyde, and may vary in case of other crosslinking agents.
  • polypeptide A and polypeptide B are also determined experimentally and include, but are not limited to 1: 0.001, 1: 0.01, 1: 0, 1, 1: 1, 1: 10, 1 : 100, 1: 1000.
  • Preferred proportions of polypeptide A: polypeptide B according to the invention are: 0.01, 1: 0.1 and 1: 1.
  • the method of obtaining the biocatalyst of the invention comprises the activation of polypeptide A and / or the activation of polypeptide B, so that said activation takes place at a stage prior to the stage conjugation
  • the activation reaction and / or the conjugation reaction takes place under conditions of pH, temperature, reaction time, reaction volume, agent proportion cross-linking: protein / peptide, etc. particular, suitable for activation and / or conjugation of polypeptides A and B.
  • the activation and / or conjugation reaction proceeds at a pH value between pH 6 and pH 11.
  • the conjugation reaction proceeds at pH 8. approximately.
  • the activation and / or conjugation reaction takes place at a temperature between 4 ° C and 30 ° C. In a preferred embodiment, the activation reaction proceeds at a temperature of approximately 25 ° C, and the conjugation reaction proceeds at a temperature of approximately 4 ° C.
  • the reaction time in a particular embodiment of the present invention, the activation and / or conjugation reaction takes place in a period of time between 30 and 1,440 minutes. In a preferred embodiment, the activation reaction takes place in a period of approximately 60 minutes and the conjugation reaction takes place in a period of time between 840 and 1,080 minutes.
  • the activation and / or conjugation reaction takes place in a final volume of 50 to 750 ⁇ (activation 75-300 ⁇ and conjugation 300-650 ⁇ ).
  • the activation and / or conjugation reaction is carried out with a ratio of 1: 0.0005, 1 : 0.005, 1: 0.05, 1: 0.5, 1: 5, 1: 50, 1: 500 crosslinking agent: protein to conjugate.
  • the ratio is 1: 0.005-1: 0.05 in the case of glutaraldehyde, although other proportions may be suitable for other crosslinking agents.
  • the method of obtaining the biocatalyst of the invention further comprises contacting a polypeptide A, which comprises a capsid protein of a virus of the family Poyyviridae, with a polypeptide C, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, wherein the enzyme or fragment thereof of polypeptide C is different from the enzyme or fragment thereof of polypeptide B, in the presence of a cross-linking agent, wherein the cross-linking agent may be the same or different from the crosslinking agent for the binding of polypeptide A and polypeptide B, under conditions suitable for the formation of said biocatalyst.
  • the method of obtaining the biocatalyst of the invention comprises the conjugation of a polypeptide A, which comprises a capsid protein of a Poyvirus, in particular of turnip mosaic virus, and of a B polypeptide, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in particular a lipase enzyme, more particularly the lipase B from Candida Antarctica.
  • a polypeptide A which comprises a capsid protein of a Poyvirus, in particular of turnip mosaic virus
  • a B polypeptide which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in particular a lipase enzyme, more particularly the lipase B from Candida Antarctica.
  • the capsid protein of a virus of the family Po ⁇ yviridae can be assembled and give rise to virus of the family Poyyviridae, which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity. Therefore, in another aspect, the invention relates to a method for obtaining a virus of the invention, hereinafter, "method of obtaining the virus of the invention", wherein said method comprises contacting a virus of the Poyviridae family, with a B-polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in the presence of a cross-linking agent, under conditions suitable for the formation of said virus.
  • Obtaining the route of the invention may require an additional step comprising the activation of the capsid proteins of the Potyviridae family virus and / or of the B polypeptide, prior to the conjugation stage.
  • the capsid proteins of the Potyviridae family virus in a first stage are activated with the cross-linking agent to form a complex [virus-cross-linking agent], and , in a second stage, the above resulting complex is conjugated with polypeptide B.
  • polypeptide B in a first stage polypeptide B is activated with the crosslinking agent to form a complex [polypeptide B-crosslinking agent], and, in a second stage, the above resulting complex is conjugated with the capsid proteins of the Potyviridae family virus.
  • the method of obtaining the virus of the invention further comprises contacting a virus of the Potyviridae family, with a C polypeptide, comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, wherein the Enzyme or fragment thereof of polypeptide C is different from the enzyme or fragment thereof of polypeptide B, in the presence of a cross-linking agent, wherein the cross-linking agent may be the same or different from the cross-linking agent for virus binding and polypeptide B, under conditions suitable for the formation of said virus.
  • the method of obtaining the virus of the invention comprises the conjugation of a Potyvirus, in particular of the turnip mosaic virus, and of a B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in Particularly a lipase enzyme, more particularly Lipase B from Candida Antarctica.
  • the capsid protein of a virus of the Potyviridae family comprised in polypeptide A, can be assembled and give rise to a VLP, so that said VLP comprises a heterologous protein of interest.
  • the invention relates to a method for obtaining a VLP of the invention, hereinafter, "method of obtaining the VLP of the invention"), wherein said method comprises contacting a VLP of a virus of the Potyviridae family, with a B-polypeptide, comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in the presence of a cross-linking agent, under conditions suitable for the formation of said VLP.
  • Obtaining the VLP of the invention may require an additional step comprising the activation of the capsid proteins of the Potyviridae family virus and / or of the B polypeptide, prior to the conjugation step.
  • the capsid proteins of the VLP Potyviridae family virus are activated with the cross-linking agent to form a complex [VLP-agent of cross-linking], and, in a second stage, the above resulting complex is conjugated with polypeptide B.
  • polypeptide B is activated in a first stage with the agent cross-linking to form a complex [B-cross-linking agent polypeptide], and, in a second stage, the above resulting complex is conjugated with the capsid proteins of the VLP Potyviridae family virus.
  • the method of obtaining the VLP of the invention further comprises contacting a VLP of a family virus Potyviridae, with a polypeptide C, comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, wherein the enzyme or fragment thereof of polypeptide C is different from the enzyme or fragment thereof of polypeptide B, in the presence of an agent of cross-linking, wherein the cross-linking agent may be the same or different from the cross-linking agent for the binding of the VLP and polypeptide B, under conditions suitable for the formation of said VLP.
  • the method of obtaining the VLP of the invention comprises the conjugation of a VLP formed by capsid proteins of a Potyvirus, in particular turnip mosaic virus, and a B-polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, in particular a lipase enzyme, more particularly lipase B from Candida Antarctica.
  • the authors of the present invention have managed to immobilize a lipase, in particular CALB, on viral particles of turnip mosaic virus (TuMV), observing an increase in the enzymatic activity of the immobilized lipase enzyme with respect to the enzyme without immobilization (Example 1) .
  • a lipase in particular CALB
  • TuMV turnip mosaic virus
  • the invention relates to a method for immobilization of an enzyme (enzymatic immobilization), which comprises conjugating a polypeptide A, which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, and a B-polypeptide, comprising said enzyme or a fragment thereof that retains its enzymatic activity, by a cross-linking agent.
  • an enzyme enzymatic immobilization
  • conjugating a polypeptide A which comprises a capsid protein of a virus of the Potyviridae family
  • a B-polypeptide comprising said enzyme or a fragment thereof that retains its enzymatic activity
  • the invention relates to the use of a polypeptide A comprising a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, of a virus of the Potyviridae family, or of a VLP comprising capsid proteins of a virus of the Potyviridae family, for the immobilization of a B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • a polypeptide A comprising a capsid protein of a virus of the Potyviridae family, of a virus of the Potyviridae family, or of a VLP comprising capsid proteins of a virus of the Potyviridae family, for the immobilization of a B polypeptide comprising an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity.
  • the capsid protein of a virus of the Potyviridae family comprised in polypeptide A of the biocatalyst of the invention, can be assembled and give rise to viral particles or V
  • polypeptide B which comprises an enzyme or fragment thereof that retains its enzymatic activity, can be immobilized by binding to a virus of the Potyviridae family, in particular a Potyvirus, such as TuMV, or a VLP comprising viral capsid proteins from a virus of the Potyviridae family, in particular from a Potyvirus, such as TuMV.
  • said polypeptide A and / or said polypeptide B is activated prior to conjugation by a cross-linking agent, as described above.
  • polypeptide A is activated in a first stage with the cross-linking agent to form a complex [polypeptide A-cross-linking agent] and, in a second stage, conjugates the above resulting complex with polypeptide B.
  • polypeptide B is activated in a first step with the crosslinking agent to form a complex [polypeptide B-crosslinking agent], and, in a second stage , the above resulting complex is conjugated with polypeptide A.
  • polypeptide A comprises a capsid protein of a Potyvirus virus, in particular turnip mosaic virus
  • polypeptide B comprises an enzyme or fragment thereof that it retains its enzymatic activity, in particular a lipase enzyme, more particularly lipase B from Candida Antarctica.
  • the present invention relates to a process for the enzymatic conversion of a substrate into a product comprising contacting said substrate with a biocatalyst of the invention, or with a virus of the invention, or with a VLP of the invention, wherein the enzyme or fragment thereof that preserves its enzymatic activity present in polypeptide B of the biocatalyst, or of the virus or of the VLP, is an enzyme that catalyzes a specific enzymatic reaction for the conversion of said substrate into said product, under suitable conditions for said enzymatic reaction to take place.
  • Suitable conditions for the enzymatic conversion of a substrate into a product refer to the reaction buffer, pH, temperature, reaction time, concentration of reactants, etc., and can be determined for each particular enzymatic reaction.
  • Non-limiting examples of enzymatic conversions of a substrate into a product of interest include the conversion of paraphenylacetate (pNA) by lipases into paranitrophenol (p P), the hydrolysis of triacylglycerol, diacylglycerol or monoacrylic glycerol by lipases to glycerol and free fatty acids, the hydrolysis of lactose by lactose to glucose and galactose, the partial or total hydrolysis of starch or glycogen by amylases to simpler sugars, the digestion of proteins by proteases obtaining peptides or amino acids, the digestion of peptides by peptinase obtaining smaller peptides or amino acids, the hydrolysis of polysaccharides, oligosaccharides and disaccharides such as sucrose by invertases to obtain oligosaccharides or monosaccharides, cellulose hydrolysis or derivatives by cellulases to obtain glucose, the conversion of oxygen peroxide by cat
  • Viral stability tests were carried out with the objective of evaluating the structural maintenance against different parameters such as pH, pH of the conjugation buffer and organic solvents used in the activity tests. To do this, changes in absorbance spectra and the typical A 2 5o A 2 67 ratio of nucleoproteins were analyzed (Thounevel JC et al. 1976 Annals Appl Biol 84 (3): 311-320). The spectra were obtained after 24 h and at room temperature by Nanodrop®.
  • Viral stability as a function of temperature was carried out at different times (60-360 min) and temperatures (50 ° C, 60 ° C, 70 ° C and 100 ° C).
  • CALB lipase (Sigma®) was dissolved in 0.02M phosphate buffer pH 8 at a concentration of 1 mg / ml or 10 mg / ml, and incubated with 1% glutaraldehyde (GA) for 1 h at room temperature and by gentle agitation .
  • G glutaraldehyde
  • filtration was performed to remove excess cross-linking agent, by commercial filtration / concentration devices.
  • an acrylic resin desalting column with a MWCO (molecular weight cut off) of 7 kDa (Zeba spin column®) was used.
  • the resulting concentrate after centrifugation following the manufacturer's instructions was recovered and adjusted to the initial concentration in 0.02 M potassium phosphate buffer pH 8.
  • CALB-GA and TuMV were conjugated in different proportions CP-TuMV: CALB (100: 1, 10: 1 and 1: 1, CP units: CALB units) in one volume 600 ⁇ and incubating the mixture for 18 hours, at 4 o C and with orbital stirring (15 rpm). Controls without GA and without viruses were included.
  • the possible GA reactive sites that could remain active were blocked with 30 ⁇ of 0.5 M glycine in carbonate buffer pH 8 for 2 hours at room temperature and with stirring, following the conditions used in Hermanson GT 2008 Bioconjugate Tecniques . 2nd ed. Academic Press, San Diego.
  • the products resulting from the previous steps were subjected to filtration through a commercial device (Amicon® YM-100, NMWL -Nominal Molecular Weight Limit- 100 kDa) to separate molecules smaller than 100 kDa, comprising aggregates with 1 to 3 molecules of CALB, from the mixture containing CALB bioconjugated or trapped with TuMV or CALB aggregates of more than 3 enzyme molecules.
  • the conjugates were maintained at a temperature of -20 ° C and in 50% glycerol.
  • Figure 1 shows a scheme of the activation and conjugation process used.
  • Polyacrylamide gel electrophoresis was carried out in the presence of 12% SDS (SDS-PAGE) and staining with EZ blue® (Sigma) for quantification of virus-bound protein.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • EZ blue® Sigma
  • the enzymatic activity of the CALB enzyme immobilized on TuMV is tested using p-nitrophenyl acetate as substrate (Jung S & Park S 2008 Biotechnology Letters 30: 717-722) in MOPS buffer (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid) -Na 50 mM pH 8 instead of BES buffer (N, N-bis- (2-hydroxyethyl) -2-amino- ethanesulfonic acid).
  • MOPS buffer 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid
  • BES buffer N, N-bis- (2-hydroxyethyl) -2-amino- ethanesulfonic acid
  • CALB activity tests in the different steps of the process are shown as a percentage of the commercial CALB activity (considered 100%) used in the bio-conjugation process.
  • Samples for electron microscopy were prepared by dropping a drop of 10 ul of the conjugates and controls on electron microscopy grids covered with Formvar® nickel (3.05 mm nickel, TAAB). After 15 min of incubation, the grids were washed with 200 drops of water and stained with 2% uranyl acetate for 2 minutes. The racks were dried and stored at room temperature. The images were obtained by electron microscopy in a JEM JEOL1010 at 80 kV.
  • Virus purification The yield obtained during purification was approximately 30 ⁇ g of virus per gram of infected tissue.
  • the size of the capsid protein (CP) obtained by SDS-PAGE was as expected (33 kDa). Viral stability tests
  • the ratio A 250 / A 26 7 remained similar to controls with a proportion of acetonitrile of 7% ( Figure 2D), which was subsequently used in the activity tests. Furthermore, higher proportions of acetonitrile changes were observed in the ratio A 250 / A 26 7-
  • the conjugates were filtered through a device with a 100 kDa exclusion limit, so that conjugated or entrapped CALB was retained by TuMV particles, as well as molecules formed by at least 4 CALB units.
  • a quantification was carried out based on the intensity levels of the bands corresponding to 33 kDa.
  • the intensity of the test samples was measured and virus-bound CALB was quantified (Figure 4).
  • Table 3 shows the percentage of virus-bound lipase, so that the percentages obtained were higher for the C5 conjugate, being similar for the C4 conjugate.
  • TuMV is stable within a wide pH range (6-11) and also tolerates limited amounts of acenonitrile.
  • the temperature range in which TuMV is stable (4 ° C-50 ° C) can be considered acceptable within the biological parameters.
  • the results show a structural transition at 60 ° C, which would confirm the results of Atabekov et al. (Atabekov J et al. 201 1 J Gen Virol 92 (2): 453-456). Therefore, TuMV can be considered as a biosoporte of interest in a wide range of necessary conditions in a variety of processes.
  • the present invention provides a stable virion that can be used as a tool in protein immobilization.
  • the results obtained in the blocking stage suggest a correlation between the reactive groups obtained and the color observed.
  • the total amount of CALB bound to the virus varies, depending on parameters such as the concentration of the sample and the device used for filtration.
  • the system approximates the saturation of CALB in C4 and C5.
  • the data obtained for Cl and C2 are similar, while in C3 a greater amount of CALB can be retained. This may be due to the fact that conjugation is carried out in a larger volume and that steric impediments are avoided.
  • lipase forms aggregates by way of balls conjugated with GA.
  • it is considered that the CALB is retained due to the centrifugation stages, according to the results obtained by electron microscopy.
  • the relative specific activity shows improvements of 186% to 333% compared to commercial lipase. It is necessary to point out that the heterogeneity of conjugates C4 and C5 makes it difficult to achieve reproducibility between trials.
  • the system of the invention would allow the binding of several enzymes to the surface of the virion for the catalysis of reactions that take place in different stages.
  • this system offers the possibility of joining different biological molecules, such as peptides and enzymes, becoming a useful alternative as a three-dimensional scaffold in tissue engineering.
  • the length between viruses can be adjusted by using different linkers or by combining several molecules (peptide-virus-enzyme).
  • TuMV has approximately 11 Usina residues per CP and 2000 copies of CP, which represent a minimum of 22,000 sites capable of reacting with GA (without paying attention to other residues with reactivity is possible).
  • the biosecurity of the conjugates can also be improved through the use of VLPs that lack genetic material. If you compare the surface / volume ratio of carbon nanotubes and TuMV, you can see that the ratio is 400 times higher in the case of TuMV. This advantage is further complemented by the monodispersion and regular structure of the flexuous type viruses.

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Abstract

Se describe el empleo de proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae como soporte para la inmovilización de enzimas de interés, mediante el empleo de un agente de entrecruzamiento adecuado para la unión de las proteínas de la cápsida viral al enzima de interés.

Description

BIOCATALIZ ADORE S Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al área de la inmovilización de biocatalizadores y se relaciona con unos biocatalizadores en los que se inmoviliza un enzima sobre un soporte basado en una proteína de una cápsida viral, en donde dicha inmovilización tiene como resultado un aumento en la actividad enzimática específica del enzima inmovilizado. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Dado que el número de procesos catalizados por enzimas en la industria es cada vez mayor, la inmovilización de enzimas es de gran interés en sectores tales como el químico, farmacéutico o alimentario, así como en procesos tales como el tratamiento de residuos, métodos de diagnóstico y/o de tratamiento de enfermedades, etc.
La nanotecnología ha suscitado un reciente interés en la inmovilización enzimática debido a sus potenciales aplicaciones en Biotecnología y Biomedicina. La inmovilización enzimática conlleva ventajas asociadas a la manipulación, separación del enzima de la mezcla de reacción, reutilización del enzima, reducción de costes y posibilidad de aumentar la estabilidad térmica y el rango de pH de actuación del enzima. En el campo de la nanotecnología, los factores que determinan la eficiencia de los biocatalizadores vienen dados por el área de la superficie, la resistencia a la transferencia de masa, y la carga enzimática efectiva. Se han descrito diversos nanomateriales en relación con biocatalizadores: nanopartículas, nanofibras, nanotubos, y matrices nanoporosas. Un requisito importante en la inmovilización de una proteína es que la matriz proporcione un entorno biocompatible e inerte, es decir, que no interfiera con la estructura nativa de la proteína. Desde el punto de vista bioquímico, la inmovilización enzimática aporta una serie de ventajas, tales como: disminución de problemas de autolisis (proteasas) o de agregación, al estar limitados los movimientos rotacionales y traslacionales,
ralentización de los cambios conformacionales, por lo que se pueden estudiar las relaciones estructura-función,
- simulación de reacciones in vivo,
simulación de sistemas estructuralmente asimétricos (tales como estudios de membranas),
en sistemas entrecruzados, pueden fijarse interacciones con fosfolípidos, polisacáridos, etc. para simular orgánulos celulares,
- unión multipuntual a soportes deformables que permite estudiar la deformación de proteínas globulares, y
especificidad de sustrato.
Asimismo, la inmovilización enzimática plantea una serie de desventajas, tales como la disminución en la actividad enzimática del enzima inmovilizado, la dificultad en la interpretación de los datos si la preparación enzimática no es homogénea, y la posibilidad de contactos proteína-proteína indeseados.
Desde un punto de vista aplicado, la inmovilización enzimática plantea una serie de ventajas: aumento de la estabilidad enzimática, aumento de la productividad enzimática debido a la posibilidad de reutilización, facilidad de recuperación del enzima, de purificación de los productos y, en general, de operación y control del proceso. Por otro lado, como inconvenientes, cabe destacar que generalmente la actividad enzimática disminuye, aumentan los problemas difusionales, aumenta el coste del proceso y el hecho de que el intervalo de pH de trabajo puede ser diferente al del biocatalizador nativo.
En el estado de la técnica se han descrito enzimas inmovilizados en una variedad de soportes (scaffolds), tales como nanotubos de silicio, bicapas fosfolipídicas, monocapas auto-ensambladas, matrices poliméricas, en películas Langmuir-Blodgett, partículas de látex poliestireno, partículas de oro ensambladas en polímeros y zeolita o películas lipídicas evaporadas térmicamente, nanopartículas magnéticas y no magnéticas, entre otras.
Se han descrito diversas aplicaciones de enzimas inmovilizados en nanopartículas (Ansari SA & Husain Q 2012 Biotech Adv 30: 512-523) y en nanotubos de carbono (Feng W & Ji P 2011 Biotech Adv 29: 889-895). La solicitud de patente internacional WO2008133433 está dirigida a métodos de exposición de proteínas, azúcares o ácidos nucleicos sobre la superficie de esporas, virus, bacterias y levaduras. Cardinale D et al. (2012 Trends Biotech 30(7): 369-376) describe el desarrollo de nanotrasportadores enzimáticos (enzyme nano-carriers, ENCs) basados en virus de plantas, bacteriófagos y partículas similares a virus (virus-like partióles, VLPs) como soporte (scaffold) para, entre otros, el confinamiento enzimático. Se han descrito diferentes metodologías para la inmovilización de enzimas de interés comercial tal como la lipasa B de Candida antárctica (CALB), habitualmente basados en proteínas de fusión (Idris A & Bukhari A 2012 Biotechnol Adv 30: 550-563; Mateo C et al. 2007 Enzyme Microb Tech 40: 1451- 1463; Carette N et al. 2007 Nature Nanotechnol 2: 226- 229; Minten IJ et al. 2011 Chem Sci 2: 358-362).
A la vista del estado de la técnica en el área de la inmovilización enzimática, es necesario desarrollar sistemas alternativos a los descritos que, ventajosamente, no requieran la generación de proteínas de fusión, resultando así más fáciles y rápidos y que, convenientemente, permitan obtener una mayor actividad enzimática específica.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un biocatalizador que comprende
- un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y
- un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática,
en donde dicho polipéptido A está unido al polipéptido B mediante un agente de entrecruzami ento . En otro aspecto, la invención se relaciona con un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae mediante un agente de entrecruzami ento .
En otro aspecto, la invención se relaciona con una VLP de un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae mediante un agente de entrecruzami ento .
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de dicho biocatalizador, que comprende poner en contacto un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzami ento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho biocatalizador. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de dicho virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae, que comprende poner en contacto un virus de la familia Potyviridae, con dicho polipéptido B, en presencia de un agente de entrecruzami ento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho virus.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de dicha VLP de un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae, que comprende poner en contacto una VLP de un virus de la familia Potyviridae, con dicho polipéptido B, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicha VLP.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inmovilizar un enzima que comprende conjugar un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, que comprende un enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, mediante un agente de entrecruzami ento . En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de
(i) un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, o de
(ü) un virus de la familia Potyviridae, o de
(iii) una VLP que comprende proteínas de la cápsida de un virus de la familia
Potyviridae,
para la inmovilización de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la conversión enzimática de un sustrato en un producto que comprende poner en contacto dicho sustrato con dicho biocatalizador, virus anterior o VLP, en donde el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática presente en el polipéptido B del biocatalizador, o del virus o de la VLP, es un enzima que cataliza una reacción enzimática específica para la conversión de dicho sustrato en dicho producto, bajo condiciones adecuadas para que dicha reacción enzimática tenga lugar.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra un esquema del proceso de bioconjugación. La primera columna representa la activación, mientras que la segunda columna es una representación de la conjugación. La Figura 2 muestra el análisis de estabilidad de las partículas virales, expresada bien como relación A25o A267 (A, C-E) o bien como variación del espectro de absorción respecto al control (B), en función del pH (A, B), del pH del tampón de conjugación (C), de la proporción de acetonitrilo (D) y de la temperatura (E).
La Figura 3 muestra la variación de color observada en los conjugados Cl, C2, C3, C4 y C5 (de izquierda a derecha) tras el bloqueo, debida a la formación de bases de Schiff.
La Figura 4 muestra el resultado del SDS-PAGE. Carril 1 : marcador Rainbow. Carriles 2-5: 18, 45, 90 y 180 ng de CALB comercial. Carril 6: muestra Cl . Carril 7: muestra C2. Carril 8: muestra C3. Carril 9: muestra C4. Carril 10: muestra C5. La flecha señala los fragmentos 33 kDa de tamaño.
La Figura 5 muestra las curvas de cinéticas de lipasa comercial y de los conjugados Cl, C2, C4 y C5, representadas como velocidad (μΜ/min) frente a concentración de sustrato (μΜ).
La Figura 6 muestra imágenes de los conjugados Cl (A), C2 (B), C3 (C), C4 (D) y C5 (E) mediante microscopía electrónica y tinción negativa. Se muestra en cada caso el aumento (A: x40K, B: x40K, C: xl5K, D: x50K, E: x40K).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado un sistema de inmovilización proteica, en particular enzimática que, entre otras ventajas asociadas a la inmovilización de un enzima, resulta en un aumento de la actividad enzimática específica del enzima inmovilizado con respecto a la actividad del enzima libre. Los inventores de la presente invención han inmovilizado la lipasa B de Candida antárctica (CALB) sobre la proteína de la cápsida del virus del mosaico del nabo TuMV {Turnip mosaic virus). Los resultados obtenidos muestran que el enzima así inmovilizado experimenta un importante aumento en su actividad enzimática específica con respecto al enzima sin inmovilizar (Ejemplo 1). Definiciones
El término "activación" se emplea en la presente invención en el contexto de activación de una molécula, y se refiere a la transición reversible de una molécula hacia un estado físico o químico, de modo que dicho estado tiene una mayor tendencia a seguir una reacción química determinada.
El término "actividad específica", referido a un enzima, hace referencia a la actividad de un enzima por miligramo de proteína. Este parámetro se relaciona con la pureza de un enzima, y habitualmente se expresa en unidades de μιηοΐ min"1 mg"1.
El término "agente de entrecruzamiento" o "agente entrecruzante" o "agente de reticulación", también conocido como "cross-linker", hace referencia a un reactivo bifuncional que origina uniones intermoleculares de tipo covalente entre dos moléculas. Los agentes de entrecruzamiento comprenden grupos reactivos en los extremos que son específicos para determinados grupos funcionales. Los grupos reactivos de los agentes bifuncionales están separados entre sí por una cadena espaciadora (también denominada "brazo espaciador") de una longitud determinada, la cual permite determinar la distancia a la que se encuentran los dos residuos que son entrecruzados. En una realización particular de la invención, las moléculas que contienen grupos reactivos susceptibles de conjugación mediante agentes de entrecruzamiento son proteínas y/o péptidos.
En la Tabla 1 se recoge un listado de los grupos funcionales presentes en los agentes de entrecruzamiento y de sus correspondientes grupos funcionales diana con los que reaccionan.
Tabla 1
Grupos reactivos de agentes de entrecruzamiento y sus grupos funcionales diana
Grupo reactivo Grupo funcional diana
aril azida no selectivo (o amino primaria)
carbodiimida amino/carboxilo hidrazida carbohidrato (oxidado)
hidroximetil fosfina amino
imidoester amino
isocianato hidroxilo (no acuoso) carbonil hidrazina
maleimida sulfhidrilo
HS-éster amino
PFP-éster amino
psoraleno timina (intercalante fotoreactivo) piridil di sulfuro sulfhidrilo
vinil sulfona sulfhidrilo, amino, hidroxilo
Los agentes de entrecruzamiento pueden ser homobifuncionales o heterobifuncionales.
Los "agentes de entrecruzamiento homobifuncionales" son aquellos que comprenden grupos reactivos iguales en los extremos opuestos, separados entre sí por un brazo espaciador. Los agentes de entrecruzamiento homobifuncionales permiten que la reacción de entrecruzamiento transcurra en una sola etapa. Los agentes homobifuncionales incluyen, sin limitarse a, glutaraldehído, diaminoalcanos, di(N- succinimidil) carbonato, di(N-succinimidil) suberato, dimetil adipimato dihidrocloruro, dimetil pimelimidato dihidrocloruro, dimetil suberimidato dihidrocloruro, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BSSS, BS3), disuccinimidil glutarato (DSG), etilen glicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), disuccinimidil suberato (DSS), dithiobis(succinimidil propionato) (DTSP, reactivo de Lomant), etilen glicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS), bis(sulfosuccinimidil) glutarato (BS2G), 3,3 '- dithiobis(sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP), disuccinimidil tartrato (DST), (Bis(2- (succinimidooxicarboniloxi]etil)sulfona (BSOCOES), l,4-di-(3'-(2'piridilditio)- propionamido) butano (DPDPB), sulfodisuccinimidil tartrato (sulfo DST), ditiobis(succinimidil propionato) (DSP), etilenglicol bis(succinimidil succinato) (EGS).
Los "agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales" son aquellos que comprenden grupos reactivos diferentes en los extremos opuestos, separados entre sí por un brazo espaciador. El empleo de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales requiere que la reacción de entrecruzamiento transcurra en dos etapas secuenciales, de modo que en primer lugar se hace reaccionar el extremo reactivo menos lábil. Los agentes heterobifuncionales incluyen, sin limitarse a, succinimidil-4-[N- maleimidometil]cyclohexano-l-carboxilato (SMCC), SA PAH, n-sulfosuccinimidil-6- [4'-azido-2'-nitrofenilamino] hexanoato (sulfo- SANPAH), m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida éster (MBS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo MBS), Ν-γ-maleimidobutiriloxisuccinimida éster (GMBS), Ν-γ- maleimidobutiriloxisulfosuccinimida éster (sulfo GMBS), N-(8-maleimidocaproico azido) hidrazida (EMCH), N-(8-maleimidocaproiloxi) succinimida éster (EMCS), Ν-(ε- maleimidocaproiloxi) sulfo succinimida éster (sulfo EMCS), N-(p-maleimidofenil) isocianato (PMPI), N-succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB), succinimidil 3- (2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil 6-[3(2-piridilditio)propionamido] hexanoato (LC-SPDP), N-succinimidil bromoacetato (SBA), N-[e- mal eimidocaproiloxi] succinimida éster (EMCS), succinimidil-6-[B- maleimidopropionamido]hexanoato (SMPH), sulfosuccinimidil 6-(3'-[2-piridilditio]- propionamido)hexanoate (sulfo-LC-SPDP), N-succinimidil 4-[4- maleimidophenil]butirato (SMPB), (3-[2-Piridilditio]propionil hydrazida) (PDPH), N- succinimidil iodoacetate (SIA), N-(B-maleimidopropiloxi)succinimida ester (BMPS) y N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS), así como acoplamiento mediante diazonio, ciclo-adición alcalina de azida catalizada por cobre (CuAAC), ligación oxima/hidrazona y acoplamiento oxidativo a p-aminofenilalanina.
Los agentes de entrecruzamiento según la invención pueden ser de tipo homobifuncional o heterobifuncional. En una realización particular de la invención, el agente de entrecruzamiento es de tipo homobifuncional. En una realización aún más particular, el agente de entrecruzamiento es el glutaraldehído.
Si se atiende a los grupos funcionales que se unen, los agentes de entrecruzamiento incluyen, sin limitarse a, agentes de entrecruzamiento amino-a-amino, agentes de entrecruzamiento amino-a-sulfhidrilo, agentes de entrecruzamiento carboxilo-a-amino, agentes de entrecruzamiento fotorreactivos, agentes de entrecruzamiento sulfhidrilo-a- carbohidrato, agentes de entrecruzamiento sulfhidrilo-a-hidroxilo y agentes de entrecruzamiento sulfhidrilo-a-sulfhidrilo.
Los agentes de entrecruzamiento amino-a-amino incluyen, sin limitarse a:
- agentes imidioéster tales como dimetil adipimidato 2 HCl (DMA), dimetil pimelimidato 2 HCl (DMP), dimetil suberimidato 2 HCl (DMS) y dimetil 3,3 -ditiobispropionimidat 2 HCl (DTBP),
agentes HS-éster tales como bis(succinimidil)penta(etilenglicol) (BS(PEG)5), bis(succinimidil) nona(etilenglicol) (BS(PEG)9), bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS3), bis[2-
(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES), disuccinimidil glutarato (DSG), ditiobis(succinimidil) propionato (DSP) (reactivo de Lomants), disuccinimidil suberato (DSS), disuccinimidil tartrato (DST), 3,3'- ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP), etilenglicol bis(succinimidilsuccinato) (EGS), etilenglicol bis(sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), Tris(succinimidil) aminotriacetato (TSAT), y
otros agentes amino-reactivos tal como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno (DFD B).
Los agentes de entrecruzamiento amino a sulfhidrilo incluyen, sin limitarse a:
agentes NHS-haloacetil, basados en el éster NHS y iodoacetilo, bromoacetilo u otro haloacetilo, tales como sulfosuccinimidil (4-iodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB), succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP) y succinimidil iodoacetato (SIA), agentes NHS-maleimida, basados en H-hidroxisuccimida y maleidimida, tales como sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidomethil)cyclohexano-l- carboxylato (sulfo-SMCC), etilenglicol funcionalizado con n unidades de extremos succinimidilo y maleimido (SM(PEG)n), succinimidil 4-(N- maleimidomethil)ciclohexano-l-carboxylato (SMCC), succinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-l-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), sulfo-EMCS, EMCS, sulfo-GMBS, N-gamma-maleimidobutiril- oxisuccinimida éster (GMBS), N-kappa-maleimidoundecanoil- oxisulfosuccinimida (sulfo-KMUS), sulfo-MBS, m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida éster (MBS), sulfosuccinimidil 4-(p- maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB), SMPB, N-alfa-maleimidoacet- oxisuccinimida éster (AMAS), BMPS y succinimidil 6-[(beta- maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), y
agentes NHS-piridilditiol, basados en N-hidroxisuccinimida y piridilditiol, tales como 2-piridilditiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hidroxisuccinimida (PEG12-SPDP), 2-piridilditiol-tetraoxatetradecane-N-hidroxisuccinimida (PEG4-SPDP), sulfosuccinimidil 6-[3'-(2-piridilditio)propionamido] hexanoato (sulfo-LC-SPDP), succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil 6-[3(2-piridilditio) propionamido] hexanoato (LC- SPDP), sulfosuccinimidil-6-[alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)toluamido] hexanoato (sulfo-LC-SMPT) y 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa(2- piridilditio)tolueno (SMPT).
Los agentes de entrecruzamiento carboxilo a amino incluyen, sin limitarse a diciclohexilcarbodiimida (DCC), l-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida hidrocloruro (EDC o EDAC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-hidroxisulfoccinimida (S-NHS).
Los agentes de entrecruzamiento fotorreactivos incluyen, sin limitarse a:
agentes amino y fotorreactivos tales como N-5-azido-2- nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS), NHS-diazirina (SDA), sulfo-NHS- diazirina (sulfo-SDA), NHS-LC-diazirina (LC-SDA), sulfo-HHS-LC- diazirina (sulfo-LC-SDA), NHS-SS-diazirina (SDAD), sulfo-NHS-SS- diazirina (sulfo-SDAD) y N-sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'- nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH), y
otros agentes fotorreactivos tales como succinimidil-[4-(psoralen-8-iloxi)]- butirato (SPB). Los agentes de entrecruzamiento sulfhidrilo a carbohidrato incluyen, sin limitarse a, hidrazida-TFA del ácido N-beta-maleimidopropiónico (BMPH), hidrazida-TFA del ácido N-epsilon-maleimidocaproico (EMCH), hidrazida-TFA del ácido N-kappa- maleimidoundecanoico (KMUH), hidrazida-HCl del ácido 4-(4-N- maleimidofenil)butírico (MPBH) y 3-(2-piridilditio)propionil hidrazida (PDPH).
Los agentes de entrecruzamiento sulfhidrilo a hidroxilo incluyen, sin limitarse a, p- maleimidofenil isocianato (BMPI). Los agentes de entrecruzamiento sulfhidrilo a sulfhidrilo incluyen, sin limitarse a, 1,8- bismaleimidodietileneglicol (BM(PEG)2), 1, 1-bismaleimidotrietileneglicol
(BM(PEG)3), 1,4-bismaleimidobutano (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bismaleimidoetano (BMOE). En una realización preferida de la presente invención, las moléculas que contienen grupos reactivos susceptibles de conjugación mediante agentes de entrecruzamiento son proteínas y/o péptidos.
Para el entrecruzamiento proteico, los grupos funcionales proteicos a los que se dirigen los agentes de entrecruzamiento comprenden grupos amino, grupos ε-amino de Usinas, grupos α-amino terminal, grupos sulfhidrilo (-SH o grupos tioles) de cisteínas, grupos carbohidrato (en el caso de glucoproteínas) y grupos carboxilo.
Agentes de entrecruzamiento de proteínas a través de grupos amino, ε-amino de Usinas y α-amino terminal incluyen, sin limitarse a, imidoésteres y N-H-hidroxisuccinimida ésteres ( HS-ésteres).
Agentes de entrecruzamiento de proteínas a través de grupos sulfhidrilo incluyen, sin limitarse a, maleimidas, haloacetilos (tales como iodoacetilo) y piridil disulfuro (p iridi 1 ditio 1 e s) . Agentes de entrecruzamiento de proteínas a través de grupos carbonilo (tales como aldehidos o cetonas) por tratamiento oxidativo de los carbohidratos de glucoproteinas incluyen, sin limitarse a, reactivos que comprenden hidrazidas (- H- H2-). Agentes de entrecruzamiento de proteínas a través de grupos carboxilo incluyen, sin limitarse a, carbodiimidas.
El término "biocatalizador" hace referencia a un catalizador biológico que participa en una reacción química de un ser vivo. El biocatalizador disminuye la energía de activación necesaria para una reacción química determinada, facilitando y acelerando dicha reacción, sin consumirse en dicha reacción. En el contexto de la presente invención, el término biocatalizador se refiere a un enzima.
El término "biocatalizador inmovilizado" hace referencia a enzimas, extractos celulares que comprenden dichos enzimas, células que comprenden dichos enzimas, o combinaciones de los mismos, que se encuentran en un estado tal que permiten su reutilización. Se relaciona con el confinamiento físico de un enzima o célula en una determinada región del espacio, de modo que su actividad catalítica se retiene y puede ser reutilizado. En una realización preferida de la presente invención, el biocatalizador inmovilizado es un enzima.
El término "catálisis" se refiere en la presente invención al proceso en el que se aumenta la velocidad de una reacción química mediante intervención de un catalizador, de modo que dicho catalizador no resulta modificado durante la catálisis.
El término "cápsida", en ocasiones también denominada "cápside", hace referencia a la estructura proteica externa de un virus que encapsula el material genético de éste. La cápsida está formada por subunidades proteicas idénticas llamadas "capsómeros", codificadas por el genoma del propio virus. Cada capsómero puede estar constituido por una o por varias proteínas distintas. Atendiendo a la simetría, se distinguen tres tipos de la cápsida: helicoidal (habitual en virus vegetales y bacteriófagos), icosaédrica (habitual en víais animales, menos frecuente en virus vegetales y fagos) o compleja (consta bien de dos partes, cabeza y cola, o bien incluso de tres partes, cabeza, cuello y cola).
El término "conjugación", también denominado "entrecruzamiento" o "bioconjugacion" hace referencia al proceso de obtención de un conjugado, en particular un conjugado proteico formado por al menos dos proteínas, mediante unión química por enlace covalente no peptídico. Métodos de conjugación química son bien conocidos en la técnica. La conjugación puede llevarse a cabo directamente o a través de un agente de entrecruzamiento, a través de uno o más grupos funcionales en la proteína, tales como aminos, carboxilos, fenilos, tioles o hidroxilos.
El término "enzima", como se usa aquí, se refiere a una proteína que cataliza las reacciones químicas. Un enzima permite que una reacción química, termodinámicamente posible pero que transcurre a baja velocidad, sea cinéticamente favorable. El enzima actúa sobre una molécula denominada "sustrato", convirtiéndola en una molécula diferente denominada "producto", en una reacción denominada "reacción enzimática". Algunos ejemplos de enzimas útiles en la presente invención son, lipasas, amilasas, proteasas, peptinasas, invertasas, celulasas, lipasas, lactasas, catalasas, quimosinas, xilanasas y fitasas. Entre los parámetros que definen la reacción catalizada por un enzima, destacan la velocidad máxima (Vmax, o velocidad a la que un enzima es capaz de catalizar una reacción), la constante de afinidad (Km, o concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, representa la relación de afinidad de un enzima y su sustrato, de modo que a menor valor de Km, mayor afinidad del enzima por un sustrato) y la constante catalítica (Kcat, o número de moléculas de sustrato transformadas en producto, por centro activo y por unidad de tiempo). El experto en la materia conoce que los sustratos preferidos para las enzimas son aquellos para los que los valores de Km son bajos y los valores de Kcat altos en comparación con sustratos por los que no muestra afinidad. El término "fragmento de un enzima que conserva su actividad enzimática", en el contexto de la presente invención, hace referencia a un fragmento de cualquier longitud de un enzima que conserva al menos el 100%, al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85% o al menos el 80%> de la actividad enzimática del enzima del que se ha obtenido dicho fragmento. Asimismo, la presente invención contempla variantes funcionalmente equivalentes de un enzima de interés, que conservan al menos el 100%>, al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%> o al menos el 80%> de la actividad enzimática del enzima de interés y tienen una secuencia sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos del enzima de interés. Una secuencia de aminoácidos es "sustancialmente homologa" a una secuencia de aminoácidos determinada cuando presenta un grado de identidad de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 75%), típicamente de, al menos, un 80%>, preferentemente de, al menos, un 85%>, más preferentemente de, al menos, un 90%, aún más preferentemente de, al menos, un 95%, 96%), 97%), 98%) ó 99%), respecto a dicha secuencia de aminoácidos determinada. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST (Altschul SF et al. 1990 Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 215(3):403- 10). El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, etc.
El término "lipasa" se refiere a un enzima (E.C. 3.1.1.3) que es capaz de hidrolizar enlaces ésteres presentes en sustratos lipidíeos insolubles en solventes acuosos. En los sistemas biológicos, el enzima lipasa cataliza la hidrólisis (es decir, la separación del grupo hidroxilo y el átomo de hidrógeno de los compuestos para dar fragmentos por la adición de agua) de los lípidos a glicerol y ácidos grasos simples. En medio orgánico, sin embargo, el comportamiento enzimático cambia y este enzima puede sintetizar diferentes lípidos. Su versatilidad enzimática hace que sea de interés en la industria alimentaria, farmacéutica, cosmética, etc. permitiendo la síntesis de ésteres de carbohidratos, aminas y amidas. Las lipasas se caracterizan por su enantio selectividad y presentan un mecanismo catalítico conocido como activación interfacial. El término "lipasa B de Candida antárctica" o "CALB" hace referencia a un enzima lipasa de 33 kDa perteneciente a la familia de α/β hidrolasas cuya estructura consta de un núcleo de 8 hojas beta flanqueadas a ambos lados por alfa-hélices. Es un enzima de gran eficiencia y alta selectividad, de gran interés en aplicaciones tales como resoluciones cinéticas, aminolisis, esterificación, transesterificación, hidrólisis en agua, transesterificación en solventes orgánicos y transformaciones enantio selectivas. Es altamente estereoespecífica tanto en la hidrólisis como en la síntesis de ésteres. El centro activo contiene los residuos Ser 105, Asp 187 y His 224. El bolsillo oxianiónico, implicado en la estabilización de los estados transitorios de reacción, contiene los residuos Gly 39 y Thr 40. La secuencia de nucleótidos que codifica CALB y su correspondiente secuencia de aminoácidos ha sido descrita (Uppenberg J et al. 1994 Structure 2:293-308). La secuencia del gen de CALB está alojada en las bases de datos de secuencias del NCBI con la referencia EU915210 (cds parciales, versión correspondiente al 28 de septiembre de 2008 de GenBank). La base de datos del NCBI recoge dos entradas para la secuencia de aminoácidos de CALB, correspondientes a una secuencia de 342 aminoácidos (CAA83122, en la actualización del 12 de junio de 2006 de GenBank) y a una secuencia parcial de 321 aminoácidos (ACI06118, en la actualización del 28 de septiembre de 2008). El término "polipéptido", según se emplea en la presente invención, se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud en donde los distintos aminoácidos se encuentran unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o por puentes disulfuro. Un polipéptido es un polímero de residuos de aminoácido preferentemente unidos exclusivamente por enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintéticamente. Un polipéptido producido mediante la expresión de una molécula de ADN que no es del huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo". El término "polipéptido" como se usa en el presente documento abarca péptidos y oligopolipéptidos, de modo que dichos péptidos u oligopéptidos pueden o no haber sufrido modificaciones postraduccionales. La modificación postraduccional puede ser, por ejemplo, fosforilación, metilación y glucosilación. En una realización particular, el polipéptido es una proteína. El término "Potyviridae" hace referencia a una familia de virus infectivos de plantas. Los virus que pertenecen a esta familia comprenden un genoma de RNA monocatenario positivo (también denominado (+)ssRNA, ((+) single stranded RNA) y se incluyen en el Grupo IV de la clasificación de Baltimore. Esta familia de virus comprende los géneros Potyvirus (especie tipo: virus Y de la patata, PVY), Rymovirus (especie tipo: virus del mosaico de raigrás, RMV), Bymovirus (especie tipo: virus del mosaico amarillo de la cebada, BYMV), Macluravirus (especie tipo: virus del mosaico de la madura), Ipomovirus (especie tipo: virus del moteado suave de la batata), Tritimovirus (especie tipo: virus del mosaico estriado del trigo), Brambyvirus. Aunque el genoma de estos virus es monocistrónico, codifica entre 7 y 10 proteínas con diversas funciones (proteasas tales como S-PRO, P-PRO, C-PRO, helicasas HEL, proteínas genómicas VPg, polimerasas POL, proteínas de la cápsida CP). Los huéspedes de estos virus comprenden plantas mono y dicotiledóneas herbáceas y leñosas {Potyvirus) o bien se restringe a gramíneas (Bymorivus y Rymovirus).
El término "Potyvirus" hace referencia a un género de virus de la familia Potyviridae cuya especie tipo es el virus Y de la patata (Potato Y virus, PYV). Los virus de este género son filamentosos y flexibles, de dimensiones 680-900 x 11-15 nm y simetría helicoidal. El genoma de estos virus está constituido por una sola molécula de RNA monocatenario positivo ((+)ssRNA), que codifica una polipoproteína precursora que, al ser procesada, da lugar a siete proteínas: una serina proteasa (Pl), componente auxiliar (HC), P3, inclusión cilindrica (CI), inclusión nuclear A (Nía), inclusión nuclear B (Nlb), proteína de la cápsida (CP) y dos pequeñas proteínas 6K1 y 6K2. La proteína de la cápsida tiene un tamaño de entre 30 y 35 kDa.
El término "proteína" se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud en donde los distintos aminoácidos se encuentran unidos entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoácidos adyacentes o por puentes disulfuro, incluyendo opcionalmente modificaciones, por ejemplo, modificaciones post-translacionales, que alteran las propiedades físicas y químicas, plegabilidad, estabilidad, actividad, y por último, la función de las proteínas. La secuencia de aminoácidos de una proteína adopta una disposición espacial o conformación determinada que es responsable de la función asociada a la proteína. Las proteínas que no tienen grupos peptídicos adheridos (e.g. grupos protésicos o co- factores) también se incluyen en esta definición. El número de residuos de aminoácidos en una proteína puede variar notablemente, por ejemplo, la cadena de polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos puede contener típicamente 50 o más residuos de aminoácidos. Algunos ejemplos de proteínas útiles en la presente invención son, sin limitación, proteínas con actividad enzimática.
El término "virus del mosaico del nabo", también denominado "TuMV" (Turnip mosaic virus) es un Potyvirus de la familia Potyviridae. Se trata de un virus filamentoso y flexible, de dimensiones 720-850 nm x 12-15 nm Su genoma está constituido por RNA monocatenario positivo. Es un virus no envuelto, de la cápsida de simetría helicoidal.
La proteína de la cápsida (CP) es de aproximadamente 33 kDa y cada virus comprende unas 2000 copias de dicha proteína. Este virus es causante de enfermedades en plantas, entre otras, cruciferas. El virus puede ser transmitido por áfidos. Los síntomas en las plantas infectadas por este virus comprenden lesiones locales cloróticas, mosaico, moteado y rugosidades.
El término "virus", también denominado "partícula vírica" o "virión", hace referencia a agentes infecciosos cuya capacidad de multiplicación requiere necesariamente la infección celular. Constan de material genético, bien de tipo DNA o de tipo RNA, una cubierta proteica denominada "cápsida" y, en algunos tipos de virus, una bicapa lipídica externa que rodea al virus fuera de la célula denominada "envuelta". El término "partícula similar a virus", "pseudovirus" o "VLP" (virus-like particle) hace referencia a partículas carentes de material genético viral que comprenden un número de copias de proteínas de la cápsida distribuidas en una disposición similar a la de la cápsida viral. Resultan de la expresión de proteínas estructurales virales, tales como proteínas de la cápsida o proteínas de envuelta, y de su autoensamblaje. En una realización particular de la invención, las VLP están constituidas por proteína de la cápsida viral. En una realización preferida, las VLP están constituidas por proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae. En una realización más preferida, las VLP están constituidas por proteínas de la cápsida viral de un Potyvirus. En una realización aún más preferida, las VLP están constituidas por las proteínas de la cápsida viral del virus TuMV. El término "ruta enzimática", tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a una sucesión de reacciones químicas catalizadas enzimáticamente, en donde un sustrato inicial puede dar lugar a uno o varios productos finales a través de uno o más productos intermedios, en donde el producto intermedio resultante de la catálisis por parte de uno de los enzimas implicados en dicha ruta es a su vez el sustrato de otro de los enzimas implicados en dicha ruta.
Biocatalizador de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a un biocatalizador, en adelante "biocatalizador de la invención", que comprende
- un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y
- un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática,
en donde dicho polipéptido A está unido al polipéptido B mediante un agente de entrecruzami ento .
El biocatalizador de la invención comprende, por tanto, dos polipéptidos, un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae y un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unidos ambos polipéptidos mediante un agente de entrecruzami ento .
Polipéptido A del biocatalizador de la invención
El polipéptido A del biocatalizador de la invención comprende una proteína de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae. En una realización particular de la invención, el polipéptido A comprende una unidad de una proteína de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae. En una realización particular alternativa de la invención, el polipéptido A comprende más de una unidad de una proteína de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae. Las unidades de proteína de la cápsida viral comprendidas en dicho polipéptido A pueden formar parte de un precursor poliproteico viral de un virus de la familia Potyviridae, de modo que la escisión proteolítica de dicho poliproteína viral da lugar a las proteínas virales. El término "poliproteína" hace referencia en la presente invención a un polipéptido que comprende las secuencias proteicas de las proteínas estructurales de un virus. Las proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae comprendidas en el polipéptido A pueden ensamblarse bien en un virus de la familia Potyviridae o bien en una estructura similar a virus o VLP, carente de material genético. Por lo tanto, en una realización de la invención, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae forma parte de la cápsida vírica de dicho virus. En una realización particular de la invención, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae que forma parte del polipéptido A del biocatalizador de la invención es una proteína de la cápsida de un Potyvirus. En una realización aún más particular, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae que forma parte del polipéptido A del biocatalizador de la invención es una proteína de la cápsida del virus del mosaico del nabo (TuMV, Turnip mosaic virus). En una realización alternativa, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae forma parte de una VLP.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invención contempla que las proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae comprendidas dentro del polipéptido A pueden ensamblarse bien en un virus o bien en una estructura similar a virus o VLP carente de material genético. En este caso, las partículas virales o de VLP pueden a su vez interaccionar entre sí dando lugar a estructuras de soporte (scaffolds) biológico tridimensionales sobre las que se une el polipéptido B de la invención. Estas estructuras tridimensionales se forman mediante interacciones proteína-proteína entre los capsómeros, que incluyen enlaces iónicos y covalentes, e incluso posibles enlaces metálicos con metales presentes en el medio que ayudan a estabilizar estas estructuras. El término "tridimensional" o "3D", como se usa aquí, significa que el soporte biológico de la invención tiene tres dimensiones, es decir, que se necesitan tres coordenadas para localizar una molécula dentro de ella. La forma tridimensional de este soporte biológico puede ser de cualquier forma 3D. Métodos de obtención de estructuras tridimensionales a partir de partículas virales se han descrito en la técnica (Gerasopoulos K et al. 2010 Nanotechnology 21(5): 055304)
Polipéptido B del biocatalizador de la invención
El polipéptido B del biocatalizador de la invención comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática.
El polipéptido B está unido al polipéptido A en una región diferente a la del centro activo del enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática comprendido en dicho polipéptido B.
En una realización particular, el polipéptido B comprende una unidad de un enzima o de un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática. En una realización alternativa, el polipéptido B comprende dos o más unidades de un enzima, o de un fragmento del mismo que conserva su capacidad enzimática, dispuestas en tándem. En una realización alternativa, el polipéptido B comprende una unidad de dos o más enzimas diferentes, o fragmentos de los mismos que conservan su actividad enzimática, dispuestas en tándem. En una realización alternativa, el polipéptido B comprende dos o más unidades de dos o más enzimas diferentes, o fragmentos de los mismos que conservan su actividad enzimática, dispuestos en tándem. El biocatalizador de la invención puede comprender una o más unidades de los polipéptidos B descritos anteriormente. En una realización preferida de la invención, el biocatalizador comprende una o más unidades de un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende una unidad de un enzima o de un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática.
Cualquier enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática puede formar parte del polipéptido B del biocatalizador de la invención incluyendo, sin limitación a, oxidorreductasas (EC1) tales como deshidrogenasas, peroxidasas u oxidasas, tranferasas (EC2) tales como transaminasas, aciltransferasas, glicosiltransferasas, polimerasas, sulfotransferasas o quinasas, hidrolasas (EC3) tales como glicosidasas, lipasas, amilasas, helicasas o peptidasas, liasas (EC4) tales como descarboxilasas o deshidratasas, isomerasas (EC5) tales como racemasas, epimerasas o mutasas y ligasas (EC6) tales como sintetasas. Enzimas preferidas que pueden formar parte del polipéptido B del biocatalizador de la invención incluyen, sin quedar limitadas a, lipasas, amilasas, proteasas, peptinasas, invertasas, celulasas, lipasas, lactasas, catalasas, quimosinas, xilanasas y fitasas. En una realización preferida de la invención, el enzima es una lipasa, en particular la lipasa B de Candida antárctica.
En otra realización de la invención, el biocatalizador de la invención comprende además al menos un polipéptido C, de modo que dicho polipéptido C comprende un enzima, o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, diferente al enzima, o al fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido al polipéptido A mediante un agente de entrecruzamiento, y en donde dicho agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente al agente de entrecruzamiento que une el polipéptido A con el polipéptido B.
En una realización particular, el polipéptido C comprende una unidad de un enzima, o de un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, diferente del enzima o del fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B. En una realización alternativa, el polipéptido C comprende dos o más unidades de un enzima, o de un fragmento de los mismos que conserva su actividad enzimática, diferente del enzima o del fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B, dispuestos en tándem. En una realización alternativa, el polipéptido C comprende una unidad de dos o más enzimas, o de un fragmento de los mismos que conserva su actividad enzimática, diferentes del enzima o del fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B, dispuesto en tándem. En una realización alternativa, el polipéptido C comprende dos o más unidades de dos o más enzimas, o de un fragmento de los mismos que conserva su actividad enzimática, diferentes del enzima o del fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B, dispuestos en tándem. El biocatalizador de la invención puede comprender una o más unidades del polipéptido C descrito anteriormente. En una realización preferida de la invención, el biocatalizador comprende una o más unidades de un polipéptido C, en donde dicho polipéptido C comprende una unidad de un enzima o de un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, diferente del enzima o del fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B. Tal como se ha indicado anteriormente, las proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae comprendidas en el polipéptido A pueden ensamblarse bien en un virus o bien en una estructura similar a virus o VLP carente de material genético. En este caso, la presente invención contempla tanto que los polipéptidos B y/o C estén expuestos en la superficie del virus o de la VLP, como que queden incluidos en el interior del virus o de la VLP.
La presente invención contempla que los enzimas comprendidos en los polipéptidos B y C del biocatalizador de la invención sean enzimas integrantes de una ruta, en donde el producto resultante de la reacción catalizada por uno de los enzimas, por ejemplo el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B, sea el sustrato de la reacción catalizada por otro de los enzimas, por ejemplo el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido C, o bien en donde el donde el producto resultante de la reacción catalizada por uno de los enzimas, por ejemplo el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido C, sea el sustrato de la reacción catalizada por otro de los enzimas, por ejemplo el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática del polipéptido B.
Agente de entrecruzamiento del biocatalizador de la invención
El polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae, y el polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, del biocatalizador de la invención están unidos entre sí mediante un agente de entrecruzamiento. En particular, el agente de entrecruzamiento según la invención es un agente de entrecruzamiento de proteínas. La unión mediante entrecruzamiento de los polipéptidos A y B comprendidos en el biocatalizador de la invención es tal que dicho entrecruzamiento no anula la funcionalidad biológica de tales polipéptidos A y B. En particular, el entrecruzamiento no anula la capacidad de la proteína de la cápsida viral comprendida en el polipéptido A para ensamblarse y formar parte de una cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae o bien de una VLP, ni tampoco anula la funcionalidad biológica del enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática comprendido en el polipéptido B. En el caso del enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática comprendido en el polipéptido B, el entrecruzamiento se produce en un sitio diferente del centro activo enzimático del enzima o del fragmento del mismo que conserva la actividad enzimática.
Métodos para comprobar que el polipéptido B está unido al polipéptido A son conocidos por el experto en la materia. Un posible método comprende la unión de un anticuerpo primario que reconoce el polipéptido B de interés seguida de la unión de un anticuerpo secundario marcado y detección del mareaje asociado al anticuerpo secundario. Otro posible método comprende el uso de proteasas específicas del polipéptido B y medida del descenso de su actividad asociada. Otro posible método comprende el mareaje de los polipéptidos y su observación mediante microscopía. El mareaje puede ser realizado, en un ejemplo no limitativo de la invención, mediante inmunodecoración y su observación mediante SEM (scanning electrón microscopy, microscopía electrónica de barrido). Métodos adicionales incluyen, sin limitarse a, Western blot, ensayos de retardo en la movilidad electroforética (EMSA), microscopía, etc. En el biocatalizador de la invención, el polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y el polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, están unidos mediante un agente de entrecruzamiento, en particular mediante un agente de entrecruzamiento de proteínas. Agentes de entrecruzamiento según la invención comprenden agentes homobifuncionales o heterobifuncionales de unión de proteínas, tales como los descritos anteriormente, los cuales comprenden grupos reactivos adecuados a los grupos funcionales diana presentes en los polipéptidos A y B del biocatalizador de la invención. Estos agentes de entrecruzamiento pueden unir diferentes grupos funcionales presentes en las proteínas que incluyen, sin limitarse a, grupos α-amino, grupos ε-amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo, grupos fenólicos y grupos imidazol. Como entiende el experto en la materia, los grupos funcionales proteicos que se unen mediante el agente de entrecruzamiento están localizados en regiones expuestas de la proteína accesibles a dicho agente de entrecruzami ento .
El experto en la materia conoce que la selección del agente de entrecruzamiento adecuado viene dada por factores tales como la solubilidad del reactivo, la naturaleza de los grupos reactivos, el carácter homobifuncional o heterobifuncional del agente de entrecruzamiento, la presencia de grupos fotoreactivos o termoreactivos, la longitud del brazo espaciador del agente de entrecruzamiento, el carácter divisible o no del producto, la necesidad de mareaje adicional y las condiciones de reacción necesarias para la conjugación.
Agentes de entrecruzamiento preferidos según la invención incluyen, sin limitarse a, agentes sin brazo espaciador tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida ( HS) o isocianatos, maleimidas o bromo/iodoacetamidas, carbodiimidas como ECD (l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) hidrocloruro de carbodiimida, agentes de entrecruzamiento homobifuncionales tales como glutaraldehído, di(N-succinimidil) carbonato, di(N- succinimidil)suberato, dimetil adipimato dihidrocloruro, dimetil pimelimidato dihidrocloruro, dimetil suberimidato dihidrocloruro y agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales tales como acoplamiento mediante diazonio, ciclo-adición alcalina de azida catalizada por cobre (CuAAC), ligación oxima/hidrazona, acoplamiento oxidativo a p-aminofenilalanina. En una realización particular de la invención, los grupos funcionales proteicos a los que se dirigen los agentes de entrecruzamiento son grupos amino, en particular grupos amino de residuos aminoacídicos de Usina, de residuos de histidina o del extremo amino terminal de la proteína, presentes en la proteína de la cápsida viral comprendida en el polipéptido A y/o presentes en el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática comprendido en el polipéptido B. En una realización particular, el agente de entrecruzamiento de unión de proteínas es un agente homobifuncional. En una realización preferida de la presente invención, el agente de entrecruzamiento es el glutaraldehído (CHO(CH2)3CHO). Este reactivo homobifuncional puede formar en solución polímeros de diferentes pesos moleculares, y son estos polímeros los que reaccionan con los grupos amino de las proteínas para producir el entrecruzamiento.
Virus de la invención Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invención contempla que las proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae comprendidas en el polipéptido A pueden ensamblarse para formar un virus.
Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un virus de la familia Potyviridae, en adelante "virus de la invención", que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae mediante un agente de entrecruzamiento. En una realización particular, el enzima es una lipasa, aún más en particular, la lipasa B de Candida antárctica.
En una realización particular, el virus de la familia Potyviridae en un Potyvirus. En una realización aún más particular, el virus de la familia Potyviridae es el virus del mosaico del nabo (TuMV). El víais de la invención exhibe en su superficie el polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento. En una realización alternativa, el virus de la invención encierra en su interior el polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento. Por tanto, la presente invención también se relaciona con el uso de un virus tal como se ha descrito anteriormente para la inmovilización de un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática de interés.
En una realización particular, el virus de la invención comprende, además, al menos un polipéptido C, que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido a una proteína de la cápsida del virus mediante un agente de entrecruzamiento. En una realización, el agente de entrecruzamiento que une el polipéptido C a la proteína de la cápsida del virus es el mismo agente que une el polipéptido B a la proteína de la cápsida del virus. En una realización alternativa, el agente de entrecruzamiento que une el polipéptido C a la proteína de la cápsida del virus es diferente al agente que une el polipéptido B a la proteína de la cápsida del virus.
VLP de la invención
Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invención contempla que las proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae comprendidas en el polipéptido A pueden ensamblarse formando una estructura similar a virus o VLP, carente de material genético.
Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con una VLP de un virus de la familia Potyviridae, en adelante "VLP de la invención", que comprende un polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento. En una realización particular, las proteínas de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae comprendidas por la VLP son proteínas de la cápsida de un Potyvirus. En una realización aún más particular, las proteínas de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae son proteínas de la cápsida del virus del mosaico del nabo (TuMV).
La VLP de la invención comprende un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática. En una realización particular, el enzima es una lipasa. En una realización aún más particular, el enzima es la lipasa B de Candida antárctica.
La VLP de la invención exhibe en su superficie el polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicha VLP mediante un agente de entrecruzamiento. En una realización alternativa, la VLP de la invención encierra en su interior el polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática unido a una proteína de la cápsida de dicha VLP mediante un agente de entrecruzamiento. Por lo tanto, la presente invención se relaciona con el uso de una VLP tal como se ha descrito anteriormente para la inmovilización de un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática de interés.
En una realización particular, la VLP de la invención comprende, además, al menos un polipéptido C, que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido a una proteína de la cápsida de la VLP mediante un agente de entrecruzamiento. En una realización, el agente de entrecruzamiento que une el polipéptido C a la proteína de la cápsida de la VLP es el mismo agente que une el polipéptido B a la proteína de la cápsida de la VLP. En una realización alternativa, el agente de entrecruzamiento que une el polipéptido C a la proteína de la cápsida de la VLP es diferente al agente que une el polipéptido B a la proteína de la cápsida de la VLP. Método de obtención del biocatalizador de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un biocatalizador de la invención, en adelante "método de obtención del biocatalizador de la invención", que comprende poner en contacto un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho biocatalizador.
La obtención del biocatalizador de la invención puede requerir una etapa adicional que comprende la activación del polipéptido A y/o del polipéptido B, previa a la etapa de conjugación. Así, en una realización particular del método de obtención del biocatalizador de la invención, en una primera etapa se activa el polipéptido A con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido A - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con el polipéptido B. En una realización alternativa y preferida del método de obtención del biocatalizador de la invención, en una primera etapa se activa el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con el polipéptido A.
Cuando la proteína a conjugar posee grupos funcionales carboxilo reactivos, la conjugación proteica se lleva a cabo mediante métodos tales como, sin limitarse a, el método del anhídrido mixto, el método de la carboxidiimida (CDI) o el método del éster N-hidroxisuccinimida (NHS). En el método del anhídrido mixto, se hace reaccionar una de las proteínas con cloroformato de alguielo, y el anhídrido de ácido formado se hace reaccionar con los grupos amino libres de la proteína a pH 9 aproximadamente. En el método de la carboxidiimida se emplean agentes tales como l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC); N,N -diciclohexilcarbodiimida (DCC) y p- toluenosulfonato de l-ciclohexil-3-(2-morfoliniletil) carbodiimida (CMC). En el método del éster N-hidroxisuccinimida, la proteína con el grupo carboxilo se acopla a NHS en presencia de DCC, se purifica el éster de NHS obtenido y se hace reaccionar con la proteína.
El agente de entrecruzamiento empleado en el método de obtención del biocatalizador de la invención es un agente de entrecruzamiento para la unión de proteínas, tal como se ha descrito anteriormente. La conjugación mediante un agente de entrecruzamiento del polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y del polipéptido B, que comprende que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, tal como entiende el experto en la materia, se lleva a cabo en condiciones bajo las cuales no resultan alteradas ni la capacidad de ensamblaje en partículas virales y/o VLPs por parte de la proteína de la cápsida viral comprendida por el polipéptido A, ni la funcionalidad biológica del enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática comprendida por el polipéptido B. De este modo, las condiciones de reacción bajo las cuales se produce la conjugación son tales que permiten el mantenimiento de la estructura nativa de las proteínas a enlazar por lo que, en general, tanto la reacción de activación como la reacción de conjugación se produce en presencia de una solución tamponadora y condiciones suaves de pH. En una realización preferida de la invención, en donde la conjugación mediante un agente de entrecruzamiento se produce entre un polipéptido A y un polipéptido B, y en donde el polipéptido B comprende un enzima de interés, se prefiere un grado de conjugación bajo o moderado del polipéptido B tal que conserve la funcionalidad enzimática del enzima. Se considera que un enzima conserva su actividad enzimática tras la conjugación si mantiene al menos el 100%, al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85% o al menos el 80% de actividad enzimática con respecto a su actividad enzimática antes de la conjugación. Métodos para determinar el mantenimiento de la función biológica de una proteína, en particular de un enzima, tras su conjugación son conocidos por el experto en la materia para cada proteína particular. En una realización preferida, el polipéptido B comprende un enzima lipasa. Métodos para determinar la actividad enzimática de una lipasa son conocidos por el experto en la materia e incluyen, sin quedar limitados a, el método recogido en el Ejemplo 1 de la invención, en el que se emplea acetato de paranitrofenilo como sustrato, así como los métodos descritos por Fuciños et al. (2005 J Biotechnol 1 17: 233-241) o el ensayo descrito en el Ejemplo 12 de la solicitud de patente WO2006/096834. Métodos para la determinación de la capacidad de una proteína de la cápsida viral de formar partículas virales y/o VLPs son conocidos por el experto en la materia e incluyen, sin limitarse a, observación mediante microscopía electrónica de las partículas virales, tal como se describe en Risco C & Carrascosa JL 1999 Histol Histopathol 14(3): 905-926, simulaciones de tipo "coarse-grained" (Arkhipov A et al. 2006 Structure 14: 1767-1777) o ensayos de estabilidad vírica tal como se recogen en el Ejemplo 1 de la presente solicitud.
Asimismo, la proporción molar adecuada de proteína y agente de entrecruzamiento se determina experimentalmente tal como conoce el experto en la materia. A modo de ejemplo, proporciones molares habituales de agente de entrecruzamiento:polipéptido son 1 :0,001, 1 :0,01, 1 :0,1, 1 : 1, 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000. Proporciones preferidas de agente de entrecruzamiento:polipéptido son 1 :0,01 - 1 :0,1 en el caso de que el agente de entrecruzamiento sea glutaralehído, pudiendo variar en caso de otros agentes de entrecruzami ento .
Por otro lado, la proporción molar adecuada del polipéptido A y del polipéptido B son también determinadas experimentalmente e incluyen, sin limitarse a 1 :0,001, 1 :0,01, 1 :0, 1, 1 : 1, 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000. Proporciones preferidas de polipéptido A:polipéptido B de acuerdo con la invención sonl :0,01, 1 :0,1 y 1 : 1.
Tal como se ha indicado anteriormente, en una realización particular, el método de obtención del biocatalizador de la invención comprende la activación del polipéptido A y/o la activación del polipéptido B, de modo que dicha activación tiene lugar en una etapa previa a la etapa de conjugación.
La reacción de activación y/o la reacción de conjugación transcurren bajo condiciones de pH, temperatura, tiempo de reacción, volumen de reacción, proporción agente de entrecruzamiento:proteína/péptido, etc. particulares, adecuadas para la activación y/o conjugación de los polipéptidos A y B.
En relación al pH, en una realización particular de la presente invención, la reacción de activación y/o de conjugación transcurre a un valor de pH comprendido entre pH 6 y pH 11. En una realización preferida, la reacción de conjugación transcurre a pH 8 aproximadamente.
En relación a la temperatura, en una realización particular de la presente invención, la reacción de activación y/o de conjugación transcurre a una temperatura comprendida entre 4°C y 30°C. En una realización preferida, la reacción de activación transcurre a una temperatura de 25°C aproximadamente, y la reacción de conjugación transcurre a una temperatura de 4°C aproximadamente. En relación al tiempo de reacción, en una realización particular de la presente invención, la reacción de activación y/o de conjugación transcurre en un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 1.440 minutos. En una realización preferida, la reacción de activación transcurre en un periodo de tiempo de 60 minutos aproximadamente y la reacción de conjugación transcurre en un periodo de tiempo comprendido entre 840 y 1.080 minutos.
En relación al volumen de reacción, en una realización particular de la invención, la reacción de activación y/o de conjugación transcurre en un volumen final de 50 a 750 μΐ (activación 75-300 μΐ y conjugación 300-650 μΐ).
En relación a la proporción de agente de entrecruzamiento y la proteína y/o péptido a conjugar, en una realización particular de la invención, la reacción de activación y/o de conjugación se lleva a cabo con una proporción 1 :0,0005, 1 :0,005, 1 :0,05, 1 :0,5, 1 :5, 1 :50, 1 :500 de agente de entrecruzamiento:proteína a conjugar. En una realización preferida, la proporción es de 1 :0,005 - 1 :0,05 para el caso del glutaraldehído, si bien otras proporciones pueden resultar adecuadas para otros agentes de entrecruzamiento. En una realización particular, el método de obtención del biocatalizador de la invención comprende, adicionalmente, poner en contacto un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Poíyviridae, con un polipéptido C, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en donde el enzima o fragmento del mismo del polipéptido C es diferente del enzima o fragmento del mismo del polipéptido B, en presencia de un agente de entrecruzamiento, en donde el agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente del agente de entrecruzamiento para la unión del polipéptido A y el polipéptido B, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho biocatalizador.
En una realización de la invención, el método de obtención del biocatalizador de la invención comprende la conjugación de un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un Poíyvirus, en particular del virus del mosaico del nabo, y de un polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en particular un enzima lipasa, más en particular la lipasa B de Candida antárctica.
Método de obtención del virus de la invención Tal como se ha indicado anteriormente, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Poíyviridae, comprendida en el polipéptido A, puede ensamblarse y dar lugar a virus de la familia Poíyviridae, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un virus de la invención, en adelante, "método de obtención del virus de la invención", en donde dicho método comprende poner en contacto un virus de la familia Poíyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho virus. La obtención del víais de la invención puede requerir una etapa adicional que comprende la activación de las proteínas de la cápsida del virus de la familia Potyviridae y/o del polipéptido B, previa a la etapa de conjugación. Así, en una realización del método de obtención del virus de la invención, en una primera etapa se activan las proteínas de la cápsida del virus de la familia Potyviridae con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [virus - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con el polipéptido B. En una realización alternativa y preferida del método de obtención del virus de la invención, en una primera etapa se activa el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con las proteínas de la cápsida del virus de la familia Potyviridae.
Los agentes de entrecruzamiento, así como las condiciones de reacción de activación y/o de conjugación se han descrito anteriormente.
En una realización particular, el método de obtención del virus de la invención comprende, adicionalmente, poner en contacto un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido C, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en donde el enzima o fragmento del mismo del polipéptido C es diferente del enzima o fragmento del mismo del polipéptido B, en presencia de un agente de entrecruzamiento, en donde el agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente del agente de entrecruzamiento para la unión del virus y el polipéptido B, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho virus.
En una realización particular, el método de obtención del virus de la invención comprende la conjugación de un Potyvirus, en particular del virus del mosaico del nabo, y de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en particular un enzima lipasa, más en particular la lipasa B de Candida antárctica. Método de obtención de VLP de la invención
Asimismo, tal como se ha indicado anteriormente, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, comprendida en el polipéptido A, puede ensamblarse y dar lugar a una VLP, de modo que dicha VLP comprende una proteína heteróloga de interés.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de una VLP de la invención, en adelante, "método de obtención de la VLP de la invención"), en donde dicho método comprende poner en contacto una VLP de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicha VLP. La obtención de la VLP de la invención puede requerir una etapa adicional que comprende la activación de las proteínas de la cápsida del virus de la familia Potyviridae y/o del polipéptido B, previa a la etapa de conjugación. Así, en una realización del método de obtención de la VLP de la invención, en una primera etapa se activan las proteínas de la cápsida del virus de la familia Potyviridae de la VLP con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [VLP - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con el polipéptido B. En una realización alternativa y preferida del método de obtención de la VLP de la invención, en una primera etapa se activa el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con las proteínas de la cápsida del virus de la familia Potyviridae de la VLP.
Los agentes de entrecruzamiento, así como las condiciones de reacción de activación y/o de conjugación se han descrito anteriormente.
En una realización particular, el método de obtención de la VLP de la invención comprende, adicionalmente, poner en contacto una VLP de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido C, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en donde el enzima o fragmento del mismo del polipéptido C es diferente del enzima o fragmento del mismo del polipéptido B, en presencia de un agente de entrecruzamiento, en donde el agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente del agente de entrecruzamiento para la unión de la VLP y el polipéptido B, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicha VLP.
En una realización particular de la invención, el método de obtención de la VLP de la invención comprende la conjugación de una VLP formada por proteínas de la cápsida de un Potyvirus, en particular del virus del mosaico del nabo, y de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en particular un enzima lipasa, más en particular la lipasa B de Candida antárctica.
Método de inmovilización de un enzima
Los autores de la presente invención han logrado inmovilizar una lipasa, en concreto CALB, sobre partículas virales del virus del mosaico del nabo (TuMV), observando un aumento de la actividad enzimática del enzima lipasa inmovilizado con respecto al enzima sin inmovilizar (Ejemplo 1).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la inmovilización de un enzima (inmovilización enzimática), que comprende la conjugación de un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y un polipéptido B, que comprende dicho enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, mediante un agente de entrecruzamiento. Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, de un virus de la familia Potyviridae, o de una VLP que comprende proteínas de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, para la inmovilización de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática. Tal como se ha descrito con anterioridad, la proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae , comprendida en el polipéptido A del biocatalizador de la invención, puede ensamblarse y dar lugar a partículas virales o a VLPs. Por tanto, el polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, puede quedar inmovilizado mediante su unión a un virus de la familia Potyviridae, en particular a un Potyvirus, tal como TuMV, o bien a una VLP que comprende proteínas de la cápsida viral de un virus de la familia Potyviridae, en particular de un Potyvirus, tal como TuMV. En una realización particular, dicho polipéptido A y/o dicho polipéptido B es activado previamente a su conjugación mediante un agente de entrecruzamiento, tal como se ha descrito anteriormente. Así, en una realización del método de inmovilización enzimática proporcionado por la presente invención, en una primera etapa se activa el polipéptido A con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido A - agente de entrecruzamiento] y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con el polipéptido B. En una realización alternativa y preferida, en una primera etapa se activa el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y, en una segunda etapa, se conjuga el complejo resultante anterior con el polipéptido A.
En una realización particular del método de inmovilización enzimática proporcionado por la presente invención, el polipéptido A comprende una proteína de la cápsida de un virus Potyvirus, en particular del virus del mosaico del nabo, y el polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en particular un enzima lipasa, más en particular la lipasa B de Candida antárctica.
Procedimiento de conversión enzimática de un sustrato en un producto
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un procedimiento para la conversión enzimática de un sustrato en un producto que comprende poner en contacto dicho sustrato con un biocatalizador de la invención, o con un virus de la invención, o con una VLP de la invención, en donde el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática presente en el polipéptido B del biocatalizador, o del virus o de la VLP, es un enzima que cataliza una reacción enzimática específica para la conversión de dicho sustrato en dicho producto, bajo condiciones adecuadas para que dicha reacción enzimática tenga lugar.
Condiciones adecuadas para la conversión enzimática de un sustrato en un producto hacen referencia al tampón de reacción, pH, temperatura, tiempo de reacción, concentración de reactantes, etc., y pueden ser determinadas para cada reacción enzimática particular.
Ejemplos, no limitativos, de conversiones enzimáticas de un sustrato en un producto de interés de acuerdo con la presente invención incluyen la conversión de parafenilacetato (pNA) por lipasas en paranitrofenol (p P), la hidrólisis de triacilglicerol, diacilglicerol o monoacilglicerol por lipasas a glicerol y ácidos grasos libres, la hidrólisis de lactosa por lactasas a glucosa y galactosa, la hidrólisis parcial o total de almidón o glucógeno por amilasas a azúcares más simples, la digestión de proteínas por proteasas obteniendo péptidos o aminoácidos, la digestión de péptidos por peptinasa obteniendo péptidos de menor tamaño o aminoácidos, la hidrólisis de polisacáridos, oligosacáridos y disacáridos como la sacarosa por invertasas para obtener oligosacáridos o monosacáridos, la hidrólisis de celulosa o derivados por celulasas para obtener glucosa, la conversión de peróxido de oxígeno por catalasas en agua y oxígeno, la digestión de la caseína de la leche por quimosinas para obtener cuajados en productos derivados de la leche, la hidrólisis de hemicelulosas por xilanasas para obtener hidratos de carbono menos ramificados, la hidrólisis de fitato por fitasas para obtener distintos tipos de inositol y fosfato, etc.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma. EJEMPLO 1
Inmovilización de lipasa B de Candida antárctica (CALB) en la proteína de la cápsida del virus del mosaico del nabo (Turnip mosaic virus) (CP-TuMV) Los inventores de la presente invención han logrado inmovilizar con éxito la lipasa B de Candida antárctica (CALB) sobre la proteína de la cápsida del virus del mosaico del nabo TuMV {Turnip mosaic virus). Para ello, los inventores han seguido un procedimiento de bioconjugación, adaptado a partir de la metodología descrita en Hermanson GT 2008 Bioconjugate Tecniques. 2a Ed. Academic Press, San Diego.
Materiales y métodos
Purificación del virus Plantas Brassica júncea fueron inoculadas en el estadio de desarrollo 1,4-1,5 con la cepa TuMV UK1. La purificación de las partículas víricas fue llevada a cabo mediante el método descrito por Sánchez et al. (Sánchez F et al. 1998 Virus Res 55 (2):207-219). El virus purificado se almacenó a una temperatura de -20 °C en tampón fosfato potásico 0,25M pH 7,5 EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 10 mM y glicerol 50%. El grado de purificación se determinó mediante la ley de Lambert-Beer usando el coeficiente de extinción 2,65 para potivirus {A 0, 1%, 1 cm, 260 nm),
Ensayos de estabilidad vírica Los ensayos de estabilidad vírica se realizaron con el objetivo de evaluar el mantenimiento estructural frente a diferentes parámetros tales como pH, pH del tampón de conjugación y solventes orgánicos empleados en los ensayos de actividad. Para ello, se analizaron cambios en los espectros de absorbancia y de la relación A25o A267 típica de nucleoproteínas (Thounevel JC et al. 1976 Annals Appl Biol 84(3): 311-320). Los espectros se obtuvieron tras 24 h y a temperatura ambiente mediante Nanodrop®. La evaluación de estabilidad viral a diferente pH se llevó a cabo en tampón Britton & Robbinson en un rango de pH de entre 5 y 12, y en tampón de conjugación (tampón fosfato 0,02M) en un rango de pH de entre 7 y 9. El mantenimiento estructural en solvente orgánico (acetonitrilo) se realizó a la misma concentración empleada en los ensayos de actividad, 7% y 50%.
La estabilidad viral en función de la temperatura se llevó a cabo a diferentes tiempos (60-360 min) y temperaturas (50°C, 60°C, 70°C y 100°C).
Bioconjugación: etapa de activación
La lipasa CALB (Sigma®) se disolvió en tampón fosfato 0,02 M pH 8 a concentración 1 mg/ml ó 10 mg/ml, y se incubó con glutaraldehído (GA) al 1% durante 1 h a temperatura ambiente y mediante agitación suave.
A continuación, se realizó una filtración para eliminar el exceso de agente de entrecruzamiento, mediante dispositivos comerciales de filtración/concentración. Para la disolución de baja concentración, se empleó una columna de desalado de resina acrílica con un MWCO ( "molecular weight cut off") de 7 kDa (Zeba spin column®). Para la disolución de mayor concentración, una solución enzimática y una membrana de celulosa regenerada con MWL { "nominal molecular weight limit") de 10 kDa (Amicon ® YM-10). El concentrado resultante tras la centrifugación siguiendo las instrucciones del fabricante se recuperó y ajustó a la concentración inicial en tampón fosfato potásico 0,02 M pH 8.
Bioconjugación: etapa de conjugación
La conjugación de CALB-GA y TuMV se realizó en diferentes proporciones CP- TuMV:CALB (100: 1, 10: 1 y 1 : 1, unidades de CP:unidades de CALB) en un volumen de 600 μΐ e incubando la mezcla durante 18 horas, a 4o C y con agitación orbital (15 rpm). Se incluyeron controles sin GA y sin virus.
Tras la conjugación, los posibles sitios reactivos de GA que pudieran permanecer activos fueron bloqueados con 30 μΐ de glicina 0,5 M en tampón carbonato pH 8 durante 2 horas a temperatura ambiente y con agitación, siguiendo las condiciones empleadas en Hermanson GT 2008 Bioconjugate Tecniques. 2a Ed. Academic Press, San Diego. Los productos resultantes de los pasos anteriores fueron sometidos a filtración a través de un dispositivo comercial (Amicon® YM-100, NMWL -Nominal Molecular Weight Limit- de 100 kDa) para separar moléculas de tamaño inferior a 100 kDa, que comprenden agregados con 1 a 3 moléculas de CALB, de la mezcla que contiene CALB bioconjugada o atrapada con TuMV o agregados de CALB de más de 3 moléculas de enzima. Los conjugados se mantuvieron a una temperatura de -20°C y en glicerol al 50%.
La Figura 1 muestra un esquema del proceso de activación y conjugación empleados. SDS-PAGE
Se llevó a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS- PAGE) al 12% y tinción con EZ blue® (Sigma) para la cuantificación de la proteína unida a virus. En paralelo, se cargaron en el gel cantidades variables, entre 20 y 200 ng, de lipasa libre con diferentes volúmenes de cut-off (obtenidos a partir de volúmenes de exclusión de Centricon®). La concentración de determinó comparando la intensidad de las bandas obtenidas mediante Adobe Photoshop®.
Ensayos de actividad enzimática CALB
La actividad enzimática del enzima CALB inmovilizado sobre TuMV se ensaya utilizando como sustrato acetato de p-nitrofenilo (Jung S & Park S 2008 Biotechnology Letters 30: 717-722) en tampón MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico)-Na 50 mM pH 8 en lugar de tampón BES (ácido N,N-bis-(2-hidroxietil)-2-amino- etansulfónico). Los ensayos de actividad se llevaron a cabo en microplacas de 96 pocilios, durante 30 minutos a temperatura ambiente y con agitación, en un volumen final de 250 μΐ. La absorbancia de p-nitrofenilo se midió en un espectrofotómetro Tecan®.
La comparación de las diferentes etapas del proceso se llevó a cabo con una concentración 1,5 mM de sustrato y por duplicado. Se midió la actividad específica entre los conjugados, mostrándose el error estándar de los parámetros cinéticos.
Los ensayos de actividad de CALB en los distintos pasos del proceso se muestran como porcentaje respecto de la actividad de la CALB comercial (considerado un 100%) utilizada en el proceso de bioconjugación.
Microscopía electrónica
Las muestras para microscopía electrónica se prepararon dejando caer una gota de 10 ul de los conjugados y los controles sobre rejillas para microscopía electrónica cubiertas de níquel Formvar® (3,05 mm níquel, TAAB). Tras 15 min de incubación, las rejillas se lavaron con 200 gotas de agua y se tiñeron con acetato de uranilo al 2% durante 2 minutos. Las rejillas se secaron y almacenaron a temperatura ambiente. Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía electrónica en un equipo JEM JEOL1010 a 80 kV.
Resultados
Purificación del virus El rendimiento obtenido durante la purificación fue de aproximadamente 30 μg de virus por gramo de tejido infectado. El tamaño de la proteína de la cápsida (CP) obtenido mediante SDS-PAGE fue el esperado (33 kDa). Ensayos de estabilidad vírica
En cuanto a la estabilidad en función del pH, el valor obtenido para la relación A25o A267 tanto en las muestras como en los controles fue el mismo para valores de pH comprendidos entre 6 y 11 (Figura 2A). Se observó un aumento para valores de pH 5 y 12, indicativos de que la estabilidad resulta alterada a dichos valores. Se observaron también diferencias en función de la concentración del virus, siendo los valores más estables a mayor concentración del virus. En relación a los cambios en los espectros, se observaron cambios en la forma de la curva a pH 5 y 12, mostrando una desviación en la región 250-267 (Figura 2B). Estos resultados indican que los valores de pH adecuados para la conjugación química están comprendidos entre pH 6 y pH 11.
En cuanto a la estabilidad en función del tampón de conjugación, se ensayó el tampón fosfato 0,02 M pH 7-9 (Figura 2C). Se observó que la estabilidad de los viriones se mantuvo a todos los pHs para la molaridad del tampón empleada. Se seleccionó el valor de pH 8 para sucesivos experimentos.
En cuanto a la estabilidad en función del acetonitrilo, la relación A250/A267 se mantuvo similar a los controles con una proporción de acetonitrilo del 7% (Figura 2D), que se empleó posterioremente en los ensayos de actividad. Por otro lado, a proporciones mayores de acetonitrilo se observaron cambios en la relación A250/A267-
En cuanto a la estabilidad en función de la temperatura, se observó que el virus era estable a 50°C durante 240 minutos. Transcurrido ese tiempo, se observó la presencia de un estado transicional no estable. A temperaturas superiores, tales como 60°C, e incluso en periodos de tiempo menores, se observó un aumento de la relación A250/A267. A 70°C y 100°C se observaron pocos cambios entres las muestras (Figura 2E). Conjugación química
Se llevaron a cabo 5 reacciones en paralelo empleando los conjugados denominados C1-C5 (Tabla2). Se observaron variaciones en el color debidas a la formación de las bases de Schiff tras el paso de bloqueo, siendo de color más oscuro conforme aumenta la proporción TuMV-CP:CALB (Figura 3).
Tabla 2
Características de los conjugados empleados
Figure imgf000045_0001
Tras el bloqueo, los conjugados se filtraron a través de un dispositivo con límite de exclusión de 100 kDa, de modo que se retuvieron CALB conjugada o atrapada por partículas TuMV, así como moléculas formadas por al menos 4 unidades de CALB. Para evaluar la proporción de CALB retenida mediante el dispositivo de separación, se llevó a cabo una cuantificación basada en los niveles de intensidad de las bandas correspondientes a 33 kDa. Se realizó una curva patrón mediante concentraciones conocidas de lipasa libre, de R2=0,97. Se midió la intensidad de las muestras problema y se cuantificó CALB unida a virus (Figura 4). En la Tabla 3 se muestra el porcentaje de lipasa unida a virus, de modo que los porcentajes obtenidos fueron mayores para el conjugado C5, siendo similares para el conjugado C4. Tabla 3
Estimación de la eficiencia de conjugación basada en el porcentaje de CALB en cada muestra final
Figure imgf000046_0001
Ensayos de actividad CALB
En experimentos anteriores, los ensayos de CALB fueron establecidos con un sustrato a concentración fija (1,5 mM) con el propósito de evaluar la actividad en diferentes pasos del protocolo de conjugación (Tabla 4). Posteriormente, los ensayos cinéticos se llevaron a cabo en presencia de diferentes concentraciones de sustrato (Figura 5). La Tabla 5 muestra los valores de p y otros parámetros analizados.
Tabla 4
Etapas del proceso y comparación con CALB comercial (los resultados se muestras en proporciones relativas)
Figure imgf000046_0002
[NA: no ensayado] Tabla 5
Parámetros cinéticos y actividad específica de los conjugados (la última columna muestra las proporciones relativas de la mejora de actividad específica de los conjugados)
Figure imgf000047_0001
En cuanto a la actividad obtenida en las diferentes etapas del proceso, se observaron diferencias relacionadas con el dispositivo particular empleado para el lavado del exceso de glutaraldehído (GA). La columna Zeba® permitió obtener una mejora en la actividad de las muestras Cl y C2. Sin embargo, la actividad de la muestra C3 disminuyó, probablemente debido a la ausencia de GA. Con el sistema Centricon® se observó un aumento de 2 veces en la actividad de las muestras C4 y C5. Tras el lavado, los conjugados para los que se obtuvieron mayores actividades fueron Cl y C2, siendo el mejor resultado el obtenido para la muestra C2. Asimismo, se determinaron los parámetros cinéticos correspondientes a los conjugados, a excepción de C3 (control sin GA). El mayor aumento de actividad específica se obtuvo para el conjugado C5.
Microscopía electrónica
La apariencia de los conjugados obtenidos se analizó mediante microscopía electrónica. En el caso de Cl, se observó la formación moderada de una estructura en red. En la muestra C2, no se observaron partículas virales. En la muestra C3 se observó una baja formación de estructura en red. Sin embargo, en las muestras C4 y C5 se observó la formación de estructuras en red complejas, en especial en la muestra C5. Ambas muestras C4 y C5 dieron lugar con frecuencia a una distribución heterogénea en los límites de las rejillas. Esto podría ser debido a un aumento de la hidrofobicidad de las muestras con alto contenido en lipasa CALB.
Discusión/Conclusiones
TuMV es estable dentro de un amplio rango de pH (6-11) y además tolera cantidades limitadas de acenonitrilo. Por otro lado, el rango de temperatura en el que TuMV es estable (4°C-50°C) puede considerarse aceptable dentro de los parámetros biológicos. Los resultados muestran una transición estructural a 60°C, que confirmaría los resultados de Atabekov et al. (Atabekov J et al. 201 1 J Gen Virol 92(2): 453-456). Por tanto, TuMV puede considerarse como un biosoporte de interés en un amplio rango de condiciones necesarias en una variedad de procesos. Así, la presente invención proporciona un virión estable que puede ser empleado como herramienta en la inmovilización proteica.
Los resultados obtenidos en la etapa de bloqueo sugieren una correlación entre los grupos reactivos obtenidos y el color observado. La cantidad total de CALB unida al virus varía, en funión de parámetros tales como la concentración de la muestra y el dispositivo empleado para la filtración. El sistema se aproxima a la saturación de CALB en C4 y C5. Los datos obtenidos para Cl y C2 son similares, mientras que en C3 se puede retener una mayor cantidad de CALB. Esto puede deberse a que la conjugación se lleva a cabo en un mayor volumen y a que se evitan impedimentos estéricos. En C2, la lipasa forma agregados a modo de bolas conjugadas con GA. En C3, se considera que la CALB queda retenida debido a las etapas de centrifugación, de acuerdo a los resultados obtenidos mediante microscopía electrónica.
Cuando se compara la actividad en diferentes etapas del proceso se observa que hay un mayor aumento de actividad cuando se emplea la resina acrílica (columna Zeba®), de modo que CALB pasa a través de la columna y GA queda retenido. El lavado con Centricon® puede formar aglutinados de CALB activada y la filtración de GA. Esto podría relacionarse con impedimentos estéricos en los conjugados finales. La mayor actividad se observa para CALB sin virus (C2), en donde el enzima entrecruzado puede dar lugar a agregados, lo cual puede explicar el aumento de actividad (Lopez-Serrano P et al. 2002 Biotechnol Lett 24(16): 1379-1383). Tasas mayores de CALB, en donde se dificulta el acceso al sustrato y hay salida del producto, resultan en valores menores de actividad, lo cual es confirmado por microscopía electrónica (Figura 6). Los valores de Km para C5 apuntan hacia una menor afinidad por el sustrato.
La actividad específica relativa muestra mejoras de entre el 186% al 333% respecto a la lipasa comercial. Es necesario señalar que la heterogeneidad de los conjugados C4 y C5 hace difícil lograr la reproducibilidad entre ensayos.
El sistema de la invención permitiría la unión de varios enzimas a la superficie del virión para la catálisis de reacciones que transcurren en diferentes etapas. Por otro lado, este sistema ofrece la posibilidad de unir diferentes moléculas biológicas, tales como péptidos y enzimas, convirtiéndose en una alternativa útil como soporte (scaffold) tridimensional en la ingeniería de tejidos. Además, la longitud entre los virus se puede ajustar mediante el uso de enlazadores diferentes o mediante la combinación de varias moléculas (péptido-virus-enzima). TuMV posee aproximadamente 11 residuos de Usina por CP y 2000 copias de CP, que suponen un mínimo de 22.000 sitios susceptibles de reaccionar con GA (sin prestar atención a otros residuos con reactividad es posible). La bioseguridad de los conjugados se puede además mejorar mediante el uso de VLP que carecen de material genético. Si se compara la relación superficie/volumen de nanotubos de carbono y de TuMV, se aprecia que la relación es 400 veces mayor en el caso de TuMV. Esta ventaja se complementa además con la monodispersión y la estructura regular de los virus de tipo flexuoso.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un biocatalizador que comprende
- un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y
- un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática,
en donde dicho polipéptido A está unido al polipéptido B mediante un agente de entrecruzamiento.
2. Biocatalizador según la reivindicación 1, en el que la proteína de la cápsida forma parte de un virus o de una VLP.
Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la proteína de la cápsida es una proteína de la cápsida de un Potyvirus.
Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína de la cápsida es una proteína de la cápsida del virus del mosaico del nabo (TuMV).
Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el enzima es una lipasa.
Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el enzima es la lipasa B de Candida antárctica.
Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente de entrecruzamiento es glutaraldehído.
8. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende, además, al menos, un polipéptido C que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido al polipéptido A mediante un agente de entrecruzamiento, en donde dicho agente de entrecruzamiento es el mismo, o diferente al, agente de entrecruzamiento que une el polipéptido A con el polipéptido B.
9. Biocatalizador según la reivindicación 8, en el que dichos enzimas comprendidos en los polipéptidos B y C se seleccionan de modo que el producto resultante de la reacción enzimática catalizada por uno de los enzimas es el sustrato de la reacción enzimática catalizada por el otro enzima.
10. Un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae mediante un agente de entrecruzamiento.
11. Virus según la reivindicación 10, en donde el virus de la familia Potyviridae es un Potyvirus.
12. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 ú 11, en el que el virus de la familia Potyviridae es el virus del mosaico del nabo (TuMV).
13. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el enzima es una lipasa.
14. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el enzima es la lipasa B de Candida antárctica.
15. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el agente de entrecruzamiento es glutaraldehído.
16. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que dicho virus comprende, además, al menos, un polipéptido C que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido al víais mediante un agente de entrecruzamiento, en donde dicho agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente al agente de entrecruzamiento que une el virus con el polipéptido B.
17. Virus según la reivindicación 16, en el que dichos enzimas comprendidos en los polipéptidos B y C se seleccionan de modo que el producto resultante de la reacción enzimática catalizada por uno de los enzimas es el sustrato de la reacción enzimática catalizada por el otro enzima.
18. Una VLP de un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento.
19. VLP según la reivindicación 18, en la que el virus de la familia Potyviridae es un Potyvirus.
20. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, en la que el virus de la familia Potyviridae es el virus del mosaico del nabo (TuMV).
21. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en la que el enzima es una lipasa.
22. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en la que el enzima es la lipasa B de Candida antárctica.
23. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en la que el agente de entrecruzamiento es glutaraldehído.
24. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, que comprende, además, al menos, un polipéptido C que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido a la VLP mediante un agente de entrecruzamiento, en donde dicho agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente al agente de entrecruzamiento que une la VLP con el polipéptido B.
25. VLP según la reivindicación 24, en la que dichos enzimas comprendidos en los polipéptidos B y C se seleccionan de modo que el producto resultante de la reacción enzimática catalizada por uno de los enzimas es el sustrato de la reacción enzimática catalizada por el otro enzima.
26. Un método de obtención de un biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende poner en contacto un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho biocatalizador.
27. Método según la reivindicación 26, que comprende
(i) activar el polipéptido A con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido A - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar el complejo resultante en (i) con el polipéptido B.
28. Método según la reivindicación 26, que comprende
(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el polipéptido A.
29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que la proteína de la cápsida forma parte de un virus o de una VLP.
30. Un método de obtención de un virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, que comprende poner en contacto un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho virus.
31. Método según la reivindicación 30, que comprende
(i) activar las proteínas de la cápsida del virus con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [virus - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar el complejo resultante en (i) con el polipéptido B.
32. Método según la reivindicación 30, que comprende
(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el virus.
33. Un método de obtención de una VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, que comprende poner en contacto una VLP de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicha VLP.
34. Método según la reivindicación 33, que comprende
(i) activar la VLP con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [VLP - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar el complejo resultante en (i) con el polipéptido B.
35. Método según la reivindicación 33, que comprende
(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con la VLP.
36. Un método para inmovilizar un enzima que comprende conjugar un polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B, que comprende un enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, mediante un agente de entrecruzami ento .
37. Método según la reivindicación 36, en el que la proteína de la cápsida de dicho virus de la familia Potyviridae forma parte de un virus o de una VLP.
38. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, que comprende
(i) activar el polipéptido A con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido A - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el polipéptido B.
39. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, que comprende
(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido B - agente de entrecruzamiento], y
(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el polipéptido A.
40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en el que el virus de la familia Potyviridae es un Potyvirus.
41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en el que virus de la familia Potyviridae es el virus del mosaico del nabo (TuMV).
42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, en el que el enzima es una lipasa.
43. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 42, en el que el enzima es la lipasa B de Candida antárctica.
44. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 43, en el que el agente de entrecruzamiento es glutaraldehído.
45. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, que comprende, además, inmovilizar un segundo enzima, comprendiendo dicho método conjugar dicho polipéptido A, que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido C, comprendiendo dicho polipéptido C dicho segundo enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en donde dicho segundo enzima es un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, mediante un agente de entrecruzamiento.
46. Uso de
(i) un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, o de
(ii) un virus de la familia Potyviridae, o de
(iii)una VLP que comprende proteínas de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae,
para la inmovilización de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática.
47. Uso según la reivindicación 46, en el que el virus de la familia Potyviridae es un Potyvirus.
48. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 46 ó 47, en el que el virus de la familia Potyviridae es el virus del mosaico del nabo (TuMV).
49. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 46 a 48, en el que el enzima es una lipasa.
50. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, en el que el enzima es la lipasa B de Candida antárctica.
51. Un procedimiento para la conversión enzimática de un sustrato en un producto que comprende poner en contacto dicho sustrato con un biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o con un virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, o con una VLP según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en donde el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática presente en el polipéptido B de dicho biocatalizador, o de dicho virus o de dicha VLP, es un enzima que cataliza una reacción enzimática específica para la conversión de dicho sustrato en dicho producto, bajo condiciones adecuadas para que dicha reacción enzimática tenga lugar.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101113433A (zh) * 2007-06-29 2008-01-30 浙江工业大学 一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101113433A (zh) * 2007-06-29 2008-01-30 浙江工业大学 一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALJABALI ALAA A A ET AL.: "Controlled immobilisation of active enzymes on the cowpea mosaic virus capsid..", NANOSCALE ENGLAND, vol. 4, no. 18, 2012, pages 5640 - 5645 *
STEINMETZ N F ET AL.: "Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications", NANO LETT., vol. 10, no. 1, 2010, pages 305 - 312 *
TORRES ET AL.: "Acetylation of vitamin E by Candida antarctica lipase B immobilized on different carriers.", PROCESS BIOCHEMISTRY, vol. 43, no. 2, 19 November 2007 (2007-11-19), pages 145 - 153 *

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