Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es un método para cuantificar con precisión las diferencias de expresión de proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas. Etiquetado REDI se lleva a cabo utilizando formas regulares deuterados (pesados) de formaldehído y cianoborohidruro de sodio (luz) o para agregar dos grupos metilo a cada amina libre. Aquí se demuestra un protocolo robusto para el etiquetado Redi y la comparación cuantitativa de mezclas complejas de proteínas. Proteína muestras para la comparación se digieren en péptidos, etiquetados para llevar la luz o las etiquetas de metilo pesados, mezclados, y co-analizados por LC-MS/MS. Abundancias de proteínas relativas se cuantificaron mediante la comparación de las áreas de los picos del cromatograma de iones de versiones pesadas y ligeras marcados de la péptido constituyente extraído de la plena espectros de MS. El método descrito aquí incluye preparación de la muestra por extracción en fase sólida de fase inversa, etiquetado Redi en columna de péptidos, péptido fraccionamiento por rev de pH básicofase ersed (BPRP) cromatografía y purificación de péptidos StageTip. Se discuten las ventajas y limitaciones de etiquetado Redi con respecto a otros métodos para la incorporación de isótopos estables. Destacamos las nuevas aplicaciones utilizando el etiquetado Redi como un método rápido, económico y preciso para comparar la abundancia de proteínas en casi cualquier tipo de muestra.

Medición de diferencias de concentración de muchas proteínas entre muestras complejas es un reto central en la proteómica. Cada vez más, esto se hace mediante el etiquetado de proteínas en cada muestra con diferentes etiquetas isotópicas, la combinación de las muestras, y el uso de la espectrometría de masas para cuantificar las diferencias de concentración. Existen varios métodos para el marcaje isotópico estable de proteínas y péptidos. ¹⁵ N etiquetado ¹ y ² SILAC introducen marcadores isotópicos metabólicamente in vivo, mientras que iCAT ^3, iTRAQ ^4, y la reducción de dimethylation ⁵ agregan....

NOTA: Este método fue descrito previamente ^12.

1. De aislamiento de proteínas

Prepare 1 mg de proteína celular por las células de lisis, preferiblemente por métodos físicos como la prensa francesa, golpes de talón, o ultrasonidos. Evitar la lisozima lisis celular mediada porque la enzima confundirá mediciones de espectrometría de masas.

2. Precipitación con TCA de las proteínas

Añadir á.......

Se evaluó la exactitud, precisión y reproducibilidad de etiquetado Redi utilizando Saccharomyces cerevisiae y Clostridium phytofermentans lisados ​​de células enteras. Primero cuantificamos el etiquetado de eficiencia Redi de una mezcla de C. phytofermentans lisados ​​de proteínas a partir de celulosa culturas (pesada etiqueta, H) y glucosa (etiqueta de la luz, L). Cuando se filtra a un péptido falso descubrimiento tasa del 1%, la muestra contenía 11.194 secuencias de péptidos ?.......

Varios puntos hacen que el etiquetado de isótopos estables de péptidos utilizando un método atractivo para proteómica cuantitativa dimethylation reductora (etiquetado REDI): reactivos baratos etiquetado (reactivos cuestan menos de $ 1 por muestra), la velocidad de reacción rápida (~ 10 min), ausencia de productos secundarios, altas reproducibilidad (Figuras 3, 4), productos de reacción estable, capacidad de utilizar cualquier proteasa y de alta eficiencia de ionización de péptidos marcados. Eti.......

We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.