Purificación e Inmovilización Enzimática

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
ENZIMOLOGÍA
TEMA: Purificación e inmovilización enzimática
NRC: 2438
INTEGRANTES:
Katherin Graciela Cajas Villalva
Gabriela Alejandra Pazmiño Araujo
PERÍODO ACADÉMICO: ABRIL – AGOSTO 2017
1. RESUMEN
2. INTRODUCCIÓN
En los últimos años la industria biotecnológica ha crecido significamente creando
productos con aplicaciones industriales. Los procesos catalizados por enzimas en la
industria son cada vez más numerosos al presentar estas una serie de ventajas frente
a los catalizadores no biológicos como: Presentan una gran actividad catalítica,
muestran una gran especificidad al sustrato y son muy activos a temperatura
ambiente y presión atmosférica. Sin embargo, a pesar de estas claras ventajas, el
empleo de las mismas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales
debido a que la mayoría de enzimas no son estables en condiciones de trabajo,
también al ser solubles en agua su separación de los sustratos y productos es difícil
por lo que no son reutilizables [ CITATION San12 \l 21514 ].
Es por ello que procedimientos como purificación e inmovilización de las mismas
facilitan la utilización de las enzimas en productos biotecnológicos dando solución a
las desventajas presentadas anteriormente [ CITATION Hue10 \l 21514 ]
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Conocer los diferentes tipos de purificación e inmovilización enzimática y en
que consiste cada uno.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Clasificar los métodos de purificación e inmovilización enzimática para
establecer diferencias entre ellos.
 Reconocer que método es el más óptimo dependiendo de la enzima que
se desea extraer.
 Conocer las aplicaciones biotecnológicas que el proceso de purificación
e inmovilización enzimática puede generar.
4. MARCO TEÓRICO
4.1. Purificación enzimática
2
4.2. Inmovilización enzimática
1. Definición
La inmovilización enzimática es un proceso que permite mejorar
significativamente la estabilidad de las enzimas, lo que facilita su empleo en la
producción industrial de productos químicos, farmacéuticos, alimenticios, en el
tratamiento de residuos, en diagnóstico y tratamiento de enfermedades, entre
otras. Esta propiedad le da la posibilidad de separar a las enzimas de su sustrato
para así poder reutilizarlas, haciendo de esta manera que el proceso
biotecnológico sea económicamente rentable [ CITATION Arr00 \l 21514 ].
De manera general la inmovilización de enzimas es usada para confinar o
localizar a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas
insolubles que retienen su actividad catalítica para poder reutilizarlas
repetidamente, es decir; se restringe total o parcialmente los grados de libertad
de movimiento de enzimas a su sustrato [ CITATION Ber02 \l 21514 ].
2. Métodos de inmovilización
A los métodos de inmovilización enzimática se los puede clasificar en dos

categorías:
 Retención física
 Unión química
2.1. Métodos de inmovilización enzimática por retención física

a. Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de

una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros
fotoentrecruzables o polímero del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato,
carraginato o resinas de poliuretano. El atrapamiento es un método muy
sencillo experimentalmente hablando, requiere poca cantidad de enzima para
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obtener derivados activos, además de que la misma no sufre ninguna
alteración estructural; sin embargo, este requiere un riguroso control de las
condiciones de polimerización y de que la naturaleza química del proceso no
altere los grupos reactivos de la proteína [ CITATION Arr00 \l 21514 ]; este
proceso:
1) Se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución

del monómero
2) Se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante
la adición de un reactivo químico.
3) El atrapamiento se lo puede realizar en geles o fibras.
Tipos de membranas
 Microencapsulación: Las enzimas están rodeadas de membranas

semipermeables las mismas que permiten el paso de moléculas de
sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas pueden ser
permanentes (polimerización interfacial) o no permanentes
(surfactantes), mediante este método se puede encapsular
simultáneamente una gran cantidad de enzima permitiendo llevar a cabo
determinadas reacciones en múltiples pasos [ CITATION Hue10 \l 21514 ].
 Reactores de membrana: Se emplean membranas permeables al
producto final, permeables o no al sustrato inicial e impermeables a la
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enzima y mediante una bomba establece un flujo líquido de sustrato. La
adsorción en el reactor se puede realizar de dos formas: Mediante el paso
de una solución taponada de enzima a través de la membrana y por
contacto continuo de una solución de enzima con la membrana
[ CITATION San12 \l 21514 ].
2.2. Métodos de inmovilización enzimática por unión química

a) Unión a soportes
Este es el método de inmovilización enzimática más utilizado y de los que se

dispone de mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace
determinan el comportamiento del biocatalizador, se debe procurar que la
inmovilización incremente la afinidad de la enzima por el sustrato,
disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las
posibles contaminaciones microbianas. Al soporte se puede unir la enzima
por medio de adsorción o por unión covalente y el mismo debe tener gran
resistencia mecánica y ser fácilmente separable del medio líquido para que
pueda ser reutilizado es por ello que hay varios dependiendo de la enzima
que se desea extraer difieren en el tamaño, densidad, porosidad y forma
[ CITATION Her03 \l 21514 ]; los soportes se clasifican en:
I. Soportes inorgánicos: En esta clasificación hay una gran variedad

de soportes, pueden ser naturales (arcillas, piedra pómez, sílice) o
manufacturados (óxidos de metales, vidrio, alúmina, cerámicas,
geles).
II. Soportes orgánicos: Se pueden clasificar en:
 Polímeros naturales: Los cuales pueden ser polisacáridos o
proteínas fibrosas.
 Polímeros sintéticos: Los cuales pueden ser poliolefinas,
polímeros acrílicos, entre otros.
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b) Adsorción
La enzima se une a un soporte mediante interacciones iónicas, fuerzas de

Van der Waals y por puentes de hidrógeno [ CITATION Arr00 \l 21514 ]. Los
factores que influyen en la misma son:
 El pH medio controla el número y la naturaleza de las cargas que

presenta la superficie de la proteína.
 La fuerza iónica que produce la desorción de la enzima.
 El diámetro del poro
 La presencia de iones que actúan como cofactores de la enzima.
c) Unión covalente
La metodología de este proceso se basa en la activación de grupos químicos

del sustrato para que reaccionen con nucleofilos de las proteínas, los
aminoácidos que forman enlaces covalentes son principalmente la lisina,
cisteína, tirosina e histidina y en menor medida la metionina, triptófano,
arginina, aspartato y glutamato; el resto de aminoácidos al ser hidrófobos no
se encuentran expuestos a la superficie proteica [ CITATION Mar09 \l 21514 ].
d) Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que

ha sido utilizada ampliamente utilizada en la estabilizaciónde muchas
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enzimas, consiste en el uso de reactivos bifuncionales (dialdehídos,
diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio) que originan uniones
intermoleculares. El reticulado ofrece enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
El co-reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática
debido a efectos disfuncionales [ CITATION Hue10 \l 21514 ].
Ventajas de la inmovilización enzimática

a) Aumenta la estabilidad de la enzima.
b) Permite reutilizar la enzima, disminuyendo al mismo tiempo el costo del
proceso que se desea catalizar.
c) Permite diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control el
mismo que aumenta la actividad enzimática por más tiempo y da
productos con mayor pureza.
Desventajas de la actividad enzimática
a) Altera la conformación de la enzima respecto a su estado nativo.
b) Gran heterogeneidad del sistema enzima-sustrato donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas.
c) Puede haber una pérdida de actividad enzimática durante la
movilización.
d) El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas
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Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas son:
 Aplicaciones analíticas como lo son los biosensores
 Aplicaciones médicas en tratamiento con enzimas inmovilizadas
 Aplicaciones industriales en la industria química, farmacéutica,
alimentaria y en tratamiento de residuos.
5. CONCLUSIONES
6. BIBLIOGRAFÍA
Arroyo, S. (9 de septiembre de 2000). Inmovilización de enzimas. Obtenido de
farmacia.ugr.es/ars/ars_web/controldescargas.php?125
Bernard, A. (2002). Reactores bioquímicos. Barcelona: Editorial Reverté.
Herrera, C. (2003). Química de alimentos. Costa Rica: Universidad de Costa Rica.
Huerta, S. (10 de junio de 2010). Inmovilización. Obtenido de
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Tema_10_Biotec_Enzimas.pdf
Martínez, R. (2009). Fundamentos teóricos y prácticos de histoquímica. Madrid: Consejo
superior de investigaciones científicas.
Sanchez, J. (13 de mayo de 2012). Inmovilización de enzimas. Obtenido de
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/btg/personales/jmsanchez/00_INMOVILIZ
ACION_Introduccion.pdf

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A los métodos de inmovilización enzimática se los puede clasificar en dos

2.1. Métodos de inmovilización enzimática por retención física

Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de

1) Se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución

 Microencapsulación: Las enzimas están rodeadas de membranas

2.2. Métodos de inmovilización enzimática por unión química

Este es el método de inmovilización enzimática más utilizado y de los que se

I. Soportes inorgánicos: En esta clasificación hay una gran variedad

La enzima se une a un soporte mediante interacciones iónicas, fuerzas de

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