UNIVERSIDAD NACIONAL

JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

E. A. P DE ENFERMERÍA

CURSO : Microbiología y Parasitología

TEMA : Técnicas de coloración bacteriana

DOCENTE : Adelmo Goñi Salazar

ALUMNO : Urbano Castillo Silvia Milagros

CICLO : II

2017

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 DEDICATORIA

Al creador de todas las cosas, el que me ha dado la

fortaleza para continuar con mis metas; por ello, con
toda mi humildad que de mi corazón puede emanar,
dedico primeramente este trabajo a Dios.
De igual forma, dedico el presente trabajo a mis
padres que me han sabido formar con buenos
sentimientos, hábitos y valores, lo cual me ha ayudado
a salir adelante en los momentos más difíciles.

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 INTRODUCCIÓN
Las bacterias, levaduras y protozoarios, en su estado natural, carecen de color,

teniendo un aspecto semitransparente, por lo que resulta muy difícil su

observación en las preparaciones acuosas sobre láminas portaobjetos, sometidas

a la intensa iluminación que se requiere en los exámenes microscópicos de campo

brillante, siendo necesario colorearlas por diferentes métodos de tinción que

faciliten su observación y distinguir las características morfológicas y estructurales

que sirvan de datos para su identificación genérica.

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 TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA
1. GENERALIDADES:
La técnica de coloraciones citológicas s e remontan a 1849, siendo el botánico
alemán Ferdmand Conh el primero en utilizar coloraciones de secciones
histológicas, disponiendo de los tintes vegetales como el carmín y la hematoxilina;
siete años más tarde Perkin de Manchester, sintetizó el primer colorante de anilina
en ese entonces la industria de coloración tecnológica era mucho más elevada y al
cual contribuyeron tanto los fabricantes que adivinaban las inmensas
potencialidades de los nuevos métodos, como las químicas industriales que fueron
capaces de introducir las técnicas adecuadas para la producción a gran escala.
El primer informe acerca de la aplicación de tintes vegetales a las células
bacterianas es el de Hoffam en 1869 en el carmín; luego en 1875 Heigert utilizó
diversos colorantes simples entre ellos el Azul de Metileno sintético para teñir
bacterias. En 1877 Robert Koch, publicó la suscripción de una revolucionaria obra
el avance de la microscopía de bacterias, ilustrándolos con las primeras
microfotografías; siendo el primero en realizar preparaciones con películas secas
al aire, coloreadas con azul de Metileno; luego Paul Ehrlich introdujo la fijación, de
esas películas secadas en alcohol.
Los resultados de las coloraciones en ese entonces eran insatisfactorios, con el
Azul de Metileno las bacterias aparecían como puntos más oscuros contra un
fondo azul y a menudo era difícil decidir cuál de los puntos oscuros era una
bacteria o un artefacto. El primer intento para resolver el problema fue de colorear
las secciones después de la tinción. En 1884 el problema finalmente fue resuelto
por el Dinamarqués Hans Christian Gram, que introdujo la técnica de recuento por
tinción después de la coloración. En los años inmediatos a la publicación de su
método, se hizo evidente que esta técnica era de gran utilidad como medio para
dividir las bacterias en dos clases de acuerdo a su comportamiento cuando se
aplicaba un agente decolorante. Los que retenían el Violeta fueron clasificados
como microorganismos Gram positivos y los que se decoloraban y retenían el
color rojizo, como microorganismos Gram negativos.

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Desde un principio se advirtió que la reacción de los microorganismos frente a la
coloración Gram, correlacionaba con otros caracteres fisiológicos de las especies
bacterianas.
Tuvieron que pasar 10 años cuando se obtuvo algún conocimiento, acerca de los
mecanismos de la reacción, siendo el mérito de Fischer quien sustentó por vez
primera que las paredes celulares de las bacterias eran precisamente los que
reaccionaban con los colorantes.
Para demostrar su teoría utilizó un procedimiento de plasmólisis para separar la
membrana de la pared celular bacteriana, pudiendo demostrar de esta forma que
constituían dos estructuras separadas de las bacterias, lo que simplemente ha
sido ratificado con las técnicas como la observación en el Microscopio Electrónico
y las microfotografías que actualmente se conocen.
2. COLORANTES:
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos,
fibras, etcétera.  Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la
definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras
musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando
diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células
individuales.
A propósito, los colorantes se clasifican en:
Colorantes Naturales:
Los términos colorantes naturales y tintes naturales hacen referencia
a colorantes o tintes derivados de plantas, invertebrados o minerales. La mayor
parte de los colorantes naturales son colorantes vegetales provenientes de plantas
( raíces, bayas, cortezas, hojas y madera), y otras fuentes orgánicas como, por
ejemplo, los hongos y los líquenes.
Colorantes Sintéticas:
Proceden de la anilina o más exactamente del alquitrán de hulla, siendo todos
derivados de benceno.
En cuanto a su afinidad por las células se pueden clasificar en:

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Colorantes básicos: La acción colorante está a cargo del catión, mientras que el
anión no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.
Colorante ácido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante está a cargo del
anión, mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+
Colorantes neutros: Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de
colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble
exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad
tintorial de sus componentes ácidos y básicos, por ejemplo: la giemsa.
3. PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una
muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya
que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen
clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos
para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación
al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.
Realización del frotis:
Materiales:
 Muestra líquida con microorganismos.

 Mechero

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  Lamina portaobjetos

 Asa bacteriológica

Procedimiento:
1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de
siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una
mínima gota de agua, que resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña
cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua.
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión
homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar
los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la
suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre
el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando
el portaobjeto a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha

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 precaución de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células pueden
deformarse o romperse.
4. MÉTODOS DE COLORACIÓN
Atendiendo a los objetivos que se persigan, los métodos de coloración se
clasifican en: 

A. Tinción simple

En la tinción simple se utiliza un solo colorante con el que se tiñe rápidamente el

microorganismo, utilizándose fundamentalmente para observar su morfología y
tamaño. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo de tinción
son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fuscina fenicada, entre otros.

1.1. Tinción de Azul de Metileno.

OBJETIVOS:

 Realizar la técnica de coloración de microorganismos y comparar con las

láminas coloreadas de la cátedra.

 Adquirir habilidad y destreza en lo referente a los trabajos que se realizaran

en las prácticas posteriores.

MATERIALES:

 Muestra líquida

 Muestra sólida
 Lámina portaobjetos

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 Mechero

 Asa microbiológica

 Batería de gram

 Lápiz de cera

 Encendedor

 Aceite de inmersión

 Microscopio

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PROCEDIMIENTO:

1. Teñir el frotis con solución acuosa de azul de metileno al 0.5 durante 5

minutos.

2. Lavar con agua de caño.

3. Dejar evaporar al ambiente.

4. Observe microscópicamente usando el aceite de inmersión.

RESULTADOS:

 La Coloración de Azul de Metileno tiñe a todas las bacterias por igual.

 El azul de metileno tiñe las estructuras presentes en el citoplasma de las

bacterias.

 No es diferencial porque cuando se tiñe microorganismos con este

colorante tiñe a todos por igual, se comporta de la misma forma con una
bacteria u otra.

B. Tinción compuesta

Se puede determinar algunas características propias de diversos géneros que

permiten diferenciarlo de los demás, por lo que reciben también el nombre de
coloraciones diferenciales. Entre los métodos más utilizados se encuentran: La
coloración de Gram. y la de Ziehl Neelsen. Es un método de gran utilidad para la
división de bacterias en dos grandes grupos:

 Bacterias Gram. Positivas: La que toman el colorante de violeta de

genciana, que se observan de color azul violáceo o morado.

 Bacterias Gram. Negativas: Aquellas que se decoloran al se r lavadas con

alcohol de acetona y captan el contra colorante safranina, tiñéndose de
color rosáceo (rojizo).

Siendo la coloración Gram. la más importante en lo que se refiere a la tinción de

los microorganismos.

1.1. Coloración de Gram.

OBJETIVOS:

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  Observar la morfología y tipo de agrupación bacteriana.
 Observar y estudiar la reacción bacteriana frente a la coloración Gram.
 Adquirir destreza y habilidad en la realización de trabajos en el laboratorio
de Microbiología.

MATERIAL:
 Lámina porta con frotis debidamente fijado.
 Mechero

 Lápiz de cera
 Batería de Gram
PROCEDIMIENTO:

1. Verter la solución de violeta de genciana, hasta cubrir el frotis, dejando que

el colorante actué por espacio de 30 segundos.

2. Lavar la preparación ligeramente con agua corriente.

3. Echar sobre la preparación el lugol., hasta cubrir el frotis dejando que actué
durante 2 minutos.

4. Lavar la lámina con agua corriente.

5. Echar sobre la preparación el alcohol etílico 95 % o el alcohol acetona al 20

%, hasta que se evidencie que este solvente no extrae más el colorante
violeta. Esta operación debe durar aproximadamente de 1 a 2 minutos.

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 6. Lavar la lámina con agua corriente.

7. Echar sobre la preparación la solución de safranina, dejándola actuar por

espacio de 1 minuto.

8. Lavar con agua corriente.

9. Dejar evaporar al ambiente. Observar con el microscopio, usando el

objetivo de inmersión.

RESULTADOS:

En el primer paso de la coloración, cuando los microorganismos presentes en el

frotis son expuestos a la acción colorante de la violeta de genciana, todos los
géneros que se encuentran en el frotis se tiñen de color violeta.

Al adicionar el lugol, no se produce ningún cambio de color, ya que el lugol no es

un colorante, sino un mordiente, que se adiciona con el objetivo de formar un
complejo violeta-lugol, para fijar el color en la bacteria.

Al adicionar el decolorante (alcohol etílico o alcohol acetona) algunos géneros no

son afectados por estos solventes, reteniendo por consiguiente el color violeta
aplicado inicialmente, en tanto que otros son decolorados quedando la bacteria
nuevamente incolora.

Al echar finalmente la solución de safranina (que es de color rojo) las especies que
no fueron decoloradas, mantienen la coloración violeta ya que la safranina es un
colorante más débil que la violeta y su adición no influye significativamente en
cambio de color, en tanto que los géneros que fueron decolorados por el alcohol,
se tiñen con la safranina, adquiriendo un color de rosado o rojo.

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Diagnóstico microscópico

Las bacterias que se observan de color violeta se clasifican como Gram positivas y
las que se observan de color rojo, como Gram negativas.

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 CONCLUSIÓN

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico

oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel

importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.

Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en

sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales,

vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnóstico microbiológico.

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ANEXOS

BACTERIAS GRAM
NEGATIVAS

BACTERIAS GRAM
POSITIVAS

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