FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA

“Papel de la entrada de calcio regulada por

reservorios en la vasoconstricción y
proliferación celular inducida por
Urotensina-II en aorta”

Trabajo de investigación presentado por

MARÍA RODRÍGUEZ MOYANO
para optar al grado de Doctora en Biología
Sevilla, 2012

1
INDICE

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………….9

1. Papel emergente de los GPCR deorfanizados en la regulación cardiovascular…………9

2. La Urotensina-II y su relación con la fisiopatología cardiovascular............................12

- 2.1 Estructura y características generales…………………………………………………………………12

- 2.2 Efecto agudo de la Urotensina-II en el sistema cardiovascular: regulación del tono
vascular………………………………………………………………………………………………………………………13
- 2.3 Efectos a largo plazo de la acción de la Urotensina-II a nivel cardiovascular……..14
- 2.3.1 Relación de la Urotensina-II con la fisiopatología cardiovascular
- 2.3.2 Urotensina-II y proliferación celular
- 2.3.3 Urotensina-II y aterosclerosis
- 2.4 Mecanismo de acción de la Urotensina-II…………………………………………………………..17

3. Reactividad del músculo liso vascular........................................................................18

- 3.1 Estructura del músculo liso vascular…………………………………………………………………..18

- 3.2 Papel del Ca2+ intracelular en la contracción vascular…………………………………………21
- 3.3 Regulación de la homeostasis de Ca2+ intracelular…………………………………………….23
- 3.3.1 El retículo endo/sarcoplásmico
- 3.3.2 Entrada de Ca2+ a través de la membrana plasmática
- 3.3.3 Proteínas de unión a Ca2+ en el citosol
-3.3.4 La ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA) y el intercambiador Na+/
Ca2+
- 3.3.5 La mitocondria

2
4. Canales de calcio regulados por reservorio (Store Operated Calcium Channels)…….31

- 4.1 Descubrimiento y concepto de la entrada de Ca2+ regulada por los reservorios…31

- 4.2 Vía de señalización de la SOCE……………………………………………………………………………32
- 4.2.1 Stim1
- 4.2.2 Orai
- 4.2.3 Canales TRPC
- 4.2.4 Comunicación entre Stim, Orai y otras moléculas participantes en la SOCE
- 4.2.5 Fosfolipasa A2 independiente de Ca2+ (iPLA2) y su papel en la SOCE
- 4.3 La entrada de Ca2+ a través de los SOC en el músculo liso vascular…………………….43
- 4.3.1 Canales SOC y su influencia en el tono vascular
- 4.3.2 Canales SOC, regulación de la expresión génica y proliferación de CMLV

5. Proliferación del músculo liso vascular y su relación con procesos

fisiopatológicos………………………………………………………………………………………………………….47

- 5.1 Mecanismos promotores de la proliferación en células de músculo liso; papel de

la homeostasis de Ca2+……………………………………………………………………………………………….47
- 5.2 Regulación de la expresión génica por Ca2+ y factores de transcripción inductores
de proliferación………………………………………………………………………………………………………….47
- 5.3 Proliferación de las CMLV y su relación con la vía de los SOC……………………………49
- 5.4. Procesos de aterosclerosis y reestenosis en la pared vascular…………………………..50

OBJETIVOS...................................................................................................................54

MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................55

1. Modelo animal y disección de la aorta…………………………………………………………………..55

3
2. Cultivo primario de músculo liso…………………………………………………………………………….56

- 2.1 Dispersión de células de músculo liso vascular………………………………………………….56

- 2.2 Condiciones de incubación de los cultivos………………………………………………………….57

3. Análisis del tono vascular……………………………………………………………………………………….58

- 3.1 Estructura de la cámara de órganos……………………………………………………………………58

- 3.2 Preparación y montaje del vaso………………………………………………………………………….60
- 3.3 Recogida de datos y análisis del efecto de los inhibidores………………………………….63

4. Registro de Ca2+ intracelular con microscopía de fluorescencia………………………………64

- 4.1 Papel del Fura-2 AM en el estudio de la movilización de Ca2+ intracelular………….64

- 4.2 Estructura microscopio de fluorescencia y lámpara……………………………………………65
- 4.3 Fases del experimento……………………………………………………………………………………….66
- 4.4 Análisis de los datos……………………………………………………………………………………………67

5. Ensayo de proliferación………………………………………………………………………………………….68

- 5.1 Características del reactivo AlamarBlue……………………………………………………………..68

- 5.2 Fases del experimento, mediciones y análisis…………………………………………………….68

6. Inmunofluorescencia………………………………………………………………………………………………69

- 6.1 Marcaje con bromodeoxiuridina…………………………………………………………………………69

- 6.2 Inmunocitoquímica para PCREB………………………………………………………………………….71
- 6.3 Obtención de las imágenes y análisis de datos……………………………………………………71

4
7. Técnicas de biología molecular………………………………………………………………………………72

- 7.1 Transfección y silenciamiento con ARN interferente………………………………………….72

- 7.1.1 Función de los ARN interferentes
- 7.1.2 Transfección de células de músculo liso

8. Grupos de tratamiento y análisis estadístico………………………………………………………….75

- 8.1 Tratamientos en registro del tono vascular……………………………………………………….75

- 8.2 Movilización de Ca2+ intracelular………………………………………………………………………75
- 8.3 Ensayos de proliferación e inmunofluorescencia……………………………………………….76
- 8.4 Análisis estadístico…………………………………………………………………………………………….76

9. Soluciones……………………………………………………………………………………………………………...77

RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………….78

1. Efecto de la Urotensina-II sobre el tono vascular en aorta…………………………………….78

- 1.1 La Urotensina-II induce vasoconstricción de forma dosis-dependiente en anillos

arteriales, con un importante papel del endotelio……………………………………………………..78
- 1.2 La Urotensina-II promueve un aumento en la concentración de Ca2+ intracelular
en células de músculo liso aisladas…………………………………………………………………………….80
- 1.3 El incremento en Ca2+ y la vasoconstricción inducidos por Urotensina-II tienen
lugar a través de su receptor específico y mediante la activación de la fosfolipasa C…83

2. Papel de los canales iónicos en la vasoconstricción mediada por la Urotensina-II....86

- 2.1 Los canales de Ca2+ voltaje-dependientes participan de forma parcial en la

contracción inducida por Urotensina-II………………………………………………………………………86

5
- 2.2 El aumento en tono vascular mediado por la Urotensina-II se revierte
completamente mediante la inhibición farmacológica de los canales SOC………………..87
- 2.3 La entrada de Ca2+ inducida por Urotensina-II también puede ser revertida por el
uso de fármacos inhibidores de los SOC……………………………………………………………………..89
- 2.4 La Urotensina-II induce corrientes iónicas similares a ICRAC en células de músculo
liso vascular, que se inhiben por bloqueantes de los SOC…………………………………………..90

3. Implicación de los nuevos componentes moleculares de la SOCE, Stim1 y Orai1, así

como de TRPC1 en la entrada de Ca2+ promovida por la Urotensina-II..........................93

4. Papel de la fosfolipasa A2 independiente de Ca2+ (iPLA2), reguladora de la entrada de

Ca2+ a través de los SOC, en la respuesta a Urotensina-II………………………………………….96

- 4.1 La Urotensina-II aumenta la actividad de la iPLA2 en células de músculo liso de

aorta………………………………………………………………………………………………………………………….97
- 4.2 El inhibidor específico de la iPLA2 revierte la contracción vascular mediada por la
Urotensina-II………………………………………………………………………………………………………………98
- 4.3 La entrada de Ca2+ inducida por Urotensina-II es sensible a la inhibición de la
isoforma β de iPLA2, pero no a la de la isoforma γ…………………………………………………….99

5. La Urotensina-II estimula la proliferación de células de músculo liso vascular……..100

- 5.1 La incubación a largo plazo con Urotensina-II promueve cambios en la entrada de

Ca2+ regulada por los reservorios de CMLV………………………………………………………………101
- 5.2 La Urotensina-II induce proliferación celular a las 24 y 48 horas de su
aplicación…………………………………………………………………………………………………………………102
- 5.3 El marcaje con BrdU confirma el efecto inductor de proliferación de la Urotensina-
II……………………………………………………………………………………………………………………………….103
- 5.4 El aumento en proliferación mediado por Urotensina-II se inhibe mediante el
tratamiento con inhibidores de los SOC……………………………………………………………………104
- 5.5 El silenciamiento de Stim1 logra revertir la proliferación inducida por Urotensina-
II……………………………………………………………………………………………………………………………….105

6
- 5.6 Las proteínas Orai1 y TRPC1 se encuentran también fuertemente implicadas en la
proliferación promovida por la Urotensina-II……………………………………………………………106

6. La Urotensina-II promueve la activación y translocación al núcleo celular del factor

de transcripción CREB...................................................................................................108

- 6.1 La Urotensina-II induce la activación de CREB de forma dosis-dependiente……..108

- 6.2 El uso de inhibidores de los canales SOC previene la activación de CREB
promovida por la Urotensina-II………………………………………………………………………………..109
- 6.3 Stim1 y TRPC1, pero no Orai1, juegan un importante papel en la activación de
CREB mediada por la Urotensina-II…………………………………………………………………………..110

DISCUSIÓN.................................................................................................................112

1. La Urotensina-II como uno de los más potentes vasoconstrictores………………………112

- 1.1 Vasoconstricción por Urotensina-II en distintos territorios vasculares…………….112

- 1.2 Influencia de la presencia del endotelio en la contracción vascular mediada por
Urotensina-II…………………………………………………………………………………………………………….114
- 1.3 La Urotensina-II y su efecto en la homeostasis de Ca2+ intracelular…………………115

2. Papel de los canales de Ca2+ en la regulación del tono vascular inducida por
Urotensina-II…………………………………………………………………………………………………………….116

- 2.1 Participación de los canales voltaje-dependientes en la contracción vascular….116

- 2.2 Regulación del tono vascular y de la homeostasis de Ca2+ por los SOC…………….117
- 2.3 Relación entre contracción vascular a través de los SOC y la iPLA2; papel de la
Urotensina-II…………………………………………………………………………………………………………….118
- 2.4 Papel de los distintos componentes de la SOCE en la contracción vascular……..120
- 2.5 TRPC1 como potencial componente del complejo macromolecular de la SOCE..120

7
3. Los cambios en fenotipo de las células de músculo liso vascular se asocian con
alteraciones en la homeostasis de Ca2+…………………………………………………………………….122

4. Implicación de la Urotensina-II y los SOC en la proliferación de las células de músculo

liso vascular……………………………………………………………………………………………………………..124

- 4.1 La Urotensina-II como activador de la proliferación celular…………………………….124

- 4.2 Papel de los SOC en el cambio de fenotipo del músculo liso vascular………………125
- 4.3 TRPC1 y su papel en la proliferación del músculo liso vascular………………………..126

5. La activación celular por entrada de Ca2+ se acompaña de cambios en la expresión

génica………………………………………………………………………………………………………………………127

- 5.1 Papel de los SOC en la activación de factores de transcripción mediada por

Ca2+………………………………………………………………………………………………………………………….127

6. Implicaciones fisiopatológicas de la proliferación promovida por la Urotensina-II a

través de la SOCE en músculo liso vascular: posibles dianas terapéuticas………………..128

CONCLUSIONES........................................................................................................131

BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………………….133

8
INTRODUCCIÓN

1. PAPEL EMERGENTE DE LOS GPCR DEORFANIZADOS EN LA

REGULACIÓN CARDIOVASCULAR

En los últimos años, la terminación de la primera parte del Proyecto Genoma Humano
ha traído consigo la identificación de una gran variedad de péptidos y proteínas
noveles, entre los que se encuentran un gran número de receptores acoplados a
proteína G (G-protein coupled receptors) o GPCRs, con funciones fisiológicas hasta el
momento desconocidas. En total, se calcula que en humanos existen unos 175 genes
que codifican para GPCRs cuyo ligando endógeno aún no ha sido determinado; este
tipo de receptores se denominan oGPCR (orphan GPCR) o GPCR “huérfanos”
(Katugampola y Davenport, 2003).

Recientemente, los ligandos para algunos de estos GPCR noveles han sido identificados
mediante el conjunto de procedimientos conocido como “farmacología inversa”.
Mediante técnicas de clonación de los GPCR en ADN complementario y rastreo de
genotecas con miles de proteínas diferentes, se ha llegado a la identificación de más
de 40 ligandos para estos receptores; entre ellos, moléculas que poseen una gran
influencia en la fisiología y/o fisiopatología vascular, como la urocortina, la apelina o la
Urotensina-II (Katugampola y Davenport, 2003).

En suma, aproximadamente un 40-50% de los fármacos de prescripción médica

actuales actúan sobre los GPCR, ya sea como agonistas o como antagonistas de éstos.
Sin embargo, estos fármacos tan sólo tienen como diana a unos 200 GPCR de entre
todos los existentes; lo cual indica que los, al menos, 800 restantes en cuyo
conocimiento aún no se ha profundizado constituyen un vasto terreno de dianas
terapéuticas por explorar (Summers, 2010; Cook, 2010).

Las proteínas G heterotriméricas constituyen uno de los componentes más relevantes

en cuanto a transducción de señales intracelulares. Estas proteínas específicas de

9
unión a nucleótidos de guanina (GTP/GDP) se componen de dos subunidades
principales: Gα y el dímero Gβ/Gγ. Los GPCR son una superfamilia de receptores
anclados a membrana plasmática que interaccionan en su cara citosólica con estas
proteínas G y transducen la señal extracelular de su ligando a una cascada de
señalización en el citoplasma celular (Tuteja 2009). Estos receptores se encuentran
presentes en todas las células eucariotas y también en una parte de las procariotas. Se
trata de la mayor familia de receptores de membrana plasmática; se calcula que
aproximadamente el 3-4% del genoma humano codifica para GPCRs, lo que se
traduciría en la expresión más de 1000 GPCR distintos, sin contar la formación de
homo y heterodímeros (Bai y col. 2004, Fredriksson y col. 2005). El primero de ellos en ser
descrito, el receptor β-adrenérgico, fue caracterizado en 1981 (Stadel y col. 1981).

Los GPCR se componen de siete regiones transmembrana en α-hélice, un extremo

amino-terminal extracelular y un extremo carboxilo en la cara citoplásmica. Estas siete
regiones transmembrana se encuentran conectadas a su vez por tres bucles
extracelulares y tres intracelulares. Las siete hélices constituyen en su conjunto un
núcleo central en forma de anillo, y las interacciones entre ellas favorecen el
mantenimiento de esta estructura terciaria (Tuteja 2009).

Los GPCR pueden unirse a ligandos extracelulares de muy diversa composición, como
nucleótidos, péptidos, aminas e iones Ca2+. En estado inactivo, la subunidad Gα de la
proteína G se encuentra unida a GDP, y a su vez al dímero Gβ/Gγ (figura 1). Cuando un
agonista se une al sitio activo del GPCR en su cara extracelular, éste sustituye el GDP
unido a Gα por GTP, teniendo así lugar un cambio conformacional en el receptor que
resulta en una disociación de Gα y el dímero Gβ/Gγ. Ambas subunidades difunden
entonces por el citosol, activando o inhibiendo una gran variedad de efectores que
continúan la cascada de señalización, como la adenil ciclasa o la fosfolipasa C (PLC).
Este proceso ocurre simultáneamente en muchas proteínas G unidas al receptor, y
tiene como consecuencia una ampliación de la señal recibida por el GPCR a través de
su agonista. Finalmente, el ciclo se cierra mediante la actividad GTPasa de la subunidad
Gα, que hidroliza el GTP en GDP y frena la cascada de señalización, restableciendo a la
proteína G en su estado inactivo inicial (Tuteja, 2009; Cook, 2010).

10
 Tuteja 2009

Figura 1. Ciclo de activación e inactivación de los GPCR y sus proteínas G asociadas.

Entre las rutas de señalización intracelular activadas por los GPCR en el sistema
cardiovascular, cabe destacar dos, cuyo efecto a corto plazo es la contracción del
músculo liso vascular: la vía dependiente de Ca2+, que opera a través de la PLC y
promueve liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico mediada por inositoI 1,4,5-
trifosfato (InsP3); y la vía de las RhoA/Rho-quinasas, responsable de la contracción
vascular por sensitización a Ca2+ (Somlyo y Somlyo 2003).

Entre los GPCR se encuentran moléculas con una gran influencia en la fisiología y
patología cardiovascular, como los receptores adrenérgicos β1, β2, α1 y α2, y varios
subtipos del receptor muscarínico de acetilcolina; también receptores de otros
importantes agentes vasoactivos como la angiotensina-II, endotelina, adenosina,
trombina y vasopresina (Drake y col. 2006). Uno de estos agentes vasoactivos y ligando
de un GPCR ya deorfanizado, la Urotensina-II, y su posible papel en algunos aspectos
de la fisiopatología vascular, es el objeto de estudio del presente trabajo.

11
2. LA UROTENSINA-II Y SU RELACIÓN CON LA FISIOPATOLOGÍA
CARDIOVASCULAR

2.1. Estructura y características generales

La Urotensina-II (U-II) es un péptido de 12 aminoácidos

que fue aislado por primera vez en 1967 del sistema
neurosecretor de peces teleósteos (Bern y col. 1985). Posee
una región cíclica de 6 aminoácidos altamente conservada
desde peces hasta humanos, tal y como se ilustra en la
figura 2 (Couluarn y col. 1998). Su receptor en humanos,
UTS2R, fue identificado en 1999 tras rastrear una
genoteca con el receptor GPR14 de rata, un GPCR sin
ligando hasta entonces conocido y que guarda cierta Maguire y Davenport, 2002.

homología con los receptores para somatostatina. GPR14 Figura 2. Isoformas de U-II
en distintas especies.
y UTS2R comparten un 75% de su secuencia (Couluarn y col.
1998, Ames y col. 1999).

De esta forma, se describió que UTS2R se expresa en diversas regiones del sistema
nervioso central, así como en tejido cardíaco y vascular, incluyendo células de músculo
liso y endoteliales de aorta, arteria coronaria y vena umbilical (Ames y col. 1999;
Couluarn y col. 1999; Maguire y col. 2000). La naturaleza de su ligando específico se
determinó al ser transfectado en células HEK293 y testado con más de 700 posibles
agonistas para GPCR en ensayos de movilización de Ca2+, donde sólo la U-II de pez
consiguió promover una respuesta significativa (Ames y col. 1999).

Una vez identificado el homólogo en humanos, cuya secuencia posee 11 aminoácidos

a diferencia de la isoforma presente en peces, varios experimentos dieron muestra de
su potencial importancia en la fisiopatología cardiovascular. Para empezar, se
comprobó que esta molécula se expresa en placas de ateroma procedentes de arteria
coronaria y que posee propiedades vasoconstrictoras mayores que la endotelina-I,

12
noradrenalina y serotonina; pero al contrario que la primera, limitadas tan sólo a la
parte arterial de la vasculatura (Ames y col. 1999).

Sin embargo, a la hora de hablar en profundidad de la relación de este péptido con el

sistema cardiovascular, deberíamos discernir entre sus efectos a corto plazo,
principalmente los que promueve en el tono vascular y que se encuentran mediados
por aumento en el Ca2+ intracelular; y aquellos a largo plazo, como su relación con
numerosos factores de riesgo cardiovascular y su posible implicación en procesos
fisiopatológicos.

2.2. Efecto agudo de la Urotensina-II en el sistema cardiovascular: regulación del

tono vascular

En mamíferos, la U-II es capaz de inducir una fuerte vasoconstricción en aorta torácica

(Gibson 1987; Rossowski y col. 2002; Tasaki y col. 2004). También es capaz de promover
contracción vascular en arteria coronaria (con el endotelio previamente eliminado) de
diferentes especies, como rata, mono, perro y humanos (Bottrill y col. 2000; Douglas y
col. 2000; Maguire y col. 2000). Sin embargo, esta vasoconstricción no tiene lugar en
ratones knockout para su receptor UTS2R, lo que demuestra la especificidad de dicho
efecto (Behm y col. 2003).

En humanos, la U-II promueve vasoconstricción independiente de endotelio con mayor

potencia que cualquier otro agonista conocido hasta la fecha, incluida la endotelina-1,
la noradrenalina y la serotonina (Maguire y Davenport. 2002). Sin embargo, este efecto
vasoconstrictor parece ser selectivo según el territorio vascular, ya que tiene lugar en
arteria coronaria, radial y vena umbilical (Maguire y col. 2000, 2004) pero no en arterias
pulmonares de pequeño calibre, arterias abdominales de resistencia y arterias o venas
subcutáneas (Stirrat y col. 2001, Hillier y col. 2001). En otros vasos, como arteria mamaria
o vena safena, este efecto vasoconstrictor no tiene lugar cuando el tejido endotelial se
encuentra intacto (Hillier y col. 2001). La U-II también es capaz de producir
vasodilatación dependiente de endotelio, o de las óxido nítrico sintasas de la capa
adventicia (Botrill y col. 2000, Lin y col. 2004). Este efecto diferencial promovido por la U-

13
II en la pared vascular sugiere que su función fisiológica en estos tejidos es
probablemente la regulación del tono vascular (Tasaki y col. 2004, Russell 2008).

El tipo de efecto que la U-II ejerce sobre un vaso determinado va a depender, por
tanto, del tipo de lecho vascular y del estado funcional de su capa endotelial (Douglas y
col. 2000, 2004); lo que da indicios de la importancia de la acción de este péptido en
procesos patológicos en los que se parte de una disfunción del endotelio.

2.3 Efectos a largo plazo de la acción de la Urotensina-II a nivel cardiovascular

2.3.1 Relación de la Urotensina-II con la fisiopatología cardiovascular

Desde los inicios de su estudio, se ha relacionado a la U-II con una gran diversidad de
factores de riesgo y eventos cardiovasculares. Varios estudios muestran que la
concentración de U-II en plasma se ve incrementada en pacientes con hipertensión
(Cheung y col. 2004), cardiopatía isquémica (Lapp y col. 2004), insuficiencia cardiaca (Ng y
col. 2002) y preeclampsia (Balat y col. 2005). En pacientes con insuficiencia cardiaca por
cardiopatía dilatada, estos niveles significativamente elevados de U-II en plasma se
correlacionan positivamente con los niveles de endotelina-1 y péptido cerebral
natriurético (BNP) (Gruson y col. 2005). Se la ha relacionado además con hipertrofia en
cardiomiocitos (Tzanidis y col. 2003, Onan y col. 2004). En placas de ateroma procedentes
de coronaria y carótida humana se ha encontrado también alta expresión de U-II,
especialmente en las regiones con elevada cantidad de macrófagos infiltrados (Maguire
y col. 2004, Suguro y col. 2007).

Por otra parte, existen evidencias que vinculan a la U-II con las alteraciones en el
metabolismo de la glucosa. Por ejemplo, la U-II es capaz de inhibir la liberación de
insulina en respuesta a glucosa en páncreas de rata (Silvestre y col. 2001, Marco y col.
2008) y algunos estudios resaltan su posible papel como indicador de aterosclerosis
carotídea en pacientes con diabetes tipo II (Suguro y col. 2008). Determinados
polimorfismos del gen de la U-II se han relacionado con resistencia a la insulina y
diabetes tipo II en la población japonesa (Suzuki y col. 2004); también en la población

14
española se ha encontrado asociación entre polimorfismos en el gen UTS2 y
parámetros relacionados con la resistencia a la insulina (Sáez y col. 2011).

Además, la potente vasoconstricción mediada por la U-II podría ser causa de

hipertensión arterial. Así, en ratas espontáneamente hipertensas se han observado
altos niveles de U-II en plasma en comparación con individuos control normotensos
(Song y col. 2002). En pacientes con hipertensión se han encontrado así mismo niveles
de U-II en plasma elevados con respecto a pacientes sanos, que además se
correlacionan positivamente con su presión sistólica y diastólica independientemente
del tratamiento farmacológico al que estuvieran sometidos estos pacientes (Cheung y
col. 2004). De esta forma, la U-II ha sido propuesta como un eslabón entre diversos
factores de riesgo, como la hipertensión arterial, y el desarrollo de procesos
fisiopatológicos a nivel cardiovascular (Watanabe y col. 2006).

Tomados en conjunto, todos estos datos indican que la U-II podría ser un importante
biomarcador y un factor clave en lo que se refiere a la presencia y el desarrollo de
enfermedades cardiovasculares (Watanabe y col. 2006, Ross y col. 2010). De hecho, el uso
de antagonistas de su receptor, como el B-611812, es capaz de atenuar la hipertrofia y
disfunción cardiaca causadas en modelos animales de ligación de la coronaria (Bousette
y col. 2006) así como el aumento del espesor de la neoíntima en ratas modelo de
reestenosis por angioplastia (Rakowski y col. 2005), disminuyendo así el daño por
remodelado tisular en procesos patológicos tanto a nivel cardiaco como vascular.

2.3.2 Urotensina-II y proliferación celular

Además de todos los efectos reseñados en los anteriores apartados, se ha descrito que
la U-II media la proliferación de las células de músculo liso vascular, mecanismo para el
cual se han propuesto diversas vías de señalización intracelular: las quinasas de
adhesión focal (FAK), la proteín quinasa C, la proteín quinasa activada por mitógeno
(MAPK), la vía de las RhoA/Rho quinasas, y la vía de las quinasas dependientes de
Ca2+/calmodulina (Peng y col. 2000; Sauzeau y col. 2001; Iglewski y Grant. 2010). En aorta
de conejo, esta proliferación de células de músculo liso vascular inducida por

15
Urotensina-II ejerce además un efecto sinérgico con LDL oxidadas, lisofosfatidilcolina
(LPC), H2O2 y serotonina (Watanabe y col. 2001, 2001b).

Algunas hipótesis postulan que la U-II podría actuar de forma autocrina y/o paracrina
en el tejido endotelial, induciendo de esa forma la proliferación y migración de las
células de músculo liso vascular (Watanabe y col. 2006), lo cual la relacionaría con el
desarrollo de la aterosclerosis en la pared vascular.

2.3.3. Urotensina-II y aterosclerosis

Además del incremento en la proliferación de las células de músculo liso vascular, la U-

II parece estar implicada también en otras características importantes de este proceso
fisiopatológico. En aorta torácica de rata, la U-II es capaz de incrementar la
permeabilidad de las células endoteliales, uno de los primeros tipos celulares en verse
afectado en esta patología (Gendron y col. 2004). En el endotelio de vena umbilical
humana, la U-II activa la proliferación e inhibe la apoptosis mediante la vía de las MAP
quinasas (Shi y col. 2005).

La U-II acelera además la formación en la placa de ateroma de las “foam cells” o

“células espumosas” a partir de macrófagos, mediante el aumento en la expresión de
ACAT-1 (Watanabe y col. 2005). También activa a la enzima NADPH oxidasa induciendo
la creación de especies reactivas de oxígeno (Djordjevic y col. 2005), que pueden
contribuir a acelerar el desarrollo de la placa de ateroma; y activa la formación de
fibras de estrés en el citoesqueleto de células de músculo liso de aorta, efecto que
parece tener lugar mediante la vía de las RhoA/Rho quinasas, implicadas en la
desensitización a Ca2+ (Sauzeau y col. 2001). Finalmente, en ratones knockout para la
Apolipoproteína E, que funcionan como modelo animal de aterosclerosis, la
sobreexpresión inducida del receptor de U-II es capaz de promover lesiones en la aorta
significativamente mayores que en ratones control (Papadopoulos y col. 2009).

Tomadas en conjunto, todas estas evidencias señalan la potencial implicación de la U-II

en el desarrollo de este proceso en la pared vascular.

16
2.4. Mecanismo de acción de la Urotensina-II

A pesar de la estrecha relación de la U-II con la fisiopatología del sistema

cardiovascular, y de todos los efectos que ejerce en él tanto a corto como a largo
plazo, aún no se conoce de forma exacta cuál es el mecanismo de señalización
activado en el interior celular a partir de su unión al receptor UTS2R.

Se han establecido diversas teorías sobre la vía por la cual la U-II ejerce su efecto en
contracción vascular. En los primeros estudios que se llevaron a cabo sobre la
vasoconstricción mediada por U-II en aorta torácica de rata, se describió relación entre
la primera fase de la contracción y la activación de los canales de Ca2+ voltaje-
dependientes (Gibson y col. 1988). Trabajos posteriores mostraron que la contracción
vascular inducida por U-II podía ser revertida, además, por inhibidores de la ruta de las
MAPK, de tirosín quinasas y de Rho quinasas, y se la relacionó con el sistema de
sensitización a Ca2+ mediado por Ca2+/calmodulina/cadena ligera de la miosina. Un
dato interesante a tener en cuenta es que el uso de inhibidores de la entrada de Ca2+
voltaje-dependiente no consigue revertir por completo la vasoconstricción promovida
por la U-II (Rossowski y col. 2002, Tasaki y col. 2004). Otros trabajos demuestran que la
administración de U-II eleva el nivel de InsP3 en aorta de conejo de forma dosis-
dependiente, en la misma medida en que promueve contracción vascular (Saetrum-
Opgaard y col. 2000). En la figura 3 se muestra un resumen de todas estas vías de acción
descritas en la literatura en base a diversos efectos de la U-II.

Sin embargo, y a pesar de los numerosos estudios al respecto, la vía o vías de

señalización por las cuales la U-II ejercería todos estos efectos a nivel vascular aún no
se encuentra claramente determinada.

17
 Papadopoulos y col. 2007

Figura 3. Esquema representativo

esentativo de las posibles vías de señalización intracelular activadas por la U-II
U en
células de músculo liso y endoteliales de la pared vascular.

Para elucidar los componentes implicados en esta ruta molecular, primero es

importante conocer los principales
principales mecanismos mediante los cuales las células de
músculo liso vascular regulan la homeostasis del Ca2+ intracelular, proceso clave en la
reactividad de este músculo y que a su vez se encuentra relacionado con dos de los
efectos inducidos por la U-II:
U II: la vasoconstricción y la proliferación del músculo liso
vascular.

3. REACTIVIDAD DEL MÚSCULO LISO VASCULAR

3.1. Estructura del músculo liso vascular

El músculo liso vascular es de tipo involuntario y de unidad múltiple; sus células son
capaces de contraerse de forma independiente. Se caracteriza por no presentar fibras
organizadas en sarcómeros, por esta
es a razón no posee las estriaciones características de
los músculos esquelético y cardíaco.

18
Su estructura se basa en la existencia de los cuerpos densos (equivalentes a las líneas Z
del músculo estriado) entre los cuales se extienden los filamentos de actina. En la
región central entre los cuerpos densos, solapándose con los filamentos de actina, se
localizan los filamentos gruesos de miosina, como se muestra en la figura 4. Las células
de músculo liso vascular (CMLV) presentan invaginaciones de la membrana plasmática
llamadas caveolas, bajo las cuales discurre la mayor parte del retículo sarcoplásmico
(RS), de una forma análoga a la distribución de los túbulos T y el RS en el músculo
estriado. Las uniones estrechas entre las CMLV sirven como anclaje mecánico para
evitar que las células se separen entre sí durante la contracción. Además, estas células
se organizan de forma circunferencial alrededor de la luz del vaso, facilitando así la
contracción vascular (Berne y Levy, 2006).

Figura 4. Estructura básica de una fibra de músculo liso, en la que se muestran los anclajes entre los
filamentos de actina (filamentos finos) y los de miosina (filamentos gruesos).

Por otra parte, la estructura de un vaso completo se compone de tres capas principales
o túnicas, que van de la luz del vaso al exterior (figura 5):

- Capa íntima: la constituye una monocapa de células endoteliales altamente

especializadas y multifuncionales, que a su vez descansa sobre una lámina
basal. El endotelio posee diversas funciones en la pared vascular, siendo una de
las más importantes contribuir a la regulación del tono vascular mediante la
síntesis de óxido nítrico. Sin embargo, también se encuentra implicado en

19
 funciones de adhesión celular, de inhibición de la coagulación sanguínea y de
transporte, entre otras.

- Capa media: formada mayoritariamente por células de músculo liso reforzadas

por capas organizadas de tejido elástico (lámina elástica). Esta capa es bastante
prominente en las arterias, más fina en venas y prácticamente inexistente en
vasos pequeños y/o capilares. El grado de contracción y relajación de las CMLV
se modula por hormonas y neurotransmisores, a través del sistema nervioso
autónomo y de los compuestos vasoactivos segregados por el tejido endotelial.

- Capa adventicia: se encuentra compuesta básicamente por colágeno y elastina,

pero también puede contener células de músculo liso, especialmente en venas.
(Stevens y Lowe, 2006).

Arce-Torres y col. 2008

Figura 5. Diferenciación de las distintas capas de tejido en el corte longitudinal de un vaso sanguíneo.

Existen dos tipos principales de arterias: las arterias elásticas o de conducción, como la
aorta torácica, que se caracterizan por poseer una capa media muy desarrollada y con
una alta cantidad de fibras elásticas organizadas en capas concéntricas. Por otro lado
están las arterias de resistencia o musculares, como la cerebral o la mesentérica, que
poseen una mayor proporción de CMLV en su capa media y menos capas de láminas
elásticas (Stevens y Lowe, 2006).

20
3.2. Papel del Ca2+ intracelular en la contracción vascular

La contracción del músculo liso vascular se encuentra modulada por la intervención de

hormonas y/o neurotransmisores que inducen un aumento en la concentración de Ca2+
citosólico en las CMLV. Algunos de estos agonistas actúan promoviendo una
despolarización de la membrana plasmática y la subsiguiente activación de los canales
de Ca2+ voltaje-dependientes presentes en ella (Berne y Levy, 2006). Otras de estas
sustancias, en cambio, actúan mediante diferentes rutas de señalización intracelular
que no requieren cambios en el potencial de membrana para su activación. Estas vías
se relacionan generalmente con la activación de la fosfolipasa C, que rompe el
fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2) produciendo diacilglicerol (DAG) e inositol
trifosfato (InsP3); éste último abre canales en la membrana del RS y promueve
liberación al citosol del Ca2+ almacenado en este orgánulo (figura 6). Algunos de los
agonistas capaces de contraer el músculo liso vascular mediante esta vía son la
angiotensina-II o la fenilefrina (Berridge y col. 1993, Potier y Trebak. 2008).

Extraído de www.uam.es (web de docencia de Fisiología de la Universidad Autónoma de

Madrid)

Figura 6. Vía de señalización intracelular de la contracción en miocitos de músculo liso.

21
El mecanismo de contracción del músculo liso vascular es ligeramente diferente al de
los músculos cardiaco y esquelético. El proceso en este caso recibe el nombre de “ciclo
de los puentes cruzados”. La miosina, componente de los filamentos gruesos, consta
de dos cadenas gruesas y dos ligeras. Una de estas cadenas ligeras (MLC20) al
fosforilarse mediante la acción de la quinasa de la cadena ligera (MLCK) que actúa de
forma dependiente de Ca2+/calmodulina, promueve la interacción de la actina con la
miosina y la contracción del músculo liso. La relajación muscular tiene lugar cuando
disminuye la concentración de Ca2+ intracelular y MLC20 se desfosforila por acción de
una fosfatasa específica (Berne y Levy, 2006; Hirano 2007).

El músculo liso vascular es de tipo tónico, por lo que es capaz de mantener la

contracción durante periodos de tiempo prolongados. Esto se lleva a cabo con poco
gasto de energía gracias a la existencia del denominado estado de interacción, en el
cual la cadena ligera de la miosina es desfosforilada por la fosfatasa cuando aún se
encuentra unida a los filamentos de actina, lo que ralentiza de forma considerable la
separación de ambos tipos de filamentos y el comienzo de otro ciclo de puentes
cruzados. La existencia del estado de interacción hace posible que el músculo liso
vascular permanezca contraído durante largos periodos de tiempo con el fin de
mantener el tono vascular (Berne y Levy, 2006).

Sin embargo, a la hora de hablar de este proceso, debemos tener en cuenta que un
aumento en la concentración de Ca2+ intracelular de la misma magnitud no siempre
produce el mismo grado de vasoconstricción. Esto depende de varios factores; por
ejemplo, la unión de un agonista a su receptor suele estimular una mayor
vasoconstricción que cuando ésta se induce por cambios en el potencial de membrana.
También tiene una gran influencia el curso temporal de la contracción: así, la fase
tónica de la contracción requiere menos aumento de Ca2+. Este tipo de fenómenos se
engloban dentro del proceso llamado “sensitización a Ca2+ de la maquinaria contráctil”
(Somlyo y Somlyo. 1993, Hirano 2007). De esta forma, el grado de contracción del
músculo liso vascular depende conjuntamente de la movilización de Ca2+ intracelular y
de la sensitización de las células musculares a éste.

22
La sensitización del músculo liso vascular puede operar de forma tanto dependiente
como independiente de la fosforilación de MLC20; en el primer caso, se considera que
la regulación de la actividad de la fosfatasa (MLCP) juega un mayor papel en estos
procesos. La fosforilación de MLCP por quinasas específicas tiene como consecuencia
una disminución de su actividad. Una de estas quinasas capaces de inhibir a MLCP es la
Rho quinasa, que se activa a su vez por RhoA, aumentando la sensitización del aparato
contráctil. La vía RhoA-Rho quinasas parece tener una gran relevancia en condiciones
fisiopatológicas, como modelos animales de hipertensión (Hirano 2007).

A pesar de todo, aún no está del todo clara la manera en que estos mecanismos se
regulan por los agonistas estimuladores de la contracción vascular; ni cuáles de ellos
juegan un papel verdaderamente relevante en condiciones fisiológicas.

3.3. Regulación de la homeostasis de Ca2+ intracelular

El Ca2+ es uno de los mensajeros intracelulares más importantes en prácticamente

todos los organismos existentes (Berridge y col. 2003, Kurosaki y Baba 2010), y se encarga
de regular una gran variedad de procesos, tanto a corto como a largo plazo. Sin
embargo, es tóxico para la célula a altas concentraciones. Así, aunque la concentración
extracelular de Ca2+ ronda los 10-3 mol/l, dentro de la célula debe mantenerse durante
la mayor parte del tiempo a concentraciones del orden de 10-7 mol/l, aunque en
estados temporales de activación puede llegar hasta 10-6 mol/l (Kurosaki y Baba 2010).
Por tanto, la homeostasis de Ca2+ en el citosol es un proceso fundamental en la
fisiología celular, y se compone de un balance continuo entre las vías de entrada de
Ca2+ desde el medio extracelular, los quelantes y efectores que se unen al ión una vez
dentro del citoplasma y los mecanismos que exportan Ca2+ de la célula o lo almacenan
en los reservorios intracelulares, principalmente el retículo sarcoplásmico en células
musculares (Berridge y col. 2003). En los siguientes apartados hablaremos más en
detalle de este proceso, que aparece reflejado de forma esquemática en la figura 7.

23
 Berridge y col. 2003

2+ 2+
Figura 7. Dinámica de la homeostasis de Ca intracelular. Este balance de Ca dentro de la célula
cataliza una gran variedad de procesos, tanto de forma prácticamente instantánea como a medio/largo
plazo.

3.3.1. El retículo endo/sarcoplásmico.

El retículo endo/sarcoplásmico (ER/SR) es un orgánulo de membrana que constituye

uno de los principales reservorios y fuentes de Ca2+ en células eucariotas. Además, el
retículo tiene como función principal establecer la conformación de las proteínas
recién sintetizadas mediante la acción de las chaperonas, de forma que se plieguen
correctamente y ejerzan su función de forma óptima. Posee así mismo otros
cometidos, como son el tráfico vesicular o la regulación del metabolismo del
colesterol. Es por ello que los niveles de Ca2+ en su interior deben mantenerse dentro
de unos rangos determinados para asegurar la correcta funcionalidad del orgánulo
(Parekh y Putney. 2005). Estos niveles de Ca2+ dentro del RS suelen estar en el orden de
100-700 µmol/l, concentraciones bastante más altas que las presentes habitualmente
en el citoplasma. Además, se estima que debe haber unas 10 veces más cantidad de
Ca2+ en el lumen del orgánulo unido con baja afinidad a quelantes, disponible para
movilizarse en forma libre en caso de que el orgánulo lo requiriera (Gwack y col. 2007).

24
Por tanto, el ER/SR dispone de moléculas específicas que median la liberación de Ca2+
desde su interior manteniendo estos niveles basales, entre las que destaca el inositol
trifosfato (InsP3). La fosfolipasa C, enzima que cataliza la síntesis de esta molécula,
posee diversas isoformas, cada una de las cuales se activa por un estímulo diferente
(Kelley y col. 2001); la dinámica de la producción de InsP3 dependerá, por tanto, del
receptor que active su síntesis.

Una vez liberado en el citosol, el InsP3 se une a su receptor específico en la membrana

del ER/SR (InsP3R), una proteína transmembrana anclada a la membrana de éste.
Funcionalmente, actúa en la membrana del retículo como un canal, y al abrirse
mediante facilita la liberación de Ca2+ al citoplasma (Miyawaki. y col 1990). Cuando el
InsP3 se une a su receptor, incrementa la sensibilidad de éste a Ca2+, de tal manera que
se activa a niveles citosólicos bajos del ión y se ve inhibido tras el vaciado del
reservorio, cuando en el citoplasma se alcanzan altas concentraciones de Ca2+.

El InsP3R pertenece a una familia de canales iónicos con seis dominios

transmembrana; sin embargo, este receptor es característico tanto por su localización
subcelular como por su regulación por InsP3. También actúan como agonistas del
InsP3R el propio ión Ca2+, uniéndose de forma directa o a través de la calmodulina
tanto en la cara citosólica del receptor como en la luminal; la proteín quinasa
dependiente de GMPc (PKG), la proteín quinasa C (PKC) y la proteín quinasa A (PKA)
(Carafoli y col 2001, Mikoshiba y col. 2007). Consta de tres isoformas, cada una de las
cuales posee diferente afinidad por InsP3 (Blondel y col. 1994, Mikoshiba y col. 2007). Su
estructura básica (ver figura 8) se divide en: un dominio amino terminal orientado al
lado citoplásmico, junto al sitio de unión a InsP3; un dominio modulador o “de
acoplamiento interno” que transduce la señal del InsP3, un dominio transmembrana
que forma el canal de Ca2+ y un dominio de apertura, que recibe la información desde
el dominio modulador y abre el canal mediante un cambio en su estructura (Mikoshiba
y col. 2007).

25
 Mikoshiba y col. 2007

Figura 8. Estructura de los dominios principales del receptor de InsP3 en la membrana del ER/SR.

Existe otro importante receptor en la membrana del RS que promueve la liberación de

Ca2+ al citosol: el receptor de rianodina (RyR), que se activa por otro tipo de agonistas,
como son la ADP ribosa cíclica (cADPR) y el ácido nicotin-adenin-dinucleótido fosfato
(NAADP), además de la cafeína (Lee y col. 1997, Carafoli 2002).

Por último, cabe destacar la presencia de la ATPasa de Ca2+ del RS (SERCA) que acopla
la hidrólisis de ATP con transporte de Ca2+ desde el citoplasma al lumen del retículo.
Esta bomba de Ca2+, que se encuentra anclada a la membrana del orgánulo, posee dos
funciones primordiales: asegurar que los contenidos de Ca2+ luminales se mantengan
dentro de unos niveles mínimos; y que la concentración del ión en el citoplasma
vuelva rápidamente a su nivel basal después de que tenga lugar una movilización de
Ca2+ por activación celular. La SERCA posee una tasa de transporte baja pero una alta
afinidad por Ca2+, por lo que es capaz de detectar variaciones muy pequeñas en la
concentración de Ca2+ citosólico y es esencial en el mantenimiento de la homeostasis
de Ca2+ intracelular (Wuytack y col. 2002).

3.3.2 Entrada de Ca2+ a través de la membrana plasmática.

La entrada de Ca2+ desde el medio extracelular tiene lugar sin gasto de energía para la
célula, debido a que fluye a través de la membrana a favor de gradiente

26
electroquímico (Berridge y col. 2003). Los principales canales iónicos encargados de
promover esta entrada de Ca2+ se encuentran representados en la figura 9 y se dividen
en:

- Canales regulados por voltaje (voltage-operated channels) (VOC) que se activan

ante una despolarización en el potencial de membrana (Berridge y col. 2003).
Hay muchos tipos de VOC en células excitables de mamíferos, de los cuales el
más abundante en células de músculo liso vascular es el tipo L. Presentan una
alta selectividad por Ca2+ con respecto a otros cationes como Na+, del orden de
1000:1 en soluciones fisiológicas (Gwack y col. 2007).

- Canales regulados por receptor (receptor-operated channels) (ROC), que se

abren ante la unión de un ligando en su cara extracelular, en la mayoría de los
casos un neurotransmisor. Este tipo de canales, al igual que el anterior, es
predominante en células excitables (Parekh y Putney. 2005).

- Canales regulados por segundos mensajeros (second messenger-operated

channels) (SMOC) que se encuentran modulados por moléculas de señalización
procedentes del interior celular, como diacilglicerol, ácido araquidónico o
AMPc. Estos canales pueden estar presentes tanto en células excitables como
no excitables, aunque no se encuentran tan ampliamente distribuidos como los
tipos anteriores (Parekh y Putney. 2005).

- Canales regulados por reservorio (store-operated channels) (SOC) cuya señal de

activación es la liberación de Ca2+ desde los reservorios intracelulares,
principalmente el ER/SR. Hablaremos en profundidad de este tipo de canales
en el apartado 4.

- Canales activados por estímulos físicos del medio extracelular, como son los
canales termosensores o los canales activados por estiramiento.

27
 - También el intercambiador Na+/Ca2+ (apartado 3.3.4) puede operar como vía de
entrada de Ca2+ desde el medio extracelular, cuando bajo determinadas
condiciones fisiológicas funciona en sentido inverso al habitual (Parekh y Putney.
2005).

Parekh y Putney. 2005

2+
Figura 9. Vías de entrada de Ca en la célula a través de la membrana plasmática.

Varios de estos canales se encuentran además englobados dentro de una relevante

familia de canales iónicos, la familia del receptor de potencial transitorio (canales TRP)
de la que hablaremos en el apartado 4.2.3 de este trabajo.

3.3.3 Proteínas de unión a Ca2+ en el citosol.

De todo el Ca2+ que entra en el citoplasma a través de canales iónicos o es liberado de

los reservorios, sólo una pequeña fracción permanece en forma libre. El resto se une a
los efectores que continúan su cascada de señalización intracelular; por ejemplo, la
calmodulina, que es capaz de activar a varios tipos de quinasas específicas y a la
fosfatasa calcineurina, mediando así los efectos del ión a largo plazo (Gwack y col.
2007). El Ca2+ también es quelado por los numerosos buffers o proteínas de unión
específicas presentes en el citosol, como la calbindina o la calretinina (Carafoli y col.
2001). La presencia de estas proteínas quelantes constituye una manera adicional de

28
regular la concentración de Ca2+ en el interior celular. La capacidad de cada tipo celular
de quelar Ca2+ en el citoplasma se estima mediante la tasa de unión a Ca2+ (Ks), que es
igual al cociente entre el Ca2+ unido a estas proteínas y el Ca2+ que difunde en el citosol
(Berridge y col. 2003).

3.3.4 La ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA) y el intercambiador Na+/

Ca2+.

Los mecanismos de exportación de Ca2+ al exterior celular contribuyen a la hora de

devolver la concentración de Ca2+ citoplásmico a sus niveles basales después de una
activación, o bien para adecuarla a los requerimientos específicos de la célula. Existen
dos mecanismos principales de exportación de Ca2+:

- La PMCA, que con gasto de energía expulsa Ca2+ al espacio extracelular en

contra de gradiente electroquímico.

- El intercambiador Na+/Ca2+, que transporta en direcciones opuestas tres

moléculas de Na+ por una molécula de Ca2+. En condiciones normales introduce
Na+ en el citosol y exporta Ca2+, pero también puede funcionar en sentido
inverso en determinadas circunstancias.

Cada uno de los diferentes mecanismos de exportación de Ca2+ al medio externo

posee distintas propiedades; así, el intercambiador Na+/Ca2+ se caracteriza por tener
baja afinidad por Ca2+ pero gran capacidad de transporte, ocurriendo al contrario con
la PMCA, que sería por tanto más sensible a pequeños cambios en la concentración del
Ca2+ citosólico (Carafoli 2002). De esta forma, al poseer exportadores con distintas
características cinéticas, la célula se encuentra siempre preparada para satisfacer las
demandas necesarias en lo que respecta a la regulación del Ca2+ intracelular.

29
3.3.5. La mitocondria.

En condiciones fisiológicas, la mitocondria también juega un papel relevante en la

homeostasis del Ca2+ intracelular. Las primeras evidencias de la existencia de
transporte de Ca2+ desde el citosol a la matriz mitocondrial (en músculo cardiaco) se
remontan a los años 50, antes incluso de haberse determinado el papel que el RS
juega en la regulación del Ca2+ intracelular (Slater and Cleland. 1953, Carafoli 2002).
Posteriormente se descubrió que existe un transportador específico en la membrana
interna del orgánulo, el uniportador mitocondrial, que introduce Ca2+ del citosol a la
matriz; varios estudios demuestran además la existencia de un intercambiador
Na+/Ca2+ específico de la membrana mitocondrial (Carafoli 2002). Este tipo de
transporte, sin embargo, posee muy baja afinidad por Ca2+, y sólo funciona a pleno
rendimiento a concentraciones citosólicas del ión del orden de 10-5 mol/l. Se piensa
que podría activarse ante subidas repentinas de Ca2+ en microdominios cercanos al
orgánulo (Rizzuto y col. 1993).

------------------------

En definitiva, la homeostasis de Ca2+ es un proceso altamente complejo, en el que la

pérdida de uno de los componentes que lo constituyen se traduce en la aparición de
un mecanismo compensatorio. En las últimas décadas se ha ahondado de forma
notable en el conocimiento de una de las vías de entrada de Ca2+ en la célula, la vía de
los canales SOC; la que originariamente se considerara una vía secundaria y con una
funcionalidad concreta ha demostrado poseer una importante relevancia en gran
variedad de procesos fisiológicos y patológicos en diversos tipos celulares, entre ellos
el músculo liso vascular.

30
4. CANALES DE CALCIO REGULADOS POR RESERVORIO (STORE-
OPERATED CALCIUM CHANNELS).

4.1 Descubrimiento y concepto de la entrada de Ca2+ regulada por los reservorios

Las primeras evidencias de una vía de señalización de Ca2+ relacionada con el vaciado
de los reservorios intracelulares fueron descritas en 1986, en células procedentes de
glándula salivar. A partir de este trabajo se formuló la hipótesis de que el Ca2+
contenido en el ER/SR podía regular de alguna manera la entrada de Ca2+ en la célula,
proceso que se denominó originariamente como entrada capacitativa de Ca2+ y que se
representa en la figura 10 (Putney 1986).

1986 1990

Putney 1990

2+
Figura 10. Esquemas ilustrativos de la entrada de Ca regulada por los reservorios. En condiciones
fisiológicas, ésta tiene lugar por medio de agonistas que promueven síntesis de InsP3 en el citosol.

Pero fueron los estudios electrofisiológicos en mastocitos llevados a cabo por Hoth y
Penner en 1992 los que por primera vez determinaron de forma directa la existencia
de una corriente de Ca2+ inducida por la liberación del ión desde los reservorios, a la
que se llamó ICRAC o corriente de Ca2+ activada por liberación de Ca2+ (Ca2+ release-
activated Ca2+ current) (Hoth y Penner. 1992). En los años posteriores, se establecieron
las características electrofisiológicas de esta corriente. También se determinó su
presencia en muchos tipos celulares, principalmente en células hematopoyéticas como

31
linfocitos y macrófagos, aunque también en otros tipos celulares como hepatocitos y
CMLV (Parekh y Penner. 1997; Lewis y col. 1999; Parekh y Putney. 2005; Potier y col. 2009).

La entrada de Ca2+ regulada por los reservorios o SOCE (store-operated calcium entry)
se puede inducir en condiciones in vitro por cualquier procedimiento que promueva el
vaciado del ER/SR. Los más comunes consisten en tratamiento de la célula con
inhibidores de la SERCA, como la tapsigargina (TG) o el ácido ciclopiazónico (CPA), o
bien con altas concentraciones de quelantes de Ca2+; ambos métodos propician el
vaciado pasivo del orgánulo. Sin embargo, a nivel fisiológico los SOC se activan
principalmente por aumento en los niveles de InsP3 citosólicos, lo que conlleva la
unión del InsP3 a su receptor específico en la membrana del ER/SR y la posterior
liberación de Ca2+ desde su interior (Parekh y Putney, 2005).

En principio, se creía que la única función significativa de la SOCE era la de llenar el

retículo previamente vaciado, con el fin de preservar los niveles de Ca2+ basales que
éste necesita para mantener su funcionalidad (Putney. 2007). Sin embargo, con el paso
de los años se caracterizaron las muchas otras funciones que este tipo de entrada de
Ca2+ es capaz de ejercer, de algunas de las cuales hablaremos en detalle en los
apartados 4.3.1 y 4.3.2. Actualmente, se sabe que la SOCE es una vía indispensable en
todos los tipos de células eucariotas (Parekh y Putney. 2005) y que los canales
encargados de activar esta vía juegan un papel esencial en numerosos procesos, que
van desde la exocitosis hasta la regulación de la expresión génica (Putney y McKay,
1999).

4.2 Vía de señalización de la SOCE

A la hora de estudiar la vía de señalización vinculada a los SOC, el proceso clave a tener
en cuenta y que a pesar de todos los estudios al respecto aún no se encuentra
totalmente elucidado, es el mecanismo de conexión existente entre el sensor que
detecta la bajada de los niveles de Ca2+ en el interior del ER/SR y la activación del canal
o canales presentes en la membrana plasmática (Parekh y Putney. 2005, Vaca y col. 2010).

32
Hasta hace pocos años, las teorías formuladas en base a esta conexión se podían
resumir en dos hipótesis principales:

- Existe un mensajero soluble que difunde por el citosol y transmite la

información entre las dos partes del sistema; en esta hipótesis, se propuso
como mensajero al llamado factor de entrada de calcio o calcium influx factor
(CIF). Se trata de un factor no proteico liberado por el retículo endoplásmico de
linfocitos Jurkat-T tras el vaciado de los reservorios, y capaz de inducir SOCE al
inyectarse en oocitos de Xenopus (Randriamampita y Tsien. 1993, Thomas y
Hanley. 1995, Csutora y col. 1999, Bolotina y Csutora. 2005).

- La membrana del ER/SR y la membrana plasmática se unen físicamente

formando un complejo macromolecular (teoría del acoplamiento
conformacional) (Tregear y col. 1991, Berridge 1995, Rosado y col. 2000), de una
forma análoga a la excitación-contracción en el músculo esquelético, donde los
canales de Ca2+ voltaje-dependientes interaccionan directamente con el
receptor de rianodina en el RS (Potier y Trebak. 2008). En esta teoría, se propuso
inicialmente al receptor para InsP3 como la molécula que interaccionaría con el
canal en la membrana plasmática (Berridge 1995).

Sin embargo, fue necesario replantear todas las hipótesis acerca de la vía de
señalización de la SOCE en 2005 y 2006, con la caracterización de dos proteínas claves
en dicha ruta: Stim y Orai.

4.2.1 Stim1.

En 1996, Parker y colaboradores describieron la presencia de un gen al que llamaron

GOK y que inicialmente se relacionó con la supresión tumoral (Parker y col. 1996); no
fue hasta casi una década después cuando se describió la función de la proteína para
la que codificaba y su papel en la homeostasis de Ca2+ intracelular.

33
En 2005, y de forma casi simultánea, dos laboratorios describieron la presencia de esta
proteína, a la que se llamó stromal interacting molecule o molécula de interacción con
el estroma (Stim), en células S2 de Drosophila (Roos y col. 2005) y la línea celular
humana HeLa (Liou y col. 2005). El silenciamiento de Stim1, pero no el de Stim2 (este
subtipo sólo presente en mamíferos) es capaz de reducir considerablemente la SOCE
en HEK-293 y linfocitos Jurkat T (Roos y col. 2005). Además, cuando disminuyen los
niveles de Ca2+ del retículo, Stim1 se oligomeriza en la membrana del orgánulo en una
estructura conocida como puncta, acercándose a la membrana plasmática (figura 11).
Estos datos demostraron que Stim1 constituía el hasta entonces desconocido sensor
de los niveles de Ca2+ en el ER/SR, y su papel como activador de los canales SOC en la
membrana plasmática (Liou y col. 2005, Zhang y col. 2005, Mercer y col. 2006, Putney 2007,
Cahalan 2009).

Gwack y col. 2007

Figura 11. Organización en puncta de las moléculas de Stim1 en la membrana del ER/SR tras el vaciado
de los reservorios.

Stim1 es una proteína transmembrana anclada al retículo por un único dominio, tal y
como se ilustra en la figura 12. Consta de un dominio EF-hand próximo a su extremo
amino terminal y orientado hacia el lumen del retículo. Esta región posee una KD de
unión a Ca2+ de 200-600 µmol/l, similar a los niveles del ión en el interior del ER/SR; y
se trata, por tanto, del dominio encargado de sensar los niveles de Ca2+ dentro del
orgánulo (Liou y col. 2005). La disociación de Ca2+ de este dominio al vaciarse el retículo
es el estímulo que induce la agrupación de Stim1 en puncta (Putney 2007; Kurosaki y
Baba 2010). Además, mutaciones en esta región de la proteína, que reducen su

34
afinidad por Ca2+, tienen como consecuencia una activación celular constitutiva de la
vía SOC (Zhang y col. 2005). Stim1 posee también un dominio estructurado en α que
podría encontrarse implicado en su oligomerización; su extremo carboxilo terminal
parece ser el responsable de la interacción de Stim1, una vez estructurado en puncta,
con la membrana plasmática o con otras proteínas accesorias que puedan intervenir
en la señalización de la SOCE (Ong y Ambudkar, 2011).

Parekh 2010

Figura 12. Estructura de la molécula de Stim1 insertada en la membrana del RS.

Sin embargo, mientras que algunos autores defienden la teoría de que Stim1, después
de organizarse en puncta, se transloca a la membrana plasmática (Zhang y col. 2005,
Spassova y col. 2006) otros muchos estudios no han conseguido detectar su inserción en
tal estructura tras el vaciado de los reservorios (Liou y col. 2005, Mercer y col. 2006, Xu y
col. 2006, Wu y col. 2006). Una hipótesis intermedia entre estos resultados dispares
sugiere que Stim1 no se transloca a la membrana tras agregarse en puncta, y que
aunque existen moléculas de Stim1 localizadas en la membrana plasmática, cumplen
una función distinta a la de la activación de la SOCE (Putney 2007).

Además, Stim1 es capaz de activar otro tipo de canales de naturaleza completamente

distinta a los SOC. Es el caso de los canales selectivos para Ca2+ regulados por ácido
araquidónico (ARC channels). Esta función adicional de Stim1 es independiente del

35
vaciado de los reservorios y parece encontrarse mediada principalmente por las
moléculas de Stim1 ancladas en la membrana plasmática (Mignen y col. 2007).

En cuanto a Stim2, ha sido propuesto como un regulador de las concentraciones

citosólicas de Ca2+, dado que esta molécula se encuentra activa cuando el Ca2+ dentro
del retículo se encuentra en sus niveles basales, y puede promover la SOCE con
vaciado de los reservorios de menor magnitud (Brandman y col. 2007). Sin embargo,
otras evidencias descartan que esta proteína esté implicada en la activación de la
SOCE; algunos autores sugieren que funciona como inhibidor de dicha vía en las líneas
celulares HEK293 y A7r5 (Soboloff y col. 2006).

4.2.2 Orai.

En 2006, Feske y colaboradores determinaron la existencia de la proteína Orai1,

mediante un genotipado entre los individuos de una familia con inmunodeficiencia
hereditaria combinada severa (SCID) asociada a la pérdida de la corriente ICRAC. En este
mismo trabajo, Orai1 fue también localizada en células S2 de Drosophila e identificada
como la proteína que origina la entrada de Ca2+ inducida por el vaciado del retículo
(Feske y col. 2006). Poco después, otros dos grupos corroboraron que la presencia de
Orai1 es indispensable para la entrada de Ca2+ regulada por los reservorios (Vig y col.
2006, Yeromin y col. 2006).

Orai1 se localiza en la membrana plasmática y posee 4 dominios transmembrana

(figura 13). Tanto su extremo amino como el carboxilo se encuentran en su cara
citoplásmica, así como un 60% de la proteína (Maruyama y col. 2009). Varios estudios
sugieren que podría funcionar estructuralmente como dímero y como tetrámero
(Gwack y col. 2007, Maruyama y col. 2009). Cuando se coexpresa junto con Stim1 en
células HEK293, es capaz de inducir corrientes ICRAC de tamaño mayor al usual, pero
con las mismas propiedades electrofisiológicas y farmacológicas (Mercer y col. 2006,
Peinelt y col. 2006). Además, determinadas mutaciones en las hélices transmembrana 1
y 3 modifican la corriente ICRAC y su selectividad a Ca2+ con respecto a cationes
monovalentes como Na+ y Cs+ (Prakriya y col. 2006); también mutaciones en uno de sus

36
bucles extracelulares son capaces de alterar las características propias de la corriente
ICRAC (Vig y col 2006). Todas estas evidencias demuestran que Orai1 forma parte del
propio poro del canal SOC, y que Stim1 y Orai1 constituyen los principales
componentes de ICRAC.

Parekh 2010

Figura 13. Estructura básica y dominios principales de la proteína Orai1.

Existen otras dos isoformas de Orai en mamíferos, Orai2 y Orai3, las cuales también se
encuentran implicadas en la entrada de Ca2+ regulada por los reservorios, y son
capaces de promover corrientes de Ca2+ cuando se coexpresan con Stim1 en células
HEK293, aunque de menor tamaño a las inducidas por Orai1 (Mercer y col. 2006). Estas
isoformas se diferencian de Orai1 en sus patrones de selectividad iónica, regulación
por Ca2+ intracelular e inhibición farmacológica (Peinelt y col. 2008). Por ejemplo, el 2-
aminoetildifenil borato (2APB) un inhibidor de la vía SOC ampliamente usado (Bootman
y col. 2002) es capaz de inhibir las corrientes iónicas mediadas por Orai1, pero sin
embargo activa aquellas inducidas por Orai3 (Peinelt y col. 2008, Zhang y col. 2008). Estas
diferencias en las propiedades biofísicas de las isoformas de Orai podrían explicar la
heterogeneidad existente entre las corrientes SOC procedentes de distintos tipos
celulares (Potier y Trebak, 2008). Además, Orai2 y 3 podrían formar heteromultímeros
con Orai1 en diferentes clases de células (Peinelt y col. 2008). En cualquier caso, es
necesario un estudio más exhaustivo de las posibles interacciones entre las distintas
isoformas de Orai en diferentes tipos celulares y tejidos.

37
4.2.3 Canales TRPC.

La familia de canales del receptor de potencial transitorio (transient receptor potential

o TRP) fue identificada por primera vez en 1991 en Drosophila como un
canal/transportador de Ca2+ implicado en fototransducción (Minke y Selinger. 1996). Sus
homólogos en mamíferos codifican para un total de 28 canales catiónicos no selectivos
con distintas permeabilidades a Ca2+. Esta familia consta a su vez de tres grandes
subfamilias: TRP canónicos (TRPC), TRP vanilloides (TRPV) y TRP de melastatina
(TRPM). De entre ellas, los TRP clásicos o canónicos destacan como potenciales
participantes en la SOCE.

La subfamilia de TRPC se compone de siete proteínas, TRPC1-TRPC7, de las cuales

TRPC2 no existe como gen completo en humanos, sino como pseudogen. Todas ellas
constan de una estructura básica compuesta de seis dominios transmembrana, con la
región que forma el poro situada entre el quinto y el sexto. Ambos extremos de la
proteína se localizan en su cara citosólica; el extremo carboxilo terminal se encuentra
altamente conservado y el extremo amino presenta varios dominios de ankyrina. Cada
una de estas regiones parecen constituir sitios de unión a otras proteínas (Ong y
Ambudkar, 2011). De hecho, se ha descrito que los TRPC funcionan como
heterotetrámeros in vivo; por ejemplo, en interacciones de TRPC1 con TRPC4 y TRPC5.

Todas las isoformas de esta subfamilia, salvo TRPC2 y TRPC7, pueden activarse por
promotores de la SOCE. TRPC1, por ejemplo, ha sido relacionado con la vía SOC en
muchos tipos celulares, como células de glándula salivar (Liu y col. 2007), células
acinares pancreáticas (Hong y col. 2011) y células de músculo liso vascular (Brueggemann
y col. 2006). Además, diversas combinaciones de TRPCs, como TRPC1/TRPC3 y
TRPC1/TRPC4, median entrada de Ca2+ vía SOC en células de hipocampo, HEK-293 y
células endoteliales (Albert y col. 2007).

TRPC1 se encuentra presente en una gran variedad de tejidos y está implicado en

funciones fisiológicas como secreción, proliferación y diferenciación celular, entre
otras. Existe cierta variabilidad en la selectividad por Ca2+ de los canales formados por

38
TRPC1, debido en parte a su capacidad para agruparse en heteromultímeros. Se ha
descrito que TRPC1 puede constituir un complejo macromolecular con componentes
de la SOCE, como la SERCA, la PLC y el InsP3R (Ong y col. 2007); o de forma general, con
otras moléculas relevantes en la señalización de Ca2+, como la calmodulina. Más
recientemente se ha demostrado que Stim1, Orai1 y TRPC1 forman un complejo
macromolecular regulado por componentes del citoesqueleto, con los que TRPC1 es
capaz de asociarse (Galán y col. 2011, Ong y Ambudkar 2011). Este modelo de interacción
se encuentra esquematizado en la figura 14.

Ong y Ambudkar, 2011

Figura 14. Esquema propuesto para la interacción entre las proteínas Orai1 y TRPC1 tras el vaciado de
los reservorios.

Se ha sugerido también que los complejos que TRPC1 forma con distintas proteínas
podrían estar asociados con la membrana del ER/SR y con la membrana plasmática al
mismo tiempo, en regiones donde ambas estructuras se encuentran próximas. Esto
facilitaría el mecanismo de activación y desactivación de la SOCE, lo que concuerda
con estudios previos que demuestran que esta vía de entrada de Ca2+ tiene lugar en
microdominios celulares, como las caveolas de membrana (Ong y Ambudkar, 2011).

Sin embargo, no en todos los tipos celulares se ha descrito relación de los TRPC con la
entrada de Ca2+ vía SOC. Estos canales no parecen implicados en dicho proceso en
células que presentan de forma típica la corriente ICRAC, como mastocitos y linfocitos

39
Jurkat T; de lo que podría deducirse que ninguno de los TRPC son componentes de
esta corriente, aunque sí puedan serlo de otras corrientes SOC (Kim y col. 2009, Ong y
Ambudkar, 2011).

4.2.4 Comunicación entre Stim, Orai y otras moléculas participantes en la SOCE.

La teoría más aceptada acerca de la comunicación entre Stim1 y Orai es que Stim1, al
organizarse en puncta, se transloca a regiones cercanas a la membrana plasmática
para interaccionar directamente con Orai. Favoreciendo esta idea existen estudios que
demuestran que Stim1 y Orai1 coinmunoprecipitan, efecto que es más patente cuando
se ha inducido previamente el vaciado de los reservorios (Yeromin y col. 2006); Wu y
colaboradores también observaron una interacción cercana entre Stim1 y la
membrana plasmática, de tan sólo 10-25 nm (Wu y col. 2006). No obstante, otros
trabajos han conseguido estudiar las uniones que tienen lugar entre la membrana del
ER y la membrana plasmática tras el vaciado de los reservorios y la reorganización de
Stim1, y describen que Orai1 requiere un espacio en estas uniones de unos 11-14 nm
dentro del citoplasma, considerablemente mayor de lo que cabría esperar por la
longitud de su secuencia. Esto indica que Orai1, a la hora de promover la SOCE,
probablemente interacciona con otras proteínas además de con Stim1, formando un
complejo macromolecular (Várnai y col. 2007).

De igual manera, y dada la complejidad de esta vía, tampoco existen evidencias que
permitan descartar la implicación de otro tipo de moléculas anteriormente descritas
en la SOCE, como el factor de entrada de Ca2+ (CIF) o la fosfolipasa A2 independiente
de Ca2+ (iPLA2) (Putney 2007).

4.2.5 Fosfolipasa A2 independiente de Ca2+ (iPLA2) y su papel en la SOCE.

Las fosfolipasas A2 son una familia de enzimas encargadas de catalizar la ruptura de

fosfolípidos en ácidos grasos y lisofosfolípidos. Esta familia se divide en varios grupos,
de la cual los principales son: los grupos I, II y III, constituidos por las fosfolipasas A2
secretoras (sPLA2), que requieren concentraciones milimolares de Ca2+ para su

40
correcto funcionamiento y se almacenan en vesículas dentro del citoplasma; el grupo
IV, formado por las fosfolipasas A2 citosólicas (cPLA2) que son funcionales a
concentraciones de Ca2+ micromolares; y el grupo VI, constituido por una serie de
enzimas cuyo peso molecular ronda los 85-88 kD, denominadas fosfolipasas A2
independientes de Ca2+ o iPLA2; y que se caracterizan en que no requieren la unión de
Ca2+ en su sitio activo para llevar a cabo la reacción catalítica. Este grupo de enzimas se
encuentra presente tanto en el citosol como en estructuras de membrana (Akiba y
Sato. 2004).

El grupo VI de iPLA2 fue identificado a partir de la línea celular P388D (Kim y col. 1989).
La proteína presenta ocho dominios similares a ankyrina (Winstead y col. 2000) y la
secuencia consenso GXSTG, común a otras lipasas de la familia (Hazel y col. 1991). A
pesar de no depender de Ca2+ para su funcionalidad, sí se ha descrito que la iPLA2
forma un complejo con la proteína de unión a Ca2+ calmodulina en estado inactivo; de
tal forma que cuando iPLA2 se encuentra libre, su sitio activo interacciona con el
dominio de unión a calmodulina adquiriendo así funcionalidad catalítica (Wolf y Gross.
1996; Jenkins y col. 2001; Bolotina 2008).

Dado que la iPLA2 cataliza la ruptura de fosfolípidos, su función principal en la célula se

encuentra ligada al remodelado de los componentes de la membrana celular (Balsinde
y Dennis, 1997). Sin embargo, los productos de su catálisis (ácido araquidónico,
lisofosfatidilcolina y lisofosfatidilinositol) actúan a su vez en el citosol como segundos
mensajeros que inician cascadas de señalización en el interior celular (Winstead y col.
2000) lo cual indica que esta enzima juega un importante papel fisiológico, y no tan
sólo de mantenimiento estructural, en diversos tipos celulares (Smani y col. 2003).

Ya en la década de los 90 se describió que agonistas inductores del vaciado de los

reservorios, como la arginina vasopresina y la tapsigargina, promovían la liberación de
ácido araquidónico en células de músculo liso, efecto que se veía inhibido tras la
aplicación de BEL (inhibidor específico de la enzima), o de un antagonista de la
calmodulina (Wolf y col. 1997). El mismo fenómeno fue descrito poco después en islotes
pancreáticos (Nowatzke y col. 1998).

41
Fue, sin embargo, en 2003 cuando salieron a la luz las primeras evidencias del papel
esencial que la actividad de esta enzima juega en la SOCE. Experimentos llevados a
cabo en células de músculo liso de aorta demostraron que la inhibición tanto
molecular como farmacológica de iPLA2 era capaz de abolir la entrada de Ca2+ inducida
por tapsigargina, así como las corrientes SOC activadas tras el vaciado de los
reservorios (Smani y col. 2003). Más tarde se determinó además que antagonistas de la
calmodulina, que la desplazan de iPLA2 activando a la enzima, son capaces de imitar la
entrada de Ca2+ regulada por los reservorios y las corrientes de Ca2+ mediadas por esta
misma vía. También se describió que el factor de entrada de Ca2+ (CIF) es capaz de
activar a iPLA2 desplazando a la calmodulina; y que, de los subproductos de iPLA2, son
los lisofosfolípidos (lisofosfatidilinositol y lisofosfatidilcolina) y no el ácido
araquidónico, los responsables de activar la SOCE, siguiendo el esquema propuesto en
la figura 15 (Smani y col. 2004).

Smani y col. 2004

Figura 15. Modelo propuesto para la interacción entre iPLA2 y los canales SOC, por medio de los
lisofosfolípidos producto de su catálisis.

Todas estas evidencias hacen a esta enzima un factor clave a tener en cuenta a la hora
de estudiar la vía de señalización de la SOCE.

42
4.3. La entrada de Ca2+ a través de los SOC en el músculo liso vascular

4.3.1. Canales SOC y su influencia en el tono vascular.

Las primeras corrientes mediadas por la vía SOC en músculo liso se registraron en
1996, en células de músculo anococcígeo de ratón (Wayman y col. 1996). Desde
entonces, se han detectado corrientes activadas por ácido ciclopiazónico (CPA) o
tapsigargina en diferentes tipos celulares de músculo liso, con distintas conductancias
y con variaciones en la ratio de permeabilidad Ca2+/Na+, que en cualquier caso es
considerablemente menor que la que posee ICRAC en células no excitables. Esto sugiere
que los canales SOC en músculo liso son principalmente canales catiónicos con mayor
o menor permeabilidad por Ca2+; y que las discrepancias entre estas corrientes según
el tipo celular de músculo liso, así como las diferencias de todas ellas con respecto a
ICRAC, se deben a variaciones en la composición molecular del canal (por ejemplo,
asociaciones de Orai con algunas isoformas de TRPC) (Albert y col. 2007).

Inicialmente se creía que la única función de la SOCE en músculo liso vascular era la de
volver a llenar el retículo sarcoplásmico tras su vaciado, y que esta vía de entrada de
Ca2+ carecía de relevancia en cuanto a activación celular. No obstante, en la actualidad
hay una gran cantidad de trabajos que demuestran no sólo la presencia de SOCE en
células de músculo liso vascular de diferentes vasos, como aorta, arteria pulmonar,
arteria coronaria o en líneas celulares (A7r5); sino que relacionan esta entrada de Ca2+
con un aumento en el tono vascular (Kwan y col. 1994, González de la Fuente y col. 1995,
Iwamuro y col. 1999, Smani y col. 2007). Según el tipo de vaso, esta vasoconstricción
puede ser sensible al uso de antagonistas de los canales voltaje-dependientes, como la
nifedipina. Esto indica que, cuando hablamos de contracción vascular mediada por
SOCE, debe existir alguna clase de conexión entre ambos tipos de canales. Sin
embargo, tanto la SOCE promovida por agonistas como aquella inducida por vaciado
pasivo del retículo tienen también un componente independiente de la vía regulada
por voltaje (Leung y col. 2008).

43
Como se representa en la figura 16, cuando la SOCE la originan agonistas que
promueven síntesis de InsP3, el Ca2+ contenido en el RS se libera de una forma rápida
al citoplasma, señal que puede verse amplificada por activación del receptor de
rianodina. Este aumento drástico en la concentración de Ca2+ intracelular activa a los
canales de Ca2+ dependientes de Cl-, lo que a su vez ocasiona cambios en el potencial
de membrana y abre los canales de Ca2+ voltaje-dependientes (Gibson y col. 1998, Leung
2+
y col. 2008). La bajada de los niveles de Ca en el interior del RS induce la apertura de
los canales SOC, que mantienen la contracción vascular y aseguran el llenado de los
reservorios al final del proceso. Por otra parte, el diacilglicerol producido por la
fosfolipasa C puede activar a la PKC y promover la sensitización a Ca2+ del aparato
contráctil. Algunos de estos agonistas, además de promover SOCE, activan la vía de las
Rho quinasas que también es responsable de la sensitización a Ca2+ (Gibson y col. 1998).

Leung y col. 2008

Figura 16. Modelo propuesto para la excitación-contracción en el músculo liso vascular, en el que la
2+
entrada de Ca vía SOC se encuentra ligada a los canales VOC.

Por otra parte, el óxido nítrico procedente del tejido endotelial, además de actuar
sobre la vía voltaje-dependiente, inhibe la SOCE a través de GMP cíclico, promoviendo
el llenado del retículo y mediando vasodilatación (Wayman y col. 1996, Kwan y col. 2000).

44
En cualquier caso, en músculo liso vascular los canales SOC constituyen, junto con los
ROC, la principal vía de entrada de Ca2+ independiente de cambios en el potencial de
membrana. A ambos tipos de canales se les relaciona con los canales TRPC.

Las isoformas de TRPC que expresa el músculo liso vascular varían según el tipo de
vaso; así, en aorta de rata se ha descrito expresión de TRPC1, 3, 4, 5 y 6, pero no de
TRPC2 ni de TRPC7 (Facemire y col. 2004). Se ha descrito un aumento en la expresión
tanto de la SOCE como de los TRPC en arteria pulmonar de ratas hipertensas (Liu y col.
2012). También hay varios trabajos que muestran como la inhibición de TRPC1, llevada
a cabo tanto por tratamiento con anticuerpos específicos como por silenciamiento
molecular, es capaz de reducir las corrientes y/o entrada de Ca2+ vía SOCE en diversos
tipos de músculo liso, como aorta y mamaria humanas (Xu y Beech. 2001), arteria
pulmonar (Sweeney y col. 2002) arteria mesentérica (Saleh y col. 2006) y la línea celular
A7r5 (Brueggemann y col. 2006). De la misma forma, anticuerpos contra TRPC5 son
capaces de inhibir la SOCE em arteriolas piales (Xu y col. 2006). Algunos autores
proponen que estas dos isoformas de TRPC pueden formar heterotetrámeros entre sí
para mediar la SOCE en músculo liso (Albert y col. 2007).

Sin embargo, la vasoconstricción no es el único efecto que la entrada de Ca2+ vía SOC
puede ejercer en músculo liso vascular. También se han descrito efectos a largo plazo
relacionados con la señalización de Ca2+ intracelular, entre los que se encuentran la
activación de factores de transcripción reguladores de la expresión génica y la
proliferación celular.

4.3.2. Canales SOC, regulación de la expresión génica y proliferación de CMLV.

En CMLV, existen varios factores de transcripción que regulan la expresión génica en

base a la concentración de Ca2+ intracelular. Dos de los más estudiados son el factor
nuclear de células T activadas (NFAT) y la proteína de unión al elemento de respuesta
a Ca2+-AMP cíclico (CREB). Estos factores de transcripción, además, se encuentran
íntimamente relacionados con la vía de los canales SOC.

45
Se ha descrito que NFAT juega un importante papel en la patogenia de la
inmunodeficiencia combinada severa de origen familiar SCID, en la que los pacientes
sufren una pérdida de la corriente ICRAC (ver apartado 4.2.2).

También se ha demostrado en diferentes estudios que la activación del factor de

transcripción CREB se promueve por entrada de Ca2+ proveniente tanto de los VOC
como de la vía SOC (figura 17) (Stevenson y col. 2001, Pulver y col. 2004). Concretamente,
la activación de la SOCE con tapsigargina es capaz de incrementar la expresión de 14
genes diana de CREB, entre los que se encuentran la fosfatasa-1 de MAPK (MKP-1) y c-
fos (Pulver y col. 2004). Estos datos demuestran el importante papel que desempeña la
SOCE a la hora de aumentar la expresión de genes activados por CREB.

Barlow y col. 2006

Figura 17. CREB incrementa la expresión génica de forma diferencial dependiendo de la vía de entrada
2+
de Ca por la cual sea activado.

Por otra parte, numerosas evidencias demuestran que la entrada de Ca2+ a través de
los SOC es capaz de promover respuestas proliferativas del músculo liso. Ahondaremos
más en este efecto de la SOCE en el apartado 5.3.

46
5. PROLIFERACIÓN DEL MÚSCULO LISO VASCULAR Y SU RELACIÓN CON
PROCESOS FISIOPATOLÓGICOS

5.1 Mecanismos promotores de la proliferación en células de músculo liso; papel de

la homeostasis de Ca2+

Las CMLV presentan gran plasticidad, de forma que pueden modificar su fenotipo
durante el desarrollo embrionario, en la maduración de los vasos sanguíneos adultos y
en el transcurso de ciertas lesiones. Uno de estos fenotipos que las CMLV pueden
adquirir es el fenotipo proliferativo o “sintético” en el que se promueve una supresión
de los genes que caracterizan el fenotipo fisiológico contráctil y se activan mecanismos
que inducen un exceso de proliferación y migración celular. Cuando muestran este
fenotipo, las CMLV también pueden expresar citoquinas y moléculas de adhesión que
contribuyen al desarrollo de lesiones (Orr y col. 2010). Por tanto, este fenotipo es objeto
de estudio, ya que presenta muchas características en común con las modificaciones
celulares que tienen lugar en los procesos de aterosclerosis y restenosis (House y col.
2007, House y Singer. 2008).

De una forma general, el crecimiento celular se encuentra modulado por la

concentración de Ca2+ intracelular, tanto citoplásmica como dentro de los reservorios;
de forma que existen unas concentraciones basales mínimas sin las cuales no habría
proliferación celular (Berridge 1995); de esta manera, la homeostasis de Ca2+ se ve
alterada cuando tiene lugar la modulación fenotípica de las CMLV (Berra-Romani y col.
2008).

5.2 Regulación de la expresión génica por Ca2+ y factores de transcripción inductores

de proliferación

Existe toda una batería de genes cuya expresión se encuentra transcripcionalmente

modulada por Ca2+. Así, modificaciones en la homeostasis de Ca2+ pueden tener
consecuencias fisiopatológicas importantes basadas en patrones alterados de la

47
expresión génica. En CMLV, existen varios factores de transcripción que regulan esta
expresión en base a la concentración de Ca2+ intracelular (Barlow y col. 2006). Dos de los
más estudiados, y de los que ya hablamos en el apartado 4.3.2, son NFAT y CREB.

NFAT se localiza en el citoplasma en estado inactivo, fosforilado en múltiples residuos;

al incrementarse los niveles de Ca2+ citosólico, este factor es desfosforilado por la
proteína de unión a Ca2+ calcineurina, translocándose junto a ésta al núcleo celular
(Gwack y col. 2007). NFAT se encuentra implicado en multitud de procesos de distintos
tipos celulares, siendo uno de los más conocidos la activación y diferenciación de los
linfocitos T. Además, hay evidencias que relacionan a NFAT con la proliferación y
migración de células de músculo liso vascular, mediada por receptores acoplados a
proteína G y por receptores acoplados a tirosín-quinasas (Yellaturu y col. 2002, Liu y col.
2004).

Por otra parte, CREB ejerce su acción mediante la unión al elemento de respuesta a
Ca2+-AMP cíclico o CRE, una secuencia presente en el promotor de más de 100 genes.
Su activación tiene lugar por medio de fosforilación en un residuo de serina, lo cual
promueve la formación de un complejo transcripcional con otras proteínas, entre ellas
la proteína de unión a CREB CBP300. CREB puede ser activado por diversas vías de
señalización dependientes de Ca2+, entre ellas la vía de la proteín quinasa dependiente
de calmodulina (CaMK), la proteín quinasa dependiente de AMPc y la vía de las MAPK
(Barlow y col. 2006).

Al igual que NFAT, CREB y algunos de sus genes diana, como MKP-1 y c-fos, parecen
estar implicados en respuestas patológicas relacionadas con la proliferación de CMLV.
En concreto, la activación de CREB guarda relación con la proliferación y formación de
neoíntima que sigue al daño vascular (Tokunou y col. 2003, Gerzanich y col. 2003).
Además, la sobreexpresión de MKP-1 puede promover proliferación de músculo liso
tras daño vascular. Son resultados que indican el importante papel que CREB juega en
la regulación de la proliferación celular en músculo liso vascular, y por tanto, en
procesos fisiopatológicos relacionados con ésta.

48
5.3 Proliferación de las CMLV y su relación con la vía de los SOC

Como explicamos con anterioridad en el apartado 5.1, las CMLV pueden presentar dos
fenotipos diferentes: el fenotipo contráctil o quiescente, característico in vivo; y el
fenotipo “sintético”, que posee una proliferación y migración celular inusualmente
altas, y es el mostrado por los miocitos vasculares tras cultivo en suero durante más de
30 horas (Potier y col. 2009, Orr y col. 2010). El cambio fenotípico que lleva a las CMLV
del estado contráctil al proliferativo se asocia con pérdida de función de los VOC, por
lo que serían otras vías de entrada de Ca2+, como la SOCE, las que regularían el
aumento en Ca2+ intracelular y la subsiguiente proliferación de estas células (Berra-
Romani y col. 2008, Potier y col. 2009).

Así, en células de músculo liso de aorta la SOCE es significativamente mayor en el

fenotipo sintético que en el quiescente, efecto que se acompaña de un aumento de
hasta 4 y 5 veces en la expresión proteica de Orai1 y Stim1, respectivamente. Además,
tanto la proliferación como la migración de este tipo celular sintético dependen de la
expresión de ambas proteínas (Baryshnikov y col. 2009, Guo y col. 2009, Potier y col. 2009).
También se ha demostrado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), un agonista asociado a daño vascular, es capaz de activar la ruta de los SOC vía
Stim1 y Orai1 para promover migración en células de músculo liso (Bisaillon y col. 2010).

Un aumento en la SOCE induce también proliferación en células de músculo liso

procedentes de arteria pulmonar; en este vaso, se relaciona a la proliferación celular
con la expresión de TRPC1 (Sweeney y col. 2002). Además, Stim1 y Orai1 se encuentran
sobreexpresados a nivel de proteína en la neoíntima de modelos de angioplastia por
balón en arteria carótida; el silenciamiento de ambas proteínas reduce claramente la
formación y proliferación de esta capa neoíntima tras el daño vascular, efecto que
guarda relación con la activación de NFAT. En base a estos estudios, Orai1 ha sido
propuesto como una potencial diana terapéutica en patologías como aterosclerosis y
reestenosis (Guo y col. 2009, Zhang y col. 2011).

49
Por último, también en células del endotelio vascular la proliferación celular depende
de la expresión de posibles componentes de la SOCE, como Orai1, TRPC1, TRPC4 y
TRPC6, y en menor medida, Stim1 y Stim2 (Abdullaev y col. 2008). La SOCE juega,
además, un importante papel en la angiogénesis del tejido endotelial, que depende
tanto de la inhibición farmacológica del canal como de la expresión de Orai1 (Li y col.
2011).

Tomados en conjunto, estos datos sugieren que los principales componentes

moleculares de la SOCE, Stim1 y Orai1, se encuentran relacionados con la proliferación
y migración de células de músculo liso vascular; procesos en los que TRPC1 también
parece estar parcialmente involucrado. Su modulación puede ayudar a crear nuevas
dianas terapéuticas a la hora de tratar procesos vasculares fisiopatológicos, como son
la reestenosis tras el daño vascular o el proceso de aterosclerosis.

5.4. Procesos de aterosclerosis y reestenosis en la pared vascular

La proliferación excesiva de las células de músculo liso en la pared del vaso es un

evento clave en el desarrollo de procesos como la aterosclerosis y la hiperplasia de la
capa neoíntima tras daño vascular (Zhang y col. 2011). La formación de la placa de
ateroma es un evento complejo, que cursa de forma similar a procesos inflamatorios
crónicos y se encuentra ampliamente estudiado, sobre todo, en aorta y arteria
coronaria (Stary y col. 1994, Glass y col. 2001). Consta de tres fases principales,
esquematizadas en la figura 18:

1) El inicio de la lesión comienza con la formación de la estría grasa o fatty streak. Bajo
el endotelio vascular, tiene lugar una acumulación de lipoproteínas LDL (low density
lipoprotein), encargadas de transportar el colesterol en sangre. Estas LDL sufren
modificaciones oxidativas que las incapacitan para ser reconocidas por sus receptores
específicos presentes en el endotelio; lo que favorece, mediante citoquinas y
moléculas de adhesión, la acumulación bajo este tejido de monocitos procedentes del
torrente sanguíneo, que se diferencian a macrófagos. Éstos a su vez incorporan el
colesterol presente en las LDL, convirtiéndose en las denominadas foam cells o células

50
espumosas. El inicio de la formación de la placa de ateroma recibe también el nombre
de lesión tipo I.
2) La progresión de la lesión y el aumento en la expresión de citoquinas por parte del
endotelio implica la migración a la estría grasa de CMLV presentes en la capa media del
vaso. Una vez en la lesión, éstas proliferan de forma excesiva e incorporan también
LDL oxidadas, contribuyendo a la formación de células espumosas. Además, sintetizan
proteínas de matriz extracelular que llevan a la formación de una placa fibrosa. Por
otra parte, los macrófagos presentes en la lesión se estratifican en capas e
interaccionan con linfocitos T, promoviendo el establecimiento de un estado
inflamatorio crónico. Este grado de lesión se denomina lesión tipo II, y puede
evolucionar de forma rápida a estadíos más graves de aterosclerosis dependiendo en
gran parte del engrosamiento de la capa íntima y del número de CMLV presentes en
ésta.

3) En la lesión tipo III o preateroma, empiezan a formarse pequeños depósitos de

lípidos diseminados fuera de las células espumosas, constituyendo un núcleo lipídico
que deforma la capa íntima. Además, las interacciones entre macrófagos y CMLV y la
alta cantidad de citoquinas inflamatorias llevan a apoptosis y necrosis de ambos tipos
celulares, lo que ayuda a liberar los lípidos contenidos en su interior y forma el
denominado núcleo necrótico. La placa de ateroma ya formada puede sufrir una o
varias rupturas, lo que tiene como consecuencia la liberación a la sangre de los lípidos
contenidos en el núcleo, así como del resto de factores inflamatorios; y desencadena
procesos de coagulación, formación de trombos y posibles obstrucciones e infartos
(Stary y col. 1994, Glass y col. 2001).

51
 Glass y col. 2001

Figura 18. Diferentes estadíos de la formación de la placa de ateroma.

Por otra parte está el proceso de reestenosis, que tiene lugar después de llevar a cabo
intervenciones para tratar una oclusión vascular, como la angioplastia con balón o la
implantación de un stent (Curcio y col. 2011). Estos procedimientos tienen como
consecuencia un estrechamiento de la luz vascular, además de compresión de la placa

52
de ateroma u otras lesiones preexistentes y pérdida del tejido endotelial en el vaso. El
daño vascular originado pone en marcha el proceso, que comienza con la formación de
una capa de plaquetas y fibrina en la región carente de endotelio, y se continúa con la
adhesión de leucocitos y su migración a través de esta capa. La respuesta inflamatoria
provoca un aumento en la síntesis de matriz extracelular, así como de proliferación y
migración de células de músculo liso. En conjunto, esta serie de procesos llevan a la
formación y engrosamiento de una capa neoíntima, lo que provoca un mayor
estrechamiento de la luz del vaso (Inoue y Node. 2009, Curcio y col. 2011). En la
reestenosis, es este último paso de proliferación y migración de CMLVs el que
contribuye mayoritariamente a la formación de la capa neoíntima (Guo y col. 2009,
Curcio y col. 2011).

La proliferación de CMLV se trata, por tanto, de un proceso a tener en cuenta a la hora

de hablar de patologías cardiovasculares por todas sus implicaciones en el desarrollo y
pronóstico de estas lesiones.

53
OBJETIVOS

Los experimentos desarrollados durante este estudio se han centrado en caracterizar

la vía de señalización por la cual la Urotensina-II promueve sus efectos a corto y largo
plazo de a nivel del músculo liso vascular; así como el papel de la entrada de Ca2+ a
través de los canales SOC en esta vía y su posible implicación a nivel fisiopatológico.

Los objetivos planteados son los siguientes:

1. Determinar el papel de los canales de Ca2+ voltaje-dependientes, de los canales SOC

y de su proteína reguladora iPLA2 en los cambios en tono vascular mediados por U-II.

2. Estudiar los cambios en concentración de Ca2+ intracelular inducidos por U-II en

CMLV aisladas, así como la influencia en este efecto de varias proteínas participantes
en la SOCE: iPLA2β, Stim1, Orai1 y TRPC1.

3. Caracterizar si la movilización de Ca2+ intracelular promovida por U-II podría

contribuir al establecimiento de cambios celulares a largo plazo, como un aumento en
la proliferación celular.

4. Determinar la implicación de los canales SOC y las proteínas de su vía de

señalización Stim1, Orai1 y TRPC1 en la proliferación inducida por U-II.

5. Elucidar si la aplicación de U-II podría promover cambios en la expresión génica de

CMLV aisladas; y si este efecto depende de la entrada de Ca2+ a través de los SOC y de
Stim1, Orai1 y TRPC1.

54
MATERIALES Y MÉTODOS

1. MODELO ANIMAL Y DISECCIÓN DE LA AORTA

Todos los experimentos para el presente trabajo se realizaron en aorta torácica de

ratas de la cepa Wistar Kyoto. Los animales, suministrados desde el Centro de
Producción y Experimentación Animal de Espartinas (Sevilla), fueron todos machos de
entre 2 y 6 meses de edad, con un peso de 250 - 350g en el momento del sacrificio. Los
animales estuvieron estabulados hasta su intervención quirúrgica en condiciones
estables de humedad y temperatura, con una densidad de estabulación no superior a 5
ratas por jaula, acceso permamente a agua y alimento y un ciclo de luz/oscuridad de
12 horas. La manipulación de los animales siguió en todo momento lo estipulado por la
normativa de utilización y cuidado de los animales utilizados en la investigación y otros
fines científicos acordada por la UE en 1986 (Real Decreto 1201/2005, España).

La disección de la aorta fue llevada a cabo en el Quirófano Experimental del edificio de

laboratorios adscrito al Instituto de Investigación Biomédica de Sevilla (IBIS), que
consta de las instalaciones necesarias para operar animales tanto de pequeño como de
gran tamaño. Como paso previo a la intervención, a la rata le fue administrada una
dosis intraperitoneal de heparina (1000 U/kg) y después se anestesió, tambien vía
intraperitoneal, con 1,5 ml/250 g de ketamina (Ketolar, Parke-Davis). Tras inmovilizarla
y rasurar la región toracoabdominal, se abrió la cavidad torácica con un bisturí;
después de extraer el bloque cardiopulmonar, se localizó la sección de aorta torácica
justo por encima de la columna vertebral. El vaso se cortó cuidadosamente de forma
paralela a ésta y se depositó en una placa de Petri con solución Krebs estándar (ver
apartado 9, Tabla 1), en caso de destinarla al análisis de la función vascular, o en un
tubo Falcon con medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) estéril
(PAA Labs), si se necesitaba para dispersar células de musculo liso aisladas.

Antes de su montaje o dispersión, la aorta fue separada de la grasa adyacente y de su

capa adventicia. Este proceso se realizó bajo lupa binocular y con ayuda de pinzas y

55
tijeras de microcirugía. Cuando la arteria se iba a destinar a cultivo de células de
músculo liso, la capa endotelial se eliminó manualmente con ayuda de una torunda de
algodón estéril, frotando cuidadosamente la luz del vaso.

2. CULTIVO PRIMARIO DE MÚSCULO LISO

2.1. Dispersión de células de músculo liso vascular

Todos los cultivos primarios necesarios para este estudio se llevaron a cabo bajo
condiciones de esterilidad en una cabina de seguridad biológica modelo Cellgard 437-
400E de Nuaire. La aorta, una vez extraída del animal y limpia de las capas adventicia y
endotelial (figura 19), fue trasladada a la campana de flujo laminar, donde se cortó en
fragmentos más pequeños con ayuda de material de microcirugía estéril. Estos trozos
de músculo fueron incubados en la solución de enzimas, compuesta por: 4 mg/ml de
colagenasa I (125 U/mg) y 2 mg/ml de elastasa pancreática (4 U/mg) (Sigma Aldrich)
diluidas en medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (PAA Labs), y
filtrada previamente mediante un filtro de jeringa con 0,22 µm de diámetro de poro.
La placa con los fragmentos de aorta se trasladó a un incubador a 37ºC durante un
periodo comprendido entre 60 y 90 minutos, con el fin de disgregar el tejido y
promover la separación de las células de músculo liso aisladas. Durante los últimos
minutos de la incubación se fue observando la placa al microscopio invertido para
reconocer la presencia y cantidad de estas células separadas del tejido, y poder
determinar así el momento idóneo en el que interrumpir la dispersión, antes de que la
alta concentración de enzimas comenzara a dañar las células. Nuevamente dentro de
la campana, la solución fue pipeteada repetidas veces con una micropipeta para
ayudar a completar la disgregación del tejido. Después se neutralizó la solución
enzimática con 3 ml de DMEM y se centrifugó durante 5 minutos a 800 rpm. El
sobrenadante fue desechado y el pellet, que contenía las células, se resuspendió en
DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS, Biowhitaker) y 1% de

56
penicilina/estreptomicina (PAA Labs, 100 U/ml) para después sembrarse en la placa de
cultivo (Chamley-Campbell
Campbell y col. 1979, Smani y col. 2007).

Figura 19. Sección de aorta torácica de rata y células de músculo liso vascular al microscopio (objetivo
20X),, dispersadas a partir de ésta.

2.2. Condiciones de incubación

incubació de los cultivos

Las placas de cultivo se conservaron hasta el momento de su ensayo en una cámara

incubadora Nuaire clase 100 con camisa de agua de 188 litros y filtro HEPA externo. La
cámara se encuentra conectada a una bombona que suministraba la mezcla de gases
necesariaa para el correcto desarrollo de los cultivos (95% O2 y 5% CO2). Tanto la
temperatura (37ºC) como la humedad y los porcentajes de O2 y CO2 en el interior eran
controlados electrónicamente por el incubador.

Se observó cada día el progreso del cultivo al microscopio

microscopio invertido, y se realizaron
cambios de medio cada 3-4
3 4 días. Se consideraba que las células en cultivo se
encontraban preparadas para el experimento cuando alcanzaban un 70% de
confluencia (aún en fase de crecimiento exponencial) en el caso de los ensayos de
proliferación y de inmunofluorescencia; o un 90% en el caso de los registros de Ca2+
intracelular.

57
3. ANÁLISIS DEL TONO VASCULAR

3.1. Estructura de la cámara de órganos

Figura 20. Cámara de órganos para macrovasos. Cada una de las cuatro copas está diseñada para el
montaje, baño y oxigenación de un anillo arterial de 3-4 mm de longitud.

La cámara compacta de órganos para macrovasos, que se muestra en la figura 20 (QOB

Cibertec S.A. Madrid, España), es un sistema encargado de registrar los cambios en
tono vascular en anillos arteriales de gran tamaño. Se compone de cuatro copas de
vidrio graduadas con capacidad para 10 ml y bañadas a su vez por una cámara común
con un calentador de agua y un termostato. Cada una de estas copas consta de un
sistema de alambres de tungsteno: un alambre fijo que se atornilla a la superficie de la
cámara, y un alambre móvil que se conecta en su parte superior a un dinamómetro
modelo Piodem UF-1 (figuras 20-22). La altura del dinamómetro y, por tanto, la fuerza
que ejerce sobre el alambre móvil y el anillo arterial, se encuentra regulada por una
rueda de precision micrométrica. Los cambios en fuerza isométrica registrados por el
dinamómetro se monitorizaron a través de una tarjeta de adquisición y conversión de
datos analógico/digital y un amplificador de señales PowerLab (AD Instruments, USA);

58
los valores durante el experimento fueron registrados por medio de los programas
Chart 5 o Chart 8 (para una o dos cámaras de órganos, respectivamente).

Alambre fijo

Alambre móvil

Figura 21. Sistema de alambres de la cámara de órganos. El alambre fijo se atornilla a la superficie de la
cámara y el alambre móvil va conectado en su extremo superior al dinamómetro. La masilla situada en
la parte superior del alambre fijo facilita el montaje del sistema.

Figura 22. Dinamómetros encargados de registrar tensión isométrica. Se conectan al alambre móvil
mediante el pequeño gancho situado en su extremo inferior, y la rueda micrométrica en su parte
superior permite regular la tensión que el sistema ejerce sobre la arteria.

59
La cámara posee así mismo un sistema de burbujeo de las copas conectado a una
bombona de carbógeno (95% O2 y 5% CO2). Esta mezcla de gases, además de
suministrar oxígeno a los anillos arteriales una vez montados dentro de las copas,
permite mantener estable el pH de la solución salina que los baña durante todo el
experimento. También facilita la rápida disolución de los fármacos una vez éstos se
agregan a la solución, y su pronta incorporación a los tejidos.

3.2. Preparación y montaje del vaso

El primer paso a realizar es el encendido del calentador de agua, que permite que las
copas alcancen una temperatura estable de 37,5ºC, y la preparación de la solución
salina Nutricia Krebs (apartado 9, Tabla 1). Ésta se incorpora a cada copa por medio de
un sistema de tubos situado en la parte inferior de la cámara. Antes de comenzar el
montaje de los anillos, las copas fueron lavadas repetidamente con la solución, para
asegurarnos de que ésta, al comenzar el experimento, no se encontrara diluida; ya que
las copas se enjuagan al final de cada experiencia con agua destilada. También es
necesario conectar la bombona de carbógeno y regular el burbujeo de cada copa de
forma que sea homogéneo en todas ellas.

La arteria limpia se cortó en anillos de 3 a 4 mm de longitud. El proceso de montaje

comenzó dentro de la placa de Petri con solución Krebs burbujeada. Cada uno de ellos
se ensartó por su luz vascular en el extremo del alambre fijo y después en el del
alambre móvil, teniendo cuidado de que ambos alambres no se cruzaran entre sí ni
tampoco tiraran del tejido muscular, tal y como se muestra en la figura 23.
Posteriormente, se pegó el alambre móvil en su parte superior a la masilla del alambre
fijo, con el fin de impedir que los alambres se separaran durante el resto del montaje.
Después, el anillo ya montado en los alambres se sumergió en la copa llena de solución
(figura 24). Estos pasos previos fueron hechos con rapidez, para evitar que el tejido
arterial sufriera demasiado estrés y se encontrara en buen estado a la hora de realizar
los experimentos.

60
Figura 23. A la izquierda, anillos de aorta torácica de rata de aproximadamente 4 mm de longitud,
preparados para su montaje en la cámara. Derecha: fotografía explicativa del montaje de un anillo
arterial, ensartado por su luz vascular en los dos alambres dentro de la misma solución donde se limpió
la arteria tras su extracción.

Figura 24. El sistema compuesto por el anillo de aorta y los alambres fue introducido dentro de la copa y
se fijó a la cámara en su parte superior.

Después se conectó el amplificador y el programa informático Chart 5 (o Chart 8,

cuando se utilizaron las dos cámaras simultáneamente). La ventana de registro del
programa muestra un canal por cada copa y la tensión que registra cada uno de los
dinamómetros expresada en gramos, a una velocidad de 4 valores por segundo, tal y
como aparece representado en la figura 25. Con la rueda Balance del amplificador fue
necesario ajustar la tensión inicial de todos los canales a -0,180 g (masa aproximada

61
del alambre móvil). Después se ensartó cuidadosamente el gancho situado en el
extremo inferior del dinamómetro en el extremo superior del alambre móvil. Con
ayuda de la rueda micrométrica, se subió poco a poco la altura del dinamómetro hasta
que el alambre móvil comenzó a ejercer presión sobre el anillo (unos 0,100 g
aproximadamente). Se repitió el proceso en las demás copas. Después se liberó
lentamente, con ayuda de las pinzas de microcirugía, el alambre móvil de la masilla.
También se separó, en los casos en que fue necesario, el anillo arterial de los tramos
verticales de ambos alambres, así como de las paredes de la copa, con la finalidad de
eliminar cualquier fuerza de rozamiento existente que pudiera alterar el registro de los
cambios en tono vascular.

Figura 25. Ventana de registro de la aplicación Chart 5, que representa los valores de tensión isométrica
registrados durante el experimento en cada uno de los anillos arteriales.

Una vez montados todos los segmentos de aorta, se ajustó la tensión que ejercían los
alambres sobre cada uno de ellos para que fuera similar a la tensión que los vasos
soportan en condiciones fisiológicas. Esta tensión basal se determinó previamente
para este tipo de vaso según la metodología descrita por Mulvany y Halpern (Mulvany y
Halpern, 1977). Después, las copas se lavaron un par de veces para suministrar solución

62
Krebs fresca a las arterias; también se realizó otro lavado más antes de dar comienzo al
experimento en sí.

El tiempo de estabilización de los anillos en su tensión fisiológica basal, necesario para

que el tejido muscular del vaso se recuperara debidamente del estrés de la
manipulación durante el montaje, fue de entre 60 y 90 minutos.

3.3. Recogida de datos y análisis del efecto de los inhibidores

Una vez comenzado el experimento, los fármacos se añadieron al interior de las copas
con ayuda de la micropipeta, incorporándose así de una forma rápida al medio que
baña los anillos. La aplicación de Chart permite registrar el tratamiento farmacológico
que se dio a cada anillo arterial en cada momento del experimento (figura 25). Los
datos de la hoja de registro, monitorizados a lo largo de todo el experimento, fueron
copiados a un documento de Excel para su análisis y representación en gráficas de
dispersión X-Y, donde se muestra la fuerza isométrica expresada en gramos frente al
tiempo. La contracción inducida por U-II se estimó en base al aumento neto en tensión
isométrica (Δfuerza), restándole al pico máximo de contracción, que se suele alcanzar
a los 20-25 minutos de la aplicación del fármaco, la tensión inicial del anillo arterial.

Debido a que la vasoconstricción típica mediada por U-II en aorta posee un curso
temporal en el que se observa siempre una leve desensitización a lo largo del tiempo,
el efecto de los inhibidores sobre la contracción se analizó de una forma comparativa,
normalizándose en distintos puntos temporales (a los 10, 15 y 30 minutos de la
aplicación del inhibidor) con respecto a dicha caída en contracción que tiene lugar de
forma espontánea, y asegurándonos siempre de que la inhibición de cada fármaco era
estadísticamente significativa con respecto a este control.

63
4. REGISTRO DE Ca2+ INTRACELULAR CON MICROSCOPÍA DE
FLUORESCENCIA

4.1. Papel del Fura-2 AM en el estudio de la movilización de Ca2+ intracelular

El Fura-2-acetoximetil éster (Fura-2 AM) es un fluorocromo derivado del quelante de

Ca2+ ácido tetraacético etilen glicol (EGTA), y se trata de un reactivo ampliamente
empleado para registrar la concentración de Ca2+ libre intracelular en células aisladas.
Esta sustancia permea a través de la membrana plasmática, y una vez en el citosol
pierde el grupo acetoximetil gracias a la acción de las esterasas intracelulares,
quedando tan sólo el compuesto activo Fura-2. Éste, al unirse a Ca2+, altera su
intensidad de fluorescencia emitida, de tal manera que es posible estimar la
concentración de calcio intracelular de las células cargadas con Fura-2 a partir de
dichos cambios en intensidad de fluorescencia.

Para ello se deben excitar las células con dos longitudes de onda diferentes (340 y 380
nm) que se encuentran a ambos lados del punto isosbéstico del Fura-2 (360 nm)
definiendo como tal el pico de longitud de onda en el que el colorante, a cambios en la
concentración de Ca2+, no detecta cambios en su fluorescencia de emisión (figura 26).
A la longitud de onda de 340 nm, cuanto mayor sea la concentración de Ca2+ mayor
será la intensidad de fluorescencia de emisión; mientras que a la longitud de onda de
380 nm la fluorescencia disminuye al aumentar la concentración de Ca2+ (Poenie y Tsien.
1986). La fluorescencia emitida se colectó a una longitud de onda de 510 nm y las
variaciones en la intensidad de esta fluorescencia (equivalente a la concentración de
Ca2+ intracelular) se estimaron a partir del cociente o ratio entre ambas señales de
excitación (R=340/380nm).

64
Figura 26. Diagrama del expectro de excitación del Fura-2 y sus cambios en fluorescencia en respuesta a
2+
la concentración de Ca .

4.2. Estructura microscopio de fluorescencia y lámpara

Los experimentos se llevaron a cabo con ayuda del sistema de imagen Incyt Basic Im2.
(Intracellular Imaging Inc.; Imsol, UK) (figura 27) que se encuentra compuesto de los
siguientes elementos:

- Microscopio invertido Nikon Eclipse TS100 con sistema de epifluorescencia y

cámara acoplada CCD de 12 bits (Cooke PixelFly, ASI, Eugene, OR, USA)
adecuada para grabar con baja intensidad de luz
- Lámpara de mercurio y xenón encargada de excitar las células durante el
experimento
- Monocromador para la selección de longitudes de onda de excitación, con
capacidad de excitar en el rango de UV/luz visible
- Software especializado InCytIM2

65
Figura 27. Esquema del sistema de imagen Incyt Basic Im2 empleado para los ensayos de movilización
2+
de Ca intracelular.

4.3. Fases del experimento

Las células de músculo liso se cultivaron sobre cubreobjetos estériles hasta alcanzar
una confluencia del 90%. Para ello se empleó un cubreobjetos rectangular que fue
fragmentado en cuadrados de aproximadamente 3 mm de longitud. Estos cubres
fueron esterilizados y colocados cubriendo el fondo de una placa de Petri de 30 mm de
diámetro, antes de sembrar las células. Éstas, tras frenar su división durante 24 horas
en DMEM con 1% de FBS, fueron incubadas con Fura-2 AM (Invitrogen) a 5 µmol/l
durante 30 minutos a 37ºC. Tras realizar un lavado a las células con DMEM, éstas se
trasladaron al cuarto de fluorescencia, preservándolas de la luz a partir de ese
momento para no alterar la fluorescencia del compuesto.

Al comenzar el experimento, cada cubre se depositó en el interior de una cámara de

registro con 1 ml de solucion 0Ca2+ (apartado 9, tabla 2) bajo el objetivo 20X del

66
microscopio de fluorescencia. La lámpara de mercurio encargada de excitar las células
durante el proceso se conectó unos 10-15 minutos antes de dar comienzo al
experimento. Los fármacos añadidos durante la experiencia se aplicaron directamente
en la cámara de registro.

El protocolo básico del experimento consistió en la aplicación de Urotensina-II 100nM

en ausencia de Ca2+ extracelular durante tiempo suficiente para liberar Ca2+ del
retículo sarcoplásmico y activar la vía operada por los reservorios (tiempo establecido
previamente mediante experimentos de curso temporal: 3 minutos); después se
añadió al medio CaCl2 2mM y se cuantificó el aumento en el nivel de Ca2+ intracelular.

4.4. Análisis de los datos

La adquisición de los datos se llevó a cabo con ayuda del software InCytIM2, con una
velocidad de adquisición de 2 ratios/segundo. Los parámetros del programa fueron
ajustados de forma que la escala de grises y la ganancia con la que se adquirieran los
datos fuera constante en cada experimento. En cada experiencia individual se
seleccionó para su registro, con ayuda de herramientas de dibujo, un número variable
de entre 10-25 células. InCytIM2 almacena los registros de cada célula por separado, y
permite el cálculo de la ratio entre las señales de 340 y 380 nm y su representación
mediante gráficas de dispersión X-Y.

Los datos de cada experimento, así como los tratamientos que se dieron a las células
durante el transcurso de éstos, fueron almacenados en la aplicación Data InCytIM. Las
variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular fueron estimadas de forma directa
a partir de la variación de la ratio (ΔRatio) al inicio de cada experimento y tras la
aplicación de fármacos (Smani y col. 2004). Esta variación se normalizó siempre en
función a la ΔRatio obtenida en los experimentos de leakage o flujo pasivo de Ca2+ (ver
grupos de tratamiento, apartado 8.2).

67
5. ENSAYO DE PROLIFERACIÓN

5.1. Características del reactivo AlamarBlue

El AlamarBlue (Biosource) es un reactivo soluble en agua que contiene un indicador de

oxidación-reducción. Gracias a este indicador, en el compuesto tiene lugar un cambio
colorimétrico y de fluorescencia ante la reducción del medio de cultivo como
consecuencia del crecimiento celular. Dicho cambio de absorbancia es cuantificable en
un espectofotómetro y se utiliza como medida indirecta de proliferación (Kakishita y col.
2000).

La ventaja de este reactivo a la hora de realizar ensayos de proliferación es que se

trata de un producto no tóxico para el metabolismo celular, por lo que en un mismo
cultivo tratado con AlamarBlue se pueden realizar mediciones sucesivas durante varios
días y observar la progresión del crecimiento en la población celular. También permite
realizar mediciones control antes del tratamiento farmacológico al cultivo; lo cual es
importante en cultivos primarios donde no fue posible cuantificar el número de células
iniciales.

5.2. Fases del experimento, mediciones y análisis

Las células de músculo liso se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta alcanzar un

grado de confluencia del 70 %. 24 horas antes del experimento, se frenó el crecimiento
celular reduciendo el porcentaje de suero a 0,1% FBS. Las últimas 16 horas se
incubaron con AlamarBlue en una concentración de 10 %. Finalizado el tiempo de
incubación, se realizó una medición control de la absorbancia a 570 nm, para obtener
una estimación de la cantidad inicial de células en cada uno de los pocillos; esta
medición la tomaríamos como cantidad de células en el tiempo cero de la experiencia.

Tras la medición control se procedió a los diferentes tratamientos; en cada

experimento se reservó una columna de pocillos con células sin tratar, que tomamos

68
como control negativo, y otra columna con DMEM y 0,1% FBS sin células, que
utilizamos como blanco del ensayo.

Los cambios en absorbancia fueron registrados en un espectofotómetro de lectura de

placas modelo Oasys UVM40, con un sistema basado en un monocromador para
selección de longitudes de onda y un rango de selección UV/VIS. Se realizaron
mediciones a las 24 y 48 horas del tratamiento a las células, que se llevaron a cabo a
570 nm de longitud de onda y por duplicado; los datos se registraron a través de la
aplicación DigiRead, para placas de 96 pocillos. Desde que se dio comienzo a la
incubación con AlamarBlue, la placa se mantuvo aislada de la luz en todo momento
para evitar alteraciones en las medidas de absorbancia.

Los valores obtenidos por cada pocillo en cada tiempo de medición se reflejaron en
una tabla de Excel. Se calculó la media de todos los pocillos en la misma columna
(mismo tratamiento) y a este valor se restó la media de valores obtenida en la columna
blanco, con lo que obtendríamos el grado de reducción de AlamarBlue mediado por la
proliferación celular. Teniendo estos datos en los diferentes tiempos de medición, se
elaboraron gráficas de dispersión de puntos en las que se observa la curva de
crecimiento a lo largo del tiempo en cada uno de los grupos de tratamiento. También
se calculó el gradiente de crecimiento, parámetro que refleja la diferencia cuantitativa
de células en cada tiempo de medición con respecto a la cantidad de células registrada
en la medición control (tiempo cero de la experiencia).

6. INMUNOFLUORESCENCIA

6.1. Marcaje con bromodeoxiuridina

La 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) (Sigma Aldrich) es un compuesto análogo de la base

timidina, componente diferencial del ADN con respecto del ARN; al agregarse al medio
de cultivo, las células en fase de replicación de ADN lo incorporan a su núcleo. Así, es
capaz de indicar de una forma directa la proporción de células en un cultivo que han
69
sintetizado ADN de novo, y por tanto se encuentran en proliferación, en un periodo de
tiempo determinado. Para ello, es necesario realizar de forma posterior a la incubación
con el compuesto un ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal
antiBrdU y un anticuerpo secundario fluorescente, reconociendo como células
positivas para BrdU (células que han proliferado) a aquellas que emitan fluorescencia
al microscopio (Magavi y Macklis, 2008).

Las células de músculo liso se cultivaron sobre cubreobjetos circulares, previamente

esterilizados y colocados cubriendo los pocillos de la placa de cultivo. Las células
fueron tratadas con U-II por un periodo de 24 o 48 horas, y con BrdU 10 µM durante
las 18 últimas horas. Después se llevó a cabo el ensayo de inmunofluorescencia:

- Fijación con paraformaldehido 4% (Sigma Aldrich) a temperatura ambiente

durante 5 minutos.
- Tratamiento con acido clorhídrico (Fluka, Sigma Aldrich) 2N 30 minutos, para
desnaturalizar el ADN y permitir que quedaran expuestos los sitios de unión
antígeno-anticuerpo.
- Dos lavados de cinco minutos con tetraborato sódico (Sigma Aldrich) 0.1 M a
pH= 8.5.
- Permeabilización celular y bloqueo de los sitios de unión inespecíficos para el
anticuerpo: Triton 0.05% (Fluka, Sigma Aldrich), suero de cabra al 3% (Gibco) y
seroalbúmina bovina 1% (BSA) (Sigma Aldrich) en PBS 1X, a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
- Incubación con anticuerpo primario monoclonal anti-BrdU de ratón (Sigma
Aldrich) en una proporción de 1:300 a 4ºC y con agitación durante toda la
noche.
- Incubación con el anticuerpo secundario fluorescente AlexaFluor FITC, de 488
nm de emisión (Invitrogen), antiIgG de ratón a 1:500 en solución de bloqueo
(3% de suero de cabra y 1% BSA en PBS), durante 50 minutos a temperatura
ambiente, preservando la placa de la luz.
- Tratamiento con 4’, 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) (Sigma
Aldrich) a 300 nM en PBS durante 5 minutos; este colorante es un agente

70
 intercalante de bases que se une al ADN de los núcleos y los tiñe, permitiendo
contar el número de células viables presentes en cada cubre.
- Montaje de los cubres sobre portaobjetos para microscopio con ayuda de la
solución de montaje Dako Fluorescent (Dako). Una vez secos, se observaron al
microscopio.

6.2. Inmunocitoquímica para PCREB

Las células de músculo liso se cultivaron de igual modo que las destinadas al marcaje
para BrdU. Los pasos realizados en el ensayo de inmunofluorescencia para PCREB
fueron los siguientes:

- Fijación: con metanol (Sigma Aldrich) a -20ºC durante 8 minutos.

- La permeabilización y bloqueo se llevaron a cabo del modo anteriormente
descrito para el marcaje con BrdU.
- Incubación con anticuerpo primario anti-PCREB de conejo (Santa Cruz
Biotechnology) a 1:300, toda la noche a 4ºC; y con anticuerpo secundario
AlexaFluor antiIgG de conejo FITC de 488 nm (Invitrogen) a 1:500, durante 50
minutos a temperatura ambiente.
- Tratamiento con DAPI y montaje sobre portas para microscopio.
(Protocolo extraído y modificado de: Stevenson y col. 2001).

6.3. Obtención de las imágenes y análisis de datos

Las imágenes procedentes de inmunofluorescencia se obtuvieron con la ayuda de un

microscopio Olympus equipado con una cámara digital Olympus DP70, con 12,5
megapíxels de resolución y 3 canales de fluorescencia (DAPI, TRITC y FITC). Las
fotografías de las células teñidas con los distintos colorantes fueron realizadas con
ayuda de la aplicación DPController.

71
En cada experimento, se tomaron fotografías de 4-5
5 campos por cada grupo de
tratamiento con el objetivo de 20X. Se realizaron dos fotografías por cada campo
seleccionado, una para cada tipo de fluorescente (DAPI o FITC-AlexaFluor
FITC AlexaFluor 488 nm).

Para el análisis de los resultados, se realizó por cada campo fotografiado un conteo de
los núcleos teñidos con DAPI, equivalente al número total de células viables; y después
otro de los marcados con el anticuerpo secundario fluorescente (figura 28).
28) Los datos
finales se expresaron en porcentaje de núcleos marcados con AlexaFluor respecto al
número de núcleos totales o núcleos con fluorescencia para DAPI.

Figura 28. Fotografía de campos al microscopio con el objetivo de 20X; los núcleos celulares visibles en
las imágenes a izquierda y derecha muestran marcaje para DAPI y FITC, respectivamente.

7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

7.1. Transfección y silenciamiento con ARN interferente

7.1.1. Función de los ARN interferentes.

Los small interfering RNA (siRNA) o ARN interferentes son ribooligonucleótidos que
intervienen en la regulación de la expresión génica post-transcripcional
post transcripcional en células
eucariotas. Estos ARN se unen específicamente a ARN mensajeros complementarios en
el citosol, aumentando o disminuyendo
disminuyendo su actividad. Así, pueden impedir que un

72
determinado ARN mensajero sintetice su proteína, disminuyendo la expresión del gen.
Los ARN interferentes poseen una importante función endógena protegiendo a la
célula de la entrada de material genético foráneo, como el procedente de virus; y
también actuando en algunos casos en supresión tumoral. En los últimos años han sido
ampliamente utilizados en investigación como herramienta molecular para disminuir la
expresión de genes in vitro, y así ayudar a elucidar la función de la proteína que
sintetizan.

La vía de acción de los ARN interferentes, esquematizada en la figura 29, se inicia

mediante la enzima Dicer, que tras la unión del ARN interferente con su homólogo
dentro de la célula, se une específicamente a la cadena de ARN de doble cadena larga
resultante (dsRNA) y lo fragmenta en pequeños dúplex de aproximadamente 20 pares
de bases cada uno. Estos pequeños ARNs son entonces introducidos en el complejo
RISC (RNA-induced silencing complex), teniendo lugar la degradación por proteolisis de
la cadena de ARN “diana” del siRNA, (pero no la de éste) mediante el componente
catalítico de este complejo (Hammond 2005).

Figura 29. Esquema del mecanismo de acción de los siRNA en el interior celular.

Los ARN intereferentes disminuyen la expresión de una proteína de forma transitoria,

ya que poseen una vida relativamente corta dentro de la célula. El máximo
silenciamiento del ARN diana tiene lugar entre las 48 y las 72 horas de la transfección.
En el caso de los ensayos de marcaje con BrdU, la incubación con U-II tuvo lugar a las

73
24 horas de añadir los ARN interferentes, con el fin de que el péptido actuara durante
el periodo de máxima inhibición de la expresión proteica. En cambio, cuando se realizó
la transfección a los cultivos destinados para cuantificación de Ca2+ intracelular o para
marcaje de PCREB, estos experimentos tuvieron lugar a las 48-72 horas de la
transfección, ya que no constan de pasos de incubación previa.

7.1.2. Transfección de células de músculo liso.

Una vez que los cultivos primarios de músculo liso alcanzaron la confluencia óptima
para el experimento, se les cambió el medio de cultivo DMEM por medio OPTIMEM
(Invitrogen) especial para este tipo de procedimientos. Las células se incubaron con
este nuevo medio al menos una hora a 37ºC, para que se adaptaran a las nuevas
condiciones. Después se trataron con la solución de transfección, compuesta del
agente de transfección HiPerfect (Qiagen) al 12% y los oligonucleótidos para el ARN
diana, Orai1, Stim1 o scramble, (Ambion) en un porcentaje de 3% (concentración final
10nM) en medio OPTIMEM frío. La solución se añadió gota a gota a los pocillos,
mezclándola bien con medio OPTIMEM en una proporción 1:10. Las células se
incubaron durante 3 horas a 37ºC con la mezcla de transfección, y finalmente se les
añadió 2 ml de medio DMEM con 10% FBS. Aproximadamente a las 24 horas siguientes
a la finalización del proceso, se realizó un cambio completo de medio al cultivo.

Todos estos pasos se realizaron en completa esterilidad dentro de la cabina de flujo

laminar. Se puso especial cuidado en la manipulación durante la preparación de la
mezcla de transfección y la adición de ésta al cultivo para evitar cualquier tipo de
contaminación, ya que el medio OPTIMEM no contiene antibiótico.

Las secuencias de oligonucleótidos empleadas para la transfección fueron:

Stim1-s156046: GGAUCUCAGAGGAUUUUGAtt
Orai1-s167653: GGGUGAAGUUCUUACCGCUtt

74
8. GRUPOS DE TRATAMIENTO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

8.1. Tratamientos en registro del tono vascular

- Dosis-respuesta de Urotensina-II (U-II): 1, 10, 50 y 100 nmol/l de U-II fueron

aplicados a distintos anillos de aorta ya estabilizados, en experimentos en
paralelo con anillos procedentes del mismo vaso.
- Dosis-respuesta de U-II independiente de endotelio: se realizó el mismo
tratamiento del grupo anterior, incubando previamente con LNNA 100 µmol/l
durante al menos 10 minutos; siendo éste el mismo protocolo que se siguió a
partir de entonces para el estudio de los inhibidores.
- Grupos de tratamiento con inhibidores: Urantide, U73122, nifedipina, 2APB,
DES, nifedipina + 2APB, BEL. Estos fármacos, salvo en el caso del Urantide y del
U73122, en que se agregaron previamente a la aplicación de U-II, se aplicaron
una vez que la vasoconstricción mediada por el péptido hubo llegado a meseta
(20-25 minutos).

8.2. Movilización de Ca2+ intracelular

- Urotensina-II 100 nmol/l (3 min) + CaCl2 2 mmol/l + 5 min (protocolo base).

- Estimación del leakage o flujo pasivo de Ca2+, en el que tan sólo se añade CaCl2
2 mmol/l a las células tras unos minutos en ausencia de Ca2+ extracelular.
Este paso es necesario para determinar el flujo pasivo de Ca2+ en las células a
ensayar, y en el análisis de datos fue tomado como control negativo de cada
experiencia, comparándose con la movilización de Ca2+ inducida por U-II.
- Control positivo con uno de los activadores típicos de la vía a estudio: la
tapsigargina (TG), un bloqueante de la bomba de Ca2+ del retículo
sarcoplásmico (SERCA) que promueve el vaciado gradual del mismo (Parekh y
Putney. 2005): TG 2 µmol/l (3-4 min) + CaCl2.
- Inhibidores empleados: Urantide, U73122, Gd3+ y R-BEL/S-BEL, con los que se
incubaron las células de forma previa al experimento; 2APB, que se agregó
durante el transcurso de éste, una vez tuvo lugar el vaciado de los reservorios
75
 de Ca2+; y ML9, que se añadió una vez la entrada de Ca2+ tras la readición de
éste al medio extracelular hubo llegado a su punto máximo (2 min
aproximadamente).
- Protocolo base en células silenciadas para Stim1/Orai1/TRPC1.

8.3. Ensayos de proliferación e inmunofluorescencia

Proliferación con AlamarBlue:

- Dosis-dependencia de la proliferación inducida por U-II (1, 10, 50 y 100 nmol/l)
durante 24 y 48 horas.

Marcaje PCREB y BrdU:

- Dosis-dependencia del efecto de la U-II (10, 50 y 100 nmol/l) incubando
durante 5 minutos para el marcaje de PCREB, y 24/48 horas en el caso del
ensayo con BrdU.
- Inhibidores: 2APB, Gd3+ y ML9, que se aplicaron previamente al tratamiento
con U-II 100 nmol/l.
- Experimentos en células con silenciamiento para Stim1, Orai1, Orai2 y TRPC1.

8.4. Análisis estadístico

Todos los experimentos realizados fueron analizados gráficamente en documentos de

Excel, comparando los grupos control sin tratar con los grupos tratados con U-II, y
éstos a su vez con los transfectados con ARN interferente o incubados con inhibidores.
En cuanto a la inferencia estadística, se empleó el análisis de comparación de medias
de la t de Student; se consideraron estadísticamente significativos todos los casos en
los que p <0,05.
Los datos numéricos se muestran en resultados como media + error estándar.

76
9. SOLUCIONES

Compuesto Concentración (mmol/l)

NaCl 118,5
KCl 4,7
MgSO4 1,2
KH2PO4 1,2
CaCl2 2,5
NaHCO3 24,8
Glucosa 10

Tabla 1. Composición en sales de la solución Nutricia Krebs para montaje y ensayo de los anillos
arteriales.

Compuesto Concentración (mmol/l)

NaCl 140
KCl 2,7
MgCl2 4
HEPES 10
EGTA 0,5

2+ 2+
Tabla 2. Composición en sales de la solución 0Ca para registro de Ca intracelular.

77
RESULTADOS

Los resultados experimentales del presente trabajo se dividen en dos bloques

principales de contenido. El primero, que constituye los apartados del 1 al 4, está
dedicado a estudiar los efectos a corto plazo de la Urotensina-II en aorta torácica de
rata, tanto a nivel de arteria completa (contracción vascular) como a nivel de cambios
en la concentración de Ca2+ citosólico de células aisladas. En el segundo bloque, que
comprende los apartados 5 y 6, ahondaremos un poco más en los efectos fisiológicos
del péptido y estudiaremos su repercusión a largo plazo en la fisiología de las CMLV de
aorta; concretamente, en efectos como la proliferación celular y la regulación de la
expresión génica.

1. EFECTO DE LA UROTENSINA-II SOBRE EL TONO VASCULAR EN AORTA

1.1 La Urotensina-II induce vasoconstricción de forma dosis-dependiente en anillos

arteriales, con un importante papel del endotelio

En varios trabajos realizados anteriormente, se ha relacionado la respuesta

vasoconstrictora de la U-II con la disfunción endotelial debida a diversas patologías
(Maguire y col. 2000, Watanabe y col. 2006). Por tanto, el paso inicial en este trabajo fue
evaluar la capacidad de la U-II para promover vasoconstricción en anillos arteriales de
aorta, tanto en vasos con un endotelio funcional como en aquellos que fueron
previamente tratados con N-Nitro-L-arginina (LNNA), un inhibidor de la enzima óxido
nítrico sintasa endotelial (eNOS) que elimina el componente endotelial dependiente de
óxido nítrico (Rees y col. 1990). Este estudio comparativo tiene como finalidad
determinar la dependencia de endotelio del efecto de la U-II en vasoconstricción.

En ambos grupos de tratamiento, se observó que la U-II a la concentración de 100

nmol/l induce un aumento significativo en el tono vascular. Sin embargo, existe un
efecto diferencial en arterias que poseen un endotelio intacto con respecto a aquellas
que fueron tratadas con 100 µmol/l de LNNA 10 minutos antes de la aplicación de U-II.

78
El aumento en tono vascular ejercido por la Urotensina-II a 100 nmol/l (aumento en
fuerza isométrica, expresado en gramos) es significativamente menor en anillos con el
tejido endotelial activo (0,92 + 0,13 g vs. 0,30 + 0,05 g en anillos con y sin tratamiento
con LNNA, respectivamente) (figura 30). Esto confirma que el efecto de la U-II en
vasoconstricción se ve fuertemente atenuado en presencia del endotelio; por tanto, el
resto de los registros en tono vascular contenidos en este trabajo fueron llevados a
cabo en la presencia continua de LNNA.

+ LNNA 100 µmol/l

1,2
*

ΔFuerza isométrica (g)

+ LNNA 1
Fuerza isométrica

0,8
U-II 0,6
0,5 g 0,4

- LNNA 0,2
0
1 10 50 100 100
5 min
U-II, nmol/l

Figura 30. Efecto diferencial de la vasoconstricción mediada por U-II en anillos de aorta con y sin
endotelio activo. Izquierda: registros representativos del aumento en tono vascular de anillos arteriales
tratados con U-II 100 nmol/l, tratados o no con LNNA 100 µmol/l durante 10 minutos (n= 5). En el panel
derecho, resumen estadístico de la contracción vascular promovida por U-II, dependiente o no de
endotelio; y de las distintas concentraciones de U-II sometidas a estudio en los anillos tratados con
LNNA (n= 4-13 anillos). “*”p<0,05

La importancia del endotelio en la contracción vascular inducida por U-II fue

determinada con la dosis de 100 nmol/l, la máxima utilizada en la literatura para
estudiar el efecto del péptido en vasoconstricción (Saetrum-Opgaard y col. 2000, Tasaki y
col. 2004). Sin embargo, después de este paso se testó también la influencia de
concentraciones menores de U-II, con el fin de elucidar la posible dosis-dependencia
de esta contracción. Las figuras 30 y 31 muestran que la aplicación de distintas dosis
de U-II (1, 10, 50 y 100 nmol/l) en experimentos en paralelo con anillos de la misma
arteria incrementa el tono vascular de forma creciente, alcanzándose la máxima
vasoconstricción a la concentración de 100 nmol/l (Δfuerza isométrica: 0,02 + 0,01 g;

79
0,23 + 0,05 g; 0,36 + 0,07 g; y 0,92 + 0,13 g con las dosis de 1, 10, 50 y 100 nmol/l
respectivamente). Al llevar a cabo el ajuste de la curva de dosis-respuesta (figura 31)
comprobamos que la concentración efectiva media (EC50) de la acción del fármaco en
vasoconstricción es de 57,38 nmol/l.

100 nmol/l 1,2

Δ fuerza isométrica (g)

1
EC50 ≈ 57,38 nmol/l
0,8

0,5 g
U-II 0,6
50 nmol/l 0,4
10 nmol/l 0,2
0
2 3 4 5 6 7 89 2 3 4 5 6 7 89
1 10 100
5 min
U-II, nmol/l

Figura 31. Dosis-dependencia de la contracción inducida por U-II. En el panel izquierdo, contracción
vascular en anillos arteriales tratados con 10, 50 y 100 nmol/l de Urotensina-II. El panel derecho
representa la curva dosis-dependencia a escala logarítmica de la vasoconstricción promovida por el
péptido, con una EC50 de 57,38 nmol/l (n= 4-13 anillos). Los datos están expresados en media + error
estándar. El ajuste de la curva se llevó a cabo con la ecuación de Hill.

1.2 La Urotensina-II promueve un aumento en la concentración de Ca2+ intracelular

en células de músculo liso aisladas

El mecanismo intracelular más importante a la hora de promover la contracción del

músculo liso vascular es el aumento en la concentración de Ca2+ citosólico, como se ha
explicado con detenimiento en la Introducción de este trabajo (apartado 3.2.). Por esta
razón, una vez confirmado el relevante efecto de la U-II en el aumento del tono
vascular, se realizaron ensayos de movilización de Ca2+ en CMLV procedentes de
cultivo primario para elucidar el papel del péptido en la regulación del Ca2+
intracelular. En presencia de 2 mmol/l de CaCl2, la U-II (100 nmol/l) es capaz de inducir
un aumento significativo en la concentración de Ca2+ intracelular (Δratio = 0,97 + 0,32
u.a.), como aparece reflejado en la figura 32. Estos resultados muestran que la U-II es
capaz de movilizar el Ca2+ intracelular en CMLV.

80
 Ca2+ 2mmol/l

2,5
2,5
Ratio (340/380nm)

2 2

Ratio (340/380nm)
1,5
1,5 U-II
1

1 0,5

0
0,5 basal + U-II 100 nmol/l
30 seg
2+
Figura 32. En CMLV de aorta, la Urotensina-II promueve un aumento en la concentración de Ca
2+
intracelular. A la izquierda, registro que ilustra los cambios en concentración de Ca intracelular de
2+
CMLV en solución control (con 2 mmol/l de Ca ). La U-II (100 nmol/l) se agregó al medio en el punto
marcado con la flecha. Derecha: diágrama de barras que muestra el resumen estadístico de los
2+
experimentos. El aumento en concentración de Ca se estimó a partir de la ratio al final y al comienzo
del experimento.

Por otra parte, se llevaron a cabo experimentos similares en ausencia de Ca2+

extracelular (solución 0Ca2+, tabla 2 de Material y Métodos) con el fin de evaluar si el
aumento en Ca2+ citosólico promovido por la U-II se debe a una liberación del ión
desde los reservorios, a una entrada desde el medio extracelular o a una combinación
de ambos fenómenos. Así, la figura 33 muestra que la aplicación de U-II 100 nmol/l en
solución 0Ca2+ induce un pequeño incremento en la concentración de Ca2+ que
corresponde a la liberación del ión desde los reservorios intracelulares. 3 minutos
después, que según experimentos previos de curso temporal son suficientes para
vaciar los reservorios e inducir una respuesta máxima del péptido, se añadió 2 mmol/l
de Ca2+ al medio; y se observó una segunda subida más potente en la concentración de
Ca2+ intracelular correspondiente a la entrada del ión a través de la membrana
plasmática. Este aumento en la concentración de Ca2+ intracelular es además
significativamente superior a la entrada pasiva de Ca2+ o leakage que tiene lugar
cuando el mismo protocolo de readición de Ca2+ se lleva a cabo en ausencia de
agonistas (0,84 + 0,06 con 100 nmol/l de U-II vs. 0,25 + 0,03 en experimentos de
leakage; los datos se expresan en unidades arbitrarias).

81
 UTS2R 60 KDa

0Ca2+ + EGTA Ca2+ 2mmol/l U-II 100 nmol/l

2,5
1
Ratio (340/380nm)

2,0 0,8

U-II

Δratio
0,6
1,5
0,4
+ Urantide
1,0
0,2
**
1 min
0,5 0
+ Urantide 100 nmol/l

2+
Figura 33. El incremento de Ca intracelular promovido por la Urotensina-II depende de su receptor
específico. En el panel superior, ensayos de Western Blot confirman la presencia del receptor UTS2R en
2+
CMLV de aorta. Izquierda: registro que muestra los dos componentes del aumento en Ca intracelular
2+
mediado por U-II (100 nmol/l) en ausencia de Ca , así como el efecto inhibitorio de ambos en células
preincubadas durante 1-2 minutos con Urantide 100 nmol/ (línea gris). A la derecha, resumen
estadístico (n= gran nº de células de 4-12 cultivos independientes). “**”p<0,01

Así mismo, el efecto de la U-II en la concentración de Ca2+ citosólico fue estudiado con
otras concentraciones del péptido: 50 nmol/l, 200 nmol/l y 1 µmol/l; tal y como se
representa en la figura 34. En el caso de la dosis de 50 nmol/l, la U-II no es capaz de
inducir una respuesta significativa (0,32 + 0,08 u.a., n= 2). En cuanto al resto de
concentraciones, ninguna de ellas promueve una respuesta mayor que la inducida por
U-II a 100 nmol/l (0,83 + 0,27 y 0,69 + 0,28 en u.a. con las dosis de U-II 200 nmol/l y 1
µmol/l, respectivamente). Por tanto, para los experimentos posteriores la U-II se aplicó
en todos los casos a la concentración de 100 nmol/l.

82
 0Ca2+ + EGTA Ca2+ 2mmol/l
U-II, nmol/l
2
1,2
100 nmol/l
Ratio (340/380nm)

200 nmol/l 1
1,5 1 µmol/l 0,8

Δratio
50 nmol/l 0,6

1 0,4
*
0,2
0
0,5 30 seg 50 100 200 1000

2+
Figura 34. Efecto dosis-dependiente de la U-II en la concentración de Ca intracelular de CMLV.
2+
Registros representativos (izquierda) y estadística (derecha) de los cambios en Ca citosólico en células
2+
tratadas con 50 nmol/l, 100 nmol/l, 200 nmol/l y 1 µmol/l de U-II en solución libre de Ca . La U-II fue
2+
aplicada 3 minutos antes de la readición de Ca 2 mmol/l al medio. (n= gran número de células
procedentes de 2 cultivos independientes). “*” p<0,05

1.3 El incremento en Ca2+ y la vasoconstricción inducidos por Urotensina-II tienen

lugar a través de su receptor específico y mediante la activación de la fosfolipasa C

El siguiente objetivo consistía en determinar la vía de señalización de la U-II, que

comienza por su receptor específico UTS2R siguiendo el esquema propuesto en la
figura 35. Primero, ensayos de Western Blot determinaron la presencia de la proteína
UTS2R en CMLV de aorta (figura 33). A continuación se comprobó su papel en la
movilización de Ca2+; la figura 33 muestra que el efecto del péptido se ve inhibido
drásticamente, tanto la fase en ausencia de Ca2+ como la dependiente de Ca2+
extracelular, cuando las células son pretratadas durante 1-2 minutos con uno de los
inhibidores específicos de UTS2R más potentes, el Urantide (Patacchini y col. 2003), a
100 nmol/l (Δratio= 0,13 + 0,02 vs. 0,84 + 0,06).

Una vez comprobado que el efecto de la U-II en el aumento de Ca2+ intracelular

depende de la activación de su receptor UTS2R, se analizó además la implicación en la
contracción promovida por el péptido de dicho receptor y de la enzima que éste activa,
la fosfolipasa C (PLC) (figura 35).

83
 Urantide Urotensina-II

PLC

DAG

U73122 InsP3

Ca2+

retículo
sarcoplásmico

Figura 35. Primeros pasos en la vía de acción propuesta para la Urotensina-II en CMLV de aorta. La U-II
se uniría a su receptor específico UTS2R anclado en la membrana plasmática. Este receptor, unido a
proteína G, activaría a la fosfolipasa C (PLC) que a su vez sintetiza diacilglicerol (DAG) e InsP3. Éste último
2+
es capaz de promover el vaciado de Ca desde el retículo sarcoplásmico.

Los inhibidores específicos utilizados en este paso del estudio para bloquear la acción
de UTS2R y PLC fueron el Urantide y el U73122, respectivamente.

Los resultados muestran que también el efecto de la U-II en contracción vascular es

dependiente de la funcionalidad de UTS2R. Los anillos de aorta tratados con Urantide
100 nmol/l durante 5 minutos antes de la adición de U-II muestran una
vasoconstricción significativamente menor, de 52,15 + 11,86 % con respecto a anillos
control (figura 36).

Dado que UTS2R se encuentra funcionalmente unido a la proteína Gq11 cuya

activación estimula a su vez a la fosfolipasa C, pasamos a testar la influencia del
inhibidor específico de ésta última, el U73122. Tal y como se ilustra en la figura 37, la
aplicación de 50 µmol/l de U73122 a anillos de aorta de forma previa a la adición de U-
II es capaz de inhibir significativamente la vasoconstricción inducida por el péptido
(47,9 + 5,62 % con respecto a anillos control con U-II).

84
 U-II 100 nmol/l

control 100

U-II 80

% contracción
0,5 g + Urantide *
100 nmol/l 60

40

20

5 min 0
+ Urantide 100nmol/l

Figura 36. La contracción ejercida por Urotensina-II en anillos vasculares depende de la activación de
su receptor específico UTS2R. A la izquierda, se muestra la diferencia en vasoconstricción de dos anillos
tratados con U-II 100 nmol/l, uno de ellos preincubado con Urantide (100 nmol/l) durante 5 minutos.
Derecha: diagrama de barras que muestra los datos estadísticos (n= 3). “*”p<0,05

U-II 100 nmol/l

control 100

80
% contracción

U-II + U73122 50 µmol/l

0,5 g 60 *
40

20

0
5 min + U73122 50 µmol/l

Figura 37. Efecto de la inhibición de la fosfolipasa C en la vasoconstricción mediada por Urotensina-II.

Panel izquierdo: registro representativo de la contracción vascular promovida por U-II 100 nmol/l en
anillos control y en anillos pretratados durante 60 minutos con el inhibidor de la fosfolipasa C, U73122
(50 µmol/l). A la derecha, resumen estadístico de los experimentos (n= 5). “*”p<0,05

Tomados en conjunto, estos datos confirman que la acción de la U-II tiene lugar
mediante la activación de su receptor específico, así como a través de la enzima
fosfolipasa C.

85
2. PAPEL DE LOS CANALES IÓNICOS EN LA VASOCONSTRICCIÓN MEDIADA
POR LA UROTENSINA-II

2.1 Los canales de Ca2+ voltaje-dependientes participan de forma parcial en la

contracción inducida por Urotensina-II

El siguiente paso del estudio fue comprobar si la activación de la cascada de

señalización dependiente de UTS2R y fosfolipasa C podía modular la apertura de
canales de Ca2+ de forma posterior al vaciado del retículo sarcoplásmico, de la manera
propuesta en la figura 38.

2APB/Gd3+/ML9 Urotensina-II
Nifedipina
VOC SOC

PLC

Ca2+ Ca2+ DAG

↑ [Ca2+]i
InsP3
CONTRACCIÓN
VASCULAR
Ca2+
vaciado de los
reservorios de Ca2+
retículo
sarcoplásmico

2+
Figura 38. Modelo propuesto para la entrada de Ca y subsiguiente contracción vascular mediada por
Urotensina-II en CMLV. Una vez elucidados los primeros pasos de la ruta de señalización de la U-II, se
2+
estudió la vía de entrada del ión al interior celular, mediante dos de los canales de Ca más relevantes
en músculo liso: los voltaje-dependientes (VOC) que se inhiben por antagonistas como la nifedipina; y
3+
los SOC, sensibles a 2APB, Gd y ML9.

Para ello, analizamos primero el papel de la vía de los canales voltaje-dependientes

(VOC) con uno de sus bloqueantes más empleados, la nifedipina, en la contracción
vascular. El tratamiento con nifedipina 1 µmol/l induce una vasodilatación de las
arterias precontraídas con U-II 100 nmol/l de hasta un 54,53 + 1,76 %. Sin embargo, la
subsiguiente aplicación de 2-aminoetildifenil borato o 2APB (50 µmol/l), conocido

86
inhibidor de los SOC (Smani y col. 2007), consigue relajar de forma prácticamente
completa el componente de contracción resistente a nifedipina (86,15 + 6,6 %), como
aparece ilustrado en la figura 39.

U-II 100 nmol/l

Nif 1 µmol/l 2APB 50 µmol/l
LNNA 200uM 100

80

% contracción
60 *
0,5 g U-II
40
**
20

0
10 min +Nif +2APB
1 µmol/l 50 µmol/l

Figura 39. El componente resistente a nifedipina en la vasoconstricción mediada por U-II se revierte
mediante la acción de 2APB. Registro representativo (izquierda) y resumen de datos (derecha) de la
relajación vascular mediada por nifedipina (Nif, 1 µmol/l) y 2APB (50 µmol/l) en anillos arteriales
precontraídos con U-II (100 nmol/l) (n= 5). “*”p<0,05 y “**”p<0,01.

Estos resultados muestran que la vía de los canales de Ca2+ voltaje-dependientes se

encuentra implicada, aunque sólo parcialmente, en la vasoconstricción inducida por la
U-II. Sin embargo, el componente de contracción resistente a la inhibición de esta vía
puede relajarse mediante la inhibición de los SOC.

2.2 El aumento en tono vascular mediado por la Urotensina-II se revierte

completamente mediante la inhibición farmacológica de los canales SOC

Una vez elucidado el papel de los canales VOC en el efecto de la U-II, pasamos a
estudiar más detenidamente la implicación de los canales SOC. La aplicación de un
inhibidor de los SOC ampliamente usado, el dietilestilbestrol (DES, 2 µmol/l) (Smani y
col. 2007) en arterias precontraídas con U-II a 100 nmol/l logra revertir esta contracción
vascular de una forma significativa (% de relajación = 64,15 + 5,08 % a los 30 minutos
de su aplicación). También el 2APB, aplicado en dosis crecientes de 10, 30 y 50 µmol/l,
ejerce un potente efecto vasodilatador en anillos contraídos con U-II, con una EC50 =

87
6,7 µmol/l (figura 40). El porcentaje de relajación tras la aplicación de la última dosis
de 2APB es de 94,03 + 2,66 %; por tanto, este fármaco logra devolver a los anillos a su
tensión basal previa al experimento.

2APB, µmol/l
A
10
* 100
80 EC50≈ 6,7 μmol/l

% contracción
0,5 g 30 60
U-II * 40
50
* 20

2 3 4 5 6 7 89 2 3 4 5 67
1 10

10 min 2APB, μmol/l

U-II + DES 2 µmol/l

B DES 2 µmol/l

100

80
% contracción

0,5 g 60
**
40
U-II
20

0
0 30

10 min Tiempo, min

Figura 40. La aplicación de inhibidores farmacológicos de los SOC revierte la vasoconstricción inducida
por U-II. A la izquierda, registros representativos de anillos tratados con U-II 100 nmol/l y relajados con
dosis sucesivas de 10, 30 y 50 µmol/l de 2APB (A) o DES 2 µmol/l (B). En el panel derecho: (A) ajuste de
la curva a escala logarítimica de la dosis-dependencia del efecto de 2APB, donde la EC50 es de 6,7 µmol/l
(n= 4). El ajuste de la curva se realizó con la ecuación sigmoidal. (B) datos estadísticos de la relajación
por DES, expresados en porcentaje de contracción normalizado a máxima respuesta de U-II (n= 5). “**”
p<0,01

88
2.3 La entrada de Ca2+ inducida por Urotensina-II también puede ser revertida por el
uso de fármacos inhibidores de los SOC

A nivel celular, se confirma también el efecto de varios inhibidores de los SOC, como el
2APB (75 µmol/l) y el gadolinio (Gd3+, 5-10 µmol/l) (Domínguez-Rodríguez y col. 2012), a
la hora de prevenir la entrada de Ca2+ mediada por U-II. Así, el Δratio es de 0,354 + 0,1
y 0,428 + 0,12 (u.a.) en células pretratadas con 2APB y Gd3+ respectivamente (figura
41). En la misma figura se muestra, además, que la entrada de Ca2+ inducida por U-II
posee una magnitud y una cinética similares a la mediada por tapsigargina (TG, 2
µmol/l), fármaco promotor de la SOCE por inhibición de la SERCA y vaciado pasivo del
ER/SR (Parekh y Putney, 2005) (0,86 + 0,08 u.a.).

0Ca2+ + EGTA Ca2+ 2 mmol/l

2,5 U-II 100 nmol/l
1
Ratio (340/380nm)

2,0 0,8
TG
U-II *
Δratio

U-II/TG 0,6
1,5 **
U-II + 2APB
0,4
*
1,0 0,2

0
0,5 + Gd 3+ + 2APB TG 2 µmol/l
1 min 5-10µmol/l 75µmol/l

3+ 2+
Figura 41. El tratamiento de CMLV con 2APB o Gd previene la entrada de Ca promovida por la U-II.
2+
A la izquierda, registro de los cambios en Ca intracelular en células tratadas con U-II 100 nmol/l (línea
2+
negra) o con tapsigargina (TG, 2 µmol/l) (línea gris claro) 3-4 minutos antes de la readición de Ca 2
mmol/l. El registro en color gris oscuro corresponde a células incubadas con U-II y tratadas con 2APB 75
µmol/l en el punto marcado con el asterisco. A la derecha, resumen de los experimentos, donde se
3+
incluye el estudio del efecto en células incubadas 10 minutos con Gd (5-10 µmol/l) y después tratadas
con U-II (n= 3-6 cultivos). “*”p<0,05 y “**”p<0,01 en el tratamiento con inhibidores vs. control con U-II.

Además, se estudió el efecto de otro inhibidor de los SOC descrito recientemente por
varios autores en distintos tipos celulares, el ML9 (Smyth y col. 2008, Potier y col. 2009),
que en este caso fue aplicado tras la readición de Ca2+ al medio en dosis sucesivas de

89
25 y 50 µmol/l (figura 42). El resultado fue una inhibición prácticamente completa del
aumento en Ca2+ intracelular promovido por la U-II (Δratio = 0,614 + 0,07 y 0,353 +
0,07 tras la aplicación de 25 y 50 µmol/l de ML9, respectivamente).

0Ca2++ EGTA Ca2+ 2mmol/l

U-II 100 nmol/l
2 ML9 25 µmol/l
1
ML9 50 µmol/l
0,8
*
Ratio (340/380)

1,5

Δratio
0,6
**
0,4
1
+ U-II 0,2

0
0,5 1 min + ML9 + ML9
25 µmol/l 50 µmol/l

2+
Figura 42. La aplicación de dosis crecientes de ML9 tras la readición de Ca al medio revierte la
2+
entrada de Ca mediada por U-II. Izquierda: registro que muestra la inhibición por ML9 de la entrada de
2+
Ca en una célula tratada con U-II 100 nmol/l. Las sucesivas dosis del fármaco se aplicaron en los puntos
del registro marcados con flechas, en intervalos de 2-3 minutos. A la derecha, resumen de los datos
expresados en Δratio (n= 4 cultivos). “*”p<0,05 y “**”p<0,01.

Estos datos y los reseñados en el apartado anterior muestran el importante papel que
la SOCE juega en los efectos a corto plazo de la U-II, tanto a nivel de vasoconstricción
en arteria completa como en el aumento de Ca2+ intracelular en CMLV.

2.4 La Urotensina-II induce corrientes iónicas similares a ICRAC en células de músculo

liso vascular, que se inhiben por bloqueantes de los SOC

Dando un paso más allá, y en colaboración con el equipo del Dr. Mohamed Trebak en
Albany (New York, US) se realizaron experimentos de electrofisiología o patch-clamp
con el fin de determinar la posible activación por la U-II de la denominada corriente de
Ca2+ activada por liberación de Ca2+ (ICRAC) como medio de entrada de Ca2+ al citosol en
CMLV. La figura 43 muestra que la diálisis de CMLV con una solución interna de BAPTA

90
a 1 mmol/l no induce ninguna corriente ICRAC durante los 6 minutos de duración del
registro. Sin embargo, en las mismas condiciones, la U-II (1 µmol/l) sí es capaz de
promover una corriente entrante significativamente superior a la corriente basal; a su
vez, esta corriente entrante es totalmente inhibida por la adición de Gd3+ a 5 µmol/l
(figura 44A) lo que indica su similitud con la corriente ICRAC.

A 150 nmol/l Ca2+ en pipeta B -100 0 100

DVF + 0.0
+ mV
+
-0,5

pA/pF
0,2 pA/pF
2 min
* -1,0

Densidad de la corriente de
150 nmol/l Ca2+ en pipeta C
n=7
U-II Gd3+ 5 µmol/l 0,12
**
*
Ca2+ (pA/pF)

DVF 0,10
0,08
+ 0,06
0,04
0,02 n=3
0,2 pA/pF
0,00
2 min
Control U-II
*
2+
Figura 43. La aplicación de U-II induce corrientes de Ca similares a ICRAC en CMLV. A: registros
representativos de las corrientes iónicas en células control (panel superior) y tratadas con U-II 1 µmol/l +
3+
Gd 5 µmol/l (panel inferior) tanto en solución control como en DVF. B: relación intensidad/voltaje de
2+
las corrientes de Ca en células control (en negro) y tratadas con U-II (gris). C: análisis estadístico de la
densidad de corriente de ambos grupos de tratamiento en solución control (n= 3-7 experimentos
independientes). “***” p<0,01

Dado que la corriente inducida por U-II es de pequeña magnitud, también se llevaron a
cabo experimentos en soluciones de registro libres de cationes divalentes (divalent
free cations o DVF), que promueven una mayor conductancia de Na+ a través de los
canales SOC. En la figura 44A, la corriente inducida por U-II en solución DVF es
significativamente mayor que antes de la aplicación del péptido. El análisis de la curva
de intensidad de corriente/voltaje (I/V) confirma que la corriente registrada es de

91
entrada rectificada (inward rectifier) una característica electrofisiológica distintiva de la
corriente ICRAC (Parekh y Putney, 2005) (figura 44B).

A 150 nmol/l Ca2+ en pipeta B -100 0 100

- 0.0
DVF mV
*
+
-0,5

pA/pF
*
0,2 pA/pF
2 min
* -1,0

Densidad de las corrientes de

150 nmol/l Ca2+ en pipeta C n=5
0,35
Gd3+ 5 µmol/l ***

Na+ (pA/pF)
U-II 0,30
DVF 0,25
0,20
+ 0,15
0,10
n=3
0,05
0,2 pA/pF 0,00
2 min Control U-II
*
+
Figura 44. La adición de U-II en medio libre de cationes divalentes promueve corrientes de Na de
3+
mayor magnitud. A: registros de corrientes iónicas en células control y células tratadas con U-II + Gd ,
+
similares a los representados en la figura 14A. B: curva de intensidad/voltaje de las corrientes de Na en
células control (negro) e incubadas con U-II (gris), donde se aprecia la entrada rectificada de la corriente
inducida por el péptido. C: Análisis estadístico de la diferencia entre las corrientes en DVF (corrientes de
+
Na ) en células con y sin tratamiento con U-II (n= 3-5). “***” p<0,01

Estos datos complementarios sugieren que la entrada de Ca2+ mediada por U-II en
CMLV tendría lugar mediante una corriente catiónica que muestra características
eléctricas y farmacológicas muy similares a ICRAC, la primera corriente iónica operada
por reservorio que ha sido descrita, presente en una gran variedad de tipos celulares
(Parekh y Putney, 2005).

92
3. IMPLICACIÓN DE LOS NUEVOS COMPONENTES MOLECULARES DE LA
SOCE, STIM1 Y ORAI1, ASÍ COMO DE TRPC1 EN LA ENTRADA DE Ca2+
PROMOVIDA POR LA UROTENSINA-II

Los resultados obtenidos en los apartados anteriores indican que la U-II ejerce
aumento en Ca2+ intracelular y contracción vascular de forma dependiente de la
activación de los SOC. Para ahondar un poco más en la demostración de esta hipótesis,
se determinó el efecto del silenciamiento a nivel celular de dos proteínas clave en su
ruta de señalización, Stim1 y Orai1 (figura 45), que constituyen respectivamente el
sensor de los niveles de Ca2+ en el ER/SR y la proteína formadora del poro del canal
SOC (apartados 4.2.1 y 4.2.2 de la Introducción).

siRNA siRNA Urotensina-II

TRPC1 SOC/Orai1

PLC
?
Ca2+ Ca2+ DAG

siRNA InsP3

vaciado de los Ca2+

reservorios de Ca2+
STIM1
retículo
sarcoplásmico

Figura 45. Modelo propuesto para la interacción entre los canales SOC y TRPC1 a la hora de promover
2+
la entrada de Ca mediada por Urotensina-II. Para estudiar esta posible interacción, se utilizaron siRNA
específicos que inhiben distintos puntos de la vía: Stim1, Orai1 y TRPC1. Según nuestra hipótesis, es
probable que la apertura del canal SOC inducida por el vaciado de los reservorios promueva a su vez la
2+
activación de TRPC1. Por tanto, ambos canales participarían en la entrada de Ca ejercida por la U-II.

93
Así mismo, se analizó la influencia del canal catiónico TRPC1, que en varios estudios se
ha relacionado de una forma bastante directa con la activación de la SOCE (Sweeney y
col. 2002; Brueggemann y col. 2006; Ong y col. 2007; Cheng y col. 2011). Los componentes
de la vía que fueron silenciados molecularmente mediante la transfección con ARN
interferente (siRNA) se encuentran esquematizados en la figura 45, así como la posible
interacción entre el canal SOC y TRPC1, a través de la cual la U-II promovería la entrada
de Ca2+ en el citoplasma celular.

Primero se comprobó que la transfección con siRNA para los ARN mensajeros de estas
tres moléculas se traduce en una disminución significativa de sus proteínas diana
(figuras 46 y 47). Más tarde, en ensayos de movilización de Ca2+ llevados a cabo 72
horas después de la transfección, se vio que las CMLV silenciadas para Stim1 (figura
46) sufren una inhibición drástica de la entrada de Ca2+ inducida por U-II (100 nmol/l)
en comparación con la que tiene lugar en las células tratadas con siRNA control para
GADPH o siRNA scramble (control negativo). Se observó este mismo efecto en las
células silenciadas para Orai1, que mostraron una inhibición de la entrada de Ca2+
regulada por U-II de magnitudes similares (0,31 + 0,11 u.a. vs. 0,84 + 0,15 u.a. en
células siOrai1 y scramble, respectivamente) (figura 46).

En ambos casos, se trata de una inhibición tan potente que la entrada de Ca2+ residual
en las células silenciadas para Stim1/Orai1 no es significativamente diferente de la que
tiene lugar por flujo pasivo de Ca2+ en los experimentos de leakage, mencionados en el
apartado 1.2. Estos resultados confirman el papel crucial que los principales
componentes de la SOCE juegan en el aumento en Ca2+ intracelular mediado por U-II.

94
 A Stim1 Orai1

actin tubulin

B 0Ca2++ EGTA Ca2+ 2mmol/l U-II 100 nmol/l

2,5 1
Ratio (340/380nm)

scramble 0,8
2
0,6

Δratio
1,5 *
0,4
1 siSTIM1
0,2

0,5 0
1 min Control sin scramble siStim1
transfectar

U-II 100 nmol/l

C 0Ca2++ EGTA Ca2+ 2 mmol/l
2 1

0,8
Ratio (340/380nm)

scramble
1,5
0,6
Δratio

*
+ U-II siOrai1 0,4
1
0,2

0,5 0
Control sin scramble siOrai1
1 min transfectar

2+
Figura 46. La entrada de Ca promovida por la U-II depende de la expresión de Stim1 y Orai1. A:
ensayos de Western Blot muestran los niveles de expresión de la proteína Stim1 (panel izquierdo) u
Orai1 (panel derecho) en células sin transfectar (control), transfectadas con siRNA scramble (scramble) y
en células silenciadas para Stim1/Orai1 (siStim1/siOrai1) (n= 2). B: en el panel izquierdo, registros
2+
representativos que ilustran el aumento en Ca intracelular promovido por la U-II en células scramble y
silenciadas para Stim1 (siStim1). A la derecha, resumen de los resultados (n= 3). C: registros
2+
representativos y resumen de datos de la entrada de Ca inducida por U-II 100 nmol/l en células
silenciadas para Orai1 (siSOrai1) y células scramble (n= 3). “*”p<0,05

95
Por otra parte, la figura 47 muestra que en células tratadas con siRNA para TRPC1 la U-
II también induce una entrada de Ca2+ significativamente menor cuando se las
compara con las células scramble. Estos datos revelan que la entrada de Ca2+ inducida
por U-II también depende, al menos en parte, de la activación de TRPC1, que se
encuentra estrechamente relacionado con la vía de señalización de los canales SOC y
algunos de sus efectos a nivel fisiopatológico (Ong y Ambudkar 2011).

U-II 100 nmol/l

0Ca2+ + EGTA Ca2+ 2mmol/l
1
2
0,8
Ratio (340/380nm)

scramble
1,5 0,6

Δratio
*
+ U-II 0,4
1 siTRPC1
0,2

0,5 0
Control sin scramble siTRPC1
1 min transfectar
2+
Figura 47. El efecto de la Urotensina-II en aumento de Ca intracelular se ve afectado por el
silenciamiento de TRPC1. Panel superior: ensayo de Western Blot que muestra los niveles proteicos de
TRPC1 en células sin transfectar (control), scramble y transfectadas con siRNA para TRPC1 (siTRPC1). En
2+
la parte inferior, registro que ilustra el efecto de la U-II (100 nmol/l) en la concentración de Ca
citosólico de células scramble y silenciadas para TRPC1. Panel derecho: resumen estadístico de los datos
(n=3). “*”p<0,05

4. PAPEL DE LA FOSFOLIPASA A2 INDEPENDIENTE DE Ca2+ (iPLA2),

REGULADORA DE LA ENTRADA DE Ca2+ A TRAVÉS DE LOS SOC, EN LA
RESPUESTA A UROTENSINA-II

El último paso referente a los efectos a corto plazo de la U-II en músculo liso vascular
se centra en el papel de la fosfolipasa A2 independiente de Ca2+ (iPLA2). Varios estudios
determinan la importancia de esta enzima como reguladora de la activación de los SOC
tras el vaciado de los reservorios (Smani y col. 2004, 2007; Bolotina 2008) (figura 48). Por

96
lo tanto, parece relevante caracterizar su implicación en los efectos de la U-II, tanto a
nivel de cambios en la concentración de Ca2+ intracelular como en base a la
contracción vascular.

BEL/S-BEL Urotensina-II
SOC/Orai1

iPLA2β
PLC

DAG
Ca2+

InsP3

vaciado de los reservorios Ca2+

de Ca2+
STIM1
retículo
sarcoplásmico

2+
Figura 48. Posible implicación de la iPLA2 en la entrada de Ca vía SOC y la contracción vascular
promovidas por la Urotensina-II. En los últimos experimentos de este primer apartado, el objetivo es
2+
comprobar la implicación de la enzima iPLA2 como reguladora de la entrada de Ca a través de los SOC;
y sin la cual los efectos de la U-II a corto plazo se verían claramente reducidos.

4.1 La Urotensina-II aumenta la actividad de la iPLA2 en células de músculo liso de

aorta

Primero, se realizaron ensayos específicos de actividad enzimática para determinar si

la aplicación de U-II a CMLV en cultivo primario podía tener alguna influencia en la
actividad de iPLA2. La figura 49 muestra que las CMLV incubadas 5 minutos con U-II
100 nmol/l ven la actividad de la enzima significativamente incrementada con respecto
a aquellas sin ningún tratamiento (1,08 + 0,20 vs. 0,27 + 0,11 en u.a.). Este efecto cursa
mediante la activación de UTS2R, ya que el tratamiento previo con Urantide (100
nmol/l) durante 5 minutos antes de la adición de U-II logra prevenir este aumento en
la actividad de iPLA2 (0,32 + 0,13 u.a.). Además, la incubación durante 30 minutos con
BEL (25 µmol/l), inhibidor específico de la enzima, antes de la aplicación de U-II inhibe

97
también este efecto promovido por el péptido (0,15 + 0,07 u.a.). Estos datos indican
que la U-II, a través de la unión a su receptor, es capaz de aumentar la actividad
enzimática de iPLA2 de manera específica.

U-II 100 nmol/l

1,4 **
Actividad iPLA 2 (U.A.)

1,2
1
0,8
0,6 ††
0,4 ††
0,2
0
Control sin tratar + BEL + Urantide
25 µmol/l 100 nmol/l

Figura 49. El tratamiento de CMLV con Urotensina-II promueve un aumento en la actividad de la iPLA2,
que se revierte con el pretratamiento con BEL y Urantide. Resumen de los datos obtenidos en el
ensayo de actividad enzimática de iPLA2: en control sin tratar, en células tratadas con U-II 100 nmol/l 5
minutos, y en células preincubadas durante 30 minutos con BEL 25 µmol/l o 5 minutos con Urantide 100
nmol/l antes del tratamiento con U-II. Los datos de actividad se muestran en unidades arbitrarias (n= 5-
10). “**”p<0,01 en células tratadas con U-II vs. células sin tratar.”†”p<0,01 en tratamientos con
inhibidores vs. células tratadas con U-II.

4.2 El inhibidor específico de la iPLA2 revierte la contracción vascular mediada por la

Urotensina-II

De la misma forma, se analizó el efecto del inhibidor de la enzima en la contracción

vascular mediada por U-II. A anillos de aorta precontraídos con U-II 100 nmol/l se les
aplicaron dosis crecientes de BEL (10, 15 y 25 µmol/l) consiguiéndose una inhibición
prácticamente completa del efecto de la U-II en vasoconstricción, con un ajuste de la
curva dosis-dependencia donde la EC50 del efecto de BEL es de 11,31 µmol/l (figura
50). El porcentaje de relajación vascular alcanzado por el tratamiento con BEL fue de
33,8 + 2,45 %, 62,84 + 3,89 % y 91,71 + 2,49 % con las dosis de 10, 15 y 25 µmol/l,
respectivamente.

98
Figura 50. BEL, el inhibidor específico de iPLA2, revierte la vasoconstricción inducida por Urotensina-II
de forma dosis-dependiente. A la izquierda, registro representativo de un anillo arterial contraído con
U-II 100 nmol/l y la inhibición completa de este efecto tras la aplicación de dosis sucesivas de BEL (10, 15
y 25 µmol/l). A la derecha, ajuste de la curva a escala logarítmica del efecto dosis-dependiente de BEL
(EC50=11,31 µmol/l) (n= 5). El ajuste se realizó con la ecuación sigmoidal.

4.3 La entrada de Ca2+ inducida por Urotensina-II es sensible a la inhibición de la

isoforma β de iPLA2, pero no a la de la isoforma γ.

Finalmente, se analizó la influencia de la iPLA2 sobre el aumento en Ca2+ intracelular

inducido por U-II, discriminando entre las isoformas de la enzima con ayuda de los
distintos enantiómeros de BEL, R-BEL y S-BEL; que poseen especificidad para las
isoformas iPLA2γ e iPLA2β, respectivamente (Jenkins y col. 2002, Park y col. 2008).

Así, el efecto de la U-II en aumento de Ca2+ intracelular se ve efectivamente inhibido

por la preincubación de las células con S-BEL 25 µmol/l, pero no cuando se lleva a cabo
el tratamiento con la misma concentración de R-BEL. La figura 51 muestra que el
aumento en Ca2+ mediado por U-II en células tratadas 30 minutos a 37 ºC con S-BEL
antes del experimento es de 0,44 + 0,13 u.a., en comparación con aquellas a las que se
aplicó R-BEL en las mismas condiciones, que tuvieron un aumento de ratio de 0,70 +
0,17; valor no significativamente diferente al de las células tratadas sólo con U-II 100
nmol/l (0,84 + 0,06 u.a.).

99
 U-II 100 nmol/l
0Ca2++ EGTA Ca2+ 2 mmol/l
* †
2,5 1
Ratio (340/380nm)

+ R-BEL 0,8
2,0
U-II
0,6

Δratio
1,5
+ S-BEL
0,4
1,0
0,2
0,5 0
1 min + R-BEL +S-BEL
25 µmol/l 25 µmol/l
2+
Figura 51. La entrada de Ca promovida por U-II depende de la activación de iPLA2β, pero no de
2+
iPLA2γ. En el panel izquierdo se muestra el aumento en Ca citosólico en células incubadas con R-BEL ó
S-BEL (25 µmol/l) durante 30 minutos a 37 ºC; y después tratadas con U-II 100 nmol/l de la forma
anteriormente descrita. A la derecha, resumen estadístico de los resultados (n= 3 cultivos). “*”p<0,05 en
células tratadas con S-BEL + U-II vs. control con U-II. “†”p<0,05 en el tratamiento con S-BEL vs.
tratamiento con R-BEL.

Estos resultados demuestran que es la isoforma β de la iPLA2 la implicada

mayoritariamente en los efectos de la U-II en cuanto a aumento de Ca2+ intracelular.
En cambio, la isoforma γ de la enzima no parece guardar una relación significativa con
este efecto del péptido.

5. LA UROTENSINA-II ESTIMULA LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS DE

MÚSCULO LISO VASCULAR

Los resultados obtenidos en los apartados anteriores nos han permitido determinar la
vía molecular por la cual la U-II ejerce dos importantes efectos a corto plazo: aumento
del Ca2+ intracelular en CMLV y contracción vascular. Sin embargo, como se explica en
detalle en la Introducción de este trabajo (apartados 3.3 y 5.1), el aumento en Ca2+
citosólico no sólo se encuentra implicado en los mecanismos de la vasoconstricción; es,
además, un evento clave a la hora de regular otros procesos que requieren cursos
temporales más prolongados. Así, la segunda parte de este estudio está dedicada a

100
comprobar si el efecto de la U-II en cuanto a aumento de Ca2+ intracelular podría
repercutir también en algunos de estos procesos celulares a largo plazo, como la
regulación de la expresión génica y la proliferación del músculo liso vascular.

5.1. La incubación a largo plazo con Urotensina-II promueve cambios en la entrada

de Ca2+ regulada por los reservorios de CMLV

Cuando se mantienen en cultivo a bajo porcentaje de suero, las CMLV poseen un

fenotipo más similar al fisiológico o contráctil, así como una menor capacidad de
movilización de Ca2+ intracelular ante estímulos como el vaciado del RS (Berra-Romani y
col. 2008, Potier y col. 2009). El primer objetivo en esta parte del trabajo fue determinar
si, en estas condiciones de cultivo, la incubación a largo plazo de CMLV con U-II era
capaz de inducir cambios a nivel de entrada de Ca2+ como respuesta al vaciado de los
reservorios. Los datos representados en la figura 52 muestran que, efectivamente, la
entrada de Ca2+ inducida por la aplicación de TG (2 µmol/l) es significativamente más
potente en células tratadas con 100 nmol/l de U-II durante 48 horas, en comparación
con las células que no recibieron ningún tratamiento previo (Δratio = 0,73 + 0,06 u.a.
en células incubadas con U-II vs. 0,46 + 0,04 u.a. en células sin tratar).

0Ca2++ EGTA Ca2+ 2mmol/l

2 TG 2 µmol/l

0,8
Ratio (340/380nm)

0,1% FBS + U-II

1,5
0,6
TG 0,1% FBS
Δratio

0,4
1
0,2

0
0,5 + U-II 100 nmol/l
1 min
2+
Figura 52. La incubación a largo plazo con U-II induce cambios en la entrada de Ca regulada por los
2+
reservorios. A la izquierda, registros representativos de la movilización de Ca intracelular en células
cultivadas con 0,1% de FBS, tratadas o no 48 horas con U-II a 100 nmol/l. La tapsigargina (2 µmol/l) se
2+ 2+
agregó en el punto marcado por la flecha en ausencia de Ca extracelular, y se añadió Ca mmol/l al
medio después de 3-4 min. Derecha: resumen estadístico de los experimentos mostrados a la izquierda.

101
Estos resultados demuestran que la U-II es capaz de promover cambios en el
comportamiento celular mediante su aplicación a largo plazo, lo que sugiere que ésta
podría encontrarse implicada en los procesos que tienen lugar durante la modulación
fenotípica de las CMLV.

5.2 La Urotensina-II induce proliferación celular a las 24 y 48 horas de su aplicación

A continuación, y teniendo en cuenta que la proliferación celular depende en gran

medida de los niveles de Ca2+ intracelulares que se ven aumentados en presencia de U-
II, estudiamos si ésta podía inducir proliferación en CMLV de aorta. Se empleó en
primer lugar un ensayo de proliferación con el reactivo AlamarBlue, que calcula el
crecimiento celular de forma indirecta a partir del aumento en el metabolismo.

45
40
35 *
% crecimiento celular

30
* *
Control
25
* U-II 10 nmol/l
20 24h * U-II 50 nmol/l
15 48h U-II 100 nmol/l
10
5
0
0h

Figura 53. Ensayos con AlamarBlue muestran que la U-II promueve proliferación en CMLV a las 24 y 48
horas de su aplicación. Resumen estadístico del crecimiento celular a lo largo de 48 horas en células
control o tratadas con distintas concentraciones de U-II (10, 50 y 100 nmol/l). Los datos se encuentran
normalizados al tiempo cero del experimento (n= 2-6 cultivos independientes). “*” p<0,05 respecto a
control.

Así, la figura 53 muestra que la U-II es capaz de inducir, de forma dosis-dependiente,

un aumento significativo en crecimiento celular a las 24 y 48 horas de su aplicación a
cultivo primario de CMLV. Para este ensayo, se estudió el efecto de la U-II a las
concentraciones de 10, 50 y 100 nmol/l, observándose el mayor efecto en crecimiento
con las dosis de 10 y 50 nmol/l (a las 48 horas: 33,19 + 3,46 % y 29,54 + 10,68 %,

102
respectivamente, de aumento en proliferación; en comparación con un 18,40 + 4,03 %
de crecimiento en células control).

5.3 El marcaje con BrdU confirma el efecto inductor de proliferación de la

Urotensina-II

Para confirmar este efecto, seguidamente se contrastaron los resultados con otro
ensayo de proliferación diferente, que permite realizar un contaje directo del número
de células que se han dividido en un periodo determinado de tiempo: el marcaje con
bromodeoxiuridina (BrdU).

Los ensayos de marcaje con BrdU en células incubadas con U-II confirmaron que ésta,
a las 24 y 48 horas de su aplicación, es capaz de inducir un aumento de proliferación en
comparación con las células que no han recibido ningún tratamiento (figura 54).

**
100
para BrdU (24h)
% fluorescencia

80
Control U-II 100 nmol/l (48h)
60
40
20
0
50 100

BrdU U-II, nmol/l

100
**
para BrdU (48h)
% fluorescencia

80
60
40
DAPI 20
0
+ U-II 100 nmol/l

Figura 54. El marcaje con BrdU confirma que la U-II induce proliferación en CMLV. A la izquierda,
imágenes representativas de la fluorescencia para BrdU (en verde) y DAPI (en azul) en CMLV sin tratar
(control) y tratadas durante 48 horas con U-II a 100 nmol/l. El marcaje con DAPI se analizó como control
positivo del experimento. Derecha: resumen estadístico de la proliferación inducida por U-II a las 24
horas (panel superior) y 48 horas (panel inferior). Los datos están normalizados a máxima respuesta (n=
2-4 cultivos independientes). “**” p<0,01

103
De esta forma, las CMLV tratadas con 100 nmol/l de U-II durante 24 o 48 horas
proliferaron un 50,06 + 14,11 % y un 45,11 + 8,12 % más que las células control,
respectivamente. En cambio, la concentración de 50 nmol/l no tuvo un efecto
significativo, ya que en este caso el aumento en proliferación fue tan sólo de 9,46 +
11,60 % a las 24 horas.

Tomados en conjunto, estos datos prueban que la U-II es capaz de promover un

incremento relevante en la proliferación del músculo liso vascular, consiguiéndose el
máximo efecto con la concentración de 100 nmol/l.

5.4 El aumento en proliferación mediado por Urotensina-II se inhibe mediante el

tratamiento con inhibidores de los SOC

A continuación se analizó la implicación de la vía de los canales SOC en esta

proliferación celular, para comprobar si posee la misma relevancia que en los otros
efectos de la U-II anteriormente estudiados.

Los resultados indican que las células incubadas con 50 µmol/l de 2APB 5 minutos
antes del tratamiento con U-II (100 nmol/l) muestran un nivel de proliferación no
estadísticamente diferente del que poseen las células sin tratar; así, este grupo de
tratamiento posee un 67,98 + 12,59 % menos de núcleos positivos para BrdU que las
células tratadas sólo con U-II, como aparece reflejado en la figura 55.

También la incubación previa con ML9 logra inhibir de una forma significativa este
efecto del péptido. Las células que fueron tratadas con ML9 a 5 µmol/l 5 minutos antes
de la aplicación de U-II mostraron una proliferación 62,55 + 8,70 % menor que las
tratadas tan sólo con U-II (figura 55).

104
 U-II 100 nmol/l

ML9 5 µmol/l 2APB 50 µmol/l

U-II 100 nmol/l

% fluorescencia para BrdU

100
80

BrdU 60
40
20
0
+ ML9 + 2APB
5 µmol/l 50 µmol/l
DAPI

Figura 55. El efecto de la U-II en proliferación se revierte mediante el tratamiento previo con 2APB o
con ML9. Izquierda: imágenes de la fluorescencia para BrdU y DAPI en células tratadas 48 horas con U-II
100 nmol/l, y en células incubadas durante 5 minutos con 2APB 50 µmol/l o con ML9 5 µmol/l + 48
horas con U-II. En el panel derecho, el diágrama de barras muestra un resumen de los resultados,
expresados en % de núcleos positivos para BrdU y normalizados a la máxima respuesta con U-II (n= 2-4
cultivos independientes). “**” p<0,01

Estos datos demuestran que los canales SOC juegan un importante papel en la
proliferación inducida por U-II, de la misma forma que ocurre con el resto de efectos
del péptido estudiados en la primera parte de este trabajo. Por tanto, los resultados
sugieren también que el aumento en Ca2+ citosólico mediado por el péptido puede
ejercer efectos a largo plazo en CMLV.

5.5 El silenciamiento de Stim1 logra revertir la proliferación inducida por Urotensina-

II

Una vez comprobado que la inhibición de los canales SOC parece afectar de forma
importante a la proliferación mediada por U-II, pasamos a estudiar el papel de las
proteínas que pudieran encontrarse implicadas en su ruta de señalización.
Comenzamos con el silenciamiento molecular de Stim1, proteína encargada de sensar
los niveles de Ca2+ en el interior del retículo y activadora de la SOCE.

105
Así, la figura 56 muestra cómo la transfección de CMLV con siRNA específico para
Stim1 inhibe de manera contundente la proliferación promovida por U-II. Las células
silenciadas para Stim1 y tratadas con 100 nmol/l de U-II durante 48 horas muestran un
43,83 + 4,69 % menos de proliferación que las células scramble que recibieron el
mismo tratamiento farmacológico. Estos datos ponen de manifiesto que Stim1
participa de una forma crucial en la proliferación mediada por U-II en CMLV.

U-II 100 nmol/l

scramble siStim1
U-II 100 nmol/l
**
100

% fluorescencia BrdU 80
BrdU
†
60

40

20
siStim1
DAPI scramble

Figura 56. La proliferación celular mediada por U-II depende de la activación de Stim1. A la izquierda:
imágenes de núcleos positivos para BrdU y DAPI en células transfectadas con siRNA scramble o con
siRNA para Stim1 (siStim1) y tratadas 48 horas con U-II 100 nmol/l. A la derecha, resumen estadístico de
los experimentos, incluyendo el estudio comparativo entre células scramble con y sin tratamiento con
U-II (no incluido en las fotografías). Los valores se encuentran normalizados al grupo de células scramble
con U-II (n= 3-5 cultivos). “**” p<0,01 en células scramble tratadas con U-II vs. células sin tratar. “†”
p<0,05 en células silenciadas vs. scramble con U-II.

5.6 Las proteínas Orai1 y TRPC1 se encuentran también fuertemente implicadas en

la proliferación promovida por la Urotensina-II

Una vez demostrado que Stim1 juega un papel clave en el efecto proliferativo de la U-
II, pasamos a estudiar la implicación en éste de Orai1, subunidad formadora del poro
del canal SOC. Siguiendo los pasos llevados a cabo en el estudio del aumento en Ca2+
intracelular, se analizó además el papel del canal catiónico TRPC1.

106
Los resultados muestran que también el silenciamiento de estas dos proteínas revierte
de una forma drástica la proliferación inducida por el péptido. En este caso, la
inhibición es de un 30,99 + 4,97 %, y de un 68,85 + 5,64 % en células silenciadas para
TRPC1 y Orai1 respectivamente (figura 57). Los datos se encuentran normalizados a la
respuesta a U-II en células scramble.

U-II 100 nmol/l

scramble siOrai1 siTRPC1 U-II 100 nmol/l

**

100

% fluorescencia BrdU
80 †
BrdU
60
††
40

20
siTRPC1 siOrai1
DAPI scramble

Figura 57. El efecto de U-II en proliferación se inhibe por el silenciamiento de Orai1 y TRPC1. Izquierda:
marcaje de BrdU y DAPI en células scramble y en células silenciadas para Orai1 ó TRPC1 (scramble,
siOrai1 y siTRPC1 resp.) y tratadas 48 horas con U-II (100 nmol/l). A la derecha, resumen de los
experimentos, donde se muestran también los valores de proliferación correspondientes a las células
scramble sin tratar (n= 3-5 cultivos). “**” p<0,01 en células scramble con U-II vs. células sin tratar. “†” y
“††” p<0,05 y p<0,01, respecƟvamente, en células silenciadas vs. scramble con U-II.

No obstante, experimentos similares llevados a cabo con células silenciadas para

Orai2, otra potencial subunidad formadora del canal SOC en ciertos tipos celulares
(Mercer y col. 2006, Potier y Trebak. 2008) no logran demostrar una inhibición significativa
en la proliferación celular inducida por U-II. De esta forma, los núcleos BrdU positivos
en células siOrai2 son un 94,31 + 22,98 % de los que muestran las células scramble
tratadas con U-II (n= 3; datos no incluidos).

Estos resultados confirman la implicación de la SOCE en la proliferación celular

promovida por la U-II, y demuestran que la activación de Orai1 y TRPC1 son

107
indispensables para que ésta tenga lugar. Sin embargo, la proteína Orai2 no parece
jugar un papel relevante en dicho efecto.

6. LA UROTENSINA-II PROMUEVE LA ACTIVACIÓN Y TRANSLOCACIÓN AL

NÚCLEO CELULAR DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN CREB

6.1 La Urotensina-II induce la activación de CREB de forma dosis-dependiente

El aumento en proliferación es uno de los muchos procesos celulares que cursan

mediante cambios en la expresión génica, a través de la activación o inhibición de
factores de transcripción. Por eso, y a fin de encontrar un nexo de unión entre el
aumento en Ca2+ citosólico inducido por la U-II y su activación a largo plazo de la
proliferación de CMLV, estudiamos qué efecto podía tener este péptido en la actividad
de CREB, un importante factor de transcripción regulado por Ca2+ y relacionado con la
proliferación del músculo liso vascular en procesos patológicos (Barlow y col. 2006).

De esta forma, ensayos de inmunofluorescencia para su forma activa fosforilada PCREB

revelan que la U-II es capaz de promover la activación de este factor y su translocación
al núcleo celular de una forma dependiente de la dosis. En células tratadas 5 minutos
con U-II a las concentraciones de 10, 50 y 100 nmol/l, la fluorescencia para PCREB es
significativamente más abundante que en células control, además de encontrarse más
localizada en el interior del núcleo celular (figura 58). Así, los máximos valores de
fluorescencia para PCREB se alcanzan con las dosis de 50 y 100 nmol/l (% de núcleos
positivos para PCREB con respecto al marcaje con DAPI: 22,82 + 2,91 %; 27,87 + 4,03
%; 41,04 + 2,75 % y 39,85 + 5,64 % en células control y tratadas con U-II a 10, 50 y 100
nmol/l respectivamente).

Estos resultados sugieren que la U-II podría jugar un papel clave a la hora de modular
la actividad de factores de transcripción involucrados en la proliferación de CMLV.

108
 U-II, nmol/l

Control 10 50 100

Fluorescencia de PCREB (% del

50
** **

marcaje con DAPI)

40

30
P-CREB
20

10
10 50 100
DAPI
U-II, nmol/l

Figura 58. La U-II induce activación y translocación al núcleo del factor de transcripción CREB de forma
dosis-dependiente. Imágenes representativas (izquierda) y resumen de datos (derecha) del marcaje de
PCREB en células sin tratar (control) y en células tratadas 5 minutos con U-II a las concentraciones de 10,
50 y 100 nmol/l . El marcaje con DAPI como control positivo del experimento se muestra en las fotos
inferiores. Los datos estadísticos se expresan en % de núcleos positivos para PCREB (n= 3-11 cultivos).
“**”p<0,01 vs. control sin tratar.

6.2 El uso de inhibidores de los canales SOC previene la activación de CREB

promovida por la Urotensina-II

A continuación se analizó la ruta de señalización intracelular por la cual la U-II induciría

este efecto; en concreto, se estudió si podía encontrarse también modulado por la vía
de los canales SOC. La figura 59 muestra cómo el tratamiento previo de las CMLV
durante 5-10 minutos con algunos de los inhibidores farmacológicos de los SOC más
utilizados, como el Gd3+ (5 µmol/l), el 2APB (50 µmol/l) y el ML9 (25 µmol/l) logra
inhibir de una forma prácticamente completa la activación y translocación de CREB
mediada por U-II. Así, las células incubadas con Gd3+, 2APB ó ML9 y después tratadas
durante 5 minutos con U-II 100 nmol/l tienen, respectivamente, un 30,54 + 15,21 %;
un 1,71 + 1,5 % y un 2,23 + 2,34 % de núcleos positivos para PCREB en comparación
con aquellas tratadas sólo con U-II.

109
Sin embargo, el tratamiento previo de las células durante 30 minutos con el inhibidor
específico de la iPLA2, BEL, a las concentraciones de 15 y 25 µmol/l, no es capaz de
revertir el efecto de la U-II a nivel de la activación de CREB (datos no incluidos).

U-II 100 nmol/l

+ Gd 3+ + 2APB + ML9
U-II 100 nmol/l

% fluorescencia PCREB
100
80

P-CREB 60 *
40
20
** **
0
+ Gd3+ + 2APB + ML9
5 µmol/l 50 µmol/l 25 µmol/l
DAPI

Figura 59. El uso de inhibidores farmacológicos de los SOC anula la activación de CREB mediada por U-
II. El panel izquierdo muestra la localización de PCREB (verde) y la tinción con DAPI (azul) en CMLV
3+
tratadas 5 min con U-II 100 nmol/l, en células incubadas durante 10 minutos con Gd 5 µmol/l + 5 min
con U-II; y en células tratadas 5 minutos con 2APB 50 µmol/l o con ML9 25 µmol/l + 5 min con U-II. A la
derecha, resumen de los datos expresados en % de fluorescencia para PCREB (n= 3-4 cultivos). “*”
p<0,05 y “**” p<0,01 con respecto al control con U-II.

Estos datos ponen de manifiesto que el efecto de la U-II en cuanto a activación y

translocación al núcleo de CREB depende en gran medida de la apertura de los canales
SOC; no obstante, no ha sido posible demostrar que la iPLA2 se encuentre
significativamente implicada en este efecto.

6.3 Stim1 y TRPC1, pero no Orai1, juegan un importante papel en la activación de

CREB mediada por la Urotensina-II

Por último, y dado que la SOCE también parece jugar un papel clave en este efecto de
la U-II, se llevó a cabo el silenciamiento molecular de Stim1, Orai1 y TRPC1 con el fin de
analizar la influencia de estas tres proteínas en la activación de CREB promovida por el
péptido.

110
Los resultados muestran que en las células silenciadas para Stim1 y TRPC1, la
activación y localización nuclear de PCREB tras el tratamiento con U-II durante 5
minutos es significativamente menor que en células scramble. Como aparece reflejado
en la figura 60, las células transfectadas con siRNA para Stim1 y TRPC1 poseen un % de
núcleos PCREB positivos de 62,82 % + 11,39 y 70,38 % + 1,84 con respecto a scramble,
valores similares a los que poseen las células control sin tratamiento con U-II (64,52 %
+ 7,46). No ocurre así, sin embargo, con las células silenciadas para Orai1, en las que
no se aprecia una diferencia significativa con respecto al control (104,45 % + 13,51).

U-II 100 nmol/l

scramble siStim1 siTRPC1 siOrai1 U-II 100 nmol/l

120

% fluorescencia PCREB
100
*
80 † †
P-CREB
60

40

20
siStim1 siTRPC1 siOrai1
DAPI scramble

Figura 60. Stim1 y TRPC1, pero no Orai1, se encuentran implicados en la activación de CREB inducida
por U-II. Izquierda: las imágenes muestran el marcaje para PCREB y DAPI en células transfectadas con
siRNA scramble o siRNA para Stim1 (siStim1), TRPC1 (siTRPC1) y Orai1 (siOrai1). A su vez, todos estos
grupos fueron tratados 5 minutos con U-II 100 nmol/l. A la derecha, resumen de los resultados en los
grupos de tratamiento mostrados a la izquierda, así como en scramble sin tratar (n= 3). “*” p<0,05 en
scramble con U-II vs. scramble sin tratar; “†” p<0,05 en células silenciadas vs. scramble.

En conjunto, estos datos indican que Stim1 y TRPC1 se encuentran fuertemente

implicados en el efecto de la U-II referente a la activación de CREB y subsiguiente
modificación de la expresión génica en CMLV. No obstante, no hay resultados
concluyentes sobre el papel de Orai1 en este efecto del péptido.

111
DISCUSIÓN

Los resultados del presente trabajo analizan los efectos de la Urotensina-II, tanto a
corto como a largo plazo, en músculo liso vascular de aorta. También estudian el papel
que juegan en dichos efectos la vía de entrada de Ca2+ a través de los canales SOC y su
proteína reguladora, la iPLA2.

La influencia de la U-II en la regulación del tono vascular y en la proliferación celular es

de gran interés, ya que los resultados indican que se trata de un compuesto implicado
en patologías vasculares como la hipertensión, o en otras dolencias que cursan con un
aumento desmedido en la proliferación de CMLV, tales como la aterosclerosis o la
reestenosis. Al mismo tiempo, conocer una de las vías de señalización por las cuales la
U-II actúa a nivel celular podría ser de gran ayuda en la búsqueda de dianas
terapéuticas que contrarresten los efectos adversos del péptido en el organismo.

1. LA UROTENSINA-II COMO UNO DE LOS MÁS POTENTES

VASOCONSTRICTORES

1.1 Vasoconstricción por Urotensina-II en distintos territorios vasculares

La U-II, conocida desde los inicios de su estudio como un importante agente

vasoactivo, ha sido propuesta como el vasoconstrictor más potente identificado hasta
la fecha en mamíferos, por encima de la endotelina-I (Maguire y col. 2000). Sin
embargo, la presencia y la potencia de este efecto en tono vascular dependen
claramente de la especie y el vaso estudiados, y en ocasiones incluso de la sección de
dicho vaso. En ratas, por ejemplo, la potencia de contracción de la U-II es mayor en la
sección de aorta torácica que en la abdominal, y en ambos casos mayor que en arteria
mesentérica (Itoh y col. 1988). En humanos, la U-II promueve contracción vascular en
arteria coronaria, mamaria y radial, así como en vena safena y umbilical (Maguire y col.

112
2000). No obstante, la U-II no induce contracción vascular significativa en algunos
vasos de resistencia, como arterias y venas subcutáneas (Hillier y col. 2001).

En este estudio confirmamos que la U-II ejerce una potente vasoconstricción en la

sección torácica de la aorta, como se ha demostrado en trabajos anteriores (Gibson
1987; Itoh y col. 1988; Tasaki y col. 2004). La contracción vascular inducida por el péptido
es dependiente de la dosis y alcanza su máximo efecto cuando éste se aplica a 100
nmol/l. Al mismo tiempo, hemos determinado la especificidad del efecto de la U-II en
tono vascular, demostrando que éste cursa mediante la unión del péptido a su
receptor acoplado a proteína G UTS2R, que a su vez activa a la fosfolipasa C y
promueve la síntesis de InsP3. En el estudio del mecanismo de acción de la U-II ya se
había descrito con anterioridad una relación entre el aumento citosólico de InsP3 y la
vasoconstricción inducida por el péptido en aorta de conejo, sensible a inhibidores de
la fosfolipasa C (Saetrum-Opgaard y col. 2000).

Por otra parte, se ha demostrado que la vasoconstricción promovida por U-II en aorta
de rata puede revertirse mediante inhibidores de la PKC, Rho quinasas, tirosín
quinasas, MAP quinasas y, de forma parcial, con verapamil, un bloqueante de los
canales VOC, además de con antagonistas para el receptor de somatostatina (Itoh y col.
1987; Rossowski y col. 2002; Tasaki y col. 2004). Sin embargo, los mecanismos exactos por
los cuales la U-II promueve su efecto en contracción vascular son hasta la fecha
desconocidos. En la parte de nuestro estudio referente a la influencia de la U-II sobre
el tono vascular, demostramos que anillos de aorta precontraídos con U-II a 100
nmol/l se relajan de una forma prácticamente completa ante el tratamiento con
inhibidores de los SOC, como 2APB y DES. Con estos resultados, presentamos por
primera vez evidencias del importante papel que juegan los canales SOC en la
vasoconstricción por U-II en aorta torácica de rata.

113
1.2 Influencia de la presencia del endotelio en la contracción vascular mediada por
Urotensina-II

De la misma forma, los datos de este estudio muestran que la vasoconstricción por U-
II es significativamente mayor en anillos a los que se ha eliminado el componente
endotelial dependiente de óxido nítrico mediante la aplicación de LNNA, un inhibidor
de la NO sintasa endotelial. Este dato es interesante, ya que anteriormente se ha
demostrado que la U-II tiene un efecto dual en la pared vascular, siendo capaz de
promover vasoconstricción independiente de endotelio y vasodilatación dependiente
de endotelio (Bottrill y col. 2000). La vasodilatación a través del endotelio inducida por
U-II puede tener lugar mediante la acción del óxido nítrico o de mediadores
inflamatorios como las prostaglandinas (Bottrill y col. 2000; Gray y col. 2001; Lin y col.
2004).

Así, es lógico suponer que la respuesta a U-II en tono vascular depende del balance
final entre el efecto en CMLV y aquel que tiene lugar en células endoteliales. De esta
manera, cuando el endotelio se encuentra presente en la pared del vaso, el efecto
vasodilatador dependiente de este tejido compensaría de forma parcial la contracción
de la capa media de músculo liso. De ahí que algunos autores sugieran que una de las
funciones fisiológicas de la U-II es regular el tono vascular mediante el equilibrio entre
la acción de los dos tipos de tejido (Russell 2008).

Sin embargo, cuando el endotelio se encuentra dañado y no es funcional, quedaría tan

sólo el componente vasoconstrictor dependiente del músculo liso y la contracción
mediada por U-II sería considerablemente mayor. Es por este motivo que se piensa
que la U-II puede favorecer el desarrollo de la hipertensión cuando se rompe este
equilibrio en la pared vascular, y ha sido propuesta como un eslabón entre factores de
riesgo que cursan con disfunción endotelial y el desarrollo de enfermedades
cardiovasculares (Watanabe y col. 2006). Nuestros resultados confirman este
importante papel del endotelio en la regulación del tono vascular por U-II, y por tanto
apoyan la hipótesis de su rol como desencadenante de dolencias cardiovasculares
partiendo de una disfunción de este tejido.

114
1.3 La Urotensina-II y su efecto en la homeostasis de Ca2+ intracelular

Los resultados ponen de manifiesto que la U-II promueve un aumento en la

concentración de Ca2+ intracelular de CMLV aisladas; efecto que depende, al igual que
la contracción vascular, de la funcionalidad de su receptor. El efecto de la U-II en
movilización de Ca2+ intracelular se describió por primera vez en células HEK293
transfectadas con el receptor GPR14 de rata, homólogo a UTS2R en humanos (Ames y
col. 1999, Liu y col. 1999). También se ha demostrado que la aplicación de U-II
incrementa la concentración de Ca2+ citosólico en cardiomiocitos (Onan y col. 2004) y en
aorta de rata. En este último caso, el efecto del péptido muestra sensibilidad a la
incubación previa con tapsigargina (Tasaki y col. 2004). En CMLV de aorta, esta entrada
de Ca2+ por U-II se ha relacionado también con la vía de las MAP quinasas (Iglewski y
Grant. 2010).

Sin embargo, los mecanismos por los cuales la U-II induce aumento en Ca2+ intracelular
no se encuentran claramente elucidados; y hasta hace poco, no se sabía si existía una
implicación clara de la vía de los canales SOC y la iPLA2, encargada de regular su
apertura, en este efecto del péptido. Este aspecto de su vía de señalización quedó
establecido por primera vez en CMLV de arteria coronaria, donde se demuestra que la
entrada de Ca2+ mediada por U-II puede prevenirse mediante la utilización de
inhibidores de los SOC, como el 2APB, el Gd3+ o el DES; o de la iPLA2β, mediante el uso
de S-BEL (Domínguez-Rodríguez y col. 2012). Esta ruta de señalización queda también
caracterizada en CMLV de aorta en el presente trabajo, a través del uso que hemos
hecho de los inhibidores de los SOC y de la iPLA2β. Además de los fármacos ya
mencionados, hemos testado la influencia del ML9, empleado en otros trabajos para
inhibir la SOCE en CMLV de aorta (Potier y col. 2009) aplicándolo en este caso de forma
posterior a la entrada de Ca2+ por U-II con el fin de estudiar su posible dosis-
dependencia. Efectivamente, hemos comprobado que el fármaco revierte este
aumento en Ca2+ intracelular alcanzando su máximo efecto a la concentración de 50
µmol/l. Así mismo, analizamos como control positivo del experimento el aumento en
concentración de Ca2+ mediado por tapsigargina (TG), inhibidor irreversible de la
SERCA (Parekh y Putney, 2005) y típico agonista promotor de la SOCE por vaciado pasivo
115
del RS. La entrada de Ca2+ inducida por TG y por U-II en células de aorta son muy
similares en cinética y magnitud, lo que confirma la implicación de la vía de los canales
SOC en ésta última.

Por otra parte, ICRAC ha sido la primera corriente SOC descubierta y la mejor estudiada
hasta la fecha en distintos tipos celulares (Parekh y Putney, 2005). Hasta hace pocos
años no existían evidencias de la presencia de ICRAC en CMLV; no obstante, un estudio
realizado por el equipo del Dr. Trebak en 2009 muestra que los miocitos de aorta
pueden presentar una corriente ICRAC típica ante el vaciado de los reservorios con
tapsigargina. Esta corriente se inhibe por 2APB, ML9 y bajas concentraciones de Gd3+,
de la misma forma que ocurre en otros tipos celulares como HEK293 (Potier y col. 2009).
En este trabajo, y en colaboración con el equipo de investigación del Dr. Trebak, hemos
descubierto que la U-II activa una corriente de Ca2+ de propiedades similares a ICRAC en
CMLV de aorta, que es así mismo sensible a la aplicación de 5 µmol/l de Gd3+.

Para nuestro conocimiento, estas son las primeras evidencias de una corriente iónica
activada por U-II. El hecho de que sus características tanto cinéticas como
farmacológicas sean muy similares, aunque no idénticas (debido al prolongado curso
temporal de su inhibición por Gd3+, que no se da en ICRAC) a la principal corriente SOC
estudiada en mamíferos corroboran el importante papel que juega la SOCE en el
aumento en Ca2+ intracelular mediado por la U-II.

2. PAPEL DE LOS CANALES DE Ca2+ EN LA REGULACIÓN DEL TONO

VASCULAR INDUCIDA POR UROTENSINA-II

2.1 Participación de los canales voltaje-dependientes en la contracción vascular

Hasta hace poco, la vía de los canales de Ca2+ voltaje-dependientes se consideraba la

única de importancia a la hora de hablar de la contracción vascular promovida por
agonistas, sobre todo en arterias pequeñas o de resistencia (Leung y col. 2008, Park y col.

116
2008). Esto cambió en gran medida al descubrirse y estudiarse en profundidad la vía de
los canales SOC, y descubrir que se encuentran fuertemente implicados en la
contracción vascular de un gran número de arterias (Leung y col. 2008).

En nuestro estudio, la aplicación de nifedipina, un bloqueante de los canales de Ca2+

voltaje-dependientes (Smani y col. 2007) consiguió promover una relajación
significativa, pero parcial, de anillos arteriales precontraídos con la máxima dosis de U-
II. Con estos datos, corroboramos lo demostrado en estudios anteriores, donde el
tratamiento con inhibidores de los VOC no consigue revertir totalmente el efecto de la
Urotensina-II en el tono vascular de aorta (Rossowski y col. 2002, Tasaki y col. 2004). Esto
confirma que debe haber otras vías de importancia en la contracción vascular mediada
por U-II, por lo que nos centramos en estudiar la vía de los canales SOC.

2.2 Regulación del tono vascular y de la homeostasis de Ca2+ por los SOC

Para analizar el papel de los SOC en contracción vascular y aumento en Ca2+

intracelular, utilizamos inhibidores farmacológicos ampliamente usados en anteriores
trabajos. Así, Flemming y colaboradores han demostrado en sus estudios con CMLV de
arteriola cerebral de conejo que la SOCE puede bloquearse de manera efectiva con
Gd3+ de una forma dosis-dependiente y con una concentración de hasta 75 µmol/l de
2APB; mientras que la nifedipina no tiene efecto apreciable en la inhibición de los SOC
(Flemming y col. 2003). También se ha determinado que el DES, agonista sintético de los
receptores para estrógenos, inhibe los canales SOC de forma reversible en CMLV de
aorta, así como en células de arteria mesentérica, células RBL y plaquetas humanas
(Zakharov y col. 2004, Brueggemann y col. 2006). En nuestros experimentos, tanto el 2APB
como el DES inhibieron de una forma prácticamente completa la vasoconstricción
inducida por 100 nmol/l de U-II. El 2APB fue aplicado en dosis sucesivas de 10, 30 y 50
µmol/l, alcanzándose la vasodilatación de la arteria hasta su nivel basal previo a la
aplicación de la U-II con esta última concentración.

Según nuestros datos, la SOCE parece tener más peso que la vía de los canales VOC a la
hora de revertir la contracción vascular por U-II, dado que el 2APB consigue relajar el

117
componente resistente a nifedipina en arterias precontraídas con el péptido. Cuando
se aplicaron en ausencia de inhibidores de los VOC, tanto el 2APB como el DES
vasodilataron los anillos de aorta contraídos con U-II hasta prácticamente devolverlos
a su nivel de contracción basal. Sin embargo, estudios de contracción mediada por
tapsigargina o fenilefrina (agonista que también se une a GPCR y es capaz de activar la
SOCE) en arterias de resistencia, como la arteria coronaria o la mesentérica, indican
que en este tipo de vasos la contracción vascular puede ser inhibida en su totalidad
tanto por bloqueantes de los VOC como por inhibidores de los SOC (Park y col. 2008).
Además, estudios en arteria coronaria muestran que la U-II promueve contracciones
significativamente menores al aplicarse en presencia de 0,5 µmol/l de nifedipina
(Domínguez-Rodríguez y col. 2012). Estas evidencias podrían explicarse por una conexión
entre los VOC y los SOC a la hora de inducir la contracción vascular, que ya ha sido
sugerida por otros autores (Leung y col. 2008) y que sería más fuerte en arterias de
resistencia que en arterias de conducción, como es la arteria aorta (Park y col. 2008).
Esta hipótesis también explicaría el hecho de que la contracción vascular inducida por
tapsigargina u otros inhibidores de la SERCA sea también sensible a nifedipina en aorta
(Kwan y col. 1994; Tepel y col. 1994; Leung y col. 2008).

Por otra parte, hemos demostrado que el aumento en Ca2+ intracelular promovido por
la U-II depende de la activación de los SOC y su vía de señalización, ya que se inhibe de
una forma casi completa tanto mediante el tratamiento con algunos de los inhibidores
farmacológicos antes mencionados (2APB, Gd3+ y ML9) como a través del
silenciamiento molecular de dos componentes clave en la SOCE, Stim1 y Orai1.

2.3 Relación entre contracción vascular a través de los SOC y la iPLA2; papel de la
Urotensina-II

Nuestros resultados muestran un importante papel de los SOC en el aumento de Ca2+

intracelular y la contracción inducida por U-II, efectos para los que es necesaria la
activación de la iPLA2. La aplicación de BEL, inhibidor específico de la enzima, muestra
un efecto contundente tanto aplicado en dosis crecientes en la arteria completa como
en la incubación de CMLV con una dosis única de 25 µmol/l, siendo esta inhibición

118
comparable a la producida tanto a nivel arterial como celular por los inhibidores de los
SOC.

La funcionalidad de iPLA2 ha demostrado ser un requisito indispensable para el

desarrollo de la SOCE en una gran diversidad de tipos celulares, no sólo en CMLV
(Smani y col. 2003, 2004) sino también en células RBL (Zarayskiy y col. 2007), astrocitos
(Singaravelu y col. 2006), fibroblastos (Martínez y Moreno, 2005) o músculo esquelético
(Boittin y col. 2006). Como reguladora de la actividad de los SOC, esta enzima se
encuentra así mismo implicada en efectos a nivel fisiológico de estos canales. Nuestro
grupo de investigación ya ha demostrado en anteriores estudios el importante papel
de la iPLA2 y de los lisofosfolípidos producto de su síntesis en la vasoconstricción de la
arteria coronaria a través de la SOCE inducida por agonistas (Smani y col. 2007).
También se ha descrito un papel crucial de la iPLA2β como mediadora de la SOCE en la
vasoconstricción por agonistas de arteria carótida, cerebral y mesentérica (Park y col.
2008). En ambos estudios, el fármaco empleado para promover la contracción vascular
es la fenilefrina, que al igual que la U-II se une a un receptor acoplado a proteína G y
promueve un aumento de los niveles de IP3 en el citosol.

Por último, otro reciente estudio de nuestro equipo demuestra que la U-II es capaz de
promover una potente vasoconstricción en arteria coronaria a través de la SOCE y de la
iPLA2β o de lisofosfatidilcolina, uno de los lisofosfolípidos que sintetiza (Domínguez-
Rodríguez y col. 2012) el cual a su vez ya había sido relacionado con anterioridad con la
inhibición de la vasodilatación por óxido nítrico en el territorio vascular (Watanabe y col.
2002). Así mismo, en el estudio de Domínguez-Rodríguez y colaboradores al igual que
en este trabajo, la U-II es capaz de incrementar la actividad de iPLA2 en CMLV de forma
dependiente de la funcionalidad de su receptor. Por lo tanto, los resultados del
presente estudio suponen un paso más en el esclarecimiento de los mecanismos que
median la ruta de señalización de la SOCE a la hora de promover la vasoconstricción
por agonistas en general, y mediada por la U-II en particular.

119
2.4 Papel de los distintos componentes de la SOCE en la contracción vascular

En este trabajo demostramos que el aumento en Ca2+ intracelular mediado por U-II
posee una clara dependencia de la activación de Stim1 y Orai1. Ya en los inicios del
estudio de estas proteínas, quedó patente que ambas eran necesarias para que la
entrada de Ca2+ por los canales SOC tuviera lugar (Roos y col. 2005; Zhang y col. 2005; Vig
y col. 2006). A pesar de estos datos, y de las evidencias que demuestran la existencia y

la importancia de la SOCE en el músculo liso vascular, no existen apenas estudios

acerca del papel de Stim1 u Orai1 en la contracción vascular promovida por agonistas.

El gran tamaño y grosor de los anillos de aorta hacen que resulte complicada la
realización de técnicas de silenciamiento molecular de tejidos para elucidar el papel de
Stim1 y Orai1 en la vasoconstricción mediada por U-II. No obstante, existen evidencias
del importante papel que estas proteínas juegan en la contracción de otro tipo de
vasos. Recientemente, un estudio de nuestro grupo ha revelado que la transfección de
anillos de arteria coronaria con siRNA para Stim1 u Orai1 mediante la técnica de
Chariot inhibe drásticamente la vasoconstricción por U-II de estos anillos, en
comparación con los anillos transfectados con siRNA scramble (Domínguez-Rodríguez y
col. 2012). Estos datos, y el indispensable papel que juegan tanto Stim1 como Orai1 en
la entrada de Ca2+ inducida por U-II en aorta, sugieren que también en este vaso es
necesaria la funcionalidad de estas dos proteínas para que la vasoconstricción mediada
por el péptido tenga lugar.

2.5 TRPC1 como potencial componente del complejo macromolecular de la SOCE

Existen varios tipos de corrientes reguladas por los reservorios, con distintas
características a ICRAC, y que se encuentran presentes en tejidos muy diversos, como
células acinares pancreáticas (Krause y col. 1996), endotelio (Vaca y Kunze 1994) y células
de músculo liso vascular, tanto arteriales (Trepakova y col. 2001, Golovina y col. 2001)
como venosas (Albert y Large. 2002). Estos datos sugieren que la SOCE no se encuentra
mediada por un único canal, sino por una familia de canales cuyas propiedades
biofísicas pueden diferir, y a la que se denomina en su conjunto familia de los canales

120
regulados por reservorio o SOC (Parekh 2003). Además, su vía de señalización se
encuentra compuesta por numerosas proteínas y estructuras macromoleculares, de tal
forma que algunos autores van un paso más allá y lo denominan el complejo de
entrada de Ca2+ regulada por los reservorios o SOCIC (Vaca 2010) del cual aún se han
seguido elucidando nuevos componentes en los últimos años. A medida que éstos se
van descubriendo, las hipótesis sobre la estructura del complejo macromolecular que
media esta entrada de Ca2+ se complican y surgen nuevas incógnitas al respecto.

En este trabajo, demostramos la implicación de TRPC1 en la entrada de Ca2+ mediada

por U-II, implicación que juega una relevancia en este efecto casi tan importante a la
que poseen las moléculas principales de la SOCE, Stim1 y Orai1. Cada vez son más
numerosas las evidencias de otras moléculas activadas por Stim1, la mayoría de las
cuales también se encuentran implicadas en la SOCE. Huang y colaboradores han
descrito que Stim1 y TRPC1 interaccionan entre ellos y que el dominio citosólico de
Stim1 aumenta la actividad del canal (Huang y col. 2006), asociación que se ve
incrementada tras el vaciado de los reservorios y vuelve a su estado inicial cuando
éstos se llenan de nuevo. Por otra parte, Stim1 no sólo se une directamente a TRPC1,
sino también a TRPC4 y TRPC5, siendo necesaria esta unión para su apertura inducida
por agonistas; y modula indirectamente la actividad de TRPC3 y TRPC6 (Yuan y col.
2007). Otros experimentos en células de glándula salivar humana muestran que Orai1
y TRPC1 colocalizan en la membrana plasmática, y que la colocalización subcelular de
Stim1 y TRPC1, así como la de Stim1 y Orai1, aumenta tras la estimulación con
tapsigargina (Ong y col. 2007).

Todos estos datos sugieren que Stim1 podría formar un complejo con TRPC1 y Orai1
para promover SOCE (Ong y col. 2007) lo que concordaría con los resultados obtenidos
en este estudio, donde la U-II requiere la actividad de las tres proteínas para mediar
aumento en Ca2+ citosólico. Sin embargo, otros estudios sostienen que Orai1 y TRPC1
podrían promover dos corrientes independientes dentro de la misma vía de
señalización de Ca2+, actuando ambas después del vaciado de los reservorios y
activándose mediante la interacción con Stim1. En células de glándula salivar humana,
que expresan una corriente SOC distinta de ICRAC, la expresión de un mutante de Stim1

121
capaz de activar a Orai1 pero no a TRPC1 modifica las corrientes inducidas por vaciado
de los reservorios, de forma que se hacen similares a ICRAC. En estas células la unión de
TRPC1 a Stim1 y su translocación a la membrana tiene lugar tras la entrada de Ca2+
mediada por Orai1; es decir, se trata de una consecuencia de la activación de Orai1
(Cheng y col. 2011). También se ha descrito la presencia de dos corrientes
independientes en células RBL, una mediada por Orai1 y ligada al vaciado de
reservorios, así como a la iPLA2β; y otra a través de TRPC1 y activada por medio del
IP3R (Zarayskiy y col. 2007). Además, estudios del mismo grupo muestran que el
silenciamiento de TRPC1 no afecta a la entrada de Ca2+ vía SOC de células RBL ni de
CMLV (Bolotina 2008).

Por otra parte, el hecho de que en nuestros resultados la corriente de Ca2+ inducida
por U-II es similar, pero no idéntica, a ICRAC es una prueba más de que esta corriente no
se encuentra mediada tan sólo por los componentes “clásicos” de la SOCE, sino que
debe haber más elementos actuando para promoverla. En conjunto, esto sugiere que
la corriente de Ca2+ inducida por U-II en CMLV de aorta tendría lugar a través de un
complejo macromolecular en el que intervendrían tanto Stim1 como Orai1 y TRPC1.

3. LOS CAMBIOS EN FENOTIPO DE LAS CÉLULAS DE MÚSCULO LISO

VASCULAR SE ASOCIAN CON ALTERACIONES EN LA HOMEOSTASIS DE
Ca2+

La modulación de un fenotipo contráctil a un fenotipo proliferativo cursa en las CMLV

con cambios de la expresión de receptores del RS, transportadores, canales iónicos y
otras proteínas involucradas en la señalización de Ca2+. Una consecuencia clara de este
fenómeno es la alteración drástica de la homeostasis de Ca2+ tanto en el citosol como
en los reservorios intracelulares del ión, que precede a la pérdida de contractilidad de
estas células y juega un importante papel en el proceso de modificación fenotípica
(Berra-Romani y col. 2008). También se han observado estos cambios en homeostasis de
Ca2+ y expresión génica a nivel celular en patologías vasculares, como aterosclerosis o

122
hipertensión; es de suponer que las modificaciones en estos dos procesos se
encuentran relacionadas entre sí, pero se trata de una conexión que no ha sido
estudiada en profundidad hasta la fecha (Barlow y col. 2006).

Los niveles de Ca2+ citosólico requeridos para que tenga lugar la proliferación celular se
atribuyen, al menos en parte, a la SOCE, que llena los reservorios y mantiene la
concentración intracelular de Ca2+ dentro de los mínimos necesarios para este tipo de
procesos (Berra-Romani y col. 2008); además, los canales SOC se encuentran
sobreexpresados durante la proliferación vascular (Pulver y col. 2006). El fenotipo
proliferativo de las CMLV puede reproducirse in vitro mediante el cultivo celular a
largo plazo en medios que contengan un alto porcentaje de suero (Berra-Romani y col.
2008, Potier y col 2009). En estas condiciones, y en comparación con células dispersadas
en agudo que muestran un fenotipo contráctil, los niveles de Ca2+ citosólicos en reposo
son mayores y la SOCE se encuentra significativamente elevada, tanto cuando es
promovida por inhibidores de la SERCA como por agonistas que elevan los niveles
citosólicos de IP3, como el ATP o la fenilefrina. Este aumento en la SOCE se acompaña
de un incremento en la expresión del IP3R, Stim1, los TRPC1/4/5 y de las 3 isoformas
de Orai (Berra-Romani y col. 2008).

Nuestros datos en CMLV mantenidas en cultivo a bajo porcentaje de suero (0,1% de

FBS) demuestran que la incubación a largo plazo con U-II incrementa de forma drástica
tanto los niveles basales de Ca2+ en el citosol como la SOCE activada por tapsigargina,
lo que imita las características fisiológicas del cultivo celular en alto porcentaje de
suero y sugiere que la U-II puede contribuir a desencadenar un cambio fenotípico en
CMLV, con las consiguientes modificaciones en proliferación celular.

123
4. IMPLICACIÓN DE LA UROTENSINA-II Y LOS SOC EN LA PROLIFERACIÓN
DE LAS CÉLULAS DE MÚSCULO LISO VASCULAR

4.1 La Urotensina-II como activador de la proliferación celular

Hemos demostrado que la U-II es capaz de promover proliferación celular de CMLV de

aorta a las 24 y 48 horas de su aplicación en cultivo primario. El efecto de la U-II en
cuanto a incremento en la proliferación del músculo liso vascular es un fenómeno que
ha sido previamente estudiado en células de distintos vasos, como aorta de rata
(Sauzeau y col. 2001, Iglewski y Grant. 2010), aorta de conejo (Watanabe y col. 2002, 2006b)
y arteria pulmonar (Iglewski y Grant. 2010). Es más, el aumento en la proliferación
celular de diversos tejidos, incluyendo territorios vasculares pero también cerebro y
riñón, guarda una relación muy estrecha con el aumento de los niveles de U-II en estos
tejidos (Yoshimoto y col. 2004).

En nuestros resultados, observamos que la proliferación inducida por U-II alcanza su

máximo efecto con la concentración de 100 nmol/l, dato que concuerda con los
obtenidos en estudios anteriores (Sauzeau y col. 2001; Tsai y col. 2009; Iglewski y Grant,
2010); no obstante, en otros trabajos se han obtenido respuestas máximas con la
concentración de 50 nmol/l (Watanabe y col. 2002, 2006b). Estas discrepancias en
cuanto a la dosis máxima de U-II promotora de proliferación pueden deberse a la
diferencia entre las especies con que se ha trabajado en ambos grupos de estudios. En
aorta torácica de rata, a diferencia de en la de conejo, los datos son concluyentes en
cuanto al efecto máximo de la U-II a la dosis de 100 nmol/l.

Por otra parte, y a pesar de todos los estudios al respecto, es la primera vez hasta la
fecha que se ha demostrado la clara implicación de la SOCE, incluidas las proteínas
Stim1 y Orai1, y de TRPC1 en esta proliferación celular. Los trabajos anteriores que
estudiaron el crecimiento celular mediado por U-II propusieron otras vías de acción del
péptido. Un reciente estudio relaciona la proliferación por U-II con la activación de la
quinasa dependiente de calmodulina I, la proteín quinasa D y la ERK; los autores

124
sugieren, sin embargo, que este efecto cursa a través de la síntesis de IP3 y
subsiguiente liberación de Ca2+ desde los reservorios (Iglewski y Grant. 2010). Otros
trabajos reseñan un importante papel de las quinasas de adhesión focal o FAK (Peng y
col. 2000), de las proteínas Ras/Raf y ERK (Tamura y col. 2003, Watanabe y col. 2006b) o de
la vía RhoA/Rho quinasas (Sauzeau y col. 2001) en la proliferación celular inducida por U-
II. También se ha demostrado que las LDL oxidadas ejercen un efecto sinérgico con la
U-II a la hora de promover proliferación de CMLV (Watanabe y col. 2006b). El presente
estudio muestra que la activación de los canales SOC y de dos de las proteínas más
importantes en su vía de señalización, Stim1 y Orai1, es crucial para que el efecto
proliferativo mediado por U-II tenga lugar. No obstante, en ningún caso eso significa
que la SOCE sea la única vía implicada en esta proliferación; por lo que otras
importantes vías de señalización intracelular, como la ERK o las Rho quinasas, podrían
también encontrarse relacionadas con este efecto.

Por otra parte, no ha sido posible determinar un efecto claro de la iPLA2 en la

proliferación ni en la activación de factores de transcripción por U-II. Sin embargo,
Watanabe y colaboradores han demostrado que uno de los productos de esta enzima,
la lisofosfatidilcolina (LPC), se encuentra implicado en la proliferación de CMLV de una
forma dependiente de la fosfolipasa C; además, el LPC es capaz de potenciar de forma
sinérgica los efectos de la U-II cuando ambas sustancias se aplican a concentraciones
que no son efectivas de forma independiente (Watanabe y col. 2002).

4.2. Papel de los SOC en el cambio de fenotipo del músculo liso vascular

En estudios anteriores, se ha visto cómo en CMLV de aorta que muestran el fenotipo

proliferativo, tanto la SOCE mediada por ICRAC como la expresión de Stim1 y Orai1
sufren un drástico aumento en comparación con CMLV dispersadas en agudo. El
silenciamiento de ambas proteínas inhibe la proliferación y la migración de estas
células, mientras que el silenciamiento de Orai2, Orai3 o Stim2 no influyen en este
efecto. Estos datos sugieren que el canal CRAC es el tipo de canal SOC implicado en las
respuestas proliferativas de CMLV al cambiar de fenotipo (Potier y col. 2009). Stim1 y
Orai1 también juegan un importante papel en la proliferación de CMLV mediadas por

125
angiotensina-II (Guo y col. 2012). Por el contrario, otros trabajos señalan que el
silenciamiento de Stim1 en CMLV humanas tiene como consecuencia la inhibición de la
migración de estas células, pero no tiene efectos en la proliferación (Li y col. 2008).

De una forma análoga a los dos primeros trabajos mencionados en este apartado,
nuestros resultados muestran cómo la proliferación de las CMLV se ve
significativamente aumentada en células que han sido tratadas a largo plazo con U-II,
efecto sensible a la inhibición farmacológica de los SOC. La expresión tanto de Stim1
como de Orai1 es necesaria para que este aumento en proliferación tenga lugar, lo que
certifica la importancia de la SOCE a la hora de promover modificaciones en las CMLV
que conlleven cambios en su comportamiento a largo plazo, como variaciones en la
proliferación celular. A la vez, demuestra que la U-II es capaz de activar esta vía, no
sólo para inducir cambios celulares a corto plazo como la contracción vascular, sino
también para promover cambios fenotípicos a nivel de proliferación celular en CMLV.

4.3. TRPC1 y su papel en la proliferación del músculo liso vascular

Los datos del presente estudio muestran que el silenciamiento a nivel molecular del
canal TRPC1 tiene como resultado unos niveles de proliferación inducidos por U-II
similares a los que se dan en células sin tratar. Por tanto, este canal no sólo se
encuentra implicado en los efectos del péptido en aumento de Ca2+ intracelular
mediado por la SOCE, sino que también juega un papel importante en sus efectos a
largo plazo. Se ha descrito que TRPC1 se encuentra sobreexpresado en CMLV de
arteria pulmonar en proliferación inducida por alto porcentaje de suero o por
endotelina-I, fenómeno que se acompaña con un aumento en la SOCE (Golovina y col.
2001, Wang y col. 2008); además, su silenciamiento en este mismo tipo celular tiene
como consecuencia la inhibición de la entrada de Ca2+ vía SOC y del crecimiento celular
(Sweeney y col. 2002). Del mismo modo, la funcionalidad de TRPC1 es importante tanto
para la proliferación como para la migración de CMLV procedentes de vena safena
humana (Li y col. 2008).

126
En conjunto, nuestros datos ponen de manifiesto el potencial papel que posee TRPC1
en la proliferación del músculo liso vascular. Este trabajo supone un paso más al
presentar las primeras evidencias de su implicación, junto con los componentes
clásicos de la SOCE, en la vía de acción de la U-II y sus efectos en proliferación celular.

5. LA ACTIVACIÓN CELULAR POR ENTRADA DE Ca2+ SE ACOMPAÑA DE

CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA

5.1 Papel de los SOC en la activación de factores de transcripción mediada por Ca2+

A pesar de que se conoce la importancia clave de la conexión entre las señales de Ca2+
intracelulares y el control transcripcional de la expresión génica como proceso
iniciador de cambios en el fenotipo de las CMLV, los mecanismos por los cuales esta
conexión tiene lugar aún no se encuentran bien establecidos (Pulver y col. 2006).

Varias evidencias señalan a la entrada de Ca2+ vía SOC como evento clave en estos
procesos. La pérdida de función de la corriente ICRAC (por ejemplo, en enfermos de
inmunodeficiencia congénita severa o SCID) se traduce en patrones modificados de la
expresión génica y en una activación menor de algunos factores de transcripción,
como NFAT (Gwack y col. 2007). De la misma manera, tanto la tapsigargina como la
angiotensina-II son capaces de activar CREB a través de la SOCE por una vía
dependiente de ERK (Pulver y col. 2004, 2006); la activación de la expresión de MKP-1 y
c-fos mediada por CREB es sensible a 2APB, pero no a antagonistas de los VOC. Por
otra parte, el silenciamiento de Stim1 es capaz de inhibir la activación de CREB y la
proliferación en CMLV, sugiriendo una conexión entre los mecanismos activadores de
la SOCE, la translocación al núcleo de este factor de transcripción y el crecimiento
celular. En este mismo estudio, la SOCE en un mutante de Stim1 activado
constitutivamente depende de la activación de TRPC1 (Takahashi y col. 2007).

127
En este trabajo, demostramos por vez primera que la U-II es capaz de modificar la
actividad de factores de transcripción activados por Ca2+ a través de la SOCE,
promoviendo la fosforilación de CREB y su translocación al núcleo celular. Este efecto
puede prevenirse de forma contundente incubando las células con tres diferentes
inhibidores farmacológicos de los SOC: 2APB, ML9 y Gd3+ a bajas concentraciones. Este
efecto del péptido también se inhibe por el silenciamiento molecular de Stim1 y de
TRPC1, lo que está en concordancia con los resultados obtenidos en estudios
mencionados con anterioridad en este apartado (Takahashi y col. 2007).

6. IMPLICACIONES FISIOPATOLÓGICAS DE LA PROLIFERACIÓN

PROMOVIDA POR LA UROTENSINA-II A TRAVÉS DE LA SOCE EN
MÚSCULO LISO VASCULAR: POSIBLES DIANAS TERAPÉUTICAS

Se ha demostrado en varios trabajos el papel que juega desde una perspectiva

fisiopatológica la modulación fenotípica y el aumento en proliferación de CMLV
mediada por los SOC, tanto por sus componentes clásicos como por el canal TRPC1 de
forma asociada a la SOCE.

El silenciamiento tanto de Stim1 como de Orai1 reduce la activación y translocación al

núcleo de NFAT en modelos animales de angioplastia con balón (Zhang y col. 2011). Por
otra parte, la expresión de TRPC1 se ve incrementada en modelos animales de daño
vascular y en muestras humanas con formación de neoíntima, en las que el uso de
anticuerpos específicos para el canal revierte la proliferación celular (Kumar y col. 2006).
Además, en modelos animales de reestenosis por daño vascular, los niveles de
expresión de Stim1 y Orai1 en células de la capa media y neoíntima se encuentran
significativamente elevados; el silenciamiento de ambas proteínas se traduce en una
disminución del engrosamiento de la neoíntima. Tras estos estudios, Orai1 ha sido
propuesto como una posible diana terapéutica en el tratamiento de patologías
vasculares que impliquen un cambio fenotípico de las CMLV, con ventajas respecto a

128
Stim1 ya que es más fácilmente accesible al localizarse en la membrana plasmática
(Zhang y col. 2011, Guo y col. 2012).

Los resultados obtenidos en este trabajo están en concordancia con estas evidencias,
demostrando además que un péptido endógeno con gran influencia en la
fisiopatología del sistema cardiovascular, la U-II, es capaz de desencadenar estas
respuestas e inducir un cambio fenotípico y un aumento en proliferación del músculo
liso vascular de aorta por una vía dependiente de la SOCE y de la activación de Stim1,
Orai1 y TRPC1.

Estos datos suponen un campo abierto a la hora de determinar nuevas dianas

terapéuticas para el tratamiento de aquellas patologías vasculares que cursan con
modificaciones de las CMLV hacia un fenotipo proliferativo, como la aterosclerosis o la
reestenosis tras daño vascular. Estas dianas terapéuticas podrían centrarse en la
inhibición del receptor UTS2R o de la fosfolipasa C activada por éste; o también
podrían encaminarse hacia la inhibición de las proteínas participantes en la SOCE que
se ven activadas tras la síntesis de IP3 inducida por la U-II y el posterior vaciado de los
reservorios, como Stim1, Orai1 o TRPC1.

----------------------

En conclusión, nuestros resultados caracterizan la ruta de señalización intracelular por

la cual la U-II ejerce sus efectos de aumento en el Ca2+ intracelular, vasoconstricción,
activación del factor de transcripción CREB y proliferación celular, de una forma
dependiente de la SOCE a través de PLC, Stim1, iPLA2, Orai1 y TRPC1. Un resumen de la
vía de señalización intracelular propuesta por estos resultados se encuentra
esquematizado en la figura 61.

129
 siRNA siRNA DES/Gd3+/2APB/ML9

BEL/S-BEL Urantide
TRPC1
U-II
SOC (Orai1)

UTS2R
iPLA2
Gq11
PLC U73122
?
IP 3

Ca2+ Ca2+
? ?
Ca2+
PCREB

contracción vascular siRNA STIM1

y proliferación
SERCA

vaciado de los
reservorios de Ca2+

Figura 61. Esquema propuesto para la vía de señalización intracelular de la U-II. Según el modelo
propuesto por los resultados obtenidos en este estudio, la U-II se une a su receptor UTS2R acoplado a
proteína G, que activa a la PLC y promueve vaciado de los reservorios y agrupación de Stim1 en puncta
por medio de la síntesis de IP3. Esta agrupación de Stim1 activa a la iPLA2 y a los canales SOC, de los
2+
cuales Orai1 constituye una parte esencial. El Ca que entra a través de estos canales y de TRPC1,
2+
activados simultáneamente o a continuación de los SOC, así como el Ca liberado de los reservorios,
son los desencadenantes de la vasoconstricción y proliferación inducidas por U-II. En este último efecto,
el factor de transcripción CREB parece encontrarse también parcialmente implicado.

130
CONCLUSIONES

1. La Urotensina-II induce un aumento dosis-dependiente en el tono vascular de aorta

torácica de rata, sensible a la funcionalidad del tejido endotelial.

2. La Urotensina-II, a través de la unión a su receptor específico, induce contracción

vascular y aumento en la concentración de Ca2+ intracelular en CMLV aisladas. La
contracción vascular mediada por Urotensina-II es sensible a la inhibición tanto de los
canales de Ca2+ voltaje-dependientes como de los canales SOC.

3. El aumento en Ca2+ intracelular promovido por la Urotensina-II en CMLV de aorta

procedentes de cultivo primario también se revierte mediante la aplicación de
inhibidores de los SOC.

4. La aplicación de Urotensina-II promueve corrientes de Ca2+ y Na+ de características

similares a ICRAC, la principal corriente regulada por los reservorios estudiada en
diversos tipos celulares.

5. El silenciamiento molecular de Stim1 y Orai1, proteínas clave en la vía de

señalización de la entrada de Ca2+ a través de los SOC, revierte el aumento en Ca2+
intracelular promovido por la Urotensina-II. La inhibición de la expresión del canal
catiónico TRPC1 también previene este efecto.

6. La fosfolipasa A2 independiente de Ca2+, enzima reguladora de los canales SOC, se

activa mediante el tratamiento con Urotensina-II. Su inhibición farmacológica revierte
tanto la contracción vascular como el aumento en Ca2+ intracelular inducidos por el
péptido.

7. La Urotensina-II produce un aumento en la entrada de Ca2+ mediada por

tapsigargina en CMLV cultivadas a bajo porcentaje de suero, cambios similares a los
que tienen lugar durante la modulación fenotípica de este tipo celular.

131
8. La Urotensina-II estimula la proliferación de CMLV de aorta a las 24 y 48 horas de su
aplicación.

9. La proliferación celular mediada por Urotensina-II depende de la entrada de Ca2+ a

través de los canales SOC.

10. El efecto de la Urotensina-II en proliferación depende de la activación de Stim1,

sensor del vaciado de Ca2+ del retículo sarcoplásmico en la SOCE.

11. La proliferación inducida por Urotensina-II es también sensible al silenciamiento

molecular de Orai1 y TRPC1, proteínas candidatas a formar un complejo
macromolecular para promover la entrada de Ca2+ inducida por el vaciado de los
reservorios.

12. La Urotensina-II promueve, de una forma dosis-dependiente, la activación y

translocación al núcleo celular del factor de transcripción CREB.

13. Tanto los canales SOC como Stim1 y TRPC1 se encuentran fuertemente implicados
en la activación de CREB mediada por Urotensina-II.

14. Los resultados contenidos en este trabajo indican que la Urotensina-II puede
constituir una importante diana terapéutica a la hora de prevenir y tratar
enfermedades cardiovasculares relacionadas con la hipertensión y la proliferación
celular. Así mismo, la vía de señalización de los SOC implicada en sus efectos podría ser
de utilidad como diana farmacológica a la hora de tratar estas dolencias.

132
BIBLIOGRAFÍA

- Abdullaev IF, Bisaillon JM, Potier M, Gonzalez JC, Motiani RK, Trebak M. Stim1 and
Orai1 mediate CRAC currents and store-operated calcium entry important for
endothelial cell proliferation. Circ Res. 2008 Nov 21; 103(11):1289-99. Epub 2008 Oct
9.

- Akiba S, Sato T. Cellular function of calcium-independent phospholipase A2. Biol

Pharm Bull. 2004 Aug; 27(8):1174-8.

- Albert AP, Large WA. A Ca2+-permeable non-selective cation channel activated by

depletion of internal Ca2+ stores in single rabbit portal vein myocytes. J Physiol. 2002
Feb 1; 538(Pt 3):717-28.

- Albert AP, Saleh SN, Peppiatt-Wildman CM, Large WA. Multiple activation
mechanisms of store-operated TRPC channels in smooth muscle cells. J Physiol. 2007
Aug 15; 583(Pt 1):25-36. Epub 2007 Jul 5.

- Ames RS, Sarau HM, Chambers JK, Willette RN, Aiyar NV, Romanic AM, Louden CS,
Foley JJ, Sauermelch CF, Coatney RW, Ao Z, Disa J, Holmes SD, Stadel JM, Martin JD, Liu
WS, Glover GI, Wilson S, McNulty DE, Ellis CE, Elshourbagy NA, Shabon U, Trill JJ, Hay
DW, Ohlstein EH, Bergsma DJ, Douglas SA. Human urotensin-II is a potent
vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14. Nature. 1999 Sep 16;
401(6750):282-6.

- Bai M. Dimerization of G-protein-coupled receptors: roles in signal transduction. Cell

Signal. 2004 Feb; 16(2):175-86.

- Balat O, Aksoy F, Kutlar I, Ugur MG, Iyikosker H, Balat A, Anarat R. Increased plasma
levels of Urotensin-II in preeclampsia-eclampsia: a new mediator in pathogenesis? Eur
J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 May 1; 120(1):33-8.

133
- Balsinde J, Dennis EA. Function and inhibition of intracellular calcium-independent
phospholipase A2. J Biol Chem. 1997 Jun 27; 272(26):16069-72.

- Barlow CA, Rose P, Pulver-Kaste RA, Lounsbury KM. Excitation-transcription coupling

in smooth muscle. J Physiol. 2006 Jan 1; 570(Pt 1):59-64. Epub 2005 Oct 13.

- Baryshnikov SG, Pulina MV, Zulian A, Linde CI, Golovina VA. Orai1, a critical
component of store-operated Ca2+ entry, is functionally associated with Na+/Ca2+
exchanger and plasma membrane Ca2+ pump in proliferating human arterial
myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 2009 Nov; 297(5):C1103-12. Epub 2009 Aug 12.

- Behm DJ, Harrison SM, Ao Z, Maniscalco K, Pickering SJ, Grau EV, Woods TN, Coatney
RW, Doe CP, Willette RN, Johns DG, Douglas SA. Deletion of the UT receptor gene
results in the selective loss of urotensin-II contractile activity in aortae isolated from
UT receptor knockout mice. Br J Pharmacol. 2003 May; 139(2):464-72.

- Bern HA, Pearson D, Larson BA, Nishioka RS. Neurohormones from fish tails: the
caudal neurosecretory system. I. "Urophysiology" and the caudal neurosecretory
system of fishes. Recent Prog Horm Res. 1985; 41:533-52.

- Berne and Levy. Principles of Phisiology. 2006

- Berra-Romani R, Mazzocco-Spezzia A, Pulina MV, Golovina VA. Ca2+ handling is

altered when arterial myocytes progress from a contractile to a proliferative
phenotype in culture. Am J Physiol Cell Physiol. 2008 Sep; 295(3):C779-90. Epub 2008
Jul 2.

- Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis
and remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jul; 4(7):517-29.

- Berridge MJ. Capacitative calcium entry. Biochem J. 1995 Nov 15; 312 ( Pt 1):1-11.

- Berridge MJ. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 1993 Jan 28;
361(6410):315-25.

134
- Bisaillon JM, Motiani RK, Gonzalez-Cobos JC, Potier M, Halligan KE, Alzawahra WF,
Barroso M, Singer HA, Jourd'heuil D, Trebak M. Essential role for STIM1/Orai1-
mediated calcium influx in PDGF-induced smooth muscle migration. Am J Physiol Cell
Physiol. 2010 May; 298(5):C993-1005. Epub 2010 Jan 27.

- Blondel O, Moody MM, Depaoli AM, Sharp AH, Ross CA, Swift H, Bell GI. Localization
of inositol trisphosphate receptor subtype 3 to insulin and somatostatin secretory
granules and regulation of expression in islets and insulinoma cells. Proc Natl Acad Sci
USA. 1994 Aug 2; 91(16):7777-81.

- Boittin FX, Petermann O, Hirn C, Mittaud P, Dorchies OM, Roulet E, Ruegg UT. Ca2+-
independent phospholipase A2 enhances store-operated Ca2+ entry in dystrophic
skeletal muscle fibers. J Cell Sci. 2006 Sep 15; 119(Pt 18):3733-42. Epub 2006 Aug 22.

- Bolotina VM, Csutora P. CIF and other mysteries of the store-operated Ca2+-entry
pathway. Trends Biochem Sci. 2005 Jul; 30(7):378-87.

- Bolotina VM. Orai, STIM1 and iPLA2beta: a view from a different perspective. J
Physiol. 2008 Jul 1; 586(13):3035-42. Epub 2008 May 22.

- Bootman MD, Collins TJ, Mackenzie L, Roderick HL, Berridge MJ, Peppiatt CM. 2-
aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) is a reliable blocker of store-operated Ca2+ entry
but an inconsistent inhibitor of InsP3-induced Ca2+ release. FASEB J. 2002 Aug;
16(10):1145-50.

- Bottrill FE, Douglas SA, Hiley CR, White R. Human urotensin-II is an endothelium-
dependent vasodilator in rat small arteries. Br J Pharmacol. 2000 Aug; 130(8):1865-70.

- Bousette N, Hu F, Ohlstein EH, Dhanak D, Douglas SA, Giaid A. Urotensin-II blockade

with SB-611812 attenuates cardiac dysfunction in a rat model of coronary artery
ligation. J Mol Cell Cardiol. 2006 Aug; 41(2):285-95. Epub 2006 Jun 22.

- Brandman O, Liou J, Park WS, Meyer T. STIM2 is a feedback regulator that stabilizes
basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca2+ levels. Cell. 2007 Dec 28; 131(7):1327-
39.

135
- Brueggemann LI, Markun DR, Henderson KK, Cribbs LL, Byron KL. Pharmacological and
electrophysiological characterization of store-operated currents and capacitative
Ca(2+) entry in vascular smooth muscle cells. J Pharmacol Exp Ther. 2006 May;
317(2):488-99. Epub 2006 Jan 13.

- Cahalan MD. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nat Cell Biol. 2009 Jun;
11(6):669-77.

- Carafoli E, Santella L, Branca D, Brini M. Generation, control, and processing of

cellular calcium signals. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2001 Apr; 36(2):107-260.

- Carafoli E. Calcium signaling: a tale for all seasons. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Feb
5; 99(3):1115-22.

- Chamley-Campbell J, Campbell GR, Ross R. The smooth muscle cell in culture. Physiol
Rev. 1979 Jan; 59(1):1-61.

- Cheng KT, Liu X, Ong HL, Swaim W, Ambudkar IS. Local Ca²+ entry via Orai1 regulates
plasma membrane recruitment of TRPC1 and controls cytosolic Ca²+ signals required
for specific cell functions. PLoS Biol. 2011 Mar; 9(3):e1001025. Epub 2011 Mar 8.

- Cheung BM, Leung R, Man YB, Wong LY. Plasma concentration of urotensin II is raised
in hypertension. J Hypertens. 2004 Jul; 22(7):1341-4.

- Cook JL. G protein-coupled receptors as disease targets: emerging paradigms.

Ochsner J. 2010 Spring; 10(1):2-7.

- Coulouarn Y, Jégou S, Tostivint H, Vaudry H, Lihrmann I. Cloning, sequence analysis

and tissue distribution of the mouse and rat urotensin II precursors. FEBS Lett. 1999
Aug 20; 457(1):28-32.

- Coulouarn Y, Lihrmann I, Jegou S, Anouar Y, Tostivint H, Beauvillain JC, Conlon JM,

Bern HA, Vaudry H. Cloning of the cDNA encoding the urotensin II precursor in frog and
human reveals intense expression of the urotensin II gene in motoneurons of the
spinal cord. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Dec 22; 95(26):15803-8.

136
- Csutora P, Su Z, Kim HY, Bugrim A, Cunningham KW, Nuccitelli R, Keizer JE, Hanley
MR, Blalock JE, Marchase RB. Calcium influx factor is synthesized by yeast and
mammalian cells depleted of organellar calcium stores. Proc Natl Acad Sci USA. 1999
Jan 5; 96(1):121-6.

- Curcio A, Torella D, Indolfi C. Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and

endothelial regeneration after vascular injury and stenting: approach to therapy. Circ J.
2011; 75(6):1287-96. Epub 2011 Apr 29.

- Djordjevic T, BelAiba RS, Bonello S, Pfeilschifter J, Hess J, Görlach A. Human urotensin

II is a novel activator of NADPH oxidase in human pulmonary artery smooth muscle
cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005 Mar; 25(3):519-25. Epub 2004 Dec 23.

- Dolmetsch RE, Lewis RS, Goodnow CC, Healy JI. Differential activation of transcription
factors induced by Ca2+ response amplitude and duration. Nature. 1997 Apr 24;
386(6627):855-8.

- Domínguez-Rodríguez A, Díaz I, Rodríguez-Moyano M, Calderón-Sánchez E, Rosado

JA, Ordóñez A, Smani T. Urotensin-II Signaling Mechanism in Rat Coronary Artery: Role
of STIM1 and Orai1-Dependent Store Operated Calcium Influx in Vasoconstriction.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012 Jan 5. [Epub ahead of print]

- Douglas SA, Ashton DJ, Sauermelch CF, Coatney RW, Ohlstein DH, Ruffolo MR,
Ohlstein EH, Aiyar NV, Willette RN. Human urotensin-II is a potent vasoactive peptide:
pharmacological characterization in the rat, mouse, dog and primate. J Cardiovasc
Pharmacol. 2000 Nov; 36(5 Suppl 1):S163-6.

- Douglas SA, Dhanak D, Johns DG. From 'gills to pills': urotensin-II as a regulator of
mammalian cardiorenal function. Trends Pharmacol Sci. 2004 Feb; 25(2):76-85.

- Drake MT, Shenoy SK, Lefkowitz RJ. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ
Res. 2006 Sep 15; 99(6):570-82.

137
- Facemire CS, Mohler PJ, Arendshorst WJ. Expression and relative abundance of short
transient receptor potential channels in the rat renal microcirculation. Am J Physiol
Renal Physiol. 2004 Mar; 286(3):F546-51. Epub 2003 Dec 16.

- Feske S, Gwack Y, Prakriya M, Srikanth S, Puppel SH, Tanasa B, Hogan PG, Lewis RS,
Daly M, Rao A. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC
channel function. Nature. 2006 May 11; 441(7090):179-85. Epub 2006 Apr 2.

- Flemming R, Xu SZ, Beech DJ. Pharmacological profile of store-operated channels in

cerebral arteriolar smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 2003 Jul; 139(5):955-65.

- Fredriksson R, Lagerström MC, Schiöth HB. Expansion of the superfamily of G-protein-

coupled receptors in chordates. Ann N Y Acad Sci. 2005 Apr; 1040:89-94.

- Galán C, Dionisio N, Smani T, Salido GM, Rosado JA. The cytoskeleton plays a
modulatory role in the association between STIM1 and the Ca2+ channel subunits
Orai1 and TRPC1. Biochem Pharmacol. 2011 Aug 15; 82(4):400-10. Epub 2011 May 27.

- Gendron G, Simard B, Gobeil F Jr, Sirois P, D'Orléans-Juste P, Regoli D. Human

urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.
Can J Physiol Pharmacol. 2004 Jan; 82(1):16-21.

- Gerzanich V, Ivanova S, Simard JM. Early pathophysiological changes in cerebral

vessels predisposing to stroke. Clin Hemorheol Microcirc. 2003; 29(3-4):291-4.

- Gibson A, McFadzean I, Wallace P, Wayman CP. Capacitative Ca2+ entry and the
regulation of smooth muscle tone. Trends Pharmacol Sci. 1998 Jul; 19(7):266-9.

- Gibson A. Complex effects of Gillichthys urotensin II on rat aortic strips. Br J

Pharmacol. 1987 May; 91(1):205-12.

- Glass CK, Witztum JL. Atherosclerosis. the road ahead. Cell. 2001 Feb 23; 104(4):503-
16.

138
- Golovina VA, Platoshyn O, Bailey CL, Wang J, Limsuwan A, Sweeney M, Rubin LJ, Yuan
JX. Upregulated TRP and enhanced capacitative Ca(2+) entry in human pulmonary
artery myocytes during proliferation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001 Feb;
280(2):H746-55.

- Gonzalez De La Fuente P, Savineau JP, Marthan R. Control of pulmonary vascular

smooth muscle tone by sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump blockers: thapsigargin and
cyclopiazonic acid. Pflugers Arch. 1995 Mar; 429(5):617-24.

- Gray GA, Jones MR, Sharif I. Human urotensin II increases coronary perfusion
pressure in the isolated rat heart: potentiation by nitric oxide synthase and
cyclooxygenase inhibition. Life Sci. 2001 Jun 1; 69(2):175-80.

- Gruson D, Rousseau MF, Ahn SA, van Linden F, Ketelslegers JM. Circulating urotensin
II levels in moderate to severe congestive heart failure: its relations with myocardial
function and well established neurohormonal markers. Peptides. 2006 Jun; 27(6):1527-
31. Epub 2005 Dec 20.

- Guo RW, Wang H, Gao P, Li MQ, Zeng CY, Yu Y, Chen JF, Song MB, Shi YK, Huang L. An
essential role for stromal interaction molecule 1 in neointima formation following
arterial injury. Cardiovasc Res. 2009 Mar 1; 81(4):660-8. Epub 2008 Dec 3.

- Guo RW, Yang LX, Li MQ, Pan XH, Liu B, Deng YL. Stim1- and Orai1-mediated store-
operated calcium entry is critical for angiotensin II-induced vascular smooth muscle
cell proliferation. Cardiovasc Res. 2012 Feb 1; 93(2):360-70. Epub 2011 Nov 22.

- Gwack Y, Feske S, Srikanth S, Hogan PG, Rao A. Signalling to transcription: store-

operated Ca2+ entry and NFAT activation in lymphocytes. Cell Calcium. 2007 Aug;
42(2):145-56. Epub 2007 Jun 18.

- Hammond SM. Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference
pathway. FEBS Lett. 2005 Oct 31; 579(26):5822-9. Epub 2005 Sep 27.

139
- Hazel JR, Williams EE, Livermore R, Mozingo N. Thermal adaptation in biological
membranes: functional significance of changes in phospholipid molecular species
composition. Lipids. 1991 Apr; 26(4):277-82.

- Hillier C, Berry C, Petrie MC, O'Dwyer PJ, Hamilton C, Brown A, McMurray J. Effects of
urotensin II in human arteries and veins of varying caliber. Circulation. 2001 Mar 13;
103(10):1378-81.

- Hirano K. Current topics in the regulatory mechanism underlying the Ca2+

sensitization of the contractile apparatus in vascular smooth muscle. J Pharmacol Sci.
2007 Jun; 104(2):109-15. Epub 2007 May 31.

- Hong JH, Li Q, Kim MS, Shin DM, Feske S, Birnbaumer L, Cheng KT, Ambudkar IS,
Muallem S. Polarized but differential localization and recruitment of STIM1, Orai1 and
TRPC channels in secretory cells. Traffic. 2011 Feb; 12(2):232-45. doi: 10.1111/j.1600-
0854.2010.01138.x. Epub 2010 Nov 24.

- Hoth M, Penner R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium

current in mast cells. Nature. 1992 Jan 23; 355(6358):353-6.

- House SJ, Ginnan RG, Armstrong SE, Singer HA. Calcium/calmodulin-dependent

protein kinase II-delta isoform regulation of vascular smooth muscle cell proliferation.
Am J Physiol Cell Physiol. 2007 Jun; 292(6):C2276-87. Epub 2007 Jan 31.

- House SJ, Singer HA. CaMKII-delta isoform regulation of neointima formation after
vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Mar; 28(3):441-7. Epub 2007 Dec
20.

- Huang GN, Zeng W, Kim JY, Yuan JP, Han L, Muallem S, Worley PF. STIM1 carboxyl-
terminus activates native SOC, I(crac) and TRPC1 channels. Nat Cell Biol. 2006 Sep;
8(9):1003-10. Epub 2006 Aug 13.

- Iglewski M, Grant SR. Urotensin II-induced signaling involved in proliferation of

vascular smooth muscle cells. Vasc Health Risk Manag. 2010 Sep 7; 6:723-34.

140
- Inoue T, Node K. Molecular basis of restenosis and novel issues of drug-eluting stents.
Circ J. 2009 Apr; 73(4):615-21. Epub 2009 Mar 13.

- Itoh H, McMaster D, Lederis K. Functional receptors for fish neuropeptide urotensin II

in major rat arteries. Eur J Pharmacol. 1988 Apr 27; 149(1-2):61-6.

- Iwamuro Y, Miwa S, Zhang XF, Minowa T, Enoki T, Okamoto Y, Hasegawa H, Furutani

H, Okazawa M, Ishikawa M, Hashimoto N, Masaki T. Activation of three types of
voltage-independent Ca2+ channel in A7r5 cells by endothelin-1 as revealed by a novel
Ca2+ channel blocker LOE 908. Br J Pharmacol. 1999 Mar; 126(5):1107-14.

- Jenkins CM, Han X, Mancuso DJ, Gross RW. Identification of calcium-independent

phospholipase A2 (iPLA2) beta, and not iPLA2gamma, as the mediator of arginine
vasopressin-induced arachidonic acid release in A-10 smooth muscle cells.
Enantioselective mechanism-based discrimination of mammalian iPLA2s. J Biol Chem.
2002 Sep 6; 277(36):32807-14. Epub 2002 Jun 27.

- Jenkins CM, Wolf MJ, Mancuso DJ, Gross RW. Identification of the calmodulin-binding
domain of recombinant calcium-independent phospholipase A2beta. implications for
structure and function. J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276(10):7129-35. Epub 2000 Dec 15.

- Katugampola S, Davenport A. Emerging roles for orphan G-protein-coupled receptors

in the cardiovascular system. Trends Pharmacol Sci. 2003 Jan; 24(1):30-5.

- Kelley GG, Reks SE, Ondrako JM, Smrcka AV. Phospholipase C(epsilon): a novel Ras
effector. EMBO J. 2001 Feb 15; 20(4):743-54.

- Kim MS, Zeng W, Yuan JP, Shin DM, Worley PF, Muallem S. Native Store-operated
Ca2+ Influx Requires the Channel Function of Orai1 and TRPC1. J Biol Chem. 2009 Apr
10; 284(15):9733-41. Epub 2009 Feb 19.

- Krause E, Pfeiffer F, Schmid A, Schulz I. Depletion of intracellular calcium stores

activates a calcium conducting nonselective cation current in mouse pancreatic acinar
cells. J Biol Chem. 1996 Dec 20; 271(51):32523-8.

141
- Kumar B, Dreja K, Shah SS, Cheong A, Xu SZ, Sukumar P, Naylor J, Forte A, Cipollaro M,
McHugh D, Kingston PA, Heagerty AM, Munsch CM, Bergdahl A, Hultgårdh-Nilsson A,
Gomez MF, Porter KE, Hellstrand P, Beech DJ. Upregulated TRPC1 channel in vascular
injury in vivo and its role in human neointimal hyperplasia. Circ Res. 2006 Mar 3;
98(4):557-63. Epub 2006 Jan 26.

- Kurosaki T, Baba Y. Ca2+ signaling and STIM1. Prog Biophys Mol Biol. 2010 Sep;
103(1):51-8. Epub 2010 Mar 11.

- Kwan CY, Chaudhary R, Zheng XF, Ni J, Lee RM. Effects of sarcoplasmic reticulum
calcium pump inhibitors on vascular smooth muscle. Hypertension. 1994 Jan; 23(1
Suppl):I156-60.

- Kwan HY, Huang Y, Yao X. Store-operated calcium entry in vascular endothelial cells is
inhibited by cGMP via a protein kinase G-dependent mechanism. J Biol Chem. 2000
Mar 10; 275(10):6758-63.

- Lapp H, Boerrigter G, Costello-Boerrigter LC, Jaekel K, Scheffold T, Krakau I, Schramm

M, Guelker H, Stasch JP. Elevated plasma human urotensin-II-like immunoreactivity in
ischemic cardiomyopathy. Int J Cardiol. 2004 Mar; 94(1):93-7.

- Lee MG, Xu X, Zeng W, Diaz J, Wojcikiewicz RJ, Kuo TH, Wuytack F, Racymaekers L,
Muallem S. Polarized expression of Ca2+ channels in pancreatic and salivary gland
cells. Correlation with initiation and propagation of [Ca2+]i waves. J Biol Chem. 1997
Jun 20; 272(25):15765-70.

- Leung FP, Yung LM, Yao X, Laher I, Huang Y. Store-operated calcium entry in vascular
smooth muscle. Br J Pharmacol. 2008 Mar; 153(5):846-57. Epub 2007 Sep 17.

- Lewis RS. Store-operated calcium channels. Adv Second Messenger Phosphoprotein

Res. 1999; 33:279-307.

- Li J, Cubbon RM, Wilson LA, Amer MS, McKeown L, Hou B, Majeed Y, Tumova S,
Seymour VA, Taylor H, Stacey M, O'Regan D, Foster R, Porter KE, Kearney MT, Beech

142
DJ. Orai1 and CRAC channel dependence of VEGF-activated Ca2+ entry and endothelial
tube formation. Circ Res. 2011 May 13; 108(10):1190-8. Epub 2011 Mar 24.

- Li J, Sukumar P, Milligan CJ, Kumar B, Ma ZY, Munsch CM, Jiang LH, Porter KE, Beech
DJ. Interactions, functions, and independence of plasma membrane STIM1 and TRPC1
in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2008 Oct 10; 103(8):e97-104. Epub 2008 Sep
18.

- Lin L, Ding WH, Jiang W, Zhang YG, Qi YF, Yuan WJ, Tang CS. Urotensin-II activates L-
arginine/nitric oxide pathway in isolated rat aortic adventitia. Peptides. 2004 Nov;
25(11):1977-84.

- Liou J, Kim ML, Heo WD, Jones JT, Myers JW, Ferrell JE Jr, Meyer T. STIM is a Ca2+
sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 2005 Jul 12;
15(13):1235-41.

- Liu Q, Pong SS, Zeng Z, Zhang Q, Howard AD, Williams DL Jr, Davidoff M, Wang R,
Austin CP, McDonald TP, Bai C, George SR, Evans JF, Caskey CT. Identification of
urotensin II as the endogenous ligand for the orphan G-protein-coupled receptor
GPR14. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Dec 9; 266(1):174-8.

- Liu X, Cheng KT, Bandyopadhyay BC, Pani B, Dietrich A, Paria BC, Swaim WD, Beech D,
Yildrim E, Singh BB, Birnbaumer L, Ambudkar IS. Attenuation of store-operated Ca2+
current impairs salivary gland fluid secretion in TRPC1(-/-) mice. Proc Natl Acad Sci
USA. 2007 Oct 30; 104(44):17542-7. Epub 2007 Oct 23.

- Liu XR, Zhang MF, Yang N, Liu Q, Wang RX, Cao YN, Yang XR, Sham JS, Lin MJ.
Enhanced store-operated Ca²+ entry and TRPC channel expression in pulmonary
arteries of monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats. Am J Physiol Cell
Physiol. 2012 Jan; 302(1):C77-87. Epub 2011 Sep 21.

- Liu Z, Dronadula N, Rao GN. A novel role for nuclear factor of activated T cells in
receptor tyrosine kinase and G protein-coupled receptor agonist-induced vascular

143
smooth muscle cell motility. J Biol Chem. 2004 Sep 24; 279(39):41218-26. Epub 2004
Jul 21.

- Magavi SS, Macklis JD. Identification of newborn cells by BrdU labeling and
immunocytochemistry in vivo. Methods Mol Biol. 2008; 438:335-43.

- Maguire JJ, Davenport AP. Is urotensin-II the new endothelin? Br J Pharmacol. 2002
Nov; 137(5):579-88.

- Maguire JJ, Kuc RE, Davenport AP. Orphan-receptor ligand human urotensin II:
receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses
with endothelin-1. Br J Pharmacol. 2000 Oct; 131(3):441-6.

- Maguire JJ, Kuc RE, Wiley KE, Kleinz MJ, Davenport AP. Cellular distribution of
immunoreactive urotensin-II in human tissues with evidence of increased expression in
atherosclerosis and a greater constrictor response of small compared to large coronary
arteries. Peptides. 2004 Oct; 25(10):1767-74.

- Marco J, Egido EM, Hernández R, Silvestre RA. Evidence for endogenous urotensin-II
as an inhibitor of insulin secretion. Study in the perfused rat pancreas. Peptides. 2008
May; 29(5):852-8. Epub 2007 Sep 4.

- Martínez J, Moreno JJ. Role of Ca2+-independent phospholipase A2 and cytochrome

P-450 in store-operated calcium entry in 3T6 fibroblasts. Biochem Pharmacol. 2005 Sep
1; 70(5):733-9.

- Maruyama Y, Ogura T, Mio K, Kato K, Kaneko T, Kiyonaka S, Mori Y, Sato C. Tetrameric

Orai1 is a teardrop-shaped molecule with a long, tapered cytoplasmic domain. J Biol
Chem. 2009 May 15; 284(20):13676-85. Epub 2009 Mar 16.

- Mercer JC, Dehaven WI, Smyth JT, Wedel B, Boyles RR, Bird GS, Putney JW Jr. Large
store-operated calcium selective currents due to co-expression of Orai1 or Orai2 with
the intracellular calcium sensor, Stim1. J Biol Chem. 2006 Aug 25; 281(34):24979-90.
Epub 2006 Jun 28.

144
- Mignen O, Thompson JL, Shuttleworth TJ. STIM1 regulates Ca2+ entry via
arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or
translocation to the plasma membrane. J Physiol. 2007 Mar 15; 579(Pt 3):703-15. Epub
2006 Dec 7.

- Mikoshiba K. IP3 receptor/Ca2+ channel: from discovery to new signaling concepts. J

Neurochem. 2007 Sep; 102(5):1426-46.

- Minke B, Selinger Z. The roles of trp and calcium in regulating photoreceptor function
in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 1996 Aug; 6(4):459-66.

- Miyawaki A, Furuichi T, Maeda N, Mikoshiba K. Expressed cerebellar-type inositol

1,4,5-trisphosphate receptor, P400, has calcium release activity in a fibroblast L cell
line. Neuron. 1990 Jul; 5(1):11-8.

- Mulvany MJ, Halpern W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in

spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ Res. 1977 Jul; 41(1):19-26.

- Ng LL, Loke I, O'Brien RJ, Squire IB, Davies JE. Plasma urotensin in human systolic
heart failure. Circulation. 2002 Dec 3; 106(23):2877-80.

- Nowatzke W, Ramanadham S, Ma Z, Hsu FF, Bohrer A, Turk J. Mass spectrometric

evidence that agents that cause loss of Ca2+ from intracellular compartments induce
hydrolysis of arachidonic acid from pancreatic islet membrane phospholipids by a
mechanism that does not require a rise in cytosolic Ca2+ concentration. Endocrinology.
1998 Oct; 139(10):4073-85.

- Onan D, Pipolo L, Yang E, Hannan RD, Thomas WG. Urotensin II promotes

hypertrophy of cardiac myocytes via mitogen-activated protein kinases. Mol
Endocrinol. 2004 Sep; 18(9):2344-54. Epub 2004 Jun 17.

- Ong HL, Ambudkar IS. The dynamic complexity of the TRPC1 channelosome. Channels
(Austin). 2011 Sep-Oct; 5(5):424-31. Epub 2011 Sep 1.

145
- Ong HL, Cheng KT, Liu X, Bandyopadhyay BC, Paria BC, Soboloff J, Pani B, Gwack Y,
Srikanth S, Singh BB, Gill DL, Ambudkar IS. Dynamic assembly of TRPC1-STIM1-Orai1
ternary complex is involved in store-operated calcium influx. Evidence for similarities
in store-operated and calcium release-activated calcium channel components. J Biol
Chem. 2007 Mar 23; 282(12):9105-16. Epub 2007 Jan 15.

- Orr AW, Hastings NE, Blackman BR, Wamhoff BR. Complex regulation and function of
the inflammatory smooth muscle cell phenotype in atherosclerosis. J Vasc Res. 2010;
47(2):168-80. Epub 2009 Oct 22.

- Papadopoulos P, Bousette N, Al-Ramli W, You Z, Behm DJ, Ohlstein EH, Harrison SM,
Douglas SA, Giaid A. Targeted overexpression of the human urotensin receptor
transgene in smooth muscle cells: effect of UT antagonism in ApoE knockout mice fed
with Western diet. Atherosclerosis. 2009 Jun; 204(2):395-404. Epub 2008 Nov 21.

- Parekh AB, Penner R. Store depletion and calcium influx. Physiol Rev. 1997 Oct;
77(4):901-30.

- Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated calcium channels. Physiol Rev. 2005 Apr;
85(2):757-810.

- Parekh AB. Store-operated Ca2+ entry: dynamic interplay between endoplasmic

reticulum, mitochondria and plasma membrane. J Physiol. 2003 Mar 1; 547(Pt 2):333-
48. Epub 2003 Feb 7.

- Park KM, Trucillo M, Serban N, Cohen RA, Bolotina VM. Role of iPLA2 and store-
operated channels in agonist-induced Ca2+ influx and constriction in cerebral,
mesenteric, and carotid arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008 Mar;
294(3):H1183-7. Epub 2007 Dec 21.

- Parker NJ, Begley CG, Smith PJ, Fox RM. Molecular cloning of a novel human gene
(D11S4896E) at chromosomal region 11p15.5. Genomics. 1996 Oct 15; 37(2):253-6.

146
- Patacchini R, Santicioli P, Giuliani S, Grieco P, Novellino E, Rovero P, Maggi CA.
Urantide: an ultrapotent urotensin II antagonist peptide in the rat aorta. Br J
Pharmacol. 2003 Dec; 140(7):1155-8.

- Peinelt C, Lis A, Beck A, Fleig A, Penner R. 2-Aminoethoxydiphenyl borate directly

facilitates and indirectly inhibits STIM1-dependent gating of CRAC channels. J Physiol.
2008 Jul 1; 586(13):3061-73. Epub 2008 Apr 10.

- Peinelt C, Vig M, Koomoa DL, Beck A, Nadler MJ, Koblan-Huberson M, Lis A, Fleig A,
Penner R, Kinet JP. Amplification of CRAC current by STIM1 and CRACM1 (Orai1). Nat
Cell Biol. 2006 Jul; 8(7):771-3. Epub 2006 May 30.

- Peng X, Yin H, Wang LH, Chai SB, Shu JL, Tang CS. Content and activity of the focal
adhesion kinase in cultured vascular smooth muscle cells enhanced by urotensin II.
Sheng Li Xue Bao. 2000 Dec; 52(6):455-8.

- Poenie M, Tsien R. Fura-2: a powerful new tool for measuring and imaging [Ca2+]i in
single cells. Prog Clin Biol Res. 1986; 210:53-6.

- Potier M, Gonzalez JC, Motiani RK, Abdullaev IF, Bisaillon JM, Singer HA, Trebak M.
Evidence for STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium influx through ICRAC
in vascular smooth muscle cells: role in proliferation and migration. FASEB J. 2009 Aug;
23(8):2425-37. Epub 2009 Apr 13.

- Potier M, Trebak M. New developments in the signaling mechanisms of the store-

operated calcium entry pathway. Pflugers Arch. 2008 Nov; 457(2):405-15. Epub 2008
Jun 7.

- Prakriya M, Feske S, Gwack Y, Srikanth S, Rao A, Hogan PG. Orai1 is an essential pore
subunit of the CRAC channel. Nature. 2006 Sep 14; 443(7108):230-3. Epub 2006 Aug
20.

- Pulver RA, Rose-Curtis P, Roe MW, Wellman GC, Lounsbury KM. Store-operated Ca2+
entry activates the CREB transcription factor in vascular smooth muscle. Circ Res. 2004
May 28; 94(10):1351-8. Epub 2004 Apr 8.

147
- Pulver-Kaste RA, Barlow CA, Bond J, Watson A, Penar PL, Tranmer B, Lounsbury KM.
Ca2+ source-dependent transcription of CRE-containing genes in vascular smooth
muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006 Jul; 291(1):H97-105. Epub 2006 Feb 3.

- Putney JW Jr, McKay RR. Capacitative calcium entry channels. Bioessays. 1999 Jan;
21(1):38-46.

- Putney JW Jr. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 1986 Feb;
7(1):1-12.

- Putney JW Jr. Identification of cellular activation mechanisms associated with salivary

secretion. Annu Rev Physiol. 1986; 48:75-88.

- Putney JW Jr. New molecular players in capacitative Ca2+ entry. J Cell Sci. 2007 Jun
15; 120(Pt 12):1959-65. Epub 2007 May 3.

- Putney JW. Capacitative calcium entry: from concept to molecules. Immunol Rev.
2009 Sep; 231(1):10-22.

- Rakowski E, Hassan GS, Dhanak D, Ohlstein EH, Douglas SA, Giaid A. A role for
urotensin II in restenosis following balloon angioplasty: use of a selective UT receptor
blocker. J Mol Cell Cardiol. 2005 Nov; 39(5):785-91. Epub 2005 Sep 19.

- Randriamampita C, Tsien RY. Emptying of intracellular Ca2+ stores releases a novel

small messenger that stimulates Ca2+ influx. Nature. 1993 Aug 26; 364(6440):809-14.

- Rees DD, Palmer RM, Schulz R, Hodson HF, Moncada S. Characterization of three
inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo. Br J Pharmacol. 1990
Nov; 101(3):746-52.

- Rizzuto R, Brini M, Murgia M, Pozzan T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-
sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 1993 Oct 29;
262(5134):744-7.

148
- Roos J, DiGregorio PJ, Yeromin AV, Ohlsen K, Lioudyno M, Zhang S, Safrina O, Kozak
JA, Wagner SL, Cahalan MD, Veliçelebi G, Stauderman KA. STIM1, an essential and
conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 2005 May
9; 169(3):435-45. Epub 2005 May 2.

- Rosado JA, Jenner S, Sage SO. A role for the actin cytoskeleton in the initiation and
maintenance of store-mediated calcium entry in human platelets. Evidence for
conformational coupling. J Biol Chem. 2000 Mar 17; 275(11):7527-33.

- Ross B, McKendy K, Giaid A. Role of urotensin II in health and disease. Am J Physiol

Regul Integr Comp Physiol. 2010 May; 298(5):R1156-72.

- Rossowski WJ, Cheng BL, Taylor JE, Datta R, Coy DH. Human urotensin II-induced
aorta ring contractions are mediated by protein kinase C, tyrosine kinases and Rho-
kinase: inhibition by somatostatin receptor antagonists. Eur J Pharmacol. 2002 Mar 8;
438(3):159-70.

- Russell FD. Urotensin II in cardiovascular regulation. Vasc Health Risk Manag. 2008;
4(4):775-85.

- Saetrum Opgaard O, Nothacker H, Ehlert FJ, Krause DN. Human urotensin II mediates
vasoconstriction via an increase in inositol phosphates. Eur J Pharmacol. 2000 Oct 13;
406(2):265-71.

- Sáez ME, Smani T, Ramírez-Lorca R, Díaz I, Serrano-Ríos M, Ruiz A, Ordoñez A.

Association analysis of urotensin II gene (UTS2) and flanking regions with biochemical
parameters related to insulin resistance. PLoS One. 2011 Apr 29; 6(4):e19327.

- Saleh SN, Albert AP, Peppiatt CM, Large WA. Angiotensin II activates two cation
conductances with distinct TRPC1 and TRPC6 channel properties in rabbit mesenteric
artery myocytes. J Physiol. 2006 Dec 1; 577(Pt 2):479-95. Epub 2006 Sep 14.

- Sauzeau V, Le Mellionnec E, Bertoglio J, Scalbert E, Pacaud P, Loirand G. Human

urotensin II-induced contraction and arterial smooth muscle cell proliferation are
mediated by RhoA and Rho-kinase. Circ Res. 2001 Jun 8; 88(11):1102-4.

149
- Shi L, Ding W, Li D, Wang Z, Jiang H, Zhang J, Tang C. Proliferation and anti-apoptotic
effects of human urotensin II on human endothelial cells. Atherosclerosis. 2006 Oct;
188(2):260-4. Epub 2005 Dec 15.

- Silvestre RA, Rodríguez-Gallardo J, Egido EM, Marco J. Inhibition of insulin release by

urotensin II--a study on the perfused rat pancreas. Horm Metab Res. 2001 Jun;
33(6):379-81.

- Singaravelu K, Lohr C, Deitmer JW. Regulation of store-operated calcium entry by

calcium-independent phospholipase A2 in rat cerebellar astrocytes. J Neurosci. 2006
Sep 13; 26(37):9579-92.

- Slater EC, Cleland KW. The calcium content of isolated heart-muscle sarcosomes.
Biochem J. 1953 Jun; 54(3):xxii.

- Smani T, Domínguez-Rodríguez A, Hmadcha A, Calderón-Sánchez E, Horrillo-Ledesma

A, Ordóñez A. Role of Ca2+-independent phospholipase A2 and store-operated
pathway in urocortin-induced vasodilatation of rat coronary artery. Circ Res. 2007 Nov
26; 101(11):1194-203. Epub 2007 Sep 20.

- Smani T, Zakharov SI, Csutora P, Leno E, Trepakova ES, Bolotina VM. A novel
mechanism for the store-operated calcium influx pathway. Nat Cell Biol. 2004 Feb;
6(2):113-20. Epub 2004 Jan 18.

- Smani T, Zakharov SI, Leno E, Csutora P, Trepakova ES, Bolotina VM. Ca2+-
independent phospholipase A2 is a novel determinant of store-operated Ca2+ entry. J
Biol Chem. 2003 Apr 4; 278(14):11909-15. Epub 2003 Jan 23.

- Smyth JT, Dehaven WI, Bird GS, Putney JW Jr. Ca2+-store-dependent and -
independent reversal of Stim1 localization and function. J Cell Sci. 2008 Mar 15; 121(Pt
6):762-72. Epub 2008 Feb 19.

- Soboloff J, Spassova MA, Hewavitharana T, He LP, Xu W, Johnstone LS, Dziadek MA,

Gill DL. STIM2 is an inhibitor of STIM1-mediated store-operated Ca2+ Entry. Curr Biol.
2006 Jul 25; 16(14):1465-70.

150
- Somlyo AP, Somlyo AV. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II:
modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase. Physiol Rev. 2003 Oct;
83(4):1325-58.

- Somlyo AV, Somlyo AP. Intracellular signaling in vascular smooth muscle. Adv Exp
Med Biol. 1993; 346:31-8.

- Spassova MA, Soboloff J, He LP, Xu W, Dziadek MA, Gill DL. STIM1 has a plasma
membrane role in the activation of store-operated Ca(2+) channels. Proc Natl Acad Sci
USA. 2006 Mar 14; 103(11):4040-5. Epub 2006 Mar 6.

- Stadel JM, Shorr RG, Limbird LE, Lefkowitz RJ Evidence that a beta-adrenergic
receptor-associated guanine nucleotide regulatory protein conveys guanosine 5'-O-(3-
thiotriphosphate)- dependent adenylate cyclase activity. J Biol Chem. 1981 Aug 25;
256(16):8718-23.

- Stary HC, Chandler AB, Glagov S, Guyton JR, Insull W Jr, Rosenfeld ME, Schaffer SA,
Schwartz CJ, Wagner WD, Wissler RW. A definition of initial, fatty streak, and
intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular
Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Arterioscler
Thromb. 1994 May; 14(5):840-56.

- Stevens and Lowe. 2006

- Stevenson AS, Cartin L, Wellman TL, Dick MH, Nelson MT, Lounsbury KM. Membrane
depolarization mediates phosphorylation and nuclear translocation of CREB in vascular
smooth muscle cells. Exp Cell Res. 2001 Feb 1; 263(1):118-30.

- Stirrat A, Gallagher M, Douglas SA, Ohlstein EH, Berry C, Kirk A, Richardson M,

MacLean MR. Potent vasodilator responses to human urotensin-II in human pulmonary
and abdominal resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001 Feb;
280(2):H925-8.

151
- Suguro T, Watanabe T, Ban Y, Kodate S, Misaki A, Hirano T, Miyazaki A, Adachi M.
Increased human urotensin II levels are correlated with carotid atherosclerosis in
essential hypertension. Am J Hypertens. 2007 Feb; 20(2):211-7.

- Suguro T, Watanabe T, Kodate S, Xu G, Hirano T, Adachi M, Miyazaki A. Increased

plasma urotensin-II levels are associated with diabetic retinopathy and carotid
atherosclerosis in Type 2 diabetes. Clin Sci (Lond). 2008 Dec; 115(11):327-34.

- Summers R. Themed section: molecular pharmacology of GPCRs. Br J Pharmacol.

2012 Mar; 165(6):1609-12.

- Suzuki S, Wenyi Z, Hirai M, Hinokio Y, Suzuki C, Yamada T, Yoshizumi S, Suzuki M,

Tanizawa Y, Matsutani A, Oka Y. Genetic variations at urotensin II and urotensin II
receptor genes and risk of type 2 diabetes mellitus in Japanese. Peptides. 2004 Oct;
25(10):1803-8.

- Sweeney M, McDaniel SS, Platoshyn O, Zhang S, Yu Y, Lapp BR, Zhao Y, Thistlethwaite

PA, Yuan JX. Role of capacitative Ca2+ entry in bronchial contraction and remodeling. J
Appl Physiol. 2002 Apr; 92(4):1594-602.

- Takahashi Y, Watanabe H, Murakami M, Ono K, Munehisa Y, Koyama T, Nobori K,

Iijima T, Ito H. Functional role of stromal interaction molecule 1 (STIM1) in vascular
smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Oct 5; 361(4):934-40. Epub
2007 Jul 26.

- Tamura K, Okazaki M, Tamura M, Isozumi K, Tasaki H, Nakashima Y. Urotensin II-

induced activation of extracellular signal-regulated kinase in cultured vascular smooth
muscle cells: involvement of cell adhesion-mediated integrin signaling. Life Sci. 2003
Jan 17; 72(9):1049-60.

- Tasaki K, Hori M, Ozaki H, Karaki H, Wakabayashi I. Mechanism of human urotensin II-

induced contraction in rat aorta. J Pharmacol Sci. 2004 Apr; 94(4):376-83. Bottrill FE, -

- Tepel M, Ruess C, Mehring N, Neusser M, Zidek W. Effect of inhibition of sarcoplasmic

Ca(2+)-ATPase on vasoconstriction and cytosolic Ca2+ in aortic smooth muscle from

152
spontaneously hypertensive and normotensive rats. Clin Exp Hypertens. 1994 Jul;
16(4):493-506.

- Thomas D, Hanley MR. Evaluation of calcium influx factors from stimulated Jurkat T-
lymphocytes by microinjection into Xenopus oocytes. J Biol Chem. 1995 Mar 24;
270(12):6429-32.

- Tokunou T, Shibata R, Kai H, Ichiki T, Morisaki T, Fukuyama K, Ono H, Iino N, Masuda

S, Shimokawa H, Egashira K, Imaizumi T, Takeshita A. Apoptosis induced by inhibition
of cyclic AMP response element-binding protein in vascular smooth muscle cells.
Circulation. 2003 Sep 9; 108(10):1246-52. Epub 2003 Aug 25.

- Tregear RT, Dawson AP, Irvine RF. Quantal release of Ca2+ from intracellular stores by
InsP3: tests of the concept of control of Ca2+ release by intraluminal Ca2+. Proc Biol
Sci. 1991 Mar 22; 243(1308):263-8

- Trepakova ES, Gericke M, Hirakawa Y, Weisbrod RM, Cohen RA, Bolotina VM.
Properties of a native cation channel activated by Ca2+ store depletion in vascular
smooth muscle cells. J Biol Chem. 2001 Mar 16; 276(11):7782-90. Epub 2000 Dec 11.

- Tsai CS, Loh SH, Liu JC, Lin JW, Chen YL, Chen CH, Cheng TH. Urotensin II-induced
endothelin-1 expression and cell proliferation via epidermal growth factor receptor
transactivation in rat aortic smooth muscle cells. Atherosclerosis. 2009 Sep; 206(1):86-
94. Epub 2009 Feb 20.

- Tuteja N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 2009
Oct; 4(10):942-7.

- Tzanidis A, Hannan RD, Thomas WG, Onan D, Autelitano DJ, See F, Kelly DJ, Gilbert RE,
Krum H. Direct actions of urotensin II on the heart: implications for cardiac fibrosis and
hypertrophy. Circ Res. 2003 Aug 8; 93(3):246-53. Epub 2003 Jul 3.

- Vaca L, Kunze DL. Depletion of intracellular Ca2+ stores activates a Ca(2+)-selective

channel in vascular endothelium. Am J Physiol. 1994 Oct; 267(4 Pt 1):C920-5.

153
- Vaca L. SOCIC: the store-operated calcium influx complex. Cell Calcium. 2010 Mar;
47(3):199-209. Epub 2010 Feb 10.

- Várnai P, Tóth B, Tóth DJ, Hunyady L, Balla T. Visualization and manipulation of

plasma membrane-endoplasmic reticulum contact sites indicates the presence of
additional molecular components within the STIM1-Orai1 Complex. J Biol Chem. 2007
Oct 5; 282(40):29678-90. Epub 2007 Aug 7.

- Vig M, Beck A, Billingsley JM, Lis A, Parvez S, Peinelt C, Koomoa DL, Soboloff J, Gill DL,
Fleig A, Kinet JP, Penner R. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC
channel. Curr Biol. 2006 Oct 24; 16(20):2073-9. Epub 2006 Sep 14.

- Wang C, Wang J, Zhao L, Wang Y, Liu J, Shi L, Xu M, Wang C. Sildenafil inhibits human
pulmonary artery smooth muscle cell proliferation by decreasing capacitative Ca2+
entry. J Pharmacol Sci. 2008 Sep; 108(1):71-8.

- Watanabe T, Kanome T, Miyazaki A, Katagiri T. Human urotensin II as a link between

hypertension and coronary artery disease. Hypertens Res. 2006 Jun; 29(6):375-87.

- Watanabe T, Koba S, Katagiri T, Pakala R, Benedict CR. Lysophosphatidylcholine

potentiates the mitogenic effect of various vasoactive compounds on rabbit aortic
smooth muscle cells. Jpn Heart J. 2002 Jul; 43(4):409-16.

- Watanabe T, Pakala R, Katagiri T, Benedict CR. Synergistic effect of urotensin II with

mildly oxidized LDL on DNA synthesis in vascular smooth muscle cells. Circulation. 2001
Jul 3; 104(1):16-8.

- Watanabe T, Pakala R, Katagiri T, Benedict CR. Synergistic effect of urotensin II with

serotonin on vascular smooth muscle cell proliferation. J Hypertens. 2001 Dec;
19(12):2191-6.

- Watanabe T, Suguro T, Kanome T, Sakamoto Y, Kodate S, Hagiwara T, Hongo S, Hirano

T, Adachi M, Miyazaki A. Human urotensin II accelerates foam cell formation in human
monocyte-derived macrophages. Hypertension. 2005 Oct; 46(4):738-44. Epub 2005 Sep
19.

154
- Watanabe T, Takahashi K, Kanome T, Hongo S, Miyazaki A, Koba S, Katagiri T, Pakara
R, Benedict CR. Human urotensin-II potentiates the mitogenic effect of mildly oxidized
low-density lipoprotein on vascular smooth muscle cells: comparison with other
vasoactive agents and hydrogen peroxide. Hypertens Res. 2006 Oct; 29(10):821-31.

- Wayman CP, McFadzean I, Gibson A, Tucker JF. Inhibition by sodium nitroprusside of

a calcium store depletion-activated non-selective cation current in smooth muscle cells
of the mouse anococcygeus. Br J Pharmacol. 1996 Aug; 118(8):2001-8.

- Wayman CP, McFadzean I, Gibson A, Tucker JF. Two distinct membrane currents
activated by cyclopiazonic acid-induced calcium store depletion in single smooth
muscle cells of the mouse anococcygeus. Br J Pharmacol. 1996 Feb; 117(3):566-572.

- Winstead MV, Balsinde J, Dennis EA. Calcium-independent phospholipase A(2):

structure and function. Biochim Biophys Acta. 2000 Oct 31; 1488(1-2):28-39.

- Wolf MJ, Gross RW. The calcium-dependent association and functional coupling of
calmodulin with myocardial phospholipase A2. Implications for cardiac cycle-
dependent alterations in phospholipolysis. J Biol Chem. 1996 Aug 30; 271(35):20989-
92.

- Wu MM, Buchanan J, Luik RM, Lewis RS. Ca2+ store depletion causes STIM1 to
accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol.
2006 Sep 11; 174(6):803-13.

- Wuytack F, Raeymaekers L, Missiaen L. Molecular physiology of the SERCA and SPCA

pumps. Cell Calcium. 2002 Nov-Dec; 32(5-6):279-305.

- Xu P, Lu J, Li Z, Yu X, Chen L, Xu T. Aggregation of STIM1 underneath the plasma

membrane induces clustering of Orai1. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Dec 1;
350(4):969-76. Epub 2006 Oct 4.

- Xu SZ, Beech DJ. TrpC1 is a membrane-spanning subunit of store-operated Ca(2+)

channels in native vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2001 Jan 19; 88(1):84-7.

155
- Xu SZ, Boulay G, Flemming R, Beech DJ. E3-targeted anti-TRPC5 antibody inhibits
store-operated calcium entry in freshly isolated pial arterioles. Am J Physiol Heart Circ
Physiol. 2006 Dec; 291(6):H2653-9. Epub 2006 Jul 21.

- Yellaturu CR, Ghosh SK, Rao RK, Jennings LK, Hassid A, Rao GN. A potential role for
nuclear factor of activated T-cells in receptor tyrosine kinase and G-protein-coupled
receptor agonist-induced cell proliferation. Biochem J. 2002 Nov 15; 368(Pt 1):183-90.

- Yeromin AV, Zhang SL, Jiang W, Yu Y, Safrina O, Cahalan MD. Molecular identification
of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 2006 Sep 14;
443(7108):226-9. Epub 2006 Aug 20.

- Yoshimoto T, Matsushita M, Hirata Y. Role of urotensin II in peripheral tissue as an

autocrine/paracrine growth factor. Peptides. 2004 Oct; 25(10):1775-81.

- Yuan JP, Zeng W, Huang GN, Worley PF, Muallem S. STIM1 heteromultimerizes TRPC
channels to determine their function as store-operated channels. Nat Cell Biol. 2007
Jun; 9(6):636-45. Epub 2007 May 7.

- Zakharov SI, Smani T, Dobrydneva Y, Monje F, Fichandler C, Blackmore PF, Bolotina

VM. Diethylstilbestrol is a potent inhibitor of store-operated channels and capacitative
Ca(2+) influx. Mol Pharmacol. 2004 Sep; 66(3):702-7.

- Zarayskiy V, Monje F, Peter K, Csutora P, Khodorov BI, Bolotina VM. Store-operated

Orai1 and IP3 receptor-operated TRPC1 channel. Channels (Austin). 2007 Jul-Aug;
1(4):246-52.

- Zhang SL, Kozak JA, Jiang W, Yeromin AV, Chen J, Yu Y, Penna A, Shen W, Chi V,
Cahalan MD. Store-dependent and -independent modes regulating Ca2+ release-
activated Ca2+ channel activity of human Orai1 and Orai3. J Biol Chem. 2008 Jun 20;
283(25):17662-71. Epub 2008 Apr 17.

- Zhang SL, Yu Y, Roos J, Kozak JA, Deerinck TJ, Ellisman MH, Stauderman KA, Cahalan
MD. STIM1 is a Ca2+ sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+
store to the plasma membrane. Nature. 2005 Oct 6; 437(7060):902-5.

156
- Zhang W, Halligan KE, Zhang X, Bisaillon JM, Gonzalez-Cobos JC, Motiani RK, Hu G,
Vincent PA, Zhou J, Barroso M, Singer HA, Matrougui K, Trebak M. Orai1-mediated I
(CRAC) is essential for neointima formation after vascular injury. Circ Res. 2011 Aug 19;
109(5):534-42. Epub 2011 Jul 7.

157