Escuela de Tecnología Médica

BIOTECNOLOGÍA
LUMINISCENCIA

FLUORESCENCIA
FOSFORESCENCIA PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA
EXCITACIÓN DE FLUORÓFOROS

Introducción a la microscopía de super resolución

¿QUÉ ES LA FLUORESCENCIA?
Principios básicos de las radiaciones.

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO
Se denomina como radiación electromagnética
al campo electromagnético que transporta, de 10-12 103
manera oscilante, energía desde un lugar a
otro a la velocidad de la luz y que a diferencia
del sonido puede transportarse a través del
Ultravioleta Infrarrojo
vacío. El espectro electromagnético es la
distribución ordenada de esta radiación según Rayos Rayos Microondas Radar Radio
su nivel de energía. cósmicos gamma

avanzados de cámaras son capaces de registrar

Nuestra visión sólo es capaz de detectar estas

en el ultravioleta o el espectro infrarrojo.

longitudes de onda, sin embargo equipos
380nm 780nm

UV IR
Espectro de luz visible

Amarillo
Verde
Violeta

Rojo
Naranjo
Indigo

Azul

Rojo Profundo
A las radiaciones electromagnéticas ubicadas Cada color representa una longitud determinada y un
entre los 380nm y los 780nm se les conoce nivel determinado de energía, mientras menor sea la
como el espectro de la luz visible longitud de onda, mayor es su nivel de energía
¿QUÉ ES LA FLUORESCENCIA?
El diagrama de Jablonski y la excitación/emisión.
Esta etapa es muy breve (10-9seg) y la molécula sufre cambios
conformacionales y diversas interacciones químicas que
Como se trata de activar un disipan la energía creándose subestados de energía menores.
estado de energía en los Los electrones son excitados a
electrones se refiere a estado un estado vibracional más alto
excitado o excitación

Energía de excitación o absorbida

Una vez que termina la etapa de cambios en la
molécula, esta regresa a su estado fundamental
emitiendo una pequeña cantidad de luz de
En este tipo de interacción menor energía que dura muy poco tiempo.

Energía de emisión
energética, el espectro de
absorción siempre es de
mayor energía que el
espectro de emisión.
Diagrama de Jablonski

En la fosforescencia, el tiempo de
Cuando una partícula o molécula es capaz de absorber en sus electrones energía en unas determinadas longitudes emisión de la molécula dura más
de onda (espectro de absorción) pero a su vez, es capaz de emitir la energía en unas longitudes de onda distintas tiempo que el de la fluorescencia,
(espectro de emisión) a las absorbidas es cuando se genera la fluorescencia. permitiendo que exista emisión de
luz aún cuando no hay excitación
directa sobre la molécula.
FLUOROCROMOS Y FLUORÓFOROS
Diferencia entre fluorocromo y fluoróforo, fluorescencias primarias y secundarias.

Toda aquella molécula fluorescente contiene

en un estructura un fluorocromo que es capaz
de absorber energía y emitir energía en otra
longitud de onda.

Dentro del fluorocromo, el

fluoróforo corresponde a la
porción responsable de
dicha emisión.
FLUORESCENCIA PRIMARIA:
Es aquella fluorescencia que se
da debido a que dentro de la
O la fluorescencia intrínseca que estructura molecular existe un
tienen los alacranes y escorpiones fluorocromo.
en sus tejidos corporales.

Por ejemplo, la fluorescencia natural que posee la proteína

fluorescente verde aislada de la medusa Aequorea victoria
FLUOROCROMOS Y FLUORÓFOROS
Diferencia entre fluorocromo y fluoróforo, fluorescencias primarias y secundarias

FLUORESCENCIA SECUNDARIA:
Es aquella fluorescencia que se da
sólo cuando se adiciona un
fluorocromo específico en la
estructura de la muestra

Por ejemplo, la adición de una molécula

de DAPi que es capaz de intercalarse
con el ADN y permitir la fluorescencia
del material genético para estudios de
microscopía.
 ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN
De acuerdo con las características de cada molécula, existen excitaciones y emisión típicas y propias de cada una de ellas.

Em máx
Energía de excitación

Energía de emisión
Longitudes de
menor excitación

Longitudes de
menor excitación Ex máx
Espectro de emisión λ
Espectro de excitación Muestra la intensidad de luz relativa de emisión al
Muestra la intensidad de luz máxima a la que se excitar con la longitud de onda máxima de
En la práctica, los fluoroforos nunca
obtiene la máxima emisión, también indica las excitación para ese fluoróforo.
alejan tan exageradamente el
longitudes de onda que permiten excitar al espectro de excitación y emisión,
fluoróforo con su respectiva excitación. por lo que existen solapamientos
espectrales.
FLUOROCROMOS Y FLUORÓFOROS
Diferencia entre fluorocromo y fluoróforo, fluorescencias primarias y secundarias.

Algunos ejemplos de fluorocromos utilizados en biología celular para el

estudio de estructuras celulares.

EGFP es una variante genéticamente modificada de la proteína

fluorescente verde, publicada en 1996. Presenta mejor resistencia al
fotoblanqueado y un espectro de excitación y emisión más acotado.

EYFP es una variante de la porción fluorofora de la EGFP, que presenta

igual características que la anterior, sin embargo emite en color
amarillo.

Así como esas proteínas se han desarrollado proteínas azules, celestes,

rojas, mediante la modificación de algunos residuos aminoacídicos de la
secuencia original de GFP.
 EL PROBLEMA DE LA FLUORESCENCIA: LA DISMINUCIÓN.
Los ciclos de excitación y emisión no son infinitos por lo que con cada estimulación se pierde intensidad de fluorescencia.

Los fluorocromos pueden tener múltiples ciclos de

excitación/emisión, sin embargo, con el tiempo de
exposición y a una velocidad propia de cada molécula, Quenching
(enfriamiento o decoloración)
comienzan a perder intensidad de fluorescencia emitida
Ocurre por condiciones del medio en que se realiza la
Intensidad de fluorescencia

debido a la pérdida total o parcial de electrones o excitación (temperatura, oxidantes, interacción con
destrucción de las moléculas en el proceso. otras moléculas o con excesos de fluorocromos)

Photobleaching
En este ejemplo, el fluoróforo A posee una (fotoblanqueado)
velocidad de decaimiento de la
fluorescencia mayor que el fluoróforo B. Proceso de descomposición natural del fluorocromo
producto de los ciclos de excitación/emisión. Ocurre
por sobreexposición a la luz o tiempos de excitación
muy largos.

Tiempo de exposición a la luz

0 seg 20 seg 40 seg 60 seg
(Cantidad de ciclos excitación/emisión)
 UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

ADN
Sonda fluorescente Anticuerpos fluorescentes
DAPi para ADN. Mediante técnicas de laboratorio se
Análogos proteicos pueden crear anticuerpos monoclonales
A determinadas proteínas se les puede que se pueden acoplar a diferentes
acoplar secuencias fluorescentes de fluoróforos para hacer reconocimiento de
proteínas fluorescentes primarias para proteínas.
poder trazar su localización o determinar
su presencia o tasa de degradación.

Análogos de fosfolípidos
Algunas empresas fabrican fosfolípidos
acoplados a secuencias fluorescentes que
pueden o no ser incorporados en las
membranas plasmáticas permitiendo estudiar
el transporte, degradación y mecanismos de
transducción de señales con lípidos. P2X7R
Inmunofluorescencia indirecta
para el receptor P2X7
Mitocondrias
Sonda fluorescente
Hibridación de ADN y/o ARN (Alexa 488)
DAPi para detectar
Al acoplar una sonda o primer específico mitocondrias.
a fluoróforos se puede determinar la (Mitotracker Red)
presencia o no de un determinado gen o
ARN. También existen sondas que marcan
la presencia de ácidos nucleicos.
 UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES Hoechst 33342
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología Sonda de contraste nuclear,
marca ADN de color azul.

Indicadores de iones
Algunas moléculas cambian o muestran
Indicadores del EmV
fluorescencia al interaccionar con iones Existen algunos fluoróforos que pueden
como el calcio, potasio, sodio, ingresar a las membranas biológicas y
bicarbonato, entre otros, permitiendo hacer registros del potencial de
conocer in vivo cambios en los niveles de membrana presente en la célula.
estos iones en las células bajo
determinadas condiciones.
Lysosensor® Green DND-189
Sonda fluorescente que marca
organelos ácidos al interior de la
Indicadores de pH célula siendo mayor su
Al igual que lo que ocurre con los iones, fluorescencia al pH 5,2.
ciertas sondas cambian su fluorescencia
en presencia de determinados pH, lo que
las hace excelentes herramientas para el
estudio de organelos y citoplasma.

Indicadores de proximidad
Existen algunos kits o juegos de
fluoróforos que permiten indicar si dos MitoFluor™ Far Red 680
moléculas se encuentran a determinada Es capaz de marcar de color rojo
distancia una de la otra. lejano mitocondrias con su
potencial de membrana
mitocondrial intacto.
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología
Hoechst 33342
Sonda de contraste nuclear,
marca ADN de color azul.

Ensayo TUNEL
Sustratos enzimáticos fluorescentes
Para conocer la función y tasa de degradación de (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling)
una enzima a tiempo real se pueden utilizar Sonda fluorescente que se une a
sustratos enzimáticos fluorescentes que pueden los extremos terminales del ADN.
ser detectados con equipos específicos. En células apoptóticas, como el
ADN se fragmenta, se marcan
positivamente las células

Biosensores de actividad
Existen diseños moleculares y bioquímicos
que permiten construir enzimas que al
activarse o desactivarse emiten
fluorescencia si se unen a su cofactor o
coenzima.

Indicadores de apoptosis o necrosis

Existen sondas que son capaces de unirse a
células en proceso de muerte celular
discriminando entre células necróticas o
apoptóticas.
EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: FLUORÍMETRO
Permite detectar fluorescencia en suspensión.

Incluso con una micropipeta se pueden adicionar

moléculas y estimar el cambio a tiempo real.
Muestra precargada con un
indicador fluorescente.

Emiten luz UV y visible

Lámparas de Al ser estimulado el fluorocromo con la luz
mercurio o LEDs óptima para su absorción, este emite luz
fluorescente en su espectro de emIsión.

La luz fluorescente es
90º
detectada y su intensidad
de fluorescencia es
graficada en forma
El fluorímetro es un equipo de Filtro seleccionador Filtro seleccionador continua
laboratorio que permite detectar de la longitud de de la longitud de
fluorescencia a tiempo real en onda de absorción onda de emisión
cubetas en suspensión.

Estimulación continua: photobleaching Estimulación púlsatil (Shutter)

¿Problemas? Precipitación y no homogeneización del fluorocromo Agitación continua
 EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: FLUORÍMETRO
Permite detectar fluorescencia en suspensión.

Los registros de fluorometría Las señales fluorescentes de

son entregados en tablas registros a tiempo real
contienen siempre una señal
donde se registra la
de error o ruido que genera
intensidad de fluorescencia una dispersión de los datos en
por unidad de tiempo, que el tiempo. Esto puede ocurrir
puede o no ser normalizada por diferencias en las
con la fluorescencia inicial o densidades o homogeneización
un valor de fluorescencia de la muestra, interposición
conocido. de partículas microscópicas,
etc.
Esto permite con ayuda de
programas para la
elaboración de gráficos,
mostrar la continuidad en el
tiempo del cambio de la
fluorescencia en una
muestra.
Debido a que la viabilidad es un parámetro crucial para determina la importancia de un
estudio toxicológico, es que estos autores hicieron un método rápido para evaluar con
espectrofluorimetría la viabilidad de tres especies de invertebrados marinos utilizando las
SYBR-14 es una tinción nuclear que sólo Yoduro de propidio es una tinción
pruebas SYBR-14 y Yoduro de propidio.
marca espermatozoides vivos intercalante del DNA que sólo es capaz de
atravesar membranas destruidas.
Ciona intestinalis

Paracentrotus lividus

Mytilus galloprovincialis
 EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: MICROSCOPIO DE EPIFLUORESCENCIA
Permite detectar fluorescencia en células vivas y fijadas, con una resolución de microscopio óptico.

Filtro seleccionador de la El microscopio de epifluorescencia contiene

Filtro para
longitud de onda de una fuente de luz que generalmente es una
absorción
la emisión lampara de mercurio o xenón, que tienen un
brillo en longitudes de onda útiles para
estudios con fluorocromos. Esta luz es
filtrada inicialmente dejando sólo la luz del
Espejo espectro óptimo de absorción del fluoróforo
dicroico o la que se requiera para el estudio, que es
dirigida por un espejo dicroico hacia la
muestra a través del objetivo de
Objetivo para Emiten luz UV y visible fluorescencia. Esta luz excita los fluoróforos
Lámparas de
fluorescencia
mercurio/xenón o
emitiendo una luz en una longitud de onda
LEDs distinta que es recibida por el objetivo y
Por lejos, la configuración de luego hacia el ojo o cámara pasando por un
microscopía de epifluorescencia filtro para la emisión.
es la más común de todas.
Muestra
También existen microscopios
invertidos de fluorescencia.
El objetivo de este trabajo fue determinar si la fuente de proteínas del
medio influencia en el desarrollo de el embrión del cebú, su velocidad de
desarrollo, bloqueo del desarrollo y muerte celular programada. Para esto
probaron con dos suplementos para el suero: suero fetal bovino y albúmina
sérica bovina. Se clasificaron los embriones como rápidos o lentos
basados en el tiempo que tardan en llegar a 4 células.
EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: MICROSCOPIO DE EPIFLUORESCENCIA
Permite detectar fluorescencia en células vivas y fijadas, con una resolución de microscopio óptico.

¿PROBLEMA? Estimulación continua: photobleaching Estimulación púlsatil (Shutter)

Contaminación en el plano focal

Debido a que las muestras

utilizadas en epifluorescencia
contienen múltiples planos focales,
sin embargo, la luz de absorción y
la de emisión no discriminan entre
los planos de enfoque, es que la
muestra se contamina con luz
emitida de estructuras cercanas
pero que no pertenecen al plano
focal.

Filtrar la luz en cada

plano focal (microscopía
confocal)
 EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: MICROSCOPIO CONFOCAL
Permite detectar fluorescencia en células vivas y fijadas, con una mejor resolución que un microscopio tradicional.

Detector de fluorescencia

“Pinholes”
La microscopía de fluorescencia confocal
o también conocida como microscopía de
escaneo láser confocal es una técnica
que utiliza un “pinhole” o diafragma
para eliminar toda aquella luz
proveniente planos fuera de foco. Utiliza
Espejo dicroico un láser de argón/kriptón ya que su
intensidad de luz es más poderosa que
Láser que emite
las lámparas convencionales (hay que
una determinada recordar que se está limitando la luz de
longitud de onda absorción y de emisión), y obtiene las
Lente del objetivo imágenes en barrido, ya que la capacidad
Los microscopios confocales son equipos de estimulación y emisión es muy
muy grandes que requieren de softwares Punto de enfoque limitada en espacios.
para la formación de la imagen y debido a Muestra
la gran intensidad de calor que generan
deben utilizarse en cámaras frías. Estimulación continua: photobleaching
¿PROBLEMA? Tiempo de barrido imposibilita los estudios a tiempo real
Simvastatina es un fármaco que protege contra la fibrosis en el
corazón, pero cuyo mecanismo de acción no era del todo conocido. Se
sabe que existe una fuerte relación entre la comunicación mediada por
exosomas y la fibrosis cardiaca, por lo que los autores quisieron
evaluar si simvastatina regula este tipo de comunicación. Para esto,
indujeron fibrosis perivascular con angiotensina II en ratas y evaluaron
que sucedia en presencia o ausencia de simvastatina. Estudiaron
transdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos usando
microscopía confocal a través de la expresión de colágeno y los
exosomas.
mRNA Colágeno tipo I

mRNA Lisil oxidasa tipo 2 (estabilizadora de colágeno)

EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: MICROSCOPIO CONFOCAL SPINNING-DISK
Permite detectar fluorescencia en células vivas y fijadas, con una mejor resolución que un microscopio tradicional.

En la microscopía de
fluorescencia confocal
spinning-disk o de disco
giratorio, se agrega un
disco que contiene pinholes
separados entre sí por una
distancia fija. Este disco
gira y su velocidad puede
ser controlado a través del
sistema computacional.
Cada vez que la luz pasa
por el pinhole, se ilumina la
muestra y se recibe su
fluorescencia en el
detector, evitando de esta La información entonces es recibida en múltiples imágenes lo que
manera que la muestra permite generar barridos más rápidos para muestras vivas y eventos
sufra photobleaching tiempo/dependientes. (microscopía de live imaging)
EQUIPOS DE REGISTRO DE FLUORESCENCIA: MICROSCOPIA DE MULTIFOTONES
Permite corregir problemas de resolución del microscopio confocal a través de la utilización de láseres infrarojos

Pulsos de láser
En la microscopia de
multifotones el láser utilizado
es un láser infrarojo de gran Cubreobjeto
longitud de onda pero de baja
energía que se dispara en
pulsos cada 10 nanosegundos
de una duración de menos de
un picosegundo.
Portaobjeto

Al utilizar una baja energía

para estimular al fluorocromo
se requiere más de un fotón
para alcanzar el estado
excitado en el fluoróforo. Sólo donde la intensidad del láser es mayor se genera la doble
excitación y con ello se obtiene un punto focal con menos ruido.
Una de las ventajas de esta microscopía es que permite utilizar y
reconstruir en 3 dimensiones muestras muy profundas (900μM)
Las estrategias terapéuticas que tienen como blanco
macrófagos asociados a tumores (TAMs) de
glioblastoma (GBM) han mostrado muy poca eficacia.
Poco se sabe también de las características de la
conducta de estas células en esta neoplasia. En este
estudio ellos realizaron microscopía de dos fotones en
cerebros de ratones con una ventana en su cráneo in
vivo, descubriendo que existen 2 poblaciones de
macrófagos en el cerebro: microglía residente y
macrofagos derivados de la médula ósea, además
vieron que utilizando anticuerpos anti factor de
crecimiento endotelial vascular de tipo A se reduce la
infiltración de este último grupo.
At the time of imaging, TRITC-dextran (2.5 mg/mL)
was injected i.v. to outline the blood vessels
EQ. DE REG. DE FLUO.: MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA DE REFLEXIÓN INTERNA TOTAL
Se basa en principios de evanescencia en relación a ángulos de incidencia que generan una imagen muy nítida pero muy pequeña.

FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO TIRF

Rango del halo El halo evanescente que se genera por la completa reflexión
evanescente de los haces de excitación en la interfaz líquido/cristal es
capaz de excitar selectivamente a una pequeña fracción de
Muestra los fluoróforos contenidos en la muestra. Desde el punto de
origen del halo evanescente hacia la periferia existe un
decaimiento progresivo y exponencial de la luz que permite
sólo estimular 100nm de profundidad.
Aceite de
inmersión cristal
emisión
Excitación

Por esta razón el TIRFM permite una visualización selectiva de las regiones de la
superficie como la membrana plasmática basal (que tiene cerca de 7,5 nm de
espesor) de células y el citoplasma que se encuentra inmediatamente al costado
de esta membrana plasmática.
Objetivo
 Los mecanismos moleculares y de biología celular que permiten
el ensamblaje de los alfa herpes virus y su liberación no están
del todo claros, es por eso que utilizando TIRF, estos autores
lograron describir 3 clases de exocitosis viral en células: trafico
de las proteínas a la membrana, exocitosis de partículas livianas
virales y exocitosis de viriones. Además describieron el rol de las
proteínas Rab en esta exocitosis de alfaherpes virus.

En este estudio los autores crearon un virión transgénico que contiene una
proteína de la cápside acoplada a una proteína fluorescente roja y una
proteína biosensora de pH verde, que en pH ácido apaga su fluorescencia,
acoplada con una glicoproteína de la envoltura viral

Red capsid

gM-pHluorin
 UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: CALCIO
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

Todas las moléculas indicadoras tienen Indicadores de iones

Algunas moléculas cambian o muestran
constantes de disociación diferentes Las pruebas de detección de calcio mediante fluorescencia
fluorescencia al interaccionar con iones
(Kd) o rangos sensibilidad a calcio, por se basan en el acoplamiento de fluoróforos a la estructura como el calcio, potasio, sodio,
lo que, se deben escoger y calibrar en de un quelante de calcio conocido como BAPTA. bicarbonato, entre otros, permitiendo
función de cada tipo celular. conocer in vivo cambios en los niveles de
estos iones en las células bajo
determinadas condiciones.

Algunos indicadores de iones contienen

una porción acetometilada o esteres
AM, que le confieren permeabilidad a la
membrana plasmática. Al ingresar a la
Ión calcio (Ca2+)
célula, esterasas endógenas cortan la El calcio es un mensajero intracelular muy
porción AM dejando al indicador importante en la regulación de múltiples
atrapado en el citoplasma. procesos biológicos de la célula. Está
involucrado en procesos como la secreción o
exocitosis, contracción de fibras del
En algunos casos se puede adicionar citoesqueleto, tráfico de vesículas, metabolismo
ácido plurónico para incrementar la celular, control de canales iónicos, muerte
permeabilidad del ester AM. celular, etc. Por lo que los métodos de
detección de este ión son sumamente
La forma de incorporación tradicional importantes para la biología celular.
es a través de microinyección si el
fluorocromo no es permeable
INDICADORES DE CALCIO CELULAR MEDIANTE FLUORESCENCIA
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología
INDICADORES DE CALCIO CELULAR: FLUO-3
El más utilizado de todos.

FLUO-3 es un indicador que no

utiliza razón a diferencia de FURA o
INDO-1, que básicamente se
encuentra apagado en ausencia de
calcio. En presencia de calcio
aumenta 50 veces su fluorescencia.

Es uno de los más utilizados porque se puede El nivel de emisión de fluorescencia

excitar con luz de 488 (verde), una de las más con FLUO-3 disminuye a media que
comunes en microscopía de fluorescencia se reduce la concentración de
calcio libre en el citoplasma.
CM: Cardiomiocitos VSMC: células del músculo liso vascular EEC: células endoteliales endocárdicas
VEC: Células vasculares endoteliales
INDICADORES DE CALCIO CELULAR: FURA-2
Un indicador utilizado por su facilidad para ser empleado como indicador cuantitativo.

FURA-2 es otro de los indicadores de calcio celular

más usado en su forma AM. Este indicador, a
diferencia del Fluo-3, es un indicador de razón.

Cuando Fura-2 se une a calcio, el fluorocromo experimenta

un cambio en el máx punto de excitación desde 363nm
Tradicionalmente este indicador es
(calcio libre) a 335nm (saturado en calcio), mientras que la
excitado a los 340nm y a los 380nm,
emisión se mantiene relativamente estable.
mientras se registra siempre a los 510nm.
Esto permite realizar una razón entre la
fluorescencia sin calcio (f0 o 340nm) y la
fluorescencia con calcio (f1 o 380nm).
Este ensayo tiene la ventaja de evitar la
señal de error por distribución de la
tinción y corregir el photobleaching.
 UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: CLORO
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

Las pruebas fluorescentes para aniones como el cloro, tienen mejor eficacia si el anión involucrado es
de alto peso molecular, como el bromo y el yodo, por lo que la eficiencia en detección de cloro es algo Indicadores de iones
limitada. Algunas moléculas cambian o muestran
fluorescencia al interaccionar con iones
como el calcio, potasio, sodio, bicarbonato,
entre otros, permitiendo conocer in vivo
cambios en los niveles de estos iones en las
células bajo determinadas condiciones.

Ión cloro (Cl-)

Los ensayos de fluorescencia para el
cloro, se basan en el principio del
quenching descrito por Stokes, en
1869. Una molécula de quinina cuando Es considerado el anión más importante en el espacio
extracelular. El cloro es un anión presente en muchas células y
es incubada en presencia de ácido
tejidos que puede ser transportado por varias proteínas al interior
clorhídrico (iones cloro), reduce su La estructura de la quinina es un anillo de las células. Entre las más importantes están los receptores
fluorescencia de una manera quinolina (que le confiere la sensibilidad ionotrópicos de GABA (GABAA) y Glycina en el sistema nervioso
concentración dependiente. al cloro), y un grupo radical (que le central, el CFTR en el epitelio respiratorio, los transportadores
confiere la especificidad a un NKCC2, NCC, KCC del epitelio renal. Participa en la mantención
determinado anión). En el extremo del ambiente ácido gástrico mediante la secreción de ácido
opuesto contiene un grupo donante de clorhídrico, la colaboración en el transporte de dióxido de carbono
electrones metil o metoxy. en los hematíes y la formación del líquido cefalorraquídeo
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: CLORO
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

Grupo donante Radical Nombre del compuesto

-CH3 -(CH2)3SO3- 6-metil-N-(3-sulfopropil) quinolinium
-OCH3 -(CH2)3SO3- 6-metoxi-N-(3-sulfopropil) quinolinium (SPQ)
-OCH3 -(CH2)3SO3- 6-metoxi-N-(3-sulfobutil) quinolinium
-OCH3 -(CH2)7COOH Bromuro de 6-metoxi-N-(8-ácido octanoico) quinolinium
-OCH3 -(CH2)10COOH Bromuro de 6-metoxi-N-(11-ácido undecanoico) quinolinium
-OCH3 -(CH2)2COO- Bromuro de N-(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinium (MQAE)

El MQAE contiene un radical que le

El SPQ es una molécula que se
excita a los 344 y emite a los MQAE confiere una muy alta sensibilidad por el
cloro, así como una mayor resistencia al
443. Es altamente específico
photoblanqueo (excitación a los 350nm y
para el cloro, y funciona en
emisión a los 460nm). El único problema
base a quenching. Sólo puede
SPQ ser incorporado a las células
es que su grupo radical se degrada
lentamente en el interior de la célula.
por shock hipotónico.
 UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: SODIO
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

El SBFI o Isoftalato de unión a sodio, es un fluoróforo formado por anillos

benzofuranilos acoplados a un quelante de sodio en forma de corona. Cuando
se une a sodio, cambia su espectro de excitación de 340nm a 380nm, y su Indicadores de iones
Algunas moléculas cambian o muestran
emisión puede ser registrada entre los 410nm a los 590nm. Esto transforma fluorescencia al interaccionar con iones
al SBFI en un fluoróforo de razón para la cuantificación del sodio. como el calcio, potasio, sodio, bicarbonato,
entre otros, permitiendo conocer in vivo
cambios en los niveles de estos iones en las
células bajo determinadas condiciones.
Es esta cavidad en la corona, la que confiere la
selectividad de la prueba al ión sodio frente a
otros cationes monovalentes como el potasio. Ión sodio (Na+)
El catión más importante en el medio extracelular es
el sodio. El sodio está implicado en la mantención del
Utiliza razón: potencial de membrana de las células, en la
(
380𝑛𝑚
)
Aunque el SBFI es una prueba ampliamente utilizada para estudiar
generación del potencial de acción, en el transporte
340𝑛𝑚 dinámica de sodio en una célula, su fluorescencia es levemente de glucosa en los tejidos del tracto gastrointestinal,
sensible a pequeños cambios de pH, pero muy afectada cuando en la reabsorción de agua en el túbulo contorneado

SBFI existen grandes gradientes iónicas y viscosidad aumentada en los

medios. Por otra parte, a pesar de ser selectivo al sodio, el K+ puede
interferir en su fluorescencia por afinidad natural con la corona.
distal y colector; y glucosa en el túbulo contorneado
proximal. Transportadores de Na+ existe una larga
lista, por nombrar algunos está en eNAc, los
receptores ionotrópicos de Ach, Glutamato, 5-HT,
etc, SGLT. Intercambiadores de sodio.
Las espinas dendríticas son las unidades más pequeñas de la integración
de señales en las neuronas, y su estudio estuvo poco desarrollado hasta
la generación de la microscopia de dos fotones que entregaba una muy
buena resolución y mínimo fotoblanqueo. En este estudio buscaron
estudiar transientes de sodio en espinas dendríticas de neuronas
utilizando el indicador SBFI.

10μm
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: SODIO
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

El Indicador Sodium Green es una molécula

que comprende dos fluorocromos de 2’,7’-
CoroNa Red
diclorofluorosceínas unidas a una corona
que le confiere sensibilidad al sodio al igual
que el SBFI. Este fluoróforo se excita a los
488 nm y cuando se une a sodio, incrementa
su intensidad de fluorescencia sin cambiar
su longitud de onda de emisión.

Es mucho más específico para el sodio

que el potasio (comparado con el El coroNa Red es una estructura que indica sodio
SBFI) y su excitación provoca menor con similitud estructural al quelante de calcio
daño sobre la célula. En algunos BAPTA. Este colorante tiene una carga positiva y
casos, las interacciones proteína- es de naturaleza lifofílica, lo hace acumularse al
tinción pueden eliminar o disminuir
interior de la mitocondria. Cuando se une a sodio,
Sodium completamente la respuesta del
aumenta su fluorescencia 15 veces, sin embargo
Sodium green al sodio intracelular.
green requiere aumentos de Na+ significativos en el
citoplasma para fluorescer debido a su baja
afinidad al sodio.
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: POTASIO
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

El PBFI o Isoftalato de unión a potasio, es un fluoróforo formado por anillos

benzofuranilos acoplados a un quelante de sodio en forma de corona, de
similitud estructural al SBFI. Presenta los mismos parámetros que la forma Indicadores de iones
Algunas moléculas cambian o muestran
sensible a Na+ en cuanto a la excitación y la emisión. fluorescencia al interaccionar con iones
como el calcio, potasio, sodio, bicarbonato,
entre otros, permitiendo conocer in vivo
cambios en los niveles de estos iones en las
La afinidad por el K+ sin embargo, es dependiente de la células bajo determinadas condiciones.
concentración de sodio en el medio, siendo más alta en
presencia de ion Na+. La selectividad del PBFI para el ión
potasio es sólo 1,5 veces mayor que para el sodio, pero las Ión Potasio (K+)
concentraciones de potasio, tienden a ser 10 veces mayores El catión más importante en el medio
en el espacio intracelular que el espacio extracelular. intracelular es el potasio, responsable de la
mantención del potencial de membrana en
reposo de las células, en el transporte de
moléculas en la nefrona, en la contracción
muscular, interviene en la estabilización de los
telómeros del ADN entre otras funciones.

PBFI Canales de potasio existen muchos (Kir, KATP,

Kv, canales de fuga KLEAK, TASK-1/3, KCNQ,
etc.)
En hepatocitos, el ATP extracelular induce in incremento en el Ca2+ que
lleva a disfunción mitocondrial y muerte celular. Estos efectos se ven
disminuídos si la célula presenta bajo K+ intracelular. En este estudio, los
autores quisieron utilizar una prueba sensible para el K+ (PBFI) para
determinar las concentraciones mitocondriales de K+, y asociarlas a la
disminución de la viabilidad celular. Además, estudiaron integridad
mitocondrial por Rhodamina 123 en células permeabilizadas.
 UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: TINCIÓN DE ESTRUCTURAS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL ΔΨm

Mitocondrias teñidas con

VectaCell® Rhodamine 123

La rhodamina 123 es una

tinción que es capaz de
registrar el potencial de
membrana mitocondrial ΔΨm,
que se excita a los 505nm y MITOCONDRIAS
emite a los 535nm. Presenta Las mitocondrias son organelos de doble
muy baja citotoxicidad. membrana (MMI y MME), que presentan un
potencial mitocondrial y participan en la
generación de ATP a través de la fosforilación
oxidativa, síntesis de hormonas esteroidales,
Otras pruebas fluorescentes que permiten el estudio del ΔΨm son la apoptosis, mantención del equilibrio REDOX,
tetrametilrhodamina metilada (TMRM) y el yoduro de JC-1. Siendo el regulación del calcio celular, entre otras.
TMRM una prueba que es compatible con la respiración mitocondrial Además presentan mecánicas de fusión y fisión
Mitocondrias teñidas con Rhod123 de células (usada en células in vivo ). DiOC6 (yoduro de 3,3′-dihexiloxacarbocianina) conocidas como dinámica mitocondrial.
endoteliales en cultivo (escala de pseudocolor). es otra prueba que permite estudiar el ΔΨm pero no discrimina entre
retículo, vesículas y mitocondrias.
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: TINCIÓN DE ESTRUCTURAS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

TRAZADORES MITOCONDRIALES

Mitotracker, MitoBlue, MitoGreen, MitoRed, MitoLite,

NAO (Nonil naranja de acridina), DASPEI ( yoduro de
2-(4-(dimetilamino)estiril)-N-etilpiridio), DASPMI
(yoduro de 4-(4-(Dimetilamino)-estiril)-N-
metilpiridinio), NPA-TPP, Splendor y MitoBADY.

Existe una larga lista de trazadores mitocondriales

que permiten el estudio en células vivas o en células
fijadas. Estos trazadores no son sensibles al cambio MITOCONDRIAS
en el potencial de la membrana mitocondrial, por lo
que se utilizan para el estudio de la dinámica Las mitocondrias son organelos de doble
membrana (MMI y MME), que presentan un
mitocondrial, y se basan en una afinidad por la matriz
potencial mitocondrial y participan en la
mitocondrial (debido a la presencia de oxido generación de ATP a través de la fosforilación
reducción) oxidativa, síntesis de hormonas esteroidales,
apoptosis, mantención del equilibrio REDOX,
Imagen: las mitocondrias fueron teñidas con regulación del calcio celular, entre otras.
MitoTracker Orange CMTMRos. Actina teñida con Además presentan mecánicas de fusión y fisión
falacidina conjugada con un fluorocromo y el núcleo conocidas como dinámica mitocondrial.
teñido con una prueba fluorescente DRAQ5.
Debido a que las mitocondrias son organelos dinámicos que pueden dividirse y fusionarse, siendo este último proceso parte importante de la mantención de la capacidad
respiratoria y transmisión de ADN mitocondrial en mamíferos, poco se sabe en algas y plantas, por lo que este estudio buscó caracterizar este fenómeno en un alga unicelular
verde llamada Clamydomonas reinhardtii, utilizando marcadores fluorescentes de mitocondrias y microscopia de fluorescencia.

En este ensayo, utilizaron los principios de la

fusión de gametos de las Chlamydomonas
que se pueden obtener en un medio privado
de nitrógeno. Una célula mt- (paternal) y mt+
(maternal) fueron inducidas a fenotipo
gamético, y las mitocondrias fueron teñidas
con Mitotracker Green y Mitotracker Orange.
Y las células fueron caracterizadas de
acuerdo con la formación de mitocondrias
fragmentadas y mitocondrias en red.
 mt+

mt-

mt-x mt+
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: TINCIÓN DE ESTRUCTURAS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

TRAZADORES DEL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

ER-Tracker™ Blue-White DPX (de color azul), ER-Tracker
Green, ER-Tracker Red, son pruebas fluorescentes que
contienen una estructura sulfonilurea que presentan
excitación/emisión máxima a los ~504/511 nm y 587/615
nm respectivamente. Todas estas pruebas tienen problemas
al momento de fijar las células, ya que se pierde
considerablemente su fluorescencia. Es por eso que estos
trazadores se utilizan en estudios in vivo . Todos los
trazadores mencionados se basan en la afinidad de una
molécula Glibenclamida (contenida en su estructura) a los RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
canales receptors de ATP-sensibles a K+. Sin embargo,
dependiendo del tejido estudiado es si tendrán o no buena El retículo endoplasmático es el sitio de
especificidad. transporte primario y procesamiento de
proteínas sintetizadas de forma
cotraduccional, es además sitio de
síntesis de lípidos de la célula y un gran
Células endoteliales de arterias pulmonares almacén de calcio intracelular.
bovinas teñidas con ER-Tracker™ Blue-White
DPX. El retículo endoplasmático se encuentra
teñido.
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La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

TRAZADORES DE LISOSOMAS Y PEROXISOMAS

Los ensayos de Lysosensor permiten estudiar

organelos ácidos como resultado de procesos de
protonación. En este tipo de pruebas, el fluoróforo se
encuentra en estado de “quenching” producto de la Células humanas mesangiales teñidas con Mitotracker Green FM
asociación con una base débil que es eliminada en y RedoxSensor Red CC-1, expuestas a medios hiperglicémicos.
presencia de pH ácido, de esta forma entonces
incrementa la intensidad de su fluorescencia.
Lysosensor ™ Green y Blue son más eficientes en pH RedoxSensor Red CC-1 Stain
de 5,2 a 7,5, mientras que Blue DND-167 y Green A diferencia del Lysosensor, RedoxSensor permite
DND-189 funcionan major entre pH 3 y pH 5. La estudiar organelos con potencial redox en su
única prueba que es radiométrica es la de interior. Cuando ingresa a la célula (es lipofílico) es
Lysosensor Yellow/Blue DND-160. reducido por enzimas celulares (mitocondriales),
pero es oxidado en lisosomas y peroxisomas, por lo
Lisosomas de células de riñon canino teñidas con Lysosensor que el diferencial entre ambos compartimientos es
Yellow/Blue DND-160. Las imágenes fueron pseudocoloreadas lo que permite estudiar esta tinción. Es por esta
de color azul cuando el pH era cercano a 4 y de color
amarillo-verdoso si era cercano a 7). razón que se utiliza con trazadores mitocondriales.
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: TINCIÓN DE ESTRUCTURAS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

TRAZADORES NUCLEARES
Tinción en macrófagos invivo marcados
El DAPI (4’,6-Diamidino-2- con un colorante fluorescente Alexa
fenilindol diclorhidrato) es un Fluor® 555 acoplado a la toxina del cólera
(reconoce proteína G). Los núcleos están
colorante fluorescente que teñidos con Hoescht 33342
pertenece al grupo de los
colorantes de indol. DAPI se usa
para la tinción de ADN, para tinción
nuclear, para la tinción de células
vivas y para la contratinción en
tinciones inmunofluorescentes de
material humano y botánico, y en
citometría de flujo. El DAPI se
acopla al surco menor de la hebra
doble del ADN en fuerte asociación
con los clusters de Adenina/Timina.
Cuando el DAPI se une, aumenta 20
Cromosomas en placa metafásica veces su fluorescencia.
de células en cultivo. El núcleo ha
sido teñido con DAPI.
Otra tinción con el mismo principio
que el DAPI es el Hoescht 33342
UTILIZACIÓN DE LA FLUORESCENCIA PARA ESTUDIOS CELULARES: TINCIÓN DE ESTRUCTURAS CELULARES
La fluorescencia acoplada a técnicas de biología celular es una excelente herramienta para el estudio en biotecnología

TRAZADORES NUCLEARES

El yoduro de propidio es una molécula

muy utilizada para el estudio de
viabilidad celular, debido a su gran
tamaño (teóricamente impermeable a la
membrana plasmática de las células
vivas). Este compuesto químico
fluorescente, cuando ingresa a las
células, se intercala con el ADN en los
surcos mayores incrementando su
fluorescencia entre 20 a 30 veces,
teniendo menor afinidad por el ARN. Se
excita a 488nm sin embargo su emisión
es a los 617nm (cambio de Stokes).
Imagen muestra núcleos de
células en cultivo permeabilizadas
y teñidas con IP.
Otra tinción con el mismo principio
que el IP es el Bromuro de Etidio
ampliamente utilizado como
marcador en geles de agarosa (PCR)
 INMUNOFLUORESCENCIA
Detección de estructuras celulares por medio de inmunoglobulinas acopladas a fluorocromos.

La inmunofluorescencia es una técnica

que nos entrega la localización
subcelular de componentes estructurales
de las células con mejor resolución que
estudios histoquímicos, y que permite en
algunos casos una progresión temporal.
Además, algunos ensayos permiten
Célula Célula
estudiar interacciones entre estas Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta
moléculas al interior de la célula. En este En la inmunofluorescencia directa el En la inmunofluorescencia directa el anticuerpo
proceso se utilizan anticuerpos anticuerpo primario se encuentra acoplado primario se une al epitope y luego se agrega un
conjugados con un fluoróforo. directamente al fluoróforo. Las ventajas de segundo anticuerpo, que reconoce la cadena Ig
Es diferente a la transfección de genes este estudio fundamentalmente son el tiempo del primero, que contiene el fluoróforo. Esta
y la complejidad, al requerir menos pasos, es técnica es menos costosa y más sensible (ya que
acoplados a proteínas fluorescentes (la
más sencilla y rápida de realizar esta técnica. los anticuerpos secundarios al ser policlonales
relación radiométrica entre la proteína- permiten reconocer múltiples epitopes de la IgG o
Sin embargo tiene menor sensibilidad al tener
GFP y es 1:1 mientras que en la IgM), pero es más lenta y compleja, lo que puede
una relación radiométrica menor que su
inmunofluorescencia es mayor), por lo contraparte, y es muchísimo más costosa. inducir a mayor error y variación entre estudios.
que es una prueba más sensible.
PROTOCOLO DE INMUNOFLUORESCENCIA
Detección de estructuras celulares por medio de inmunoglobulinas acopladas a fluorocromos.

1
A pesar de ser un paso clave en el estudio de tejidos por inmunofluorescencia e histoquímica, esta prueba en el caso de la IF puede ser realizada sin fijar en
FIJACIÓN DE LA MUESTRA

células in vivo si los antígenos se encuentran en la membrana plasmática.

Tiene como objetivo
preservar de la forma más
fiel la célula o tejido a
estudiar. Tradicionalmente se Glutaraldehído Paraformaldehído Metanol
utilizan 3 tipos de fijadores Mejor mantención de la Fijación rápida, produce una Fijación más rápida, afecta los
antígenos, permeabiliza células,
para la IF: Glutaraldehído, estructura, mayor fluorescencia menor autofluorescencia que el
inespecífica y autofluorescencia. Glutaraldehído. casi sin autofluorescencia.
Paraformaldehído o Metanol.

2
PERMEABILIZACIÓN

Cuando se busca estudiar un

antígeno al interior de una célula, se
debe realizar una permeabilización
celular previa. Si no se utilizó
metanol, esto se realiza
tradicionalmente con detergentes
débiles no iónicos.
Los más comunes son el NP40, el tritón X-100 y el Tween 20.
PROTOCOLO DE INMUNOFLUORESCENCIA
Detección de estructuras celulares por medio de inmunoglobulinas acopladas a fluorocromos.

3
Este paso tiene como objetivo Los bloqueadores más utilizados en
eliminar toda aquella interacción que IF son la albúmina de suero bovino
pueda ocurrir entre el anticuerpo y la (BSA), la gelatina de pescado y la
BLOQUEO

muestra que no responda a la unión carragenina (un compuesto derivado

específica de antígeno/anticuerpo. de las algas). Lo importante es que
Principalmente se da por asociación se utilicen tanto para el bloqueo de
entre radicales de aminoácidos y los sitios inespecíficos como para
estructuras iónicas presentes en diluir los anticuerpos en el estudio.
proteínas, azúcares o lípidos.

3
DETECCIÓN ANTICUERPOS

Una vez bloqueados se introducen e

incuban los anticuerpos primarios
fluorescentes (si es IF directa) o
primarios y secundarios (si es IF
indirecta), con lavados entre ellos.
La razón de los anticuerpos secundarios
variará según el fluorocromo utilizado,
siendo baja para el FITC o TRITC, y muy
alta para los ALEXA fluor.
PROTOCOLO DE INMUNOFLUORESCENCIA
Detección de estructuras celulares por medio de inmunoglobulinas acopladas a fluorocromos.

En cuanto a los anticuerpos secundarios, existen una variedad de ellos con máximos de emisión diferentes, lo que los hace muy variados, los
clásicos son la fluoroceína isotiocianato o FITC, el TRITC o tetrametilrodamina isotiocianato, la rodamina y la fluoresceína. Estos fluoróforos
presentan menos brillo y mayor tasa de photobleaching que los desarrollados biotecnológicamente Alexa Fluor, DyLight o Cy. Es por esta
razón que suelen agregarse, los primeros, en la dilución 1:200 en las muestras, mientras que los más modernos en diluciónes que van de
1:2000 a 1:5000.
PROTOCOLO DE INMUNOFLUORESCENCIA
Detección de estructuras celulares por medio de inmunoglobulinas acopladas a fluorocromos.

Tejido neuronal marcado con

anticuerpos fluorescentes rojos y
verdes para distintos tipos
neuronales y DAPI ..
 RESONANCIA FLUORESCENTE POR TRANSFERENCIA DE ENERGÍA (FRET)
Detección de estructuras adyacentes gracias a la presencia de 2 fluoróforos que actúan como donadores y aceptores de energía.

Los canales de registro de fluorescencia son la excitación

del CFP y la emisión de YFP. Sin embargo, parte de la
emisión del CFP puede contaminar el canal de emisión del
YFP, por lo que se debe corregir el FRET con una fórmula.

En este ensayo se conjugan dos moléculas con 2 Luego de la excitación de CFP se crean
proteínas fluorescentes. Por ejemplo, proteína diferentes niveles de energía hasta alcanzar el
fluorescente celeste o CFP y proteína fluorescente nivel de energía que permite hacer fluorescer a
amarilla YFP. Que presentan espectros de la proteína fluorescente amarilla. En estos
excitación e emisión diferentes, sin embargo parte subniveles es cuando la proteína fluorescente
de la curva de emisión de la proteína donadora, se amarilla puede aceptar los electrones y resonar
solapa con el espectro de absorción de la proteína generando un estado de activación del
aceptora. fluoróforo emitiendo fluorescencia.

Uno de los grandes problemas del FRET es el rápido decaimiento de la fluorescencia del aceptor por la estimulación del fluoróforo donador
RESONANCIA FLUORESCENTE POR TRANSFERENCIA DE ENERGÍA (FRET)
Detección de estructuras adyacentes gracias a la presencia de 2 fluoróforos que actúan como donadores y aceptores de energía.
 CITOMETRÍA DE FLUJO
El citómetro de flujo es un instrumento utilizado para caracterizar poblaciones celulares cuantitativamente con rapidez.

Parámetros directos (luz visible). Parámetros indirectos (fluorescencia).

¿Qué es citometría de flujo? Detector de luz reflejada a

Detectores de fluorescencia
(roja y naranja/amarilla)
los 90º (dispersión lateral) o
Esta técnica permite estudiar diferentes
side scatter (SSC). Evalúa
características ópticas de las células complejidad de una célula. Detectores de fluorescencia
simultáneamente (dispersión de la luz o (luz verde o azul)
la fluorescencia) una a una en una
dispersión. Es por eso que esta técnica
exige para su correcto funcionamiento,
la disgregación total del tejido o cultivo Detector de luz frontal
celular que se va a utilizar. (dispersión frontal) o
forward scatter (FSC). Espejos dicroicos con
Evalúa volumen celular. filtros de determinadas
longitudes de onda.

En este sistema de fluidos, las células pasan a través

de un mecanismo de alineación que mantiene un
flujo laminar muy delicado que las hace fluir por
Fuente de luz (láser).
gravedad una a una muy rápidamente.
CITOMETRÍA DE FLUJO
El citómetro de flujo es un instrumento utilizado para caracterizar poblaciones celulares cuantitativamente con rapidez.
Luego de amplificar en múltiples
Al ingresar los fotones estos inciden en un
dinodos, la corriente eléctrica
fotocátodo que libera electrones que son
DETECTORES DE LUZ rápidamente conducidos a un sistema de
generada por el flujo de electrones
estimula al ánodo y se convierte
Transforman la luz en una señal cuantificable dinodos.
en una señal digital.
(eléctrica), donde la intensidad eléctrica será
proporcional a la luz recibida. Consta de dos
sistemas:

Fotodiodos de silicio (registran FSC):

son menos eficientes al detectar la luz, pero al
recibir el laser de luz incidente en su totalidad,
es suficiente para el registro eficiente del
volumen celular.

Fotomultiplicadores (registran Fluo y SSC):

Dado que el sistema de complejidad utiliza una Cuando el dinodo es alcanzado por el electrón,
libera proporcionalmente electrones en un
porción de la luz emitida (sólo la reflejada por
proceso de emisión secundaria.
lo espejos), se requiere amplicar la señal de
cada celula con un tubo fotomultiplicador.
Un PMT o tubo fotomultiplicador es un sensor de luz al vacío en el que los
electrones se multiplican mediante emisiones secundarias.
 CITOMETRÍA DE FLUJO
El citómetro de flujo es un instrumento utilizado para caracterizar poblaciones celulares cuantitativamente con rapidez.

Voltaje

Brillo relativo (en un histograma)

Láser

Número de canal
alto del pulso (H)
Área del Threshold
Láser pulso de
voltaje (A)

Tiempo (μs)

Láser Ancho del pulso (W)

Dependiendo de la intensidad del voltaje empleado, se genera una
Este registro a tiempo real, permite transformación digital que permite estimar el brillo real de la muestra
generar un gráfico del cambio en el en cada detector de luz (canales) a nivel digital. En este punto uno
voltaje (pulso de voltaje) registrado por puede generar un umbral (Threshold) para la detección de luz para
el ánodo de los fotomultiplicadores o el eliminar aquellos registros que no corresponden a la muestra
Láser fotodiodo de silicio, de cual se pueden estudiada.
extraer parámetros como el área (A),
alto (H) y ancho (W).
Los detectores de luz registran a
tiempo real el paso de cada célula por
el capilar de flujo laminar.
 CITOMETRÍA DE FLUJO
El citómetro de flujo es un instrumento utilizado para caracterizar poblaciones celulares cuantitativamente con rapidez.

Nombre de la muestra
Nombre de la muestra Nombre de la muestra

Recuento

Recuento
Recuento

FSC- Canal A FSC- Canal A FSC- Canal A

Nombre de la muestra
En la citometría de flujo, es usual representar la información en
forma de histograma (frecuencias), relativo al volumen, complejidad

Recuento

Umbral
o fluorescencia de la muestra. Dependiendo de la intensidad de una
muestra control positivo inicial, se calibran los ejes para el registro
posterior de los parámetros celulares.
FSC

Por lo general registros muy pequeños Poblaciones celulares ordenadas según su tamaño
representan detritus celulares. (FSC), complejidad (SSC) o fluorescencia.
CITOMETRÍA DE FLUJO
El citómetro de flujo es un instrumento utilizado para caracterizar poblaciones celulares cuantitativamente con rapidez.

En algunos registros, además se

agrega pseudocolor para representar
la abundancia de células.

Otra forma de representar los datos en citometría de

flujo es a través de un gráfico de dispersión de puntos.
En este tipo de registros se relacionan 2 parámetros
obtenidos simultáneamente para cada tipo de célula Mediante esta técnica se estudian tradicionalmente la proporción de células de una
(en este caso FSC (volumen) y SSC (complejidad)). muestra de sangre. Además, junto con el histograma, se pueden seleccionar poblaciones
para estudiar específicamente el comportamiento de algún tipo celular.
Las técnicas actuales para el estudio de
poblaciones espermáticas humanas ha sido
difícil por la presencia de multiples células
anómalas y cuerpos apoptóticos (M540). En
este estudio caracterizaron el uso de
Citometría para discriminar entre
espermatozoides y cuerpos apoptóticos (que
inducen a error en citometría).

FSC