CAPITULO

9
Cultivo, visualización y
perturbación de células

La m icroscopia por fluorescencia muestra la loca lización d el DNA y múltiples

pro teínas dentro de la misma cél ula. Las técn icas de marcación y tinción
utilizan d iferen tes molécu las fl uo rescentes q ue revelan las proteínas del cito es-
queleto a -tubulina (verd e) y actina (roja), el DNA (azul), el com p lejo de Golg1
(am arillo ) y las m itocond rias (p úrpura). Las imágenes en la parte superior son
imágenes en falso colo r d e cada estructu ra teñida individ ualm ente. La imagen
más grand e d e estas imágen es sep arada s combina éstas para describ ir la célula
completa. (De B N G G,epman1 y col1. 2006. lcience 312:2 171

s difícil creer que hace 400 años no se sabía que todos los seres aislados, es lo suficientemente compleja como para plantear problemas

E vivos están constituidos por células. En 1655, Robert Hooke usó

un microscopio primitivo para examinar una pieza de corcho y
vio una disposición ordenada de rectángulos -las paredes celulares de
para la investigación. Por ende, los biólogos celulares y moleculares
suelen realizar estud ios experimentales en células aisladas de un orga-
nismo. En la Sección 9.1 se aprende cómo mantener y crecer d iversos
las plantas muertas- que le recordó a las celdas de los monjes en un tipos celulares y cómo aislar tipos específicos de células desde sus lo-
monasterio, por lo que acuñó el nombre de células (o celdas) , Poco calizaciones nativas, por lo que se analizará cómo los investigadores
después de esto, Antonie van Leeuwenhook describió a los microor- cultivan y examinan células en ambientes tridimensionales para imitar
ganismos que vio en este simple microscopio, la primera descripción tanto como sean posibles sus situaciones en un animal.
de las células vivas. Dos siglos más tarde, Matthias Schleiden y Theo- En la mayoría de los casos, las células aisladas pueden mantener-
dore Schwann observaron que las células individuales constituyen la se en el laboratorio bajo condiciones que permitan su supervivencia y
unidad fundamental de la vida en una variedad de plantas, animales y crecimiento, un procedimiento que se conoce como cultivo. Las células
organismos unicelulares. Colectivamente, éstos fu eron algunos de los cultivadas tienen diversas ventajas respecto de los organismos intactos
grandes descubrimientos en biología y plantearon la cuestión de cómo para la investigación biológica. Las células de un único tipo específico
se organizan y funcio nan las células. Sin embargo, muchas limitaciones pueden crecer en un cultivo, donde las condiciones experimentales se
técnicas impiden los estudios de las células en los animales y plantas controlan mejor, y en muchos casos una única célula puede hacerse
intactos. Una alternativa es el uso de órganos intactos que son retira- crecer de manera rápida para formar una colonia de células idénticas.
dos de los animales y tratados para mantener su integridad y fun ciones La cepa resultan te de células, que es genéticamente homogénea, se de-
fisiológicas. Sin embargo, la organización de los órganos, incluso los nomina un don.

CONTENIDO

9.1 Crecimiento de células en cultivo 398 9 .4 Aislamiento y caracterización de orgánulos celulares 424

9.2 Microscopia óptica: exploración de las estructuras 9 .5 Perturbación de funciones celulares específicas 430
celulares y visualización de las proteínas dentro de
404
las células

9.3 Microscopia electrónica: imagen de alta resolución 419

 Los d esc ubrimientos acerca de la o rga ni zació n celular han esta- La microscopia y la caracterización d e orgánulos son lecnolo .
d . . gias
do íntimamente ligados co n los desarroll os tanto de la microscopia inherentemente descriptivas. ¿Cómo uno pue e mvest1gar los rnec _
óptica como elect rónica. Esto es una verdad hoy como lo fue hace nismos moleculares que subyacen a los. procesos biológicos celulare\ L
400 años. La m icroscopia óptica inicialmente reveló la maravillosa Si queremos comprender cómo ~nc10na . un autom~vil , podernos
organización celular interna , y en la actualidad constantemente se es- explorar los efectos de la eliminación o 1~ 111terferenc1a con cornpo.
tán mejorando los microscopios altamen te sofisticados para sondear nen tes individuales para ver qué sucede. Este es en prmcipio, por su-
cada vez m ás profundo y revelar el mecanismo molecular por el cual puesto, el concepto del análi sis genético qu e se describió en el Cap¡.
funcionan las células. En la Secció n 9.2 describimos la microscopia tu lo 5: cómo la interferencia de un componente específico puede ser
óp tica y las diferentes tecnologías disponibles, de hace mucho tiempo usada para ana lizar su función. En la Secció n 9.5 describimos córno
pero que aú n son m étodos valiosos, y luego haremos un recorrido las pequeñas molécu las que interfieren con la fu nción de proteínas
a través de diversos métodos ingeniosos q ue han sido desa rrollados específicas pueden también ser utilizadas para analizar procesos ce-
desde e nto nces, hasta culminar con la m ás nueva de las tecnologías lula res. Finalm ente, describiremos cómo el descubrim iento de los
punteras. En la década de 1960 se produjo un avance importante y en RNA de interferencia peq ueños q ue se dirigen a mRNA específicos
la década de 1970 con el desarrollo de la microscopia de inm 1111ofluo- para su destrucción han sido explotados para suprimir la expresión
resce11cia que permitió la localización específica de proteínas dentro de proteínas específicas, tanto en células cultivadas como en anirnales
de células fijadas, lo que proporcionó así una imagen estática de su enteros, para expandir y complementar el uso de las genéticas clásicas
localización, como se ilustra en la figura de apertura. Tales estud ios en el análisis de los procesos biológicos.
llevaron al concepto impo rtante de que las m embranas y los espacios
interiores de cada tipo de orgánulo contienen un grupo distintivo
de proteínas que son esenciales para que el orgánulo lleve a cabo sus 9.1 Crecimiento de células en cultivo
funciones únicas. Un avance importante se produjo a mediados de la
década de 1990 con la simple idea de expresa r proteínas quiméricas, El estudio de las células está facilitado en gran m edida por el crecimien-
que consisten en una proteína de interés unida de forma covalen te a to de ellas en cultivo, donde pueden ser examinadas por microscopia y
una proteína naturalmente flu o rescente, para permitir a los biólogos sometidas a tratamientos específicos bajo condiciones controladas. En
visualizar los movimientos de las proteínas individuales en las células general es bastante fácil hacer crecer células bacterianas unicelulares,
vivas. De repente, se pudo aprecia r la naturaleza dinámica de las cé- hongos o protistas; por ejemplo, colocándolas en un medio rico que
lulas, que cambió la visión de las imágenes estáticas de éstas disponi- mantenga sus crecimientos. Sin embargo, las células animales prove-
bles anteriormente. Además, presentó un desafío tecnológico -cuan to nientes de organ ismos mu lticelulares son más difíciles de cultivar en
más sensible era el microscopio para detectar la proteína fluorescente, forma aislada o en grupos pequeños. En esta sección analizaremos
más información podía obtener el investigador de esos datos-. Tam- cómo las células animales crecen en cultivo y cómo se pueden purificar
bién posibilitó el desarrollo de técnicas de fluorescencia para evaluar diferentes tipos celulares para su estudio.
las interacciones proteína-proteína en las célu las vivas, como también
una mirad a sobre otras tecnologías moleculares sofisticadas, algunas
de las cuales se describen en esta secció n. El cultivo de células animales requiere de un medio
A pesar d e los desarrollos asombrosos en la microscopia ó ptica, la rico en nutrientes y superficies sólidas especiales
luz visible proporciona una resolución demasiado baja para examinar a
las células a nivel de detalle ultramolecular. El microscopio electrónico Para permitir la supervivencia y el funcionamiento normal de tejidos
proporciona una resolución mayor, pero la tecnología suele necesitar o células cultivadas se deben simular tanto como sea posible las con-
que la célula sea fijada y seccionada y, por lo tanto, los movimientos diciones de temperatura, pH, fuerza iónica y acceso a los nutrientes
celulares se congelan en el tiempo. La microscopia electrónica también esenciales, de dentro de un organismo intacto. Las células animales
permite que los investigadores examinen la estructura de complejos aisladas en general se colocan en un m edio líquido rico en nutrientes,
macromoleculares o macromoléculas únicas. En la Secció n 9.3 se deta- denominado medio de cultivo, dentro de placas O recipientes con una
llan algunas técnicas para la preparación de especímenes para la obser- cubierta especial de plástico. Los cultivos se mantienen en incuba-
vación en el m icroscopio electró nico y se describe el tipo de informa- doras en las cuales se puede controlar la temperatura, la humedad Y
ción que se p uede obtener de ellos. la atmósfera. Para reducir las posibilidades de contaminación bacte-
La microscopia óptica y electrón ica reveló que todas las células eu- riana O con hongos se suelen añadir antibió ticos al medio de cultivo.
cariontes -ya sean de origen anim al, de plantas u hongos- contienen Para protegerlo aún más contra la contaminación, los investigadores
un repertorio similar de compa rtim entos limitados por membrana suelen '.ransferir cél ulas en tre las placas, añadiendo reactivos al medio
llam ad os orgánulos. En la Sección 9.4 se proporciona una introduc- de cultivo, Y manipu lar los especímenes dentro de cabinas estériles
ción simple a la estructura y la función básica de los principales or- especiales que contienen aire ci rculante que es filtrado para eliminar
gánulos en las células de plantas y anim ales, como un preludio a sus los microo rgan ismos Y o tros conta minantes trasportados por el aire.
d escrip ciones detalladas en los siguientes capítulos. En paralelo co n Los medws para cultivar cél ulas an imales deben estar suplementa-
los desarrollos de la microscopia, se desarrollaron métodos de fra c- dos con. nueve ami noa•c·d1 os (e - . . . · tó'ano,
. 1en11a1anma, valma, treonma, tnp ''
cionamiento subcelular que permitieron a los biólogos celulares aislar isoleucm_a, metionina, lisina e histidina ) que no pueden ser sintetizados
o rgánulos individuales con un alto grado de pureza. Estas técnicas, ¡ºr l~s celulas _de animales vertebrados adultos, Además, la mayo~ía ~~
también detalladas en la Sección 9.4, continúan proporcionando in- as celulas ~ultivadas requieren otros tres aminoácidos (cisteína, t1ro~i
formación importante acerca de la composición proteica y las funcio- na y argmma) que son smtetizados
· • • 1· das en
solo por células especia iza
que sir ve como f uente
nes bioquímicas de los orgánulos. los animales intactos , as1, como g1utam ma, . . de

398 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y pertu rbación de células

nitrógeno. Los otros componentes necesarios de un medio para las Cuando se cultivan células extraídas de un embrión o un animal
células animales en cultivo son las vitaminas, diversas sales, los ácidos adulto, la mayoría de las células adherentes se dividirá un número finito
grasos, la glucosa y el suero -el líquido remanente después de permi- de veces y luego dejara de crecer (células senescentes). Por ejemplo, los fi-
tir la coagulació n de las partes no celulares de la sangre (plasma )-. broblastos fetales humanos se dividen alrededor de SO veces antes de de-
El suero contiene diversos factores proteicos que son necesarios para tener su crecimiento ( Fig. 9- 1a). Si se comienza con 106 células, SO dupli-
la proliferación de las células de mamífero en cultivo, que incluyen caciones tienen el potencial de producir 106 x 250, o más de 1020 células,
la hormona polipeptídica insulina; la transferrina, la cual suministra que es equivalente al peso de alrededor de I 000 personas. Normalmente,
hierro en una forma bioaccesible, y numerosos factores de crecimien- en cualquier experimento solo se utiliza una pequeña fracción de estas
to. Además, ciertos tipos de células requieren factores de crecimiento células. Por lo tanto, incluso a pesar de que su tiempo de vida es limitado,
especializados no presentes en el suero. Por ejemplo, los progenitores un cultivo simple, si se lo mantiene cuidadosamente, puede ser estudiado
de los glóbulos rojos requieren eritropoyeüna, y los linfocitos T re- a través de muchas generaciones celulares. Tal linaje de células originadas
quieren interleucina 2 (véase el Ca p. 16). Unos pocos tipos de células a partir de un cultivo primario inicial se denomina una cepa celular.
de mamífero se pueden cultivar en un medio qu ímicamente definido, Una excepción importante del tiempo de vida finito de las célu-
libre de suero, que contiene aminoácidos, glucosa, vitaminas y sales, las normales es la célula madre embrionaria, que como su nombre lo
además de ciertos minerales, factores de crecimiento específicos y indica, deriva de un embrión y se dividirá para dar origen a todos
otros componentes.
A diferencia de las células de levadura y bacterianas, que pueden (a) Células humanas
cultivarse en suspensión, la mayoría de los tipos de células animales Fase
solo crecerá adherida a una superficie sólida. Este requerimiento resalta Fase 11 111
la importancia de las proteínas de la superficie celular, denominadas Cepa celular
moléculas de adhesión celular (CAM, cell-adhesion molecules), que
las células usan para unirse a las células adyacentes y a componentes Velocidad de
crecimiento
de la matriz extracelular (MEC), tales como colágeno o fibronectina del cultivo
(véase el Cap. 20). Estas proteínas MEC cubren la superficie sólida (en
general de vidrio o plástico), ya sea que provengan del suero o sean Senectud
celular
secretadas por las células en cultivo. Una única célula cultivada en una
/
placa de vidrio o plástico prolifera hasta formar una masa visible, o
25 50
colonia, que contiene miles de células genéticamente idénticas en 4 a 14 Generaciones celulares
días, lo cual depende de la tasa de crecimiento. Algunas células sanguí-
neas especializadas y células tumorales pueden ser mantenidas o crecen (b) Células murinas
en suspensión como células individuales. Pérdida inicial
/ del potencial
de crecimiento
Los cultivos celulares primarios y las cepas de Velocidad de
crecimiento
células tienen un tiempo de vida limitado del cultivo
• ( . . 1
Por 1o genera1 se u t 1·1;7~n
~
los te¡'idos animales normales . p. e¡., /pie'
riñón hígado) o embriones enteros para establecer cult1vos ce/u ~res
' , d .. d
primarios. Para preparar celulas e te¡• os individuales para un cultivo
. ·ones célula-célula y cé1u1a-ma- 30 60
primario se deben romper 1as mteracci b' 'ó
' "d t t n con una com mac1 11 Olas después de la iniciación del cultivo
triz. Para ello, los fragmentos de te¡1 os s_e ra ~d ¡· t de colágeno
de una proteasa ( P· e¡., . tri sina la enzuna h1 ro 11..an e ' FIGURA 9-1 Etapas en el establecimiento de un cultivo de células. (a)
P ' . EDTA ) que reduce la Cuando inicialmente se cut11van células aisladas de 1ej1do humano, algunas
o ambas) y un catión divalente quelante (p. e¡., 1 1 d dh -
'b I edio Muchas mo écu as e a e cflulas mueren y otras (principalmente los f1broblastos) comienzan a crecer;
concentración de CaH h re en e m · · activadas cuando de manera global. la 1asa de crecimiento se incrementa (fase 1). Si el resto de
al . r Jo tanto, son 111
sión celular requieren c cio y, po dh . celular que no son tas células son privadas de alime1110, se las diluye y se las vuelve a sembrar en
. . 1· s moléculas de a es•6 n placas una y 01ra vez. la cepa de célula continúa d1vid1éndose a una velocidad
se el1mma el ca c10; otra . d s para que las célu-
.
depend1entes d 1 1. cesitan ser proteo11.1.a a constante durdnte alrededor de SO generaciones celulares (fase 11), después
e ca CIO ne quelante se utiliza para
1as se separen. La misma. olución de proteasa- de ta cual la velocidad de crec1m1en10 disminuye rápidamente. En el período
s de cultivo para estudios s1gu1ente (fase 111). rodas las célulds en el cul11vo detienen su crecimiento (se-
eliminar las células adherentes de una p Iaca ¡. )
. ( sferencia a otra p aca . nectud) (b) [n un culr1vo preparado a part,r de células de rarón u otro roedor,
bioquímicos o subculuvos tran d • antes en el tejido conec- la célula 1111c1al muerra (no se muesira) se acopla con el grupo de células que
)as células pre omm
Los fibroblastos son d la MEC tales como co- crece saludablemenre A medida que las d1v1s1ones celulares disminuyen y se
d cen componentes e ' perm1re que cont1nue el crecimiento, pronto comienzan a perder su potencial
tivo y normalmente pro u d dhesión celular, anclando las
1ágeno, que se unen a a J s moléculas e ª ... de crec1m1enro y la mayoría deja de crecer (es decir. el cultivo entra en se-
. fib blastos suelen d1v1d1rse más
· En cul uvo 1os ro nectud) Células muy raras sufren mutaciones oncogén1cas que les permiten
cé1ulas a una superfi c1e. ' . d te¡'ido y eventualmente se
, . élulas a partir e un ' . sobrev1v1r y continuar dividiéndose hasra que su progenie cubre el cultivo.
rap1damente que otras c . te en un cultivo primano a Estas células constituyen una linea celular, la cual crecerá indefinidamente si
. 1 . lular predomman
conVJerten en e upo ce . . les para eliminarlas cuando se la diluye y suministran nutrientes adecuados.Tales células se dice que son
menos que se tomen preca uciones especia inmortales.
se aíslan otros tipos de célula.

9.1 Crecimiento de células en cultivo 3 99

los tejidos durante el desarrollo. Como se analizó en el C apítulo 2 1, generaciones, el cultivo en tra e n se~ectud ( Fig: 9 -_1b ). Durante este pe.
las células madre embrionarias se pueden cultivar indefinidamente en ríodo, la mayoría de las células detiene su crec1m1ento, pero a menudo
condiciones adec uadas. una célula transformada que se divide rápidamente surge espontá.
La investigación con cepas celulares se simplifica por la capacidad neamente y toma el control, o crece por encima del cultivo. Una línea
para congelarlas y d escon gelarlas exitosamente un tiempo después celular der ivada de esta varian te transformada proliferará espontánea.
para análisis experimental. Las cepas celulares se pueden congelar en mente si se le proporcionan los nutrientes necesarios. En contraste con
un estado de a nimación suspendida y almacenar por períodos largos las células de roedores, las células humanas n ormales raramente sufren
a temperatura de nitrógen o líquido, proporcionando un conservante transfor m ación espontánea para dar luga r a una línea celular. La línea
que evite la formación de cristales d e hielo dafiinos. Aunque no todas celular HeLa, la pri m era línea celular humana establecida, se obtuvo
las células sobreviven al descongelamiento, muchas sí lo hacen y reto- originalmente en ¡ 952 a partir d e un tumor maligno (carcinoma) de
man su crecimiento. cuello uterino. O tras líneas celula res humanas suelen derivarse de cán-
ceres y otras se han convertido en inmorta les a l t ransformarlas para
Las células transformadas pueden crecer que expresen oncogenes.
indefinidamente en cultivo Independientemente d e la fuente , las células en las líneas inmor-
talizadas suelen tener cromosomas con secuencias de DNA anómalas.
Para poder clonar células individuales, modificar su comportamiento Adem ás, el número de cromosom as en tales células s uele ser mayor que
celular o seleccionar mutantes, los b iólogos a menudo quieren man- el de las células no rmales a partir de las cuales surgen, y el nú mero de
tener cultivos de células por mucho m ás de 50 divisiones. Tales cre- cromosomas cambia a m edida que las células continúan dividiéndose
cimien tos prolongados son mostrados por las células derivadas de en cultivo. Una excepción notoria es la línea de ovario de hámster chino
algunos tumores. Además, células raras en una població n de cél ulas (CHO) y sus derivados, que tienen m enos cromosom as que sus proge-
p rimarias p ueden sufrir mutacio nes o ncogénicas espontá neas, lo que n itores hámster. Las células con u n número a nó malo de cromosomas
lleva a la transformación oncogénica (véase el C ap. 24). Tales célu- se dice q ue son aneuplo ides.
las, se dice que está n o n cogénicamente tra11sfor111adas o simplemente
transformadas, y pueden proliferar indefinidamente. Un cultivo de cé- La citometría de flujo separa diferentes
lulas con un período d e vida indefinido es considerado inm ortal y se tipos de células
denomina línea celular.
Los cultivos de células primarias de células de roedores normales Algu nos tipos de células difieren lo suficiente en densidad como para que
suelen sufri r transformación espont ánea en una línea celular. Después puedan ser separados sobre la base de sus p ropiedades físicas. Los glóbu-
que las células de roedores son mantenidas en cultivo durante varias los blancos (leucocitos ) y los gló bulos rojos (eritrocitos), por ejemplo,

Suspensión celula r

Líq uido que recubre

Filtro t
o !r a
Condensador
Detector
FIGURA 9-2 El clasificador de células activado por
fluorescencia (FACS) separa las células que están
B de luz
Detector dispersada
marcadas de modo diferencial con un reactivo fluo-
rescente. Paso O: se mezcla una susper.s,ón concer,tr;,do
de luz
fluorescente
a
de células marcdoas con una soluoór amort,guadord •¡
!el líquido que las recubre) de manera tal que las células
pasen en una ún,ca fila a través de un haz de lu, láser
Paso H se mide tamo la luz íluore~cemi: em1t,do como la
Í'\iJ
Rayo láser ----..____ ~
-º ' .._J
l-1
o-
luz dispersada por cada célula. a partir de las rred1c,or.es
de la luz dispersada se puede determ inar el tamano y la
forma de la célula. Paso ll oespués la susoem,ón se ha,.r-
pasar a través de una boouilla. la cual form.; rJIJ!as urrr,1-
/ - ~ i;(J/
nutas que contienen como mdx mo un;i un1c;, Cl'·lul,; /-1
momento de formación en la punta ce la b0qu1lla. a c¿rJ,; ~
'/Á D ~ ------- Golhos
o<-;;o•• sin carga
gota que contiene una celula se l.; da una d1:sccrg;, e-1"< Got itas con ° o • oe • 0

mea negativa proporcional a la íluorem-nc1a dP la cl'lu1a menos carga ~ gJ, o••

determinada a partir de las primeras med,non,-s Paso 0
las gotas ahora pasan a través oe un campo Plectnco oor :} Células fluorescentes . ~~-~ Gotitas con
ende se descartan aquellas gotas s,n c.wJa, rr,ientras qu·
aquellas con carg as eléctricas d,ferentes son sr-oarad,,s y • Células no fluorescentes más carga
recolectadas. Debido a que sólo toma unos ,n,l1sequndos • } Gotitas de células fluorescentes
,o Gotitas ca rgadas
clasificar cada gota. pueoen pasar tanto como IOmillo- clasifica das que contienen
nes de células por hora a través de la máquina M.rr,,,n 1• • Gotitas de células no fluorescentes células fluorescentes
O P Parh •t l:,. Hem=,....t'-"fg, º9F.¿ Vet., ( ,. 5,oi 26:.'.~.!

400 CAPÍTULO 9 • Cultivo, vis ualización y perturbación de células

 • ' troc·t ·
1icncn densidades muy diferentes debido a que los "ri 1 os no tienen
centri fugació n por
núcleo; por eso estas células _se pueden separa r por
4) Debido a 1
grad. iente de .densid ad (descrita en la Secció n 9 · · que a ma-
los ti pos ~e células no pueden diferen ciarse fácilme nte, se deben
rona de
rlas.
ut ilizar otras técnicas como la citometría de flujo para separa
Para identificar un tipo de célula de una mezcla coinpleJª• · es necesa- i
Q)

deseadas. E
rio rener alguna forma de marca r y luego clasificar las células ~ C'!
las en sus su-
Diferentes tipos de célula suelen expresar diferen tes molécu .~ >
solo se expresa u
perfici_es celulares. Si una molécula de superfi cie particular
.J:.
~ 1-
celular desead o, esto puede utilizarse para marcar esas células . u
en el tipo "'
Q)
cente unido
La mezcla celular se puede incuba r con un colora nte fluores o
::,
endo así las
a un anticuerpo contra moléculas de superficie celular, obteni u. 10 1 Células no T
analiza r en un
células desead as con fluorescencia. Las células se pueden
un haz de láser
citómetro de flujo. Este aparato hace fluir las células por
; de este modo
que mide la luz que dispersan y la fluorescencia que emiten
o a partir 104
se pueden cuantificar las cantid ades de células del tipo desead 10 1 102
encia (FACS,
de una mezcla . Un clasificador celular activado por fl uoresc CD3
tría de flujo,
j/1wresce11ce-activnted ce// sorter), que se basa en la citome Fluorescencia roja ~
unas pocas célu-
puede tanto analiza r las células , como seleccionar una o
separad a (Fig.
las de miles de otras y clasificarlas en una placa de cultivo a los anticu erpos mar-
tracion es de maner a FIGURA EXPERIMENTAL 9-3 las células T unidas
9-2). Para clasificar las células se ajustan sus concen icie celular
solo conten ga cados con fluorescencia contra dos proteínas de la superf
ral que las gotas diminu tas que el FACS forma y analiza son separadas de otros glóbul os blancos median te FACS.
Las células
fluorescencia,
una célula por cada gota. Un chorro de goras se analiza por del bazo de un ratón se trataron con un anucuerpo monoclonal fluoresc
ente
separá ndolas de las que rpo
y aquellas que tienen la señal desead a se clasific an especifi co para la proteína de superficie celular CD3 y con un anticue
a de la
no la tienen. Una vez que las células han sido clasificadas, las seleccio na- monoclonal verde fluorescente específico contra una segunda proteín
de un aparato
das se pueden cultivar. superficie celular. Thy 1.2 Amedida que las células pasan a través
por cada
diferen- FACS. se mide la intensidad de la fluorescencia verde y roja emirida
El proced imient o por FACS se suele urilizar para purificar pu11to represe nta una célula ún,ca. Este gráfico de la íluorescenc,a
cuales porra en su superf icie una célula. Cada
tes tipos de leucoc itos, cada uno de los verde (e¡e vemcal) versus la fluorescencia ro¡a (eje hor,zontal) para
miles de
erpos monoc lonales especí- T expresan
o más proteínas distintivas y unirán anticu células de bazo muestra que alreded or de la mitad de estas células
T del sistem a inmun itario, por .2 sobre su superfic ie (cuadra nre supenor
ficos para la proteína. Solo las células tanto las proteinas CD3 como Thy 1
CD3 como Thyl .2 en sus superf icies. células resrantes. que present an baja fluoresc encia (cuadra nte
ejempl o, tienen tanto proteín as derecho). Las as y
craoon es basales de esras proteín
La presencia de estas proteín as de superficie permit e que
las células T infelior izquierdo). expresan solo concen
de glóbulo s blancos Nótese la escala logarítm ica sobre ambos
to de los otros tipos de leucoc itos o son otros 11pos
sean separadas fácilmente respec eJeS (Cortesi.; dt.• (11~nqchen9 ZhJnc¡, Wh11ehead lnsrnu>·e)
células del bazo ( Fig. 9-3).
del conte-
Otros usos de la citometría de flujo incluyen la medición
una célula y la determ inación de su forma y ta- epitelia l,
nido de DNA o RNA de células. Ejemp los claves son las capas tipo láminas del tejido
puede medir simult áneam ente el tamaño de una s de los
maño general. El FACS llamado epiteli o, que cubre las superficies internas y externa
cantida d de luz dispers ada) y la cantida d de DNA epitelia l po-
célula (a partir de la órganos. En general, las diferentes superfi cies de una célula
a por un
que contiene (a partir de la cantidad de fluorescencia emitid larizad a se denom inan superfi cie apical (parte superio r), basal (parte
de DNA de las
coloran te unido al DNA). Las medic iones del contenido inferio r o base) y lateral (costad o) (véase el Fig. 20- 1O).
La superficie
DNA a me-
células individ uales se utilizan para seguir la replicación del basal suele hacer contac to con la matriz extracelular sub)'ac en te deno-
el Cap. 19).
dida que las células progresan a través del ciclo celular (véase minada lámina basal, cuya composición y funció n se analiza en la Sec-
icos de
Un métod o alternativo para la separación de tipos específ ción 20-3. Las células epitelia les funcio nan en rl transp orte específ ico
rpos para
células usa pequeñ as esferas m agnéticas acopla das a anticue de clases de moléculas a través de las lám inas epitelia les; por ejempl o,
células T,
la molécula de superficie específica. Por ejemplo, para aislar el recubrimiento epitelial del intesti no rra nsport a nutrien tes hacia el
ico para una
las esferas se cubren con un anticuerpo monoclonal específ interio r de la célula a través de la superficie apical y hacia afuera a Ja
con estas p_ro-
proteín a de superficie como CD3 o Thy l .2. Sólo las células circulación sanguí nea a través de la superfi cie basolat eral.
Cuand o cre-
la preparación
teínas se adheri rán a las esferas y se pueden recupe rar de cen sobre una superfic ie de plástico o vidrio las células epitelia les no
de ensayo.
mediante adhesión a un im án pequeñ o en el lateral de tubo pueden llevar a cabo esta funció n con facilida d. Por ende, se han dise-
ic ie porosa que act úa como
iiado recipientes especiales con una superf
forman una
El crecimient o de céf ufas en cultivos la lámina basal a la cual se adhieren las células epitelia les y
Una línea celular cultivada
bidimensionales y tridim ensio nales imita lám ina bidimensiona l unifor me (Fig. 9-4).
del epitelio ele riñón de perro se
que se uriliza con frecuen cia deriva da
el ambi ente in vivo K) ce/Is y suele utilizar se para
llama Mndin- Dnrby cn11i11e kidney (MDC
Se ha aprend ido mucho utilizando el cultivo en una
superficie de p_lás- las lám inas epitelia les.
nte t1sl~- estudia r la fo rmació n y funció n de
tico O vidrio, aunqu e estas superficies están ale¡adas de! ambie Sin embargo, incluso una lámina bidi mensional a menud
o no
como mucho s ti-
lar normal de las células. En el Capíw lo 20 se detalla permite que las células imiten por completo el compo rtamie nto en su
tran conectadas a otras
pos de células funcio nan solo cuando se encuen

9.1 Crecimiento de células en cultivo 401

 Superficie apical
FIGURA 9-4 Las células MDCK que crecen en recipientes especializados Placa de cultivo
proporcionan un sistema experimental para el estudio de las células
epiteliales. 1;is células MDCK forman un epitelio polarizado cuando crecen
Superficie
1
sobre una men1brana porosa cubrerra por un lado con colágeno y pcr el otro
por componentes de la l.imrna basal. Aquí se muestra un drsco especial de
late ral
Medio apical
-~
cul tivo en el cual el medio a cada lado del filtro (lados apical y basal de mono· Superficie
plano) puede manipularse experimentalmente y controlarse el movirnrento de basal
las moléculas a trdvés de los planos. Varras rnterconexiones que comunican las
cél ulas sólo se forman sr el medio de crecimiento con tiene Ca7 • suficiente.

ambiente normal. En la actualidad se han desarrollado métodos para Lámina Filtro Monocapa de
cultivar células en tres dimensiones al proporcionarles un sostén infil - basal poroso células MDCK
trado con componentes de la matriz extracelular. Si las células JVIDCK
se cultivan en condiciones adecuadas, formarán una lám ina tubular
que imita un órgano tubular o el conducto de una glándula sec retora. ra r estas proteínas (véanse las Figs. 5-3 1 Y 5-32). Aquí considerare-
En las estructu ras tridimensionales, el lado apical de la lámina epitelial mos el uso de células cultivadas especiales para generar anticuerpos
recubre el lumen, mientras que el lado basal de cada célu la está en con· mo nocl onales, q ue son herramientas experimentales ampliamente
tacto con la matriz extracelula r (Fig. 9-5 ). utilizadas en muchos aspectos de la investigación biológica celular.
De manera creciente, se están utili za nd o en med icina para propó•
Las células híbridas llamadas hibridoma producen sitos terapéuticos)' de diagn ós tico, como se anali za en los últimos
abundantes anticuerpos monoclonales capítul os.
Para comprender el desafío de generar anticuer pos monoclonales,
Además de servir como modelo de investigación para est udios de necesitamos brevemente repasar cómo se producen los anticuerpos
función celular, las células cultivadas se pueden convertir en "fábri- de mamífero; más detalle se proporciona en el Capítulo 23 . Recuérde-
cas" para la producción de proteínas específicas. En el Capítul o 5 se se que los anticuerpos son proteínas secretadas por los glóbulos blan-
describió cómo la introducción de genes que codifican insulina, fac- cos que se unen con gran afinidad a sus antígenos (véase la Fig. 3- 19).
tores de crecimiento y ot ras proteínas terapéuticas al interior de las Cada lin focito B normal productor de anticuerpo en un mamífero es
células eucariontes o bacterias se puede usar para expresar)' recupe- capaz de producir un único tipo de anticuerpo que se puede unir a un

(al (b)

FIGURA EXPERIMENTAL 9-5 Las células MDCK pueden formar quistes

en cultivo. (a) Las células MDCK que crecen en una matrrz extracelular de -
dos con Ecl lado ilo,cal m
'· ' n,
basol;iterales (vf'rde E"r· -1 ,
ef' u i:, puede verse que están totalmente po arr
. . ·
1 za-

es
soporte forman grupos de células que se polarrzan para formar una únrca cap;i . · · ranr1o o1 lumen, lo cual recapitu la sus organrzacron
en los tu bulos rerrales d 1 .. d azul.
esférrca de células con un lumen en el medio, llamado qurste (b) Al analizar la e os cuales derivan. El DNA nuclear está tenrdo e
'Pd1tr•<,[c1] 1ft, d':.'0 M 8r,•a"1 tcolr, /lllQ .'.JO/ Ct-l!B•o - 12: l(J _
~r, )
localrzacrón de proteínas que se encuentran en las membranas apicales íro¡oJ y

402 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 determinante o cpítopo parti cular en u 1 . I d
' a mo1ecu a e antígeno Un
cpftopn .:sen general una región pequeña d ¡ .. u • Inyecta'. un ratón /.~
. , e ant1gen o, por ejemplo

~
qu.: consiste en solo unos pocos aminoác·d . . .
1 os. 51 e1 a111111al es 111vec-
_ '
_ • .
1aJo ~011 un an11geno, los lm focito s B que · t · - '
sm et12an anticuerpos que
reco nocen al antíge no son estimulados p ¡·r
. . . ara pro ,,erar )' secretar los
a1111cucrpos. Cada linfoc1to B activado po r an t'igeno ,arma r
un clan
.
de célul as en el bazo o en los nodos lin fát icos,
don produce
.
· d d
on e cada celula del
anticuerpos idénticos, es decir, un ant1c11erpo ·
.
l
. .
.
.
,wl. Debido a que la mayoría de los ant,·g
.
111ult1plcs epltopos, la exposición de un animal a u,1 a nt'1geno sue e
- .
1
enos natura es contienen
1110 11 0 cJ 0 _
•

1
ºººº •••••
••••
estimular la formación de múltiples clones de ¡1·n,oc,
cada uno de los cuales produce un anticu erpo es pee,·nKa d'f
La. mezcla . resultante de anticuerpos a part,
e ·
1os B d·r

, ·r de lo s mu ehos c¡ones de
hnf~Cltos B que r~conocen diferentes epítopos en el mismo antígeno
11erentes,
I erente. ººº
ºººº
Cél ulas de mieloma ••
Células murinas del
se d1Ce que es po/,c/onal. Tales anticuerpos policlonales ci rculan en la murino mutantes bazo; algunas células
sa ngre y pueden aislarse como un grupo.
incapaces de crecer
en medio selectivo
11 (rojo) sintetizan
anticuerpos contra
Aunque los anticuerpos policlonales son muy útiles, los anticuer- el antígeno X
pos monoclonales son adecuados para muchos tipos de experimentos
y aplicaciones médicas cuando se necesita un reactivo que se una solo a Mezcla y
un sitio de una proteína, por ejemplo, uno que compita con un ligando fusión de • }
sobre un receptor de superficie celular. Lamentablemente, la purifica-
células O O
ción bioquímica de cualquier tipo de anticuerpo monoclonal a partir
de la sangre no es factible por dos razones principales: la concentración
de cualquier anticuerpo es muy baja, y todos los anticuerpos tienen la
El l Transferencia
a un medio selectivo

misma estructura molecular básica (véase la Fig. 3-19). Las células no

Para producir y luego purificar anticuerpos monoclonales, prime- fusionadas
ro se necesita ser capaz de cultivar el don de linfocito B apropiado. Sin ( O e e ) mueren
embargo, los cultivos primarios de linfoc itos B normales tienen utili- Las cél ulas
dad limitada para la producción de anticuerpos monoclonales debido fusionadas
( O O) proliferan
a que poseen una vida media limitada. Por lo tanto, el primer paso
para producir un anticuerpo monoclonal es generar células producto-
ras de anticuerpo, inmortales (Fig. 9-6). Esta inmortalidad se logra al
fusionar los linfocitos B normales obtenidos de un animal inmuniza-
El l Cultivo de células individuales
en pocillos separados

do con linfocitos inmortalizados, transformados, llamados células de

mieloma que por sí solos no sintetizan ni los polipéptidos ligeros ni
los pesados que constituyen todos los anticuerpos (véase la Fig. 3- 19) . 6 6 66
El tratamiento con ciertas glucoproteínas virales o con polietilenglicol
estimula las membranas plasmáticas de dos células para fusionarse, lo 6 6 6 6
que permite que sus citosoles y orgánulos se entremezclen. Algunas de 66 6 6
las células fusionadas sufren división y sus núcleos suelen coalescer, lo
que produce células híbridas con un único núcleo que contiene cromo-
somas de ambos "progenitores''. La fusión de dos células que son gené- Se analiza cada pocillo para el anticuerpo
ticamente diferentes puede producir una célula híbrida con caracterís- contra el antígeno X
ticas nuevas. Por ejemplo, la fusión de una célula de mieloma con u~a
célula normal productora de anticuerpos del bazo de una rata º.raton FIGURA 9-6 Uso de la fusión y selecclón de células para obtener
hibridomas productores de anticuerpos monoclonales específicos
produce un híbrido que prolifera para da_r un don qu~ se deno~m~ un
contra una protelna. Paso n las células de mieloma inmortales que no
hibridoma. Al igual que las células de m1eloma, las ~el~las de h1bndo- pueden sintetizar purinas en condiciones especiales debido a que carecen de
y son inmortales. .Cada .h1bndoma produce
ma pro l1,eran ·r
rá p1'<lamente . timidina-cinasa se fusionan con células del bazo productoras de anticuerpo
·
e1anticuerpo mo nocional codificado por su lmfocito B progenitor. . normal de un animal que fue inmunizado con el antígeno X. Paso O: cuando se
en este procedimiento para la producción de cultivan en o sobre un medio selectivo especial, las células fusionadas y las no
El segun d o paso . . .
· ]anales es separar, o selecc10nar, las celulas de h1- fusionadas no proliferan: las células de mieloma mutante no crecen debido a
ant1cuerpos monoc . .
que el medio selectivo no contiene punnas y las células del bazo, debido a que
'd
bn orna e Ias c u
d él las progenitoras no fusionadas . y las celulas . auto- tienen un tiempo de vida limitado en cultivo. Así. solo las células fusionadas
• d r ]a reacción de fusión. Esta selección suele
fus10nadas genera as po . . formadas a partir de una célula de mieloma y una célula de bazo sobreviven
. d' . bación de ]a mezcla de celulas en un medio de
~~mme~w~u . . . en el medio especial, y proliferan para producir clones llamados hibridomas.
. . ll d medio de selección, que permite el crecim1en- Cada hibridoma produce un único anticuerpo. Paso ID: el análisis de los clones
cult1vo especia1, . ama o , .
to solo de las células hibridoma debido a sus caractensticas ~uevas.
de individuales identifica aquellos que reconocen al antígeno X. Después de que
• adas para la fusión llevan una mutación que se ha identificado un hibridoma que produce el anticuerpo deseado, el clan se
Las células de m1e1orna us . .
órea de manera tal que un medio de selección puede cultivar para obtener grandes cantidades del anticuerpo.
bloquea una via metab 1 ,

9.1 Crecimiento de células en cultivo 403

se puede usar para que sea letal para ellas y no los linfocitos de fu sión
que no tienen la mutación. En las células híbridas inmortales , el gen •Utl·1·izan d o an t'1c uerpos flu orescentes .contra las moléculas
, de 1a su.
• ce1u1ar, u n aparato llamado clasificador de celulas activado
perfi c1e
funcional del linfocito puede suministra r el producto génico ausente, . Por
fluorescencia puede separar las células con diferentes marcadores de
y así las células de hibridoma será n capaces de crecer en el medio de
selección. Debido a que los linfocitos usados en la fusión no están in- superficie.
mortalizad os, solo proliferará n rápidamen te las células de hibridoma . Para imitar el crecimient o en los tejidos, las células epiteliales suelen
en el medio de selección y por lo tanto se las puede aislar rápidamente cultivarse en recipientes especiales que imitan su polaridad funcional.
de la mezcla inicial de células. Finalment e, cada don de hibrido ma Las células también pueden cultivarse en matrices tridimensionales
selecciona do luego es evaluado para la producció n del anticuerpo de- para reflejar con mayor precisión sus ambientes normales.
seado; cualquier don producto r de ese anticuerpo luego es cultivado
en cultivos grandes, a partir del cual se puede obtener una cantidad • Los anticuerpo s monoclon ales, reactivos que unen un epítopo sobre
considerab le de anticuerpo monoclon al. un antígeno, pueden ser secretados por células en cultivo llamadas hi-
Los anticuerpo s monoclon ales se han to rnado unos reactivos va- bridomas. Estas células híbridas se obtienen al fusionar una célula B
liosos como herramien tas de investigac ión específica. Comúnme n- productora de anticuerpo con una célula de mieloma inmortalizada
te se los utiliza en cromatogr afía de afinidad para aislar y purificar y luego se identifican los clones productor es del anticuerpo . Los anti-
proteínas a partir de mezclas complejas (véase la Fig. 3-38c). Como cuerpos monoclon ales son important es para la investigaci ón básica y
se describirá más adelante en este capítulo, también se pueden utili- como agentes terapéutic os.
zar en microscop ia de inmunoflu orescencia para unir y, po r lo tan-
to, localizar una proteí na particular dentro de las células. También
se los puede utilizar para identificar proteínas específicas en fraccio-
nes celulares con el uso de inmunotra nsferencia (véase la Fig. 3-39). 9.2 Microscopia óptica: exploración
Los anticuerpo s monoclon ales se han convertido en herramien tas de de las estructuras celulares y visualización
diagnóstic o y tratamien to important es en medicina; por ejemplo, los
de las proteínas dentro de las células
anticuerpo s monoclon ales que se unen e inactivan toxinas secretadas
por patógenos bacteriano s son utilizados para tratar enfermeda des. La existencia de las bases celulares de la vida se apreció por primera
Otros anticuerpo s monoclon ales son específicos para las proteínas de vez usando los microscop ios ópticos. Desde entonces, el progreso en la
la superficie celular expresada s por ciertos tipos de células tumorales . biología celular ha sido paralelo y a menudo impulsado por los avan-
Diversos de estos anticuerpo s antitumor ales son ampliame nte usados ces tecnológicos en microscop ia óptica (Fig. 9-7). Aquí analizaremos
en la terapia contra el cáncer, incluidos los anticuerpo s monoclon ales cada uno de estos principale s desarrollo s y cómo avanzó el estudio de
contra una forma mutante del receptor Her2 que se sobreexpre sa en los procesos celulares. Primero describire mos los usos básicos de un
algunos cánceres de mama (véase la Fig. 16- 7). microscopio óptico para observar las células y estructura s sin tinción.
Luego describirem os el desarrollo de la microscop ia de fluorescenci a y
su uso para localizar proteínas específicas en células fijadas. Mediante
el uso de técnicas de biología molecular para expresar una fusión entre
una proteína de interés y una proteína naturalme nte fluorescente , es
CONCEPTOS CLAVE de la Sección 9.1 posible rastrear la localizació n de proteínas específicas en las células vi-
Crecimiento de células en cultivo vas -una capacidad que reveló cómo es la dinámica de la organización
de las células vivas-. En paralelo con estos avances en la preparación
• Las células animales deben cultivarse en condicione s que imiten el de especímenes, los avances ópticos posibilitar on amplificar y agudizar
ambiente natural, que en general requiere del aporte de aminoácid os y las imágenes proporcio nadas por la microscop ia de fluorescencia para
factores de crecimient o necesarios. revelar la estructura celular con una claridad sin precedentes. A partir
de estos avances han surgido muchas tecnologías especializadas, y aquí
• La mayoría de las células animales necesitan adherirse a una superficie
se describirán algunas de las más important es.
sólida para proliferar.

• Las células primarias, aquellas aisladas directame nte a partir de tejido,

tienen un tiempo de vida finito. La resolución del microscopio óptico es de
• Las células transforma das, al igual que aquellas que derivan de tumo- alrededor de 0,2 µm
res, pueden crecer indefinida mente en cultivo.
Todos los microscop ios producen una imagen aumentad a de un objeto
• Las células que pueden crecer indefinida mente se denomina n una lí- peq~eño, pero la naturaleza de la imagen depende del tipo de micros·
nea celular. cop'.o empleado Y de la forma en que se prepara la muestra. El micr~s-
• Muchas líneas celulares son aneuploide s, tienen un número diferente copio compuest o, usado en la microscopia óptica de campo claro, conue·
de cromosom as que los animales progenitor es de los cuales derivan. ne diversas lentes que amplifican la imagen de una muestra en estudio

• Diferentes células expresan distintas proteínas marcadoras sobre su

ª!·
(Fig. 9~8 _La amplificac ión total es un producto del aumento de 1:'.
lentes m d ividuales: si la lente obJ'etivo la lente más cercana a la mue
. '
superficie, las cuales pueden utilizarse para diferenciar las. tra, amplifica 100 veces ( una lente x 100, el máximo usado) Yla /ertt~~
·,
proyeccion, ª veces llamada ocular, aumenta 10 veces, la amph•fi cac16n
total registrada por el ojo humano o una cámara será de 1 QOO veces,

404 CAPITULO 9 • Cultivo, visualízación y perturbación de células

(a) (b) (e)

FIGURA 9-7 Desarrollo del microscopio óptico. (a) Los microscopios sofisucados limitados solo por la resoluC1ón de la luz. (c) En la segunda mitad
primitivos, como el que utilizaba Robert Hooke en la década de 1660, utilizaba del siglo veinte se desarrollaron las técnicas de microscopia de íluorescencia y
lentes o un espejo para iluminar la muestra. (b) Los microscopios ópticos de imagen digital junto con las técnicas confocales para obtener la versatilidad
en general y los de luz e n particular se desarrollaron enormemente durante de los microscopios actuales. (Parte l•I SSPLa ,,aves de Geny lmages; parle [bl cones,a de Carl
el siglo x1x, y a mediados del xx eran comunes los microscopios altamente Zeiss Arch ive; parte [el Ze1~scom )

Sin embargo, la propiedad más impo rtante de cualquier microsco- Sin impo rta r cuántas veces se a m plifiq ue la imagen, un m icroscop io
pio no es su aumento sino su poder de resolución, o resolució n - la ca- óptico convencion al nunca puede reso lver los objetos q ue están a me-
pacidad para distinguir entre d os objetos ubicados uno muy cerca del nos de - 0,2 µm de sepa ració n o mostrar detalles meno res de - 0,2 µ m
otro-. El mero aumento de la imagen de una muestra no lleva a nada de tamaño. Sin embargo, algunas sofisticadas tecno logías nuevas se han
si la imagen es borrosa. La resolución de una lente de microscopia es diseñado para "supera r" esta barrera de resolución y pueden resolver
numéricam ente equivalente a D, la distancia mínima entre dos objetos objetos de solo unos pocos nanómetros de separació n; en la última sec-
que permite distinguirlos corno tales. C uanto más pequeño es el valo r ción analizaremos tal m icroscopio de superresolu ció n.
A pesar de esta fa lta de resolució n, un m icroscopio convencion al
de D, mejor es la resolució n. El valor de D está dado por la ecuación
puede rastrear un solo o bjeto de hasta unos pocos nanómet ros. Si co-
nocemos el tamaño y la forma precisa de un objeto -es decir, una esfera
0,6111. (9- I ) de 5 nm de o ro que está adherida a un a nticuer po a su vez unido a una
D=
N sencx proteína de la superficie celular sobre una célula viva- y si usa mos una
cáma ra para toma r múltiples imágenes digitales ráp idamente, ento n -
ces una com putado ra puede calcular la posició n prom edio para revelar
donde ex es la ape rtura angular, o la mitad del á ngulo de ape rtura del
el cent ro del objeto de casi unos pocos na nó met ros. De esta fo r ma,
cono de luz que entra en la le nte objetivo desde la muestra (véase la F_ig.
los algoritmos info rmáticos se pueden usar para localizar los objetos
9-Sa), N es el índice de refracción del m edio entre la_muestra y el obJ_e-
únicos a un nivel más prec iso - en este caso la localización y el movi-
tivo (es decir, la velocidad relativa de luz en el med10 en com~a rac,on
miento con el tiempo de una proteína de superficie marcada con un
con la velocidad en el aire), y 11. es la longitud de o nda de la luz mc1den -
· • e meJ·ora media nte el uso de lo ngitudes de onda de anticuerpo marcado con oro- lo q ue sería posible solo sobre la base de
te. La reso1uC1on s la resolució n del microscopio óptico. Esta técnica se ha utilizado para
• t (al d 1'srni·nuir el valor de 11.) o concentrando más luz. (al
1uz mas cor as medir niveles del ta maño de nanó met ros como molécu las y vesículas
·mcrementa r N o ex ). Las lentes para la microscopia de alta resolució n
. - d funcionar con aceite entre la lente y la muestra ya que se mueven a lo largo de los filamentos del citoesquelet o ( véa nse las
están d 1sena as para Figs. 17-29 y 17-30).
· tº1ene un 'i ndice de refracción más elevad o (.1,56, en compa-
que e 1aceite .
ºó a el aire y l ,3 para el agua). Para max.1m1zar el á ngulo
rac1 n con 1,0 par . _
· 1 ncx, las lentes también se d1sena n pa ra enfoca r
ex, y en consecuenc ia e se . .
. tos delgado que cubre la muestra. El termino La microscopia de contraste de fase y la de
muy cerca d e I cub reob Je
ertura numérica (AN) y suele. estar marcado contraste de interferencia diferenci al visualizan
N sena se conoce como aP
•• u
en la lente obJetJvo. na
buena le nte de alto a umento tiene una AN de
. células no teñidas
e¡·ores lentes un valor que se aproxima a los 1,7,
al.rededor de 1,4 y 1as m tomó vil mediano ! Nó tese que el aumento Las células constan d e al rededor de un 70% de agua, 15% de proteína,
y ¡cuesta tanto como un au 6% de RNA y cantidades más pequ eñas de lípidos, DNA y mo léculas
no es parte de esta ecuación.
. • • · es en los valores de ex, A.y N sobre la. base de pequeñas. Como ninguna de estas principales clases de mo léculas está
Debido a las hm1tacion
. fí • d la luz, el límite de resoluc,ón de un m1crosco- coloreada, se deben utilizar o tros méto dos pa ra visualizar las células en
las propiedades s1cas e un microscop io.
. . ilº luz visible es de alrededor de 0,2 µm (200 nm ).
p10 óptJco que ut 1za

· ...
9.2 Microscopia óptica: exploración de las estructuras celulares y visua1·1zac·10·n d e 1as prote1nas 405
 '

(a) Microscopio óptico

Detector

- 1
Filtro de
Lentes de
proyección
_ - - Lámrra 7
Espejo ---l+---,-"/
dicroico

.J¡--
·'---'===.:;;;;--;1
-=-=
o
=--
_I
Objetivo ®

Portaobjetos
con muestra

Condensador Lentes

ámpara 1
Espejo
il _1

(b) (c) (d )

Campo claro Contraste de fase Epifl uorescencia

Plano de i magen f- _ _____._
1Filtro de

e_:)- - - Lentes de
proyección
~ Lentes de _ , -
proyección 1
1¡
excitación
Fuente
de luz

..._____,.,, -
r-----1, - - - Lentes - -
objetivo
---,--
1
~'~
- Placa de fase
en el objetivo

- - - Luz no
- ..._____,., obstruida
.
~SP?Jº ....______
dicroico "----._

- - - - Lentes
o o
o

objetivo

/ ·-~
f=.1===~. 1
\ ~ Muestra -----:c= :-c- \
t==-: --.- - - Muestra

,.-- Lentes
( _ _ ) - - - condensadoras ------~r-: ,,¡---- _

Fuente
de luz
•~ - Diafragma anular

--
n n o
406 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células
 FIGURA 9-8. Los microscopios ópticos suelen estar configura d os para del í11rlice de refrncció11 de la región . La luz s,· murvr más lenta mente en
microscopia d~ campo claro (transmisión), de contraste de fase y de un medio de índice de refracción más alto. Por lo tanto. u n haz de luz es
eplfluorescenc1a. (a) En un m,croscop,o óptico típico. la muestra suele estar
refractado (curvado) una vez que pasa desde un medio al interior de un
n·,cn:.,da ,obrta un ponaol.Jjetos de vidrio transparente que se coloca sobre un
objeto transparen te y nuevamen te cuando se aleja. En un microscopio
sopo, le mov,1 (b) En la m,croscop,a óptica de campo claro. la luz de una lám-
pJra de tungsteno se enfoca sobre la muestra mediante una lente condensa- de contraste de fase se genera un co no de luz por un diafragma anular
dora por deba¡o de la muestra; la luz sigue la trayectoria mostrada en amarillo. en el condensad o r que ilumina a la muest ra (véase la 1·1¡:. 9.¡;, ), La luz
(e) En IJ rn,croscopia de contraste de fase. la luz incidente pasa a través de un pasa a través de la muestra al objetivo, y la lu z directa sin obstrucció n
diafragma anula r, el cual enfoca un anillo de luz sobre la muestra. La luz que pasa a través de una región de la placa de fase que transmi te solo un
pa,a s,n ser obstruida a traves de la muestra es enfocada por la lente objetivo peque110 porcentaje de la luz a la vez que cambia su fase levemen te. La
sobre el anillo gris más grueso de la placa de fase. donde abso,I.Je algo de la
parte de un a onda de luz que pasa a través de la muestra será refractada
luz directa y altera su fase un cuarto de una longitud de onda s, una muestra
refracta (curva) o difracta la luz, se altera la fase de algunas ondas de luz (líneas )' estará fuera de fase (fuera de si ncron ía) con la parte de la onda que
verdes) y las ondas de luz pasan a través de la región clara de la placa de fase no pasa a través de la mu estra. Cuánto difieren sus fases depende de la
La luz refractada Yla no refractada se vuelven a combinar en el plano de la diferencia en el índice de refracción a lo largo de dos trayectorias y del
imagen para formar la imagen. (d) En la microscopia epifluorescente. un haz de espesor de la muestra. La luz refractada y la no refractada se vuelven
luz procedente de una lámpara de mercurio (líneas verdes) es dirigida hac,a el a co mbin ar en el plano de imagen para formar la imagen. Si las dos
liltro de excitación que permite pasar solo la luz de longitud de onda correcta partes de la onda de luz se vuelven a combinar, la luz resultan te será
(líneas verdes). Aconunuaoón, la luz se refleja fuera de un liltro dicroico y a
más brillante si están en fase o menos brillante si están fuera de fase.
través del objetivo que la enfoca sobre la muestra La luz fluorescente emitida
La microscopia por contraste de fase es adec uada para la observación
por la muestra (líneas rojas) pasa a través del ob¡etivo. luego a través del espejo
dicroico y es enfocada y registrada sobre el detector en el plano de imagen. de células únicas o capas de células muy delgadas pero no para tejidos
gruesos. En particular es ütil para anal izar la localizació n y el movi-
miento de o rgánulos grandes en las célu las vivas.
La microsco pi a DI C se basa en la interferencia entre la luz pola-
El microscopio más simple visualiza las células bajo la óptica de rizada y es el método de elección para detalles extremada mente pe-
campo claro ( Fig. 9-Sb) y se puede observar poco detalle ( Fig. 9-9 ). Dos queños y objetos gruesos. El co ntraste se genera por diferencias en el
métodos comunes para tomar imágenes de células vivas y tejidos no índice de refracción del objeto y el medio que lo rodea. En la imagen
teñidos para generar contraste se basan en las diferencias en los índices DIC. el objeto parece em itir una sombra sobre un lado. La "sombra"
de refracción y el espesor de los materiales celulares. Estos métodos, representa principalm ente una di ferencia en el índice de refracción
denomina dos microscopia de contraste de fase)' microscopia de contraste de una muestra más que su topografía . La microscopia DIC define
por interferencia diferencial (DIC, differential-interference-contrast) (o con fa cilidad los bordes de los orgánulos grandes, como el núcleo
microscop io de interferencia de Nomarski ) producen imágenes que y las vacuolas. Además de tener un aspecto "relajado", una imagen
DIC es una sección óptica delgada, o lámina o loncha, a través del
difieren en apariencia y revelan diferentes características de la arqui-
tectura celular. La Figura 9-9 compara imágenes de células cultivadas objeto (Fig. 9-9, derecha). Así, los detalles del núcleo en las muestras
gruesas (p. ej., un gusano Caenorhabditis elegans intacto; véase la Fig.
vivas obtenidas por estos dos métodos y por microscopia de campo
21-3 1) se pueden observar en una serie de tales secciones ópticas, y la
claro estándar. Como los microscop ios ópticos son costosos, a menudo
estructura tridimensional del objeto se puede reconstrui r mediante
se los monta para que lleven a cabo diferentes tipos de microscopia en
combinac ión de las imágenes individuales de DIC.
el mismo microscop io (véase la Fig. 9-8a-d ).
Tanto la microscop ia por contraste de fase como la DIC se pueden
La microscop ia de contraste de fase genera una imagen en la cual
usar en microscopia a i11tervalos de tiempo, en la cual se fotografía la misma
el grado de oscuridad o brillantez de una región de la muestra depende

y oscuras alternadas. los detalles en foco y fuera de foco son proyectados de

FIGURA 9 _9 Las células vivas se pueden visualizar ~ediante técnicas de
contraste por Interferen cia. Estas m1croforo- forma simultánea en un microscopio de contraste de fase. En una imagen por
m1croscopla que gener
.
a" . . . d.
- 1 de macrófagos cultivadas,.vivas, v1sual1zadas me ,ante DIC. las células aparecen en un seudorrelreve. Debido a que solo se captura
graf1as muestran ce1u as
laro (izquierdo) microscopia por contraste de fase la imagen de una región lina en foco, una imagen DIC es una loncha óptica a
. . d .
m1croscop1a e campo c contraste por ·interferencia d1.ferenoal (DIC) (derecho). través del Objeto. (Cortes,a de N Watson, J Evan; )
• · d .
(cenero) y m1croscop1 a e
. de fase , las células estan rodeadas por bandas c1aras
En la imagen por contraste

9.2 Microscopia óptica: exploración de las estructu ras celulares y visualización de las proteínas... 407
 hematoxilina se une a los aminoácidos básicos (iisina y arginina)
célula a intervalos regulares de tiempo para generar una película. Este pro- , . en
muchas clases diferentes de protemas, mientras que 1a eosina se une
cedimiento permite al observador estudiar el movimiento celular, lo que
permite el control de la temperatura de la muestra y el ambiente adecuado. a las moléculas de tipo ácido (como el. DNA y las ca~enas laterales de
aspartato y glutamato). Debido a sus diferentes propiedades de unió
estos colorantes tiñen diversos tipos de células con suficiente diferen ~•
Las muestras se deben fijar, seccionar y teñir para . b) s· . Cia
para distinguirlas visualmente ( F1g. 9- l O . 1 una enzima cataliza una
obtener imágenes con detalles subcelulares reacción que produce un precipitado coloreado. o de alguna manera
Las células vivas y los tejidos en general carecen de compuestos que visible a partir de un precursor incoloro, 1a enzima se puede detectar
absorban la luz y por lo tanto son invisibles en un microscopio óptico. en secciones celulares mediante sus productos de reacción coloreados.
A pesar de que tales muestras se pueden visualizar mediante técnicas Tales técnicas de tinción, aunque alguna vez fueron bastante comunes
especiales recientemente descritas, estos métodos no revelan los deta- han sido reemplazadas en gran medida por otras técnicas para visuali:
lles finos de la estructura. zar proteínas particulares, como se describe a continuación.
Las muestras para la microscopia electrónica y óptica suelen fijarse
con una solución que contiene químicos que forman enlaces cruzados La microscopia de fluorescencia puede
entre la mayoría de las proteínas y los ácidos nucleicos. El formaldehí- localizar y cuantificar moléculas
do, un fijador común, entrecruza los grupos amino con moléculas ad- específicas en las células vivas
yacentes; estos enlaces covalentes estabilizan las interacciones proteína-
proteína y proteína-ácido nucleico y tornan insolubles y estables a las Tal vez la técnica más versátil y poderosa para localizar moléculas
moléculas para posteriores procedimientos. Después de la fijación, una dentro de una célula mediante microscopia óptica es la tinción fluo-
muestra de tejido para el examen por microscopia óptica se embebe rescente de células mediante microscopia de fluorescencia. Se dice que
en parafina y se la corta en secciones de alrededor de 50 µm de espesor un químico es fluorescente si absorbe luz a una longitud de onda (la
(Fig. 9-l Oa). Las células cultivadas que crecen sobre cubreobjetos de longitud de onda de excitación) y emite luz (fluoresce) a una longitud
vidrio, como se describió antes, son lo suficientemente delgadas como de onda específica y más larga. Los microscopios modernos para la ob-
para que puedan ser fijadas in situ y visualizarse por microscopia ópti- servación de muestras fluorescentes están configurados para pasar la
ca sin la necesidad de seccionarlas. luz de excitación a través del objetivo a una muestra y luego se observa
Un paso final en la preparación de una muestra para microscopia selectivamente la luz fluorescente emitida que regresa a través del ob-
óptica es teñirlas para visualizar las características principales de la cé- jetivo desde la muestra. Esto se logra mediante reflexión de la luz de
lula o el tejido. Muchos colorantes químicos se unen a las moléculas excitación sobre un tipo especial de filtro denominado espejo dicroico
que tienen características específicas. Por ejemplo, las muestras histo- dentro de la muestra, lo que permite que la luz emitida a la longitud de
lógicas suelen teñirse con hematoxilina y eosina ("tinción H&E"). La onda más larga llegue hasta el observador (véase la Fig. 9-Sd).

(a)
Contenedor
de la muestra Bloque Muestra

Micrótomo
Secciones

/ ~
~
Portaobjetos del microscopio
\~ Rejilla
con malla
de cobre

FIGURA 9-1 O Los tejidos para la microscopia óptica en general se fijan, que el bloque que contiene la muestre ha solidificado se lo coloca sobre el
se embeben en un medio sólido y se cortan en secciones delgadas. (a) soporte.de un micr· ótomo Yse cortan láminas con una' cuchilla. Los cortes de
Un tejido fijado es deshidratado al sumergirlo en una serie de soluciones de las seccione,
. típicas •
para microscopia . .ca son de 0.5 a 50 µm de espesor.
. opt1
agua y alcohol, finalizando con un solvente orgánico compatible con el medio .
Las secciones se colocan s0 bre portaobJetos o rejillas y se tiñen con un reactiVO
en el cual está embebido. Para incluir el tejido para su posterior secciona mien- adecuado. (b) Una secc ion . murino teñido con H&E. (Parte[bJ ~D<-
· de •intestino
to, el tejido se coloca en parafina liquida para microscopia óptica. Después de Gladden \NiHiWisuals Unlim,ted/Corbis.)

408 CAPÍTULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 rápidamente en la fracción de fura-2 que tiene un ion Ca'· unido)', por lo
tanto, en la concent ración de Ca1' citosólico ( Fig. lJ- 11 ).
Los colorantes íluorescentes ( p. ej., SN,\ RF- 1J que son ~cnsibles a
la co nce11tr,1ció 11 de H ' pueden ser usados de modo 5i m ilar para con-
trolar el pl-l citosó lico de las células vivas. O tras sondas útiles consisten
en un lluorocromo unido a una base débil que está solo pa rcialmente
protonado a pl-l neutro }' que puedl' permear libremente la5 membra-
nas celulares. Sin embargo, en orgánul os de tipo ,ícido, estas sondas se
tornan pro tonad,1s; debido a que estas sondas pro tonada, 110 pueden
volver a cruza r la membrana de los orgánu los, se arnmu la n e n el lumen
a concentraciones mucho mayores que en el citosol. 1\ sí, es te tipo de
coloran te fl uorescente puede ser usado para teíiir específicam ente mi-
tocondrias y lisosom as en las células vivas ( í'ig. 9- 12).

FIGURA EXPERIMENTAL 9-11 Fura-2, un fluorocromo sensible al Ca2+,

La microscopia de inmunofluorescencia puede
se puede utilizar para controlar las concentraciones relativas del ca2+
citosólico en diferentes regiones de las células vivas. :.:wcrc" [n "'' detectar proteínas específicas en células fijadas
leuco.: to e'l m ~ . '111ento ,e es,2:'lt'ce v1 g·.1J ,er.1t: de '- 1 · L.1, lOI' .-11111
Los cnlorantcs químico, comunes mencionados anteriormente ti r'ien áci-
c 1ont:s 'l l ,1') elevdCd~ .-erdc est,!'l en 1J P~1rte r-ostF-r10, :,. ~1 \.t .. J h.,nde , ..
oroducc•n la) \..O ....1:',JLL Ortt;:', COr! .... Jle-; \ 1a, 1..0'1\.t i 11.3\. H ··e, 111,1· t, IIJ" ,::i;-u ll dos nucleicos o clases amplias de proteínas, pero es mucho más informa-
t?,:an .-'1 la r1r 1e del.,,.,;e1<1 ce l., cei~,la ocnce ~·· rvojuc,:- '.1 í't'I r-..,.,.-a, .,. l ivo detectar l,1presencia y localización de proteínas especific,1s. Lc1 111icros-
el•.. la i1L t,na 1 ...Jt=rc:.:ra1 Cuana-:.. una orpeta llena, 011 m1.Jl1?( vict"- .. 1u11r1oláLi1 d' cnp111 d,· i111111111oj711()rcscc11cia es el método m.is am pliamente utilizado para
>e .:ol,Jca al ,ado ds: la .:t'·lula ;e ,nouce a e;,a a ,:: 'J' .! ,onct'n,rac, r ue L,l· · detectar proteínas específic:1s con un anticuerpo al cual se ha unido cova-
,1L.IT't•f I J niOrr'fr :,1nean1~n~e 1.ln tCKlO el .:nooia~r~ 11 , ~'-- ~stt.1t ,.le~ u· r Jti\·,
lcntemente un colo rante lluorescente. Para realizar esto, usted necesita pri -
cir3d1er :e F. gra,J r-·rite E-::.td o· .-r',lJ.J .... de 'TJ' E': ·u ::...it" 1 ·L-- .:: ... ~c-r
,.l l' j .... .ir
mero generar anticuerpos contra , u proteína especifica. Como se analiza
;__cru:· ··a( ,- ae (3 -- .j: ul ,;. ~nc .......... r trt?t·' -,,..-:·-- l .- ( ..... :.· :, ,•.,.~

~;·31,1 rn .:. r ' r.;c:.c ... c. in,r 0 g: c~ :.1':?,.......J. (' r , : . ~··

1 __ ..,.; ·, ,_ 1r1. , •
brevl'lllente en la Secc11H1 9.1 y en detaUe en el C.1prtulo 2.3, como parte de
f '-110 ;..,/;' ....~ "'~() , l '"\ 'ª ~·-- 3 pc::r·e r - ~ · t: r 1c .. -::.:. d ' ... 1
la respuesta a la infección del sistema 111munitario ele vertebrados se gene-
· 2S4: · ran proteína~ llamac.las ,1111icuerpos que se unen específicamente al agente

Determinación de las concentraciones de Ca 2 •

e H+ intracelulares con colorantes fluorescentes
sensibles a los iones
La concen tr ac ió n de Cae• o H · dentro de IJ, cd ula, viva; pui:de ,n
medida con l,1 Jl'uda de co lorantes flu oresccnt<.:,, o / l1,ororro111os, rnra
íluo re,cenci,1 <l;pendi: ele la co nci:ntracion e.le ntos 1onn. Lomo ,e·
analiza t'n lu~ ultimo; cJ pi tulu, , la; co ncent rac1u nn 1ntrJc<elulare; c.lc
c.1:- e H · ti r nl·n 1:fecto, p ro nunciado; l'l1 muchm procnm ll·lul.irn.
Po r ejemplo. muchJ; ho rmo nJ, )' u tro, e, 11mulo, L,1u, J n una d n .1c1011
en rl c a:- citu,ulico a pJrt ir ele la, concentrJuo nt', en rq >CJ'><J dndc
Jlrec.le<lor Jt' JIJ .\1 h-i; ta 10 ' .\ ! , lo cuJI inJutL' d ,,cr,.1, rt',pun t,1,
celulares com o la contrJcc"iu n m u,cular. . '·¡.
El colorante fluon:;cl'nte Jimi-2. ljU <.'. e, ,l·n,,bli: .11 <..i- ·, LtHllJc·nl· ( 111 '.
co grupo<; CJr boXJ•·Ja tu; qu e• forman unio11c, i:, tL'íl"' ,1111 d et.rn, 1I. l.l 1:,IL'1
. o fil,, .,· ,nu.:dc J 1funJ1 r,c Ji.:,J, d m,d ,., .1 tr,l\'n Lk
fu ra-_7 resu1tante e, l1p
. · ··ah:KiJ d111t l·noJrJi:l,1,,dul.1>. l k nlro del c1tm" I,
1a rnrm b rana p1asmJ 11 l
'd 1· a11 •·I :«ter fur •1-,- \'. r11r1Jduu.:n lu r.1 ~. u 11,1, gruJ' º ' e.i r
las estera!>as 111 ro 12 , , , ·
·¡ lib i i·
i niitilJ . ¡ 1 rn .ib :ul.1 ,_. l'"r lo 1.1111, ,, ,., 111, .q1.11
bOXJ atos res tornan 11 1 r •1 •
- ·lulars:, IJ•Jr cnd,·. pc-r1 11J11<:l,ll <:ll d crlll' "I. 1n
de cruzar Ia.s mem b ran,i, ce ·
. . J I . _. las· ·a· Ja mu l"culJ Je· (ur,1 ~ pu<ed,· 1111,r un 11111<" 1"11
e1 interior e as ce u , c.
1
. · • " lul 1r.:, btJ un11>n, qu, · ,., pr»p<1r--i1111.d .,
de Ca" pero no 01ros , a1 ionc5 '-0 ' · •
.. c.l e·· :- . t1J úlico l'll un ( l.:íl ll r,111~•·· 111o..rc·ml·llt.1 l.1 ,1i .. ,
la concentracro n e ,1 u ' FIGURA EXPERIMENTAL 9-12 Localización de los lisosomas y las mi-
. r: • ., iruJ Je ond.i J',lrtlLlJl.1r .\ un.1"·g1m, l.11, ,n
rescencta ele JUra-_1 a una 1o 11 e to condrias en una célula endotelial de arteria pulmonar bovina viva,
.·. J . fu ra- 1 .:, l.1 1111,rn.1yuc ,, .-,111, 1c-r.111111J11
gitud de onda la 1lu,, rcscci1Lta e - • cultivada. 1 - 1 , ••

' J 'cl· J , l i ·antid,id 1o1.d dt' tur,1 _ c'll un.1 rq!:"n

al Ca1' y apo rta un,1 me I a ~ • c. J.
·'•luhs c">>lllll1U,J lll.:n1,· en c·l m1,r<l,_.1p1<> e
e.le la célula. Al exarnrnar 1a, L L ' . . •
'I' .. ,·,'J•
• . ~ rapido, c·n J,1rdac1011 ,l,· l.1 tl1u\le,,c1k1.1
fluorescencia y medir 1,J, 1.,tnl 110 1 . .
/·1 ' ( ! 1 J,- , 1' .;,
· · . J 1• ,d~ ,.: pueden ..:u,1111 111c.1r lo, , .1111lir,"
de fura -2 a estas do, longitu l'S' " lll · '

9.í M1croscop1~ op11co1 explorac1t,n de l?.s ,•structurns celulares y v1sualizac1ón de las proteínas.. 409
 infeccioso. Los biólogos celulares han utilizado la respuesta inmunológica que emite luz verde. Cuando un complejo , Auoroc~~mo-anticuerpo se
para generar anticuerpos contra proteínas específicas. Considere que usted añade a una célula permeabilizada o secc1on de te¡1do, el complejo se
ha purificado la proteína X y luego la inyecta en un animal experimental de unirá al antígeno correspondiente, l~ego s_e hará _visi~le cuando sea ilu.
manera tal que responde a la proteína como una molécula ei.1raña. Duran- minado por la longitud de onda exotatona. La tmc1on de una muestra
te un período de semanas, el animal montará una respuesta inmunitaria y con diferentes colorantes que Auorescen a diferentes longitudes de onda
sintetizará anticuerpos contra la proteína X (el "antígeno"). Si usted reco- permite a múltiples proteínas, como también al DNA, ser localizados
lecta la sangre del animal, tendrá anticuerpos contra la proteína X mezcla- dentro de la misma célula (véase la figura de apertura del capítulo).
dos con los anticuerpos contra muchos otros diferentes antígenos, junto La variación más comúnmente utilizada de esta técnica se denomina
con todas las otras proteínas. Ahora usted puede unir covalentemente la 111 icroscopin de inm11noj111oresce11ci11 indirecta puesto que el anticuerpo
proteína X a una resina y, usando cromatografía de afinidad, unir y retener específico se detecta indirectamente. En esta técnica, un anticuerpo mo-
selectivamente solo aquellos anticuerpos específicos contra la proteína X. noclonal O policlonal se aplica a las células o a la sección de tejido fijada,
Los anticuerpos se pueden eluir desde la resina, y ahora usted tiene un seguido por un segundo anticuerpo marcado con Auorocromo que se
reactivo que se une específicamente a la proteína X. Este enfoque genera une al segmento constante ( Fe) del primero anticuerpo. Por ejemplo, se
1111ticuerpos polic/01111/es puesto que muchas células diferentes en el animal puede generar un "segundo" anticuerpo por inmunización de una cabra
han contribuido a los anticuerpos. Alternativamente, como se describió al con el segmento Fe que es común con todos los anticuerpos IgG de cone-
comienzo de este capitulo, es posible generar una línea celular clonal que jo; cuando estaba acoplada a un íluorocromo, esta segunda preparación
secreta anticuerpos contra un epítopo específico sobre la proteína X; estos de anticuerpo (denominada "anticuerpo de cabra anti-conejo") detec-
se denominan anticuerpos 111011oc/01111/es. tará cualquier anticuerpo de conejo usado para teñir el tejido o célula
Para usar cualquier tipo de anticuerpo para localizar la proteína, las ( Fig. 9- 13 ). Debido a que diversas moléculas de anticuerpo de cabra anti-
células o los tejidos primero se deben fijar para asegurar que todos los conejo pueden unirse a una única molécula de anticuerpo de conejo en
componentes permanezcan en el lugar y la célula permeabilizada le per- una sección, la fluorescencia suele ser mucho más brillante que si se usa
mita la entrada al anticuerpo, por lo general se realiza mediante incuba- directamente un único anticuerpo con Auorocromo acoplado. Esta téc-
ción de las células con un detergente no iónico o ell.1rayendo los lípidos nica suele ampliarse para realizar microscopia de fluoresce11ci11 doblemente
con un solvente orgánico. En una versión de la microscopia de inmu- 11111rcad11, en la cual se pueden visual izar dos proteínas simultáneas. Por
noAuorescencia, el anticuerpo se une covalentemente a un Auorocromo. ejemplo, ambas proteínas se pueden visualizar por microscopia de in-
En general los Auorocromos que se utilizan incluyen rodamina y rojo munoAuorescencia indirecta usando primero anticuerpos sintetizados
Texas, que emite luz roja; Cy3, que emite luz anaranjada, y Auoresceína, en diferentes animales (p. ej., conejo y pollo) y el segundo anticuerpo

11 Se prepara la muestra y se
coloca sobre un portaobjetos
del microscopio
.
/ \
Se incuba con el anticuerpo primario;
(

.• :.·' •·; ·
, ·,·. j
. .·.¡:·, ~ ). :¡~, ,: . / ;
Lámina
propia Membrana
lateral
Borde

lº se lava para eliminar los anticuerpos

no unidos
/ . ,, :' ' . ., Jl!J , .·_, 1.-~ I
" .. ,..J/'/ .' ./ ...,~-~ ' · .. "' I /
, I'_, ' ' ' / .- •. 1 · · 1
' •. /_,'
en cepillo

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• . •,

11 ·"
1 Se incuba con el anticuerpo secundario
conjugado con el fluorocromo; se lava
para eliminar el anticuerpo no unido

/ gg
\ - 11
Se monta la muestra y se observa
en el microscopio de fluorescencia ~
FIGURA 9- 13 Una proteína especifica se puede localizar en secciones
especializado y analizada en un m,croscopio de ,nmunoíluorescencia (paso ril
de tejido fijadas por microscopia de inmunoflurescencia indirecta. Para
l. En este e¡emplo, se tiño una sección de pared intestinal de rata con azul de
localizar una proteína por microscopia de inmunofluorescenc1a, una sección de Evans. la cual genera una íluorescenc1a roJa no especifica. y GLUT2. una proteína
tejido, o muestra de células. tiene que fijarse químicamente y tornar permeable transponadora de glucosa, se localizó por microscopia de inmunoíluorescenoa
a los anticuerpos (paso D). La muestra luego se incuba con un anticuerpo pri- 1nd irecra. Se observa que GLUT2 está presente en la región lateral y basal de
mario que se une específicamente al antígeno de interés y luego el anticuerpo las celulas inte st inales. pero está ausente en el borde en cepillo, compueSto
no unido se elimina por lavados (paso D). La muestra a continuación se incuba por m1crovellos1dades estrechamente empaquetadas sobre la superficie apical
con un anucuerpo secundario marcado con fluorocromo que se une específi- orientada hacia el lumen. Los capilares se extienden a través de la lámina propia.
camente al anticuerpo primario, y nuevamente el exceso de anticuerpo secun- un tejido conectivo laxo ubicado por debajo de la capa epitelial. 1B n,o,ens Y'"'
dario se elimina por lavados (paso 11). Luego la muestra se monta en un medio 199.J, Am J PJ-y;,o! 2S9:Cl79 cortes1oHJe e ·1noreris,

41 O CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 Faloidina ma rcada con rodamina
(fárma co conju_g ado con flu orocromo que
se une a los filamentos de actina , rojo)

Filamento de actina

Anticuerpos primarios (conejo, negro)

que reconocen los microtúbulos
Y los anticuer pos secundarios conjugados con
el fluorocromo (de cabra anti- conejo, verde)

FIG URA EXPERIMENTAL 9 - 14 La microscopia de fluorescencia doble-

mente marcada puede visualizar las distribuciones relativas de dos
proteínas. En la microscopia de fluorescencia doblemente marcada. cada
proteína tie ne que ser marcada específicamente con diferentes fluorocromos
El diagrama a la 1zqu1erda muestra cómo se puede realiza, esto una célu la cul·
11vada se fi¡ó y permeabil,zó y luego incubó con fal oid, na ma,cada con rodam,-
na. un reactivo que se une específicamente a los filamentos de acuna Tamb1en
se incubó con anticuerpos de conejo contra tubulina. el principal componente
de los m,crotúbulos. seguido por un segundo anticuerpo de cabra anucone¡o
marcado con fluoresceina (1zqu1erda) y arnna teñida con roda mina (de,echa) y
en e l panel inferior se v1suahzan imágenes fusionadas electrónicamente 1Pane
jdc-rr-rhal cortes.ta de A B1ei~cher

(p. ej., anticonejo e n cabra y an tipo llo en oveja ) ma rcado con diferentes neam ente se ciclan para formar un crom óforo que fluoresce en verde
fluorocromos. En otra variación se p uede visualizar una pro teína por cuando se lo ilumi na con luz azu l. Usa nd o tecnologías de DNA recom-
microscopia de inmunofluorescencia indirecta y la segunda proteína binante es posible construir u n DNA en el cual la secuenc ia codificada
m edian te un colora nte que se une específicamente a él. Un a vez que se de PFV esté fu sio nada a la secuenc ia codificante de una proteína de in -
toman las imágen es individuales en el microscopio de fluorescencia, se terés. Cuando se la introduce y se expresa en las células, se sintetiza un a
puede n generar sus imágenes electrónicamente ( Fig. 9- 14 ). PFV " marcada" en la cua l la prote ína de inte rés está unida en forma co-
En otra versión de esta tecnología ampliamente utilizad a se emplean valente a la PFV como parte del mismo polipéptido. Aunque la PFV es
técnicas de biología m o lecular para sintetizar cDNA que codifica una una prote ína de tamaño moderado, la func ió n de la pro teína d e interés
proteína recombinante a la cual está fusio nada una secuencia corta de no suele cambiar al ser fusio nada a la PFV. Esto per mite vis ual iza r a la
aminoácidos llamada marcación con epítopo. C uando este c DNA se ex- PFV y, en consec ue ncia, la proteín a de inte rt's. No so lo se puede vis ua -
prese en las células generará la proteína unida a una m arca específica. lizar de inmediato la localizació n de la p ro teína marcada con PFV, s ino
Dos epítopos que s uelen utilizarse son FLAG, que codifi ca la secuencia qu e se p uede ver su distribu ció n e n una célula viva con el transcurso
aminoacídica DYKDDDDK (código de una letra ), y myc, que codifica la del ti empo)', po r lo tanto, an alizJT s u din,ímica o seguir s u lo calizac ió n
secuencia EQKLISEEDL Los antic uerpos monoclo nales acoplados con despu és de diversos tra tamientos cclularr, . La s imple idea de marcar
fluorocromos a los epítopos FLAG o myc com erciales se pueden usar pro teínas es pecíficas co n l'FV h,1 revo lucionado la biolo gía celular y
para detectar la proteína recombinante en la célula . En una extensió n llevó a l desar roll o de muchas proteínas llu o resce ntes dife rentes ( Fig.
de esta tecnología para permitir la vis ualizació n de dos p roteínas, una <J . 15 ). Un uso ck e,ta variedad colo rida d e pmtcínas fluo rescentes per-

proteína se puede m arcar con FLAG y o tra proteína difere nte con myc. mite que se pued a n vis ua liz,ir d os o más proteín as d e m a nera simult,í -
Cada proteín a marcada luego es visualizada con un colo r diferente, po r nea si c,1da una e, ma rcada co n una prot eí na flu o rescente de difere nte
ejemplo, con un anticuerpo marcado con rodam ina ~a rad e pítopo myc color. En las últimas secciones se descri b irá n técnicas adicionales que
y un anticue rpo marcado con fluoresceína para d epilo po FLAG. aprovec han el uso de las proteín as flu o rescen tes.

La marcación con proteínas fluorescentes La microscopia confocal y de desconvolución

permite la visualización de proteínas amplifica la vi sualización de objetos fluorescentes
tridimensionales
específicas en células vivas
La medusa Aequorea victoria expresa una pro teína fluorescente na tura l, La m icroscopia fluorescent e co nven cional ti ene dos princ ipa les li mi -
llamada proteína fluorescente 11erde (PFV, -27 k D). La PFV contie ne u~a ta ciones. Prim ero, la luz flu o rescente emitida po r una muestra no solo
secuenc ia d e serina, tiro sina y glicina c uyas cadenas lat era les espa nta- p rov ie ne del p la n o d e foco sino ta mbié n d e las moléculas p o r e n cim a y

• ...
· d e 1as p rote1nas
9.2 Microsco pia óptica: exploració n de las estructuras celulares y visua1·12 a c1·on 411
{a)
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FIGURA 9-15 En la actualidad se dispone de muchos colores diferentes pl,K,1 rlP aoar paI a mostrar las bc1ctenas c¡ue proliferan Y expresan d1ve11a1
de proteínas fluorescentes. (a) Los tubos muestran la em1s1ón de colores y pIoteInas con colorPs fluorcscentPI d1ferentrs IR 11, ·n
nombres de muchas proteInas fluorescentes diferentes, 1· (b) se ilumina unJ

por debajo de él; así, el observador ve una imagen bo rrosa causada por ció11 tridim ensiona l de alta reso lu ción. Ambos métodos requieren que
la superposición de imágenes fluorescentes de las moléculas a muchas la imagen sea ob ten ida electrónicamente de manera tal que se la pueda
profundidades en la célula. El efecto difuminado torna di fic ultosa la manipular median le ordenador en la medida de lo necesario.
determinació n de las disposicione, molernlares reales. Segu ndo, para La primera técnica se denom ina 111icroscopin de desco11vo/11ció11, que
visualizar muestras de mayor espesor se deben obtener imágenes con- utiliza métodos computarizados para eliminar la fluorescencia aporta-
secutivas (seriadas) a diversas profundidades a través de la muestra y da por las partes íucra de foco de la muestra. Considere una muestra
luego alinearlas para reconstru ir estructuras en el tej ido gru eso origi- tr idimensional en la cual se registran imágenes de tres planos focales
nal. Se han desarrollado dos técnicas generales para obtener informa- diferentes. Debido a que se ilum in a la muestra entera, la imagen del

FIGURA EXPERIMENTAL 9-16 La microscopia de fluorescencia por largo de tOdd IQ eélula sr, ff•comb1naron en tre, d1mensIones (a) En esta recons·
1
desconvolución produce secciones ópticas de alta resolución que 1ruccIon Ir1d1mens,on,,I de las Imagenes en br uto, e DNA, los m1crotúbulo5_Y ª
pueden ser reconstruidas en una imagen tridimensional. Un macrófago • •
act1n,, dparecen corno LOnc1s difusas en la celulr1 (b) Despues de 1a a plicacron
..
1
se tiñó con rearnvos marcados con íluorocromo específicos para DNA (azul), clel dlgoritmo ele cfesconvoluc1ón a las Imagcnes. se torno rápidamente visib e
rnicrotúbulos (verde) y m1crofilamentos de arnna (roIO). Las seri es de Imaqenes •
la organ,zacIon fibrila, de los m,crotC1bulos y la localización de la aet1n
a en Ias
fluorescentes obtenidas en planos focales consecutivos (secciones op1 1cas) a lo adhes,onts (úf' ... 'ild :1(• J [, ln\ /Jl 11tf-hf>dcl lm tilll!(•

412 CAPÍTULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

plano 2 contendd fl uorescencia fuera de foco de los planos ¡ y 3. Si se de la profundidad vertical de la muest ra, se puede generar una re pre-
conoce con exactitud cómo los planos I y 3 contribuyen con la fluores- sentación tridimensional por computación. En la actualidad se utili-
cencia fuera de foco a la luz recolectada po r el plano 2, se la podría eli- zan dos tipos de microscopios confocales, un microscopio confocal
minar mediante técnicas info rmáticas. Para obtener esta info rmación de barrido (también conocido como microscopio confocal de escáner
para un microscopio particular se obtiene una serie de imágenes de con láser, o LSCM l lascr-scn1111i11g confocnl 111icroscope]) y un micros-
los planos focales a partir de un po rtaobjetos de prueba que contiene copio con focal de disco giratorio. La idea detrás de cada microscopio
diminutas esferas fluorescentes. Cada esfera representa un puntito de es la de iluminar y recolecta r la luz fl uorescente emitida en solo una
luz que se torna un objeto borroso fuera de su plano focal; a partir de zona del plano focal en cada momento, de tal forma q ue se excluya
estas imáge nes se determina una fun ción de dispersión puntual que Je la luz fuera de foco. Esto se puede lograr al recolectar la luz emitida a
permite al investigador calcular la distribució n de fuentes puntuales través de un colimador antes de que alcance el detector-luz del plano
de fluorescencia que contribuyen al "desenfoque borroso". Al tener el focal que pasa a través, mientras q ue la luz de los otros planos foca-
microscopio calibrado de esta manera, la serie experimental de imáge- les se excluye en gran medida-. La zona iluminada luego es movida
nes se puede desconvolucionar por técnicas informáticas. Las imágenes a través del plano focal para construir la imagen elect rón icamente.
restauradas por desconvolución muestran un detalle impresionante sin Los dos tipos de microscopio difieren en cómo recorren la imagen. El
borrosidad, como se ilustra en la Figura 9- 16. microscopio de barrido con láser usa una fuente de luz láser puntual
La segunda técnica para obtener informació n tridimensional se en un patró n de barrido, con la flu orescencia emitida recolectada por
deno mina microscopia confocal debido a que usa métodos ópticos un tubo fotomultiplicador y, por lo tanto, se construye una imagen
para obtener imágenes de un plano focal específi co y excluir la luz de ( f-ig. 9- l 7a). A continuación, se puede tomar una serie de imágenes
otros planos. Al recolectar una serie de imáge nes enfocadas a través a diferentes profundidades en la muestra para generar una recons-

(a) Microscopio confocal de barrido láser (b) Microscopio confocal de disco giratorio
Lás eres

Unidad de la cabeza de disco giratorio

Espejo í Disposición Disposición Rayo

-
de los o rificios / de las láser
de barrido, Plano - - • dim inutos m icrolentes
Plano diseminado

+E::=>
1
dimensión y Tubo de imagen
de imagen \ fotomultiplicador ' Rotación
Lentes de - ~ 1~..-ii!~ +-
1 -+\o ."'t-_ _ . , Lentes_~e
1 proyecc1on
proyección \
Orificios diminutos Es pejo - -
Espe jo-!- - removible
removible % spejo de barrido,
dimensión x
Lentes J_
Unidad de la cabeza
objetivo
de barrido

Muestra V ~I Cámara digital

Muestra
muy sensible

7
, ©
L- -
n,
__ 1
Computadora Computadora

. d ra dos tipos de microsco- punto ilum1n~do en el r:ilano foc~I Una computadora luego 1nco1pora e,tas
FIGURA 9-17 Las trayectorias e 1ª 1uz pa d señales y reconstruye la imagen El diagrama en (bl describe el rt->corr1clo de la
_ d microscopia se ensamblan alrededor e un
pia confocal. Ambos tipos _ e . nal (sombreado amarillo). El diagrama luz en un rn1croscop10 confocal de disco giratorio. Aquí, en lugar de utilizar dos
microscopio de fluorescenoa convenoo - oscopio confocal de barrido espPJOS de barrido. el haz proveniente del láser es diseminado para enfocar
. .d de la luz en un m1cr
en (a) descnbe el recorri O _ d d da de la luz de un láser apropiado es sobre los orif1Cios dirninuws en un disco giratorio. La luz de exrnac1ón pasa a
láser. Un único punto de longitu e obn en dos espeJOSde barrido y desde través del objetivo y proporciona ilurn1ndC1ón puntual de una cierta cantidad
. d 1 ·o d1cro1co y re ota de puntos en la muestra La íluorescenc1a ern111da pasa a uavés del objetivo, a
reflejado fuera e espej _ nto en la muestra. Los espejos de
- - a iluminar un pu través de los or1fioos en el disco 91rator10 y luego rebota en una cámara d1gnal
allí a través del objetivo P_ar , hacia delante de tal forma que la luz barre
barrido se balancean hacia atras Y uestra) La fluoresceno;i emitida sensible. Los orificios d1rn1nutos en el disco están dispuestos de tal manera que.
lí s verdes en Ia m "medida que giran, ráp1darnen1e iluminan todas las partes de la muestra varias
la muestra (véanse 1as nea . del objetivo y rebota en los espejos
por la muestra pasa de regreso ª tra~~s ermite que la luz pase a través hilcia veces Corno el d1~co gira ráp1d¡,rnente, por eJemplo a 3 000 rpm, se pueden
• - dicroico. c:..,to P registrar acontecimientos rnuy dinámicos en las células vivas
de barrido sobre e1espej0 d planos focales fuera de foco, por lo
.. cluye la luz e Ios
la rendiJa. Esta rend1ja ex . 1 dor proviene casi exclusivamente del
tanto la luz que alcanza el fotomultip ica

9.2 Microscopia óptica: exploración de las estructuras celulares y visualización de las proteínas... 413
 (a ) Mic roscopia de fluorescencia conve ncional (b ) Microscopia de fluo rescencia confocal
Kfn~1t';fl
,'1'j,-¡ J.~

-~~ -~-· .~ :..

40 µ,m
1

Plano foca l Plano focal - ~ - Volumen de

~ la imagen

FIGURA 9-18 La microscopia confocal produce una sección óptica enfo- debe a que se detecta la fluorescencia de fondo de la tubulina que se encuen-
cada a través de células gruesas. Un huevo fecundado mitótico de un erizo tra por encima y por debajo del plano foca l como se esquematiza en el dibujo.
de mar (Psammechinus) se lisó con un detergente. se expuso a un anticuerpo (b) La imagen microscópica confocal es más nítida. en particular en el centro
con antitubulina y luego se expuso a un anticuerpo marcado con fluoresceína del huso m1tótico. En este caso. la fluorescencia es detectada solo a partir de las
que se une al anticuerpo antitubulina. (a) Cuando se visualiza mediante mi- moléculas que se encuentran en el plano foca l. generando una sección óptica
croscopia de fluorescencia convencional. el huso mitónco está borroso. Esto se muy delgada.(M,crofotograf,as de J G. Wh11e y cols. 1987. J. Ce// 8101 104:41J

trucción tridimensional. Un microscopio confocal de barrido puede sobre 20 000 orificios diminutos en el segundo disco. Los orificios están
aportar imágenes con una resolución excepcionalmente alta, tanto dispuestos de tal forma que pueden escanear completamente el plano
bidimensional como tridimensional ( Fig. 9 - 18 ), aunque tiene dos focal de la muestra varias veces con cada vuelta del disco. La luz fluo-
limitaciones menores. Primero, requiere un tiempo considerable es- rescente emitida regresa a través de los orificios del segundo disco y es
canear cada plano focal, por lo tanto, si se está tomando la imagen de reflejada por un espejo dicroico y enfocada sobre una cámara digital de
un proceso dinámico, el microscopio puede no ser capaz de obtener alta sensibilidad. De esta forma, la muestra es escaneada en menos de
las imágenes lo suficientemente rápido como para segui r la dinámica. un milisegundo y, por ende, se puede capturar incluso la localización
Segundo, se ilumina cada punto co n luz láser intensa que puede blan- en tiempo real del informador fl uorescente si es altamente dinámico
quear al fl uorocromo del que se está tomando la imagen y, por ende, (Fig. 9- 19). Una limitación actual de un microscopio de disco girato-
limita el número de imágenes que se puede obtener. rio es que el tamaño de los orificios es fijo y tiene que coincidir con el
El microscopio confocal de disco giratorio elude estos dos proble- aumento del objetivo, por lo tanto, en general está configurado para
mas (véase la Fig. 9-176 ). La luz de excitación de un láser se disemina ser usado con un objetivo 63x o IOOx y es menos útil para imágenes
e ilumina una pequeña parte del disco giratorio a alta velocidad, por de menor aumento que podría ser necesario para secciones tisulares.
ejemplo a 3 000 rpm. El disco en realidad consiste en dos discos uni- Así, los microscopios confocales de barrido y de disco giratorio tienen
dos: uno con 20 000 lentes que enfocan en forma precisa la luz láser ventajas que se superponen y se complementan.

(iJ VIDEO: Dinám ica de los microtúbulos en levadura s en fisión

FIGURA EXPERIMENTAL 9-19 Se pueden obtener las dinámicas de los mas de una película de tubulina-PFV en dos de las células con forma de bastón
microtúbulos sobre el microscopio confocal de disco giratorio. Seis to- de las levaduras. [Cor1esia de Fred Chang ¡

414 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

(a ) Luz e mitida (b)

A
Rayo de excitación - - --1.:::,_--1

La reflexión interna en
la inte rfase vidrio-agua
genera onda evanescente Aceite de inmersión

Cubreobjetos Onda evanescente,

profundidad de
Muestra e n agua iluminación 50-100 nm

Portaobjeto
del microscopio
> MTTIRF

FIGURA EXPERIMENTAL 9· 20 Se pueden tomar imágenes de las mues-

tras fluorescentes en un plano focal restringido mediante microscopia
por reflexión interna total (TIRF). (a) En la m,croscop,a TIRF solo se tlum,nan
alrededor de 50 a l 00 nm adyacentes al cubreob¡etos por lo que las molccu
las íl uorescentes en el resto de la muestra no son exrnadas Esta tlum1nac1on
limitada es alcanzada d1rig1endo la luz en un ángulo tal que esta se reílC'JC' a
partir de lil interfase v1dr10-agua del cubreobjetos en lugar de pas;ir a través de
él Mientr as más luz se reíle¡a. también se genera una reg,on muy pequeri a dC'
1luminac1ón llamada onda evanescente (mostrada en celeste). (b) La m1c1osco
p,a de 1nmunoíluorcscenc1a con antic uerpo an11tubulina se ha utilizado para v1 TIRF
sual,za r m1crotubulos por microscopia de íluorescenc1a convencional (recuad10
superior), TIRF (recuadro del centro) y una imagen combinada ~e obtuvieron
las dos imágenes y se las coloreó en forma falsa de ro¡o y verde de manera tal
que la comb1 nac1on resaltara entre los m1crotubulos que estan cerca del cubre-
ob¡etos (verde) Pd/1 0 r º" 1 P, ,,,-.ne, .. , (01' : JlO l• r 191 : ,,

¡_____J

La microscopia TIRF proporciona una imagen 5µm

excepcional en un solo plano focal

Los microsco pio s confocales recientemente descritm proporcionan
imágenes sorprendentes e informativas. Sin embargo, no ,on perfecto, , excepcional para la iJ,:ntifica..:iún ele ,:stru..:tur,1s en l,t base de las célula,
y algu nas situaciones experimentales req uieren imágenes fluorc·, centes )', por ende, cerca del cuhreobjc·los ( Fiµ. ') 21lb) )' para la medición de
en un plano focal delgado adyacen te a una superficie. Por ejemplo, la las cinéticas del ensamhlaj,· y dcse11sa111bl,1jc· dt> l.1s estructuras rn mo
imagen co nfocal no es ideal para explorar los detalles de las proteína, lo, micrutúhulos y los filamento, ck a, tin.t ( ,·eansc· los l ·11"- 17 )' ¡ ¡,; ).
en sitios de adhesión entre un a célula y un cubreobjt:tos o para seguir la
cinética del ensamblado de microtúbulos adheridos a un cubn:objetos. FRAP revela la dinámica
Se pueden obtener imágenes de a lta sensibilidad de ambas situaciones de los componentes celulares
usando microscopia de J1uor1:scm cia por reflexión 111tema towl (TIRE
total interna/ rcflc.:tio 11 Jl11orcscence). En la configuración más común La, imágcnc, íluo n·,c(·Jltl's de cdul.i, viv.t, r,·wla la llK,1 li1,icio n )' las
de Ja microscopia TIRE d haz de luz de cxci1ación provii:nc tk las lrn · dinámic,ts ccntrJle, de la, pohl.t.:ionn (k mokllil,1, lluorc•sn· nll's. pero
- - (" . ') >0-i) s ,·11 emba rgo,.el ángulo al cual l.1 Ju, llega al
tes o b¡e11vo ,·1µ. · - • •
i:,
no JKe nad.1,1ccr..:.1 ck 1.ó1110 la d111,in11c.1 individu al ele- las mo ll.'c ula, .
- · st• a un ángulo crítico de.' manera tal. que l,1 lu7 ,e.1 Por i:jcmpln, ,i w mo, <)ll!' un a pro tc·1n,1 111ar..:.1cl,t cnn PF\' forma una
cu breo b¡etos se a¡ u •1 . . •
reflejada fue ra del cubreo bjetos y regrese a traves del oh¡ct_1vo. Es to ge· nunchJ en b superfic1c de· un.1 co:lula, ¿rcprc·sent,1 esto un conj u nto
nera una banda estrecha, llamada onda e1·anc,cc11tc, que il11mtna solo e,tahlc de moll'cula, de pro1 e1na fluore~ccn tes que ,:nt ran y s<1lcn dt·
alrededor de 50 a 100 nm de la muestra adyacente al cubreobjetos, , in la manchai Se puc.: dc inws tig.ir ,·,ta rn est1ó n al observar las din.ímicas
·
¡¡ ummac1 ·, d ¡ ·t de la muestra. Por lo tanto, si usted tiene una J.: las 11101<.'cula~ ,:n l.1 nrnnch,1 ( 1 1~. 11 2 1 ). ~¡ utilizamos moléculas de
on e res o ·
· d •tructuras fluorescentes en una muestra, en el mi - alta intensidad para bb nqucar el fluorocromo (¡, . e¡·.. l'F·\/ ) ,o • Jo en I·,1
mezc 1a comp 1c¡a e es
encuent ran cntrcSO)' 100nm mancha, in1cialment.: no habr.1 flu orescenc ia proveniente de él ya pa-
croscop1·0 •riRf· ver,á so loaquellasqucse .
e un m icrotúbulo ) del c:ubreoh¡etos. Cuando recerá oscuro en d m icroscopio de fluorescencia. Sin embargo, si los
(2 a 4 veces e 1 es pesor d . . __
·¡ ¡ 1· sobre un cubreob¡etos, TIRF tiene una u11hdad compo nentes en la manch,1 c~1;ín en equilibrio dinámico con ¡,15 molt'.·-
1as ce u as se cu u van

1 n d e ¡as prote1nas
9.2 Microscop1a óptica: exploración de las estructuras celulares y visualizac·ó • .._
415
 (a) .. el t iempo en la ROi
Blanquedado de una Seguimiento de la recuperaci on en ► Tiempo
región de interés
Preblanqueado pequeña (ROi)

• 1 • • • ••••
Posblanqueado
• - • 1 •
t=30,16S

(e)

"'
"ü
e
(1)
(.)
0,8
"'
(1)

o... -o
"'
:::, "'
;:¡:: .!:: 0,6
-"'-E"'
(1)
-o ...
-o o
"'e 0,4
-o
·¡¡;
e
~
e 0,2

-5 o 5 10 15 20 25 30

t
Blanqueado
Tiempo normalizado (s)

FIGURA EXPERIMENTAL 9-2 1 La recuperación de la fluorescencia restauración de la íluorescenc1a a la región representa las moléculas que no se
después del fotoblanqueamiento (FRAP) revela las dinámicas de las blanquearon y se movieron dentro de la ROi. (b) La movilidad de los receptores
moléculas. En una célula viva, el seguimiento de la distribución de una de serotonina-PFV sobre la superficie celular se observó usando FRAP. Se sigue
proteína marcada con PFV proporciona una visión de la distribución general la fluorescencia en dos regiones - una que está blanqueada (región l) y una
de la proteína, pero no dice nada acerca de cómo podrían ser las poblaciones región control que no lo está (región 2)- . (r) Al cuantificar la recuperación.
dinámicas de las moléculas individuales. Esto se puede determinar por FRAP. se pueden establecer las rrop1ecJades d1nárnicas del receptor de serotonina.
(a) En esta técnica, la señal PFV esta blanqueada por un pulso breve de luz láser (Pa11t? lbl dr• ~ t:,1hp,,tr1.:ipu, XXJ/, Mt-ml,r,H lt' O r9<Jrt1/rl llOn ..m <J üyrh.lrrnc s o f the ~ ·rotornn IA Rc.< eplDl

fuerte enfocada sobre la región de interés (ROi). Esto rápidamente blanquea t·.A<>r1110 1c1.l u•.1nq l luúff'',r 1·r\C r· MK re,-.., op,, Appr<MCht•,. (•ll w ,otonlfl HeceptoH in NeurotJiology, A

las moléculas de manera irreversible; por ende, no se detectan nuevamente. La Ct1dl!OfJ11dhydy, r·d ( H( r,f(••.~ ¡

culas sin blanquear, la fluorescencia comenzará a retornar. La velocidad FRET mide la distancia entre los cromóforos
de recuperación de la fluorescencia es una medida de la dinámica de
las moléculas. Esta técnica, conocida como recuperación de la fluores- La microscopia de fluorescencia también se puede utilizar para ~e-
cencia posterior al fotoblanqueamiento (FRAP,fluorescence recovery after terminar si dos proteínas interactúan in vivo empleando una té~:
photobleaching), ha revelado cuán dinámicos son muchos de los com- llamada transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET, for
ponentes en las células. Por ejemplo, se ha utili1.ado para determinar ter resonance energy transfer). Esta técnica utiliza dos protelnas fluo·
el coeficiente de difusión de las proteínas de membrana (véase la Fig. rescentes en las cuales la longitud de onda de emisión de la prirne~
J 0- 1O), las dinámicas de componentes específicos de la vía secretora. es la misma que la longitud de onda de excitación de la segunda (Fig,

416 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de célula s

(a ) FIGURA 9-22 Las interacciones proteína-proteína se pueden visuali-
zar por FRET. La idea detrás de FRCT es utrlrzar dos proteínas fluorescentes

y
440 nm 480 nm 440 nm 535 n m
diferentes de rnanerd tal que cuando un,1 se exrna, su ern1s1ón Pxrnará a la

~ /
YFP ("
,PlJu11da proteína fluorescente lo que probar,i que se encuentran lo suhc1en
ternentL-' ce1ca (recuadro suprrior) En este e¡ernplo, la proteína fluorescente

,y? -- ~ ¡ ;PFRET turquesa (CFP, cyan nuore5eent protein) se fusiona a la proteína X, la proteína
fluorescente amarillo (YPr. yellow fluoreKent protem) se fusiona a la prote1na Y,
y ambas proteínas se ¡,xpresan en una célula viva S1 la celula se ilumina ahora
con luz a 440 n111. la CFP em1tuá una se(1al fluorPscente a 480 nrn S1 YH-' no está
(b) cerca. no absorberá la luz 480 nrn y no s<' ern1wá luz a 53S nrn Sin embargo, s1
la proteína X 1nteractua con la proteína Y (corno se muestra). traerá a CíP cerca
de YFP. la luz em1t1da a 480 nm será capturada por vrP y ésta emitirá luz a S35
nm (b) [n L'S te fibroblasto, rRET se ha utilizado para revelar que la 1nteracc1ón
entre una proteína reguladora activa (Rae) y su patrón ele unión se localiza en
la parte del,mtera ele la celula en m1grac1011 !Parle lb) O•' I! ,. Sel ,11 y Perr,,,,,111,y /OOJ J
f 1/ lJivt 160:o)Q 1

por lo tanto muy sensible a los cam bios pequeños en distancia y, en

la pdctica, no es detecta ble a > 10 nm-. Asi, al iluminar una muestra
apropiada con luz a 440 nm y observa rla a 535 nm, se puede decir si las
proteínas marcadas con CFP e YFP se encuentran en una proximidad
10 p m muy cercana. Por ejemplo, los sensores de FRET ha n sido desarrolla-
dos para determinar dónde se produce la señalizació n celular entre una
proteína de unió n a GTP y su efector (Fig. 9-226).
9-22 ). Por ejemplo, cuando la proteína fluo rescente turquesa (CFP, Una versión modificada de esta técnica se puede usar para medi r
cyan J111oresce11t protei11) es excitada con luz de longitud de o nda de 440 los cambios conformacionales en una proteína. Por ejemplo, se ha dise-
nm, fluoresce y emite luz a 480 nm. Si la proteína fluorescente amarilla ñado un sensor llamado cameleón para medir la concentración de Ca''
(YFP, ye/low J111oresce11t protei11) está en las cercanías, absorberá la luz intracelular. Cameleón consiste en un único polipéptido que contiene
de 480 nm y emitirá a 535 nm. La eficiencia de transferencia de energía CFP e YFP unidos por una pieza de polipéptido capaz de unir Ca''
es proporcional a R-6, donde Res la d istancia entre los fl uoróforos -es (Fig. 9-23a ). En ausencia de Ca1 ' , la Cf P y la YFP no se encuentran lo

FIGURA EXPERIMENTAL 9-23 Los biosensores FRET detectan los

(a)
480 nm ambientes bioquímicos locales. (a) Un b1osensor de FRET es una prote1na
de fu11on que contiene dos proteínas fluorescentes umdas por una reg,on
Calmodulina sens1t1va al Jmb,ente en l'Stud,o En e,te e¡emplo, una construcc,on llamada
YFP camt>leon comiste en CFP urnda a YFP mediante una secuencia b~1ada en la
protr·iria CJlmodulir1J r¡ue suÍll' un 9r<1n cJmb10 conformJc1onal cuJndo une
(d' · l n Ju1Pnc1a dP CJ·' ', IJ1 dos proteínas est.:in lo suficientemente sep.ir adJs
p-,r,1 L•.(perirn('ntar r-11[ 1, m,entr.is que cuando se incr('mt'nta 1,1conccntrac,un
10< JI de C,,-''. estJ, ,,, ¡untJn lo suf1C1cntr como pJ1.i t•,¡)t'r1mentar FREl lb)
Un c·wrnplo cJr•I u,o cJC' c,11 neleon rPvela la osc,lac,on l'n IJs , 011cen1r <l, 1onPs
loc"l(•S de ( ,,, 'en ,•1 ,·xtrc-1110 ele un<l r.i,1 d,• Arob:c/op111en Lr('c1m1ento , ., ,,. ,.,
d •· !'. t.' .)1 l ,1,., , .'-j,◄ , H•I l'r I 147; 1,,• • 1• •~

- 125 15s 24 s
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-· 51 s 54s 69s 81s "

39 s
~~ ;··\·
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9.2 Microscopia óptica: exploración de las estructuras celulares y visualización de las proteínas ... 417
suficientemente cerca para que se produzca la FRET. Sin embargo, en cuales se denomin,1 111icrMcop1n de locnlizació11 fotonwmrla / PALM
presencia de una concentració n local adecuada de Ca 1 ', el camcleón pl,oto-nctil'lltcd /ocnli:11rio11 ,111crosrop)'). Se basan en la capacidad d:
se une al Ca1•y experimenta un cambio conformacional que acerca una variante de PFV para ser fotoactivada; es decir, solo se torna íluo.
a CFP y a YFP en una proximidad cercana para que se produzca la rcsccnte cuando es activado por una longitud de onda de luz especí-
¡:RET. Los sensores tales como camelcón se pueden usar para medir la fica, diferente de su longitud de onda de excitación. Considere Jo que
co ncentración de Ca1 ' en las células vivas, por ejemplo en la punt a de sucedería si usted pudiera activa r solo una molécula de PFY. Cuando
una raíz en crecimiento (Fig. 9-2Jh). Los investigadores creat ivos estfo se excita la muestra, la PFV activada podría em it ir muchos cientos de
desarrollando sensores FRET para iluminar muchos tipos diferentes de fotones. lo que originaria una distribución de Gauss (1'1¡.:. 9-2-la). ,\un.
ambientes loca les; por ejemplo, es posible hacer una sonda que experi - que el análisis de cada fotón no dice con precisión dónde se encuentra
mente FRET solo cuando es fosfor ibda por una cinasa específica)', <le la PFV, el centro de la espiga puede informarle dónde se localiza la PFV
esta forma, revelar dónde se localiza la cinasa activa en la célula. con precisión nanométrica . Si usted ahora activa otra PFV, puede loca-
lizarla individualmente con la misma precisión. En PA LM se activa un
pequeño porcentaje de las PFV y cad,1 una puede ser localizada indivi-
La microscopia de superresolución puede localizar dualmente con alta precisión, y desp ués se activa y localiza otro grupo,
y así, con el registro de ciclos adicionales de activación y localización,
proteínas de hasta el nanómetro de precisión
se obtiene una imagen de alt,1 resolución. Por ejemplo, la distribución
Como se mencionó al comienzo, el límite de resolución teórico de la tridimensional de los microtúbulos se puede visualizar con mucha ma-
microscopia de fluorescencia es de alrededor de 0,2 µm (200 nm ). Para yor claridad que con cualquier otro método de microscopia óptica (Fig.
comprender por qué esto es así, considere dos estructuras flu orescentes 9-2.J h) y se puede visualizar con notable detalle una fos ita recubierta
separadas por 100 nm. Cuando usted trata de imaginarlas, cada una con clatrina -de alrededor de 100 11111 de diámetro (Fig. 9- 2-lc)-. Estos
de ellas genera una distribución gaussiana de la fluorescencia, la cual tipos de imágenes pueden requerir hasta una hora para generase, por
se superpone de tal forma que parecen ser una sola estructura. Se han lo tanto se restringen a imágenes fijadas y en la actualidad no se pueden
desarrollado nuevos métodos para resolver este problema, uno de los usar para imágenes de proteínas en células vivas.

(a ) FIGURA EXPERIMENTAL 9-24 La microscopia de superresolución puede generar

imágenes de con microscopio óptico con una resolución del orden del nanómetro. La
,esoluc,on ceo11ca del m,croscop10 óptico se puede eludir med,ame microscopia de superreso·
lución. donde las moléculas únicas se pueden proyectar de manera 1nd1vidual o por separado
"'e
(1)
400 - para generar una imagen Una versión de esca cecnologia proyecca proceínas fusionadas a
o la PFV fowarnvable en mues11as fi¡adas (al Cuando una PFV es JC!lvada y luego excitada.
:§ em11,rá miles de focones que se pueden recoleccar Esco genera una curva gaussiana centrada
(1)
1:) alrededor de la locallzac,ón de la Prvque em11e, pi t en110 proporciona la localización de la
2 PFV hasca la prern,on del nanómecro Esce proceso es reiterado ciencos de veces hasta exrnar
(1)
200 -
E Olras moléculas de PFV y surge una imagen de alca resolución (b) Una imagen confocal de los
,:,
z m,crocúbulos (1zqu,erda) se compara con su imagen de superresoluc1ón correspondiente (dere·
cho) en la cual las configuraciones tr1d,mensionales de los m,crotúbulos están codificados por

o 1 J \ 1
colo, (c) Se muestra la naturaleza circular de una fosa recub1er1a con clatrina (analizada en el
' ,p 1.:¡ -una ,magen confocal de esta estructura pod11a aparecer como dos puntos brillantes
- 100 - 50 o 50 100 s,n cualquier decalle v,s,ble- PJ•t,-, 101, it l "' B i-<uan,i yrnl, 200a. ,,..,u 319:Slt'·SI q
x(nm)

(b) (el

1
•¡

,' l 5 urn 100 nm

418 CAPÍTULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 9.3 Microscopia electrónica: imagen de alta
CONCEPTOS CLAVE de la Sección 9.2
resolución
Microscopia óptica: exploración de las estructuras La microscopia electrónica de muestras biológicas, como las proteí nas
celulares y visualización de las proteínas dentro de únicas, los orgá nulos, las células y los tej idos, ofrece una resolución de
las células las ultraestructuras mucho ma)'Or de lo que se puede obtener mediante
microscopia óptica. La longi tud de onda de electrones significa qu.: el
· La resolución del microscopio ó ptico, alrededor de 0,2 µm , está limi-
límite de resolución para un microscopio electró nico de transmisión
tada por la longit ud de onda de la luz.
es teóricamente 0,005 nm ( menos del diámetro de un solo átomo ), o
· Debido a que la mayoría de los componentes celulares no están colo- 40 000 veces mejor que la resolución de un microscopio óptico )' 2
reados, la diferencia en el índice de refracció n se puede usar para obser- millones de veces mejor que la del ojo humano desnudo. Sin embargo,
var partes de células únicas utilizando microscopia de contraste de fase la resolución efect iva del microscopio electrónico de transmisión en
y de interferenc ia por contraste. el estudio de los sistemas biológicos e~ considerablemente menor que
este ideal. En condiciones óptimas, se pueden obtener una resolución
• En general, los tejidos deben fijarse, cortarse y teñirse para poder ob- de 0, 10 nm con microscopios elect rónicos de transmisión, alrededor
servar las células y estructuras subcelulares. de 2 000 veces mejor que los microscopios ópticos de alta resolución
• La microscopia de fluorescencia utiliza compuestos que absorben la convencionales.
luz a una longitud de onda y la emiten a una longitud de onda más Los principios fundamentales de la microscopia elect rónica son si-
larga. milares a los de la microscopia óptica; la principal diferencia es que las
lentes electromagnéticas enfoca n un haz de electrones de alta velocidad
• Los colorantes fluorescentes sensibles a iones pueden medir las con- en lugar de la luz visible usada por las lentes ópticas. En el 111icroscopio
centraciones intracelulares de los iones, como el Ca 2' . clcctró11ico de tra11S111isió11 (TEM, rrr111s111issro11 elecrro11 111icroscope), los
electrones son emitidos desde un fi lamento)' acelerados en un campo
• La microscopia de inmunofluorescencia utiliza anticuerpos para loca-
eléctrico. Una lente condensadora enfoca el haz de electrones sobre la
lizar componentes específicos en las células fijadas y permeabilizadas.
muestra; las lentes objetivo)' del proyector enfocan los electrones que
• La microscopia de inmunofluorescencia indirecta utiliza un ant icuer- pasan a través de la muestra y los proyecta sobre una pantalla u otro de-
po primario no marcado, seguido por un anticuerpo secundario mar- tector ( Fig. 9-25, izquierdo). Debido a que los átomos absorben los elec-
cado en forma fluorescente, que reconoce al primario y le permite ser trones del aire, el tubo entero entre la fuente de electrones y el detector
localizado. .:s mantenido en un vacío ultraelevado. Por tal motivo, el material vivo
no puede verse por microscopia electrónica.
• Los marcajes con epítopos que codifican una secuencia corta pueden En esta sección se describirán diversas técnicas para visualizar
ser añadidas a una secuencia que codifica una proteína para permitir muestras biológicas mediante microscopia electrónica. El instrumento
la localizació n de la proteína expresada usa ndo un anticuerpo contra más ampliamente utilizado es el microscopio electrónico de transmi-
la marca de epítopo. sión, pero también es común el uso del 111icroscopio electrónico de barri-
• La proteína fluorescente verde (PFV) y sus derivados son proteínas do (SEM, scn1111i11g electro11 111icroscope), que proporciona información
complementaria como se analiza al fi nal de esta sección.
que se producen naturalmente.
• La fusión de la PFV a una proteína de interés permite que su localiza-
ción y la dinám ica sean exploradas en una célula viva. Se pueden obtener imágenes de moléculas o
• La microscopia de desconvolución y la confocal proporcionan gran estructuras individuales después de una tinción
mejoría en la claridad de las imágenes fluorescentes al eliminar la luz negativa o de ser recubiertas con metal
fluorescente fuera de foco. Es común en biología explorar la forma detallada de las macromolé-
• La microscopia por reflexión interna total (TIRF) permite que mues- culas individuales, como proteínas o ácidos nucleicos, o de estructu-
tras fluorescentes adyacentes en un portaobjetos sean vistas con gran ras, como virus y los filamentos que constituyen el citoesqueleto. Es
claridad. relativamente fácil de visualizar esto en el microscopio electrónico de
transmisión cuando son teñidas con un metal pesado que dispersa a los
• La recuperación de la fluorescencia despué~ del fo_toblanq_ue,amiento electrones incidentes. Para preparar una muestra, primero se la absorbe
(FRAP) d e una proteína de fusión PFV permite analizar la d111am1ca de a una rejilla de microscopio electró11ico ele 3 mm (Fig. 9-26a) cubierta
la población de moléculas. con una capa delgada de plástico o carbono. La muest ra luego es ba-
• La transferencia de energía de resonancia Forster (FRET) es una t~c- iiada en una solución de metal pesado, como el acetato de uranilo, y
. en ¡a cual Ia energfa lumínica es transferida desde una protema se elimina el exceso de solución ( Fig. 9-26b). Como resultado de este
mea
do las proteínas están muy cerca, y revela así procedimiento, el acetato de uranilo cubre la rejilla pero es excluido de
fluorescente a o t ra Cua.n
cuando dos moléculas están cerca en la célula. las regiones donde se ha adherido la muestra. Cuando se visualiza en
el TEM , se observa dónde se ha excluido la tinción y, por lo tanto, la
· · de superresolución permite visualizar imágenes flu o-
• La m1croscop1a muestra se dice que está teñida 11egntivnme111e. Debido a que la tinción
• con resolución del orden del nanómetro.
rescentes det aJl adas puede revelar con precisión la topología de la muestra, se obtiene una
imagen de alta resolución (Fig. 9-26c).

9.3 Microscopia electrónica: imagen de alta resolución 419

 (b)
TEM SEM (al
Filamento de tungsteno - - - -
(cátodo)
=-•-L, - -- - ---Ánodo

_ __.,..---.---...- - - Le nte condensado ra - ,____,,..----.------.

Se añade Muestra
la muestra te ñida con
m etal pesado
•- - - - - Haz de electrones

Espirales
de ba rrido
-----t;1--::=.:t -!t:~i=-~

- - Le nte o bjetivo
,____,.,----.-..__ ·---, e lectroma g nética

,____,, ..---.---... ,-___,- - - Lente proyecto ra

- - - Detecto r /

Muestra

FIGURA 9- 25 En la microscopia electrónica, las imágenes se forman

a partir de los electrones que pasan a través de una muestra o son
dispersados desde una muestra recubierta con metal. En un m1crosco-
p10 electrónico de transmisión (TEMJ, los electrones son extraídos desde un
fi lamento calentado, acelerado por un campo elécmco y enfocado sobre la
muestra por una lente condensadora magnética. Los electrones que pasan d
través de la muestra son enfocados por una serie de ob¡et1vos magnéticos y
lentes proyectaras para formar una imagen amplificada de la muestra sobre
un detector, que puede ser una pantalla fluorescente de v1sual1Lacrón, una
película fotográfica o una cámara con dispos1t1vo de carga acoplado (CCDJ 100 nm
En un microscopio electrónico de barrido (5EM), los electrones son enfocados
por lentes condensadoras y objetivos sobre una muestra recub1ertd con metal FIGURA 9-26 La microscopia electrónica de transmisión de muestras
Bobinas de barrido mueven el haz a través de la muestra y los electrones teñidas en negativo revelan características sutiles. (a) Las muestras para
dispersados desde el metal son recolectados por un tubo detector fotomul- el m1croscop10 eleurónico de transmisión (TEMJ suelen estar montadas sobre
t1pl1cador En ambos tipos de microscopios. debido a quP los electrones son unJ rejilla de oro o cobre La re¡dla suele estar cubierta por una película muy
dispersados fácilmente por las moléculas de aire. toda la columna S" mdnt1ene dek¡ddd df• plástico o corbono a Id cual se ¡,uede udhem la muestra. (b) La
en un medio de vacío muy alto rnuestril luego \t? incuba en un rnetal pPsado, como el acetato de uranilo, Y
se el1m111d c·I Pxcc:so de unc1ór1 (c) Cuando se obsr.>rva en el I EM, la muestra
PxcluyP Id t11rc 1611. ele manera tal qur.> se ve el contorno negotívo El ejemplo en
(e) es un rétrov1rus IPn,do c•rr nc·9at1vo 1•a•H· 1, ,,,,..,, ,,,;1,.,.,1• ,

Las muestras también se pueden prepa rar median te sombreado me- Las células y los tejidos son cortados en secciones
tálico. En esta técnica , la muest ra se absorbe a una pi eza pequefia de delgadas para su visualización mediante
mica, luego se la cubre con una capa fi na de platino mediante evapo- microscopia electrónica
ració n del metal , seguido por disolució n de la muestra en ácido o solu-
ción blanq ueadora. La cubierta de platino se puede generar a parti r de Las cél ulas individ uales y las piezas de tejido son demasiado gruesas
un ángulo fijo o a un ángulo pequefio a medida q ue se rota la muestra, , · o de
para ser v1·sua 1·iza d as d'1recta mente en el m icroscopio electronIC
· ·ó
en cuyo caso se deno mina sombreado roratorio a bajo ángulo. Cuando transm1s1 n estándar. Pa ra superar esto, se desarrollaron me' t0 dos
la muestra es transferida a una rejilla y exam inada en el TEM , estas téc- para preparar Y cortar secciones delgadas de células y tej idos. Cua~do
nicas propo rcionan informac ión acerca de la topología tridimensional esto se analizó en el m icroscopio electrónico se reveló la organización,
de la muestra ( Fig. 9-27). belleza Ycom plej idad del interio r de la célul~ y llevó a una revolución

420 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbació n de células

-
(a) (b)
Mu es tr a , S

~../__-~ _b
, , uperfic ie d e mica

11 ,
Platino evapor ado

t t ¡ t Ré plica metálic a
/
D
Carbon o evapor ado

i i i i
11 1 µm

Réplica metálic a lista

para su visualiz ación

11
icas de tales prepara-
detalles de la la réplica metálica en un TEM. En m icrofotografías electrón
FIGURA 9-27 El sombre ado metálic o hace visible los s con carbono aparece n claras - al revés de las m icro-
median te el microsc opio ciones, las zonas cubierta
superficie de partícu las muy pequeñ as
cuales aparecen
(a) Se coloca la m uestra sobre una superfic ie de fotografías de las preparac iones con metal más pesado, las
electrón ico de transm isión. fibras subestructu-
Se cubre la re¡illa con más oscuras. (b) Una répl ica sombreada con platino de las
mica y luego se seca en un evaporad or de vacío (paso D). estructural de los
d e un metal pesado. como platino y oro, rales de colágen o de piel de becerro, la principa l proteína
la muestra con una película delgada r de 200 nm de
ca lentado eléctr1ca mente {paso tendones, huesos y te¡1dos sim ilares Las fibras son de alrededo
y se evapo ra a parur de un filament o metálico paralelas blancas) a lo
muestra se cubre con una película de espesor; se visualiza un patrón repetido de 64 nm (lineas
H) Para estabiliz ar la réplica, después la )
o encima (pa so O ) El material largo de la longitud de cada fibra. (Corte,io de R Ke,sel and R Kdrdon
carbono evaporada desde un electrod o colocad
luego con ácido y blanque ador (paso ~ y se visualiza
b1ológ1co se d isuelve

1
nales
vos vos que se utilizan para prepara r las seccion es delgada s tradicio
en la b iología celul ar-por primer a vez se aprecia ron o rgán ulos nue - fijación quím ica y embebi do e n plástico - pueden desnatu raJizarl as o

l
•
y los primer os atisbos del citoesq ueleto- .
Para prepara r seccion es delgada s es necesar io fijar q uímicam
la muestr a, deshidr atarla,
durece (simila r a Plexiglá
impreg
s®) r
narla
luego
con
cortar
un líquido
seccion es d
plástico
e alreded
que
or
ente
en-
de 5
modificar los antígenos de manera
dos por los anticue rpos específi cos.
tal
Se
que
han
ya no puedan
desarro
sutiles, como la fijación lumínica, que seccion an la muestra
peratur a del n itrógen o líquido ,
llado
ser

seguido
reconoc
método s más
después de
por incu-
i-

visibles , la muestra se co ngelarla a la tem

a 10 nm de espesor . Para que las estruct uras sean te. Para tornar visible
bacione s de anticue rpos a temper atura ambien

t debe teiiir con metales pesado s como el uranio y las sales

cual debe hacerse a ntes de embebe rlas en el plástico o d espués
d e plomo, lo

se corta n Jas seccion es. A lo largo de todo este libro aparece n ejemplo
de que
s
el anticue rpo en el microsc opio electrón ico, debe
marcad or electrod enso. Una forma d e hacer esto t'S utilizar
ser adherid o a un
part ículas
proteín a bac-
ica de de oro densas en electron es cubierta s co n proteín a A, una
de células y tejidos visualizados median re microscopia electrón teriana q ue se une al segmen to Fe de todas las molécu las de anticue rpo
darse cuenta
secció n fi na (véase, por ejempl o, Fig. 9 -33 ). Es importante ( Fig. 9-29). Debido a que las partículas de oro difracta n los electron es
· · obte11i·das representan solo una fina porción a tra vés
que las 1magen es inciden tes, aparece n como p untos osc uros.
tridime nsional
de la célula, de manera tal que para obtene r una visión
· t secci·ones seriada s a través de toda la muestra y re-
es necesan o cor ar iales ( Fig. 9- 28).
·1 t·r de u 11 a se rie de imágen es secuenc
constru tr a a par 1 La microscopia crioelectrónica perm ite la
visualización de muestras sin fijación o tinció n
La microscopia inmu noele ctrón ica localiza La microscopia electrón ica de transm isión estánda r no se
puede ut i-
d e agua provoc a que
prote ínas a nivel ultrae struc tural lizar para estud iar células vivas, y la a usencia
y se tornen no funcion ales . Sin
· de inmuno íluores cencia local iza_ proteín. as las mac ro m oléculas se desnatu rali cen
· · . das, no fijad as y sin tefiir
AJ igual que 1a m1Cros cop1a método~ que utd1 - embarg o, las mu estras biológi cas hidrata
• • · ó 1·, 0 se han desarro llado
. . d e trans-
a nivel de m1cros cop10 p 1 ,
1 ]'zar proteín as en seccion es .delgada s a nivel pueden verse directa ment e en un m ic roscopi o electró nico
• . . . microsc opia crioelec tró-
zan anllcue rpos para oca 1- misión si están congela das. En esta técnica de
· · 1 t ó n1·co• Sin embarg o, los proceJ1m1ento 111vas1-
s
d e m 1croscop10 e ce r

9.3 Microsc opia elect rónica: imagen de alta resoluci ón

421
~ VIDEO: Modelo tridimensional de un compl ejo de Golgi

FIGURA EX PERIMENTAL 9-28 Modelo del complejo de Golgi basado en

reconstrucciones tridimensionales de imágenes de microscopia elec-
•
trónica. Las vesiculJs transportadoras (esfe ras blancas) que se desprenden por
gemación del retículo endoplasmático rugoso se fu sionan con las membranas .:..• •
• •• •= r' •
,,
•
c1s (celeste) del complejo ele Golgr. Mediante un mecanismo descrito en el J ~ . •
,¡,111il,. l•l, las proteínas se mueven desde la región cis hacia la reg ió n medial i ..,·-~ "l . .,
Yf111almente a la región rrons del complejo de Golg1. Eventualme nte. las vesícu- .• ~.;,:¡, ·t · .,
las se d esprende n de la membrana de Golgi rrons (anaranjado y rojo); algunas
.~i1t..~• ., .;-, }.'
. J:,l;(lr\ .... •• . '- -., •
se mueven hacia la superficie celular y otras se mueven hacia los lisoso mas.
El complejo ele Go lgi. al igual que el re tículo end oplasmático, es e n especial
prominente en las células secretoras. (B1ad J Mo11h & Kathe, yn E Howell, Na,ureRev,e.i•s
M,1fl'cul,1, Ci?ll 81ulogy J 780- 785 (200.1 )
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11ica se aplica un a suspensión acuosa de una muestra a la rejilla en una resolución de alrededor de 5 nm. En la Fig ura 4-44 se muestran
una película extremadamente delgada, congelada en nitrógeno líqu i- ejem p los de tales im ágenes.
do y mantenida en este estado por medio de una montura especi al. La Una extensió n de esta técnica, la tomografía crioe/ectró11ica, per-
muestra congelada luego es colocada e n el microscopio electrónico. mite a los investigado res determi nar la arqu itectura t ridimensional
La temperatura muy baja (- 196 °C) evita la evaporación del agua, de los orgánulos o incluso células enteras embeb idas en hielo, es de-
incluso en vacío. Así, la muestra se puede observar en detalle en su
estado nativo, hidratado, sin fijarl a o teñirla con metal pesado. Sobre
la base de c ientos de imágenes promediadas por ordenador, se pue-
de generar un modelo tridimensional casi hasta resolu ció n atómica. (a)
Por ejemplo, este m éto do se ha utilizado para generar m o delos de
ribosomas, la bomba de calcio del músculo e n el C ~pít ulo 1 1 y o tras
proteínas grandes que son difíciles de cristalizar.
Muchos virus tienen cubiertas, o cápsides, que contienen múlti -
Antígeno
/
ples copias de un a o unas pocas proteín as dispuestas en una estruc-
(catalasa )
tura simé trico. En un microscopio crioelectrónico las imágenes de
estas partículas se pueden ver desde diversos ángulos. Un a n ális is de
computación de múltiples imágenes puede utilizar la sim etría de la
partícula para calcular la estructura tridim ensional de la cápside e n
(b) Peroxisomas

FIGURA 9-29 Partículas de oro recubiertas con la proteína A se utilizan

para detectar una proteína unida a un anticuerpo mediante microsco-
pia electrónica de transmisión. (a) Primero. se pe rmite que los anticuerpos
in teractúen con sus antígenos específicos (p. eJ. catalasa) en una sección de te-
jido fijado. Luego la secoón se trata con partículas de oro densas en electrones
cubiertas con pro teína A de la bacteria 5. oureus. LJ unión de la pro teína A a los
dominios Fe de las mo léculas de anticuerpo hace que la ubicación de la pro-
teína diana, e n este caso la catalasa. sea v1s1ble en el microscopio elecrrónrco
(b) Un corte delgado de te11clo hepático se fiJó con gl utaraldheído. se secc ionó

.,.. r:,·..~-~ :~:,.

y luego se trató como se describe en la parte (a) para localizar la catalasa Las
pa rtículas de oro (puntos negros) q ue 1nd1can la prese ncia de caralasa se loca-
lizan exclusivamente en los peroxisomas 0,,11 J G0 u,oyccls 198 1.J CellB,o/ 89:65 ;
~eprcducrdo al:' .10urnal of[c1: 8,ntny¡ ron .:1urorizJc1t;r. df' Th,~ Pc.:~E-tF-11,:,, Unive-r~1t; Í'rt>SS 0,5µ~
L

422 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 \n)
\ I
V

(,1 )

FIGURA 9-30 Estructura del complejo del poro nuclear (NPC) mediante 111.111t11v 11 ·1tH11•111 ", l1 • 1",lo1rl1, 1111.,, 111 , ,·, J,i r r11u •·,11 .i ,l i',1•r ,, 1 , ., , ,.¡ uw f' , ' / , ,f,t',
•.1, 1

tomografía crioelectrónica. (d) [11 la 1rnnoq1,1h.i Plt·< 11 <'>111," •,,. 1, ·t¡l\lro11J11o1 ,.¡, ., l1Cll11111 11 p,11lf'I 111111·•, 11.i lw·, 1111.',, 11 •1,, ··. 11 1r hr1,1d,r. ·.,., 111•r1, ,.,t, ,•. ' .r· " '' ''·.
serie ,emicircular dt> I111agenes b1d1llll'll\1011,1/,•, el,• /,1111u,•,11o1111cl1111<·11•,1011o1/ 11,111 d1l1 ·11 ·11l 1", (Jl lf 'lll.11 l(lllf•', d1• lt1·. 11( ,. (fl, ,, 11, 1',) ,., , /1',l,1 ·.1 1r ,1•r 11,r ,1/f /lJfl'frlfJ

que se ubica en PI ten1ro; la 111ucs1 ,,I ('sl,í 11 K l111,1Cl,111 111•1111o1•, q111 · l.1•, " I ,1u .,., y, 1•nt1u) y vl•,I, 1l. 111•1,il (d, ·,,., Ju1) ',, · v1·., 1.ih1,11 1 1, J'. ntJt ,•.t ,,ri.,·. , , ,r,, ,, ,,., J, ,._ .1 1,,
electróniGJSy el detP< 10 1 pe11n'-1neu r1 L'\ l,lt 1on.1rn>c:. 1 d l'\ l llH t u rd 11ul11111·1 ,
1 II H'III IHdll,J 1111( 11•, lf 1•,(11•11 1,1, f /¡ff l(J 1111 pt1rr ti, , di•I HI IIHJt,·.r, (r,1ir.r, 1·. ,J,. fl,., f¡,J ',,

sional se calculJ a µa,tir de las im,i9c•nc\ bicl11n,•nsron.1h·, 111cl1v,,1t,.,I, .., r¡,11 • •,,, (1) l<f•1 111 ",1•111 , u 1ú 11 ·,11¡ ,1•r l1r 1r1I 1¡1•111•r,11 l, 1 ¡,,>11 <i r11i ,1 1r.,r1,,,,. rl•• •Jr i ·.,·'Jrr 1,·r ,,, rJ,.

ob1 ienen cuando los elec1rones pIovp111Pnll's ele• cl1fc•1p111c•, cli1Pn I01 11", (11,-, l1o1•, l. 1 1111 ., 111H111 1,1 1 li · l. 1(•11vul11 Hd 11111 11 •,11 (, ir 11,11111,1) 1,., hr,n.irl.i , , ,r I j( )', r ¡¡,r t ,11 1 :I¡
en el recuadro izquierdo) forrnan la 1111,1c¡,•11 del ub¡c·lo l. ,1c1, 1111.',c¡,•11, ·, 11u l1v1 (d) Al 111C u111·d1, H l,i·, 1111,'1q1 •111••, ch· 1111·,11 1¡,I, ... í " Hf >', rnu 1, ·, ir1 ··.• •.,. ¡,1,,,,J, ., . rJ ,·,• ,.,
duales se u1iliLan µaril generJr la 11 nJyPn 111d11nl'll\ 1011,rl cid 01>¡,•1 0 (fl, ,, 11,1•,, 11• 1 ti1 r111 1( l 1l >', 111,'1•, cl1 •t,dl1 •·, 11',111, 1.,, ,1. ...1 ,,, . ·, , .., ~, -11, , ,,1. 1,, . , , 1' if• ,,, , ,1, , ,.,. ,: ,,
1 :✓ 1.
l'.11 l• ". !11).h 1yl11Jd1· IA ll1•, l ¡1, ,I , ,'IJ ►1 ,11•·11,, )06: l:i:/
cuadro d e Id derecha). (b) Lo, núcleo, ,11, l.ido, df'I 111oilo 111uc 1I,HJIIH>·,o, l'/11/. 11
01cryoS1elium d1sco1dcum ,e concJP.i,non r,ip,cl,,rr11 •1 11c· 1•111111 rc',r¡, ·11" li, Iwdo y •,1 •

cir, en un estado cerca no a la vida . En esta 1écniG1, el soporte dc la La microscopia electrónica de barrido de muestras
muestra se incl ina en peque1ios incrementos alrededor del ejl' per- recubiertas con metal revela características de la
pendicular al haz de electrones; así, se obt icncn im:igcn es del objeto superficie
vistas desde di ferentes direcciones (1-'ig. 9-.I0:1, h) . Las imágenes luego
son fusionadas med iante un progra ma inform:l tico en un a recons- l.a 111irrosro¡,i11 1·lr·rtró11im 1/r· lmrrir/11 (.'>l:MJ permite a l<J, inve,tiga -
trucción tridimensio nal llamada to111ogra111a (l' ig. 9-.IOr , d ). Una des- dorcs visualizar la, , uperfit ics de mut·,tra, cubierta, u,n metal , i11
ventaja de la tomografía crioclcctrón ica es que las mucst ras deben ser seccionar. Un haz de eil'.ttronc, intcn,o dentro del micm ,wpi,, barre
relativa men te delgadas, de alrededor de 200 11111; esto es mucho m~, r:lpiclaml'ntc por encima la 11111c,tra. l.a, molécula, <:n la cub ierta \l>n
delgado q ue )as muestras ( 200 µ111 de espesor) que se estudian con exci tadas y liberan <:lcctronc, ~ccunclario, que ,011cnfocadm h,,cia un
microscopia óptica confoca l. detector ele cen telleo; la ,ci1al re, ult antc es viH1alii.ada wbrc un tub,, de

9.3 Microscopiil electrónic;,: imagen de ;,Ita resolución 423

~IGURA 9-31 la microscopia electrónica de barrido (SEM) produce una
imagen tridimensional de la superficie de una muestra sin seccionar.
Aquí se mues1ra una imagen SEM del epitelio que 1ev,ste la luz del intesuno
Abundantes m1crovellosidades dig1t 1formes se extienden desde la superficie
orientada hacia la luz de cada célula La lámina basal bajo el epitelio ayuda a Células
mantenerlo y anclarlo al te¡1do conectivo subyacente Compare esta imagen de epiteliales
las células intestinales con la de la Figura 9- 13. una m1crofo1ografia de íluores- absortivas
cen c1a (De R tlt\St'I y R l<dldOn. 1979. fo\•Jl:\ ,mJ Org,m'í A rt•,-r-:.rfos of Scann,nq [/t'(lfOn ,'.IICtOKOf}/
\V H Fr,:-cm1.1n Jnd Comp,1n¡ p 176 J

Lámina
basal '-----N::::::::l
cátodo similar a un televisor co nvencional (véase la í-ig. 9-25, derecha).
La microfotografía electrónica de barrido resultante tiene una aparien-
cia tridimensional debido a que el número de electrones secu ndarios
producidos por cualquier punto sobre la muestra depende del ángulo
del haz de electrones en relación con la superficie ( Fig. 9-31). El poder
de resolución de los microscopios electrónicos de barrido, el cual está
limitado por el espesor de la cubierta de metal, es de solo el orden de
los 10 nm, mucho menos que el de los instrumentos de transmisión. sintetizado por la ATP sintasa, que convierte el ADP en ATP y está lo-
calizada en la mitocondria, y la ATP sintasa es un buen marcador para
mitocondrias. Como se analizará a continuación, la disponibilidad de
marcadores específicos para los orgánulos ha contribuido al desarrollo
CONCEPTOS CLAVE de la Sección 9 .3 de la purificación de orgánulos.
En esta sección, primero se describirá un breve panorama gene-
Microscopia electrónica: imagen de alta resolución ral de los orgánulos de las células eucariontes como un preludio a sus
• La microscopia electrónica proporciona imágenes de muy alta resolu- análisis más detallados en los últimos capítulos. Después se describirán
ción debido a la longitud de onda corta de los electrones de alta energia los métodos que se utilizan para abrir las células para la purificación
utilizados para crear la imagen de la muestra. de los orgánulos. Finalizaremos con avances recientes en proteómica
dirigidos a definir el repertorio completo de proteínas en los orgánulos.
· Las muestras simples, como las proteínas y los virus, se pueden teñir
en negativo o sombrear con metales pesados para ser analizadas en un
microscopio electrónico de transmisión (TEM ).
Los orgánulos en la célula eucarionte
· Las secciones más gruesas en general deben ser fijadas, deshidratadas,
embebidas en plástico, seccionadas y luego teñidas con metales pesados En la 1:igura 9-32 se describen los principales orgánulos en las células
electrodensos antes de visualizarlas por TEM. animales y vegetales, y algunos se muestran en mayor detalle en la Fi-
gura 9-33.
• El TEM puede localizar proteínas específicas empleando anticuerpos La membrana plasmcitica contiene a la célula y es una importante
específicos con un marcador de metales pesados, como partículas de oro. barrera vital ya que es la interfase que tiene una célula con su ambiente,
• La microscopia crioelectrónica permite el análisis de las muestras bio- separando el mundo exterior del citoplasma interno. Se compone de
lógicas hidratadas, no fijadas, ni teñidas en el TEM , manteniéndolas a alrededor de una masa igual de lípidos y proteínas. Aunque las propie-
unos pocos grados por encima del cero absoluto. dades fisicas de la membrana plasmática están en gran parte determi-
nadas por su composición lipídica, un complemento de proteínas de la
• La microscopia electrónica de barrido (SEM) de material sombreado
membrana es el principal responsable de las propiedades funcionales
con metal revela las características superficiales de las muestras.
de la membrana. Como se analiza en el C1pit ulo 13, la membrana plas-
mática es una barrera permeable que contiene proteínas de transporte
de membrana necesarias para traer iones y mctabolitos al interior de
la célula. También es el sitio de recepción de sc.-ñales químicas de otras
9.4 Aislamiento y caracterización célula~, de manera tal que contiene receptores que miden estas seña·
les Y transmiten la información a través de la membrana plasmática al
de los orgánulos celulares
interior del citosol, un tema que se analiza en el Capitulo 15. La mem·
El análisis de las células mediante microscopia óptica y electrónica lleva brana plasmática define la forma de una célula y, por lo tanto, está in·
a la apreciación de que las células contienen un conjunto de orgánulos. timamente asociada con el citoesquclcto y con otras células y la matni
La mayoría de los orgánulos están encerrados en una bicapa y llevan a celular, interacciones que se tratan en los Capítu los 17 al 19.
cabo una funci ón específica. Para realizar esta función, cada tipo de or- Las moléculas más grandes que los iones y los metabolitos pue~en
gánulo tiene una estructura reconocible y contiene un conjunto espe- ser incorporadas mediante cndocitosis, un proceso que involucra la in-
cífico de proteínas para ejecutar su función. Los biólogos utilizan este vaginación de la membrana plasmática, que luego se desprende por
hecho para identificar los orgánulos específicos. Por ejemplo, como se estrangulación para formar un endosoma en el citoplasma. Durante la
describe en el C1pítulo 12, la mayor parte del ATP en una célula es forma mejor estudiada de endocitosis, se forman regiones especiales de

424 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

Célula animal
11 La membrana plasmática controla el movimie~to de las .
moléculas hacia adentro y hacia afuera de la celula Yactua en
la señalización célula-célula y en la adhesión celular.

D Las mitocondrias, que están rodeadas por una r:nembrana doble.

generan ATP por oxidación de la glucosa Y los ac1dos grasos.

El Los lisosomas, que tienen una luz ácida, degradan el material

internalizado por la célula y desgastan las membranas
celulares y los orgánulos.
11 La envoltura nuclear, una membrana doble, encierra los
contenidos del núcleo; la membrana nuclear externa se
contin úa con el RE rugoso.

) 1:1 El nucléolo es un subcompartimento donde se sintetiza la

mayor parte del rRNA de la célula.
m Elproteínas;
núcleo está lleno de cromatina compuesta de DNA Y
es el sitio de síntesis del tRNA y el mRNA.

11 El retículo endoplasmático liso sintetiza lípidos y detoxifica

ciertos compuestos hidrófobos.
melEl procesamiento
retículo endoplasmático rugoso (RE) funciona en la síntesis,
y la clasificación de las proteínas secretadas,
las proteínas lisosomales y ciertas proteínas de membrana.

lil El complejo de Golgi procesa y clasifica las proteínas

secretadas, las proteínas lisosomales y fas proteínas de
membrana sintetizadas en el RE rugoso.

Célula II!l Las vesículas secretoras almacenan proteínas secretadas y se

fusionan con la membrana plasmática para liberar sus contenidos.
vegetal
mácidos
Los peroxisomas detoxifican diversas moléculas y también degradan
grasos para producir grupos acetilos para la biosíntesis.

msostienen del
Las fibras citoesqueleto forman redes y haces que
las membranas celulares, ayudan a organizar los
orgánulos y participan en el movimiento celular.

IE Las microvellosidades incrementan la superficie para la

absorción de los nutrientes del medio que las rodea.
maLamantener
pared celular, compuesta en gran parte por celulosa, ayuda
la forma de la célula y proporciona protección
contra el estrés mecánico.

mLas vacuolas almacenan agua, iones y nutrientes. degradan

moléculas y actúan en la elongación celular durante el
crecimiento.

mLos cloroplastos, que llevan a cabo la fotosíntesis. están

rodeados por una membrana doble y contienen una red de
sacos internos delimitados por membrana.

FIGURA 9-32 Panorama general esquemático de una célula animal fibrosas que se muestran dqui, y en Jlqunas pueden estar presentes otras
"típica" (arriba) y una célula vegetal (abajo) y sus principales subes- subestructuras Las células tilmb,én clifierPn considerablemente en forma y en
tructuras. Cada célula no tendrá todos los orgánulos. gránulm y estr ucruras la prom,ncnc ,a ele d1vc-rsos orgánulos y subest ructuras

la membrana plasmática llamadas fosita s recubiertas en las cuales los membrana. El RE se puede di vidir l'll rctícrrlu ,·11doplasmcirico liso, de-
receptores se reúnen y atrae n moléculas o partículas específi cas al inte• no minado así ddJido a que la mcmbran.i tiene una superficie lisa, y
rior de la célula (Fig. 9.J},1). Este proceso se conoce como endocitosis rctírn/o e11doplas111rírico rugoso, el cua l l'Stá revestido por ribosomas
mediada por receptor. Una vez que los materiales son internalizados, (hg. 'J.J 1h). El ret ículo cndoplasm,ltico liso es el sitio dl' sín tesis de
son clasificados y pueden a su vez regresar a la membrana plasmáti - ácidos grasos }' fosfolipidos. Por el cont rario, el retículo endoplasmá-
ca o ser distribuidos a los /isusomas para degradación. Los lisosomas tico rugoso, con sus ribosoma, asociados. e, el sitio ele la síntesis de
contienen una batería de enzimas degradativas que pueden degradar las proteínas ele membrana )' las proteínas que serán secretadas fuera
cualquier molécula biológica en co mponentes pequeños. El lumen de de la cél ula, y rcprcscnlan alrl."dcdor ele un tercio de lodos los tipos di-
los lisosomas tiene un pH ácido de 4,5; esto contribuye a desnaturalizar ferentes de proteínas sinteli7.adas por una c(·lula Despue·s de J·dSlnte-
' ·
0
·
proteínas las enzimas degradativas -conocidas colectivamente como sis en el_RE, las proteínas clcs1inaclas a la membrana plasmática O para
hidrolasa/ácidas- pueden resistir este ambiente y, en efecto, fu ncionan secrec1on son transportadas primero al complejo de Golgi, una pila
de manera ó ptima a ese pH . de membranas aplanadas llamadas cisternas (1-ig. 9<,3h ), en las cuales
El sistema de membrana interna más grande es un o rgánulo co- las proteínas son modificadas y clasificadas antes ele ser transpo rtadas
nocido como retículo endoplasmático (RE) , que consiste en una a sus destinos a la mem brana plasmática o, en algu nos casos, distri -
red extensa interconectada de sacos aplanados y túbulos un idos a la bu idas a los cndosomas. Dehido a que las proteí nas destinadas a la se-

9.4 Aislamiento Ycaracterización de los orgánulos celulares 425

 ® VIDEO: Mod elo trid imensional de una mitocondria
Tra ns fe rrina ma rcada Invaginación (b)
(a) con oro con clatrina

Comp1¡
de Gol¡

Retículo
e ndo plasmático
rugoso

100 nm

Membrana (d)
(c) Me mbrana interna Crestas externa

3µm
L___J

Espacio Gránulos Matriz

interme mbra na de la matriz

1 µm
1 1

FIGURA 9 .33 Ejemplos de orgánulos visualizados por microscopia cornple¡o de Golq, (e) St" 1nur•ét ra11 l.1; dos rnr •mhrdnds dt· unu rnnocondr,a Y
electrónica de transmisión de cortes delgados. (a) La mPmbrana plasmát1c,1 la11nvaq1nac1on<", rlr• lo rnen,IJr,11,;, llc1rnurid', ( rP,!<1S (d) Lo1, planta, ctintienen
contiene una ,nvag,nación recubierta con clatrina. ft nte-, de la fl¡ac,6n. 1;;~ ct-lul?.s cloroplo, 10',. otro Ort]anulo ro11 ir,r·rnl,run.i dobl<• La; rnernbr.1nu, de tilJC01des
se incubaron con transferrina marcada con oro coloidal. un.; prct•=ina ,molucrilda cor,tlf•nér1 las F-nZ,md, clp 1,, v,.,
((,1u ,1n1í-1,cc1 que· ,n,olucra 1,, convers,(>n de
en la captación de hierro a través de un receptor localizddo en 1.,s 1n·,~g,nac1cnr-~ lat:r1Hg1a lurn1n1rr1,·r1Alf' , 1'' ' ,. ¡, , ,:t. ,. , .. :·,1 , ._,·• :,.,,u,. 1., ~1i' ' t'r: r·,
recubiertas (véase el - 0r J.!J (bJUna sección a rM ,PS de una célula ~r,qr-t0r;; 27 2:~•-/j ·,¡ r 1·11 -: r,, :, ., J ~ •• , 1 J. ¡, / ,' Í ,lh·.1 1' 1 ¡ ' ,, , (, / IPfj "d .J"l'it>'' t
, •¡'

muestra el retículo endoplasmát,co rugoso tachonado con ribo;ornJ\ ; i-1 ,: · · , , :•r.:. J ' • · -· J 1, ;-; • ,: · 1 ,. , '• • ,_. , 1~,. ·1. •. ['.• • ,i t ,.,••, •• ,•1•,•1 ,1l 11-, ·•"'r:.,-,, ·

creció n son sintetizadas en el retículo endoplasmático, transpo rtadas bién incluye la síntesis y el transporte de proteínas de membrana que
a través del complejo de Golgi y liberadas desde la célula, este proceso permanecerán en el retículo endoplasmático, el complejo de Golgi Y
completo se conoce colectivamente como vía secretora, aunque ta m- la membrana plasmática y, por ende, no se secretan. Estas también

426 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 • en-
¡¡,1111.1d.1, l'Ía; rlc trá 11sito a las 111e111bra11as comprende n t an to v1as La rotura de las células libera sus orgánulos
d, ,.11,.:.1> como , c•cretora_s, y se analizan en detalle en el Cipítu lo ,~.
y otros contenidos
. dtro organu lo co mun es el peroxisoma , una clase de orgánulo
e,k, téO que contiene ox1d11sas -enzimas que usan oxígeno molecu- El paso inicial en la purificación de las estructuras subcelulares es
lar. p.ira. oxidar• toxinas para elaborar productos inoren ·
,, SIVOS y para a
1
liberar los contenidos de la célula mediante rotura de la membrana
.
ox1cJ.1c16n de ac1dos grasos para la producción de grupos acetilos, un plasmática }' la pared celular, si está presente. Primero, se suspenden
temJ que se trata en el Cap ítu lo 12. las células en una solución de pH y contenido salino adecuados, en
Todos los orgánulos que se analizaron hasta el momento están general sacarosa isotónica (0,25 M) o una combinación de sales si milar
cn(crrados por una única membrana de bicapa lipídica. AJgunos or- en composición a la del interior de la célula. Muchas células se pueden
gánulos, como el _n úcleo, las mitocondrias y, en las células vegetales, romper mediante agitación de la suspensión celular en una licuado-
los cloroplastos tienen un a membrana adicional que cumple diversas ra de alta velocidad o por exposición a sonido de frecuencia ultraalta
funciones, como se describe a continuación. (so11icació11). Alternativamente, las membranas plasmáticas se pueden
El núcleo contiene el DNA del genoma y es el sitio de trans- romper mediante homogeneizadores especiales de tejido presurizados
cripción del DNA a RNA mensajero. El núcleo tiene una membra - en los cuales las células son forzadas a pasar a través de un espacio muy
na interna que define al núcleo en sí mismo. También contiene una estrecho entre un émbolo y la pared del vaso; la presión de forzar las
membrana ex terna que se continúa con la membrana del retículo en- células a pasar entre la pared del vaso y el émbolo rompe la célula.
doplasmá tico de tal forma que el espacio entre la membrana interna Recuérdese que el agua fluye al interior de las células cua ndo son
)' la externa se continúa con el retículo endoplasmático (véase la Fig. colocadas en una solución hi potónica, es decir, una con una concentra-
9-32) . El acceso al interior y al exterior del núcleo es proporcionado ción menor de iones y pequeñas moléculas que la que se encuentran en
por conexiones tubulares entre las membranas interna y externa es- el interior de la célula. Este flujo osmótico se puede usar para que las
tabilizadas por estructuras llamadas poros nucleares. Los poros nu - células se hinchen, lo que debilita a la membrana plasmática y facilita
cleares no solo defin en el sitio de transporte a través de la membrana su ruptura. En general, la solución celular se mantiene a OºC para una
nuclear sino que actúan como porteros, que permiten solo el trans- mejor preservación de las enzimas y otros componentes después de li-
porte de macromoléculas haci a afuera y hacia adentro del núcleo - un berarlas de las fuerzas de estabilización de la célula.
tema importante y fascinante que se mencionó en el Capítulo 8 y será La rotura de la célula produce una mezcla de co mponentes ce-
analizado en más detalle en el Cap itulo 13-. lulares suspendidos, el homogenado, a partir del cual se obtienen
Las mitocondrias y los cloroplastos se cree que evolucion aron a los orgánulos. Debido a que el hígado de rata contiene abundancia
partir de un acontecimien to hace mucho tiempo cuando una cél ul a de tipos celulares únicos, este tejido se utiliza en muchos estudios
eucarionte engulló un tipo de bacteria qu e dio origen a las mito- clásicos de orgán ulos celulares. Sin embargo, los mismos principios
condrias y una clase diferente que dio origen a los cloroplastos. de aislamiento se aplican a virtualmente todas las células y tejidos,
Esas mitocondrias y esos cloroplastos tienen dos membranas y es y las modi ficac iones de estas técnicas de fraccionamiento celular se
la evidencia que avala esta hipótesi s. La membrana interna es muy pu eden usar para separar y purificar cualquier componente deseado.
probable que haya derivado de la membrana origi nal de la bacteria,
mientras que la membrana externa es un vestigio de la membrana
plasmática del aco ntecimiento de engullido. Existe mucha eviden- La centrifugac ión puede separar muchos
cia del origen bacteriano de estos orgánulos, que incluye el hech o tipos de orgánulos
de que las mitocondrias y los cloroplastos tien en ambos su propio
genoma de DNA y la biosí ntesis de las proteínas en estos orgánulos En el Ca pitulo J se consideraron los principios de centrifugación y los
usos de técnicas de cent rifugación para la separación de proteínas y
es más similar a la síntesis proteica bacteriana que a la de euca-
ácidos nucleicos. Se utiliza n técnicas similares para separar y purificar
riontes.
los diversos orgánulos, que difieren tanto en tamaño como en den-
Las mitocondrias pueden ocupar casi el 25% del volumen del ci-
sidad y, por lo tanto, sufren sedim entación a velocidades diferentes.
toplasma. Son orgánulos similares a cuentas en los cuales la mem-
La mayoría de los procedimientos de fraccionamiento celular co-
brana externa contiene proteínas porinas que tornan permeable a la
mi enza n con la ce11trif11gació11 difere11cial de un homogenado celular
membrana para inco rporar moléc ulas de un peso molecu lar de hasta
fi ltrado a velocidades crecien tes ( Fi¡;. 9- 34). Después de la centri-
JO 000. La membrana mitocondrial interna está altamente plegad_a,
fuga ción a cada velocidad durante un tiempo adecuado, el líquido
· ·
con 111vagmac10ne
· s• llamadas
crestas que sobresalen hac. ia . el espac10
. .
· ¡¡ mado matriz ( Fig. 9-33c). Una func1on pnnc1pal que permanece en la parte superior del recipiente, denominado so-
centra 1 mterno, a brenadante, es separado }' centrifugado a velocidad más elevada. Las
· d · s ¡. de completar las etapas finales de la degrada-
de 1a m1tocon n a e ,1 fracciones de precipitado obtenidas por centrifugación diferencial en
I oxidación para generar la mayor parte. del
c1 n e a g ucosa mediante
ºó d l ·
general contienen una mezcla de orgánulos, aunque los núcleos y las
· · d o a la· ce'lula · Así. las mitocond rias pueden co ns1de-
ATP sum1111stra partículas virales a veces pueden ser purificados por completo me-
rarse las "centrales de energía" de la célula. .
algas verdes se ca racterizan por la, presencia diante este procedim iento.
To d as 1as p 1an tas Y .
. 9-33d) orgánulos que usan la fotos111tes1s para Una fra cción de orgánulos impuros obtenidos por centrifugación
de cloroplastos -1g. ( F , . . . .
, ¡ ' nica co n pigm entos coloreados, 111clu1do el diferencial puede ser purificada aún más mediante centrif11gació11 por
capturar la energ1a umi . . .
• d ¡ 0,¡;fa y en última 111stancia, almacenar la cnerg1a gradie11 te de drnsidad, que separa los componentes celulares de acuer-
pigmento ver e e or 1• • ' .
do con sus densidades. Después de volver a suspender la fracción, esta
. de ATP. Los procesos mediante los cua es se
e
1
capturada en 1a 10 rma .
· • ¡ ·tocondrias y los cloroplastos se descnben en fo rma una capa en la parte superior de una solución que contiene un
smtetJza ATP en as m1
gradiente de una sustancia no ióni ca densa (p. ej., sacarosa o glicerol ).
el Capítulo 12.

9.4 Aislamiento y caracterización de los orgánulos celulares 427

 f-= Filtrado del
homogenado
para e liminar
1
, grupos de
1 células intactas,

1: ¡ tejido conectivo,
; \ etc.

'
Centrifugación

¡~]
1~
H
11
l [l ,-
;tj¡;;-; ,t1;~. r·:; ~.¡'J
1 ¡- ,,.,,m,

Homogenadoc< N:os [Mit~:rias, ~mbrana ~bunidades

"
Parte
filtrado cloroplastos, plasmática, ribosómicas, soluble
lisosomas y fracción polirribosomas del
peroxisomas microsómica pequeños citoplasma
(fragmentos (citosol)
de reticulo
endoplasmático)
y polirribosomas
grandes
FIGURA 9-34 La centrifugación diferencial es el primer paso en el frac- subsiguientes en la utlracentrifuga a 100 000 g durante 60 minutos produce
cionamiento de un homogenado celular. El homogenado resultante de la depós11os de la membrana plasmátrca, fragmentos del retículo endoplasmá-
degradación celular suele filtrarse para eliminar las células intactas y luego se t1co y polirribosomas grandes. La recuperación de subunidades rrbosóm1cas,
centrifuga a una veloodad baja para precipitar selernvamente el núcleo -el pol1rrrbosomas pequeños y partículas como complejos de enzimas requiere la
orgánulo más grande-. El material que no se deposita (el sobrenadante) es a centrifugaoón adicronal a velocidades aún mayores. Solo el otosol -la parte
continuación centrifugado a una velocidad más alta para sedimentar las m1- acuosa soluble del rnoplasma- permanece en el sobrenadante después de
tocondrias, los cloroplastos, los lisosomas y los perox1somas Centrifugaciones centrifugaciones a 300 000 g durante 2 horas.

El tubo es centrifugado a alta velocidad (alrededor de 40 000 rpm ) pueden cuantifi car las moléculas marcadoras específicas de orgánulos.
durante varias horas, lo que permite que cada partícula migre hacia Por ejemplo, la proteína citocromo c está presente solo en la mitocon-
una posición de equilibrio donde la densidad del líquido que la rodea dria, por lo tanto la presencia de esta proteína en una fracción de liso-
es igual a la densidad de la partícula (F1g. 9-35). Las diferentes capas somas podría indicar su contaminación por mitocondrias. De modo
de líquido luego son recuperadas mediante bombeo de los conteni- similar, la catalasa está presente solo en los perox.isomas, la fosfatasa
dos del tubo de centrífuga a través de una pieza estrecha de tubular y
recolecció n de las fraccio nes.
Debido a que cada orgánulo tiene características morfo lógicas
únicas, la pure1..a de las preparaciones de orgánulos se puede evaluar
mediante examen en un microscopio electrónico. Alternativamente, se

FIGURA 9-35 La fracción de orgánulos mezclados puede separarse

f
[
_J·} Fracción
de orgánulos
aún más mediante centrifugación por graidiente de densidad. En c·~te 1,09
eJemplo, en el que S€ utiliza hígado de rata. el matenal en el pre(1p,t"do de la Lisosomas
centrifugación a 15 000g (véase la f1-i : -.1) se vuel•1e a suspendEr y sE encuen 1,11 ( 1, 12 g/cm 3) "- ,
1
tra como una capa sobre un gradiente de solución dE s;;carosa dE dr-n~1dad
Mitocondrias - "l- __.. '
creciente en un tubo de centrifuga. Durante la cemrifutJac1ón oor ,ario\ hora•, 1,,15
1, 19 (1.18 g/cm 3) - ·
cada orgánulo migra a su equil1bno de dens,dad apropiado'/ pErmanece ~lli
Para obtener una buena separación de l1sosomas respEcto de la~m1toccndr,,;s 1,2
el hígado se perfunde con una solucrGn que cor,trenr- una car,t,dad ¡~E-queno Peroxisomas { 1
de detergente antes de que el reJ1do sea disgregado Durame FI v·n,,do ar 1, ( 1,23 g/cm 3) 1
perfusión, el detergente es incorporado a las células mediante er\d0ctos1s l
transferido a los l1sosomas. t0rnándolos menos dPnsos dP le aué ,,o,malmer,,r-
Antes de la Después d~ la
seria y perm1t1endo una separacron "limpia' de les lrsosomas rernecto ce las centrifugación centrifugación
mitocondrias.

428 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

-
.i, 1,1.1 "llu ,·11 los lisosomas y los ribosomas solo en el retículo endoplas- tamaño (50-100 nm de di ámetro) y densidad, lo cual las torna dificul -
111.11 "'' 1ugnso o d c11osol. tosas de separar unas de otras mediante técnicas de centrifugación.
Las técnicas inmun ológicas son particularm ente útiles para purifi-
Los anticuerpos específicos de orgánulo s son car clases específicas de tales vesículas. Las células musculares y las
úti le s en la preparac ión de orgánulo s altament e células grasas, por ejemplo, contienen un transportad or de glucosa
purificados particular (GLUT4) qu e está localizado en la membrana de unos de
estos tipos de vesículas. Cuando se añade insulina a las células, estas
J .1, fracciones celulares que permanecen después de la centrifugación por vesículas se fusionan con la membrana plasmática e incrementa el
grad1c111e de d<:ns1dad y de la centrifugación diferencial suelen contener número de transportad ores de glucosa capaces de in corporar glucosa
111.i, de un tipo ele orgánulo. Los anticuerpos monoclonales para varias desde la sa ngre. Como se vio en el Capítulo 15, este proceso es críti-
prn1ci11:is tic m<:mbrana específicas ele orgánulo son una herramienta po- co para mantener la concentraci ó n adecuada de azúcar en la sangre.
tkrnsa para la posterior purificación de las fracciones. Un ejemplo es la Las vesículas que contienen GLUT4 se pueden purificar utiliza ndo
purificació n de vesícu las cuyas superficies externas están cubiertas por la un anticuerpo que se une a un segmento de la proteína GLUT4 que
prntdna clatrina; estas vesículas recubiertas derivan ele las invaginaciones se encuentra hacia el citosol. Igualmente, las diversas vesículas que se
rccubienas en la membrana plasmática durante la enclocitosis mediada describen en el Ca pítulo 14 se caracterizan por proteínas de superfi -
por receptor (véase la Fig. 9-33a}, un tema que se analiza en detalle en el cies únicas que permiten sus separaciones con la adición de anticuer-
C.1 p11uln 1·1. Un anticuerpo para clatrina, unido a un transportado r bacte- pos específicos.
riano, puede unir selectivamente estas vesículas en una preparación cruda Cuando no se encuentran disponibles anticuerpos específicos
de membranas, y luego el complejo de anticuerpos entero se puede aislar para los orgánulos se utiliza una variación de esta técnica. Un gen
med iante centrifugación a baja velocidad (Fig. 9-36). Una técnica relacio- qu e codifica una proteína de membrana específica de orgánulo es
nada utiliza esferas metálicas diminutas recubiertas por anticuerpos espe- mod ificado por la adición de un segmento que codifica un marcaje
cíficos. Los orgánulos que se unen a los anticuerpos, y que se unen a las con epítopo; el marcaje se coloca sobre un segmento de la proteína
esferas metálicas, son recuperados de la preparación mediante adhesión a orientada hacia el citosol. A continuació n de la expresión estable de
un imán pequeño al costado del tubo de ensayo. la proteína recombinan te en la célula en estudio, se puede usar un
Tocias las células contienen docenas o más de diferentes tipos de anticuerpo mon oclonal contra ese epítopo (descrito anteriorme nte )
pequefias vesículas rodeadas de membrana de alrededor del mi smo para purificar el orgán ulo.

(b)
(a) Vesícula
cubierta
Clatrina Célula bacteriana
¡ Anticuerpo contra clatrina

Proteína A

.J

Vesícula cubierta

O, 1 µ.m

'fi r pequeñas vesículas recubiertas qc;F Sf' urr•" ia rrcg,c.;- 'e,n,ta•,1e (fe. d<> los an:,cue•po; (a) La 1meracc1ón de
FIGURA 9-36 Se pueden puri ca "d células bacterianas, espe- l.; r.,ro1e1~,¿, L con les ar 1,cu-:r;:,c; unidos a las ,esiculas recubiertas con clatrina
ó d anticuerpo, un• o a
.
med 1ante la uni n e un rfi I d las vesículas. [n rcstP r-¡emr,lo. ~r,e los .·e, rulas a las célJ 1as tacre•1ar,as Los co-nple¡os ✓esic ula- bacter1a
ifi · de supe c e ..e h' ado de rata con un ant1cuerpc, r,uede, spr r(•cuperados med,an1e ~entr1fugac1ón a baJa velocidad (b) Una
e copara una proteina. d membranas ue IOu
incuba una suspension e
SE- . que cubr/la superficie externa de c,ert?.S r-,1croiorcgraiia electror,,ca de cor:e delgado revela las vesículas recubiertas
P -~ 1 n a. una pro1e1na . d- . 'uspens1ón de bacrer,as Sra- con cla1r,na unidas a una ce lula de 5 oureui ✓~>e• E M•, 1, 01 cois 1992 1 ce:• e,0 ·
.soec11,co pa ra. e. a111 A mezcla se ana e una '
" - b n de <uperfic1e con1 ,Pne prme,na />
•P,iculas otosolicas e 5ta ··
ph¡locaccus oureus muertas, cuya mem ra a -

9.4 Aislamiento y caracterización de los orgánulos celulares 429

 La proteómica revela la composición de proteínas Capít ulo 3 hemos analizado cómo se pueden purificar las proteínas v
caracterizar sus propiedades en detalle. En muchos casos, esto ha Ue·.
de los orgánulos
vado a la reconstrucción bioquímica de procesos_bioq_uímicos cómpli.
Para identificar todas las proteínas en un orgánulo se requieren tres cados, tales como la replicación del DNA o la s111tes1s proteica. Estas
pasos. Primero, uno tiene que ser capaz de obtener el orgánulo en alta técnicas bioquímicas se han complementado con técnicas genéticas,
·¡· . y
pureza. Segundo, se debe tener una forma de identificar todas las se- como se vio en el Capítulo S, se pue d en ut1 izar mutaciones para iden.
cuencias de las proteínas en el orgánulo. Esta identificación suele rea- tificar genes cuyos productos cumplen funci ones específicas. Como se
lizarse mediante digestión de todas las proteínas con una proteasa tal verá en Jos Capítu los 14 y 19, se utilizaron búsquedas genéticas clásicas
como la tripsina, que corta todos los polipéptidos en los residuos de en levadura para identificar proteínas que participa n en la vía secretora
lisina y arginina, y luego determinar la masa y la secuencia de todos es- y en el ciclo celular, respectivamente. Las técnicas genéticas en otros
tos péptidos mediante espectrometría de masa. Tercero, uno tiene que orga nismos, como el gusano nematodo, la mosca de la fruta y el ratón,
tener la secuencia genómica para identificar las proteínas a partir de las han contribuido en gran medida a descubrir los aspectos básicos de la
cuales provienen todos los péptidos. De esta forma se ha determinado biología y el desa rrollo celulares (véase el Cap. 1).
el "proteoma" de muchos orgánulos. A modo de ejemplo, un estudio Durante los últimos años, se han desa rrollado técnicas nuevas muy
proteómico reciente en mitocondrias purificadas a partir de cerebro, poderosas para modificar componentes específicos en las células vivas
corazón, riñón e hígado murinos reveló 591 proteinas mitocondriales, y así esclarecer sus funciones. En esta sección analizaremos dos de es-
incluidas 163 proteínas que no se sabía con anterioridad que estaban tas técnicas: el uso de químicos específicos para perturbar la función
asociadas con este orgánulo. Se encontraron diversas proteínas en las celular y el uso del RNA de interferencia para suprim ir la expresión de
mitocondrias solo en tipos celulares específicos. El principal objetivo genes específicos.
de la investigación actual de este orgánulo es la determinación de las
fun ciones asociadas con estas proteínas mitocondriales recientemente En biología celular se utilizan fármacos
descubiertas.
Desde hace siglos se utilizan fármacos que se producen naturalmen-
te, pero no se conocía cómo funcionaban con exactitud. Por ejemplo,
extractos de azafrán de la pradera se utilizaban para tratar la gota, una
CONCEPTOS CLAVE de la Sección 9 .4 enfermedad que resulta de la inflamación de las articulaciones. En la
actualidad se sabe que el extracto contiene colchicina, un fármaco que
Aislamiento y caracterización de orgánulos despolimeriza los microtúbulos e interfiere con la capacidad de los
celulares glóbulos blancos de moverse hacia los sitios de la inflamación (véase
• La microscopia ha revelado un conjunto común de orgánulos presen- el Cap. l 8). Alexander Fleming descubrió que ciertos hongos secretan
tes en las células eucariontes (véase la Fig. 9-32). compuestos que matan bacterias (antibióticos), lo que dio como re-
sultado el descubrimiento de la penicilina. Solo después se descubrió
• La rotura de las células por homogeneización vigorosa, sonicación u que la penicilina inhibe la división bacteriana mediante bloqueo del
otras técnicas liberan estos orgánulos. La hinchazón de las células en ensamblaje de las paredes celulares de ciertas bacterias.
una solución hipotónica debilita la membrana plasmática y facilita su Muchos ejem plos como este dieron como resultado el descubri-
rotura. miento de una amplia gama de fármacos disponibles para inhibir pro-
• La centrifugación diferencial secuencial de un homogenado celular cesos específicos y esenciales de las células. En la mayoría de los casos,
produce fracciones de orgánulos parcialmente purificados que difieren los investigadores han sido capaces de identificar finalmente los blan-
en masa y densidad. cos moleculares del fármaco. Por ejemplo, hay muchos otros antibióti-
cos que afecta n aspectos de la síntesis de proteínas procariontes. En el
• La centrifugación de gradiente de densidad, que separa los compo-
Cuad ro 9- 1 se enumera una selección de algunos de los fá rmacos que
nentes celulares de acuerdo con sus densidades, puede purifica r aún
se utilizan con mayor frecuencia y que afectan a una amplia variedad
más las fracciones celulares obtenidas por centrifugación diferencial.
de procesos biológicos celulares, agrupados de acuerdo con el proceso
• Las técnicas inmunológicas que utilizan anticuerpos contra proteí- que inhi ben.
nas de membrana específicas de orgánulo son particularmente útiles
en la purificación de orgánulos y vesículas de tamaños y densidades Las exploraciones químicas pueden identificar
similares. nuevos fármacos específicos
• El análisis de proteómica puede identificar todos los componentes
¿Cómo se realiza el desc ubrim iento de fármacos nuevos? Un método
proteicos en una p reparación de un orgánulo purificado.
muy ut ili zado hace uso de las bibliotecas químicns que consisten en
_1O?ºº ª 1OO 000 compuestos diferentes para buscar químicos ~ue
mhiban un proceso específico. La búsqueda de bibliotecas químicas
en conjunto co n las técnicas de microscopia de alto rendimiento se ha
9.5 Perturbación de funciones celulares co nverudo_en la actu_alidad en una de las vías principales que llevan;
específicas descubrimiento de farmacos. Aquí se verá un caso para ilustrar eón
fun ciona este tipo de enfoq ue. .
¿Qué técnicas generales utilizan los científicos para comprender la fun - t
En nueS ro ejemplo (Fig. 9-37a), los investigadores querían idenW
ción de proteínas específicas en los procesos biológicos cel ulares? En el ficar compuest0s que inhiba n la mitosis, el proceso donde los cromo·

430 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 ..
Cuadro 9-l Grupo seleccionado de moléculas pequeñas utilizadas en investigación biológica celular

Algu nasde las s iguientes moléc ulas ti_e n_en una especificidad amplia, mientras que o tras son a ltam ente esp ecíficas. En los capítulos relevantes
di: este lib ro se puede encontra r m ás m formació n d e mucl1o s d t
e es o s compuestos.
lnhibidores de la replicación del DNA
Afidicolina (inhibidor de la DNA polimerasa eucarionte); camptotecina, etopósido (inhibidores
de topoisomerasa eucarionte)
lnhibidores de la transcripción
a-amanitina (inhibido r de la RNA polimerasa II); actinomicin a D (inhibidor de la elongació n de
la transc ripció n eucarionte); ri fa mpicina (inhibidor de la RNA polimerasa b acteriana); tiolutina
(inhibidor de la RNA polimerasa bacteriana y de levadura)
lnhibidores de la síntesis de
Cicloheximida (inhibidor de la traducció n en eucario ntes); geneticina/G418, higromicina, puro-
proteína-bloqueo de la producción
micina ( inhibidores de la traducción en b acterias y eu cariontes); cloranfenicol (inhibidor de la
general de proteínas; tóxico después
traducción en b acterias y mitocondrias); tetracic\ina (inhibidor de la traducció n en bacterias)
de exposición prolongada

lnhibidores de proteasas-bloqueo de MG- 132, lactacistina (inhibido res de proteosom a); E-64, leupeptina (inhibido res de serin a o cis-
la degradación de proteínas teín a proteasa); fenilm etanosulfo n ilfluoru ro (PMSF) (inhibido r d e serina-proteasa); tos il-L-lis ina
c\orom etil cetona (TLC K) (inhib idor de se rina-proteasa similar a tripsina)
Compuestos que afectan al Faloidin a; jasplaquinolida (estabilizador de F-actina); latrunculina, citocalasina (inhibidores de la
citoesqueleto polimerizació n de F-actina); taxol (estabilizador de microtúbulos); colchicina, nacodazol, vinblas-
tina, podofilotoxina (inhibido res de la polimerización de microtúbulos) ; monastrol (inhibidor de
cinesina-5 )

Compuestos que afectan el tránsito de Brefeldina A (inhibidor de secreció n ); lepto micina B (inhibidor de la exportación de proteína
membrana, el movimiento intracelular nuclear); dinasora (inhibido r de la dinamina ); tunica micina (inhibido r de la gl ucosilació n ligada
y la vía secretora, glucosilación de a N)
proteínas

lnhibidores cinasa Genisteína, rapamicina, G livec® (inhibidores de tirosina-cinasa con varias especificidades); wort-
m a nina, LY294002 (inhibidores d e la Pl3 cinasa); estaurosporina (inhibidor de proteína-cinasa);
roscovitina (inhibidores de COK \ y C DK2 del ciclo celular)

lnhibidores de fosfatasa C iclospo rina A, FK506, caliculina (inhibidores de proteí na-fosfatasa con diversas especificidades);
ácido ocadaico (inhibido r general de seri na/treonina -fosfatasa); óxido de fenilarsina, o rtovanad a-
to de sodio (inhibidores de tirosina -fosfa tasa )

Compuestos que afectan a las Foskolina (activador de adenilato ciclasa)

concentraciones de cAMP intracelular

Compuestos que afectan a los iones A23 l 87 (ionóforo de Ca1 ' ); valinomi ci na ( ionóforo de: K' ); ílAPTA (agc:nlc de unió n/captu rador
(p. ej., K+ Ca 2 +) de ca tió n di va len te [p. ej., Ca1 ' ]) ; lapsigargina (inhibidor de: ATPasa de: Ca'' ele retícu lo c·mloplas-
m ático ); o uabaína ( inhibidor de Na' / K ' AT l'asa )

Algunos fármacos utilizados en Propanolol (antagonista de receptor ~-adrcnérgico), c:statinas (inhibidorc:s de H!vlG-CoA reduc-
tasa, bloquea la síntesis de colesterol)
medicina

· d . egados en fo rma p recisa por una 111aqu1nana anticuerpos con tr,1 tuhulin ,1 . l,1 principal proteína d e los micro t úbulos.
somas duplica os son segr . . ..
. , 6 1 · llamad a husom itót1co( dcscr1toeneiLJp. lK ). De In, 1(, ()(JO cn111¡H1cstos rastrc:,Hlos, se· identificó un compuesto en cé-
basada en m1cro tu u os . , .
• , m •tido el ensa mbla¡<:, las cdulas >é det1c:nen lula, con husn, an{un,i los - en lugar de tener dos üsteres. tenía n un ún i-
Se sabe que s1 esta compro ~ .. . .
. . el b . squeda primero utili za un mctodo de robo- co :íster, que ,e denominó d isposició n monoastral- ( 1-i~. 9-376). Este
en mitosis. Por e n e, Iª u ·¡ 1
. . b •ca r compuestos que detengan a las ce u as f:írmaco, ahor.i co nocido como 1110 11n st rol, se enco ntró q ue interfi ere
tica autom atiz ado para us d 'd .
. . . la inhibició n de los compuestos ca n I ato, con d ensamblaje del hu,o mediant e inhib ició n de un motor basado
en m1tos1s Las bases para ' . •
· . . ver si afectaban el ensa mbla¡e de los m JCro· en microt úbulos de nominado cinesin a 5 ( véase el C 1p. 18 pa ra más de-
luego se an alizaron p ara . · ·b ¡
· h 'b .ción del ensa mb la¡e de los m1crotu u os talles acerca del huso mi tót icn ). En la actualid ad se conocen derivados
túbulos Pu esto que 1a 111 1 1
· . 1 f - de \os cand idatos restantes en la estruct ura de monastrol que están siendo anali zados como agentes a nti tu mo rales
no era de mterés, e e ecto .
· · o r microscopia de inmunoflunrcscenc1a con para el tratam iento de ciertos cánceres.
del huso se determ1110 P

9.5 Perturbación de funciones celulares específicas 431

 FIGURA 9-37 Búsqueda sistemática de fárma- (al
cos que afectan a los procesos biológicos espe- 16 320
cíficos. En e, t, i:jernplu, una biblimeca quirn1ca de
0
compuestos químicos
1ó 320 quirn1co:, difcre1Hes se samet1u a una serie de
deter.c1ones s1stemj,,cJs pa r., ,nh1b1dores de rn1tos1s
Del)ido a que un 1nh1b1dor se espera que detenga a Exploración en búsqueda
D de aquellos que d~tie~en

l
las células en la etapa rnrtót1ca del crclo celular, la pri-
a las células en m1tos1s
mera exploración o búsquedil D fue ver 11 cualqu iera
de los quirnrcos incrementaba la concentración de
un marcador para celulas rnrtóticas, y esto produ10 139
139 candidatos. Los rn,crotúbulos forman la estruc-
tura de los husos rn1tót1cos, y los investigadores no Exploración para
estaban interesados en fármacos nuevos di rigidos aquellos que no afectan
contra los microtúbulos, ele manera tal que en la se- el ensamblaje de los
gu nda exploración El probaron a los 139 compues- microtúbulos in vitro
tos por su capacidad de afectar el ensam blaje de los
m1crotúbulos, y esto eliminó 53 ca ndidatos. Después 86
se ut ilizó la microscopia de inm unofluorescencia con
an ticuerpos contra la tubul ina (la principal subuni- Exploración de
dacl de los rnicrotúbulos) junto con una tinción para aquellos que afectan
el DNA en la tercera exploración ~ para identificar específicamente la
los compuestos que interrumpieron la estructu ra morfología del huso
del huso. (b) La localización de la tubulina (verde) y
el DNA (azul) se muestra para un huso mitótico no 5
tratado y uno tratado con uno de los compuestos
recuperados, ahora llamado monastrol. El rnonastrol
inhibe a un motor basado en microtúbulos lla mado
cines1na 5, analizado en el Ca pitulo 18, necesario
para separar los polos del huso mitótico. Cuando la
cinesina 5 está inhibida, los dos polos permanecen
asociados para da r un huso monopolar. lPane lbl Tu
Maye, y cols . Soence 286:971 -974 )

Los RNA de interferencia pequeños (siRNA) pueden cido por RNA [ RNA -ind11ced silencing complex]) y una de las hebras es
inhibir la expresión de proteínas específicas degradada por la proteína argonauta asociada. Si la secuencia de siRNA
de simple hebra se puede aparear exactamente con una secuencia de
La interferencia por RNA (RNAi) es un meca nismo que utilizan las mRNA diana, el complejo RNA-proteína argonauta asociada corta el
células para silenciar la expresión de los genes ya sea mediante blo- mRNA diana, que luego es degradado (Fig. 9-38a). Aunque este siste-
queo de la traducción de mRNA específicos a través de los microRNA ma probablemente evolucionó como un mecanismo de defensa contra
(miRNA ) o por degradación de los mRNA específicos mediante los vi rus invasores, ha proporcionado a los investigadores una herramienta
RNA de interferencia pequeños (siRNA ). El amplio uso de los miRNA muy poderosa para suprimir experimentalmente la expresión de genes
para regular la expresión génica, en especial durante el desarrollo, se particulares y explo rar las co nsecuencias resultantes. Se ha utilizado
analizó en el Capítul o 8. Aquí nos centraremos en el uso experimen- muy eficazmente en muchos sistemas diferentes, como se resume a
tal de la tecnología de siRNA para suprimir la expresión de genes en co ntinuación.
células animales.
El descubrimiento de la vía siRNA surge a partir de muchas ob- Silenciamiento por siRNA en células cultivadas Desde el descubri-
servaciones. Por ejemplo, se descubrió en las plantas que la expresión miento en 2001 de que el tra tamiento de células cultivadas con siRNA
recombinante de un gen podía llevar a la regulaci ón negativa del gen inhibe la expresión génica med iante degradación del mRNA diana, los
diana en lugar de al resultado esperado de aumento de la expresión, siRNA se han utilizado en miles de estudios para inhibir-o "silenciar"-
En el nematodo C. elegans se observó un tipo de resultado similar. Al las concentraciones de proteínas diana. Para realizar esto, los investiga·
investigar este fenómeno, Andrew Fire y Craig Mello informaron en dores utiliza n programas informáticos para identificar una secuencia
1998 que la supresión no se podía lograr por medio de la expresión del de - 2 1 pares de bases en el mRNA que es única para el gen diana
mRNA en sentido o en antisentido, sino que era necesaria la expresión y tiene las características óptimas para el siRNA. Luego se sintetiza e!
de RNA de doble hebra. Fire y Mello fueron galardonados con el pre- RNA de doble hebra y se lo aplica a células en cultivo ( Fig. 9-38a). 5'
mio Nobel en Fisiología o Medicina en 2006 por este descubrimiento. es eficaz, esto resul tará en la degradación del mRNA específico Y no 5~
Trabajos posteriores en diversos sistemas demostraron que el RNA de si nteti zará proteína diana nueva. Sin embargo, la proteína diana est~
doble hebra tiene que ser cortado por una proteína llamada Dicer para presente al comienzo del experimento, por ende, las células son capac~s
producir fragmentos doble hebra de 21 a 23 pares de bases con dos nu- · · que la proteína endógena experimente su recamb1°
d e crecer Yperm1t1r
cleótidos que sobresalen en cada uno de los extremos 3'. Este RNA de normal Y se diluya con las divisiones celulares -esto suele necesitar de
doble hebra es reconocido por RISC (complejo de silenciamiento indu - · rse
24 a 72 ho ras-. La concentración de proteína diana suele deterrruna

432 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 siRNA s intétir.o
3 · ,.11 111111111 11111111111 5'
S' JJJlltlllllllllllllltll 3'

----1~
RISC /o u
3 ' 11111111111111111111111 5'

5' u 11111 ~: ~ ~~• ~11'111111 3' e o,cer

l!I

f 71;\' ¿!::::::::~Ju1:::::()
5'

# 1

/
~º - ~""=__.,
\11 3
5·~ \ ~ ,
mRNA diana / D "" /
/ ---:;'"
,,,

DN A con con stru cción para expr esar sh RNA

EBP50

--
(c) EPB50
(b) Control siRNA Co ntrol si RNA

EBP50

Tubulina

FIGURA 9-38 El siRNA y el DNA que expresan shRNA pueden utilizarse tarJr, fuE:-ra rJ,:-1 nucleo, la hr;rqurll" dt:- Ri !/- SE: cor, . .e-ne e--i L'"' SJStra· o ae 1~
para la degradación de los mRNA específicos en células cultivadas. ít U(\¡c.a)o ü1r(:F rJdÍ(J (j!:'rl;..rrjr él ) 1Pi ¡¡.. a'Jec u2;rJ :i OJ Ce>mo '::'J'2'rf~:c: 'JI:- ':Sta

En el primer paso (m , un siRNA d e d oble hebra que tiene hom ología con tr:-cr1ologia, lv: m 1r:sttgooores quFrían analizar 10;, '='f-eCi.os d::I )1'.e:--: a..n,~;,:o
el mRNA diana es int roducido a las células por tran sfecc1ón Este PN /, d,. de- una protr-1na, llamad;, EBPSO. qui:"-\ un 'Ompc,r.<>nte de 11 s,Jpernc,e
doble hebra es reconocido por el co mplej o RI SC (f)J q ue deg rad a unil hebra ctlular de lil, rr11cro•1tll0,1dacJps I lf-dS'- 1,
, · ·: 1 Se diseñaron ,iRNt.
1
del RNA y dirig e el mRNA con la secuencia ho m óloga (l]J. El mRl,A d ian a ~s sus c"p"c1rJdrJ es pdr" \ dr:nc1ar EBf'5ú en ctlu!as cul: ,aa::s fue e,¿,iuada me-
cortado (D) y d eg radado (~ ). En una estrategia altern ativa, una cons1ru(c10n d1,m tP unil ,r,rnuno1ramféré-nc1" cor, dí1t1lu':·¡;os E[lP50; art 1cuerpos para
de ONA que co ntiene una sec uen ci a que al ser tran scrna fo rmar¿, und hor- tubul 111,j cün10 ror,trol. Ir_¡ L;~sr.1uE':. an-.:11iz¿,r0r• la; c.f\u!as µ-::ro las rnicr:>1~Pc-
quilla es intro duc ida a la célula (0). Este DNA se puede _1n troduc,r med1;,nte s1dacfr::s rri<:-d1ar1tE- t 1r1í1c.. n pc:irr: l!l rJr'1i'• ~1c1 ~Sí.J':': r~~ ezr.r '::--, -::s~as sec:iorr.:is
rran sfección O llevarse en una partíc ula v,ral. En cualqu11:r caso, es mod1fic?.do f(,;íiÍúCdlf·j F-(1 Id rJ;· lo r':~ 1... 1--J l¿:s (':l J'á:, írJ ·ra·.adas tiere;1 -
~(lr(f· •~ 1J [J' f1 (,;'
4

genéticamente para que lleve con él un marcado r seleccionable por f:irmaco abundanti::-(;. rr,irro,~ll 0·.da,.Ji:.s. '7" i:-n•r~:. 'J ·J'? Id'.:'. c~luld:. en las que EBPSQ na
(no se m uestra), de manera tal qu e se puedan seleccionar las cel1Jla·, r•n li:~ sido silr•(!(lcda ~Olú t1':'nc.n u neis e,r..1COS rr.ir rr.) 1'?11'):, da des 2i\r~de,j1y de su
cuales este DNA se integre al genoma. Cu and o es transcri to (fl) ¡ transpor - per1fr:r1d ~a1 •L,:. ·, . , ·1:- ·' 1· ' / , ,., . , .. :- - 17S:~·.,·

9.5 Perturbación de funciones celulares específicas 433

 ◄
la)

Crecimiento de larvas de gusano Transfe rencia de algunos adultos Se permite que los embriones
ne matodo sobre cepas especia les para poner emb riones, luego se convierta n en ad ultos y se
de E. coli eliminación de los adultos observan sus fenotipos
D D El

lb) Tipo silvestre tac- 1 RNAi

FIGURA 9-39 Las búsquedas por RNAi pueden explorar la función de doble hebra correspondiente a un gen de nematodo. (a) En este enfoque, se
todos los genes en el nematodo Caenorhabditis elegans. La determ1na- ut iliza una cepa especifica de E. coli para alimentar a larvas de nematodos O
c1ón de la secuencia del genoma de C elegons en 1998 revelo que cont iene y se suprime la expresión del gen diana en la linea germinal. Debido a que
alrededor de 20 000 genes que codifican proteínas tsta 1nformac1ón abrió la estos nematodos son hermafrodnas que se autofecundan (tienen los órganos
posibil idad de usar RNAi para silenciar la expresión de cada gen para explorar reproductores de ambos sexos), no es necesario que se apa reen sino que
qué efecto tendría. En la actualidad, esto se realiza de rut ina. El nema todo simplemente se deja que los gusanos adultos pongan huevos EJ. Cuando éstos
puede vivir alimentándose de la bacteria Escher,chro co/1, y es posible expresar crecen y se convierten en adul tos, se puede evaluar el efecto de la RNA1 en el
en la bacteria un segmento largo de RNAde doble hebra que corresponde a gen diana. (b) En este eJem plo, los investigadores buscaban genes necesarios
un únrco gen de nematodo. Notablemente, cuando el nematodo se alimen- para el movi miento nuclear. Se 1dent1ficó un gen llamado TAC-1, cuyo producto
ta de la bacteria, el RNA de doble hebra entra a las células del intesuno y es se localizó en los centrómeros y es necesario para la distribución normal de
reconocido por Dicer y procesado para dar los siRNA que se diseminan a casi los microtúbulos, como lo revela la microscopia de 1nmunoíluorescenc1a con
todas las células en el animal Por lo tanto, los investigadores han construido ant icuerpos contra tu bul1 na (Parte lbl rle N Le B01 v cols. Currenr s,olO<Jy 13:1 49912ooi11
una biblioteca de ceoas de E. coli, cada una de las cuales expresa el RNAde

mediante inmunotransferen cia (véase la Fig. 3-39) y, si se reduce sig- perm itir que las célu las lo inco rporen o mediante el uso de vectores
nificativamente, se analiza el fenotipo de la célula. La in hibición de la vira les que in troducen el DNA de modo más efi ciente.
expresión génica por siRNA se ha convertido en una técn ica estándar;
En la actualidad se están haciendo enormes esfuerzos para explo-
en la Figura 9-38b y 9-38c se muestra un ejemplo y, a lo largo de todo
rar los efectos de la inactivació n de la expresión de cada gen en líneas
el libro, se pueden encontrar muchos otros ejemplos.
celulares cultivadas y luego anal izar sus efec tos en vías específicas. Este
Una estrategia alternativa para inhibir la expresión de proteínas
esfu erzo está en sus etapas iniciales, por lo tanto, perfeccionamientos
es introducir construcciones de DNA adecuadas dentro de las cél ulas
futuros proporcionarán una visió n de la " bio logía de sistemas" de la
que generarán los siRNA cuando sean transcritas (véase la Fig. 9-38a). organización y fun ción ce lu lar.
Para lograr esto, la secuencia blanco está presente como una repeti -
ción invertida en la secuencia de DNA. Cuando se transcribe, el mRNA
formará una horq uilla de RNA corto de doble hebra (shRNA), que es
reconocida y cortada por Dicer para generar siRNA. Esta técn ica ti ene La búsqueda genómica utiliza siRNA
la ventaja de q ue una vez que se expresa el shRNA, siempre se si nteti zan en el nematodo elegans c.
los siRNA, lo que da como resultado un silencia mi ento permanente de
Cua nd o en 19 98 se determin ó la secuencia genó mica registrada del
la proteína diana. Esto no funcionará si la proteína es esencial, en cuyo
gusano nematodo Cnenorha/Jdit is elegans proporcionó el primer ca-
caso el método de elección es tratar a las células con siRNA. La cons-
ta' Iogo de todos los genes prese ntes en un 'an imal. También proveyo· la
trucción de DNA para expresar shRNA se puede introducir en las cé-
posibilidad de explorar la fu nció n de cada gen utilizando RNAi para
lulas med ia nte ad ició n simple de DNA en co nd iciones adec uadas para • · 1 ·,
suprimir ª expresion de cada gen ind ivid ual. En efecto, este nema 1odo

434 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

 - - -
14425RNA 4 000 000 d e imágenes Observación
Anál is is automat izado
de imágenes de l investigado r

D El El a
l
i 30 c a n d ida to s
lb¡

Monopolar Muhipolar

FIGURA 9-40 Las búsquedas por RNAi pueden explorar la función de to-
dos los genes en células cultivadas. ~e : C': -'i:, CJ ¡ , , é:'.la: ,:;f 3 - :,: 0 :;;o ~
fruta Or01ophilo rnelonogo:;er putd,, •· .ccrpc ·;; · =· .;. Oi: •é: - • :: , ~ ,; , e ·e;:-
En eSi':- '2JE:-rr,r, .r.,, 18S ,... .1es~ -::~c;C,r':'s : ... er ·:::-- :=-· :;_ ::::· =-:.-
d(.: gt:-r1F-S r.-srI-cíhcos..
nE.-:, qué afectaban 1:-I huso rnnó;,1co. Se co,c.,~a·e,,-¡- · ¿ ¿ 25 :;, . :. e~ ce..::-= r7::.·~ -
U1ferént es E-n 96 rr11cropo-:illcs D . S'::' é:ñcCt:., ::::. c:I:' .J·~:. -::~ .: -~·-:,:; .. ; :: :a:.::
pocillo. ~r- s1lr-nc1d ti g,,n diana/ li:s C" luli:, , ~ · "'=n ::;;,,a - : ·:,· ,e _ :; . ::--
pon~ntes de 105. oc!cs dr:-1 !-'usei. Las. cflu 1as t..:=:,;o ;,:; a-~ za,... 7- ... - ~ ~-e:.~:::>
i:,10 automa¡¡zado R Las 1mi:genes luego:': a-e zar- ::-:.· ::,:,-- ::. ... ·:::::.·~ . !'= Anastral Monastral
r~·úne und gal1:-ria de 1rnáge-ne-s D. Un .::s: ;::-::r:: ... .-:..~:, e, a-- - ::: ;:;;. ~-:::;~-7s
1
-
bipolar
p;,ra Qqur:-llas qui:. t 1E:-nen ,_;n ef€-C:O c0n(_,· a:--te :s::,:r- ::: :, -~~ ~ ;:-::: :..-- ::::- - ... ~:
{b} Se rE-r uo~rárCJn d i 1€:'rsos ':-JE-r-- p!0s d,::- r _.:::.:, a::~-r~-- -~: r;.- ~=·e::..::-- ·:: ~. s~
tiñe-ron para rn1cr0túbulos r 1E:-rd1:-1. 1.,n ,.~:--... r:v~er ·,::. ;::c.!:' -::~ - -~:,
(;Jzulj f¡..,::rJI• ••Jj f¡ ,1';'.I l, , :.,-:,r' o- 't.. ,:ji. ( ':•.•.• ,.... <, , •••: • :,:- : ",: • '• 3 16:.!.

fue el p rime r a nimal en el c ual se intentó una búsqueda genómi ca por frutJ cu lti\'Jdas. Dcbido al numere) elc:,·.11.lú de genes p.ira s..-r .rn.1liz.i-
RNA i. C. elegans pue d e vivir alimentándose de la bacteria f. coli. :-S:o ta- dos, ,e dt'>.irrollaron tt'.:nic.1s ,rntomatiz.1d.1, .1 gran esc.11J 1 :' !s . ..)_~ .! 1.
blemente, si la bacteria ex presa un RNA d e doble h ebra ho mólogo a un Por ejemplo. ,e fab ricaron .ilrcdcdor Je l :i 096 mi,ropl.1c.1s c.id.i un.i
gen de nem atod o, cuando las bacteria; son ingeridas son degradas )' el cu ntcn i,·ndo un R:---:r\ dt' d0ble hd1r,1 p.1r.1 un g<'n csp<·,1tiw. Se .1ñ.1dic•-
RNA es abso rbido a través d el intestino, y luego es procesado po r !Jiccr rnn la, cdul.1s )' d R:---:.-\ de doble hd,r.i t"u<· inrnr¡'l>r,1do ,. prl',cs,.1J 0
para suprimir la ex presión d el gen di ana. Deb ido a que ex i; ten alrede- po r Dict'r pJr.1 dar , iR:-S:A , que .1 ,u , a ,uprimic:ron IJ c·:xrrc:,i0n dd
dor d e 20 000 genes diferen tes en el nematodo, ;e generaron muchas gl'n diana. 1.a, cd ula, ,e pueden .111.ili1.1r ¡1 .ir.1 un fenotip,, esp,·,iti, 0 .
cepas de f. coli diferentes, cada una exp resand o R:---:A de do ble hebra l: n d ei<.'mplo que,<.' mu<.' ,tr.1 c·n l.i f 1; ur.1 ·'· -i"P. l,1- in,c,t il!,idorc''
dirigido contra un gen nemato d o e;pecífico. En un cxperimenw típico <.'Xploraron d <.'Ít'cto de· l.i , uprc,inn gcnt,.1 en l.1, cclul.i, dete;id.i, ei~
para eliminar la expresió n de un gen único ( 1-ig. 9 · 3:J J, lo, nema todos mito,i,. Como c·,to <.', un,1 hu,4uc·d.1 m0rfol0g1,,1. l.1, ,,·lul.1, "' ,iíicn
son cri ad os sob re las bacterias que expresa n d R:-;A de doble hebra co n nurc.1dorc, .1decuado, ,. ,e ut ihL.1 un m1, rc1-c,,p1t1 r,,b0 tic,, ¡,.ir.i
emhrionc,. toma r 1magc:ne;. t¡Ul' ,e: an.1lizan meJ1Jnt,· un pro¡,:ram:i rní,,rm 3~¡,0 _
espec1' fi co, y es
to supri·m e la expresión
· . en ,u;
del gen diana
, d los nematodos adu ltos ha n dcpo,1tad o sus huerns, son De e;tc modo ello, 1dcnt11-1cJron alrcékd0r de' 150 gene, nueYos .:uq,5
1) espues e q ue . . .
. · d a li· za e l efecto ,obre lo, embrio nes en crec1m1ento produc1os contribu)·en a IJ m1tm1, , . p0r le, t,mto. ,011 c,.:clcnte, can-
e l1m111a os y se a n -
didatos para po,teriorc-s cstud10, d,· m,n·0r proiundidad
( Fig. 9 -JL/b ).
, ,. nr· t1·--hJ
.-\ d iferencia del n ema todo r<.'.:1en d,,,- c_r..ltl, • 110 t.. ¡· ·
:-1 et~ 1n1tn,lr
- d - mi· cas usando siRNA en moscas de la fruta La mo,- la expresión de gl'nc, alimentando !J, lan·as wn R>-" .-\ de doble h,+r.1.
Busque as gen 0 . .
· a lrededor de 14 000 genes q ue codifican prnte111as, Si~ embargo, e; p0sibk utilizar R_, _-\i p3r J b ,u pres ion c,pcciñc.1 de
ca d e Ia fruta tiene
y se han desarrollado técnicas para explorar la consecuencia del uso de tepdo,-_E<;t0 se logra con una mosca en lJ cudl un,1 horquiJI.1 ck R:--;_-\
si RNA para suprim ir cada una d e estas e n las célul as de mosca de la c,pcc1hco ,e exprese <letras de una ~cc uc·ncia de acti, acion ,nrriente

9.5 Perturbación de fu nciones celulares especificas 435

 arriba (UAS, 11pstrc,m1 -ncri1•n1i11g sc1¡11c11ct') µara la protd na de un ión específico de tejido, el efecto de la supresión de cada gen en el genorn
puede evaluarse en ca. d·•1 t e¡i ente enª
al DNA Gal4. En ausencia de Ga l•!, l.1 horquil la no se expresa, ¡.ior lo ··do · Este tipo de técnica está actualm
tanto no se produce la supresión. Sin embargo, si Gal4 se expresa de- curso y se esperan resu ltados sorprendentes en el futuro cercano.
trás de un promotor específico dé téj ido, se exp resará en ese tej ido, se
unirá a la UAS y conducid la expresión de la horquilla de RNA, que
se rá procesada po r Dicer pa ra dar siRNA y suprimir al gen específico
( 1-ig. 'J -41.1). El sistema se ha establecido de esta fo rma de manera tal CONCEPTOS CLAVE de la Sección 9 .5
que pueda realizarse a escala genómica: se han construido 14 000 líneas
de moscas diferentes, cada una de las cuales con la UAS para regular la Perturba ción de funcione s celulares específicas
expresión de una horquilla específica para un gen diana. Cuando cada • Las técnicas de genética han sido cruciales en el análisis de vías bio-
una de estas moscas se aparea co n un a mosca que porta el ge n Gal4 lógicas celul ares complejas. En la actualidad, las técnicas genéticas se
están extendiendo y complemen tando con búsquedas químicas y el uso
de la tecnología por RNAi.
• Se pueden analizar bibliotecas químicas grandes en búsqueda de com-
puestos dirigidos contra procesos específicos para estudiar aquellos
(a) Progenitor A Progenitor B procesos e identificar component es nuevos.
Promotor especifico • El tratamiento de células cultivadas con siRNA adecuados conduce a
para tepdo
la destrucción de los mRNA diana y, por lo tanto, al "silenciamiento" de
la proteína codificada.
• Con la disponibilid ad de los genomas registrados, las búsquedas de
RNAi se pueden usar para investigar los efectos de la supresión de la
Progenie
expresión de cada gen individual en un organismo. Esto se ha logrado
en el gusano nematodo y en células cultivadas a partir de la mosca de
la fruta.
:::@::::::a:::::::)

1 Vía de RNAi
• La RNAi se puede utilizar para suprimir la expresión de genes espe-
cíficos de tejido en un esquema específico de tejido; en la actualidad se
está aplicando esta técnica a escala genómica en la mosca de la fruta.
Silenciamie nto de gen
específico para tejido

Perspectivas para el futuro

Este capítulo ha introducido muchos aspectos de la tecnología que en

la actualidad utilizan los biólogos celulares. La ciencia es conducida por
la tecnología disponible y con cada desarrollo podemos mirar más pro-
funda men te en los misterios de la vida.
La capacidad para hacer crecer células en cultivo fue un avance
gigante en tecnología - permitió a los investigad ores analizar Y ex-
plorar los funcionami entos in ternos de las células-. Las técnicas en
cultivos ~elulares aú n se encuentran en desarrollo; por ejemplo, en
la actualidad contri buyen al fascinant e desarrollo de la investigación
de las células madre (véase el Cap. 2 1). Aunque la mayoría de los es·
FIGURA 9-41 La RNAi se puede usar para suprimir genes de una manera
específica para tejido en la mosca de la fruta. Se han utilizado enfoques ludios utiliza n placas planas para cultivar estas células, en el cuerpo
genéticos para desarrollar métodos pa ra suprimir la expresión de genes d1and estas fo rman est ructu ras tr idimensio nales. Las áreas más importantes
en tejidos específicos. Esto implica utilizar dos grupos grandes de moscas. En de inve st igació n está n anal izando en la actualidad las funciones de
el primer grupo, de alrededor de 14 000 moscas diferentes cada una designada las células e_n ambi ent es trid imensionales y generando organizaciones
para un gen diana (grupo A), se generaron moscas en las cuales una horqu1·
celu_lares tri d imensio nales, como los tubos epiteliales, en sistemas de
lla de RNA específica para el gen diana se encuentra bajo el control de una cult 1vo con soporte.
secuencia de activación comente arri ba (UAS) para el act1vador transcnpc1onal
Gal4. En cada una de las moscas del segundo grupo (grupo B). la expresión El descu bri'.11ien to Y el uso de PFV y otras proteínas fluorescen-
de GAL4 está controlada por un promotor específico de tejido. Cuando una tes han revoluciona do la biología celular. Al marcar las proteínas con
mosca del grupo Ase aparea con una mosca del grupo B, Gal4 se expresará en PFV y segui r sus loe 1·- · .
a 1zac1ones en las células vivas se ha ac larado que
un teJido y, por lo tanto. la horquilla de RNA1se expresará y el gen se silenciará el ci toplas ma de las células es mucho más dinámico de lo anterior·
en este tt:Jido. (b) Un OJO de mosca de tipo silvestre (,zqwerda) y uno en el cual men te previsto Cad · , asocia
· ª ano aparecen nu evas tecnologias · das con
el gen wh,ce ha sido silenciado específicame nte en el ojo (derecha). 1Panc 'hl d,, N
Perumo n y cols , 2010. Cofd Spr,ng '1orlx,r Per~peo 810I 2:a003640,
las proteínas flu orescentes; técnicas como FRAP, FRET y TIRF se han
co nvertido en herra · . as para explorar ¡ dinárnJ•
mientas generahzad as

436 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

, .,~ ·, lu - rn,r.HlÍ\1110, rnokc11l.m:" <le las prutl'inas, ya sea in vivo 0 citoplasma 424 microscopia de inmw10fluon."SCencia
111 '; 1tr" 1 11 el 11101n..·nto -iuc ,c cK ribió c~te libro, cst,lbamos viendo microscopia de desconvolución 41 2 indirecta 4 1O
,111.1 1c,,1l11, 1n n rn l.i_ microscopia Je supcrrc,olución, desplegando centrifugación diferencial 427 lisosoma 425
\.1 , .,p.1,rJJd d .: lo,a\izar mol(:culas por rnicroscopia óptica con una microscopia de contraste proteína de transporte
l'r,'cl '1<ll1 ,·.1ri.1s VL'(CS , uperior a lo qui: se , reía era posible. La mi- de membrana 42-1
por interferencia
, r,,,u1pi.1 d.: , up..:rresolución actualmente sólo puede rea lizarse sobre diferencial (DlC} 427 sombreado metálico 4.20
11111t·,11 .1, 1ij.1d.1,; lo, optimi, tas creen que pronto será posible lograr retíc ulo endoplasmj tico mitocondria 42i
c.:,1c.: nivcl dc rc,ohrción en células vivas y. por lo tanto, ab re la posibi- ( ER ) 425 anticuerpo monoclonal 403
lidad de.: ohserv:1r los proceso, din.lmicos a ni\'el molecular. A med ida cndosoma 425 orgánulo 398
que sc ck sa rrollan estas técn icas, menos personas necesitan utilizar la centrifugación por gradiente prroxisoma -127
micro,copia electrónica y, en consecuencia, están disminuyendo los de densidad 427 microscopia de co ntraste
cxpt'rlos en csla ;\rea impo rtantc. clasificador celular activado de fase 407
La RNAi ha proporcionado nueva lecnología impresionante e in - por fluorescencia ( FACS} -IO 1 microscopia de localizació n
esperada al arsenal de técnicas disponibles para los biólogos cel ulares y cecuperación de la fl uorescencia fotoactivada (PAL/',,!) 418
del dcsarrollo. La capacidad para realizar búsquedas en iodo el genoma, después del fotoblanqucam iento anticuerpo policlonal 403
tanlo en el gusano nematodo como en la mosca de la fruta, ha hecho (FRAP ) ,11 6 resolución 405
que los sistemas biológicos trndicionalmente excelentes sean aún más ti nción flu orescente 408 microscopio elect ró nico
poderosos. El acoplamiento de estas tecnologías con las búsquedas vi- 1ra nsferencia de energía de de barrido (SEM) 419
suales abre otra dimensión. Considere el siguiente problema: ¿cuál de resonancia de Fiirster (FRET) 41 6 microscopia de fluorescencia
los genes en el nematodo afecta la organización de un pcque1io sub- complejo de Golgi 425 por rcfl ex.ión interna
grupo de neuronas? Hace unos pocos aiios, esto podría haber sido un hibridoma 403 total (TIRF) 415
problema técnicamente desafiante. En la actualidad es posible obtener microscopia de microscopio electrónico
un nematodo en el cual solo esas neuronas estén marcadas con PFV )' inmunofluorescencia 398 de transmisión (TEM ) 419
luego someterlas a una búsqueda por RNAi en genómica para ver qué
productos génicos son necesarios para la morfología normal de esas
neuronas. Se están desarrollando cada vez más técnicas imaginativas en
combinación con la RNAi con búsquedas funcionales y visuales, tanto
en los gusanos nematodos como en la mosca de la fruta, lo cual permite Revisión de los conceptos
una comprensión cada vez más profunda de los procesos de la vida.
Además, se están haciendo todos los esfuerzos para explorar los efectos 1. Tanto la microscopia óptica como la electrónica se suelen utilizar con
del silenciamiento de la expresión de cada gen en las líneas celulares frecuencia para visualizar células, estructuras celulares y la localización
cultivadas para luego analizar los efectos en vías específicas. Este esfuer- de moléculas específicas. Explique por qué un científico puede elegir
zo se encuentra en su primera etapa, por lo tanto, futuros perfecciona- una u otra técnica de microscopia para usar en investigación.
mientos y análisis proporcionarán una visión de los sistemas biológicos 2. La amplificación posible con cualquier tipo de microscopio es una
en cuanto a la organización y la función celular. propiedad importante, pero su resolución, la capacidad para distinguir
¿Se puede utilizar la tecnología RNAi en medicina? ¿Podría esto ser entre dos objetos muy juntos, es incluso más importante. Describa por
utilizado para inhibir la expresión de los oncogenes en el tratamiento qué el poder de resolución de un microscopio es más importante para
del cáncer? Los problemas de distribución tecnológica son significati- visualizar detalles finos que su amplificación. ¿Cuál es la fórmula para
vos puesto que siRNA necesita llegar a las células indicadas, permane- describir la resolución de una lente de microscopio y cuáles son las
cer estable en el paciente y ser eficaz en silenciar a la proteína adecuada. limitaciones en cuanto a los valores en esta fórmula?
En la actualidad se está evaluando la posible utilidad de esta técnica en 3. ¿Por qué son necesarias las cepas químicas para visualizar las células
al menos una docena de ensayos clínicos. Si se pueden superar los obs- )' los tejidos con el microscopio óptico básico? ¿Qué ventajas propor-
táculos técnicos, la RNAi podría convertirse en una clase importante cionan los colorantes flu orescentes y la microscopia de fluorescencia en
comparación con los colorantes químicos usados para tei'lir muestras
de agente terapéutico. . , .
•Qué tecnologías nuevas traerá la nueva decada? En la ultima dé- para microscopia óptica? ¿Qué ventajas proporciona la microscopia de
cad:, la R.NA.i y la PFV han revolucionado la biología celul~r. No caben barrido confoca l y la microscopia de desconvolución en comparación
dudas de que la siguiente década traerá nuevos desarrollos 111esperados, con la microscopia de fluorescencia convencional?
por lo que debemos estar muy entusiasmados por lo que ha de vemr. 4. En ciertos métodos de microscopia electrónica no se obtiene la ima-
gen directa de la muestra. ¿Cómo brindan estos métodos la in forma-
ción acerca de la estructura celular )' qué tipos de estructuras se visuali-
zan? ¿Qué limitaciones tienen la mayoría de las formas de microscopia
electrónica?
Palabras clave
5. ¿Cuál es la dife rencia entre una cepa celular, una linea celular y un
cloroplasto 427 don?
microscopia óptica
d on 398 6. Explique por qué el proceso de fusión celular es necesario para pro-
de campo claro 404
microscopia confocal 4 13 duci r anticuerpos monoclonales usados para investigación.
línea celular 400
microscopia crioclectrónica 422 7. Mucho de lo que sabemos acerca de la función celular depende de los
cepa celular 399
cultivo 397 experimentos que utilizan células específi cas y partes especificas (p. ej.,
proteínas quiméricas 398

Revisión de los conceptos 437

 ◄ 1

orgánulo~) de células. ¡Qué técnicas utilizan co múnmen te los cientí fi - monofosfóricos a pH ácido; la citidil transferasa está involucrada e
. . .d n la
cos para aislar células)' orgánu los a partir de mezclas compkjas y cómo biusíntesis de fosfolípidos v la ammoac1 o permeasa en el transp
' Drtc
funcionan estas térnicas? de aminoácidos a través de membran as.
8. Hocchst 33258 es un co lorante químico que se une cspecíficamentt' a. Nombre a la molécula marcadora )' asigne el_ número de fracción
al DNA en las células vivas y, cuando es excitado por la lu z U\/, tluoresce que está más enriquecida con cada uno de los s1gu1entes componentes·
en el espectro visible. Nombre y describa un método específico, em- lisoso mas; perox.iso mas; mitocondri as; membrana plasmática; reticuJ~
pleando Ho cchst 33258, que podría utilizar un investigador para aislar endoplasmático rugoso; retículo endoplasmá tico liso.
fibroblastos en la fose G2 del ciclo celul ar a partir <le los fibroblastos en b. ¿El retículo endoplasmático rugoso es más o menos denso queeJ
interfase. retículo endoplasmático liso? ¿Por qué?
9. shRNA y siRN1\ se pueden uti lizar para silenciar ex itosamen te la c. Describa un enfoque alternativo mediante el cual usted podría
expresión ele cualquier proteína específica en una línea celular u or- identificar cuál fracción está enriquecida con cada orgánulo.
ga nismo dado. La utilidad de uno sobre otro es debatible, pero existen d. ¿De qué forma podría la adició n de un detergente al hornogena-
motivos para usar uno de ellos para aplicaciones terapéuticas en un do, el cual rompe las membranas al solubili za r sus componentes lipí-
organismo vivo. ¿Cuál de los dos métodos es probable que sea más ven - dicos y proteicos, afectar los resultados del equilibrio de gradiente de
tajoso a largo plazo y cuál es una de sus limitaciones? densidad?

2. El gusano nematodo C. elegans es adecuado como modelo para los

estudios de siRNA. En este experimento, los nematodos adultos se
Análisis de los datos alimentan co n una bacteria que expresa un RNA de doble hebra para
suprimir la expresión del gen une 18, cuyo homólogo en mamíferos co-
l. Las células hepáticas murinas se ho mogeneizaron y el ho mogenado difica una proteína que participa en la integración de las vesículas de
se sometió a centrifugación por gradiente de densidad con gradien- almacenam iento de GLUT4 en la membrana plasmática. Antes de eva-
tes de sacarosa. Las fracciones obtenidas a partir de estos gradientes se luar los efectos en el organismo mismo, es necesario utilizar RT-PCR
analizaron en busca de moléculas marcadoras (es decir, moléculas que para analizar si el experimento de siRNA funcionó. Las muestras son de
están limitadas a orgánulos específicos) . Los resultados de estos ensayos embriones provenientes de cinco adultos alimentados con las bacterias,
se muestran en la figura. Las moléculas marcadoras tienen las siguien- y a continuación se muestran los resultados obtenidos después de apli-
tes funciones: citocromo oxidasa es una enzima involucrada en el pro- car RT-PCR usando cebadores para amplificar los mRNA de dos genes
ceso por el cual se forma el ATP en la degradación aeróbica completa diferentes, uncl8 y GLUT4.
de la glucosa o los ácidos grasos; el RNA ribosómico fo rma parte de los
ribosomas que sintetizan proteínas; la catalasa cataliza la descomposi-
ción del peróxido de hidrógeno; la fosfatasa ácida hidroliza a los ésteres

Gusanos

A B c DE F B c D E
100

80

--
o
E 60
X
· <O
E
Q)
'O
o~
40 -- - - -
20

0 L-- -L...L--'---~ ~~~~- ~~ ~- ~ - ~

O 5 10
Número de fracción
15 20

50% - - - - - - - - - - - -- - Sacarosa 0%
--- - - - - -
Curva A= citocromo oxidasa Curva D = fosfatasa ácida ª· De los embriones analizados ·qué muestras demuestran que Jos
1
Curva B = RNA ribosómico Curva E = citidil transferasa · . ' . .
adul tos mcorporaron exitosamente las bacterias contemendo el R
NA
Curva C = catalasa Curva F = aminoácido oermeasa "' ni
de doble hebra une 18? ¡Basándose en qué llegó usted a esta conclusio ·

438 CAPÍTULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células

d
 b. ,\J.1 rc.1r rn:íles grupos de bandas resultan de la amplificación con Egner, A., and S. Hell. 2005. Fluorescence microscopy with super-resolved
1," cd,.1do rcs unc l 8 y cuál~s. de los cebadores para GLUT4. ¿Por qué uptical sectio ns. Tre,u/5 Ce// Bio/. 15:207- 2 15.
s~ uul1ló c,imo con trol positivo pa ra la RT-PCR a los cebadores para Gaietta, G., et al. 2002. Multicolo r and electro n microscopic imaging of
GLL; r.,i ¡Q ué le dice esto a usted acerca de la relació n entre el silencia- con nexin trafficking. Scie11ce 296:503-507.
111 i,·nto J el mRNA de unc l 8 y de GLUT4?
G .1epmans. B. N . G ., et al . 2006. T he flu orescent toolbox fo r assessing pro-
c. Con anticuerpos contra une 18, esquematice una inmunotransfe- tein location and function. Scic11ce 312:2 17-224.
n:nci.1 ( Weste rn blot} que muestre los resultados esperados a partir de G il roy, S. 1997. Fluorescence m icroscopy of li ving plan! cells. A 1111. Rev.
111 ucstras de proteí nas de cada una de las 5 muestras. P/a,11 P/1ysiol. Pln11t Mol. Biol. 48: 165-190.
d. Para investiga r aún m ás la relación entre las proteínas une 18 )' Huang, B., H . Babcock, and X. Zhuang. 20 1O. Breaking the diffractio n ba-
GLUT-1 , se repite el experimento con siRNA, pero en células embriona- rrier: super- reso lutio n imaging of cells. Ce// 143: 1047- 1058.
rias que expresan una proteina GLUT4 marcada con PFV. Dibuje una lno ué, S., a nd K. Spring. 1997. Video Micro5copy, 2d ed. Plenum Press.
célula que incluya sus mitocondrias, núcleo y retículo endoplasmático Lippincott-Schwartz, J. 20 10. lmaging: visua lizing the possibilities. /. Ce//
rugoso y muestre dónde, si se utiliza un microscopio confocal de barri- Scic11cc 123:36 19-3620.
do lüser, se podría localiza r la fluorescencia de PFV en las células que Lippincott-Schwart z, J. 201 1. Eme rging in vivo a na lyses o f ce!! function
expresan siRNA une 18. No se olvide de dibujar la célula que representa using íluo rcscence imaging. r\1111. Re,,. Biocl1c111. 80:327-332.
d control. Matsumo to, B., ed. 2002. Methods in Ce!! Biology. Vol. 70: Ce// Biological
e. La capacidad de una proteína para colocalizarse con o tra proteí- Applicntiom of Co11focal Microscopr. Academic Prcss.
na sugiere pero no prueba que las dos interactúan físicamente una con Mayo r, S., and S. Bilgra mi. 2007. Fretting abo ut FRET in ce!! a nd struc tural
otra. Tener a mbas proteínas m arcadas, en este caso unc l 8 con proteína biology. /11 Ev11/11ati11g Tcc/111ii¡11es ;,. Biochemical Research, D. Zuk, ed. Ce!! Press.
verde flu orescente y G LUT4 con proteína roja fluorescente, proporcio- Mistcli, T., and D. L. Spcctor. 1997. Applications of the green fl uo resccnt
na al experim entador los reactivos para separar la cuestión de colo- protein in ce!! biology and biotechnology. Nat11re Biotech. 15:96 1-964.
calización respecto de la interacción. Usando estos reactivos, describa Pepperko k, R., and Ellenberg, J. 2006. High-throughp ut fluorescence mi-
una técnica que podría sim plemente demostrar que une 18 se colocaliza croscop¡• for s¡•stems biology. Na t11re Re,,. Mol. Ce// Biol. AOP, pu blished o nline
con GLUT4 y otra técnica q ue pruebe la interacción físi ca de las dos July 19, 2006 (doi: I0. 1038/nrml979).
proteínas. Ro ukos, V., T. Misteli, and C. K. Schmidt. 2010. Descriptive no m o re: the
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440 CAPITULO 9 • Cultivo, visualizació n y perturbació n d e células

 Separación de orgánulos EXPERIMENTO CLÁSICO 9.1
H B,:·a11lay y rnh. 19M, Biochem,cal Jouma/ 92:1 9 1

n las décadas de 1950 y 1960, los cientí- zimático posterior. Una vez que completó el
Eti.:os utilizaban dos técnicas para estudiar única." Brevemente, estas hipótesis proponen
que la composición completa de una pobla- fraccionamiento, de Duve llevó a cabo ensa-
los orgánulos celulares: microscopia y frac- ción subcelular contendrá las mismas enzi- yos enzimáticos para determinar la distribu-
cionamiento. Christian de Duve estaba a la mas y que cada enzima se localiza en un sitio ción subcelular de cada enzima. Representó
vanguardia del fraccionamiento celular. Al independiente dentro de la célula. Con estas luego la distribu ción de la enzima a través
comienzo de la década de 1950, él utilizó la dos hipótesis y la poderosa herramienta de de toda la célula. Como se había demostrado
centrifugación para distinguir un orgánulo centrifugación, de Duve subdividió aún más anteriormente, la actividad de la citocromo
nuevo, el lisosoma, de los fraccionamientos la fracción rica en mitocondrias. Primero, oxidasa, una enzima importante en el siste-
previamente caracteri zados: el núcleo, la frac- identificó la fracción mitocondrial ligera, la ma de transferencia electrónica, se encontró
ción rica en mitocondrias y los microsomas. cual está constituida por enzi mas hidrolíticas. principalmente en las fracciones mitoco n-
Pronto después de eso, utilizó la centrifuga- Luego, en una serie de experimentos descri- driales pesadas. La fracción microsómica se
ción en gradiente de densidad para descubrir tos aquí, identificó otra fracción subcelular demostró que contenía otra enzi ma previa-
otro orgánulo. independiente, que denominó peroxisoma, mente ca racterizada, la glucosa-6-fosfatasa.
dentro de la fracc ión rica en mitocondri as. La fracción mitocondrial ligera, que está
for mada por el lisosoma, mostró las activida-
Antecedentes des características de la fosfatasa ácida. Ines-
El experimento peradamente, de Duve observó un cuarto
Las células eucariontes están altamente orga- patrón cuando ensayó la actividad uricasa.
nizadas y compuestas por estructuras celula- De Duve estudió la distribución de las enzi- En lugar de seguir el patrón de las enzimas de
res conocidas como orgánulos que realizan mas en las células hepáticas de rata. Altamen- referencia, la actividad uricasa se concentró
funciones específicas. Aunque la microscopia te activas en el metabolismo energético, el hí- bruscamente dentro de la fracción mitocon-
ha permitido a los biólogos describir la loca- gado contiene una cantidad de enzimas útiles drial ligera, lo cual le sugirió a de Duve que la
lización y la aparición de diversos orgánulos, para estudiar. Para buscar la presencia de uricasa podría estar aislada en otra población
tiene un uso limitado en cuanto a descubrir diversas enzimas durante el fraccionamiento, subcelular separada de las enzimas lisosómi-
la función del orgánulo. Para realizar esto, de Duve se basó en análisis conocidos, llama- cas.
los biólogos celulares han confiado en una dos ensayos enzimáticos, para la actividad Para evaluar esta teoría, de Duve utilizó
técnica que se conoce como fraccionamien- enzimática. Para retener la máxima actividad una técnica conocida como centrifugación
to celular. Aquí las células se rompen y los enzimática había tomado precauciones, que en gradiente de densidad, que separa las ma-
componentes celulares se separan sobre la incluían realizar todos los pasos del fraccio- cromoléculas sobre la base de la densidad.
base de su tamaño, masa y densidad con la namiento a O ºC para reducir la actividad de La centrifugación en gradiente de densidad
utilización de una variedad de técnicas de proteasas. se puede realizar usando una cantidad de
centrifugación. Los científicos podrían luego De Duve utilizó centrifugación con velo- diferentes gradientes, que incluyen sacarosa
cidad zonal para separar componentes celu- y glucógeno. Además, el gradiente se puede
aislar y analizar los componentes celulares
de diferentes densidades, llamadas fracciones. lares por sucesivos pasos de centrifugación. realizarse en agua o "agua pesada" que contie-
Extirpó el hígado de rata y lo disgregó por ne el isótopo de hidrógeno deuterio en lugar
Usando este método, los biólogos han divi-
dido la célula en cuatro fracciones: núcleo, homogeneización. La preparación cruda de del hidrógeno. En este experimento, de Duve
las células homogeneizadas se sometió Juego separó la fracción rica en mitocond rias pre-
fracción rica en mitocondrias, microsomas Y
a centrifugación a velocidad relativamente parada por centrifugación zonal de velocidad
savia celular.
De Duve fue un bioquímico interesado baja. Este paso inicial separaba el núcleo de en cada uno de estos grad ientes diferentes
las células, que se acu mula como un sedi - (véase la Fig. 9-35). Si la uri casa fu ese parte
en las localizaciones subcelulares de las en-
mento en el fondo del tubo, del extracto cito- de un co mpartimento subcelular separado, se
zimas metabólicas. Ya había completado un
plasmático, que permanece en el sobrenadan- la podría separa r de las enzimas lisosóm icas
gran volumen de trabajo sobre el fracciona-
te. A continuación, de Duve subdividió aún en cada gradiente analizado. De Duve llevó
miento de células hepáticas, en las cuales ha-
más el extracto citoplasmático en una frac- a cabo los fraccionamientos en esta serie de
bía determinado la localización subcelular de
ción mitocondrial pesada, una fracción mi - grad ientes, luego realizó ensayos enzimáti-
numerosas enzimas. Al localizar estas enzi-
tocondri al ligera y una fracción microsóm ica. cos como antes. En cada caso, la uricasa se
mas en fracciones celulares específicas, pudo
Logró realizar la separación del citoplasma encontró en un a población separada de la
comenzar a elucidar la función del orgánulo.
empleando sucesivos pasos de centrifu gación enzima lisosómica fosfatasa ácida y la enzima
Señaló que su trabajo estuvo guiado por dos
de fuerza creciente. En cada paso recolectaba mitocondrial citocromo oxidasa (rig. 1) . Al
hipótesis: el "postulado de homogeneid ad
. , . ,, y "el postulado de localización y almacenaba las fra cciones para análisis en- observar repetidamente la actividad uricasa
b 10qmm1ca

Separación de orgánulos 441

FIGURA 1 Representación gráfica del análisis enzimático de los produc- 5
tos ,11 pilrtlr de un gradiente de sacarosa . La íracción rica en mitocondrias
y luego se realizaron ensayos
4
se separó como se d escribe en la , 1 .,.
enzimáticos. Se representa la concen tración relativa de enzimas ac tivas en el
3
eje y, y la altura de los tubos en el e1e x El pico de actividades de la citocro- Citocromo OXid
asa
mo oxidasa (arriba) y la fosfatasa ácida (abajo) se ob servan cerca de la parte 2
superior del tubo. El pico de ac t1v1dad de la uricasa (medio) migra hacia la parte
inferior del tubo.

20 40 60 80

5
"'
-~
~ 4
~
e: 3
·O Urícasa
'ü
~ 2
e:
Q)
(J
e:
o
u
20 40 60 80

3
Fosfat asa ácida
2

20 40 60 80
Altura en porcent aj e en el tu b o

en una fracción distinta de la actividad de Análisis bién proporcionó pistas importantes para la
las enzimas Lisosómicas y m itocondriales, de funció n de los orgánulos. El lisosoma, donde
Duve concluyó que la uricasa era parte de un de Duve encontró tantas enzimas potencial-
orgánulo separado. El experimento también El trabajo de Duve del fraccionamiento celu- mente destruct ivas, se sabe en la actualidad
demostró que las otras dos enzimas, catalasa lar proporcionó señales acerca de la función que es el sitio para la degradación de biomo-
y O-aminoácido oxidasa, se separaban en la de las estructuras de las células mientras tra- léculas. Se ha demostrado que el peroxisoma
misma fracción que la uricasa. Debido a que taba de asignar la localización de estas enzi- es el sitio de oxidación de los ácidos grasos Y
cada una de estas enzimas prod ucía o utiliza- mas. Analizar el inventario de enzimas en un a los aminoácidos, las reaccio nes que producen
ba peróxido de hidrógeno, de D uve propuso fracción cel ular dada le brindó pistas para sus grandes cantidades de peróxido de hidróge-
que esta fracción representaba un orgánulo funciones. Su trabajo cuidadoso dio como re- no. En 197 4, de D uve recibió el premio Nobel
responsable del metabolismo del peróxido y sultado el descubrimiento de dos orgán ulos: de Fisiología o Medicina en reconocimientoª
lo apodó peroxisoma. el lisosoma y el peroxisoma. Su trabajo tam- su trabajo pionero.

442 CAPITULO 9 • Cultivo, visualización y perturbación de células