CN1891821B - 转人溶菌酶基因的动物细胞的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转人溶菌酶基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，其操作步骤如下：(1)构建含有人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体，(2)构建人溶菌酶乳腺特异表达载体与双标记选择载体和单标记选择载体的串联结构，将串联结构DNA导入家畜体细胞核内，获得转基因细胞，(3)转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有人溶菌酶基因的转基因克隆动物。本发明所研究的重组人溶菌酶，具有与天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重组人溶菌酶的牛奶可以开发成保健牛奶及奶制品；纯化的重组人溶菌酶可以开发成防腐剂、食品添加剂、保健品和药品。

Description

转人溶菌酶基因的动物细胞的生产方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及转基因-克隆技术领域。

背景技术

转基因动物研究是人类按着自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，而改变其遗传组成的目的是多种多样的。比如遗传学家希望通过改变动物的遗传组成来观察其表型变化，生理学家希望通过特定基因的表达来研究该基因对机体生理状况的影响。与动物生产有关的转基因研究则希望通过转基因技术来赋予动物新的表型性状。该项研究在实验技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。

转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射，逆转录病毒感染发育早期的动物胚胎，精子载体法，ES细胞技术，PGCs技术，体细胞核移植技术，逆转录病毒载体感染MII期的卵母细胞，精子头与DNA合并注射卵母细胞法。这些方法上的改进与提高大大地促进了转基因动物研究由实验室向生产实践转化的进程。

其中最传统和最常用的方法是原核期胚胎的显微注射，该方法由美国人Gordon发明，是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。即在显微操作仪下通过一毛细玻璃管将外源DNA注射进动物受精卵细胞的原核内，再将该受精卵细胞移植进受体细胞子宫内，在受精卵分裂时，外源DNA可能整合入宿主染色体组，待该受精卵发育成熟即可获得转基因动物。但是显微注射法获得的转基因家畜的效率极低，特别是牛，羊和猪等，往往低于1％，这将大大增加制作转基因家畜的成本。

随着体细胞克隆技术的发展，基因操作技术与克隆技术相结合是将成为转基因动物，特别是大家畜生产的主要方式。目前，取得的主要进展是转基因技术和靶位操作技术在克隆动物上的应用。首先，利用克隆进行转基因是指在核移植前，先把目的基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞，再通过标记基因的表现来筛选转基因的阳性细胞及其克隆，然后再移植。1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与罗斯林研究所的Wilmut等联手通过体细胞核移植技术率先在世界上制作了转基因绵羊。利用胎儿成纤维细胞系，经过转染之后，再克隆。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上讲，转基因成功率为100％。原核注射的方法会使大量的非转基因胚胎被怀孕，这是一种资源浪费，而利用克隆进行转基因技术不会造成代理母亲去怀孕非转基因动物。此外，利用克隆进行转基因时，转基因动物的性别会被提前决定。这样的话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因动物全是雌性动物。

由于动物转基因技术能按照人们的意愿改变动物的生产性状，得到人们所需要的产品，特别是一些蛋白药品及保健品，科学家们已经开始将动物转基因技术应用到实践当中，目前动物转基因技术主要有以下一些应用：(1)、促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质，(2)、动物抗病育种，(3)建立诊断和治疗人类疾病的动物模型，(4)生产药用蛋白。

动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的一百倍，是一种非常有潜力的高新技术。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶样中的蛋白含量高达23克/升，大约是动物细胞表达蛋白的400倍以上。该技术一经出现就得到迅猛的发展。目前，牛乳白蛋白基因人组织血纤维蛋白溶酶原因子，人生长激素基因，人体抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干扰素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表达。许许多多的著名科学家都认为这将是畜牧业前所未有的革命，可能会给社会带来巨大的经济效益。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)，是天然非特异性免疫物质，具有强力杀菌作用。人溶菌酶(hLY)属于c型溶菌酶(Isabelle，1990)，具有抗菌、免疫调节及一定的抗肿瘤作用，有潜在的临床应用价值。人溶菌酶是一种由18种130个氨基酸组成的碱性多肽，分子量为14.7KD，等电点为pH11。

溶菌酶以溶解革兰氏阳性细菌的细胞壁而具有溶菌作用。原因在于它能水解细菌细胞壁粘多糖(polypeptidoglycan)N-乙酰葡萄糖胺(NAG)与N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)之间(NAM₄-O-NAG₅ glycosidic bond)的β-1.4糖苷键。随着细胞壁的弱化，细菌会因为内部压力的作用崩裂而死。Pellegrini等人的结果显示溶菌酶抑菌作用不仅仅与它的胞壁质酶有关，而且还与其阳离子和疏水的特性有关。实验证明，最适小分子底物与酶结合时，正好与酶分子中的长形凹穴嵌合，酶活性中心由三级结构相距较近的Asp53和Glu35氨基酸残基组成。

溶菌酶的作用：1)抗菌消炎，溶菌酶是能水解粘多糖的碱性水解酶，而粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，其能直接水解革兰阳性菌，在免疫蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰阴性菌。此外，它还会与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能够增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。2)抗病毒作用，溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白作用，与DNA，RNA，脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。近来，一些结果显示来源鸡蛋清，人乳核和人中性粒细胞的溶菌酶具有抑制HIV-1生长的活性。3)增强免疫力，溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持生理平衡的重要作用，可以改善和增强巨噬细胞的吞噬和消化能力，激活白细胞的的吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，受到病原微生物的侵害时，其发挥抗感染作用，是一种非常重要的非特性免疫物质。4)其还具有激活血小板的功能可以改善组织的局部血液循环障碍，分解脓液、增强局部防卫功能，从而体现止血、消肿等作用。还可以作为一种抵抗因子，对组织局部起保护作用。

溶菌酶的应用：1)溶菌酶作为防腐剂。它本身是一种天然蛋白质，无毒性，是一种安全性高的食品添加剂。同时溶菌酶仅能作用于目的微生物的细胞壁，而不能作用于其它物质。2)溶菌酶在医学上和应用。A.五官科的应用：溶菌酶适用于五官科各种炎症。研究表明它对眼、耳、鼻、喉和口腔等的急、慢性炎症均有一定疗效，特别对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。若在牙膏、漱口水、口洁剂、口香糖中设法添加一定量的溶菌酶，则可以杀死这些病菌，达到防止虫牙的目的。同样，可用溶菌酶来制眼药水、润喉液。B.皮肤科的应用：溶菌酶可以用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿疣、带状疱疹等多种皮肤病。对于带状疱疹，内服溶菌酶即可。而对于扁平疣和传染性软疣等的治疗，最好采取内服溶菌酶和5-氟脲嘧啶人溶液外涂，疗效明显提高。C.其他方面的应用：溶菌酶可用于小儿和乳儿哮喘性支气管炎、呼吸道内膜肿胀等，它可使粘膜肿胀很快消除，使痰液变稀，呼吸道通畅。溶菌酶可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内，它还有抗流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹病毒感染。此外，对肉瘤引起的疼痛、久治不愈的小儿腹泻及Sjogren’s病，均有一定疗效。D.人体溶菌酶的浓度还可以作为多种疾病诊断指标。3)食品、饮料中的应用。溶菌酶集药理、保健和防腐三个功能于一体。做为一种天然蛋白质无任何副作用。溶菌酶的加入，补充了人体内的非特异性免疫因子，杀死肠道内的腐败球菌，维持肠道内菌群正常化，促进双歧杆菌增殖，加强白清灭菌蛋白，Y-球蛋的防御因子，增强抗感染力。加入饮料中，如钙奶、乳酸饮料中，也可起到防蛀牙、爽口的作用。特别是母乳化奶粉，对婴幼儿的成长十分重要。牛奶中的溶菌酶含量极少，而母乳中的溶菌酶含量十分丰富。为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶，制成母乳化能奶粉。溶菌酶的加入，可以加强婴幼儿的抗感染能力。4)制备细胞浸提物。酵母膏药发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解、酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。也可以用溶菌酶从酵母细胞中制备呈味物质，如有些溶菌酶中除了含有溶菌酶活性外，还含有能分解酵母细胞中的核酸为肌苷酸和鸟苷酸的单核酸类的呈味物质。5)科学研究中的应用。由于溶菌酶具有能够专一性地分解细胞壁的能力，除了在实际生产中的应用外，溶菌酶更广泛的应用于科学研究中。如用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点，了解微生物细胞壁的构造；分解细胞壁后制备原生质体，而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究和专用试剂学。

不同来源的溶菌酶，其溶菌谱各不相同。鸡蛋清溶菌酶只对革兰氏阳性菌有溶菌作用。在这些溶菌酶中，人体中的溶菌酶活性最高，其次是鸡蛋白中的溶菌酶，最低的是牛乳中的溶菌酶。人溶菌酶具有生物相容性好，对组织无刺激、无毒性的优点。商业化的人溶菌酶可以从乳汁、中性粒细胞和尿液中提取，然而这种资源毕竟非常有限，所以人们开始研究利用重组技术来生产人溶菌酶。这个过程主要经历了三个阶段。第一个阶段，最初，利用酵母和米曲霉实验来表达溶菌酶。1986年，Jigami等人利用酵母进行人溶菌酶表达，但这种重组蛋白不具有抑菌活性。接下来，Castanon和Yoshimura也作了相似的工作，也没有取得重要突破。1990年，Archer等人用米曲霉表达鸡蛋清溶菌酶，表达量为12mg/l。Tsuchiya等人在米曲霉里表达人溶菌酶，表达量为1.2mg/l，遗憾的是同样没有生物学活性。由此可见，在酵母和米曲霉里表达的溶菌酶不具有生物活性。第二个阶段，利用转基因小鼠表达人溶菌酶。Maga在这方面作了大量工作，1994年Maga等人进行了转基因小鼠乳腺表达人溶菌酶的研究，他们利用alpha s1-casein启动子来诱导溶菌酶的表达。在转基因小鼠乳腺组织检测人溶菌酶mRNA的存在。溶菌酶的表达量估计为0.2g/L到0.7g/L，由于溶菌酶的表达，乳汁的物理和功能特性也发生了改变。1998年，Maga等人的研究结果进一步表明转基因小鼠表达人溶菌酶的奶样具有同标准溶菌酶相同的活性。这些结果暗示着溶菌酶的转基因研究在乳品加工业有着巨大的应用前景。2000年，Akinbi等人为了在体内检测溶菌酶在呼吸系统的作用，他们制备了在呼吸道上皮细胞表达大鼠溶菌酶的转基因小鼠。这种转基因小鼠能提高在肺部对细菌的杀伤能力5-30倍。由此可见，利用转基因小鼠表达具有生物活性的溶菌酶的方法是可行的，并且有着巨大的潜在应用前景。第三个阶段，近年来，人们开始利用植物实验体系表达溶菌酶，在这方面已取得了很大进展。1997年，Nakajima等人的研究结果表明低水平的溶菌酶也可以在烟草叶表达，并且可以提高植物抗真菌和细菌的活性。2000年，Takaichi和Oeda利用转基因技术也成功地在胡萝卜根中表达了人溶菌酶。Ahreholta等人将T4溶菌酶基因转移到马铃薯里。发现马铃薯的根部上皮细胞可以表达T4溶菌酶并释放根表面的薄膜层。T4溶菌酶具有活性，可以杀死细菌。而且，这种杀菌能力不依赖于植物的年龄和生长环境。2002年，一个密码子优化的人工合成的溶菌酶基因通过基因枪转到水稻愈伤组织，重组的溶菌酶可以在水稻悬浮细胞里表达，表达量达到大约可溶性蛋白的4％。实验结果表明Ramy3D信号肽可以被正常剪切，并且具有和人溶菌酶同样的生物活性。以上研究结果显示利用植物表达具有生物活性的溶菌酶是可行的。可以想象，含有人溶菌酶的水果和食物一定会人们的生活带来福音。

从上述对人溶菌酶转基因的研究表明，还没有见到人溶菌酶在大型牲畜方面的转基因克隆报道。

发明内容

针对上述技术领域的空白，将转基因、细胞转染和克隆技术相结合，提供一种转人溶菌酶基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，以实现“牛奶人乳化”。

本发明提供一种转人溶菌酶基因的动物细胞的生产方法，其操作步骤如下：(1)构建含有人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体，(2)构建人溶菌酶乳腺特异表达载体与双标记选择载体或单标记选择载体的串联结构，将串联结构DNA导入动物体细胞核内，获得转基因细胞，所述乳腺特异表达载体为pBC2-sigHLY，所述的pBC2为在pBC1的6407-6438bp处缺失31bp所构建的骨架载体；所述的sigHLY由牛beta-casein信号肽序列，人溶菌酶的1-4外显子和1-3内含子组成，所述乳腺特异表达载体与双标记选择载体串联结构DNA为pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，所述乳腺特异表达载体与单标记选择载体串联结构DNA为pBC2-sigHLY-NEO，所述动物为牛、山羊、绵羊、猪或兔。

所述的导入方法为电穿孔转染法。

所述动物为牛。

为了制备高效表达人溶菌酶的奶牛乳腺生物反应器以生产重组人溶菌酶，本实验室首先建立了乳腺高效表达人溶菌酶的小鼠模型，构建了pBC1-HLY和pBC2-sigHLY四种不同的溶菌酶基因表达载体。利用显微注射方法注射原核期小鼠胚胎制备转基因小鼠。

pBC1-HLY溶菌酶表达载体包含溶菌酶基因的编码序列(含溶菌酶信号肽)、山羊beta-casein启动子、终止子及其部分不编码的外显子和内含子。经显微注射共获得6只为转基因阳性小鼠，经Western Blotting检测，在3只存活转基因阳性母鼠的乳汁中，可以检测到重组人溶菌酶的表达。其中6号转基因小鼠的溶菌酶表达量达到0.2mg/ml，34号的表达量为0.12mg/ml，41号没有检测到重组溶菌酶的表达。经溶菌实验检测及对重组溶菌酶比活力的计算，重组溶菌酶具有同人溶菌酶相似的比活力。

pBC2-sigHLY溶菌酶表达载体包含溶菌酶基因的编码序列(含牛beta-casein信号肽)，而pBC2是在pBC1的6407-6438bp处缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所构建的载体。将pBC2-sigHLY载体进行小鼠原核胚的显微注射获得转人溶菌酶基因的转基因小鼠，三只阳性小鼠乳汁中有两只能检测到重组人溶菌酶的高效表达，分别为2mg/ml和0.5mg/ml；经溶菌实验检测，表明重组人溶菌酶具有溶菌活性，其中61号小鼠的酶活性为2160U/ml、63号：948U/ml，阴性小鼠的酶浓度为：25.98U/ml，人的为：1224U/ml。与阴性小鼠相比，61号转基因小鼠乳清的溶菌酶活性提高了83倍，63号提高了36倍。与人奶相比，61号小鼠奶的酶活性提高了近一倍，而63号也比较接近人奶的溶菌酶活性。表明我们构建的pBC2-sigHLY表达载体能在动物乳腺中高效表达有溶菌活性的重组人溶菌酶。而且pBC2-sigHLY表达载体在转基因小鼠奶中人溶菌酶的表达量及活性明显高于我们构建的含自身信号肽序列的人溶菌酶表达载体pBC1-HLY(＜0.2mg/ml和480U/ml)。

本发明探索和完善了转基因技术、细胞转染技术和体细胞克隆技术相结合生产携带外源功能基因(包括山羊beta-酪蛋白5’和3’调控元件，目的基因的编码区)的转基因动物的途径，并极大提高了转基因动物，特别是转基因大家畜的制作效率，本发明所使用的技术路线适用于转基因牛、山羊、绵羊、猪和兔的基础群生产和扩繁。

溶菌酶集药理、保健和防腐三个功能于一体，做为一种天然蛋白质无任何副作用。而人乳中溶菌酶破坏和溶解细菌的比活力约为牛乳的300倍，是人乳中的重要抗菌因子，因此人溶菌酶被认为是一种具有极高开发价值的保健蛋白和药用蛋白。目前商业化的人溶菌酶主要从人乳汁、中性粒细胞和尿液等中提取，然而这种资源毕竟非常有限，所以我们利用体细胞克隆技术生产转人溶菌酶基因的转基因牛，从而通过高产奶牛的乳腺大量生产具有活性的人溶菌酶，既可开发出具有高附加值的保健牛奶，也可纯化出人溶菌酶并开发成药品和保健品。本发明所研究的重组人溶菌酶，具有与天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重组人溶菌酶的牛奶可以开发成保健牛奶及奶制品；纯化的重组人溶菌酶可以开发成防腐剂、食品添加剂、保健品和药品。

附图说明

图1：溶菌酶基因表达载体pBC1-HLY的物理图谱

其中Pcasein为pBC1上的山羊beta-casein启动子，Casein E1-E2为山羊beta-casein非编码的第1，2外显子，Casein E7-E8-E9为山羊beta-casein非编码的第7，8及9外显子，Casein3`genome DNA为山羊beta-casein 3’端调控序列。

图2：pBC1-HLY转基因阳性小鼠的PCR检测

0：非转基因小鼠基因组，+：人的基因组；6、30、34、41、48、50：分别为PCR检测的阳性转基因小鼠

图3：pBC1-HLY转基因阳性小鼠的Southern blot检测

0：非转基因小鼠基因组，6、30、34、41、48、50：分别为PCR检测的阳性转基因小鼠，阳性对照包括3条带(10、5、1)，分别相当于基因组的10、5、1拷贝。

图4：pBC1-HLY转基因母鼠乳汁的Western Blot检测

41，34，6为转基因母鼠奶样，human为人奶对照，CK为阳性对照。

图5：人溶菌酶基因编码区的PCR扩增.

M为1kb DNA marker，1为hly的PCR产物

图6：利用XhoI和KpnI对p7zf-sigHLY11进行酶切鉴定

M为1kb DNA marker，11为p7zf-sigHLY11质粒DNA，KpnI为p7zf-sigHLY11被KpnI酶切结果，XhoI为p7zf-sigHLY11被KpnI酶切结果。

图7：利用XhoI酶切对pBC2-sigHLY13进行鉴定

M为1kb DNA marker，13为pBC-sigHLY13质粒DNA，BC1为pBC1质粒DNA，XhoI为XhoI酶切pBC-sigHLY13结果。

图8：pBC2-sighLY13方向鉴定

M为1kb DNA marker，13为pBC-sigHLY13质粒DNA，CalI为CalI酶切pBC2-sigHLY13结果，KpnI为KpnI酶切pBC2-sigHLY13结果。

图9：溶菌酶表达载体pBC2-sigHLY的物理图谱

其中Pcasein为pBC2上的山羊beta-casein启动子，Casein E1-E2为山羊beta-casein非编码的第1，2外显子，Casein E7-E8-E9为山羊beta-casein非编码的第7，8及9外显子，Casein3`genome DNA为山羊beta-casein 3’端调控序列。

图10：pBC2-sigHLY转基因阳性小鼠的PCR检测

M为1kb DNA marker，0为阴性对照，h为阳性对照，6，12，43，61和63为阳性转基因小鼠。

图11：pBC2-sigHLY转基因阳性小鼠的Southern blot检测

M为1kb DNA marker，0为阴性对照，h为阳性对照，6，12，43，61和63为阳性转基因小鼠，1，3，5分别为阳性对照的1，3和5个拷贝。

图12：pBC2-sigHLY转基因阳性母鼠乳汁的Western Blot检测

CK为阴性小鼠奶样，12，61和63为转基因小鼠奶样，human为人乳对照。

图13：双标记选择载体pEGFP-NEO的结构图

EGFP为增强绿色荧光蛋白基因，NEO为新霉素抗性基因，IRES为核糖体结合位点，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，CMV-IE Enhancer为CMV-IE增强子，pEF321为EF321启动子

图14：单标记选择载体pNEO的结构图

NEO为新霉素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，pPGK为PGK启动子，Amp为氨苄抗性基因

图15：pBC2-sigHLY-EGFP-NEO酶切后的线性图谱

b-casein promoter为pBC1上的山羊beta-casein启动子，human lysozyme gene为人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP为增强绿色荧光蛋白基因，Neomycin为新霉素抗性基因

图16：pBC2-sigHLY-NEO酶切后的线性图谱

b-casein promoter为pBC2上的山羊beta-casein启动子，human lysozyme gene为人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP为增强绿色荧光蛋白基因，Neomycin为新霉素抗性基因

图17：HLY引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：盼娃；2：金娃；3：阳性对照；4：阴性对照；5：blank图18：hLY引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：329号牛；2：0365号牛；3为020613，4：阳性对照；5：阴性对照；6：blank

图19：NEO引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：盼娃；2：金娃；3：阳性对照；4：阴性对照；5：blank

图20：NEO引物的扩增结果

M：1kb ladder；1：阴性对照；2：329号牛；3：0365号牛；4为020613，5：阳性对照

图21：EGFP引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：329号牛；2：0365号牛；3为020613，4：阳性对照；5：阴性对照；6：blank

图22：pBC2引物扩增结果：

泳道1，4为普通克隆牛基因组DNA，泳道2，3分别为转pBC2-sigHLY基因克隆牛基因组DNA，泳道5为pBC2-sigHLY-NEO(在pBC上有缺失)质粒DNA，泳道6为pBC2-sigHLY转基因小鼠DNA，泳道7为完整pBC1，泳道8为非克隆牛DNA，泳道9为空白对照。

图23：HLY转基因克隆牛的Southern结果

泳道1为盼娃，泳道2为金娃，泳道3-5为阴性对照，泳道6-8分别为1，2和5个拷贝的阳性对照.

图24：hLY转基因克隆牛乳样PAGE结果，泳道1蛋白标准，泳道2为人溶菌酶标准品，泳道3为人乳，泳道4-7分别为金娃、盼娃、329及0365。

图25：HLY转基因克隆牛乳样Southern杂交结果，泳道1为人溶菌酶标准品，泳道2为人乳，泳道3-6分别为金娃、盼娃、329及0365。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进步的详细说明。

实施例

1实验材料

1.1质粒及菌株

宿主菌大肠杆菌DH5α和DH10B，pBC1 milk expression vector kit和PCR-XL-TOPO vector购自Invitrogen公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO购自Clontech公司，pGEM-7zf购自Promega公司，BAC RP11-1143G9购于美国基因公司

1.2实验动物

Holstein奶牛约3月龄的胎儿取自屠宰场，黄牛卵巢来自北京周边地区屠宰场。

1.3主要试剂

DMEM/F₁₂粉末、DMEM粉末培养基、台盼蓝(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；dNTP以及PCR引物购于上海生物工程公司；Taq酶购于中国农业大学农业生物技术实验室；内切酶SspI和BamHI为华美生物工程公司产品；IPTG、X-gal、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血蓝蛋白(KLH)均购自华美生物公司；饱和酚为鼎国生物工程公司产品；胰蛋白酶、青霉素链霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明质酸酶，HEPES，无脂肪酸BSA，细胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸钠，肝素钠，矿物油和其它无机盐均为Sigma公司产品。

1.4培养基的配制

SOB培养基：配置每升培养基，应在950ml去离子水加入：蛋白胨：20g酵母提取物：5g NaCl0.5g.摇动容器室溶质完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/L NaOH调节到pH7.0。灭菌

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶于800ml水中，调节PH值至7.5，定容制1000ml，高压灭菌。

LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，调节pH值至7.5，定容至1000ml，高压灭菌。

1.5试剂的配制

DMEM培养液：DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，链霉素100mg，Mill-Q超纯水定容到1升，PH7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。使用时加10％的血清。

0.1％Trypsin/EDTA酶消化液：Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO₃，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用灭菌的Mill-Q超纯水溶解，定容至100ml，用0.2μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。DPBS液：DPBS粉末9.7g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH 7.0-7.2，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

无钙镁PBS溶液：KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄ 12H₂O 2.88g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH 7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。Gimsa母液：Gimsa粉末0.5g，加少量甘油将Gimsa粉末在研钵中充分研磨。再加入甘油至总量为22ml，56℃保温2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色试剂瓶中，备用。细胞裂解液：10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。蛋白酶K贮存液：蛋白酶K100mg，溶于5mL灭菌水中，分装，-20度保存。TBS液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高压灭菌。G418贮液：1g G418溶于1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，过滤灭菌，-20度保存。

两倍电击缓冲液(2×HeBS)：280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，过滤灭菌，1mL分装，-20度保存。

1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)：121.1gTris碱溶于800ml水中，用HCl调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5Mol/L EDTA(pH8.0)：126.1g乙二胺四乙酸二钠加入到800ml水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

RNase溶液：将RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

TE缓冲液：10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌。5mol/L LiCl：30.2g氯化锂二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高压灭菌。50×TAE：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。氨苄青霉素(Amp)贮存液：将氨苄青霉素钠溶于灭菌水后用0.22μm的滤器过滤除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。

3mol/L NaAc(pH5.2)：24.604g无水乙酸钠溶于80ml水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至100ml，高压灭菌。

1mol/L CaCl₂：在200ml水中溶解54gCaCl₂.6H₂O，过滤除菌，分装成10ml每份，贮存于-20℃，制备感受态时取出一份稀释至100ml，过滤除菌，预冷备用。

溴化乙锭贮存液：在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4℃棕色瓶内保存。DNA提取抽提缓冲液：50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/LNaCl，1％SDS。

2×Cracking buffer：0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。

酚∶仿(1∶1)：等体积苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。

蛋白酶K溶液：用水配成20mg/ml，-20℃保存。

TCM199培养液：称TCM199粉末9.9g，NaHCO₃2.2g，丙酮酸钠0.1375g，EDTA 0.372g，用1L超纯水定容，PH7.2-7.4，正压过滤灭菌，4℃保存。培养用工作液中加入10％FCS。操作液H199：在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。

冲卵液：DPBS溶液中加入10％FCS。

透明质酸酶：透明质酸酶0.2g，溶于10ml无钙DPBS溶液中，过滤灭菌，-20℃贮存。工作液：用冲卵液稀释10倍。

融合液：0.3M甘露醇，0.1mM MgSO₄，0.05mM CaCl₂，0.5mMHEPES，0.05％BSA，调PH至7.2-7.4，过滤灭菌。

成熟培养液：M199培养液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。

CRlaa培养液：

将上述成份加入90ml ddH₂O中，待所有试剂彻底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。调整pH为7.4，用ddH₂O加到100ml，渗透压为265-285mOsm之间。过滤灭菌。

1.6主要仪器设备

1)CO2培养箱：美国Forma Scientific Inc.

2)倒置显微镜和荧光显微镜：日本Nikon公司

3)培养皿、培养瓶、离心管和细胞冻存管：Nunc公司

4)电击仪：美国BTX公司(ECM 2001)

5)电泳仪：DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂

6)超净工作台：北京净化设备厂

7)-80℃超低温冰箱：日本SANYO公司

8)制冰机：日本SANYO公司

9)超纯水仪：美国MILLIPORE公司

10)低温离心机：Eppendorf公司

11)高速冷冻离心机：BECKMAN公司

12)凝胶成像系统：ALPHA INNOTECH公司

13)PHS-3C酸度计：上海虹益仪器厂

14)自动灭菌锅：日本SANYO公司

15)测序仪：ABI 377型DNA sequencer，美国PERKIN ELMER公司

16)恒温水浴仪：美国LIFESCIENCE公司

17)9700型PCR仪：美国PERKIN ELMER公司

18)ABI 377DNA测序仪：美国PERKIN ELMER公司

1.7分析工具软件及网址：

同源性分析软件：DNAMAN

PCR引物设计软件：Oligo4.0

DNA序列分析软件：Chromas

DNA及蛋白序列数据库：NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein

2实验方法

2.1载体构建

2.1.1pBC1-HLY表达载体构建及转基因小鼠模型建立

1)pBC1-HLY表达载体的构建策略

首先利用长片段PCR的方法获得溶菌酶基因的编码区，将其克隆到PCR-XL-TOPOvector上，并进行酶切和测序验证。然后再把它连接到乳腺特异表达载体pBC1上，经插入方向和测序鉴定，最后得到溶菌酶的表达载体。

2)人溶菌酶基因编码区的PCR扩增

溶菌酶基因全长6807bp，含有4个外显子。mRNA(519-682，2246-2410，4349-4427，5281-6374)和CDS(601-682，2246-2410，4349-4427，5281-5347)，起始密码子位于547位点，TATA box位于491-496位置。为了得到溶菌酶编码区片段，我们以溶菌酶基因组DNA序列为模版设计引物进行DNA扩增。设计的引物为：上游5`CCC TCG AGA CTC TGACCT AGC AGT CAA C 3`，下游5`CCG CTC GAG TCT GTT TCT ATC ATT TGG 3`，5`端分别含有XhoI酶切位点。扩增产物全长5652bp，包含溶菌酶基因信号肽部分的DNA片段。PCR条件：94℃3min，94℃1min，60℃1min，68℃5min，68℃10min，4℃ 1h；30cycles.PCR扩增出1条约5.5kb的特异片段，于是我们把这个PCR产物回收回来，克隆到pPCR-XL-TOPO载体上。

3)人溶菌酶基因编码区DNA片段的克隆

为了对PCR产物进行测序和验证，我们首先把它克隆到PCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-HLY重组载体。经过转化后，进行培养，最后提取质粒。对获得的阳性重组质粒进行酶切及测序鉴定。

4)pBC1-HLY expression vector的构建

本发明采用pBC1作为构建乳腺表达载体的骨架载体，pBC1为Invotrogen公司的商业化乳腺表达载体，全长为21628bp，包含山羊beta-casein启动子，外显子1、2和7、8、9的非编码区，beta-casein 3`中止子区和2拷贝的beta-globin隔离子，以及原核序列。其中在山羊beta-casein的外显子2和7之间存在一个XhoI限制性内切酶位点，用于将外源基因的编码区连接上去。

在构建溶菌酶基因表达载体时，我们首先分别对pBC1和pTOPO-HLY进行XhoI酶切与回收，再按1∶10的比例混匀于16℃过夜连接，再进行电转化。挑单克隆菌落进行摇菌提取质粒，筛选重组质粒pBC-HLY阳性克隆。

5)酶切鉴定及PCR检测

XhoI酶切pBC1-HLY阳性质粒，结果显示可以切出一条5kb外源片段和21kb的pBC1的骨架片段，表明重组质粒的XhoI位点已连入5kb外源片段。

为进一步验证，我们以溶菌酶基因序列为模板设计引物：上游：5`TTA TAC ACA CGG CTT`TAC 3`下游：5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`PCR条件：94℃5min，94℃40sec，53℃40sec，72℃40sec，72℃7min，4℃ 1∞；30cycles。结果显示以4号和12号质粒为模板可以扩增到与以含人溶菌酶基因BAC为模板大小相同的DNA片段，表明人溶菌酶基因编码区已经连接到pBC1载体上

6)方向鉴定

由于上述连接属于单酶切位点连接，所以必须进行插入片段的方向鉴定。我们选择限制性内切酶Drd进行方向鉴定，有一个Drd位点位于溶菌酶基因5`端(538)，同时在pBC1上也存在相应酶切位点(2442、12109、12219、15035、17540、17953)。根据酶切产物的DNA片段大小，可以判断外源片段的插入方向。

7)测序验证

为了保证该表达载体序列的正确性，我们又对pBC1-hLY阳性质粒的外显子1-4的部分进行测序，结果表明在PCR过程中，没有造成溶菌酶基因外显子部分序列的突变，连入pBC1的是完好的人溶菌酶基因基因组DNA。

8)pBC1-HLY转基因小鼠模型的建立及检测

(1)pBC1-HLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收与检测

pBC1-HLY expression vector的物理图谱如图1所示，本实验用NotI和SalI双酶切，除去质粒的多余部分，用Qigen试剂盒回收约26kb大小的片段，溶于转基因专用TE，调整DNA浓度为2μg/ml。

(2)显微注射

共注射受精卵1200枚，移植受体鼠70只，受孕鼠32只，共生小鼠83只

(3)转基因小鼠的PCR检测

取2-3周龄转基因小鼠的尾巴组织样，提取DNA。用前面已使用过的一对引物(上游：5TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游：5`CAG CAT GAG CGA TGT TAT CT3`)分别对小鼠DNA样PCR扩增，以普通小鼠基因组作为阴性对照，以人基因组作为阳性对照，如图2所示，结果发现共有6只小鼠为转基因阳性小鼠，分别为6、30、34、41、48和50号。小鼠扩增出的PCR产物与阳性对照一致，咱们这些小鼠为携带有pBC1-hLY的转基因小鼠

(4)转基因小鼠的Southern blot检测

将PCR检测为阳性的6只小鼠尾巴组织样DNA，取大约10μg用PstI内切酶消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P³²dCTP同位素标记的PCR产物。以pBC1-HLY质粒为阳性对照，以阴性小鼠基因组为阴性对照，杂交可得到5kb片段。结果如图3所示，结果表明6、30、34、41、48和50号转基因小鼠均为阳性小鼠，与PCR检测结果一致，而阴性小鼠的基因组(0)没有杂交信号。根据Southern杂交信号强度，估算转基因小鼠的外源基因整合的拷贝数。6、48号，3拷贝；30号，1拷贝；34、41号，2拷贝；50号，8拷贝。

(5)转基因小鼠的Western blot检测

在转基因小鼠生仔鼠后的第5天，采集乳汁。将采集的乳汁进行4500rpm离心10min，去除乳脂。加入2倍体积灭菌水，调pH值至4.0左右去除酪蛋白，最后将pH值调到8.0，将乳清保存于-70℃冰箱。通过杂交的结果估算转基因小鼠的溶菌酶的表达含量：人乳汁溶菌酶的含量为：0.5mg/ml，由此可以初步估测，6号乳清重组溶菌酶含量为：0.2mg/ml；34号乳清重组溶菌酶含量为：0.12mg/ml；41号没有表达。(图4)

从图中可看出34，6号小鼠奶样可以检测到重组人溶菌酶的表达，初步估测，6号乳清重组溶菌酶含量为：0.2mg/ml；34号乳清重组溶菌酶含量为：0.12mg/ml；41号没有表达

(6)、重组人溶菌酶的活性检测

a.溶菌酶对溶壁微球菌溶菌作用的标准曲线建立

配置标准溶菌酶，浓度分别为：50、75、100、125、150、175、200U/mL。取90ul细菌悬浮液置于比色皿中，加入酶液10ul，迅速用移液器吹匀，测定450nm下的光吸收值(OD450)。从加入酶液起计时，每隔1min记录1次，每组数据要重复3次以上。以0至1分钟的OD450的差值的平均值作为纵坐标，以标准酶的浓度作为横坐标来制作标准曲线。根据标准曲线，我们可以得到回归方程：y＝0.0005x-0.002，y代表OD450的差值，x代表酶活力(U/ml)。由此公式可推导出：x＝2000(y+0.002)。在乳清的制备过程中，被稀释3倍，所以，乳清的酶活力计算公式为：x＝2000(y+0.002)×3。

b.重组人溶菌酶的活性检测

根据上述方法，分别测定转基因小鼠、人、阴性小鼠乳清对溶壁微球菌作用的OD₄₅₀值变化，测定三次，取0至1分钟的OD450差值。根据x＝2000(y+0.002)×3公式可以计算乳清中溶菌酶的浓度。转基因小鼠6号的酶活力为480U/ml、34号：301U/ml、41号：37.98U/ml，阴性小鼠的酶活力为：25.98U/ml，人的为：1224U/ml。由此可见，与阴性小鼠相比，转基因小鼠乳清的溶菌酶酶活力有非常明显提高，其中6号小鼠提高了18倍，34号提高了11倍，但41号几乎没有提高。与人乳清相比，转基因小鼠乳清中的溶菌酶酶活力度相对较低，其中6号占2/5，34号占1/4。由此可见，重组人溶菌酶的表达可以显著提高小鼠乳汁中溶菌酶的活力，表明通过乳腺表达的重组人溶菌酶具有溶菌的生物学活性。

2.1.2pBC2-sigHLY表达载体构建及转基因小鼠模型建立

1).pBC2-sighLY表达载体的构建策略

为了构建含有beta-casein信号肽DNA序列的溶菌酶表达载体，我们设计了如下构建表达载体的策略。首先合成牛beta-casein信号肽DNA序列，5’和3’端分别含有XhoI和Csp451，利用这两个酶切位点连到pGEM-7zf质粒上得到p7zf-sig质粒。再利用长片段PCR方法扩增人溶菌酶基因的编码区序列，5’端有Csp45I酶切位点，3’端依次有XhoI和HindIII两个酶切位点。利用Csp45I和HindIII酶切位点连到p7zf-sig上得到p7zf-sigHLY质粒。构建pBC2载体，用XhoI将牛信号肽和溶菌酶编码区融合序列切下来，连到pBC2的XhoI位点。

2).牛beta-casein信号肽的设计与合成

为了获得牛beta-casein信号肽，我们分别合成了两条单链DNA序列。序列分别为：正向5`TCGAGATGA AGGTCCTCAT CCTTGCCTGC CTGGTGGCTC TGGCCCTTGCAAAGGTCTT 3`，反向5`C GAAGACCTTT GCAAGGGCCA GAGCCACCAGGCAGGCAAGG ATGAGGACCTTCATC 3`。黑体划线部分序列为牛beta-casein信号肽DNA序列。将两条单链DNA退火成双链后，5`端会形成XhoI酶切位点部分，3`端形成Csp45I酶切位点部分。将已合成的信号肽DNA溶解，终浓度达825ng/μl。然后各取10μl混匀，沸水煮5分钟进行变性，然后室温冷却进行退火，这样就可以形成5`端和3`端分别包含XhoI和Csp45I部分酶切位点的牛beta-casein信号肽DNA

3).牛beta-casein信号肽DNA的克隆

我们利用牛beta-casein信号肽DNA上的XhoI和Csp45I部分酶切位点将其连接到pGEM-7zf载体上得到p7zf-sig重组质粒。为了鉴定连上信号肽的重组质粒，我们利用Kpn I进行酶切鉴定。由于在7zf质粒XhoI和Csp45I之间连上信号肽DNA片段，原有的KpnI酶切位点被去掉。因此，p7zf-sig不能被KpnI切开，而pGEM-7zf可以被切开。同时，对其进行测序，再次证实信号肽序列已连到pGEM-7zf上，并完全正确。

4).溶菌酶基因编码区(不含信号肽序列)的获得

为了获得人溶菌酶基因的编码区，我们利用探针从BAC库调取含有溶菌酶基因的BAC克隆(BAC RP11-1143G9)。在含有氯霉素的LB液体培养基内，进行摇菌。然后按上述方法提取BAC，，浓度约为100ng/L。接下来，我们用BAC RP11-1143G9作为模板进行PCR扩增来获得溶菌酶基因的编码区序列片段。

为了得到溶菌酶编码区(不含信号肽序列)片段，我们以溶菌酶基因组DNA序列为模版设计引物进行DNA扩增。设计的引物为：上游5`ATT CGA AAG GTG TGA GTT GGCCAG AAC TCT G 3`，5`端分别含有Csp45I酶切位点，下游5`TAA GCT TCT CGA GACCAT CCT GGC TAA CAC G 3`，5`端包含Hind III和XhoI两个酶切位点。扩增产物全长5255bp，不包含溶菌酶基因分泌肽部分的DNA片段。PCR条件：94℃3min，94℃ 1min，60℃1min，68℃5min，68℃14min，4℃1∞；30cycles。再按上述的方法提取含有溶菌酶基因的BAC(RP11-1143G9)，以BAC为模板进行PCR扩增，PCR结果如下(图5)。

5).PCR产物的克隆

为了对PCR产物进行测序和验证，我们首先把它克隆到pPCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-sigHLY重组载体。

6).p7zf-sighLY重组质粒的获得

为了得到含有牛beta-casein信号肽DNA的溶菌酶基因编码区，我们先利用Hind III和Csp45I将pTOPO-HLY重组载体上的溶菌酶基因编码区(不含溶菌酶本身信号肽)切下来，连接到p7zf-sig质粒上，从而得到牛beta-casein信号肽DNA和溶菌酶基因连在一起的重组质粒p7zf-sigHLY。为了鉴定p7zf-sigHLY11为阳性重组质粒，利用KpnI和XhoI分别进行酶切，由于在连接信号肽序列的过程中，KpnI酶切位点被去除，所以KpnI不能切开重组质粒。而由于信号肽的5’端和溶菌酶编码区3’端分别含有XhoI酶切位点，所以酶切可以得到3kb的7zf骨架片段和5kb的信号肽和溶菌酶编码区片段。酶切结果如图6所示，证实11号质粒确实为阳性重组质粒。

对p7zf-sighLY11进行测序，结果表明这个载体上包含牛beta-casein的信号肽序列和溶菌酶编码区的部分序列，并且这些序列没有发生任何突变。p7zf-sigHLY11质粒测得序列的比对结果如图24，该测序结果表明beta-casein的信号肽序列与hly序列成功连接

7).pBC2-sighLY exprssion vector的构建

本发明采用pBC2作为构建乳腺表达载体的骨架载体，pBC2是pBC1经过修改所获得的载体，即在pBC1的6407-6438bp处缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所构建的载体。这段序列位于pBC1中beta-casein启动子区域，构建pBC2的目的即是要检测这段序列是否影响外源基因在哺乳动物乳腺中的表达。

pBC2构建过程如下：用ClaI和XhoI酶切pBC1质粒DNA，回收4kb的片段，通过ClaI和XhoI酶切位点与pGEM-7zf进行连接获得pGEM-CX1，通过EcoRI位点将缺失序列(pBC1L1：AATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAGG，和pBC1 L2：AATTCCTAGAAATCTGCATGATTA GGAAATG，两序列退火形成双链)与pGEM-CX1连接得到pGEM-CX2，用ClaI和XhoI酶切pGEM-CX2并回收4kb的片段，通过ClaI和XhoI酶切位点与pBC1进行连接即可获得pBC2。

在构建溶菌酶基因表达载体时，我们首先分别对pBC2和p7zf-sigHLY进行XhoI酶切与回收，再按1∶10的比例混匀于16℃过夜连接，再进行电转化。挑单克隆菌落进行摇菌提取质粒，筛选组质粒的XhoI位点已连入约5kb外源片段(如图7)。由于上述连接属于单酶切位点连接，所以必须进行插入片段的方向鉴定。我们选择限制性内切酶KpnI和Csp45I与ClaI和Csp45I双酶切进行方向鉴定，Csp45I在外源片段的5’端有1个酶切位点，在pBC2上，ClaI酶切位点位于4529bp，KpnI位于13772bp，在19kb的位置存在一个Csp45I酶切位点。根据酶切产物的DNA片段大小，可以判断外源片段的插入方向。13号重组质粒的酶切结果如图8，表明13号重组质粒为正向型重组质粒。

8).载体外显子部位的测序

为了保证所构建溶菌酶基因表达载体的准确性，我们要对载体的编码区部位进行测序。因为前面已经对外显子1的部位完成了测序，所以这里主要对外显子2、3、4进行测序。如图25、26、27.综合测序的结果，表明pBC2-sigHLY表达载体的外显子序列没有发生任何突变和错配。这有利地保证了pBC2-sighLY表达载体能够正确转录和翻译。

载体外显子2的测序结果及其与溶菌酶基因序列的比对：如图25，经比对，外显子2的序列与溶菌酶基因本身序列完全一致。也显示内含子2的序列没有发生突变。

载体外显子3的测序结果及其与溶菌酶基因序列的比对：如图26，经比对，外显子3的序列也没有发生任何突变。上行为溶菌酶的基因序列，下行为外显子3及其侧翼序列。

外显子4的测序结果及其与溶菌酶基因序列的比对：如图27，经与溶菌酶基因序列比对，CDS4和外显子4均没有发生突变。

9)pBC2-sigHLY转基因小鼠模型的建立及检测

(1).pBC2-sigHLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收与检测

用显微注射法生产转基因小鼠，线形DNA比环形DNA整合效率高，因此必须将人pBC2-sigHLY切成线形后(图9)，方可进行显微注射；另外，多余的质粒片段也影响DNA整合效率。所以本实验用NotI和SalI双酶切，除去质粒的多余部分，用Qigen试剂盒回收约26kb大小的片段，OD260/OD280值为1.75，将其浓度调至2ng/μl，通过显微注射法建立转基因小鼠。

(2).显微注射

共注射受精卵1500枚，移植受体鼠73只，受孕鼠34只，共生小鼠63只

(3).转基因小鼠的PCR检测

取2-3周龄转基因小鼠的尾巴组织样，提取DNA。用前面已使用过的一对引物(上游：5TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游：5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分别对小鼠DNA样PCR扩增，以普通小鼠基因组作为阴性对照，以人基因组作为阳性对照，结果发现共有5只小鼠为转基因阳性小鼠，阳性率为7.9％，如图10.从检测结果表明这些小鼠都转有pBC2-sighLY。

(4).转基因小鼠的Southern blot检测

将PCR检测为阳性的5只小鼠尾巴组织样DNA，取大约10μg用PstI内切酶消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P³²dCTP同位素标记的PCR产物。杂交可得到5kb片段。结果如图11所示，结果表明6、12、43、61和63号转基因小鼠均为阳性小鼠，与PCR检测结果一致，而阴性小鼠的基因组没有杂交信号(0)。转基因小鼠拷贝数的计算：阳性对照包括3条带(5、3、1)，分别相当于基因组的5、3、1拷贝。根据Southern杂交信号强度，估算转基因小鼠的外源基因整合的拷贝数。6号，1拷贝；12号，2拷贝；43和61号，高于30拷贝，63号，8拷贝。

(5).转基因遗传的检测

Founder转基因小鼠一经鉴定后立刻与非转基因小鼠一起进行交配。共有6只阳性Founder小鼠，F1代共44只，采用与鉴定始祖转基因小鼠同样的程序提取基因组DNA及PCR检测。其中6、12、61号小鼠后代的阳性率接近或小于50％；63号的后代为76.9％；43号的后代为100％。理论上，转基因小鼠后代的阳性率至少为50％，并符合孟德尔分离规律。

(6).转基因小鼠的Western blot检测

在转基因小鼠生仔鼠后的第5天，采集乳汁，并采集一只阴性小鼠第5天的乳汁作为对照。在采集乳汁之前，需将母鼠与仔鼠隔离3小时以上，并通过腹腔注射一定剂量的催产素和按摩乳房才能顺利采集到乳汁。以人奶作为阳性对照，以阴性小鼠奶样作为阴性对照进行Western检测。阴性小鼠的没有杂交信号，人的有较强杂交信号作为阳性对照。对于转基因小鼠，61和63号小鼠的奶样有较强杂交信号，检测到重组溶菌酶的表达。人乳中含有溶菌酶0.5mg/ml，根据信号的强度来估计，61号外源人溶菌酶的含量约为：2mg/ml；63号约为：0.5mg/ml；而12号没有重组溶菌酶的表达，如图12。

(7)、重组人溶菌酶的活性检测

A.溶菌酶对溶壁微球菌溶菌作用的标准曲线建立

方法如前所述

B.重组人溶菌酶的活性检测

根据上述方法，分别测定转基因小鼠、人、阴性小鼠乳清对溶壁微球菌作用的OD450值变化，测定三次，取0至1分钟的OD450差值。根据x＝2000(y+0.002)×3公式可以计算乳清中溶菌酶的浓度。转基因小鼠61号的酶活性为2160U/ml、63号：948U/ml、12号：30U/ml，阴性小鼠(ck)的酶活性为：25.98U/ml，人的为：1224U/ml。由此可见，与阴性小鼠相比，转基因小鼠乳清的溶菌酶浓度有显著提高，其中61号小鼠提高了83倍，63号提高了36倍，但12号几乎没有提高。与人乳清相比，61号的溶菌酶浓度提高了近1倍，63号也接近了人乳清的溶菌酶浓度，约为0.8倍。

从以上结果可以看出，我们构建的pBC1-HLY和pBC2-sigHLY表达载体，都能在转基因小鼠乳腺中特异表达具有溶菌活性的重组人溶菌酶，而具有牛beta-casein信号肽序列的pBC2-sigHLY表达载体表达量以及相对溶菌活性都要明显高于pBC1-HLY表达载体，因此pBC2-sigHLY表达载体是我们进行下一步实验即进行转基因克隆牛制作所采用的主要载体。而且从转基因小鼠的表达情况可以看出，在山羊beta-casein启动子区缺失31bp序列的pBC2与完整的pBC1的表达效果一致，证明我们构建的pBC2也可以用于转基因动物乳腺特异表达研究。

2.1.3pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO表达载体构建

1).pBC2-sighLY标记表达载体的构建策略

为了便于筛选阳性细胞，我们首先构建了含绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因双选择标记载体(pEGFP-NEO)以及新霉素基因单选择标记载体(pNEO)，然后分别将两个标记载体与此前构建的pBC2-sigHLY载体连接构建成pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO表达载体。

2)pEGFP-NEO的构建

用NotI和SalI酶切pBC1回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片断EGFP-IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与EGFP-IRES-NEO连接即构成pEGFP-NEO，如图13.

3)pNEO的构建

用NotI和SalI酶切pBC1回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO并回收2kb片断IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与IRES-NEO连接即构成pNEO，如图14.

4)pBC2-sigHLY-EGFP-NEO表达载体构建

用NotI和SalI酶切pBC2-sigHLY和pEGFP-NEO，将两者连接即构成pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，通过酶切及测序分析，确定pBC2-sigHLY-EGFP-NEO载体构建成功，载体图如下(图15)：

5)pBC2-sigHLY-NEO表达载体构建

用NotI和SalI酶切pBC-sigHLY和pNEO，将两者连接即构成pBC2-sigHLY-NEO，通过酶切及测序分析，确定pBC-sigHLY-NEO载体构建成功，载体图如下(图16)：

2.2细胞培养，基因转染及阳性细胞筛选

2.2.1胎儿成纤维细胞的原代培养

2.2.2胎儿成纤维细胞的传代、冷冻、及复苏

待种植的原代细胞生长至80％汇合时，将细胞一部分冷冻，一部分传代继续培养。

2.2.2.1传代

2.2.2.2冷冻

2.2.2.3复苏

2.2.3转染用DNA的准备

大提质粒pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO，以SalI酶切质粒，酶切反应如下：

质粒DNA    约10-20μg

10×反应buffer    20μl

限制性内切酶      10-20U

ddH2O             补足体系至200μl

上述试剂加好后，混匀，37度水浴消化2h，取5μL酶切产物以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍体积无水乙醇和0.1倍体积乙酸钠(PH5.2)，混匀后置-20度过夜；12000rpm离心15min回收沉淀，70％乙醇洗涤一次，真空干燥，加TE溶解。

2.2.4牛胎儿成纤维细胞对G418毒性敏感性检测

细胞培养到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×10⁵个细胞接种到13个直径35mm培养皿中以使细胞尽量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入终浓度从100μg/ml到1200μg/ml的G418，还有一孔中不加入G418作为对照。连续培养三周，每3～4天换液一次，同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡情况。

2.2.5电击转染

2.2.6阳性细胞的单克隆培养

在荧光显微镜下观察上述方法所得细胞克隆的发光情况，用记号笔圈住分散良好(远离其它克隆)且细胞数量多的荧光克隆；吸除培养液，用无钙镁PBS漂洗细胞二次，在高倍解剖镜下，将30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在标记好的细胞克隆上，待克隆的大多数细胞收缩脱壁后，不等细胞悬浮，快速吸取细胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的细胞；转移细胞到加有500μl培养液的四孔板中，吹打分散细胞团块；挑出的克隆继续培养，降低G418浓度至300μg/ml维持筛选；待克隆细胞数量扩大后或汇合后，将一部分细胞转移到35mm培养皿中继续扩大培养，另一部分用于转基因检测，其它扩大后的细胞尽早冷冻。

2.3转基因体细胞克隆

2.3.1卵母细胞的成熟培养

从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2～8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/mlbLH+1μg/ml estradiol)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO₂培养箱中成熟培养18～20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1％透明质酸酶的管内振荡2～3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体.

2.3.2卵母细胞的去核

将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用.

2.3.3移核与融合

将血清饥饿2～4d的供体细胞用0.25％trypsin消化2～4min，选择直径为10～12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步激活处理.

2.3.4重构胚的激活与培养

将重构胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后换到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO₂培养箱中培养2d后观察分裂率，7d后观察囊胚发育率

2.3.5胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体母牛的子宫角内.受体母牛选择的都是经产母牛，其中红系冀南黄牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入鲁西黄牛.在移植后的第60d进行直肠检测，以确定妊娠率.

2.4转基因克隆的PCR和Southern鉴定

本发明共获得四头转有pBC-sigHLY-NEO的转基因克隆牛，一头转有pBC-sigHLY-EGFP-NEO的转基因克隆牛。采集转基因、非转基因克隆牛和普通荷斯坦奶牛耳部组织样，提取DNA，然后进行PCR鉴定和Southern鉴定。

PCR检测的引物序列为：上游：5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游：5`CAG CAT CAGCGA TGT TAT CT 3。PCR条件：94℃ 5min；94℃40sec，53℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃7min，4℃ 1∞，产物长度为700bp。结果如图17和18。

对于NEO基因，引物序列为：上游：5`AGG ATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTC CTG3`下游：5`AAGAAC TCG TCAAGAAGG CGATAGAAG GCG 3`。PCR条件：94℃5min；

94℃40sec，60℃40sec，72℃40sec，30cycles；72℃7min，4℃ 1∞，产物长度为490bp。结果如图19和20。

对于EGFP基因，引物序列为：上游：5`TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3`下游：5`CTCAGG TAG TGG TTG TCG GG 3。PCR条件：94℃5min；94℃40sec，62℃40sec，72℃40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，产物长度为380bp。结果如图21。

我们所使用的pBC2载体启动子为山羊酪蛋白启动子，并在启动子区有31bp缺失。我们在缺失处设计了一对引物(pBCF1：5′GGG GAC AGA AAA ATA GGA AG 3′，pBCF1：5′AGAGGAGAAGAAGTGAAG GA 3′)，PCR条件：94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，30cycles；72℃7min，4℃ 1∞，完整pBC1的扩增产物为174bp，而pBC2为143bp。扩增结果如图22，泳道3和6扩增产物约为140bp，这是因为pBC2-sigHLY-NEO质粒DNA和转基因小鼠DNA均含有缺失序列的pBC2；而1，2，3，4号牛，对照牛以及完整pBC的扩增产物均含有一条约为170bp带，这可能是由于牛与羊的酪蛋白启动子区同源性较高(pBCF1和2引物与牛酪蛋白启动区同源性为100％和95％)的缘故，而2和3号克隆牛则还含有一条约为140bp的条带，进一步证明2和3号克隆牛为转有pBC2-sighLY-NEO的转基因克隆牛。

从以上PCR结果可以看出，在我们得到的四头克隆牛均转有pBC2-sigHLY-NEO，而另有一头转有pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。

取PCR检测为阳性的转基因克隆牛DNA约10μg用PstI内切酶消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P³²dCTP同位素标记的5kb的hLY基因。以pBC2-sigHLY-NEO质粒为阳性对照，以非转基因克隆牛基因组为阴性对照，杂交可得到5kb片段，如图23所示进一步确定了金娃和盼娃转有溶菌酶基因，可以估计金娃和盼娃转有20个拷贝的人溶菌酶基因，根据转基因小鼠结果，可以推测这两头转基因牛将能在乳腺中高效表达人溶菌酶。

2.5转基因牛重组人乳铁蛋白表达分析

2.5.1药物催乳

以西安草滩药厂生产的催乳针按1/4剂量对6-8月龄的转基因克隆牛进行药物催乳，同时以双标记载体转基因克隆牛、普通克隆牛、同月龄普通黑白花奶牛作为对照进行催乳，还以普通牛奶为对照，每天收集3次奶样，共收集两周。

2.5.2转基因牛奶的PAGE电泳、Western和放免测定

本实施例对四头转基因牛乳样进行分析。对转基因牛的乳样用重蒸灭菌水稀释三倍，进行去乳脂、去酪蛋白的处理，最后得到乳清部分。重组人溶菌酶即存在于乳清中。对转基因牛奶样和对照乳样进行脱脂和去酪蛋白后，用减性(reducing)SDS上样Buffer变性的PAGE胶进行电泳，结果如图24。从此图可以看出转基因牛奶样有一条与人溶菌酶标准品大小一致的特异条带。用兔抗人溶菌酶抗体进行Western杂交，结果如图25。从Western结果可以看出转基因牛乳样和人奶有一条与人溶菌酶标准品大小一致的特异条带，表明转基因牛乳腺中能表达完整的重组人溶菌酶。

利用放射性免疫法检测转基因牛奶样中重组人溶菌酶的表达量。人溶菌酶标准品用¹²⁵I用氯胺-T法标记，取6个时间点的乳样进行检测。测得转基因牛乳样中重组人溶菌酶的表达量平均值金娃为3.49g/l，盼娃为0.55g/l，329为0.52g/l，而0365牛为2.48g/l，表明我们所使用的人溶菌酶基因结构可以在转基因牛乳腺中高效表达完整的重组人溶菌酶。

2.5.3重组人溶菌酶的活性检测

标准曲线建立如前所述(转基因小鼠)，经检测，转基因牛金娃的重组人溶菌酶酶活性为3065U/ml、盼娃：922U/ml、329号：986U/ml，0365号：2740U/ml，阴性小鼠(ck)的酶活性为：25.98U/ml，人的为：1224U/ml。可见本发明所生产的重组人溶菌酶具有与天然人溶菌酶相当的生物活性，甚至超过天然人溶菌酶生物活性。

附：SEQ ID NO 1：本序列为人溶菌酶一级结构即氨基酸序列，共148个氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽。

1   MKALIVLGLV LLSVTVQGKV FERCELARTL KRLGMDGYRGISLANWMCLA

51  KWESGYNTRA TNYNAGDRST DYGIFQINSR YWCNDGKTPG AVNACHLSCS

101 ALLQDNIADA VACAKRVVRD PQGIRAWVAW RNRCQNRDVR QYVQGCGV

Claims (3)

1.一种转人溶菌酶基因的转基因克隆大型家畜的动物细胞的生产方法，其操作步骤如下：(1)构建含有人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体，(2)构建人溶菌酶乳腺特异表达载体与双标记选择载体或单标记选择载体的串联结构，将串联结构DNA导入大型家畜的体细胞核内，获得转基因细胞，所述乳腺特异表达载体为pBC2-sigHLY，所述的pBC2为在pBC1的6407-6438bp处缺失31bp所构建的骨架载体；所述的sigHLY由牛beta-casein信号肽序列，人溶菌酶的1-4外显子和1-3内含子组成，所述乳腺特异表达载体与双标记选择载体串联结构DNA为pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，所述乳腺特异表达载体与单标记选择载体串联结构DNA为pBC2-sigHLY-NEO，所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。

2.根据权利要求1所述的生产方法，所述的导入方法为电穿孔转染法。

3.根据权利要求1所述的生产方法，所述大型家畜为牛。

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