ES2718000B2 - Benzopiranos prenilados agonistas de ppar - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

BENZOPIRANOS PRENILADOS AGONISTAS DE PPAR

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con compuestos que comprenden una estructura central de benzopirano prenilado. Dichos compuestos presentan actividad como agonistas de PPARa, PPARy , o actividad dual agonista de PPARa y PPARy. La invención se refiere por tanto compuestos con dicha estructura benzopirano prenilado de fórmula I, sus composiciones farmacéuticas, primer uso médico, así como el uso de compuestos de estructura benzopirano prenilado en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy . Dichas enfermedades son desórdenes tales como diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, desórdenes cardiovasculares, dislipidemias, tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia familiar (grave y moderada), quilomicronemia primaria, la disbetalipoproteinemia familiar o la hiperlipoproteinemia, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas (PPAR) pertenecen a la familia de receptores hormonales nucleares. Existen tres tipos de PPAR: PPARa (NR1C1), PPARp/5 (NUCI; NR1C2), y PPARy (NR1C3). Todos actúan como heterodímeros con receptores del ácido 9-cis-retinoico (receptor X retinoide; RXR) y ejercen un papel fundamental en la regulación de diversas vías metabólicas, incluyendo la biosíntesis de lípidos y metabolismo de la glucosa, así como en la diferenciación y proliferación celular y apoptosis (Cheang et al., 2015, Ahmadian et al., 2013 y Tan et al., 2017).

Los PPAR se consideran potentes herramientas terapéuticas en el control de diferentes patologías, tales como la diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, hiperlipidemia, desórdenes cardiovasculares, inflamación y enfermedades neurodegenerativas. Además, los PPAR tienen una importancia adicional ya que están implicados en el control de procesos inflamatorios, por lo que pueden regular la inflamación, función vascular, y el remodelado vascular (Cheang et al., 2015, Ahmadian et al., 2013 y Tan et al., 2017).

Los PPARa se encuentran principalmente en hígado, riñones, corazón, músculo y tejido adiposo, y juegan un papel fundamental en la oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de las lipoproteínas.

PPARy predomina fundamentalmente en tejido adiposo, macrófagos, monocitos, células intestinales, músculo esquelético y endotelio. Están relacionados con el metabolismo lipídico, adipogénesis, homeostasis de la glucosa, y sensibilización a la insulina.

Los ligandos PPAR y en particular los agonistas PPARa y PPAR^y , inhiben la activación de la expresión de genes de la inflamación y pueden interferir negativamente con vías de señalización de factores de transcripción proinflamatorios en células vasculares e inflamatorias.

Los PPARa son activados por los compuestos de estructura fibrato: fenofibrato, clorfibrato, benzafibrato, y compuestos similares tales como WY-14643:

FenoíílJTato (agonista PPARa) WY-14643 (agonista PPARa)

Los agonistas de PPARa son capaces de disminuir los niveles de trigliceridos y aumentar HDL-c, siendo muy efectivos en el tratamiento de hipertrigliceridemia.1

Entre los ligandos de PPARy conocidos de estos receptores destacan los agonistas de tipo tiazolidinedionas (TZD), entre los que se encuentra rosiglitazona y pioglitazona, que se han utilizado en clínica para el tratamiento de DT2 debido a su capacidad de disminuir los niveles de glucosa en sangre y mejorar la sensibilidad a la insulina (Ahmadian et al., 2013).

Rosiglitazona (agonista PPARy)

El desarrollo de agonistas de PPARa o de PPAR^y , o de agonistas duales de PPARa/PPARY, ha llevado a la síntesis de una nueva clase de candidatos con potencial terapéutico (Cheang et al., 2015 y Tan et al., 2017). De hecho, los agonistas duales PPARa/Y se consideran compuestos más potentes para corregir la homeostasis de lípidos y de glucosa en DT2 y síndrome metabólico, que los agonistas selectivos (Tan et al., 2017). A pesar de la eficacia clínica de los agonistas PPARa y PPARy en el tratamiento de las dislipemias y DT2, respectivamente, la aparición de numerosos efectos adversos ha limitado el uso de estos agonistas selectivos, obligando la retirada de numerosos fármacos. En particular, los agonistas PPARa pueden producir un aumento en los niveles de creatinina y transaminasas, y más raramente miopatía, mientras que los agonistas PPARy están relacionados con aumento de peso, edema e infarto de miocardio (Cheang et al., 2015). La posibilidad de encontrar un único compuesto capaz de activar los dos receptores PPARa y PPARy , agonista dual, se presenta como una alternativa potencial en el tratamiento de la DT2 y el síndrome metabólico, con menores efectos secundarios (Cheang et al., 2015 y Tan et al., 2017). Recientemente se ha aprobado el uso de dos agonistas duales PPARa/Y pertenecientes al grupo de los glitazares, saroglitazar en la India (Lipaglyn™, por el centro de investigación Zydus Cadila) y lobeglitazona en Corea (Duvie™, por Chong Kun Dang), para el control lipídico y glucémico (Tan et al., 2017).

Sin embargo, otros agonistas duales como farglitazar y muraglitazar se han retirado del mercado debido a sus efectos secundarios de edema, infarto de miocardio, ictus y fallo cardiaco, así como aleglitazar (en fase clínica II), ragaglitazar y tesaglitazar ya que han mostrado carcinogeneicidad en modelos de roedores y un aumento de la creatinina en plasma (Tan et al., 2017).

El desarrollo de agonistas duales hPPARa y hPPARy permite combinar las propiedades de los agonistas del PPARa (fibratos) sobre la regulación del metabolismo lipídico incluyendo disminución de triglicéridos (TG), con el efecto adicional de mejorar la sensibilidad a la insulina que producen los agonistas del PPAR^y (TZD). Generalmente, estos ligandos duales hPPARa/y han mostrado en modelos animales mayor eficacia y menor toxicidad en el tratamiento de disfunciones del metabolismo, que la utilización de compuestos selectivos para cada uno de los receptores. De hecho, estudios clínicos muestran que agonistas duales PPARa/y disminuyen la resistencia a la insulina en diabetes tipo 2, los valores de glucemia y TG en plasma, y participan en el control de la inflamación vascular. Por lo tanto, la búsqueda de agonistas duales PPARa/y es importante para el tratamiento de diversas disfunciones metabólicas como es síndrome metabólico, DT2 y enfermedades cardiovasculares.

Por todo ello, existe la necesidad de desarrollar agonistas de PPARa y/o y que muestren mayor eficacia que los actuales, y/o que además muestren menor toxicidad.

DESCRIPCIÓN

La presente invención describe compuestos agonistas de PPARa y/o PPAR^y y composiciones farmacéuticas que los comprenden. Dichos compuestos, y las composiciones que los comprenden son útiles, en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y . Dichos compuestos son, por tanto, útiles en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). La presente invención describe, asimismo, los usos de dichos compuestos agonistas de PPARa y/o PPAR^y y de las composiciones farmacéuticas que los comprenden, en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y .

Una realización de los compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy descritos se refiere a un compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- Ri se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de un fenol;

- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo, y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R5 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;

- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido.;

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona.

En una realización de la presente invención cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.

Una realización se refiere a un compuesto de formula general I, descrito anteriormente, a sus enantiómeros, isómeros E,Z y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

A efectos de la presente invención se define el término "grupo protector de un fenol” como grupos que sustituyen al H del grupo fenol OH para evitar que éste sea reactivo o bien grupos que favorecen la farmacodinamia y farmacocinética de la molécula. Son ejemplos no limitantes de grupos protectores de fenol, entre otros: C ⁱ -⁶ alquilo (p.ej. metilo, etilo, propilo, etc.); alilo; alquilamina (ej. metil- isoquinoleína); alquilamida (p.ej. acetamida); alquilarilo (p.ej. bencilo, p-fluorobencilo, p-metoxibencilo); alquil-éter (p.ej. 2-metoxietoximetil); halo-alquilo (p. ej. trifluorometilo, fluoroetilo, cloroetilo); sililo (p.ej. alquiltrimetilsilano, aliltrimetilsilano); carbamato C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^{i -6} alquilo o arilo; un grupo acilo (p.ej. benzoílo), una alquilsulfona o una halo-alquilsulfona (p.ej. trifluorometilsulfona).

En una realización de la presente invención el grupo R ⁱ es un grupo protector de un fenol que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C ^{i -6} alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^{i -6} alquilo o arilo; acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona.

En una realización R ⁱ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C ⁱ -⁶ alquilo, alilo, alquilamida, alquilarilo, alquil-éter, alquilbenzoilo, halo-alquilo, sililo, haloalquilsulfona o un grupo acilo -C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo.

En otra realización Rⁱ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C ⁱ -⁶ alquilo, alquilamida, alquilarilo, o un grupo acilo -C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo.

El término "grupo protector de un ácido carboxílico” se define, a efectos de la presente invención, como grupos que sustituyen al H del grupo ácido carboxílico -COOH para evitar que éste sea reactivo o bien grupos que favorecen la farmacodinamia y farmacocinética de la molécula. Son ejemplos no limitantes de grupos protectores de ácido carboxílico, entre otros: C ^{i -6} alquilo, alilo, alquilamida, alquilamina, alquilarilo, alquil-éter, alquil-éster, halo-alquilo, sililo, carbamato C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^{i -6} alquilo o arilo, acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo, alquilsulfona o halo-alquilsulfona.

En una realización R⁵ se selecciona independientemente entre H; C ^{i -6} alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^{i -6} alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o haloalquilsulfona.

En una realización R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C1-6 alquilo, alquilarilo o alquil-éster.

En otra realización R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C1-6 alquilo, arilo, alquilarilo, alquil-éter, alquil-éster, alquilsulfona, halo-alquilo, sililo, haloalquilsulfona.

Una realización de la invención se refiere a un compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

R¹ se selecciona independientemente entre H; C ^1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^1-6 alquilo o arilo; acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

R² se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C i-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo; y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida;

alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NRmRp, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido.;

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona.

En una realización de la presente invención cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.

A efectos de la presente invención, un compuesto de fórmula I incluye todos los estereoisómeros de dicha fórmula I.

El término “estereoisómero” se refiere, a efectos de la presente invención a moléculas que tienen la misma fórmula molecular y la misma secuencia de átomos unidos (misma constitución), con los mismos enlaces entre sus átomos, pero que difieren en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. Enantiómeros y diasterómeros son dos tipos diferentes de estereoisómeros.

El término “enantiómero” se refiere, a efectos de la presente invención, a dos estereoisómeros que son imágenes especulares y no superponibles entre sí.

En particular, una realización de la presente invención comprende los enantiómeros R y S de los compuestos de fórmula I, en los que dichos enantiómeros son los 2 enantiómeros posibles respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano, incluyendo, por tanto, la configuración R y S del radical R10.

El término “diasterómero” se refiere, a efectos de la presente invención, a dos estereoisómeros que no son imágenes especulares. Los diasterómeros incluyen compuestos meso, isómeros E/Z e isómeros ópticos no enantioméricos.

Los isómeros E/Z se refieren a compuestos que comprenden enlaces doble C=C, es decir alquenos o cicloalquenos. Si en un enlace doble C=C los dos sustituyentes de mayor prioridad, de acuerdo con las reglas de la IUPAC (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada), están en el mismo lado, la disposición es Z. En cambio, si están en lados opuestos la disposición es E.

Una realización se refiere a un compuesto de formula general I, descrito anteriormente, a sus enantiómeros, isómeros E,Z y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Una realización comprende el enantiómero R respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero E respecto al doble enlace de la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero Z respecto al doble enlace de la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.

El término sales farmacéuticamente aceptables, a efectos de la presente invención, se refiere a cualquier sal que administrada a un paciente es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el compuesto en cuestión. Dichas sales son preferentemente sales de adición de ácidos orgánicos o inorgánicos, o de bases orgánicas o inorgánicas. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, o sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, trifluoroacetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato o tartrato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, calcio o amonio, o sales de adición de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquiletanolamina, trietanolamina y sales básicas de aminoácidos. Los procedimientos de formación de sales son procedimientos convencionales en el estado del arte.

El término "Ci-6 alquilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada de 1 a 6 átomos de carbono, completamente saturada, que puede ser lineal o ramificada.

El término "halo-alquilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, en la que al menos un H se encuentra sustituido por un átomo de un halógeno.

El término "alilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, que comprende al menos un grupo -CH=CH-CH2-.

El término "alquilamida” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, sustituida con un grupo amida.

El término "alquilamina” se refiere a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, sustituida con un grupo amino.

El término "arilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a grupo derivado de un hidrocarburo aromático que se forma al extraer un átomo de hidrógeno de un anillo aromático en dicho hidrocarburo aromático. A efectos de la presente invención dichos grupos arilo pueden encontrarse opcionalmente sustituidos. Ejemplos de sustituciones no limitantes son OH, alcóxido, alquilo, halógeno, alquilo halogenado, ciano, tiol, amina o alquilamina.

El término "alquilarilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada sustituida con un grupo arilo, que a su vez se define tal como se describe anteriormente.

El término "alcóxido” se refiere, a efectos de la presente invención, a un átomo de oxígeno unido a una cadena hidrocarbonada, donde dicha cadena hidrocarbonada puede comprender un grupo alquilo y/o un grupo arilo, tal como se definen anteriormente.

El término "alquil-éter” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada saturada sustituida con un grupo alcóxido, tal como se define anteriormente.

El término "acilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a un grupo carbonilo unido a una cadena hidrocarbonada, donde dicha cadena hidrocarbonada puede comprender un grupo alquilo y/o un grupo arilo, tal como se definen anteriormente.

El término "éster” , a efectos de la presente invención, se refiere a un grupo derivado de un ácido carboxílico -COOH, en el que el grupo hidroxilo -OH se encuentra sustituido por un grupo alcóxido, tal como se define de acuerdo con la presente invención.

El término "alquil-éster” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada saturada sustituida con un grupo éster, tal como se define anteriormente.

En una realización preferente A es un átomo de O.

En otra realización preferente A es un átomo de S.

En otra realización preferente A es un grupo un grupo NR⁷ , donde R⁷ se selecciona independientemente entre H, -OR⁸ o un grupo C ^1-6 alquilo, y donde R⁸ es un grupo H o un grupo C^1-6 alquilo. Más preferentemente R⁷ es H, -OH o -OCH^3.

En una realización preferente R¹ es H.

En otra realización preferente R¹ es un grupo C ^1-6 alquilo. Más preferentemente R¹ es un grupo metilo o propilo.

En otra realización preferente R¹ es un grupo alquilarilo. Más preferentemente R¹ es un grupo bencilo o 4-fluorobencilo.

En otra realización preferente R¹ es un grupo alquilamida. Más preferentemente R¹ es un grupo acetamida.

En otra realización preferente R¹ es un grupo acilo -C(O)R^a . Más preferentemente R1 es un grupo acilo -C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo. Aún más preferentemente R^a es un grupo fenilo.

En una realización preferente R³ es H.

En otra realización preferente R³ es metilo.

En una realización preferente R⁴ es C ^1-6 alquilo o un grupo alcóxido. En una realización preferente el grupo alcóxido es un grupo alcóxido halogenado.

En una realización más preferente R⁴ es metilo.

En una realización más preferente R⁴ es -OCH²CF³.

En una realización preferente R⁵ es H.

En otra realización preferente R⁵ es C^1-6 alquilo. Más preferentemente R⁵ es metilo, etilo, propilo, butilo o tert-butilo. Aún más preferentemente R⁵ es metilo, etilo o propilo.

En otra realización preferente R⁵ es alquilarilo. Más preferentemente R⁵ es bencilo.

En otra realización preferente R⁵ es alquil éster. Más preferentemente R⁵ es -CH²COOCH³ o -CH(COOCH³)².

En una realización preferente R6 es metilo.

En otra realización preferente R6 es OR9 donde R9 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R9 es etilo.

En una realización preferente R10 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R10 es metilo.

Una realización preferente de la invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6 , 8 , 9,10, 11, 12 y 13:

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero (E,Z) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (E,E) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8,10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z,Z) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z,E) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero E de los compuestos 9 y 13, respecto a la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos 9 y 13, respecto a la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.

Los compuestos de fórmula I, sus estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables, con actividad agonista PPAR comprenden una estructura común derivada de los benzopiranos prenilados naturales policerasoidol y policerasoidin (Gonzalez et al., 1995 y 1996), isómeros naturales de los compuestos 1 y 2 aquí descritos: El isómero (3E,7Z) del compuesto 1 se corresponde al compuesto natural policerasoidol, mientras que el isómero (3E,7E) es el compuesto natural isopolicerasoidol, y el policerasoidin se corresponde al isómero (3E,7Z) del compuesto 2:

compuestos naturales policerasoidol y policerasoidin de la corteza de árboles del género Polyalthia, indicando que alguno de los compuestos de la familia de las hidroquinonas preniladas, a la que pertenecen, son conocidos por tener propiedades citotóxicas o antioxidantes, sin referirse o dar pistas sobre una posible actividad como agonistas de PPAR. En el mismo sentido, otros documentos divulgan dichos compuestos, o compuestos de estructura similar, si bien dichos compuestos tampoco presentan actividad como agonistas de PPAR. En particular, el documento Taha et al, 2015 y Karimian et al. (2015) describe el uso de policerasoidol, de su éster metílico, y de policerasoidin como inductores de apoptosis en células tumorales de cáncer de mama. Zhao et al. (2010) analiza diferentes metabolitos derivados de tocoferol y tocotrienoles detectados en orina, suero o hígado en muestras humanas y de ratones, entre los cuales se describe el policerasoidol. Zafra-Polo et al. (1996) describe el polyalthidin, relacionado con la estructura básica de los compuestos de la invención, pero que sin embargo se describe solamente con relación a su actividad como inhibidor de la cadena respiratoria mitocondrial. Finalmente, el documento EP0421419A describe compuestos de núcleo benzopirano con tres cadenas preniladas haciendo referencia a su uso para disminuir los niveles séricos del colesterol. Ninguno de estos documentos describe, o da pistas sobre la posible utilidad de compuestos similares, con un núcleo benzopirano prenilado, como agonistas de PPAR.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos 1 y 2, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos 1 y 2, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero (E,E) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (E,Z) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z,Z) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z,E) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización preferente se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R3, R10 y R4 son metilo y R2 es un derivado de un grupo prenilo de estructura:

donde A es un átomo de O, y R6 es metilo,

y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde R1 y R5 se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula II incluyen, por tanto, los compuestos 1, 2 y compuestos derivados con diferentes grupos R1 y R5.

En una realización preferente, cuando R1 es H, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es Me, R5 es distinto de H o metilo.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula II, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula II, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero (E,Z) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (E,E) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z,Z) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z,E) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente, R1 es H y R5 es H.

En otra realización preferente, R1 es C1-6 alquilo y R5 es H. Más preferentemente R1 es metilo y R5 es H.

En otra realización preferente, R ⁱ es H y R⁵ es C ^1-6 alquilo. Más preferentemente R ⁱ es H y R⁵ es metilo o propilo.

En una realización preferente, R ⁱ es H y R⁵ es alquilarilo. Más preferentemente Rⁱ es H y R⁵ es bencilo.

En otra realización preferente, Rⁱ es alquilamida y R⁵ es alquilarilo. Más preferentemente R ⁱ es acetamida, y R⁵ es bencilo.

En otra realización preferente, R ⁱ y R⁵ son alquilarilo. Más preferentemente R ⁱ y R⁵ son bencilo.

En otra realización preferente, Rⁱ es C ^{i -6} alquilo y R⁵ es H. Más preferentemente Rⁱ es propilo es R⁵ es H.

En otra realización preferente, Rⁱ es un grupo acilo -C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo, y R⁵ es un grupo alquil éster. Más preferentemente R ⁱ es un grupo benzoilo y R⁵ es un grupo -CH²COOCH³.

En otra realización preferente, Rⁱ es un grupo C ^{i -6} alquilo y R⁵ es un grupo alquil éster. Más preferentemente Rⁱ es un grupo metilo y R⁵ es un grupo -CH²COOCH³ o un grupo -CH(COOCH³)².

Ambos compuestos i y 2 muestran una estructura similar y solo difieren en el grupo funcional de la posición C-6, un hidroxilo en el compuesto i y un metoxilo en el compuesto 2. A partir de los compuestos i y 2 se pueden sintetizar los compuestos 3, 4, 4a,4b, 4c, 6, 7 u 8 de fórmula I, mediante sustitución de las posiciones C-9’ y C-6, tal como se describe en el Ejemplo i, más adelante.

Una realización del compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es un compuesto que se selecciona independientemente entre compuesto i , 2, 3, 4, 4a, 4, b, 4c, 6, 7 u 8.

Una realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 y 8. En una realización preferente los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 y 8 son isómeros (E,Z), en relación a los dobles enlaces de la cadena lateral prenilada en posiciones C-3’ y C-7’.

Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R³ es H, R⁴ y R¹⁰ son metilo y R² es un derivado de un grupo prenilo de estructura:

, donde A es un átomo de O,

y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula III, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde R¹ , R⁵ , y R⁶ se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula III presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos 1 y 2, pero a diferencia de los compuestos de fórmula II, presentan H en lugar de metilo como grupo R³ , y además de las modificaciones en las posiciones C-6 (-OR ¹) y C-9’ (-COOR⁵), también presentan modificaciones en la posición C-8’ (R⁶).

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula III, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula III, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero (E,Z) de los compuestos de fórmula III, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (E,E) de los compuestos de fórmula III, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z,Z) de los compuestos de fórmula III, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z,E) de los compuestos de fórmula III, respecto a las posiciones C-‘3 y C-‘7 de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente, R¹ es un grupo alquilarilo, R⁶ es un grupo -OR⁹, donde R⁹ es C ^1-6 alquilo, y R⁵ es H o un grupo C ^1-6 alquilo. Más preferentemente R¹ es un grupo bencilo, R⁶ es un grupo -OCH²CH³ , y R⁵ es H o etilo.

Mas preferentemente R¹ es un grupo 4-fluorobencilo, R⁶ es un grupo -OCH² CH³ , y R⁵ es etilo.

Una realización del compuesto de fórmula III, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es un compuesto que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en compuesto 10, 11 y 12:

Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R3 es H, R4 y R10 son metilo y R2 es un grupo alquil-éster de estructura:

, donde A es un átomo de O,

y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula IV, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde Ri y R5 se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula IV presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos de fórmula I 1 y 2. Sin embargo, los compuestos de fórmula IV son compuestos de fórmula I donde el radical R3 es H, y no metilo tal como presentan los compuestos 1 y 2, y el radical R2 es un grupo alquil-éster que, a diferencia de los compuestos 1 y 2 , no presenta un segundo grupo prenilo.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula IV, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos de fórmula IV, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero E de los compuestos de fórmula IV, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos de fórmula IV, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente R1 es alquilarilo y R5 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R1 es 4-fluorobencilo y R5 es etilo.

Una realización del compuesto de fórmula IV, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es el compuesto 9:

Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R3 es H, R10 es metilo y R2 es -C(O)ORb, y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula V, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde R^b es un grupo C^1-6 alquilo y, R¹ y R⁴ se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula V presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos de fórmula I1 y 2, pero donde en dicha fórmula I el radical R² es un grupo éster en lugar de un grupo alquil-éster prenilado que presentan los compuestos 1 y 2.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula V, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos de fórmula V, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero E de los compuestos de fórmula V, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos de fórmula V, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente R¹ es alquilarilo, R^b es C ^1-6 alquilo y R⁴ es un grupo alcóxido. Más preferentemente R¹ es bencilo, R^b es etilo y R⁴ es -OCH²CF³.

Una realización del compuesto de fórmula V, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es el compuesto 13:

Una realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se ha descrito anteriormente, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se define como cantidad efectiva, a efectos de la presente invención, aquella cantidad del compuesto que proporciona una mejora objetivamente identificable en el estado del paciente, reconocida por un observador cualificado, y donde dicho paciente es tratado con una composición farmacéutica que comprende dicha cantidad del compuesto.

Son excipientes farmacéuticamente aceptables, a efectos de la presente invención, ingredientes inertes tales como, pero no limitados a, codisolventes, tensioactivos, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizadores y antioxidantes.

Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- Ri es H o un grupo protector de un fenol;

- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C i-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo, y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R5 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;

- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;

donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona; y

donde cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo; o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.

Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R ⁱ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C ^{i -6} alquilo; alilo;

alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^1-6 alquilo o arilo; acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R² se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo, y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R⁵ se selecciona independientemente entre H; C ^1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^1-6 alquilo o arilo; acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R⁶ es C^1-6 alquilo o OR⁹ donde R⁹ es C ^1-6 alquilo;

donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona; y

donde cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo; o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.

Una realización del compuesto de fórmula I, o de una composición que lo comprende, para uso como medicamento, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Una realización comprende el enantiómero R. Otra realización comprende el enantiómero S. Una realización comprende el isómero E. Otra realización comprende el isómero Z.

Otra realización preferente se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12 y 13, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.

Los compuestos de fórmula I descritos, son agonistas de PPARa y/o PPARy . Por tanto, dichos compuestos son útiles en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy , es decir, en enfermedades mediadas por agonistas de PPARa y/o PPARy , que equivale a enfermedades cuyo tratamiento se beneficia de la administración de agonistas de PPARa y PPARy .

Tal como se ha indicado anteriormente, los PPAR se consideran potentes herramientas terapéuticas en el control de desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (Ahmadian et al., 2013). Además, los PPAR tienen una importancia adicional ya que están implicados en el control de procesos inflamatorios, por lo que pueden regular la inflamación, función vascular, y el remodelado vascular.

Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R1 es H o un grupo protector de un fenol;

- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo, y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R5 es H o un grupo protector de un ácido carboxílico;

- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido; y

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona;

o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy .

En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

En una realización los desórdenes cardiovasculares se refieren a la aterosclerosis.

En una realización las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R ⁱ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C ^{i -6} alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^1-6 alquilo o arilo; acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R² se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)OR^b, donde R^b es un grupo C ^1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR⁷ , donde R⁷ se selecciona independientemente entre H, OR⁸ o un grupo C ^1-6 alquilo, y donde R⁸ es un grupo H o un grupo C ^1-6 alquilo;

- R⁵ se selecciona independientemente entre H; C ^1-6 alquilo; alilo; alquilamida;

alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NR^mR^p, donde R^m y/o R^p son cada uno e independientemente H, C ^1-6 alquilo o arilo; acilo C(O)R^a , donde R^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R⁶ es C^1-6 alquilo o OR⁹ donde R⁹ es C ^1-6 alquilo;

y donde

- R³ es H o un grupo C ^1-6 alquilo; y

- R⁴ es un grupo C ^1-6 alquilo o un alcóxido; y

- Río se selecciona independientemente entre un grupo Ci-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona;

o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy .

En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

En una realización las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Una realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes tipo 2 (DT2).

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la aterosclerosis. Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la aterogénesis.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la inflamación y de enfermedades relacionadas con procesos inflamatorios.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hipercolesterolemia.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hipertrigliceridemia.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento del síndrome metabólico.

O t r a r e a l i z a c i ó n s e r e f i e r e a u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e lo c o m p r e n d e , t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e l a o b e s i d a d .

O t r a r e a l i z a c i ó n s e r e f i e r e a u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e lo c o m p r e n d e , t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e

O t r a r e a l i z a c i ó n s e r e f i e r e a u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e lo c o m p r e n d e , t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e h i p e r l i p o p r o t e i n e m i a .

O t r a r e a l i z a c i ó n s e r e f i e r e a u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e o c o m p r e n d e , t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e d i s b e t a l i p o p r o t e i n e m i a .

E n u n a r e a l i z a c i ó n d e l a p r e s e n t e i n v e n c i ó n c u a n d o R 1 e s H y R 3 e s m e t i l o , R 5 e s d i s t i n t o d e H o m e t i l o , y c u a n d o R 1 e s m e t i l o y R 3 e s m e t i l o , R 5 e s d i s t i n t o d e H o m e t i lo .

U n a r e a l i z a c i ó n d e l c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I, o d e u n a c o m p o s i c i ó n q u e lo c o m p r e n d e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e u n a e n f e r m e d a d q u e r e s p o n d e a l a a d m i n i s t r a c i ó n d e a g o n i s t a s d e P P A R a y / o P P A R y , t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , c o m p r e n d e c u a l q u i e r a d e s u s e n a n t i ó m e r o s o m e z c l a s d e e s t o s , y c u a l q u i e r a d e s u s i s ó m e r o s E / Z y m e z c l a s d e e l l o s , y s u s s a l e s f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e s . U n a r e a l i z a c i ó n c o m p r e n d e e l e n a n t i ó m e r o R . O t r a r e a l i z a c i ó n c o m p r e n d e e l e n a n t i ó m e r o S . U n a r e a l i z a c i ó n c o m p r e n d e e l i s ó m e r o E . O t r a r e a l i z a c i ó n c o m p r e n d e e l i s ó m e r o Z .

O t r a r e a l i z a c i ó n d e l a p r e s e n t e i n v e n c i ó n s e r e f i e r e a u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I, e s t e r e o i s ó m e r o s y s a l e s f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e s d e l m i s m o , q u e s e s e l e c c i o n a i n d e p e n d i e n t e m e n t e e n t r e e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n II , I I I , I V o V :

(II),

(V),

d o n d e R i , R 4 , R 5 , R 6 y R b s e d e f i n e n t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e lo c o m p r e n d e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e u n a e n f e r m e d a d q u e r e s p o n d e a l a a d m i n i s t r a c i ó n d e a g o n i s t a s d e P P A R a y / o P P A R ^y .

U n a r e a l i z a c i ó n d e l o s c o m p u e s t o s d e f ó r m u l a II, I I I , I V o V , o d e u n a c o m p o s i c i ó n q u e c o m p r e n d e u n o d e d i c h o s c o m p u e s t o s , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e u n a e n f e r m e d a d q u e r e s p o n d e a l a a d m i n i s t r a c i ó n d e a g o n i s t a s d e P P A R a y / o P P A R ^y , t a l c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e , c o m p r e n d e c u a l q u i e r a d e s u s e n a n t i ó m e r o s o m e z c l a s d e e s t o s , y c u a l q u i e r a d e s u s i s ó m e r o s E / Z y m e z c l a s d e e l l o s , y s u s s a l e s f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e s .

O t r a r e a l i z a c i ó n d e l a p r e s e n t e i n v e n c i ó n s e r e f i e r e a u n c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I, e s t e r e o i s ó m e r o s y s a l e s f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e s d e l m i s m o , q u e s e s e l e c c i o n a i n d e p e n d i e n t e m e n t e e n t r e u n c o m p u e s t o 1, 2 , 3 , 4 , 4 a , 4 b , 4 c , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 o 13 , o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e lo c o m p r e n d e , p a r a u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e u n a e n f e r m e d a d q u e r e s p o n d e a l a a d m i n i s t r a c i ó n d e a g o n i s t a s d e P P A R a y / o P P A R ^y .

E l c o m p u e s t o 5 s e r e f i e r e a l c o m p u e s t o d e f ó r m u l a I:

En una realización los compuestos 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el enantiómero R.

En otra realización los compuestos 1,2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el enantiómero S.

En una realización los compuestos 1,2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y , descritos anteriormente, comprenden el isómero (E,Z).

En otra realización los compuestos 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy , descritos anteriormente, comprenden el isómero (E,E).

En una realización los compuestos 1,2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy , descritos anteriormente, comprenden el isómero (Z,Z).

En otra realización los compuestos 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy , descritos anteriormente, comprenden el isómero (Z,E).

En una realización los compuestos 9 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy , descritos anteriormente, comprenden el isómero E .

En otra realización los compuestos 9 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy , descritos anteriormente, comprenden el isómero Z.

Otra realización se refiere al uso de los compuestos de fórmula I en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y .

Otra realización se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, o de una composición farmacéutica que lo comprende, a un paciente de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y .

Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 1,2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa y PPAR^y .

En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa/Y se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

En una realización más preferente las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Otra realización se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 1,2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, o de una composición farmacéutica que lo comprende, a un paciente de una enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa y PPARy .

Una realización de la invención se refiere al procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula I, tal como se describen anteriormente, donde dicho procedimiento comprende:

(a) condensar una 2,5-dihidroxiacetofenona y un alquilcetoéster para obtener una benzopiran-4-ona de fórmula A;

(b) reducir el grupo cetónico de la benzopiran-4-ona obtenida en el paso (a);

(c) proteger el grupo fenol de la benzopiran-4-ona para obtener un éster benzopirano de fórmula (B);

(d) reducir el grupo éster con reactivos adecuados para obtener un aldehído;

(e) hacer reaccionar el grupo aldehído (C), obtenido en (d), con un reactivo de Grignard para obtener un alcohol alílico;

y someter dicho alcohol alílico a las condiciones de transposición de Johnson-Claisen obteniendo un éster benzopirano (D);

donde opcionalmente,

- el aldehído (C) obtenido en el paso (d) se somete a:

(f) condiciones de olefinación de Horner-Wadsworth-Emmons utilizando un fosfonato que comprende un radical -CH(COORb)R4, o

(g) condiciones de olefinación de Wittig utilizando un iluro de fósforo que comprende un radical -C(COORb)R4;

- o donde una vez realizado el paso (e), el éster benzopirano (D) obtenido se somete al paso (d):

para obtener un nuevo aldehído (E); y donde se somete dicho nuevo aldehído (E) a

(f)- condiciones de olefinación de Horner-Wadsworth- Emmons utilizando un fosfonato que comprende un radical -CH(COOR5)R6, o (g) condiciones de olefinación de Wittig utilizando un iluro de fosforo que comprende un radical -C(COOR5)R6;

y donde, opcionalmente, se desprotege posteriormente el grupo fenol, y/o el grupo carboxílico en el compuesto resultante del paso (f) o (g);

y donde R1, R3, R4, R5, R6, R10 y Rb se definen tal como se describe anteriormente en las realizaciones descritas en esta invención.

Mediante dicho procedimiento de síntesis se obtienen los compuestos 1,2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 descritos anteriormente.

Dicho procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula I se puede esquematizar de la siguiente manera:

3' R1=H R3=R4=R6=Me; R5=Pr Ris=CH3

: R1= H R3=R4=R6=Me; R5=Bn Rio=CH3

a: R1= acelaimida; R3=R4=R6=Me; R£=Bn Riq=CH3

b: R1= Bn; R3=R4=R6=Me R5=Bn Ric=CFI3

c: Rt = Pr; R3=R4=R6=Me R5= H Riü=CH3

5: R1= H R3=R4=R6=Me; R5= Me Ri:=CH3

6: R1= Bz; R3=R4=R6=Me: R5= CHiCOOMe Ri£=CH3

7: R1= R3=R4=RS=Me; R5= CH(COOMe)z Rm=CH3

3: R1= R3=R4=RS=Me; R5= CH2COOMe Ric=CH3

10; R1=CH;Ph. R3=H; R4=Me; RS=Et R6=OEt Rio= CHa

11 ^R 1^{= CHsPh; R} 3^=R5^{=H; R} 4^{= M e ; R} 5^{= OE}1 ^{R-;= CHa}

12 R1=CHj-pF(Plij. R3=H. R4=Me; R5=El R6=CEt Riü= CHa

donde

f) Wittig Cj) HMner-Wadsworth'Enimons

Pl:h3* Br__ PPhj O C o

e i 0 'F ^ ^ , C O O R s T a N i e i 0 w ^ V j C 00 R 5 R O H E l ü ' P C O O R 5

Re.'^c oor5 Ri A > ^{O O F:;} EtO Eto' X J ^e.^o' ^t

f

R^í = OEV Me: Rs= El R6= OEt: Me. R5= El

R e a c t i v o s y c o n d i c i o n e s : ( a ) p i r r o l i d i n a , E t O H , 4 5 ° C , 24 h ; ( b ) Z n , H C l - A c O H ( 2 : 1 , v / v ) , t e m p a m b , 1 h ; ( c ) R 1X d o n d e X e s u n h a l ó g e n o , K 2 C O 3 , E t O H , r e f l u jo , 4 h ; ( d ) 1 M D I B A L - H ( h i d r u r o d e d i i s o b u t i l a l u m i n o ) e n T H F , - 78 ° C , 20 m in ; ( e ) 1 ) R 4- M g B r , - 78 ° C , 3 h ; 2 ) M e C ( O R 6 ) 3 , á c i d o i s o b u t í r i c o ( 2 g o t a s ) , 14 0 ° C , 2 h ; (f) ( g ) t B u O K o N a H , T H F , 0 ° C a t e m p a m b , 16 h .

L a f o r m a c i ó n d e l n ú c l e o c r o m a n o s e h a r e a l i z a d o , p o r t a n t o , m e d i a n t e ( a ) c o n d e n s a c i ó n d e ^{2 , 5 - d i h i d r o x i a c e t o f e n o n a y a l q u i l c e t o é s t e r , d a n d o l u g a r a b e n z o p y r a n - 4 - o n a ( K a b b e} et al., 19 82 ) . A c o n t i n u a c i ó n , ( b ) s e r e d u j o e l g r u p o c a r b o n i l o m e d i a n t e r e d u c c i ó n d e C l e m m e n s e n , y ( c ) s e p r o t e g i ó e l g r u p o f e n o l . L a e l o n g a c i ó n d e l a c a d e n a l a t e r a l s e r e a l i z ó ( d ) m e d i a n t e ^{r e d u c c i ó n d e l é s t e r e t í l i c o f o r m a n d o e l c o r r e s p o n d i e n t e a l d e h i d o . E l c o m p u e s t o} 13 ^{s e o b t i e n e} s o m e t i e n d o d i c h o a l d e h i d o o b t e n i d o e n e l p a s o ( d ) , a u n a o l e f i n a c i o n m e d i a n t e r e a c c i ó n d e ^{W i t t i g (f) o d e H o r n e r - W a d s w o r t h - E m m o n s ( g ) ( B i s c e g l i a} et al., ^{2 0 1 2 y T o s h i m a} et al., ^{2 0 0 1 ) .}

^{P a r a l a o b t e n c i ó n d e l c o m p u e s t o} 9 ^{, ( e ) s e t r a t ó e l a l d e h i d o o b t e n i d o e n e l p a s o ( d ) , e n p r i m e r} l u g a r , c o n u n r e a c t i v o d e G r i g n a r d g e n e r a n d o u n a l c o h o l a l í l i c o q u e s e s o m e t i ó a l a s ^{c o n d i c i o n e s d e t r a n s p o s i c i ó n d e J o h n s o n - C l a i s e n ( S e n} et al., ^{19 9 0 ) p a r a f i n a l m e n t e o b t e n e r e l é s t e r d e l c o m p u e s t o} 9 ^{. L o s c o m p u e s t o s} 1-8 ^y 10-12 ^{s e o b t i e n e n m e d i a n t e u n a s e g u n d a} e l o n g a c i ó n d e l a c a d e n a l a t e r a l u t i l i z a n d o n u e v a m e n t e l a s c o n d i c i o n e s d e l p a s o ( d ) a n t e r i o r m e n t e d e s c r i t o p a r a r e a l i z a r l a r e d u c c i ó n d e l g r u p o é s t e r d e l c o m p u e s t o 9 f o r m a n d o e l c o r r e s p o n d i e n t e a l d e h í d o , d o n d e d i c h o a l d e h í d o s e s o m e t e a u n a o l e f i n a c i ó n m e d i a n t e r e a c c i ó n d e W i t t i g (f) o d e H o r n e r - W a d s w o r t h - E m m o n s ( g ) .

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 ^{. E f e c t o e n l a v i a b i l i d a d c e l u l a r m e d i a n t e e l e n s a y o d e M T T d e p o l i c e r a s o i d o l ( 1 ) , p o l i c e r a s o i d i n ( 2 ) , c o m p u e s t o 8 , W Y - 1 4 6 4 3 y r o s i g l i t a z o n a . E n n e u t r ó f i l o s h u m a n o s (} Fig. 1A ^{) y H U V E C (} Fig. 1B ^{) . D a t o s r e p r e s e n t a d o s c o m o m e d i a ± S E M d e n = 5 e x p e r i m e n t o s} i n d e p e n d i e n t e s . * p < 0 , 05 o * * p < 0 , 01 r e l a t i v o a l g r u p o v e h í c u l o .

Figura 2 ^{. E f e c t o e n l a v i a b i l i d a d c e l u l a r m e d i a n t e e n s a y o d e M T T d e l a n á l o g o s i n t e t i z a d o 9 . E n n e u t r ó f i l o s h u m a n o s (} A ^{) y H U V E C (} B ^{) . D a t o s r e p r e s e n t a d o s c o m o m e d i a ± S E M d e n = 5} e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d i e n t e s . * p < 0 , 05 o * * p < 0 , 01 r e l a t i v o a l g r u p o v e h í c u l o .

Figura 3. ^{E f e c t o d e p o l i c e r a s o i d o l ( 1 ) , p o l i c e r a s o i d i n ( 2 ) , c o m p u e s t o 8 , W Y - 1 4 6 4 3 y} r o s i g l i t a z o n a , e n l a v i a b i l i d a d c e l u l a r m e d i a n t e c i t o m e t r í a d e f l u j o . P o r c e n t a j e d e n e u t r ó f i l o s ^{a p o p t ó t i c o s (} Fig.3A ^{) , s u p e r v i v e n c i a (} Fig.3B ^{) , a p o p t o s i s (} Fig.3C ^{) y s u p e r v i v e n c i a e n H U V E C (} Fig. 3D ^{) d e s p u é s d e 2 4 h d e i n c u b a c i ó n c o n l o s c o m p u e s t o s} 1 ^, 2 ^, 8 ^{, W Y - 1 4 6 4 3 y} r o s i g l i t a z o n a . L a s c é l u l a s a p o p t ó t i c a s s e c u a n t i f i c a r o n c o m o p o r c e n t a j e d e l a p o b l a c i ó n t o t a l de anexinas V+/PI- apoptóticas tardías y/o necróticas como anexina V+/PI+, y células no apoptóticas viables como anexina V-/PI-. Las columnas son la media ± SEM de n= 3 experimentos independientes. Se han incluido los paneles representativos de citometría de flujo (Fig. 3E) que muestran los efectos del vehículo y compuestos 1, 2, 8, WY-14643 y rosiglitazona sobre la apoptosis/supervivencia de neutrófilos. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.

Figura 4. Efecto en la viabilidad celular del compuesto 9 mediante citometría de flujo. Porcentaje de apoptosis de neutrófilos (Fig. 4A), supervivencia (Fig. 4B), apoptosis de HUVEC (Fig. 4C) y supervivencia (Fig. 4D) después de 24 h de incubación. Las células apoptóticas se cuantificaron como porcentaje de la población total anexina V+/PI-, apoptóticas tardías y/o necróticas como anexina V+/PI+, y células no apoptóticas viables como anexina V-/PI-. Las columnas son la media ± SEM de n=3 experimentos independientes. Se han incluido los paneles representativos de citometría de flujo (Fig. 4E) que muestran los efectos del vehículo y del compuesto 9 sobre la apoptosis/supervivencia de neutrófilos. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.

Figura 5. Policerasoidol (1) inhibe la adhesión de células mononucleares a HUVEC inducida por TNFa en condiciones de flujo fisiológico. Las células se pretrataron durante 20 h con 1 ^M de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 o rosiglitazona, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Neutrófilos humanos recién aislados o células mononucleares se perfundieron sobre monocapas endoteliales durante 5 min a 0,5 dinas/cm2 y se cuantificó la adhesión de neutrófilos (Fig. 5A) y células mononucleares (Fig. 5B). Las curvas dosis-respuesta se realizaron para policerasoidol (1) y rosiglitazona con HUVEC estimuladas con TNFa (20 ng/mL, 24 h) y perfusión de células mononucleares humanas recién aisladas (Fig. 5C). Los resultados son la media ± SEM de 4-6 experimentos independientes. **p <0,01 relativo al grupo vehículo y f t p < 0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 6. El compuesto 9 inhibe la adhesión de células mononucleares a HUVEC inducida por TNFa en condiciones de flujo fisiológico. Algunas células se pretrataron durante 20 h con 3, 30 o 100 ^M de compuesto 9, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Neutrófilos humanos recién aislados o células mononucleares se perfundieron sobre monocapas endoteliales durante 5 min a 0,5 dinas/cm2 y se cuantificó la adhesión de neutrófilos (Fig. 6A) y células mononucleares (Fig. 6B). Las curvas concentración-respuesta (0,1-100 ^M) se realizaron para compuesto 9 con HUVEC estimuladas con TNFa (20 ng/mL, 24 h) y perfusión de células mononucleares humanas recién aisladas (Fig.6C). Los resultados son la media ± SEM de 4-6 experimentos independientes. **p< 0,01 relativo al grupo vehículo y +p< 0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 7. Las células endoteliales se transfectaron con siRNA de control o siRNA específico de RXRa, PPARa o PPAR. 48 h después de la transfección, la expresión proteica de RXRa (Fig. 7A), PPARa (Fig. 7B) o PPAR^y (Fig. 7C) se determinó por Western blot. Los resultados (media ± SEM de n=4 experimentos independientes) se expresan en relación con p-actina. También se muestran las imágenes de los geles representativos. **p <0,01 con respecto a los valores en el respectivo grupo de control de siRNA.

Figura 8. El silenciamiento de PPAR^y o RXRa por siRNA detiene el efecto inhibitorio de policerasoidol (1) en las interacciones entre células endoteliales-leucocitos mononucleares inducidas por TNFa. HUVEC se transfectaron con el control, siRNA específico de RXRa, PPARa o PPAR^y.48h después de la transfección, las células se pretrataron con policerasoidol (10 ^M) o rosiglitazona (1 ^M) durante 20h y entonces se estimularon con TNFa (20 ng/mL, 4h). Se cuantificó la adhesión celular mononuclear. Los resultados son la media ± SEM de 3­ 4 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo a grupo vehículo respectivo, ^f p <0,05 o ^{f t} p <0,01 relativo a las células estimuladas con TNFa respectivas (Fig. 8A, 8B, 8C). La interacción RXRa/PPARY se midió por immunoprecipitación de PPARy seguido de Western blot para RXRa. Las películas de quimioluminiscencia se cuantificaron por análisis de imagen. El blot representa un n=3 de experimentos independientes (Fig. 8D).

Figura 9. La interacción RXRa/PPARY del compuesto 9 se midió por inmunoprecipitación de PPARy seguido de Western blot para RXRa. Las películas de quimioluminiscencia se cuantificaron por análisis de imagen. El blot representa un n=3 de experimentos independientes.

Figura 10. Policerasoidol (1) inhibe la expresión en HUVEC de ICAM-1, VCAM-1 y CX³CL1 inducida por TNFa. Algunas células se pretrataron con policerasoidol (10 ^M) 20 h, antes de la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h para ICAM-1, VCAM-1 y CX³CL1). Mediante citometría de flujo se determinó la expresión de ICAM-1 (Fig. 10A), VCAM-1 (Fig. 10B) y CX³CL1 (Fig. 10C). Los resultados (media ± SEM) se expresaron como una media de la intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes. La expresión de ICAM-1, VCAM-1, y CX³CL1 también se visualizó en HUVEC no permeabilizadas mediante inmunofluorescencia, utilizando alexa-fluor 488 (verde) (Fig. 10E). Los núcleos se contrastaron con colorante Hoechst (azul). *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo, ^t p <0,05 o ^{t t} p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 11. Compuesto 9 inhibe la expresión en HUVEC de VCAM-1, CX³ CL1 y CXCL16 inducida por TNFa, pero no de ICAM-1. Algunas células se pretrataron con el compuesto 9 (3 ^M) 20 h, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Mediante citometría de flujo se determinó la expresión de ICAM-1(Fig. 11A), VCAM-1(Fig. 11B), CX³CLI (Fig. 11C) y CXCL16 (Fig. 11D). Los resultados (media ± SEM) se expresaron como una media de la intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes. La expresión de ICAM-1, VCAM-1, CX³ CL1 y CXCL16 también se visualizó en HUVEC no permeabilizadas mediante inmunofluorescencia, utilizando alexa-fluor 488 (verde) (Fig. 11E). Los núcleos se contrastaron con colorante Hoechst (azul). **p <0,01 relativo al grupo vehículo, ^f p <0,05 o ^{t 1} p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 12. Policerasoidol (1) inhibe la activación de p38 MAPK y NF-^kB (p65) inducida por TNFa en HUVEC. Las células se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Algunas células se pretrataron con policerasoidol (10 ^M) 20 h antes de la estimulación con TNFa. La activación de p38 MAPK (Fig. 12A) y NF-^kB (Fig. 12B) se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados (media ± SEM) se expresaron como la media de intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes (Fig. 12C y 12D). Se muestran los histogramas representativos. **p <0,01 relativo al grupo vehículo ^t p <0,05 y ^{t t} p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 13. El compuesto 9 inhibe la activación de p38 MAPK y NF-^kB (p65) inducida por TNFa en HUVEC. Las células se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Algunas células se pretrataron con el compuesto 9 (3 ^M) 20 h antes de la estimulación con TNFa. La activación de p38 MAPK (Fig. 13A) y NF-^kB (Fig. 13B) se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados (media ± SEM) se expresaron como la media de intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes (Fig. 13C y 13D). Se muestran los histogramas representativos. **p <0,01 relativo al grupo vehículo y ^t p <0,05 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 14. El compuesto 9 no produce diferencias significativas en ganancia de peso (g) y eficiencia alimenticia en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Los histogramas muestran la ganancia de peso (Fig. 14A) que se expresó como la diferencia de peso entre el día 5 y el día 0 (d⁵-d⁰), y la eficiencia alimenticia (Fig. 14B) que se calculó como el cociente entre el aumento de peso y el alimento consumido. No se observaron diferencias significativas de aumento de peso ni eficiencia en la alimentación entre los ratones tratados con el compuesto 9 y los grupos control. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes.

Figura 15. El compuesto 9 y rosiglitazona reducen los valores de glucosa en plasma en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Se ha representado la variación de glucosa respecto al d⁰, que se ha calculado utilizando la siguiente fórmula: ((d⁵-d⁰)/d⁰) x 100. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratado con vehículo.

Figura 16. El compuesto 9 no produce diferencias significativas en la ganancia de peso de tejido adiposo blanco (WAT) en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Las columnas muestran la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes

Figura 17. El compuesto 9 reduce significativamente el área media de los adipocitos de WAT de forma dosis-dependiente en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Área media de los adipocitos, en ^m2 (Fig. 17A), y sus respectivas imágenes representativas (Fig. 17B). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 18. Estudio del efecto antiinflamatorio en tejido adiposo blanco (WAT) en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Nivel de expresión de ARNm de MCP-1 en WAT (Fig. 18A) y Cuantificación de macrófagos F4/80+ en WAT mediante inmunohistoquímica (Fig. 18B). El compuesto 9 disminuye la expresión de ARNm de MCP-1 y el número de macrófagos infiltrados en el tejido adiposo blanco (WAT). Las columnas son la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p < 0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 19. El compuesto 9 y WY-14643 aumentan los niveles de colesterol total y HDL-c, y disminuyen los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma. Valores de colesterol total (Fig. 19A), HDL-c (Fig. 19B), triglicéridos (Fig. 19C) y ácidos grasos libres (Fig.19D). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 20. El compuesto 9 no afectó de forma significativa al peso del hígado ni a los triglicéridos acumulados, en comparación con el grupo control (vehículo). Ganancia de peso del hígado (Fig. 20A) y niveles de triglicéridos en hígado (Fig. 20B). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 21. El compuesto 9 redujo los niveles circulantes de ALT y AST Niveles de alanina amino transferasa (ALT) y aspártico transaminasa (AST) en plasma de ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

EJEMPLOS

Los ejemplos descritos a continuación tienen carácter ilustrativo y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención. Toda la investigación con muestras humanas de este estudio se ha llevado a cabo cumpliendo los principios de la Declaración de Helsinki y con la aprobación del Comité ético institucional del Hospital Clínico de Valencia (Valencia, España).

Ejemplo 1: Obtención de compuestos de fórmula I

Todos los reactivos y disolventes se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron directamente. Todas las reacciones sensibles a la humedad se llevaron a cabo en matraces secados en horno, bajo atmósfera de nitrógeno y con disolventes secos. Todas las reacciones se controlaron por CCF analítica con gel de sílice 60 F254 (Merck 5554) con detección UV a 254 nm. Los residuos se purificaron a través de una columna de gel de sílice 60H (5-40 ^m, Merck 7736) y por cromatografía ultrarrápida (230-400 ^m, Merck 9385). La CCF preparativa se realizó usando placas de gel de sílice de 0,5 mm (Merck). Hewlett-Packard (HP-1100) o TripleTOF5600 (ABSciex) se utilizó para el análisis LC-MS, con la fuente API (ionización de presión atmosférica) configurada como APCI (ionización química a presión atmosférica) o APIES (ionización por electrospray) en modo positivo o negativo. Los espectros de RMN (1H, 13C, COSY 45, DEPT, HSQC y HMBC) se referenciaron para la señal de disolvente CDCh en un Bruker AC 300 o AC-500. Las multiplicidades de resonancias de 13C RMN fueron asignadas por experimentos DEPT. Las asignaciones de RMN se apoyaron en experimentos COSY 45, DEPT, HSQC y HMBC.

1.1. Obtención de los compuestos 1 (policerasoidol) y 2 (policerasoidin)

Se aislaron el policerasoidol (1) y policerasoidin (2) a partir de un extracto metanólico de cortezas de tallos de Polyalthia cerasoides y P. sclerophylla y se identificaron en base a sus características cromatográficas y espectrales (Gonzalez et al., 1995 y 1996).

1.2. Obtención de los compuestos 3 a 8

Compuesto 3: A una suspensión de policerasoidol (1) (80 mg, 0.2 mmol) y K2CO3 (80 mg) en acetona (2 mL), se añadió 1-bromopropano CH3CH2CH2Br (20 ^L 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 h. La mezcla de reacción se concentró a sequedad y se volvió a disolver en 10 mL de CH2Ch. La fase orgánica se lavó con salmuera (3 x 10 mL) y H2O (3 x 10 mL), se deshidrató con Na2SO4 anhidro y se evaporó a sequedad en el rotavapor. El crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el compuesto 3 (50 mg, 63 %). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 56.49 (d, J= 2.6 Hz, H-7), 6.39 (d, J= 2.6 Hz, H-5), 5.91 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7', 5.15 (td, J= 0.9, 7.1 Hz, H-3'), 4.11 (t, J= 6.6 Hz, 2H, COOCH²CH²CH³-9'), 2.68 (t, J= 6.6 Hz, 2H, CH²-4), 2.57 (ddd, J= 1.2, 7.5, 15.1 Hz, 2H, CH²-6'), 2.12 (s, 3H, CH³-13'), 2.10-2.03 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 1.89 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH³-1O'), 1.75 (sex, J= 7.3 Hz, 2H, COOCH² CH²CH³-9'), 1.86-1.60 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.59 (s, 3H, CH³-11'), 1.25 (s, 3H, CH-12'), 0.97 (t, J= 7.3 Hz, 3H, COOCH²CH² CH³-9'); RMN ¹³C (125 MHz, CDCI³) 5 168.4 (COOCH² CH²CH³-9'), 147.9 (C-6), 145.8 (C-8a), 142.8 (CH-7'), 134.3 (C-4'), 127.2 (C-8'), 127.0 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121.1 (C-4a), 115.6 (CH-7), 112.6 (CH-5), 75.2 (C-2), 65.8 (COOCH²CH²CH³-9'), 39.6 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.3 (CH²-3), 27.9 (CH²-6'), 23.9 (CH³-12'), 22.4 (CH²-4), 22.1 (COOCH² CH²CH³-9'), 22.0 (CH²-2'), 20.6 (CH³-10'), 16.0 (CH³-13'), 15.7 (CH³-H '), 10.5 (COOCH²CH² CH³-9'); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 401.1 (100) [MH]⁺ ; HREIMS m/z 400.263746 [M]⁺ (400.261360 calcd para C²⁵H³⁶O⁴).

Compuesto 4: A una suspensión de policerasoidol (1) (80 mg, 0.2 mmol) y K²CO³ (80 mg) en acetona (2 mL), se añadió cloruro de bencilo ClCH² Ph (25 ^L 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el compuesto 4 (60 mg, 67 %). ¹ H NMR (400 MHz, CDC^h ) 57.39-7.29 (m, 5H, COOCH²Ph-9'), 6.50 (dd, J= 0.4, 2.7 Hz, H-7), 6.40 (dd, J= 0.4, 2.7 Hz, H-5), 5.95 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7'), 5.20 (s, 2H, COOCHPh-9'), 5.12 (td, J= 1.1, 7.1 Hz, H-3'), 2.70 (td, J= 2.5, 6.7 Hz, 2H, CH²-4), 2.57 (ddd, J= 1.3, 7.4, 15.2 Hz, 2H, CH²-6'), 2.14 (s, 3H, CH³-13'), 2.12-1.90 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH³-10'), 1.82-1.60 (m, 4H, CH²-3 y CH²-1'), 1.56 (s, 3H, CH³-H '), 1.26 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³ C (125 MHz, CDCl³) 5 167.9 (COOCH² Ph-9'), 147.8 (C-6), 145.8 (C-8a), 143.6 (CH-7'), 134.1 (C-1'' de COOCH²Ph-9'), 134.3 (C-4'), 128.5 (2CH de COOCHiPh-9'), 128.0 (3CH de COOCH²Ph-9'), 127.3 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.8 (CH-3'), 121.2 (C-4a), 115.6 (CH-7), 112.6 (CH-5), 76.0 (C-2), 66.0 (COOCHPh-9'), 39.6 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.3 (CH²-3), 28.0 (CH²-6'), 24.0 (CH³-12'), 22.4 (CH²-4), 22.1 (CH²-2'), 20.6 (CH³-10'), 16.0 (CH³-13'), 15.7 (CH³-11'); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 472.2 (100) [MH Na]⁺ ; EIMS m/z 357 [M-CH² Ph]⁺ .

Compuesto 4a: A una suspensión de compuesto 4 (45 mg, 0.1 mmol) y K²CO³ (45 mg) en acetonitrilo (5 mL), se añadió 2-cloroacetamida ClCH²CONH² (0.1 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 9 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el compuesto 4a (25 mg, 50 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCh) 57.38-7.29 (m, 5H, COOCH²Ph-9'), 6.60 (d, J= 3.0 Hz, H-7), 6.46 (dd, J= 3.0 Hz, H-5), 5.93 (td, J= 1.3, 7.3 Hz, H-7'), 5.18 (s, 2H, COOCH² Ph-9'), 5.11 (td, J= 1.2, 7.3 Hz, H-3'), 4.41 (s, 2H, OCH²CONH²-6), 2.72 (td, J= 2.5, 6.5 Hz, 2H, CH²-4), 2.56 (ddd, J= 1.2, 7.3, 14.8 Hz, 2H, CH²-6'), 2.16 (s, 3H, CH³-13'), 2.10-2.04 (m, 4H, CH²2' y CH²-5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, CH³-IO'), 1.81-1.58 (m, 4H, CH²-3, CH²-I'), 1.55 (s, 3H, CH³- I I ') , 1.26 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³C (100 MHz, CDCI³) 5 171.8 (OCH² CONH²-6), 167.7 (COOCH² Ph-9'), 149.8 (C-6), 147.0 (C-8a), 143.5 (CH-7'), 136.2 (C-1'' de COOCH²Pfr-9'), 134.4 (C-4'), 128.4 (2CH de COOCH²Pfr-9'), 128.0 (3CH de COOCH²Pfr-9'), 126.7 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.7 (CH-3'), 121.2 (C-4a), 115.6 (CH-7), 112.0 (CH-5), 75.5 (C-2), 67.9 (OCH² CONH²-6), 65.9 (COOCH² Ph-9'), 39.6 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.2 (CH²-3), 28.0 (CH²-6'), 24.0 (CH³-12'), 22.6 (CH²-4), 22.1 (CH²-2'), 20.6 (CH³-10'), 16.2 (CH³-13'), 15.7 (CH³-H '); HREIMS m/z 505.290785 [M]⁺ (505.282824 calcd para C³¹H³⁹NO⁵).

Compuesto 4b. A una suspensión de compuesto 4 (35 mg, 0.1 mmol) y K²CO³ (35 mg) en acetona (5 mL), se añadió cloruro de bencilo ClCH² Ph (10 ^L, 0.1 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el compuesto 4b (20 mg, 40 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCh) 57.44-7.29 (m, 10H, OCH²Pfr-6, COOCH²Pfr-9'), 6.66 (d, J= 3.0 Hz, H-7), 6.54 (dd, J= 3.0 Hz, H-5), 5.94 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-7'), 5.19 (s, 2H, COOCHPh-9'), 5.12 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-3'), 4.98 (s, 2H, OCHPh-6), 2.73 (td, J= 2.8, 6.7 Hz, 2H, CH²-4), 2.56 (ddd, J= 1.2, 7.2, 15.2 Hz, 2H, CH²-6'), 2.16 (s, 3H, CH³-13'), 2.11-2.04 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, CH³-10'), 1.81-1.60 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.56 (s, 3H, CH³-11'), 1.27 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³ C (100 MHz, CDCl³) 5167.0 (COOCH² Ph-9'), 151.4 (C-6), 146.2 (C-8a), 143.5 (CH-7'), 137.6 y 136.2 (2C, C-1'' de OCH²Pfr-6, C-1''' de COOCH²P^-9'), 134.3 (C-4'), 128.5-127.5 (10CH, OCH²Pfr-6, COOCH²Pfr-9'), 127.2 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.9 (CH-3'), 120.9 (C-4a), 115.7 (CH-7), 112.2 (CH-5), 75.3 (C-2), 70.5 (OCH² Ph-6), 65.9 (COOCHPh-9'), 39.7 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.4 (CH²-3), 28.0 (CH²-6'), 24.0 (CH³-12'), 22.6 (CH²-4), 22.1 (CH²-2'), 20.6 (CH³-10'), 16.2 (CH³-13'), 15.7 (CH³-H '); EIMS m/z 538 [M]⁺ (70), 447 [M-CH² Ph]⁺ , 356 (10) [M-2 x CH² Ph]⁺ , 91 (100).

Compuesto 4c. A una suspensión de compuesto 4 (70 mg, 0.2 mmol) y K²CO³ (70 mg) en acetona (5 mL), se añadió 1-bromopropano CH³CH²CH² Br (20 ^L, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 10 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción con el grupo fenol protegido, se disolvió en 10 mL de una mezcla EtOH-KOH al 20% (v/v) y se mantuvo a reflujo durante 10 h. Posteriormente, la mezcla de reacción se acidificó con HCl 1N, se concentró a sequedad y se redisolvió en 10 mL de CH²Ch. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener 4c (34 mg, 43 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDCh) 56.58 (d, J= 2.9 Hz, H-7), 6.45 (d, J= 2.9 Hz, H-5), 6.06 (td, J= 1.3, 7.3 Hz, H-7'), 5.16 (td, J= 0.9, 6.6 Hz, H-3'), 3.83 (t, J= 6.6 Hz, 2H, OCH²CH²CH³-6), 2.72 (t, J= 6.8 Hz, 2H, CH²-4), 2.62 (dd, J= 7.5, 14.4 Hz, 2H, CH²-6'), 2.15 (s, 3H, CH³-13'), 2.11-2.05 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 1.90 (d, 3H, J= 1.5 Hz, CH³-10'), 1.79-1.72 (m, 6H, OCH² CH²CH³-6, CH²-3 y CH²-I'), 1.60 (s, 3H, CH³- I I ') , 1.26 (s, 3H, CH³-12'), 1.01 (t, J= 6.6 Hz, 3H, OCH² CH² CH³-6); RMN ¹³C (75 MHz, CDCI³) 5 173.0 (COOH-9'), 151.6 (C-6), 146.3 (C-8a), 145.9 (CH-7'), 134.2 (C-4'), 127.1 (C-8'), 126.1 (C-8), 125.1 (CH-3'), 120.9 (C-4a), 115.4 (CH-7), 111.8 (CH-5), 75.2 (C-2), 70.0 (OCH² CH²CH³-6), 39.7 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.4 (CH²-3), 28.1 (CH²-6'), 24.0 (CH³-12'), 22.7 (CH²-4), 22.6 (OCH² CH²CH³-6), 22.1 (CH²-2'), 20.5 (CH³-10'), 16.2 (CH³-13'), 15.7 (CH³-H ') , 22.6 (OCH² CH² CH³-6); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 424.2 (100) [MH Na]⁺ .

Compuesto 5. A una disolución de policerasoidol (1) (10 mg, 0.03 mmol) en metanol (5 mL) se le añadió gota a gota HCl conc (1.5 mL) a 0°C. La mezcla se agitó a reflujo 7 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF de sílica gel preparativa (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener 5 (6 mg, 54 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDCh) 56.48 (d, J= 2.9 Hz, H-7), 6.38 (d, J= 2.9 Hz, H-5), 5.94 (td, J= 1.2, 7.4 Hz, H-7'), 5.16 (td, J= 1.2, 7.4 Hz, H-3'), 3.73 (s, 3H, COOCH³-9'), 2.80-2.57 (m, 4H, CH²-4, CH²-6'), 2.35-2.00 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 2.12 (s, 3H, CH³-13'), 1.90-1.82 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.90 (d, 3H, J= 1.3 Hz, CH³-10'), 1.58 (s, 3H, CH³-11'), 1.25 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³C (75 MHz, CDCh) 5169.1 (COOCH³-9'), 147.3 (C-6), 146.0 (C-8a), 144.8 (CH-7'), 134.2 (C-4'), 127.2 (C-8'), 127.1 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121.1 (C-4a), 115.5 (CH-7), 112.5 (CH-5), 75.1 (C-2), 51.1 (COOCH³-9'), 39.5 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.3 (CH²-3), 27.9 (CH²-6'), 23.9 (CH³-12'), 22.3 (CH²-4), 22.0 (CH²-2'), 20.5 (CH³-10'), 16.0 (CH³-13'), 15.7 (CH³-11'); HREIMS m/z 372.236641 [M]⁺ (372.230060 calcd para C²³H³²O⁴).

Compuesto 6. A una suspensión de policerasoidol (1) (100 mg, 0.3 mmol) y K²CO³ (100 mg) en acetona (5 mL), se añadió cloruro de benzoilo PhCOCl (25 ^L, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 2 h. Transcurrido este tiempo se añadió metil bromoacetato BrCH²COOCH³ (20 ^L, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el compuesto 6 (55 mg, 35 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCh) 5 8.18 (dd, 2H, J= 1.5, 7.7 Hz, H-2'' y H-6'' de OCOPh-6), 7.62 (td, J= 1.5, 7.7 Hz, H-4'' de OCOPh-6), 7.50 (td, 2H, J= 1.5, 7.7 Hz, H-3'' y H-5'' de OCOPh-6), 6.80 (dd, J= 0.8, 2.8 Hz, H-7), 6.75 (dd, J= 0.8, 2.8 Hz, H-5), 6.02 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-7'), 5.17 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-3'), 4.69 (s, 2H, COOCH²COOCH³-9'), 3.77 (s, 3H, COOCH²COOCH³-9'), 2.77 (m, 2H, CH²-4), 2.61 (m, 2H, CH²-6'), 2.18 (s, 3H, CH³-13'), 2.15-2.06 (m, 4H, CH²-2', CH²-5'), 1.94 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH³-10'), 1.80-1.62 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.57 (s, 3H, CH³-H ') , 1.30 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³C (100 MHz, CDCl³) 5170.0-165.0 (3C, OCOPh-6 y COOCH² COOCH³-9'), 149.5 (C-6), 145.0 (CH-7'), 142.7 (C-8a), 134.4 (C-1'' de OCOPh-6), 134.2 (C-4'), 130.1-128.5 (5CH, de OCOPh-6), 127.4 (C-8'), 125.9 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121. 2 (CH-7), 120.9 (C-4a), 119.2 (CH-5), 75.9 (C-2), 60.4 (COOCH²COOCH³-9'), 52.2 (COOCH²COOCH³-9'), 39.8 (CH²-I'), 39.0 (CH²-5'), 31.0 (CH²-3), 28.0 (CH²-6'), 24.1 (CH³-I2 '), 22.4 (CH²-4), 22.1 (CH²-2'), 20.5 (CH³-IO'), 16.1 (CH³-13'), 15.7 (CH³- I I ') ; HREIMS m/z 534.267390 [M]⁺ (534.261754 calcd para C³²H³⁸O⁷).

Compuesto 7. A una suspensión de policerasoidin (2) (20 mg, 0.05 mmol) y K²CO³ (20 mg) en acetona (5 mL), se añadió dimetil bromomalonato BrCH(COOCH³)² (5 ^L, 0.05 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. Transcurrido este tiempo, se añadió metil bromoacetato BrCH²COOCH³ (20 ^L, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF preparative (hexano-AcOEt, 80:20) para obtener el compuesto 7 (17 mg, 67 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDC^h ) 56.56 (d, J= 2.8 Hz, H-7), 6.44 (d, J= 2.8 Hz, H-5), 6.08 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7'), 5.62 (s, COOCH(COOCH³)²-9'), 5.16 (t, J= 6.6 Hz, H-3'), 3.83 (s, 6H, COOCH(COOCH³)²-9'), 3.73 (s, 3H, COOCH³-6), 2.75­ 2.71 (m, 2H, CH²-4), 2.66-2.59 (m, 2H, CH²-6'), 2.18-2.05 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 2.15 (s, 3H, CH³-13'), 1.96 (d, 3H, J= 1.3 Hz, CH³-10'), 1.90-1.73 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.59 (s, 3H, CH³-11'), 1.26 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCl³) 5 169.0-167.2 (3C, COOCH(COOCH³)²-9'), 151.5 (C-6), 145.4 (C-8a), 144.4 (CH-7'), 133.7 (C-4'), 126.6 (C-8'), 126.1 (COOCH(COOCH³)²-9'), 125.3 (C-8), 124.4 (CH-3'), 121.0 (C-4a), 115.0 (CH-7), 111.0 (CH-5), 75.4 (C-2), 56.1 (OCH³-6), 52.1 (2C, COOCH(COOCH³)²-9'), 40.0 (CH²-1'), 39.0 (CH²-5'), 31.3 (CH²-3), 28.3 (CH²-6'), 24.1 (CH³-12'), 23.3 (CH²-4), 22.2 (CH²-2'), 20.3 (CH³-10'), 16.3 (CH³-13'), 16.0 (CH³-11'); HREIMS m/z 502.263390 [M]⁺ (502.256669 calcd para C²⁸H³⁸O⁸).

Compuesto 8. A una suspensión de policerasoidin (2) (20 mg, 0.05 mmol) y K²CO³ (20 mg) en acetona (5 mL), se añadió metil bromoacetato BrCH²COOCH³ (5 ^L, 0.05 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF de sílica gel preparativa (hexano-AcOEt, 80:20) para obtener el compuesto 8 (15 mg, 67 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDC^h ) 56.56 (d, J= 2.7 Hz, H-7), 6.44 (d, J= 2.7 Hz, H-5), 6.00 (td, J= 1.5, 7.2 Hz, H-7'), 5.15 (td, J= 1.5, 7.2 Hz, H-3'), 4.68 (s, 2H, COOCH²COOCH³-9'), 3.76 (s, 3H, COOCH² COOCH³-9'), 3.73 (s, 3H, COOCH³-6), 2.73 (t, 2H, J= 7.0 Hz, CH²-4), 2.59 (dd, 2H, J= 7.2, 14.8 Hz, CH²-6'), 2.15 (s, 3H, CH³-13'), 2.10-2.04 (m, 4H, CH²-2' y CH²-5'), 1.93 (d, 3H, J= 1.4 Hz, CH³-10'), 1.79-1.56 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.59 (s, 3H, CH³-11'), 1.26 (s, 3H, CH³-12'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCh) 5168.8 y 167.4 (2C, COOCH² COOCH³-9'), 152.5 (C-6), 146.4 (C-8a), 145.4 (CH-7'), 134.7 (C-4'), 127.6 (C-8'), 126.3 (C-8), 125.4 (CH-3'), 121.3 (C-4a), 115.2 (CH-7), 111.4 (CH-5), 75.7 (C-2), 60.8 (COOCH²COOCH³-9'), 56.0 (OCH³-6), 52.6 (COOCH²COOCH³-9'), 40.1 (CH²-1'), 39.4 (CH²-5'), 31.8 (CH²-3), 28.4 (CH²6'), 24.4 (CH³-12'), 23.1 (CH²-4), 22.6 (CH²-2'), 20.9 (CH³-IO'), 16.6 (CH³-13'), 16.1 (CH³- I I ') ; HREIMS m/z 444.252007 [M]⁺ (444.251189 calcd para C²⁶H³⁶O⁶).

1.3. Síntesis del compuesto 9:

(a) Síntesis de benzopiran-4-ona: 2,5-dihidroxiacetofenona (0.5 g, 3.28 mmol), etil levulinato (0.46 mL, 3.28 mmol) y pirrolidina (0.87 mL, 9.86 mmol), se disolvieron en EtOH absoluto (10 mL) con tamiz molecular de 3-Á (100 mg).^{56 *10} La mezcla se agitó a 45°C durante 24 h bajo atmósfera de N². Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se diluyó con CH²Cl² (100 mL) y se lavó con HCl 1N (3 x 50 mL), H²O (3 x 50 mL) y sal muera (3 x 50 mL), se secó sobre Na² SO⁴ anhidro y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 70:30) para obtener la benzopiran-4-ona (729 mg, 2.62 mmol, 80%) como un aceite amarillo. RMN ¹ H (400 MHz, CDCh) 57.34 (d, J= 3.0 Hz, H-5), 7.07 (dd, J= 8.9, 3.0 Hz, H-7), 6.80 (d, J= 8.9 Hz, H-8), 4.14 (q, J= 7.1 Hz, 2H, COOCH²CH³), 2.78 (d, J= 16.7 Hz, 1H, CH^2a-3), 2.63 (d, J= 16.7 Hz, 1H, CH^2b-3), 2.53-2.46 (m, 2H, CH²-2'), 2.1 (m, 2H, CH²-1'), 1.38 (s, 3H, CH³-4'), 1.25 (t, J= 7.1 Hz, 3H, COOCH² CH³); ^{13 *15}C NMR (100 MHz, CDCh) 5 193.0 (C-4), 173.3 (COOCH²CH³-3').

153.7 (C-8a), 150.2 (C-6), 125.2 (CH-7), 120.1 (C-4a), 119.5 (CH-8), 110.6 (CH-5), 79.8 (C-2), 60.8 (COOCH²CH³), 47.2 (CH²-3), 34.1 (CH²-1'), 28.7 (CH²-2'), 23.3 (CH³-4'), 14.1 (COOCH² CH³); EIMS m/z 278 [M: C ^H ^{i s} O ^ (35), 233 (25), 177 (100), 137 (75); HREIMS (%) m/z 278.11408 [M]⁺ (278.11542 calcd para C ¹⁵ H¹⁸O⁵).

(b) Reducción del grupo cetona: Se disolvió el benzopiran-4-ona (0.4 g, 1.44 mmol) en una mezcla de AcOH-H²O (2:1, v/v) (14 mL). Entonces, se añadió poco a poco Zn en polvo (1.69 g, 25.92 mmol) y HClconc (9 mL) durante 30 min y la mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió H²O (15 mL) a la mezcla de reacción y se filtró y el filtrado se extrajo con AcOEt (3 x 15 mL). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 85:15) para obtener el éster de benzopirano (220.3 mg, 0.834 mmol, 58%) como un aceite incoloro. RMN ¹ H (300 MHz, CDC^h ) 56.55 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.12 (q, J= 7.1 Hz, 2H, COOCH²CH³), 2.70 (m, 2H, CH²-4), 2.44 (t, J= 7.7 Hz, 2H, H-2'), 2.05-1.70 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.23 (s, 3H, CH³-2), 1.24 (t, J= 7.1 Hz, 3H, COOCH² CH³); ¹³C NMR (75 MHz, CDC^h ) 5 174.1 (COOCH² CH³-3'). 148.8 (C-6), 147.4 (C-8a), 121.6 (CH-7), 117.8 (CH-8), 115.4 (C-4a), 114.6 (CH-5), 74.6 (C-2), 60.5 (COOCH²CH³), 34.3 (CH²-3), 31.1 (CH²-1'), 28.8 (CH²-2'), 34.3 (CH²-3), 23.7 (CH³-2), 22.1 (CH²-4), 14.1 (COOCH² CH³); EIMS m/z 264 [M: C ¹⁵ H²⁰O⁴]⁺ (100), 218 (50), 163 (35), 123 (55). HREIMS (%) m/z 264.13562 [M]⁺ (264.13616 calcd para C ¹⁵ H²⁰O⁴) (100).

(c) O-protección del éster de benzopirano: Una suspensión de éster de benzopirano (0.5 g, 1.89 mmol), cloruro de p-flurobencilo pF(Ph)CH²Cl (0.3 mL, 2.46 mmol), K²CO³ anhidro (0.4 g, 2.83 mmol) en EtOH absoluto (20 mL) se agitó a 65°C bajo atmósfera de N² durante 4 h. La mezcla de reacción se evaporó en el rotavapor, se añadió H²O (3 x 20 mL) y se extrajo con CH²Cl² (3 x 15 mL). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con HCl 1M (2 x 15 mL) y salmuera (2 x 15 mL), deshidrataron con Na²SO⁴ anhidro y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el éster de benzopirano O-protegido (556 mg, 1.49 mmol, 79%) como un aceite incoloro. RMN ¹ H (300 MHz, CDC^h ) 57.39 (m, 2H, H-2'', H-6''), 7.05 (m, 2H, H-3'', H-5''), 6.70 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.94 (s, 2H, p-F-PhCH² O), 4.13 (q, J= 7.1 Hz, 2H, CO² CH²CH³), 2.76 (t, 2H, J= 6.7 Hz, CH²-4), 2.48 (t, J= 7.7 Hz, 2H, CH²-2'), 1.91 (m, 4H, CH²-3, CH²-1'), 1.24 (t, J= 7.2 Hz, 3H, CO²CH² CH³-3'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDC^h ) 5 173.6 (COOCH²CH³-3'), 162.3 (d, J^{c f} =243.7 Hz, C-4''), 152.0 (C-6), 147.9 (C-8a), 133.1 (d, J^{c f} = 3 Hz, C-1''), 129.1 (d, 2C, J^{c f} = 8.3 Hz, C-2'', C-6''), 121.4 (C-4a), 117.7 (CH-5), 115.2 (d, 2C, J^{c f} = 24.8 Hz, CH-3'', CH-5''), 115.1 y 114.4 (CH-7 y CH-8), 74.6 (C-2), 69.9 (p-F-PhCH²O), 60.3 (CO² CH²CH³), 34.3 (CH²-1'), 31.0 (CH²-3), 28.7 (CH²-2'), 23.6 (CH³-2), 22.2 (CH²-4), 14.1 (CO²CH² CH³); HREIMS m/z (%) 372.1730 [M]⁺ (372.173688 calcd para C²² H²⁵O⁴F) (83).

(d) Reducción del éster de benzopirano O-protegido Una disolución de éster de benzopirano O-protegido (0.2 g, 0.54 mmol) en CH2CI2 anhidro (6 mL) a -78°C bajo atmósfera de N2 se agitó durante 15 min. A esta disolución se le añadió gota a gota una disolución de hidruro de diisobutilaluminio (DIBAL-H) 1M en THF (2.47 mL, 2.47 mmol). Transcurridos 20 min, se detuvo la reacción mediante adición de MeOH (1 mL) y se agitó durante 15 min, y entonces se añadió una disolución acuosa saturada de NH4Cl (1 mL). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, se filtró y el filtrado se extrajo con AcOEt (3 x 15 mL). Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (hexano-AcOEt, 90:10) para obtener el aldehído (128 mg, 0.34 mmol, 63%) como un aceite incoloro. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) 59.78 (t, J= 1.6 Hz, 1H, CHO), 7.39 (m, 2H, H-2'' y H-6''), 7.06 (m, 2H, H-3'' y H-5''), 6.73 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.94 (s, 2H, OCHgPh-p-F), 2.75 (m, 2H, CH2-4), 2.60 (m, 2H, CH2-2'), 1.90 (m, 4H, CH2-3, CH2-1'), 1.30 (s, 3H, CH3-2); RMN 13C (75 MHz, CDCh) 5202 (CHO), 162.4 (d, J^{c f}=244.4 Hz, C-4''), 152.1 (C-6), 147.7 (C-8a), 133.1 (d, J^{c f}= 3.3 Hz, C-1''), 129.3 and 129.2 (d, 2C, J^{c f}= 8.3 Hz, C-2'', C-6''), 121.4 (C-4a), 117.7 (CH-5), 115.2 (d, 2C, J^{c f}= 24.8 Hz, CH-3'', CH-5''), 115.2 y 114.5 (CH-7 y CH-8), 74.6 (C-2), 69.9 (OCH2Ph-p-F), 38.4 (CH2-2'), 31.8 (CH2-1'), 31.2 (CH2-3), 23.7 (CH3-2), 22.3(CH2-4); HREIMS m/z (%) 329.1552 [M]+ (329.1547 calcd para C20H21O3F), 343.1710 (343.1704 calcd para C21H23O3F).

(e) Reacción de Grignard y transposición de Johnson-Claisen: Una disolución del intermedio aldehído (0.2 g, 0.61 mmol) en THF anhidro (5 mL) se agitó a -78°C bajo atmósfera de N2 durante 15 min, y entonces se trató con una solución de bromuro de isopropenilmagnesio 0.5 M (7.32 mL, 3.66 mmol) (Sen et al., 1990).7 La mezcla se agitó a -78°C durante 3 h. La mezcla de reacción se trató con una solución de NH4Cl saturada y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadió H2O y se extrajo con con AcOEt (3 x 15 mL). Se combinaron las fases orgánicas y la fase orgánica resultante se lavó con H2O (3 x 15 mL) y sal muera (3 x 15 mL), se deshidrató con Na2SO4 anhidro y se concentró en el rotavapor.

El residuo obtenido (250 mg) se utilizó en la siguiente reacción sin purificar. El residuo se trató con 10 mL de trietil ortoacetato y cantidades catalíticas de ácido isobutírico (3 gotas) (Sen et al., 1990).7 La mezcla se agitó a 140°C durante 2 h. Después de enfriar, la mezcla se concentró en el rotavapor para eliminar el exceso de trietilortoacetato. El residuo se diluyó con CH2Cl2 (20 mL) y se lavó con H2O (3 x 15 mL), se deshidrató con Na2SO4 anhidro y se concentró en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano/ AcOEt, 98:2) para obtener 126 mg de compuesto 9 (0.29 mmol, 47 %). RMN 1H (500 MHz, CDCh) 5 7.39 (m, 2H, H-2'' y H-6''), 7.06 (m, 2H, H-3'' y H-5''), 6.73 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 5.14 (t, J= 7.0 Hz, 1H, CH-3'), 4.94 (s, 2H, OCH^{^}Ph-p-F), 4.11 (q, J= 7.4 Hz, 2H, COOCH² CH³), 2.72 (t, J= 6.8, 2H, CH²-4), 2.39 (m, 2H, CH²-6'), 2.28 (m, 2H, CH²-5'), 2.08 (m, 2H, CH²-2'), 1.82 (m, 2H, CH²-3), 1.67 (m, 6H, CH²-1'), 1.60 (s, 3H, CH³-4'), 1.27 (s, 3H, CH³-2), 1.23 (t, J= 7.3 Hz, 3H, COOCH² CH³); RMN ¹³ C (125 MHz, CDCI³) 5 173.4 (CO), 162.4 (d, J^{c f} =245 Hz, C-4''), 151.9 (C-6), 148.2 (C-8a), 133.5 (C-4'), 133.3 (d, J^{c f} = 3 Hz, C-1''), 129.2 (d, 2C, J^{c f} = 8.3 Hz, C-2'', C-6''), 124.9 (C-3'), 121.7 (C-4a), 117.8 (CH-5), 115.3 (d, 2C, J^{c f} = 24.8 Hz, CH-3'', CH-5''), 115.2 y 114.4 (CH-7 y CH-8), 75.6 (C-2), 70.1 (OCH² Ph-p-F), 60.2 (COOCH² CH³), 39.2 (CH²-1'), 34.6 (CH²-6'), 33.2 (CH²-5'), 30.9 (CH²-3), 24.1 (CH³-2), 22.4 (CH²-4), 22.2 (CH²-2'), 15.8 (CH³-4'), 14.2 (COOCH² CH³); HREIMS m/z (%) 441.2441 [M]⁺ (441.2436 calcd para C²⁷ H³³FO⁴).

1.4. Síntesis de los compuestos 10 a 12:

Se procede a realizar los pasos (a), (b), (c), (d) y (e) tal como se describen en la sección 1.3 para el compuesto 9, si bien, la O-protección del éster de benzopirano se realiza en el caso de los compuestos 10 y 11 con cloruro de bencilo (R¹ = bencilo) y en el caso del compuesto 12 con cloruro de p-flurobencilo (R ¹ = p-FluoroBn).

Una vez realizado el paso (e), se vuelve a realizar una reducción del grupo éster, obtenido mediante transposición de Johnson-Claisen, para volver a obtener un aldehido, de acuerdo con las condiciones descritas en el paso (d) de la sección 1.3.

Los compuestos 10 y 12 se obtienen mediante olefinación del aldehido obtenido llevando a cabo la reacción de Wittig con un iluro de fósforo (Ph)³ P=C(CH²CH³)(COOCH²CH³) o la reacción de Horner-Wadsworth-Emmons con un fosfonato (EtO)² P(O)-CH(CH²CH³)(COOCH² CH³). El compuesto 11 se obtiene por hidrólisis del grupo éster, mediante tratamiento con KOH a reflujo del compuesto 10.

tul evu mato □enzo iran-4-ona

1.5. Síntesis del compuesto 13:

S e p r o c e d e a r e a l i z a r l o s p a s o s ( a ) , ( b ) , ( c ) y ( d ) t a l c o m o s e d e s c r i b e n e n l a s e c c i ó n 1.3 , e n d o n d e l a O - p r o t e c c i ó n d e l é s t e r d e b e n z o p i r a n o s e r e a l i z a c o n c l o r u r o d e b e n c i l o . E l a l d e h í d o o b t e n i d o t r a s e l p a s o ( d ) s e s o m e t e a o l e f i n a c i ó n l l e v a n d o a c a b o l a r e a c c i ó n d e W it t i g c o n u n i l u r o d e f ó s f o r o ( P h ) 3 P = C ( C H 2 C F 3) ( C O O C H 2 C H 3) o l a r e a c c i ó n d e H o r n e r - W a d s w o r t h -E m m o n s c o n u n f o s f o n a t o ( E t O ) 2 P ( O ) - C H ( C H 2 C F 3 ) ( C O O C H 2 C H 3 ) .

Eti evu inato □enzciniran-4-ona

donde

f) W ittig g ) Hüfner-Wadswüftti-Emmona

Estudios in vitro

Ejemplo 2: Evaluación de la transactivación hPPARa y hPPARy

^{L o s c o m p u e s t o s n a t u r a l e s} 1 ^y 2 ^{, l o s c o m p u e s t o s} 3-8 ^{y e l c o m p u e s t o (} 9 ^{) , s e e s t u d i a r o n} in vitro m e d i a n t e e n s a y o s d e t r a n s a c t i v a c i ó n P P A R a / Y . S e u t i l i z ó u n e n s a y o d e t r a n s c r i p c i ó n e n c é l u l a s C o s - 7 t r a n s i t o r i a m e n t e t r a n s f e c t a d a s c o n u n p l á s m i d o r e p o r t e r o d e l u c i f e r a s a e n ^{p r e s e n c i a d e v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n p G A L 4 h P P A R a y p G A L 4 h P P A R Y ( C a r m o n a} et al., ^{2 0 0 7 ) .} L a s c é l u l a s C o s - 7 s e o b t u v i e r o n d e l a A T C C ( C R L - 16 5 1 ) . L a s c é l u l a s s e m a n t u v i e r o n b a j o c o n d i c i o n e s d e c u l t i v o e s t á n d a r ( m e d i o e s e n c i a l m í n i m o d e E a g l e m o d i f i c a d o p o r D u l b e c c o , D M E M , p o r s u s s i g l a s e n i n g l é s ) s u p l e m e n t a d o c o n 1 0 % d e s u e r o f e t a l b o v i n o ( F C S ) a 3 7 ° C e n u n a a t m ó s f e r a d e h u m e d a d a l 5 % C O 2. E l m e d i o s e c a m b i a b a c a d a 2 d í a s . L a s c é l u l a s C o s - 7 s e s e m b r a r o n e n d i s c o s d e 60 m m a u n a d e n s i d a d d e 5 , 5 x 10 5 c é l u l a s / d i s c o e n D M E M s u p l e m e n t a d o c o n 1 0 % d e F C S e i n c u b a d o a 3 7 ° C d u r a n t e 16 h a n t e s d e l a t r a n s f e c c i ó n . L a s c é l u l a s f u e r o n t r a n s f e c t a d a s e n D M E M , u s a n d o j e t P E I , c o n r e p o r t a d o r ( p G 5 - T K - p G L 3 ) y p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n ( p G a l 4 - h , h P P A R a o h P P A R Y ) . E l p l á s m i d o d e e x p r e s i ó n p C M V - p -g a l a c t o s i d a s a s e c o - t r a n s f e c t ó c o m o c o n t r o l p a r a l a e f i c i e n c i a d e l a t r a n s f e c c i ó n . D e s p u é s d e 16 h se detuvo la transfección adicionando DMEM suplementado con 10% FCS, y las células se tripsinizaron y sembraron en placas de 96-pocillos e incubaron durante 6 h en DMEM conteniendo 10% FCS. Posteriormente, las células se incubaron durante 24 h en DMEM conteniendo 0,2% FCS y se ensayaron concentraciones crecientes de los compuestos o del vehículo (DMSO, concentración máxima 0,1%). Finalmente, las células se lavaron una vez con PBS enfriado sobre hielo, se lisaron y se realizaron los ensayos de luciferasa y pgalactosidasa.

Para evaluar los compuestos sobre la actividad transcripcional PPAR, los ensayos se llevaron a cabo en una quimera de un sistema de gen reportero de luciferasa PPAR/Gal4 humano para determinar la respuesta de transactivación máxima de cada compuesto. Los distintos compuestos se ensayaron en un rango de concentraciones de 0,001 a 10 ^M. Los resultados obtenidos de todos los compuestos se compararon con los datos de los compuestos de referencia WY-14643 y rosiglitazona en hPPARa y hPPARY, respectivamente.

Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1 hPPARa hPPARY

Compuesto CE ⁵⁰ (nM) Eficacia (%) CE ⁵⁰ (nM) Eficacia (%)

Rosiglitazona 10000 15 4 100

WY-14643 10000 100 NA NA

Policerasoidol, 1 184 107 84 95

Policerasoidin, 2 1000 82 1000 55

3 10000 100 991 86

4a 10000 18 10000 0

4b 10000 28 10000 0

4c salt 10000 191 1692 88

5 10000 27 574 35

6 10000 14 10000 0

7 1616 76 10000 37

8 10000 39 12 24

9 300 251 400 57

10 10000 60 2000 183

11 1500 96 300 62

12 10000 113 2000 183

13 10000 166 400 39

(a) Máxima actividad obtenida con cada compuesto expresada como porcentaje de actividad máxima de WY-14643 para PPARa (CE5012 ^M) y rosiglitazona para PPARy (CE504 nM) respectivamente. (NA: no activo sobre el hPPAR ensayado).

De entre todos los compuestos ensayados, el producto natural policerasoidol (1) mostró la mayor actividad agonista dual PPARa/Y y su respuesta máxima resultó comparable a la obtenida por los compuestos de referencia (WY-14643 y rosiglitazona). Los datos de CE⁵⁰ mostraron que el compuesto natural 1, y su derivado semisintético 3, con el grupo fenólico libre, presentan actividad agonista total sobre hPPARa y hPPARY, y elevados porcentajes de transactivación (107-100% y 95-86% para hPPARa y hPPARY, respectivamente). El compuesto 4c, el derivado O-propilado con una función carboxílica libre en C-9’, mostraba el máximo porcentaje de transactivación (191% y 88% para hPPARa y hPPARY, respectivamente). Los otros derivados de policerasoidol (4a, 4b y 5) mostraron porcentajes de transactivación más bajos que los compuestos 1, 3 y 4c a las concentraciones ensayadas. Las modificaciones sobre el grupo carboxílico en C-9’ de la cadena lateral en posición 2, introduciendo el grupo COOCH(COOCH³)² daba lugar al compuesto 7 con selectividad sobre la activación PPARa (76% para hPPARa y 37% para hPPARY). Sin embargo, el derivado 8, con un grupo COOCH²COOCH³ en C-9’, mostró una menor activación PPARa (39% para hPPARa y 24% para hPPARY). El compuesto 9 también mostró una actividad agonista dual y un porcentaje de transactivación elevado (251% para hPPARa y 57% para hPPARY, respectivamente).

Los compuestos 10, 11, 12 y 13 también mostraron actividad agonista dual PPARa y PPAR^y , destacando la potencia del compuesto 11, con porcentajes de transactivación del 96% y 62% para hPPARa y hPPARY respectivamente.

Cabe destacar que el compuesto 1 (natural) y 9 (sintético) mostraron una potente acción agonista dual de los receptores PPARa y PPAR^y . El compuesto 2 presentó una actividad dual PPARa/Y moderada y el compuesto 8 desplazaba su selectividad hacia la activación de PPARy (Tabla 1).

Ejemplo 3: Estudios de citotoxicidad en neutrófilos humanos y células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC)

Anteriormente se ha mencionado que existen importantes limitaciones en la utilización de agonistas PPAR para su uso en humanos, debido a sus efectos adversos como hepatotoxicidad, cáncer, cardiotoxicidad u otros efectos cardiovasculares. Los glitazares son los compuestos más estudiados con actividad agonista PPARy , sin embargo, como hemos mencionado en la introducción, únicamente está aprobado el uso de los agonistas duales s a r o g l i t a z a r ( L i p a g l y n ™ ) e n l a I n d i a d e s d e 2 0 13 y l o b e g l i t a z o n a e n C o r e a ( D u v i e TM) c o n e f e c t o s a n t i d i a b é t i c o s e h i p o l i p e m i a n t e s . E n l a a c t u a l i d a d , e x i s t e u n m a y o r i n t e r é s e n d e s a r r o l l a r a g o n i s t a s d u a l e s P P A R a y P P A R ^y q u e m u e s t r e n m e n o s e f e c t o s a d v e r s o s q u e l o s ^{l i g a n d o s s e l e c t i v o s a o y ( T a n} et al., ^{2 0 1 7 ) .}

C o n l a f i n a l i d a d d e e v a l u a r l o s p o s i b l e s e f e c t o s a d v e r s o s ( c i t o t o x i c i d a d ) d e l o s c o m p u e s t o s d e ^{l a i n v e n c i ó n , l o s c o m p u e s t o s} 1 ^, 2 ^y 8 ^{a s í c o m o l o s c o m p u e s t o s d e r e f e r e n c i a , s e e v a l u a r o n a c o n c e n t r a c i o n e s d e 3 0 y 10 0 j M e n n e u t r ó f i l o s h u m a n o s (} Fig. 1A ^{) y c u l t i v o s c e l u l a r e s p r i m a r i o s d e c é l u l a s e n d o t e l i a l e s d e v e n a s d e c o r d ó n u m b i l i c a l h u m a n o ( H U V E C ) (} Fig. 1B ⁾ m e d i a n t e d o s t é c n i c a s d i s t i n t a s : e l e n s a y o d e c o l o r i m e t r í a d e M T T y e l a n á l i s i s d e c i t o m e t r í a ^{d e f l u j o d e a p o p t o s i s c e l u l a r y s u p e r v i v e n c i a . A d e m á s , e l c o m p u e s t o s i n t e t i z a d o} 9 ^{s e e v a l u ó a 10 , 3 0 y 10 0 |j M (} Fig. 2 ^).

E n s a y o d e M T T . L a v i a b i l i d a d d e n e u t r ó f i l o s y H U V E C s e d e t e r m i n ó m e d i a n t e e l e n s a y o d e c o l o r i m e t r í a d e M T T ( b r o m u r o d e 3 ( 4 , 5 - d i m e t i l t i a z o l - 2 - i l ) - 2 , 5 - d i f e n i l t e t r a z o l i o ) .

^{S e o b t u v i e r o n n e u t r ó f i l o s a p a r t i r d e l a f r a c c i ó n l e u c o p l a q u e t a r i a} (buffy coats) ^{d e d o n a n t e s} s a n o s m e d i a n t e c e n t r i f u g a c i ó n c o n g r a d i e n t e d e d e n s i d a d d e F i c o l l - H y p a q u e .

L a s c é l u l a s e n d o t e l i a l e s d e v e n a s d e c o r d ó n u m b i l i c a l h u m a n o ( H U V E C ) s e a i s l a r o n m e d i a n t e e l t r a t a m i e n t o d e c o l a g e n a s a y m a n t e n i d a s e n m e d i o b a s a l e n d o t e l i a l e s p e c í f i c o h u m a n o ( E B M - 2 ) s u p l e m e n t a d o c o n m e d i o d e c r e c i m i e n t o e n d o t e l i a l ( E G M - 2 ) y 1 0 % F C S . S e c u l t i v a r o n c é l u l a s d e p a s e 1 h a s t a c o n f l u e n c i a e n p l a c a s d e 24 - p o c i l l o s . A n t e s d e i n i c i a r c a d a e x p e r i m e n t o , l a s c é l u l a s s e i n c u b a r o n 24 h e n m e d i o c o n t e n i e n d o 1 % F B S .

S e a ñ a d i e r o n 10 0 ^ L d e n e u t r ó f i l o s y l a s u s p e n s i ó n d e H U V E C e n m e d i o R P M I s u p l e m e n t a d o ( 2 x 10 5 c é l u l a s / m L ) a c a d a p o c i l l o d e u n a p l a c a d e 96 - p o c i l l o s . L a s c é l u l a s s e i n c u b a r o n e n a u s e n c i a y / o p r e s e n c i a d e l o s c o m p u e s t o s a 3 7 ° C d u r a n t e 24 h . S e p r e p a r ó u n a d i s o l u c i ó n d e M T T ( 2 m g / m L e n P B S ) . S e a ñ a d i e r o n 10 0 j L d e l a d i s o l u c i ó n d e M T T a c a d a p o c i l l o y s e i n c u b ó a 3 7 ° C d u r a n t e o t r a s 3 h . L o s s o b r e n a d a n t e s s e d e s c a r t a r o n y s e a ñ a d i e r o n 20 0 ^j L d e D M S O a c a d a p o c i l l o p a r a d i s o l v e r e l p r e c i p i t a d o d e f o r m a z á n . S e m i d i e r o n l a s d e n s i d a d e s ó p t i c a s a d o s l o n g i t u d e s d e o n d a ( 560 y 6 30 n m ) e n u n e s p e c t r o f o t ó m e t r o ( I n f i n i t e M 200 , T e c a n , M a n n e d o r f , S u i z a ) .

T o d o s l o s c o m p u e s t o s m o s t r a r o n u n a c i t o t o x i c i d a d s i g n i f i c a t i v a a 100 j M s o b r e a m b o s t i p o s ^{d e c é l u l a s (} Figuras 1 y 2 ^{) . P o l i c e r a s o i d i n (} 2 ^{) y e l d e r i v a d o} 8 ^{t a m b i é n p r e s e n t a r o n t o x i c i d a d a} 3 0 j M e n n e u t r ó f i l o s y H U V E C , y W Y - 14 6 4 3 p r o d u j o c i t o t o x i c i d a d a 30 j M ( 9 % ) p e r o s o l o e n ^{n e u t r ó f i l o s h u m a n o s (} Fig. 1 ^{) . E l c o m p u e s t o s i n t e t i z a d o} 9 ^{, m o s t r ó ú n i c a m e n t e c i t o t o x i c i d a d e n H U V E C a 3 0 j M (} Fig. 2 ^{) p e r o d e l 1 2 % r e s p e c t o a l v e h í c u l o .}

A d e m á s , l a t a s a d e a p o p t o s i s y s u p e r v i v e n c i a e n n e u t r ó f i l o s h u m a n o s y H U V E C s e d e t e r m i n ó m e d i a n t e d o b l e t i n c i ó n c o n a n e x i n a V y y o d u r o d e p r o p i d i o ( P I ) m e d i a n t e c i t o m e t r í a d e f l u jo .

A n á l i s i s d e c i t o f l u o r o m e t r í a d e a p o p t o s i s y s u p e r v i v e n c i a . S e u t i l i z ó e l k it F I T C A n n e x i n V A p o p t o s i s D e t e c c i ó n ( B D B i o s c i e n c e , S a n J o s e , C A ) . E l p r o t o c o l o d e t i n c i ó n y t o d o s l o s r e a c t i v o s s e s u m i n i s t r a r o n e n e l k it c o m e r c i a l . L a s H U V E C s e s e p a r a r o n d e l o s f r a s c o s d e

l

f a b r i c a n t e . L a s c é l u l a s s e a n a l i z a r o n e n u n c i t ó m e t r o d e f l u j o B D F A C S V e r s e F l o w C y t o m e t e r ( B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) y s e d i f e r e n c i a r o n c o m o c é l u l a s d e a p o p t o s i s t e m p r a n a ( a n e x i n a V y P I -) , a p o p t o s i s t a r d í a y / o n e c r ó t i c a ( a n e x i n a V y P I ) , y c é l u l a s v i v a s ( a n e x i n a V - y P I -) .

^{E n n e u t r ó f i l o s , s o l o e l c o m p u e s t o} 8 ^{y r o s i g l i t a z o n a a l a d o s i s d e 10 0 ^ M c a u s ó u n e f e c t o m í n i m o e n l a s u p e r v i v e n c i a c e l u l a r ( 5 , 3 % y 8 , 5 % r e s p e c t i v a m e n t e ) (} Figura 3B) ^{. E l c o m p u e s t o d e s í n t e s i s} 9 ^{t a m b i é n p r o v o c ó u n e f e c t o m í n i m o e n l a s u p e r v i v e n c i a d e n e u t r ó f i l o s a l a s d o s i s d e 3 0 y 10 0 ^ M ( 1 , 0 7 % y 1 , 5 5 % , r e s p e c t i v a m e n t e ) , e n c o m p a r a c i ó n c o n e l v e h í c u l o (} Figura 4B ^{) . P o r e l c o n t r a r i o , t o d o s l o s c o m p u e s t o s a u m e n t a r o n l a a p o p t o s i s d e f o r m a s i g n i f i c a t i v a y} d i s m i n u y e r o n l a s u p e r v i v e n c i a a p a r t i r d e 30 ^ M e n c é l u l a s H U V E C , c o n e x c e p c i ó n d e ^{p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) (} Figura 3C ^y D ^{) y e l c o m p u e s t o} 9 (Figura 4C ^y D ^{) . E n H U V E C , l o s c o m p u e s t o s m á s t ó x i c o s f u e r o n p o l i c e r a s o i d i n (} 2 ^{) , s u a n á l o g o} 8 ^{y r o s i g l i t a z o n a , q u e} d i s m i n u y e r o n l a s u p e r v i v e n c i a c e l u l a r u n 38 , 9 , 6 1 , 3 y 7 9 , 2 % , r e s p e c t i v a m e n t e , a 10 0 ^ M y ^{e j e r c i e r o n a l g u n o s e f e c t o s s i g n i f i c a t i v o s a 3 0 ^ M (} Figura 3C ^y D ^{) . C a b e d e s t a c a r l a a u s e n c i a d e t o x i c i d a d d e l c o m p u e s t o} 9 ^{e n H U V E C a l a s d o s i s e n s a y a d a s , i n c l u i d a a 10 0 ^ M , e n c o m p a r a c i ó n c o n e l v e h í c u l o (} Figura 4 C ^y D ^{) .}

E n l a i n t r o d u c c i ó n h e m o s m e n c i o n a d o e l u s o l i m i t a d o e n h u m a n o s d e n u m e r o s o s a g o n i s t a s P P A R a y P P A R y d e b i d o a p r o b l e m a s d e t o x i c i d a d q u e c o n l l e v a a i m p o r t a n t e s e f e c t o s a d v e r s o s . D e h e c h o , a p e s a r d e q u e r o s i g l i t a z o n a e j e r c e n u m e r o s o s e f e c t o s b e n e f i c i o s o s e n p a c i e n t e s c o n d i a b e t e s t i p o 2 , l a s e v i d e n c i a s d e s u s e f e c t o s a d v e r s o s c a r d i o v a s c u l a r e s q u e i n c l u y e n a u m e n t o d e l r i e s g o d e i n f a r t o d e m i o c a r d i o e i n s u f i c i e n c i a c a r d i a c a , h a o b l i g a d o la ^{r e t i r a d a d e l f á r m a c o e n n u m e r o s o s p a í s e s d e l a C o m u n i d a d E u r o p e a ( P a l e e} et al., ^{2 0 1 1 ) . A s í} p u e s , l o s e s t u d i o s d e t o x i c i d a d s o n i m p o r t a n t e s e n e s t e t ip o d e c o m p u e s t o s y m e d i a n t e l o s ^{e n s a y o s d e M T T y c i t o m e t r í a d e f l u j o h e m o s d e m o s t r a d o q u e l o s c o m p u e s t o s} 1 ^y 9 ^{s o n m e n o s} c i t o t ó x i c o s q u e l o s a g o n i s t a s e s p e c í f i c o s d e r e f e r e n c i a p a r a P P A R a y P P A R y .

Ejemplo 4: Efecto de los compuestos 1, 2, 8 y 9 sobre la interacción leucocito-endotelio inducida por TNFa bajo condiciones de flujo

E l e n d o t e l i o q u e r e c u b r e i n t e r n a m e n t e l o s v a s o s s a n g u í n e o s p r e s e n t a d i v e r s a s f u n c i o n e s , c u y a s a l t e r a c i o n e s ( “d i s f u n c i ó n e n d o t e l i a l ”) s e h a n v i s t o r e l a c i o n a d a s c o n e n f e r m e d a d e s c a r d i o v a s c u l a r e s , t r o m b o e m b o l i s m o y a t e r o s c l e r o s i s . D e h e c h o , l a d i s f u n c i ó n e n d o t e l i a l e s u n a d e l a s p r i m e r a s m a n i f e s t a c i o n e s d e l i n i c i o d e a t e r o s c l e r o s i s q u e c o n l l e v a a u n f e n o t ip o p r o i n f l a m a t o r i o y p r o t r o m b ó t ic o d e l e n d o t e l i o , p r o v o c a n d o l a l i b e r a c i ó n y m i g r a c i ó n d e l e u c o c i t o s a l e s p a c i o s u b e n d o t e l i a l . L o s P P A R , e n p a r t i c u l a r P P A R a r y P P A R ^y , s e e x p r e s a n e n l a m a y o r í a d e l a s c é l u l a s v a s c u l a r e s , i n c l u y e n d o e n d o t e l i a l e s y c é l u l a s d e l m ú s c u l o l i s o , ^{d o n d e p a r t i c i p a n e n e f e c t o s a n t i i n f l a m a t o r i o s e s p e c í f i c o s y e l c o n t r o l l í p i d i c o ( R o s e n s o n} et al., ^{2 0 1 2 ) . 12 L o s a g o n i s t a s P P A R} y ^{( r o s i g l i t a z o n a ) s o n c a p a c e s d e i n h i b i r e l p r o c e s o i n f l a m a t o r i o , d i s m i n u y e n d o l a a c u m u l a c i ó n d e n e u t r ó f i l o s y c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s ( P a l e e} et al., ^{2 0 1 1 ) .}

S e u t i l i z ó l a t é c n i c a d e c á m a r a d e f l u j o p a r a l e l o q u e p e r m i t e v i s u a l i z a r l a a d h e s i ó n c e l u l a r b a j o c o n d i c i o n e s d i n á m i c a s d e f l u j o f i s i o l ó g i c o .

E n l a r e a l i z a c i ó n d e e s t e e s t u d i o , l o s n e u t r ó f i l o s y l a s c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s s e p e r f u n d i e r o n a t r a v é s d e m o n o c a p a s d e H U V E C p r e v i a m e n t e e s t i m u l a d a s o n o c o n T N F a ( 20 n g / m L ) d u r a n t e 24 h . P a r a e l l o , l o s n e u t r ó f i l o s y c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s h u m a n a s s e o b t u v i e r o n e n s u s p e n s i ó n d e v o l u n t a r i o s s a n o s m e d i a n t e e l m é t o d o F i c o l l - H y p a q u e d e c e n t r i f u g a c i ó n p o r g r a d i e n t e d e d e n s i d a d . L a s c é l u l a s r e c i é n a i s l a d a s ( 1 x 10 6/ m L ) s e p e r f u n d i e r o n a t r a v é s d e l a m o n o c a p a d e c é l u l a s e n d o t e l i a l e s ( H U V E C ) e s t i m u l a d a s o n o , c o n T N F a d u r a n t e 24 h . E n t o d o s l o s e x p e r i m e n t o s , s e d e t e r m i n a r o n l a s i n t e r a c c i o n e s d e l o s l e u c o c i t o s d e s p u é s d e p e r f u n d i r d u r a n t e 5 m i n a 0 , 5 d i n a s / c m 2. L a s p l a c a s d e H U V E C s e c o l o c a r o n e n l a c á m a r a d e f l u j o ( G l y c o T e c h , G a i t h e r s b u r g , M D ) y s e a c o p l ó u n a c á m a r a c o l o c a d a s o b r e u n m i c r o s c o p i o i n v e r t i d o d e c o n t r a s t e d e f a s e s ( A x i o O b s e r v e r A 1 C a r l Z e i s s m i c r o s c o p e , T h o r n w o o d , N Y ) p a r a v i s u a l i z a r l a a d h e s i ó n c e l u l a r ( o b j e t i v o 20 x y u n o c u l a r 10 x ) . A d e m á s , l a s i m á g e n e s s e g r a b a r o n e n v í d e o p a r a s u p o s t e r i o r a n á l i s i s .

^{L a s H U V E C s e p r e t r a t a r o n c o n p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) , p o l i c e r a s o i d i n (} 2 ^{) , e l c o m p u e s t o (} 8 ^{) , o e l c o m p u e s t o} 9 ^{a d o s i s d e 1 , 3 , 10 , 3 0 y 10 0 ^ M , a s í c o m o W Y - 1 4 6 4 3 o r o s i g l i t a z o n a a 1 ^ M , 2 0 h o r a s a n t e s d e l a e s t i m u l a c i ó n c o n T N F a ( S a n z} et al., ^{2 0 1 2 ) .}

E l T N F a p r o v o c ó u n a u m e n t o s i g n i f i c a t i v o e n l a a d h e s i ó n a l a s c é l u l a s e n d o t e l i a l e s d e ^{l e u c o c i t o s m o n o n u c l e a r e s y n e u t r ó f i l o s (} Figuras 5 y 6 ^{) . N i n g u n o d e l o s c o m p u e s t o s i n h i b i ó} s i g n i f i c a t i v a m e n t e l a s i n t e r a c c i o n e s H U V E C - n e u t r ó f i l o s a l a c o n c e n t r a c i ó n d e 1 ^ M , s i n ^{e m b a r g o , c a b e d e s t a c a r q u e e l p r e t r a t a m i e n t o c o n p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) , e l a n á l o g o s i n t e t i z a d o} 9 y r o s i g l i t a z o n a d i s m i n u y e r o n s i g n i f i c a t i v a m e n t e l a a d h e s i ó n H U V E C - c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s ⁽ Figuras 5 y 6 ^{) d e f o r m a c o n c e n t r a c i ó n - d e p e n d i e n t e (} Figuras 5C y 6B ^{) . E n e s t e e n s a y o , p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) f u e 5 v e c e s m e n o s p o t e n t e q u e r o s i g l i t a z o n a , m i e n t r a s q u e e l c o m p u e s t o} 9 m o s t r ó u n a p o t e n c i a d e a p r o x i m a d a m e n t e 3 , 6 y 16 v e c e s m a y o r q u e r o s i g l i t a z o n a y ^{p o l i c e r a s o i d o l , r e s p e c t i v a m e n t e ( v a l o r e s C I 50 d e 0 , 3 0 ^ M} vs. ^{1 , 1 ^ M y 4 , 9 ^ M ,} r e s p e c t i v a m e n t e ) . T e n i e n d o e n c u e n t a e s t o s r e s u l t a d o s y l o s e s t u d i o s d e c i t o t o x i c i d a d s o b r e ^{a p o p t o s i s y s u p e r v i v e n c i a e n n e u t r ó f i l o s , p o d e m o s d e c i r q u e p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) y e l c o m p u e s t o s i n t e t i z a d o} 9 ^{, p o d r í a n a c t u a r i n h i b i e n d o e l r e c l u t a m i e n t o d e c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s s i n} c o m p r o m e t e r l a r e s p u e s t a i n m u n i t a r i a d e n e u t r ó f i l o s , n e c e s a r i a p a r a l a d e f e n s a d e l h u é s p e d . P o r lo t a n t o , p a r e c e q u e a m b o s c o m p u e s t o s s o n c a n d i d a t o s i n t e r e s a n t e s p a r a u n a e v a l u a c i ó n i n m u n o - f a r m a c o l ó g i c a a d i c i o n a l , d e b i d o a l a c a p a c i d a d d e e s t o s c o m p u e s t o s p a r a r e d u c i r e l r e c l u t a m i e n t o d e c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s , l a p o t e n c i a c o m o a g o n i s t a s d u a l e s d e P P A R a / Y y la b a j a c i t o t o x i c i d a d .

Ejemplo 5: Policerasoidol (1) y el compuesto 9 inhibieron la adhesión celular mononuclear al endotelio, inducida por TNFa vía interacción RXRq/PPARv

^{P o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) y e l c o m p u e s t o s i n t e t i z a d o} 9 ^{s o n l i g a n d o s a g o n i s t a s d u a l e s P P A R a / Y y} r o s i g l i t a z o n a e s u n a g o n i s t a s e l e c t i v o P P A R y . P a r a s u p r i m i r l a e x p r e s i ó n P P A R a o P P A R y e n c é l u l a s e n d o t e l i a l e s , h e m o s a p l i c a d o u n a a p r o x i m a c i ó n d e s i l e n c i a m i e n t o d e g e n e s m e d i a n t e A R N d e i n t e r f e r e n c i a ( s i R N A ) .

S e t r a n s f e c t a r o n H U V E C c o n f l u e n t e s c o n A R N s i d e R X R a , P P A R a , P P A R y e s p e c í f i c o s ( D h a r m a c o n , L a f a y e t t e , C O ) u t i l i z a n d o R N A i M A X d e l i p o f e c t a m i n a ( I n v i t r o g e n , C a r s l b a d , C A ) ^{d u r a n t e 4 8 h ( S a n z} et al., ^{2 0 1 2 ) . 13 A c o n t i n u a c i ó n , l a s c é l u l a s s e t r a t a r o n d u r a n t e 2 0 h c o n p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) a 1 0 |j M o r o s i g l i t a z o n a a 1 j M y l u e g o s e e s t i m u l a r o n d u r a n t e 4 h c o n T N F a} ( 10 n g / m L ) . C o n e l f in d e c o n f i r m a r e l s i l e n c i a m i e n t o P P A R a , P P A R y y R X R a v í a A R N s i , s e ^{r e a l i z ó e l a n á l i s i s m e d i a n t e W e s t e r n b lo t ( S a n z} et al., ^{2 0 1 2 ) . 13 D e s p u é s d e s i l e n c i a r , s e l a v a r o n} l a s c é l u l a s , s e r a s p a r o n , s e r e c o g i e r o n y s e c e n t r i f u g a r o n a 15 .0 0 0 g a 4 ° C d u r a n t e 30 m in p a r a o b t e n e r e l e x t r a c t o t o t a l d e p r o t e í n a . L a c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a s e d e t e r m i n ó p o r e l m é t o d o d e B r a d f o r d . L a s m u e s t r a s s e d e s n a t u r a l i z a r o n , s e s o m e t i e r o n a e l e c t r o f o r e s i s e n g e l d e p o l i a c r i l a m i d a c o n S D S a l 1 0 % ( S D S - P A G E ) y s e t r a n s f i r i e r o n a u n a m e m b r a n a d e n i t r o c e l u l o s a . L a s m e m b r a n a s s e b l o q u e a r o n c o n B S A - P B S a l 5 % c o n T w e e n 20 a l 0 , 0 5 % y s e i n c u b a r o n c o n e l a n t i c u e r p o c o r r e s p o n d i e n t e . L o s a n t i c u e r p o s p o l i c l o n a l e s d e c o n e j o f r e n t e a R X R a y P P A R y ( H - 10 0 ) y e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l d e r a t ó n f r e n t e a P P A R a f u e r o n a d q u i r i d o s a S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y ( d i l u c i ó n : 1 : 400 , S a n t a C r u z , C A ) . L o s a n t i c u e r p o s s e c u n d a r i o s I g G a n t i - c o n e j o o a n t i - r a t ó n l i g a d o s a l a p e r o x i d a s a d e r á b a n o f u e r o n s u m i n i s t r a d o s p o r D a k o C y t o m a t i o n ( d i l u c i ó n 1 : 20 00 , D i n a m a r c a ) .

Transcurridas las 48 horas de la transfección con siRNA específico de PPARa o PPARy, las HUVEC mostraron > 68% y 66% de reducción de proteína, respectivamente, en comparación con los niveles detectados en las células control tratadas con siRNA (Figura 7). En el control de células transfectadas-siRNA, la estimulación con TNFa inducía aumentos significativos en la adhesión de las células mononucleares que eran inhibidas cuando las células endoteliales se pretrataban con policerasoidol (1) o rosiglitazona (Figura 8A y B). Cabe destacar que, mientras estas respuestas no se veían afectadas por el silenciamiento PPARa (Figura 8A), las respuestas inducidas por policerasoidol (1) eran anuladas en HUVEC deficiente de PPARy (Figura 8B). Los PPAR forman heterodímeros con RXR que en algunos casos responden sinérgicamente a ambos agonistas, RXR y el receptor. Dado que PPARy puede interactuar con RXRa para producir su actividad antiinflamatoria (Sanz et al., 2012), la delección dirigida de la expresión de RXRa en HUVEC con siRNA específico de RXRa (>72% de reducción de proteína, Figura 7) también suprimió completamente el efecto inhibidor de policerasoidol (1) sobre la adhesión de células mononucleares inducida por TNFa (Figura 8C).

Además, para confirmar la interacción entre PPAR^y y RXRa, las HUVEC se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-PPARY y se sometieron a electroforesis y westernblot con un anticuerpo anti-RXRa, y se detectó el aumento de la interacción RXRa/PPARY en aquellas células pretratadas con policerasoidol (1) o rosiglitazona (Figura 8D).

Para inmunoprecipitación, los extractos de proteína se obtuvieron en 50 mM Tris-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 y proteasa (1 mM PMSF, 40 jg /m L aprotinina y 40 jg /m L leupeptina) e inhibidores de fosfatasa. Entonces, los extractos de proteína (~200 jg ) se incubaron con 5 |jg de anticuerpo frente a PPARy . Se precipitaron inmunocomplejos utilizando un anti-conejo IgG beads (cat# 8800, eBioscience, San Diego, CA) y se suspendieron en tampón de muestra con 50 mM ditiotreitol (DTT). El Western blot se llevó a cabo con un anticuerpo frente a RXRa y las membranas se incubaron con el secundario HRP-conjugado Conejo TrueBlot (eBioscience, San Diego, CA) como anticuerpo secundario. Se desarrollaron señales de quimioluminiscencia con ECL (GE Healthcare, Madrid, España).

Este mismo experimento de inmunoprecipitación se llevó a cabo con el compuesto de síntesis 9 (Figura 9). Teniendo en cuenta los resultados, podemos concluir que policerasoidol (1) y el compuesto 9, no requieren la activación de PPARa para inhibir el reclutamiento de células mononucleares, pero necesitan la activación de RXRa y PPARy para ejercer su efecto antiinflamatorio, como ocurre con otros agonistas selectivos PPAR^y o RXRa (Sanz et al., 2012).

Ejemplo 6: Policerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9 disminuyen la expresión de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1), la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y fractalquina (CX3CL1), inducidas por TNFa

En enfermedades cardiovasculares y cardiometabólicas (hipertensión, obesidad, diabetes, síndrome metabólico) se han detectado niveles elevados de mediadores circulantes, entre otros, citoquinas y quimiocinas que pueden reflejar alteraciones en la función endotelial. Las citoquinas proinflamatorias estimulan el endotelio para expresar moléculas de adhesión celular (CAM), tales como la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1), aumentando la adhesión de leucocitos a las células del endotelio vascular, que constituye un proceso importante de la etapa inicial de las respuestas inflamatorias e inmunológicas (Zernecke et al., 2010). PPAR^y se expresa en tejidos vasculares y leucocitos, y su activación puede disminuir la expresión de CAMs como ICAM-1 o VCAM-1, así como la expresión de CX³CL1 (fractalquina). CX³ CL1 es una quimiocina que se expresa en la superficie de células endoteliales, y puede unirse a su receptor CX³ CR1, expresado en monocitos, linfocitos T y células NK, promoviendo la adhesión celular. CX³ CL1 también se puede desprender de la superficie celular por acción de ADAM10 y ADAM17, liberándose una forma soluble capaz de actuar como quimioatrayente de los leucocitos que expresan su receptor. Además de CX³CL1, existe otra quimiocina transmembrana, CXCL16, que al igual que CX³CL1, también se expresa en células endoteliales y puede desprenderse por la acción de ADAM10. Ejerce su acción interaccionando con su receptor CXCR6, presente en determinados subtipos leucocitarios, promoviendo la adhesión de los mismos a la superficie endotelial. Así, estas quimiocinas y moléculas de adhesión regulan la adhesión y migración de los leucocitos a la pared vascular, y existen indicios de que un incremento de su expresión endotelial está asociado a un incremento de la aterosclerosis (Zernecke et al., 2008).

Para investigar la expresión de VCAM-1, ICAM-1, fractalquina (CX³CL1) y CXCL16, se pretrataron HUVEC con policerasoidol (1) (10 ^M) o el compuesto 9 (3 ^M) durante 24 h, y se estimularon con TNFa (20 ng/mL) durante 24 h adicionales. Las células se recogieron de los frascos utilizando accutasa (StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent, ThermoFischer Scientific, Waltham, MA). Entonces, se lavaron e incubaron durante 1 h con un anticuerpo APC-conjugado mAb frente a VCAM-1 humano (100 |jg/mL; clon STA, BioLegend, San Diego, CA), FITC-conjugado mAb frente a ICAM-1 humano (400 jg/m L; clon HA58, BioLegend, San Diego, CA), PE-conjugado mAb frente a CX³ CL1 humano (1,25 jg/m L; clon 51637, R&D Systems, Minneapolis, MN) o con un anticuerpo monoclonal APC-conjugado frente a CXCL16 humano (clon 256213, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido), todos ellos a una dilución 1:25 e n 3 % B S A / P B S . L a s m u e s t r a s s e a n a l i z a r o n e n u n c i t ó m e t r o d e f l u j o p a r a l e l o ( F A C S V e r s e , B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) .

^{E n e s t e e s t u d i o h e m o s d e m o s t r a d o q u e e l p r e t r a t a m i e n t o d e H U V E C c o n p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ⁾

^{L o s r e s u l t a d o s m o s t r a r o n q u e p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) a 1 0 j M r e d u c í a l a e x p r e s i ó n d e e s t a q u i m i o c i n a e n u n 7 7 , 6 % (} Figura 10C ^{) . L a e x p r e s i ó n d e m o l é c u l a s d e a d h e s i ó n c o m o V C A M -}1, I C A M - 1 o q u i m i o c i n a s c o m o C X 3 C L 1 o C X C L 16 , t a m b i é n s e d e t e r m i n ó p a r a e l c o m p u e s t o 9 ^{a 3 j M , q u e m o s t r ó u n d e s c e n s o s i g n i f i c a t i v o d e l a e x p r e s i ó n d e V C A M - 1 , C X 3 C L 1 y C X C L 1 6 (} Figura 11 ^).

P a r a r e a l i z a r l o s e n s a y o s d e i n m u n o f l u o r e s c e n c i a H U V E C c o n f l u e n t e s s e c u l t i v a r o n s o b r e ^{c r i s t a l e s y a l g u n a s c é l u l a s s e i n c u b a r o n 2 4 h c o n p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) ( 1 0 j M ) o e l c o m p u e s t o} 9 ( 3 j M ) , a n t e s d e s e r t r a t a d a s c o n T N F a ( 20 n g / m L ) d u r a n t e 24 h a d i c i o n a l e s . E n t o n c e s , l a s c é l u l a s s e l a v a r o n d o s v e c e s c o n P B S ( 1 x ) , s e f i j a r o n c o n 4 % d e p a r a f o r m a l d e h í d o y s e b l o q u e a r o n e n s o l u c i ó n d e P B S ( 1 x ) c o n t e n i e n d o 1 % B S A . H U V E C s e i n c u b a r o n a 4 ° C t o d a l a n o c h e c o n u n a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l p r i m a r i o d e r a t ó n f r e n t e a V C A M - 1 h u m a n o ( d i l u c i ó n 1 : 20 0 ; c l o n 1 . G 1 1 B 1 , S e r o t e c , K i d l i n g t o n , R e i n o U n i d o ) , I C A M - 1 ( d i l u c i ó n 1 : 20 0 ; c l o n 6 .5 B 5 , S e r o t e c , K i d l i n g t o n , R e i n o U n i d o ) , C X 3C L 1 ( d i l u c i ó n 1 : 20 0 ; c l o n 8 150 6 , R & D S y s t e m s , M i n n e a p o l i s , M N ) o C X C L 16 ( 1 : 20 0 d i l u c i ó n ; I m m u n o s t e p , S a l a m a n c a , E s p a ñ a ) e n u n a s o l u c i ó n 0 , 1 % B S A / P B S , s e g u i d o d e i n c u b a c i ó n c o n u n a n t i c u e r p o s e c u n d a r i o a l e x a - f l u o r 4 8 8 - c o n j u g a d o d e c a b r a a n t i - c o n e j o ( d i l u c i ó n 1 : 10 0 0 ; A 110 3 4 , L i f e T e c h n o l o g i e s , C a r l s b a d , C A ) a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e d u r a n t e 1 h . L o s n ú c l e o s c e l u l a r e s s e c o n t r a s t a r o n c o n H o e c h s t ( d i l u i d o 1 : 4000 e n P B S , S i g m a - A l d r i c h , M a d r i d , E s p a ñ a ) . S e c a p t u r a r o n i m á g e n e s c o n m i c r o s c o p i o d e f l u o r e s c e n c i a ( A x i o O b s e r v e r A 1 , C a r l Z e i s s , T h o r n w o o d , N Y ) e q u i p a d o c o n u n o b j e t i v o d e l e n t e 40 x y u n o c u l a r 10 x .

Ejemplo 7: Policerasoidol (1) y el compuesto 9 inhiben la activación de p38 MAPK y NF-kB inducida por TNFa en HUVEC

N u m e r o s a s e v i d e n c i a s h a n r e v e l a d o q u e l o s l i g a n d o s P P A R s o n c a p a c e s d e m o d u l a r l a s v í a s ^{d e s e ñ a l i z a c i ó n M A P K ( P a r k} et al., ^{2 0 1 1 ) . P o r lo q u e h e m o s i n v e s t i g a d o l a s v í a s d e} s e ñ a l i z a c i ó n i n t r a c e l u l a r q u e s u b y a c e n a l a s r e s p u e s t a s i n h i b i d o r a s m o s t r a d a s p o r ^{p o l y c e r a s o i d o l (} 1 ^{) y e l c o m p u e s t o s i n t e t i z a d o} 9 ^.

^{E l e f e c t o d e p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) o e l c o m p u e s t o} 9 ^{s o b r e l a f o s f o r i l a c i ó n d e p 3 8 M A P K y p 6 5 ( N F -}

^k B ) i n d u c i d a p o r T N F a s e d e t e r m i n ó e n H U V E C m e d i a n t e c i t o m e t r í a d e f l u j o . H U V E C s e ^{i n c u b a r o n p r e v i a m e n t e d u r a n t e 2 4 h c o n e l c o m p u e s t o} 1 ^{( 1 0 ^ M ) o} 9 ^{( 3 ^ M ) y s e e s t i m u l a r o n} d u r a n t e 1 h c o n T N F a ( 20 n g / m L ) . L a s c é l u l a s e n d o t e l i a l e s s e f i j a r o n c o n B D C y t o f i x F i x a t i o n B u f f e r ( B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) y s e p e r m e a b i l i z a r o n c o n B D S o l P e r m III s o l u c i ó n ( B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) y s e t i ñ e r o n s e c u e n c i a l m e n t e c o n u n a d i l u c i ó n 1 : 10 d e u n a n t i c u e r p o P E - c o n j u g a d o m A b f r e n t e a p 65 h u m a n o ( p S 529 , c l o n K 10 - 8 9 5 .12 .5 0 ; B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) y u n a d i l u c i ó n 1 : 10 d e a n t i c u e r p o A l e x a F l u o r - c o n j u g a d o m A b f r e n t e a p 38 M A P K h u m a n o ( p T 8 0 / p Y 18 2 , c l o n 36 / p 38 ; B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) . L a s c é l u l a s s e a n a l i z a r o n u t i l i z a n d o u n c i t ó m e t r o d e f l u j o B D F A C S V e r s e ( B D B i o s c i e n c e s , S a n J o s e , C A ) .

^{L o s r e s u l t a d o s m o s t r a r o n q u e p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) f u e c a p a z d e d e s c e n d e r d e f o r m a c o n s i d e r a b l e ( 6 3 , 4 % ) l a a c t i v a c i ó n d e p 3 8 M A P K , a s í c o m o e l c o m p u e s t o} 9 ^{( 7 1 , 9 % ) (} Figuras 12A ^y 13A ^{) . A d e m á s , l a a c t i v a c i ó n d e d i s t i n t o s c o m p u e s t o s d e l a f a m i l i a M A P K s e a s o c i a c o n} l a t r a n s a c t i v a c i ó n d e N F - ^k B ( p 65 ) , y l a m o v i l i z a c i ó n d e N F - ^k B a l n ú c l e o a c t i v a l a t r a n s c r i p c i ó n d e g e n e s q u e c o d i f i c a n l a e x p r e s i ó n d e n u m e r o s o s m e d i a d o r e s i n f l a m a t o r i o s c o m o l a s ^{m o l é c u l a s d e a d h e s i ó n e n d o t e l i a l e s o l a s í n t e s i s d e c i t o c i n a s y q u i m i o c i n a s ( M o n a c o} et al., ^{2 0 0 4 ) . P u d i m o s d e t e r m i n a r q u e p o l i c e r a s o i d o l (} 1 ^{) y e l c o m p u e s t o} 9 ^{f u e r o n c a p a c e s d e b l o q u e a r s i g n i f i c a t i v a m e n t e l a a c t i v a c i ó n d e N F - k B i n d u c i d a p o r T N F a (} Figura 12B ^y 13B ^{) .}

Estudios in vivo

Ejemplo 8: Tratamiento de ratones ob/ob con el compuesto 9.

L o s p r o t o c o l o s c o n f o r m e s a l a s d i r e c t r i c e s d e l a U n i ó n E u r o p e a p a r a e l c u i d a d o y l a p r o t e c c i ó n d e l o s a n i m a l e s f u e r o n a p r o b a d o s p o r e l C o m i t é É t i c o d e l a U n i v e r s i d a d d e V a l e n c i a . S e h i c i e r o n t o d o s l o s e s f u e r z o s p a r a m i n i m i z a r e l n ú m e r o d e a n i m a l e s u t i l i z a d o s , a s í c o m o s u s u f r i m i e n t o .

^{L o s r a t o n e s} ob/ob ^{p r e s e n t a n u n a d e f i c i e n c i a d e l e p t i n a , y e s t á n a s o c i a d o s c o n h i p e r f a g i a , y} o b e s i d a d , a d e m á s d e h i p e r g l i c e m i a e h i p e r i n s u l i n e m i a . E n e s t e e s t u d i o s e u t i l i z a r o n r a t o n e s ^{m a c h o s} ob/ob ^{( C 5 7 B L / 6 J ) ( C h a r l e s R i v e r l a b o r a t o r i e s , C h a t i l l o n - s u r - C h a l a r o n n e , F r a n c i a ) .}

L o s r a t o n e s f u e r o n a l o j a r o n e n j a u l a s i n d i v i d u a l e s e n u n a h a b i t a c i ó n d o n d e s e c o n t r o l a b a la t e m p e r a t u r a , h u m e d a d y l u z . S e m a n t u v i e r o n y c r i a r o n ( e s t a b u l a r i o d e l a U C I M , U n i v e r s i t a t d e V a l é n c i a ) . e n c o n d i c i o n e s l i b r e s d e p a t ó g e n o s c o n a c c e s o l i b r e a a l i m e n t o y a g u a a u t o c l a v a d a , a u n a h u m e d a d d e l 6 0 - 6 5 % y a u n a t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e d e 2 2 ± 2 ° C c o n u n c i c l o o s c u r o / l u m i n o s o d e 12 h ( l u z d e 0 6 : 0 0 - 18 : 0 0 h , o s c u r i d a d d e 18 : 0 0 - 0 6 : 0 0 h ) . A l o s r a t o n e s s e l e s p e r m i t i ó a c l i m a t a r s e d u r a n t e d i e z d í a s a n t e s d e l e s t u d i o .

^{L o s r a t o n e s m a c h o s} ob/ob ^{d e 7 a 8 s e m a n a s d e e d a d s e t r a t a r o n d i a r i a m e n t e e n t r e l a s 9 : 0 0 a . m . y l a s 1 1 : 0 0 h o r a s c o n e l c o m p u e s t o} 9 ^{p o r v í a o r a l m e d i a n t e u n a s o n d a o r o g á s t r i c a ( 1 0} m g / K g / d y 30 m g / K g / d ) , r o s i g l i t a z o n a ( 10 m g / K g / d ) y / o W Y - 14 6 4 3 ( 30 m g / K g / d ) d u r a n t e 4 ^{d í a s , y s e c o m p a r a r o n c o n e l g r u p o d e r a t o n e s} ob/ob ^{c o n t r o l t r a t a d o s ú n i c a m e n t e c o n e l} v e h í c u l o ( s u e r o f i s i o l ó g i c o c o n H E C 1 % ) . L a s d o s i s s e e l i g i e r o n e n b a s e a r e s u l t a d o s p r e v i o s , ^{o b t e n i d o s d e u n e x p e r i m e n t o c o n r a t o n e s} ob/ob ^{( n = 3 ) e n e l q u e e l c o m p u e s t o} 9 ^{y l o s} c o m p u e s t o s d e r e f e r e n c i a , r o s i g l i t a z o n a y W Y - 14 6 4 3 , s e a d m i n i s t r a r o n i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e ( d a t o s n o m o s t r a d o s ) . S e u t i l i z a r o n 6 a n i m a l e s p o r g r u p o , e n e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d i e n t e s ( n = 6 ) . L o s c o m p u e s t o s s e p r e p a r a r o n d i a r i a m e n t e c o m o s u s p e n s i o n e s e n H E C a l 1 % p a r a s u a d m i n i s t r a c i ó n o r a l . L a a l e a t o r i z a c i ó n s e r e a l i z ó s o b r e l o s v a l o r e s d e g l u c e m i a a d í a 0. D u r a n t e l a d u r a c i ó n d e l e x p e r i m e n t o s e p e s ó d i a r i a m e n t e p a r a c a d a r a t ó n : c a n t i d a d d e a l i m e n t o i n g e r i d o y e l p e s o c o r p o r a l . D i a r i a m e n t e , e n t r e l a s 9 : 00 a . m . y l a s 11 : 0 0 h o r a s ( p r e v i o a l t r a t a m i e n t o ) s e m i d i ó l a g l u c o s a e n s a n g r e u t i l i z a n d o ( C o n t o u r n e x t il S B B l o o d g l u c o s e m e t e r , B A Y E R , B a s e l , S u i z a ) . E l q u in t o d í a d e l e x p e r i m e n t o , l o s r a t o n e s s e a n e s t e s i a r o n c o n i s o f l u o r a n o y s e e x t r a j o l a s a n g r e p o r p u n c i ó n c a r d i a c a . L a s a n g r e s e r e c o g i ó e n t u b o s c o n t e n i e n d o E D T A o h e p a r i n a . U n a v e z t o m a d a s l a s m u e s t r a s , l o s a n i m a l e s s e s a c r i f i c a r o n p o r d i s l o c a c i ó n c e r v i c a l y p o s t e r i o r m e n t e , s e e x t r a j e r o n d i v e r s o s ó r g a n o s c o m o t e j i d o a d i p o s o b l a n c o ( W A T ) e h í g a d o , p a r a s u e s t u d i o p o s t e r i o r . L o s ó r g a n o s s e p e s a r o n y s e c o n g e l a r o n p a r a u n p o s t e r i o r a n á l i s i s d e A R N y p o d e r l l e v a r a c a b o e s t u d i o s h i s t o l ó g i c o s . L a s m u e s t r a s d e p l a s m a s e o b t u v i e r o n p o r c e n t r i f u g a c i ó n y s e a l m a c e n a r o n a - 8 0 ° C .

Análisis histológico

L a s m u e s t r a s d e t e j i d o a d i p o s o b l a n c o p e r i g o n a l ( W A T ) y d e h í g a d o f u e r o n f i j a d a s e n p a r a f o r m a l d e h í d o a l 4 % , e m b e b i d a s e n p a r a f i n a , s e c c i o n a d a s u t i l i z a n d o u n m i c r o t o m o ( L e i c a R M 224 5 , L e i c a B i o s y s t e m s , W e t z l a r , A l e m a n i a ) y m o n t a d a s e n p o r t a o b j e t o s d e m i c r o s c o p i o S u p e r f r o s t ® p l u s ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c , W a l t h a m , M A ) . S e o b t u v i e r o n s e c c i o n e s t r a n s v e r s a l e s d e t e j i d o d e W A T y d e h í g a d o . S e e x a m i n a r o n a l m e n o s 10 p o r t a o b j e t o s , q u e c o n t e n í a n « 4 s e c c i o n e s t r a n s v e r s a l e s d e t e j i d o ( 5 ^ m d e e s p e s o r ) d e c a d a a n i m a l . S e l l e v ó a c a b o u n a t i n c i ó n d e h e m a t o x i l i n a y e o s i n a ( H & E ) d e W A T e h í g a d o . L a in f i l t r a c i ó n i n f l a m a t o r i a ^{e n W A T s e m i d i ó c o m o s e d e s c r i b i ó p r e v i a m e n t e ( T o y o d a} et al., ^{2 0 0 8 ) . T r a s l a i n a c t i v a c i ó n} d e l a p e r o x i d a s a ( H 2 O 2 3 % ) y d e l b l o q u e o c o n s u e r o d e c a b r a ( A b c a m , C a m b r i d g e , R e i n o U n i d o ) , s e i n c u b a r o n s e c c i o n e s t r a n s v e r s a l e s d e W A T d u r a n t e l a n o c h e ( 4 ° C ) c o n e l s i g u i e n t e a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l ( m A b ) p r i m a r i o : m A b d e c o n e j o a n t i - r a t ó n F 4 / 80 ( d i l u c i ó n 1 : 10 0 , A b c a m , C a m b r i d g e , R e i n o U n i d o ) . S e d e t e c t ó u n m a r c a j e e s p e c í f i c o c o n u n a n t i c u e r p o s e c u n d a r i o d e c a b r a a n t i - c o n e j o c o n j u g a d o c o n H R P ( d i l u c i ó n 1 : 500 , D a k o , C o p e n h a g u e , D i n a m a r c a ) . C o n e l f in d e c o n f i r m a r l a e s p e c i f i c i d a d d e l o s a n t i c u e r p o s , s e u s a r o n a n t i c u e r p o s c o n t r o l d e i g u a l i s o t i p o ( A b c a m , C a m b r i d g e , R e i n o U n i d o ) o a n t i c u e r p o s e c u n d a r i o s ó l o c o m o c o n t r o l e s n e g a t i v o s . L a s m u e s t r a s s e r e v e l a r o n u s a n d o u n a s o l u c i ó n q u e c o n t e n í a 3 , 3 ' -d i a m i n o b e n z i d i n a ( D A B , V e c t o r L a b o r a t o r i e s I n c , B u r l i n g a m e , C A ) , p o s t e r i o r m e n t e s e c o n t r a t i ñ e r o n c o n h e m a t o x i l i n a d e H a r r i s ( S i g m a - A l d r i c h , M a d r i d , E s p a ñ a ) y s e d e s h i d r a t a r o n . C i n c o c a m p o s d e c a d a s e c c i ó n d e t e j i d o W A T f u e r o n f o t o g r a f i a d o s ( A x i o O b s e r v e r A 1 , ^{m i c r o s c o p i o C a r l Z e i s s , T h o r n w o o d , N Y ) d i g i t a l i z a d o s y a n a l i z a d o s} (ImageJ ^{s o f t w a r e 1 .4 8 V ,} B e t h e s d a , M A ) . L a c u a n t i f i c a c i ó n s e r e a l i z ó a d o b l e c i e g o y m e d i a n t e c ó d i g o s .

Extracción de ARNm, PCR en tiempo real

E l A R N t o t a l s e e x t r a j o d e l a g r a s a W A T d e r a t o n e s m e d i a n t e h o m o g e n i z a c i ó n . L a t r a n s c r i p c i ó n r e v e r s a s e r e a l i z ó c o n 100 0 n g d e A R N t o t a l u s a n d o e l k it d e t r a n s c r i p c i ó n i n v e r s a T a q M a n ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c , W a l t h a m , M A ) y s e c o n v i r t i ó a c D N A p o r m é t o d o s e s t á n d a r . E l c D N A s e a m p l i f i c ó c o n c e b a d o r e s e s p e c í f i c o s p a r a la p r o t e í n a q u i m i o a t r a y e n t e m o n o c í t i c a d e r a t ó n 1 ( M C P - 1 o C C L 2 , M m 0 0 441242 _ m 1 ) e n u n a p a r a t o d e P C R e n T i e m p o R e a l 79 0 0 H T ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c , W a l t h a m , M A ) u s a n d o e l M i x U n i v e r s a l M a s t e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c , W a l t h a m , M A ) T o d o s l o s c e b a d o r e s f u e r o n p r e d i s e ñ a d o s p o r A p p l i e d B i o s y s t e m s . L a c u a n t i f i c a c i ó n r e l a t i v a d e l a s d i f e r e n t e s t r a n s c r i p c i o n e s s e d e t e r m i n ó c o n e l m é t o d o 2 -AACt u s a n d o G A P D H ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c , W a l t h a m , M A ) c o m o c o n t r o l e n d ó g e n o y n o r m a l i z a d o p a r a e l g r u p o c o n t r o l .

Mediciones de metabolitos

S e d e t e r m i n a r o n l o s á c i d o s g r a s o s l i b r e s e n p l a s m a ( F F A ) , e l e n z i m a a s p a r t a t o a m i n o t r a n s f e r a s a ( A S T ) y a l a n i n a a m i n o t r a n s f e r a s a ( A L T ) p o r m e d i o d e u n k it d e e n s a y o c o l o r i m é t r i c o ( S i g m a - A l d r i c h , M a d r i d , E s p a ñ a ) . A d e m á s , s e d e t e r m i n a r o n l o s n i v e l e s d e l í p i d o s e n p l a s m a d e c o l e s t e r o l t o t a l y t r i g l i c é r i d o s ( T G ) m e d i a n t e p r o c e d i m i e n t o s e n z i m á t i c o s ( W A K O , C a p e C h a r l e s , V A ) . T a m b i é n s e d e t e r m i n ó l a c o n c e n t r a c i ó n d e H D L - c o l e s t e r o l ( H D L -c ) c o n e l m i s m o m é t o d o q u e e l u s a d o p a r a m e d i r c o l e s t e r o l t o t a l , d e s p u é s d e l a p r e c i p i t a c i ó n d e l a a p o l i p o p r o t e í n a - B ( a p o B ) c o n s u l f a t o d e d e x t r a n o / M g C h ( S i g m a - A l d r i c h , M a d r i d , ^{E s p a ñ a ) c o m o s e d e s c r i b i ó p r e v i a m e n t e ( Z i e s k e} et al., ^{2 0 0 5 ) .}

8.1 El compuesto 9 no provoca variaciones en el peso corporal y en la eficiencia alimenticia.

Un efecto adverso durante el tratamiento con TZD en los individuos con DT2 es la ganancia de peso (Ahmadian et al., 2013). Para determinar los efectos del tratamiento con el compuesto 9, los ratones y la comida ingerida se pesaron diariamente. Se calculó la ganancia de peso al final del tratamiento (d5-d0) (Figura 14A). El tratamiento con el compuesto 9 a las dosis de 10 y 30 mg/Kg/d no provocó diferencias significativas en la ganancia de peso en relación al grupo control. El aumento de ganancia fue de 1,70 ±0,25, 2,5±0,32 y 1,88±0,52 g, para los ratones control, tratados con rosiglitazona y compuesto 9 (30 mg/Kg/d), respectivamente. La eficiencia alimenticia siguió esta misma tendencia, y en los ratones tratados con el compuesto 9 no se observaron diferencias significativas (Figura 14B).

8.2 El compuesto 9 disminuye los valores de glucemia

El tratamiento durante 4 días nos permitió observar un aumento del 47% en el porcentaje de glucosa en sangre (248 vs. 300 mg/dL) en los ratones ob/ob del grupo control tratados con vehículo, mientras que la administración del compuesto 9 provocó un descenso del 20% en los niveles de glucosa (261 vs. 194 mg/dL) a la dosis de 30 mg/Kg/d respecto al día 0 (d0), por último, el tratamiento con rosiglitazona disminuyó la glucosa un 32% (217 vs. 135 mg/dL) (Figura 15).

8.3 Efecto del compuesto 9 sobre el tejido adiposo blanco (WAT)

El tratamiento de ratones ob/ob con el compuesto 9 no aumentó de forma significativa el peso del tejido adiposo blanco (WAT) perigonadal en comparación con el grupo de ratones control (Figura 16).

Por otra parte, el examen histológico de WAT reveló cambios en la morfología de las células, con un descenso significativo del área media de los adipocitos en ratones tratados con el compuesto 9 de forma dosis-dependiente, similar al efecto producido por WY-14643 (Figura 17), sugiriendo la capacidad del compuesto 9 para prevenir la hipertrofia de adipocitos. Por el contrario, el tratamiento con rosiglitazona aumentó el número de adipocitos de pequeño tamaño en los depósitos de WAT, disminuyendo el valor medio del área de los adipocitos y confirmando su efecto adipogénico.

8.4 Efecto antiinflamatorio del compuesto 9 sobre el tejido adiposo blanco (WAT)

Existen evidencias de que en individuos obesos con DT2 se desarrolla un proceso de inflamatorio crónico iniciado en el tejido adiposo. En WAT de ratones obesos se encuentran a u m e n t a d o s l o s n i v e l e s d e e x p r e s i ó n d e l o s g e n e s e n l a s v í a s i n f l a m a t o r i a s , e s t o s e r e f l e j a e n u n a u m e n t o d e q u i m i o c i n a s i n f l a m a t o r i a s e n e l t e j i d o a d i p o s o d e i n d i v i d u o s o b e s o s , t a l e s c o m o l a p r o t e í n a q u i m i o a t r a y e n t e d e m o n o c i t o s ( M C P - 1 ) , q u e p a r t i c i p a e n e l r e c l u t a m i e n t o d e ^{m o n o c i t o s e n l a z o n a d e l a i n f l a m a c i ó n ( Y o s h i m u r a} et al., ^{19 8 9 ) , a s í c o m o u n a u m e n t o d e la in f i l t r a c i ó n d e m a c r ó f a g o s e n t e j i d o a d i p o s o ( M a c K n i g h t} et al., ^{19 9 6 ) .}

S e r e a l i z a r o n e s t u d i o s s o b r e e l p r o c e s o i n f l a m a t o r i o d e W A T y p u d i m o s o b s e r v a r q u e e n ^{r a t o n e s} ob/ob ^{t r a t a d o s c o n e l c o m p u e s t o} 9 ^{a 3 0 m g / K g / d , d i s m i n u y ó d e f o r m a s i g n i f i c a t i v a la e x p r e s i ó n d e M C P - 1 (} Figura 18A ^{) . A d e m á s , l a c u a n t i f i c a c i ó n d e m a c r ó f a g o s e n W A T} m e d i a n t e i n m u n o h i s t o q u í m i c a u t i l i z a n d o u n a n t i c u e r p o f r e n t e a F 4 / 80 , n o s m o s t r ó q u e e l ^{c o m p u e s t o} 9 ^{f u e c a p a z d e d i s m i n u i r s i g n i f i c a t i v a m e n t e e l n ú m e r o d e m a c r ó f a g o s a l a d o s i s d e 3 0 m g / K g / d , i n d i c a n d o l a c a p a c i d a d d e l c o m p u e s t o} 9 ^{p a r a r e d u c i r l a i n f i l t r a c i ó n d e m a c r ó f a g o s e n W A T , s i m i l a r a l e f e c t o p r o d u c i d o p o r r o s i g l i t a z o n a (} Figura 18B ^).

8.5 El compuesto 9 mejora los parámetros lipidíeos en sangre

^{S e h a e s t u d i a d o l o s e f e c t o s e n l a d i s l i p i d e m i a d e r a t o n e s} ob/ob ^{d e t e r m i n a n d o d i v e r s o s} p a r á m e t r o s e n p l a s m a c o m o s o n e l c o l e s t e r o l t o t a l , H D L - c , t r i g l i c é r i d o s y á c i d o s g r a s o s l i b r e s . ^{E l t r a t a m i e n t o c o n e l c o m p u e s t o} 9 ^{a l a d o s i s d e 3 0 m g / K g / d y W Y - 1 4 6 4 3 a u m e n t ó d e f o r m a s i g n i f i c a t i v a l o s n i v e l e s d e c o l e s t e r o l t o t a l r e s p e c t o a l g r u p o d e r a t o n e s c o n t r o l} ob/ob ^{( 5 0 % y 6 4 % , r e s p e c t i v a m e n t e ) (} Figura 19A ^{) . E l c o m p u e s t o} 9 ^{a l a s d o s i s d e 1 0 y 3 0 m g / K g / d y W Y -}14 6 43 t a m b i é n a u m e n t a r o n s i g n i f i c a t i v a m e n t e e 1H D L - c , r e s p e c t o a l g r u p o d e r a t o n e s c o n t r o l ob/ob ⁽ Figura 19B ^{) . A d e m á s , e l c o m p u e s t o} 9 ^{y W Y - 1 4 6 4 3 m o s t r a r o n u n d e s c e n s o d e l o s} n i v e l e s d e t r i g l i c é r i d o s e n p l a s m a , a u n q u e n o d e f o r m a s i g n i f i c a t i v a y q u e p o d r í a s e r d e b i d o a l c o r t o p e r i o d o d e t r a t a m i e n t o ( 12 2 m g / d L o 10 1 m g / d L a l a d o s i s d e 10 o 30 m g / K g / d , ^{r e s p e c t i v a m e n t e ,} vs. ^{1 3 7 m g / d L d e l c o n t r o l} ob/ob) ⁽ Figura 19C ^{) . E l c o m p u e s t o} 9 ^{a 3 0 m g / K g / d} y W Y - 14 6 4 3 f u e r o n c a p a c e s d e d e s c e n d e r s i g n i f i c a t i v a m e n t e l o s n i v e l e s d e á c i d o s g r a s o s ^{l i b r e s e n s a n g r e ( 0 , 2 5 y 0 , 3 3 m o l e s / ^ L , r e s p e c t i v a m e n t e ,} vs. ^{0 , 6 7 m o l e s / ^ L d e l c o n t r o l} ob/ob) ⁽ Figura 19D ^).

8.6 Efecto del compuesto 9 en el hígado

^{S e h a e s t u d i a d o e l e f e c t o d e l c o m p u e s t o} 9 ^{s o b r e u n ó r g a n o p r i m o r d i a l c o m o e s e l h í g a d o , o b s e r v á n d o s e u n a u m e n t o d e p e s o n o s i g n i f i c a t i v o r e s p e c t o a l g r u p o c o n t r o l} ob/ob ⁽ Figura 20A ^{) . L a c u a n t i f i c a c i ó n d e l c o n t e n i d o d e t r i g l i c é r i d o s m o s t r ó q u e e n e l c o r t o p e r i o d o d e t r a t a m i e n t o c o n e l c o m p u e s t o} 9 ^{a 3 0 m g / K g / d , l o s t r i g l i c é r i d o s n o s e a c u m u l a r o n d e f o r m a s i g n i f i c a t i v a e n h í g a d o e n c o m p a r a c i ó n a l g r u p o c o n t r o l} ob/ob ⁽ Figura 20B ^).

8.7. El compuesto 9 disminuyó los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)

^{E l c o m p u e s t o} 9 ^{d i s m i n u y ó l o s n i v e l e s d e A L T y A S T , s u f r i e n d o e s t a ú l t i m a u n a r e d u c c i ó n} e s t a d í s t i c a m e n t e s i g n i f i c a t i v a a l a c o n c e n t r a c i ó n d e 30 m g / K g / d ( 2 8 % ) e n c o m p a r a c i ó n c o n e l ^{g r u p o c o n t r o l} ob/ob ^{t r a s 4 d í a s d e t r a t a m i e n t o (} Figura 21 ^{) . E s t o s u g i e r e q u e e l c o m p u e s t o} 9 p o d r í a r e d u c i r e l d a ñ o h e p á t i c o , m o s t r a n d o u n e f e c t o h e p a t o p r o t e c t o r .

R E F E R E N C I A S

^{1 . C h e a n g , W . S .} et al. ^{T h e p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r s in c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s : e x p e r i m e n t a l b e n e f i t s a n d c l i n i c a l c h a l l e n g e s .} Br. J. Pharmacol. ^{2 0 1 5 , 1 7 2 ,} 5 5 12 - 5 5 2 2 .

^{2 . A h m a d i a n , M .} et al. ^{P P A R y s i g n a l i n g a n d m e t a b o l i s m : t h e g o o d , t h e b a d a n d t h e f u t u r e .}

Nat. Med. ^{2 0 1 3 , 19 , 5 5 7 - 5 6 6 .}

^{3 . T a n , C . K .} et al. ^{S y n t h e t i c a n d n a t u r a l P e r o x i s o m e P r o l i f e r a t o r - A c t i v a t e d R e c e p t o r ( P P A R ) a g o n i s t s a s c a n d i d a t e s f o r t h e t h e r a p y o f t h e m e t a b o l i c s í n d r o m e .} Expert Opin. Ther. Targets ^{2 0 1 7 , 2 1 , 3 3 3 - 3 4 8 .}

^{4 . G o n z á l e z , M . C .} et al. ^{P o l y c e r a s o i d i n a n d p o l y c e r a s o i d o l , t w o n e w p r e n y l a t e d b e n z o p y r a n d e r i v a t i v e s f r o m} Polyalthia cerasoides. J. Nat. Prod. ^{19 9 5 , 5 8 , 1 2 7 8 - 1 2 8 4 .}

^{5 . G o n z á l e z , M . C .} et al. ^{P r e n y l a t e d b e n z o p y r a n d e r i v a t i v e s f r o m t w o} Polyalthia ^{s p e c i e s .}

Phytochem. ^{19 9 6 , 4 3 , 1 3 6 1 - 1 3 6 4 .}

^{6 . K a b b e , H . - J . , W i d d i g , A . S y n t h e s i s a n d r e a c t i o n s o f 4 - c h r o m a n o n e s .} Angew. Chem.

Int. Ed. Engl. ^{19 8 2 , 2 1 , 2 4 7 - 2 5 6 .}

^{7 . t e n d e d a n d t r u n c a t e d}

6 9 8 - 17 0 1.

8 . B i s c e g l i a , J . A . ; O r e l l i , L . R . R e c e n t A p p l i c a t i o n s o f t h e H o r n e r - W a d s w o r t h - E m m o n s R e a c t i o n t o t h e S y n t h e s i s o f N a t u r a l P r o d u c t s . C u r r . O r g . C h e m . 2 0 12 , 16 , 22 0 6 - 223 0 .

^{9 . T o s h i m a , K .} et al. ^{T h e F i r s t T o t a l S y n t h e s i s o f C o n c a n a m y c i n F ( C o n c a n o l i d e A ) . J .}

O r g . C h e m . 2 0 0 1, 6 6 , 17 0 8 - 17 15 .

^{C a r m o n a , M . C .} et al. ^{S 2 6 9 4 8 : a n e w s p e c i f i c p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r - m o d u l a t o r w it h p o t e n t a n t i d i a b e t e s a n d a n t i a t h e r o g e n i c e f f e c t s .} Diabetes 2 0 07 , 56 , 279 7 - 28 0 8 .

^{P a l e e , S .} et al. ^{P P A R g a m m a a c t i v a t o r , r o s i g l i t a z o n e : I s it b e n e f i c i a l o r h a r m f u l t o t h e c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m ?} World J. Cardiol. ^{2 0 1 1 , 3 , 1 4 4 - 1 5 2 .}

^{R o s e n s o n , R . S .} et al. ^{M o d u l a t i n g p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r s f o r t h e r a p e u t i c b e n e f i t ? B i o l o g y , c l i n i c a l e x p e r i e n c e , a n d f u t u r e p r o s p e c t s .} Am. Heart J.

2 0 12 , 164 , 672 - 6 80 .

^{S a n z , M . J .} et al. ^{R e t i n o i d X r e c e p t o r a g o n i s t s i m p a i r a r t e r i a l m o n o n u c l e a r c e l l r e c r u i t m e n t t h r o u g h p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r - g a m m a a c t i v a t i o n .} J. Immunol. ^{2 0 1 2 , 18 9 , 4 1 1 - 4 2 4 .}

Z e r n e c k e , A . ; W e b e r , C . , C h e m o k i n e s in t h e v a s c u l a r i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e o f ^{a t h e r o s c l e r o s i s .} Cardiovasc. Res. ^{2 0 1 0 , 86 , 1 9 2 - 2 0 1 .}

^{Z e r n e c k e , A .} et al. ^{C h e m o k i n e s in a t h e r o s c l e r o s i s a n u p d a t e .} Artherioscler. Thromb. Vasc. Biol. ^{2 0 0 8 , 2 8 , 18 9 7 - 19 0 8 .}

^{P a r k , J . B .} et al. ^{P e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r - g a m m a a g o n i s t s s u p p r e s s t i s s u e f a c t o r o v e r e x p r e s s i o n in r a t b a l l o o n i n j u r y m o d e l w it h p a c l i t a x e l i n f u s i o n .} PLoS One ^{2 0 1 1 , 6 , e 2 8 3 2 .}

M o n a c o , C . ; P a l e o l o g , E . , N u c l e a r f a c t o r k a p p a B : a p o t e n t i a l t h e r a p e u t i c t a r g e t in ^{a t h e r o s c l e r o s i s a n d t h r o m b o s i s .} Cardiovasc. Res. ^{2 0 0 4 , 6 1 , 6 7 1 - 6 7 8 .}

^{T o y o d a , T .} et al. ^{E f f e c t o f p e r o x i s o m a p r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e d r e c e p t o r - a l i g a n d s in t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a d i p o c y t e s a n d m a c r o p h a g e s in o b e s e a d i p o s e t i s s u e .} Obesity 2 00 8 , 16 , 119 9 - 12 0 7 .

^{Z i e s k e A . W .} et al. ^{E l e v a t e d s e r u m c - r e a c t i v e p r o t e in l e v e l s a n d a d v a n c e d a t h e r o s c l e r o s i s in y o u t h .} Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. ^{2 0 0 5 , 2 5 , 1 2 3 7 - 1 2 4 3 .}

^{Y o s h i m u r a , T .} et al. ^{H u m a n m o n o c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n - 1 ( M C P - 1 ) . F u l l - l e n g t h} c D N A c l o n i n g , e x p r e s s i o n in m i t o g e n - s t i m u l a t e d b l o o d m o n o n u c l e a r l e u k o c y t e s , a n d ^{s e q u e n c e s i m i l a r i t y t o m o u s e c o m p e t e n c e g e n e J E .} FEBS Lett. ^{19 8 9 , 2 4 4 , 4 8 7 - 4 9 3 2 1 .}

^{M c K n i g h t , A . J .} et al. ^{M o l e c u l a r c l o n i n g o f F 4 / 8 0 , a m u r i n e m a c r o p h a g e - r e s t r i c t e d c e l l} s u r f a c e g l y c o p r o t e i n w it h h o m o l o g y t o t h e G - p r o t e i n - l i n k e d t r a n s m e m b r a n e 7 h o r m o n e ^{r e c e p t o r f a m i l y .} J. Biol. Chem. ^{19 9 6 , 2 7 1 , 4 8 6 - 4 8 9 .}

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C1-6 alquilo;

alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NRmRp, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(O)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil éster de estructura:

o un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo, en donde cuando Rb es etilo, R1 es bencilo y R4 es -OCH2CF3;

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo, y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida;

alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(O)NRmRp, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona

y en donde, además,

cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y

cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.

2. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13:

3. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para uso como medicamento.

4. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy .

5. Compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicha enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y se selecciona independientemente entre desórdenes cardiometabólicos, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar y enfermedades neurodegenerativas.

6. Composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, para uso como medicamento.

8. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 6, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy .

9. Composición farmacéutica para uso, de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiometabólicos, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar y enfermedades neurodegenerativas.

10. Compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- Ri se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H o un grupo protector de fenol;

- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(O)ORb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, OR8 o un grupo C1-6 alquilo, y donde R8 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;

- R5 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;

- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;

- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;

- Río se selecciona independientemente entre un grupo Ci-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona

para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy ,

11. Compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicación 10, donde la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

12. Composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto según la reivindicación 10 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy .

13. Composición farmacéutica para uso, de acuerdo con la reivindicación 12, donde la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPAR^y se selecciona independientemente desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.