Dissertacao Lorena Cardoso Cintra - Unlocked

Universid
dade Federa
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Instituto d
de Ciências Biológicass
Prog
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Pós-graduaçção em Bio
ologia
Área de co
oncentraçãão: Biologia
a Celular e Molecularr

Cloonagem
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Cardosso Cinttra
Orientadora: Rossália Santos Amorim Jesuíno

J
Co-o
orientadoraa: Fabrícia
a de Paula Faria
F
G
Goiânia, 201
10.

Universidade Federal de Goiás

Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Biologia
Área de concentração: Biologia Celular e Molecular
Clonagem e expressão da tiorredoxina 1 de

Paracoccidioides brasiliensis em Pichia pastoris
Lorena Cardoso Cintra
Orientadora: Rosália Santos Amorim Jesuíno
Co-orientadora: Fabrícia de Paula Faria
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Goiás como
requisito parcial para obtenção do Título de Mestre
em Biologia e área de concentração Biologia Celular e
Molecular.
Goiânia – Goiás – Brasil,
agosto, 2010.

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Cintra, Lorena Cardoso.

C575c Clonagem e expressão do gene da tiorredoxina 1 de
Paracoccidioides brasiliensis em Pichia pastoris [manuscrito] /
Lorena Cardoso Cintra. - 2010.
xv, 135 f. : il., figs, tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Rosália Santos Amorim Jesuíno; Co-

orientadora: Profª Drª Fabrícia de Paula Faria.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Ciências Biológicas, 2010.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas.
1. Fungo – Paracoccidioides brasiliensis. 2. Pichia pastoris.

I. Título.
CDU: 582.28

Dissertação desenvolvida no Laboratório de Biotecnologia de Fungos do Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Goiás e no Laboratório de Biologia Molecular e Filogeografia/Bioagro, Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa.
Banca Examinadora
Titulares
Profa. Dra. Rosália Santos Amorim Jesuíno – Orientadora – Presidente da banca
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Goiás.
Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus – Examinador interno

Profa. Dra. Raphaela de Castro Georg – Examinador externo

Universidade Federal de Goiás
Suplentes
Profa. Dra. Kênya Silva Cunha - Examinador interno

Profa. Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva - Examinador externo
Departamento de Microbiologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,


Aos melhores e amados pais, Ivair e Wilzon,

pelo amor incondicional, pelo apoio para iniciar e
terminar esse trabalho. Amo vocês!

Agradecimentos
Esta é a hora que podemos ser nós mesmos, sair do rigor da área dura e expressar, não
apenas genes, mas um pouco de humanidade.
"Pensamos em demasia e sentimos bem pouco. Mais do que de máquinas, precisamos de

humanidade. Mais do que de inteligência, precisamos de afeição e doçura. Sem essas
virtudes, a vida será de violência e tudo será perdido."- Charlie Chaplin; O Grande Didator.
E é com a frase de Charlie Chaplin que eu inicio agradecendo a minha orientadora,

Rosália, pelos 5 anos de parceria. Aprendi muito nesse tempo juntas, desde a iniciação
científica (início de 2005) até o mestrado. Obrigada pela boa convivência, obrigada pelo
carinho, preocupação e respeito. Obrigada por ter paciência comigo e ser mais que
orientadora, uma amiga.
Agradeço também a Fabrícia, a minha co-orientadora, que muito me ensinou sobre a

Pichia. Obrigada pela convivência, ensinamentos, direcionamento. Obrigada por fazer,
juntamente, com a Rosália, nosso ambiente de trabalho muito agradável.
Essa dissertação, fruto do trabalho de 2 anos e alguns meses, só foi possível pelo apoio
físico e sentimental, direto ou indireto de várias pessoas...emprestando o laboratório, reagente,
enzima, tempo, ouvido...ou jogando papo fora (ócio criativo), demonstrando carinho, dando
apoio, dentre outras muitas coisas.
Espero que a minha memória de peixe não me deixe esquecer de agradecer a todos que
contribuíram...
Aos companheiros e amigos do laboratório de biotecnologia de fungos, por

aguentarem minhas bagunças todos os dias.
A nossa casa não é o lugar onde moramos
Mas sim o lugar em que nos sentimos bem
Pode ser com quem namoramos
Ou até muitos outros alguém (...)
A nossa casa é aqui

Onde o coração gosta de morar
Seja numa mansão de luxo

Ou no mais desolado lugar

Eu estou em casa
Nesta vida com amizades. A minha casa é o mundo.
E em todos os lugares que tiver felicidades. (Blue Heaven)
A querida Gisele, tenho muito que te agradecer pelo ouvido sempre disponível e pelas
muitas dicas para lidar com a levedura Pichia pastoris. Tenho muita admiração por você
(igual o Faustão “tanto no pessoal, quanto no profissional”). Se eu pudesse dar mais um título
de co-orientação seria para você.
Ao sempre prestativo Syd e seus pseudônimos (Sydney, Sylvio, Sydnelson e sempre

com Y...). Você é meu ídolo (risos). Sempre paciente, sempre pronto para ajudar a todos,
sempre pronto a aprender. Obrigada por ser meu assessor para assuntos computacionalísticos.
Aos meus pupilos (se é que eu posso assim considerar): Wesley, Thiago, Elvia.
Desculpe por ensinar sempre como não se deve fazer um experimento, rs. Tentei
desencaminhá-los, mas vocês são persistentes, rs. Espero ter contribuído de alguma forma.
Aprendi mais do que ensinei.
Ao Guilhermar (figura!), um exemplo de determinação e esforço. Você que sempre diz

nos admirar, agora eu digo: admiro você “Você que é um rapaz esperto...rs” obrigada, rs.
A Ilítia e sua mente borbulhante, Byancarine, Dâmaris, Matheus, Andreia, queridos

companheiros do dia a dia. Obrigada. Ao Rafael, que não está mais no laboratório, mas que
sempre me deu muita força. Ao Wagner, que estatisticamente não pertence ao laboratório,
mas que sempre está lá para nos dar uma orientação sempre bem vinda.
A todos vocês do grupo LBF, MUITO OBRIGADA!
Um agradecimento especial ao meu amigo Tiago Carrijo, obrigada pelos artigos

contrabandeados, rs. Foram muito úteis.
A Profa. Silvana por disponibilizar o laboratório sempre que preciso. Obrigada aos
amigos do laboratório de biologia molecular de fungos: Lucas, meu companheiro pedreiro
desde a graduação até o mestrado. Começamos juntos e terminamos juntos. Obrigada por me
ensinar sobre a bolsa de valores e técnicas para sobreviver com a bolsa do mestrado. Elvira
você é demais. Pessoa de alma boa. Marília, Ana Paula, Camila, Andressa, Deyze (Deyzaaas)

e Elda, vocês foram muito importantíssimas para que isso fosse possível. Valeu demais.
Nunca esquecerei o que fizeram por mim.
Ao Prof. Cirano e todo pessoal do laboratório de enzimologia. Obrigada pela estrutura

laboratorial cedida. Andrei, Marcelo, Amanda Araújo, Amanda Rafaella, , Fabyano, Roberto,
Raquel, Luana, Vanessa, Rogério, Marcela (Agradeço aqui) valeu pelo apoio. Ao querido
amigo Saulo, obrigada pelos artigos decifrados na disciplina de biologia molecular e as várias
dicas para elaboração desse trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular: Patrícia Lima, Mirelle, Elisa

Flávia, Neto (Neto Neto Neto ôôÔ), Alexandre, Juliana, Patrícia Zambuzi, Clayton, Hellen,
Tereza Cristina, Dayane, Leandro e ao pessoal das antigas Bruno Tacco, Patrícia Kott,
Moniquinha, Mônica (Moc), Fernanda, Christielly, Kesser, Aline, Sabrina, Lidiane, Milce e o
amigo mais glamousoro de todos Rodrigo (bombom de cupuaçu), o meu muito obrigada pelo
auxílio prestado (“Detalhes” só com o Roberto Carlos).
Aos amigos da ex-república que se findou Marina, Renata e Thiago pelos dias que
vivemos sob o mesmo teto, rs. Especialmente para a Renata e para Marina pela companhia no
eixão e Praça A até o longínquo Campus Samambaia, pelas “marmitas, Tarsilas e cachaçadas
de balde” etc. OBRIGADA pela amizade e companheirismo!
A pequena Liliane, minha companheira de república (ex-república), obrigada pela

companhia no meu primeiro ano de mestrado.
Ao Prof. Arthur pelas muitas dicas para elaboração do trabalho e pelo suporte técnico-
científico-estrutural. Seu laboratório foi praticamente uma extensão do meu. Ao Prof. Ivan
pela ajuda com os géis sem banda. E as amigas do laboratório de genética: Ana Flávia,
Marcela (Agradeço por aqui também) e Lílian por sempre dar ouvidos as minhas lamúrias e
lamentações.
Aos grandes amigos da UFV – Viçosa. A Profa. Valéria Monteze, por ter me recebido
em seu laboratório e ter me ensinado muito sobre evolução dirigida. Adorei os 6 meses que
passei em seu laboratório. Aprendi muito e devo isso as pessoas maravilhosas que me
acolheram (a goiana que fala poRta) de braços abertos: Ana Paula (obrigada por ser sempre
solícita), Carolzinha (obrigada pelo pouso por alguns dias), a Roberta (Robs), Beatriz (Bia) e
Maria Andreia (Mariandrei) minhas companheiras de bandeijão, Larissa, Denise , Wiliane,

meu estagiário por 6 meses Éverton, a Dayelle, Cassiane (Cassi), Flávia, Magali, Brenda,
Mariana, Maíra e Camila. “Um dia seremos todos domadores”.
A amiga Carmem, sem palavras para descrever como foi importante conviver com
você por esses 6 meses. Minha grande companheira em Viçosa. Me ensinou sobre o melhor
café do mundo e cuidou de mim como uma irmã. Um dia eu retribuo.
Ao meu amigo Rodolfo (freudflistone), meu amigo para assuntos aleatórios,

probabilísticos, metafísicos e paranormais. Infindáveis discussões sobre o que é ciência, para
onde vamos, de onde viemos e o que estamos fazendo aqui e essa é pra você:
Tenho amigos para saber quem eu sou,

pois vendo-os loucos e santos, bobos e sérios, crianças e velhos,
nunca me esquecerei de que a normalidade é uma ilusão imbecil e estéril
(Fernando Pessoa).
A minha amiga Paraense arretada Ellen Acioli: que bom que existe “Tim sem
fronteiras”.
Meus amigos queridíssimos, companheiros de café filosófico, meus mais que amigos
de bar: Bruno, Guilherme, Lorena (Tchatchatcha), Luis (jovem) e Juliana Beatriz (Jujuba).
Vocês são as melhores companhias. As minhas grandes amigas Jacque e Rosa por serem o
ombro amigo em qualquer hora. Aos amigos Victor (Vitim) – valeu pelos ouvidos, Bárbara,
Ramon (Baiano)...e todos os amigos da graduação.
Aos meus amigos do mestrado Aline França, Kárita, Karina, Flávim, Thiago, Patrícia
e Karla. Ao doido Hugo Delleon, sujeito que vive a Universidade nos três níveis possíveis
(Aluno de graduação, Professor e Aluno de pós-graduação). Valeu pela Taq e dNTPs
milagrosos.
Ao pessoal do laboratório da Profa. Elisangêla, a Flávia, Aline e César. Minhas

amostras estão muito bem guardadas no – 80 ºC. A Profa. Kênya Silva Cunha, pelas
contribuições feitas no trabalho e pela amizade e a todos do laboratório de mutagênese: Laise,
Igor, Nilza e Karla.
A Profa. Andreia Maranhão (UNB) que me cedeu o laboratório para que eu pudesse
fazer o Dot Blotting e ao querido Rafael Burtet. A querida Juliana Pfrimer, por me hospedar
em Brasília, obrigada por ter sido a melhor anfitriã de todos os tempos (nota 10).

As guardiãs do nosso dia Vaneide e Selma, me sinto segura com a proteção de vocês,
rs. Obrigada pelos cafés, prozas e muitas outras coisas...
A melhor secretária-amiga-canceriana Gleizilene ou simplesmente, a Gleice. Você me

entende como ninguém, rs. Valeu por todas as “declarações” que você foi obrigada a fazer pra
mim.
A Anézia, por sempre limpar toda bagunça que fazíamos no lab.
Ao companheiro de pedreiragem no RU, Eduardo, meu amigo cantor de sertanejo

(infelizmente). Te adoro!
A Profa. Raphaela de Castro Georg pelas contribuições feitas neste trabalho. Suas
colocações foram muito bem vindas. Muito obrigada.
Agradeço também ao melhor estimulante do mundo: o café nosso de cada dia.
Aos criadores do Google, não seria nada sem vocês. rs
A capes, pela bolsa concedida.
E para finalizar...
Ao meu irmão Wesley, a minha cunhada Angelita e a mais nova da família, a pequena
Alice, que ainda não chegou, mas que já iluminou as nossas vidas (Espero que você não
resolva nascer no dia da minha defesa, ai a Tia vai ficar louca!). Obrigada por tudo. Amo
vocês.
Aos bons e raros ventos que trouxeram um amor pra mim: Renato. Você, mais do que
ninguém, sofreu com a minha ausência, com meu mau humor terrível, com as inúmeras
explicações sobre o meu trabalho, com meus dias de choro e angústia. Obrigada pela
paciência, amizade e carinho. Sua ajuda foi decisiva para o término desse trabalho. Te amo.
Te admiro. Te agradeço por ter sido a minha Bridge Over Troubled Water...
(…)I'll take your part

When darkness comes
And pain is all around
Like a bridge over troubled water
I will lay me down(…) - Simon and Garfunkel - Bridge Over Troubled Water

Liberdade
Ai que prazer
não cumprir um dever.
Ter um livro para ler
e não o fazer!
Ler é maçada,
estudar é nada.
O sol doira sem literatura.
O rio corre bem ou mal,
sem edição original.
E a brisa, essa, de tão naturalmente matinal
como tem tempo, não tem pressa...
Livros são papéis pintados com tinta.

Estudar é uma coisa em que está indistinta
A distinção entre nada e coisa nenhuma.
Quanto melhor é quando há bruma.

Esperar por D. Sebastião,
Quer venha ou não!
Grande é a poesia, a bondade e as danças...

Mas o melhor do mundo são as crianças,
Flores, música, o luar, e o sol que peca
Só quando, em vez de criar, seca.
E mais do que isto

É Jesus Cristo,
Que não sabia nada de finanças,
Nem consta que tivesse biblioteca...
Fernando Pessoa

Sumário
Página
Lista de figuras i
Lista de tabelas iv
Lista de abreviaturas v
Resumo vii
Abstract viii
1 – Introdução 23
1.1 - Biologia e aspectos gerais do fungo Paracoccidioides brasiliensis 23
1.1.2 – Paracoccidioidomicose 26
1.2 – Espécies reativas de oxigênio e defesas antioxidantes em fungos 27
1.3 – Tiorredoxina 32
1.3.1 - A super família Tiorredoxina 35
1.3.2 - Tiorredoxina em mamíferos 36
1.3.3 - Tiorredoxina em bactérias 37
1.3.4 - Tiorredoxina em fungos 39
1.4 - Sistema de expressão heteróloga em Pichia pastoris 41
2 – Justificativa 50
3 – Objetivos 51
4 – Material 52
4.1 – Microrganismos 52
4.1.2 – Bactérias 52
4.1.3 – Levedura 52
4.2 – Vetores 53
4.2.1 - pGEM®-T 53
4.2.2 - pHIL-D2 54
4.2.3 - pPIC9 54
4. 3 – Enzimas 55
4.4 – Marcadores 56
4.4.1 - Marcadores de DNA 56
4.4.2 - Marcadores de Proteína 56
4.5 - Kits de Uso Específico em Biologia Molecular 56
4.6 – Oligonucleotídeos 56
4.7 - Ferramentas de Bioinformática 57
4.8 - Meios de Cultura e soluções 57
4.8.1 - Meios para Cultivo de Bactérias 58
4.8.2 - Meios para Cultivo da Levedura P. pastoris e Soluções Estoque 59
4.9 - Transformação da Levedura P. pastoris por Eletroporação 62
Clonagem e expressão do gene da tiorredoxina 1 de Paracoccidioides brasiliensis em Pichia pastoris

4.10 - Lise Celular de Levedura 62

4.11 - Extração de DNA Plasmidial 62
4.12 - Soluções para eletroforese em gel de agarose 63
4.13 - Soluções para os ensaios imunológicos (Western e Dot blotting) 64
4.14 – Anticorpos 64
4.15 - Soluções para análise de proteínas em gel de Poliacrilamida Desnaturante 65
(SDS-PAGE)
4.16 - Revelação das Proteínas por Coloração do Gel com Nitrato de Prata 67
4.17 - Revelação das proteínas por coloração do gel com Azul de Comassie 68
4.18 - Outras soluções de uso rotineiro 68
5 – Métodos 70
5.1 - Cultivo e manutenção de microrganismos 70
5.2 - Digestão de DNA com endonucleases 70
5.3 - Eletroforese de Ácidos Nucléicos em Gel de Agarose 70
5.4 - Reações de defosforilação 70
5.5 - Ligação de fragmentos de DNA (Vetor-Inserto) 71
5.6 - Preparação de células bacterianas competentes para choque térmico 71
(CaCl2)
5.7 - Transformação de E. coli por choque térmico 71
5.8 – Preparação de DNA plasmidial em média escala por lise alcalina 72
(adaptado de Sambrook e Russel, 2001)
5.9 - Precipitação de DNA 73
5.10 - Purificação de fragmentos de DNA em gel de agarose 73
5.11 - Purificação e clonagem dos produtos de PCR 73
5.12 - Desenho dos oligonucleotídeos 74
5.13 - Reação em cadeia da polimerase (PCR) 74
5.14 - PCR de colônia 75
5.15 - Sequenciamento de DNA e análise das sequencias de nucleotídeos 75
5.16 - Preparo de células competentes de P. pastoris 76
5.17 - Transformação de células de P. pastoris por eletroporação 76
5.18 - PCR de colônia de levedura (adaptado Akada et al., 2000) 77
5.18.1 - Extração do DNA da levedura 77
5.18.2 - Reação de PCR 77
5.19 - Expressão do gene da Trx1 em P. pastoris. 78
5.19.1 - Construção dos vetores de expressão 78
5.19.1.1 - Construção do vetor pHTRX1 – Construção 1 78
5.19.1.2 - Construção do vetor pPTRX1 – Construção 2 80
5.19.2 - Transformação de células de P. pastoris 82
5.19.3 - Seleção dos transformantes produtores da Trx1 83
5.19.3.1 - Seleção por Dot Blotting 84
5.19.4 - Análise do perfil de proteínas produzidas pela P. pastoris em 85
condições de indução (adaptado do Manual do Kit de Expressão em P.
pastoris).


5.20 - Análise de proteína em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) 86

5.20.1 - Preparo da amostra de sobrenadante de cultura 86
5.20.2 - Condições da eletroforese em gel de poliacrilamida 86
5.21 - Coloração com nitrato de prata 86
6 – Resultados e discussão 88
6.1 – Obtenção do cDNA/Trx1 90
6.2 – Clonagem do cDNA/trx1 no vetor pHIL-D2 e pPIC9 91
6.3 – Transformação de P. pastoris 96
6.4 – Análise da produção de Trx1 por P. pastoris em placa Deepweel 103
6.5 - Análise da produção da proteína rTrx1 em frasco pela levedura P. pastoris 105
7 – Conclusões e perspectivas 110
8 – Referências bibliográficas 112


i

Lista de Figuras
Página
Figura 1 - Sistema enzimático envolvido na detoxificação das EROS e controle do
29
estado redox de grupos de proteínas sulfidril em Saccharomyces cerevisiae, com
suas interpelações.
Figura 2 - Estrutura da tiorredoxina de E. coli por RMN (Ressonância magnética 34
nuclear).
Figura 3 - Trx, TrxR e NADPH formam um sistema que opera de modo geral 34
como dissulfeto redutases.
Figura 4 - Estrutura da proteína Trx1 e Trx2. 35
Figura 5 - Via metabólica da oxidação do metanol em formaldeído na levedura P. 45
pastoris.
Figura 6 - Integração no genoma de P. pastoris, por inserção (A e B) e por 45
substituição do gene (C).
Figura 7 - Representação esquemática do mapa físico do vetor para clonagem de 53
produto de PCR pGEM®- T (Promega).
Figura 8 - Representação esquemática do mapa físico do vetor pHIL-D2 para 54
expressão em P. pastoris.
Figura 9 - Representação esquemática do mapa físico do vetor pPIC9 para 55
expressão em P. pastoris.
Figura 10 - Vetor de expressão construído para produção de Trx1 intracelular em 80
P. pastoris (pHTRX1).
Figura 11- Vetor de expressão construído para produção de Trx1 extracelular em 82
P. pastoris (pPTRX1).
Figura 12 - Análise eletroforética em gel de agarose 0,8%, corado com brometo 91


ii

de etídio, do produto de amplificação relativo ao cDNA trx1 obtido por PCR.
Figura 13 - Análise eletroforética em gel de agarose 0,8 %, corado com brometo 92
de etídio, do produto da digestão do vetor pGEM-TRX1.
de etídio, dos transformantes por PCR de colônia.
de etídio, do produto da digestão dos vetores pHTRX1 e pPTRX1.
Figura 16 - Representação das sequências de nucleotídeos obtidas a partir do 95
sequenciamento dos plasmídeos pHIL-D2 e pPIC9 no qual o cDNA/trx1 foi
clonado.
Figura 17 - Representação dos vetores linearizados para formação dos cassetes de 97
expressão introduzidos na levedura P. pastoris.
Figura 18 – Representação do vetor pHTRX1 linearizado para formação do 98
cassete de expressão introduzido na levedura P. pastoris.
Figura 19 - Representação do vetor pPTRX1 linearizado para formação do cassete 99
de expressão introduzido na levedura P. pastoris.
Figura 20 - Representação das placas de cultivo dos transformantes de P. pastoris 101
obtidos.
de etídio, para confirmar a presença do cDNA/trx 1 nas células de P. pastoris.
Figura 22 - Análise por Dot Blotting da produção da proteína recombinante Trx1 104
por P. pastoris.
Figura 23 - Análise do perfil eletroforético de proteínas do extrato periplasmático

106
dos transformantes que integraram o cassete de expressão pHTRX1/Sac 1 e
pHTRX1/Not I de P. pastoris em gel de poliacrilamida (15%) corado por


iii

comassie.
Figura 24 - Análise do perfil eletroforético de proteínas do sobrenadante de

106
cultura dos transformantes que integraram o cassete de expressão pPTRX1/Sac 1 e
pPTRX1/Bgl II de P. pastoris em gel de poliacrilamida (15%) corado por
comassie.
Figura 25 - Região C-terminal do fator-α mostrando os sítios de clivagem de 108
Kex2 e Ste13.


iv

Lista de tabelas
Página
Tabela 1 - Exemplos de proteínas de fungos expressas em P. pastoris. 47
Tabela 2 - Linhagem de E. coli utilizada e seu respectivo genótipo. 52
Tabela 3 - Linhagem de P. pastoris utilizada e seu respectivo genótipo. 53
Tabela 4 - Oligonucleotídeos utilizados. 57


v

Lista de abreviaturas
°C Graus Celsius
AOX 1 e 2 Genes da álcool oxidade 1 e 2
BCIP 5-Bromo-4-Cloro-Indolil fosfato
cDNA Ácido deoxirribonucléico complementar
dNTP Deoxirribonucleotídeo
DO Densidade óptica
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EROS Éspécie Reativa de Oxigênio
g Velocidade de sedimentação em unidade gravitacional
h Hora
HIS 4 Gene histidinol desidrogenase
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
Kb Kilobases
L Litro
M Molar
mg Miligrama
Mb Mega base
min Minutos
mM Milimolar
MM Massa molecular
NBT Nitro Blue Tetrazole
ng Nanograma
ORF Open Read Frame
p/v - Peso por volume
PAGE-SDS Gel desnaturante de poliacrilamida


vi

pb Pares de base
PBS Tampão fostato – Salina
PCR Reação de polimerização em cadeia
pH Potencial hidrogeniônico
PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonato
q.s.p. Quantidade suficiente para
RNA Ácido Ribonucleico
RNAse Ribonuclease
rpm Rotações por minuto
SDS Sódio dodecil sulfato
TEMED N,N,N’,N’-tetrametil etilenodiamina
Tm Temperatura de desnaturação
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
TRX 1 Tiorredoxina 1
U Unidade de atividade enzimática
UV Ultravioleta
v Volts
v/v volume por volume
X-gal 5-bromo-4-cloro-3indoxil-β-Dgalactopiranosídeo
YNB Yeast Nitrogen Base
μg Micrograma
μl Microlitro


vii

Resumo
O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é agente etiológico da

paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na América
Latina. P. brasiliensis está sujeito a estresse oxidativo (EO) causado pelas espécies reativas de
oxigênio (EROs), produzidas pelas células de defesa do hospedeiro humano. O sistema de
defesa do hospedeiro quando da invasão por patógenos gera EROs para combater este
invasor. P. brasiliensis ao penetrar no hospedeiro humano é fagocitado pelos macrófagos,
enfrentando um ambiente extremamente hostil devido ao oxido nítrico e peróxido de
hidrogênio. A Trx1 é uma proteína redox, intracelular, que participa da manutenção da
homeostase redox da célula, tanto em condições de EO quanto redutor. É ubiquitária e
caracterizada pelo sítio ativo típico CXXC, responsável pela oxidação, redução, ou
isomerização das pontes dissulfeto de proteínas. Em trabalho realizado anteriormente, foi
isolado, caracterizado e clonado em vetor de expressão pGEX4T-3 o cDNA codificante para
Trx1 de P. brasiliensis (número de acesso AY376435). A proteína recombinante
(recPbTRX1) foi produzida e parcialmente purificada e as células leveduriformes de P.
brasiliensis apresentaram expressão aumentada do gene codificante para Pbtrx1 em condições
de EO. O presente trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga de uma tiorredoxina do
fungo P. brasiliensis em Pichia pastoris, visando sua obtenção em maior quantidade para sua
a posterior caracterização bioquímica e aplicação em processos biotecnológicos. O cDNA do
gene da tiorredoxina 1 (trx1) de P. brasiliensis foi obtido via PCR utilizando como molde o
plasmídeo pGEX-Trx1 e clonado no vetor de expressão pHIL-D2 e pPIC9 (para expressão
intracelular e extracelular). A inserção do gene de interesse na orientação correta foi
verificada por seqüenciamento, apresentando homologia com a Trx1 de P. brasiliensis. Estes
vetores foram utilizados para transformar a linhagem SMD1168 da levedura P. pastoris com
genótipo his4-. A presença do cassete de expressão foi confirmada no genoma da levedura.
Não foram detectados transformantes capazes de secretar a proteína a partir da construção
com o vetor pPIC9 e a produção intracelular foi realizada a partir do vetor pHIL-D2.


viii

Abstract
The termodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of

paracoccidioidomycosis, a human systemic mycosis of high prevalence in Latin America. P.
brasiliensis is exposed to oxidative stress (OS) caused by reactive oxygen species (ROS)
produced by the defense cells of the human host. When the invasion by pathogens occurs, the
host defense system generates ROS to fight the invader. Inside the human host, P. brasiliensis
is phagocytosed by macrophages, facing an extremely hostile environment due to nitric oxide
and hydrogen peroxide. The Trx1 is an intracellular redox protein, which participates in the
maintenance of cell redox homeostasis, both in terms of OS as reducer. It is ubiquitous and is
characterized by typical CXXC active site, responsible for oxidation, reduction, or
isomerization of proteins’ disulfide bonds. In a previous work, it was isolated, characterized
and cloned into expression vector pGEX-4T-3 cDNA coding for TRX1 of P. brasiliensis
(accession number AY376435). The recombinant protein (recPbTRX1) was produced and
partially purified and the yeast cells of P. brasiliensis showed increased expression of the gene
coding for PbTRX1 in response to OS. This study aimed the heterologous expression of
cDNA of a thioredoxin of the fungus P. brasiliensis in Pichia pastoris, in order to obtain it in
larger amounts for their subsequent biochemical characterization and application in
biotechnological processes. The P. brasiliensis thioredoxin 1 (trx1) cDNA was obtained via
PCR using the plasmid pGEX-Trx1 as template and cloned into expression vector pHIL-D2
and pPIC9 (for intracellular and extracellular expression). The insertion of the interested gene
in the correct orientation was verified by sequencing and the homology was observed with
Trx1 P. brasiliensis. These vectors were used to transform the P. pastoris’ yeast strain
SMD1168 with his4- genotype. The presence of the cassette’s expression was confirmed in
the yeast’s genome. No transformants able to secrete the protein from the building with the
vector pPIC9 were detected and the intracellular production was carried from the pHIL-D2
vector.


\ÇàÜÉwâ†ûÉ
“o caminho histórico de todas as ciências só leva

a seus pontos de partida efetivos
depois de numerosos desvios e rodeios.
Ao contrário de outros arquitetos,
a ciência não apenas projeta castelos no ar
como também constrói diversos andares habitáveis do edifício
antes de lançar os seus alicerces” (Karl Marx)


23

1 - Introdução
1.1 - Biologia e aspectos gerais do fungo Paracoccidioides brasiliensis
O fungo Paracoccidioides brasiliensis foi inicialmente descrito por Adolf Lutz em
1908, é um fungo dimorfico e patogênico ao homem. O fungo P. brasiliensis pertence ao
reino Fungi; filo Ascomycota; subdivisão Euascomycotina; classe Plectomyceto; subclasse
Euascomycetidae; ordem Onygenales; família Onygenaceae; sub-família Onygenaceae
Anamórficos; gênero Paracoccidioides, espécie única Paracoccidioides brasiliensis (San
Blas et al., 2002).
O fungo termodimórfico P. brasiliensis é um patógeno humano agente etiológico da
Paracoccidioidomicose (PCM). Uma micose sistêmica, principalmente, em países da América
Latina (Restrepo e Tobon, 2005). A maioria dos casos é registrada no Brasil seguido por
Colômbia e Venezuela (Coutinho et al., 2002). O fungo P. brasiliensis é encontrado como
levedura nos tecidos infectados ou quando cultivados in vitro a 37 ºC e sob a forma miceliana
(infectiva) em condições saprobióticas no meio ambiente ou quando cultivado em
temperaturas inferiores a 28 ºC (Baglagli et al., 2006).
O nicho ecológico de P. brasiliensis ainda não está completamente esclarecido,
entretanto algumas hipóteses são descritas. Presume-se que o fungo P. brasiliensis ocorra
normalmente em ambientes úmidos, próximos a rios, onde possa ser protegido por
representantes de espécies aquáticas heterotérmicas como moluscos, anfíbios, peixes e
artrópodes. Estes organismos estariam fornecendo ao parasita nutrientes, umidade,
competição biológica limitada e temperatura apropriada para a sobrevivência do micélio no
meio ambiente (Conti-Diaz, 2007).
Apesar do considerado volume de estudos realizados sobre P. brasiliensis, a
organização cromossômica, tamanho do genoma e composição genética deste patógeno ainda
não é bem conhecida. Estima-se que o fungo possua de 4 a 5 cromossomos, com o tamanho


24

do genoma de 30 Mb e entre 7.500 e 9.000 genes (Cano et al., 1998; Feitosa et al., 2003;
Reinoso et al., 2005).
A interconversão das formas micelianas em leveduriformes faz parte do ciclo
biológico do fungo, sendo, portanto, condição para o estabelecimento da infecção. O fungo P.
brasiliensis, assim como outros fungos patogênicos tais como Blastomyces dermatidis,
Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis, Sporothrix schenkii e Penecillium marnefii
apresentam habilidade de transitar entre a forma miceliana e leveduriforme, o que parece ser
um importante mecanismo de virulência para patogenicidade de fungos dimórficos
(Kurokawa et al., 1998; Klein e Tebbets, 2007).
A temperatura é um dos estímulos mais notórios no dimorfismo de fungos, porém
fatores nutricionais também podem interferir neste processo. A adição de soro fetal de bezerro
em meio de cultura complexo e quimicamente definido permitiu preservar a expressão
fenotípica de leveduras de P. brasiliensis a 25 ºC (Villar et al., 1988). Fatores hormonais
também têm sido relacionados ao dimorfismo de P. brasiliensis. Pesquisas sobre a ação de
esteróides neste fungo mostram que o hormônio 17--Estradiol inibe a transição da forma
miceliana para leveduriforme, tanto in vitro de maneira dose-dependente (Restrepo et al.,
1985) como in vivo (Sano et al., 1999). A alta incidência de PCM em adultos masculinos
sugere que fatores hormonais possam desempenhar papel na patogênese da doença (Sano et
al., 1999). Aristizabal et al., (2002) observaram, in vivo, a participação do hormônio feminino
na resistência de fêmeas de rato ao desenvolvimento inicial da PCM.
Acredita-se que a transição de micélio para levedura seja um importante fator de
virulência e essencial para o estabelecimento da infecção. A infecção ocorre pelas vias aéreas
superiores através da inalação de conídios, considerados a forma infectante do fungo. Nos
alvéolos pulmonares ocorre a conversão dos conídios em leveduras, dando origem ao foco


25

infeccioso inicial, de onde o fungo pode disseminar-se para diferentes órgãos e tecidos (San
Blas et al., 2002, Nemecek et al., 2006).
A conversão morfogenética está relacionada com mudanças na composição da parede
celular do fungo. Na forma miceliana há o predomínio da -1,3 glicana, enquanto que, na
forma de levedura, o principal polissacarídeo é -1,3 glicana. Quitina é encontrada em ambas
as formas do fungo (San-Blas et al., 1987, Kurokawa et al., 1998), sendo em maior teor em
leveduras quando comparados com micélio. Estudos realizados a partir do isolamento de P.
brasiliensis sugerem que a -1,3 glicana protege o fungo contra o ataque de enzimas
digestivas de leucócitos e macrófagos no tecido infectado (Kurokawa et al., 1998). Foi
sugerido que fagócitos humanos poderiam produzir -1,3-glicanase com a capacidade de
digerir somente -1,3 glicana, presente na parede celular dos fungos da forma miceliana.
Entretanto, a transformação do fungo para a forma leveduriforme logo no início da infecção,
devido ao maior teor de -1,3 glicana, protegeria o patógeno contra a ação das enzimas
fagocitárias, possibilitando a instalação do fungo no hospedeiro (San-Blas e San-Blas, 1982).
Os genes relacionados com a biossíntese dos componentes da parece celular de P.
brasiliensis tais como -1,3 glicana sintase (ags), quitina sintase (chs), manosiltransferases,
glucosamina 6-fosfato acetil transferase (gna) são considerados potenciais fatores de
virulência bem como potenciais alvos antifúngicos (Felipe et al., 2005; Tavares et al., 2005).
Alguns genes de P. brasiliensis, já caracterizados, apresentam expressão diferencial
durante a transição dimórfica do fungo. Os genes codificantes para as proteínas de choque
térmico HSP70 (Silva et al., 1999), HSP60 (Salem-Izacc et al., 2001; Cunha et al., 2002), a
proteína homóloga a flavodoxina Pb Y20 (Daher et al., 2005), a chaperona ClpB (Jesuino et
al., 2003), manosiltransferase (Costa et al., 2002), catalase peroximal (Moreira et al., 2004),
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Barbosa et al., 2004), HSP30 e alfa-trealose-fosfato
sintase (Borges et al., 2010) e Tiorredoxina 1 (Domingos, 2006) são mais expressos na forma


26

leveduriforme, quando comparados a forma miceliana, sugerindo que essas proteínas seriam
importantes fatores na composição de estratégias para morfogênese e sobrevida de P.
brasiliensis nas condições térmicas do hospedeiro.
1.1.2 – Paracoccidioidomicose
A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose humana sistêmica granulomatosa,
enfermidade de alta prevalência e morbidade que acomete parcelas da população com menor
capacidade de acesso a serviços de saúde, em áreas limitadas somente a alguns países da
América Latina (Restrepo et al., 2001). O fungo P. brasiliensis infecta o hospedeiro humano
usualmente através das vias respiratórias, por inalação de propágulos do micélio e
artroconídeos (Bagagli et al., 2006).
A doença afeta principalmente trabalhadores do sexo masculino, apresentando uma
taxa global de 13 homens para cada mulher doente (Brummer et al., 1993). A moléstia
acomete preferencialmente trabalhadores que estão em contato com o solo, como os
agricultores, entre 30 a 60 anos de idade (Svidzinski et al., 1999; Villar et al., 2000).
O progresso da patologia e a diversidade das formas clínicas dependem dos fatores
imunológicos do hospedeiro (Franco, 1987) e dos diferentes níveis de virulência dos diversos
tipos de isolados do fungo (Panunto-Castelo et al., 2003, San-Blas e Niño-Vega, 2001). A
maioria dos indivíduos infectados desenvolve apenas a infecção assintomática, a qual acomete
principalmente indivíduos sadios que vivem em áreas endêmicas. Em alguns indivíduos, a
infecção pode progredir originando a doença com manifestações clínicas do tipo aguda (tipo
juvenil) ou crônica (tipo adulto).
A PCM é caracterizada por ser uma doença de padrão granulomatoso. A resposta
imune celular e a formação de lesões granulomatosas fornecem uma resposta protetora
máxima do hospedeiro (migração, diferenciação e ativação de macrófagos) contra patógenos


27

intracelulares (Rumbley e Phillips, 1999). P. brasiliensis pode se apresentar como patógeno
intracelular facultativo, capaz de sobreviver e se multiplicar no interior de macrófagos
murinos e humanos não ativados e células epiteliais (Brummer et al., 1989; Moscardi-Bacchi
et al., 1994).
1.2 – Espécies reativas de oxigênio e defesas antioxidantes em fungos
Sies (1993) define “estresse oxidativo” como um desequilíbrio na célula ou no
organismo entre os oxidantes e os antioxidantes em favor dos oxidantes. O estresse oxidativo
causa danos em diferentes macromoléculas celulares, e tem sido relacionado a uma série de
doenças humanas (Halliwell e Gutteridge, 2007).
Os fungos, bem como outros organismos, dependem de mecanismos de defesa
antioxidante para proteção contra danos oxidativos (Giles et al., 2006). Um pré-requisito para
o sucesso do fungo patogênico humano é a sua capacidade de defesa contra espécies reativas
de oxigênio (EROS) induzidas por células do hospedeiro no curso de uma infecção.
Espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e as de cloro são geradas através das ações
de defesa dos fagócitos a fim de proteger os mamíferos de microrganismos invasores. Este
complexo de resposta imune inata é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro.
Deficiência em enzimas dos fagócitos do hospedeiro envolve a geração de EROS e resulta no
aumento da susceptibilidade de infecções fungicas ou bacterianas (Aratani et al., 2000,
Aratani et al., 2002).
A sobrevivência de fungos patogênicos no hospedeiro humano depende da resposta do
sistema imune do hospedeiro e da adaptação do fungo ao novo ambiente (Campos et al.,
2005). Patógenos, incluindo o fungo termodimórfico P. brasiliensis, têm a capacidade de
sobreviver ou adaptar a esse ataque oxidativo e contornar a inata resposta imune. A


28

capacidade de um microrganismo de sobreviver e proliferar em um ambiente hostil requer
muitas defesas, incluindo a indução de enzimas antioxidantes (Pedrajas et al., 2000).
Estes mecanismos antioxidantes têm-se mostrado importantes não só para a resistência
a EROS, nitrogênio e as espécies de cloro, mas também para a sobrevivência no hospedeiro
(Brenot et al., 2004, Missall et al., 2004, de Jesus-Berrios et al., 2003). Estas enzimas
antioxidantes além de serem importantes para a virulência de fungos patogênicos podem
também servir como excelentes alvos para a terapia antifúngica.
EROS tais como o ânion superóxido (O2¯), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical
hidroxil (HO˙) são geradas nas células como os maiores subprodutos da respiração e por
diversas reações químicas, radiações ionizantes ou altas pressões de oxigênio (Halliwell e
Gutteridge, 2007).
As EROS se constituem em uma variedade de moléculas derivadas do oxigênio
molecular e enquanto radicais livres são espécies com um ou mais elétrons desemparelhados
(Halliwell e Gutteridge, 2007). As EROS são extremamente reativas e causam danos aos
componentes celulares, incluindo DNA, proteínas, lipídeos, podendo levar à morte celular
(Halliwell e Gutteridge, 1999). Os organismos desenvolveram vários mecanismos de defesa
antioxidante para manter e proteger as células destes danos oxidativos (Figura 1).


29

Figura 11. Sistema ennzimático en

nvolvido naa detoxificação das ERO
OS e controlee do estado redox de
grupos de proteínaas sulfidril em
e Saccharoomyces cereevisiae, com suas intereelações (Adaaptado de
Herrero et al., 2008).
z
E
EROS são geradas in
nevitavelmennte em céllulas que see desenvolvvem em am
mbientes
aeróbicoos, como suubproduto de

d processoos metabóliccos normais que ocorrrem na mito
ocôndria
(respiraação) e noss peroxissom

mos (-oxiidação de ácidos
á xos), bem como em sistemas
grax
enzimátticos no citoplasma
c (lipoxigennases, nico
otinamida adenina
a diinucleótido fosfato
(NADPH), oxidasees e citocrom

mo P450). Esstudos mosttram que a mitocôndria
m a é responsáável pela
maior pprodução endógena

e de EROS nnas células (Boveris e Chance, 1973; Halllywell e
Gutteriddge, 1989). Cerca de 1-4% do ooxigênio con

nsumido peela mitocônndria são reeduzidos
incomplletamente pela
p cadeia de transpoorte de elétrrons, gerand
do EROS (K
(Kwon et al., 2003;
Turrenss, 2003).
Clonagem e expressão do geene da tiorredoxin

na 1 de Paracocccidioides brasilien
nsis em Pichia pa
astoris
Lorena Carrdoso Cintra

30

A estrutura e a função das proteínas podem ser alteradas pelas EROS produzidas pelo
metabolismo celular ou por agentes oxidantes externos. Embora catalases, superóxido
dismutases e peroxidases contribuam para a manutenção de níveis não-tóxicos de EROS,
alterações nas cadeias laterais de aminoácidos podem ocorrer. Em particular, a modificação
oxidativa de grupos sulfidrílicos em proteínas pode ser um processo de duas facetas: pode
levar ao comprometimento da função da proteína, ou, dependendo do estado redox dos
resíduos de cisteína, pode ativar vias específicas envolvidas na regulação de funções
celulares. Em células de leveduras, os sistemas tiorredoxina e glutarredoxina participam na
regulação redox em diferentes compartimentos celulares (Herrero et al., 2008)
Outros estudos mostram que EROS também estão associadas a algumas funções
fisiológicas essenciais para um organismo vivo, como a regulação da proliferação celular e a
geração de EROS por células fagocíticas promovendo a defesa do hospedeiro no combate às
infecções (Finkel e Holbrook, 2000; Galaris e Evangelou, 2002). Estudos em P. brasiliensis
mostram que a produção de Interferon-gamma (IFN-γ) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-
α) por macrófagos induzem a síntese de óxido nítrico (ON). Este, por sua vez, inibe a
transformação de conídios para a forma leveduriforme, causando a morte deste fungo
(Gonzales et al., 2000).
Outro papel fisiológico importante de EROS é o de mensageiro celular, regulando o
metabolismo (Nemoto et al., 2000), o ciclo celular e a expressão de genes, bem como a
participação destes nas vias de transdução de sinal (Allen e Tresini, 2000; Vivancos et al.,
2004). Desta forma, pode-se observar que os efeitos benéficos e deletérios de EROS exercem
influências em diversos processos biológicos e na integridade celular.
Os organismos aeróbicos têm desenvolvido sistema de defesa contra EROS por meio
da síntese de enzimas antioxidantes, como catalases (Chagas et al., 2008), peroxidases e
superóxido dismutase (SOD), citocromo c peroxidase e tiorredoxinas. Este sistema de defesa


31

contra EROS ocorre, ainda, por meio de proteínas que protegem as biomoléculas contra danos
por outros mecanismos, como as proteínas de choque térmico e as moléculas não enzimáticas
de baixo peso molecular que removem os radicais livres, a exemplo das moléculas lipofílicas,
como retinol e α-tocoferol (vitamina E) (Evans e Halliwell, 2001), glutationa, bilurrubina,
ácido úrico (antioxidante hidrofílico), flavonóides e carotenos incluindo vitamina A. A
composição das defesas antioxidantes da célula varia de acordo com o tipo celular (Halliwell
e Gutteridge, 1999).
Vários genes descritos como responsáveis pela defesa antioxidante dos organismos
foram identificados no transcriptoma de P. brasiliensis (Dantas et al., 2008). Dentre estes:
catalase, superóxido dismutase, peroxirredoxina, citocromo-c-peroxidase, glutationa,
tiorredoxina, tiorredoxina redutase e alguns fatores de transcrição relacionados com a resposta
ao estresse oxidativo (Moreira et al., 2004; Campos et al., 2005; Felipe et al., 2003; 2005).
Enzimas como as Tiorredoxinas (Trxs) e glutaredoxinas (GRXs) regulam o estado
redox das proteínas e, portanto, surgem como importantes reguladores das funções celulares e
vias de sinalização (Shelton et al., 2005, Fernandes e Holmgren, 2004). As glutarredoxinas
(GRX) também são Trxs que contêm um sítio ativo dissulfeto redox e um sítio de ligação para
GSH. As GRXs estão relacionadas com o sistema oxirredutase de dissulfetos de proteínas
(Nordberg e Arnér, 2001). Marques et al. (2004) mostraram que as glutarredoxinas são
altamente expressas na fase leveduriforme de P. brasiliensis, quando comparadas com a fase
miceliana.
P. brasiliensis é um parasita intracelular de humanos, e assim como todos parasitas
intracelulares, ele tem que eliminar os metabólitos tóxicos endógenos e ao mesmo tempo
resistir aos efeitos dos EROS produzidos pelo sistema de defesa do hospedeiro (Rappleye e
Goldman, 2006). Pode-se inferir desta forma, que a presença da Trx e TrxR juntamente com


32

outras proteínas que respondem ao estresse oxidativo em P. brasiliensis contribua para a
viabilidade deste patógeno no hospedeiro, favorecendo desta maneira a instalação da infecção.
1.3 - Tiorredoxina
No citoplasma das células as tiol-dissulfeto redutases são requeridas para a redução de
proteínas que se tornam oxidadas como resultado de sua atividade enzimática. Em alguns
compartimentos extracitoplasmáticos, outras tiol-dissulfeto são necessárias para catalisar o
processo oposto: a formação de pontes dissulfeto em proteínas (Debarbieux e Beckwith,
1998). Estas proteínas participam da manutenção da homeostase redox da célula em ambas as
condições de estresse, oxidativo e redutor (Carmel–Harel e Storz, 2000). Uma das principais
proteínas desta via de redução envolve a tiorredoxina (Trx).
Trx foi primeiramente descrita em 1964 em Escherichia coli, como uma doadora de
elétrons para a ribonucleotídeo redutase, uma enzima requerida para a síntese de DNA
(Laurent et al., 1964). Membros da família Trx, posteriormente, foram encontrados em um
grande número de espécies eucarióticas e procarióticas (Holmgren, 1985; Nakamura et al.,
1997; Follmann e Haberlein, 1995). O primeiro relato de uma Trx em mamíferos ocorreu em
1967 por Moore (Moore, 1967), que descreveu e posteriormente purificou a proteína do
hepatoma de Novikoff (Herrmann e Moore, 1973). Trx em humanos foi identificada por
outros pesquisadores, sob outros nomes como, por exemplo, a interleucina-1 (IL-1), citocina
produzida pelo vírus Epstein-Barr (EBV) – células linfoblastóides-B infectadas (Wakasugi et
al. 1987).
As Trxs atuam em diversas funções celulares como redutases no controle da
homeostase redox (Holmgren, 1985), protegem proteínas contra danos oxidativos e inativação
(Holmgren, 1985, Holmgren e Bjornstedt, 1995), atuam na regulação da morte celular
programada (Ravi et al., 2005) e na via de nitrosilação (Benhar et al., 2008). A Trx é um


33

oxidante capaz de reduzir o peróxido de hidrogênio, de eliminar radicais livres e de proteger
as células contra o estresse oxidativo (Trotter e Grant, 2002, Garrido e Grant, 2002) e outros
tipos de estresses (Messens e Silver, 2006). Além de todas essas funções citadas, algumas
Trxs atuam como fator de crescimento (Powis et al., 2000), promovem o dobramento de
proteínas (Kern et al., 2003), modulam a resposta inflamatória (Nakamura et al., 2005) ou
desempenham importantes funções no ciclo de vida de vírus e fagos (Holmgren, 1989).
Os organismos desenvolveram um subconjunto especializado de TRXs que estão
localizados em vários compartimentos celulares. Por exemplo, algumas TRXs são abundantes
no citoplasma (Arner e Holmgren, 2000), enquanto outras são translocadas para o núcleo
(Hirota et al., 1997, Hirota et al., 1999) ou mitocôndria (Pedrajas et al., 1999), associadas
com a membrana celular (Martin e Dean, 1991) ou secretadas para o meio extracelular
(Martin e Dean, 1991; Xu et al., 2008).
As Trxs possuem uma sequência conservada (-Cys-X-X-Cys-) no seu sítio ativo e na
maioria dessas enzimas, este sítio está localizado em um domínio comum denominado de
domínio Trx-like (Pedrajas et al., 1999; Martin, 1995). Os resíduos de cisteína encontrados no
sítio catalítico são os principais agentes responsáveis pela quebra de pontes dissulfeto nos
substratos protéicos oxidados e por consequência são essenciais para a atividade das Trxs.
A primeira análise da estrutura de uma proteína Trx foi descrita por Holmgren e
colaboradores em 1975. Hoje, o cristal e a resolução das estruturas de muitas Trxs, oxidada e
reduzida, são descritos (Collet e Messens, 2010). Essas proteínas compartilham uma
arquiterura 3-D comum e é conhecida como motivo Trx, que consiste em 4 α-hélices e 5
folhas-β (Eklund et al. 1991; Holmgren 1995; Martin 1995; Capitani et al. 2000) (Fig. 2).
Quando a Trx está em seu estado reduzido, Trx -(SH)2, as duas cisteínas do sítio ativo
formam um grupo ditiol que é capaz de catalizar a redução de pontes dissulfeto em várias


34

proteínaas. No seu estado

e oxid
dado (Trx -S
S2), a Trx pode ser reduzida pelo N
NADPH attravés da
ação cattalítica da flavoenzima

fl a tiorredoxinna redutase (TrxR) (Fig
g. 3)
Figura 2 – Estruturra da tiorreedoxina de E E. coli por RMN

R (Resso
onância maggnética nuclear). As
cisteínass do sítio ativvo (C32 e C3
35) são indicaadas em amaarelo. (Adapttado de Kum
mar et al., 200
04).
Figura 3 - Trx, TrxxR e NADP PH formam um sistema

a que opera de modo geeral como dissulfeto
d
redutasees (adaptadoo Collet e Meessens, 2010)).
A Trx tem sido estud

dada exausttivamente em
e humanos pelo fatoo de que ass células
canceroosas apresenntam níveis elevados ddesta proteíína e que níveis reduziidos de Trx
x celular
são indiicativos de risco de deesenvolvimeento de câncer (revisto

o em Kontouu et al., 200
04). Nas
plantas, o sistemaa tiorredoxin

na é particcularmente complexo, pois foram
m encontrad
dos pelo
menos 220 isoformaas de Trxs (rrevisto em G

Gelhaye et al.,
a 2005).

nsis em Pichia pa
astoris

35

1.3.1 - A super fam

mília Tiorredoxina
A família tiorredoxina inclui ass tioltransfeerases cujoss membross melhor esstudados
encontraados no cittoplasma sãão tiorredoxxinas 1 e 2 (TrxA e TrxC)

T (Miraanda-Vizuette et al.,
1997; S
Stewart et al.,
a 1998) e glutarredooxinas 1, 2, 3 (GrxA, GrxB, GrxxC) (Aslun
nd et al.,
1994). Também innclui uma série de pproteínas eu

ucarióticas que pertenncem à fam
mília de
proteínaas dissulfetto isomerase (PDI), coomo a PDII, ERp57, PDIp, P5, Erp72, PD
DIR e os
membroos da subfaamília PDI-D

D, que tam
mbém contêm
m domínios evolutivam
amente relaccionados
com tioorredoxina. Algumas prroteínas de bactérias, como

c DsbA
A, DsbC, D sbD, DsbG
G e DsbE
de E. cooli, promovvem a form

mação de poonte dissulfeeto em protteínas peripplásmicas e também
contêm domínios tiiorredoxinaa (Carvalho et al., 2006

6).
A
Além das cisteínas
c do
o sítio ativvo, a Trx 1 também contém
c maais três resííduos de
cisteínaa nas posiçõões 62, 69 e 73 (Fig. 4). Estas cisteínas

c são
o frequenteemente relaccionadas
com moodificações estruturaiss e pós-tradducionais, incluindo glutationilaç

g ção, oxidaçção e S-
nitrosilaação e conttribuem para a regulaçção da funçãão Trx (Haendeler, 20006). Trx 1 também
forma hhomodímeroos dissulfetto ligados através do resíduo daa cisteína-733 (Weichseel et al.,
1996).
Figura 4 - Estrutu ura da proteína Trx1 e Trx2. A Trx1 T é citoplasmática enquanto a Trx2 é
mitocon
ndrial. A Trxx1contem maais três cisteíínas adicionaais que estão
o relacionadaas com váriass funções
(Haendeeler, 2006) (A
Adaptado de Tonissen e TTrapani, 2009).

nsis em Pichia pa
astoris

36

Embora as enzimas da superfamília tiorredoxina não tenham um nível elevado de
similaridade em sua sequência elas compartilham um acentuado grau de semelhança
estrutural, tendo todos em comum a sequência CXXC no sítio ativo. A cisteína do N-terminal
deste motivo é desprotonado em pH fisiológico e exposta e é designada como cisteína
nucleofílica. A outra cisteína normalmente é protonada. A natureza dos aminoácidos entre
estas duas cisteínas varia muito entre as diferentes enzimas. Esta região é altamente
conservada e está presente no final de uma α-hélice em todas as enzimas pertencentes à
superfamília (Carvalho et al., 2006).
1.3.2 - Tiorredoxina em mamíferos
Camundongos C57BL/6 transgênicos (Trx1 Tg) contendo Trx humana super expressa
sob o controle do promotor de β-actina, são mais resistentes em vários tipos de estresse
oxidativo. Camundongos Trx1 Tg foram mais resistentes à cardiotoxicidade induzida por
adriamicina (Shioji et al., 2002), ao vírus da gripe (Nakamura et al., 2002), a bleomicina ou
citocina inflamatória induzida por pneumonia intersticial (Hoshino et al., 2003) e ao enfisema
induzido por cigarro (Sato et al., 2008). Camundongos transgênicos Trx1-Tg também se
mostraram resistentes à isquemia renal (Kasuno et al., 2003), hepatite aguda ou crônica
(Okuyama et al., 2003; Okuyama et al., 2005), doenças intestinais inflamatórias (Tamaki et
al., 2006) e pancreatite aguda (Ohashi et al., 2006). Além disso, os camundongos
transgênicos sobreviveram mais tempo do que os controles (Mitsui et al., 2002).
Nos últimos anos, o sistema TRX tem sido cada vez mais ligado ao desenvolvimento e
expressão de fenótipos de câncer. Níveis elevados de Trx e TrxR são encontrados em
diferentes tipos de tumor comparados com os níveis observados em células saudáveis
provenientes dos mesmos pacientes (Soderberg et al., 2000, Shao et al., 2001). Os tumores
super-expressam tanto Trx quanto TrxR. Tais tumores têm uma elevada capacidade de


37

proliferação, uma taxa baixa de apoptose e um elevado potencial metastático. Estes dados
implicam o envolvimento do sistema TRX nos processos de oncogênese e tumorigênese,
confirmando seu potencial como um alvo para a terapia anticâncer em uma ampla variedade
de tumores humanos (Powis e Kirkpatrick, 2007). O aumento dos níveis de TRX também é
associado com a resistência a drogas quimioterápicas incluindo a cisplatina (Yamada et al.,
1996) e o docetaxel (Kim et al., 2005) e são responsáveis pelos baixos níveis de EROs nas
células humanas (Ungerstedt et al., 2005).
Apesar de não apresentar peptídeo sinal de secreção, a Trx1 pode ser encontrada em
níveis elevados no plasma em resposta ao estresse oxidativo extracelular, o que a torna um
bom marcador de estresse oxidativo (Nakamura et al., 2006). Além disso, a Trx1 apresenta
efeito antiinflamatório no meio extracelular o que a torna boa candidata como agente
terapêutico contra a inflamação aguda (Nakamura et al., 2008). Pantenaude e colaboradores
(2005) observaram que camundongos que super expressavam o gene codificante para Trx-1
apresentavam maior tempo de vida e eram relativamente resistentes aos danos no cérebro
mediados por isquemia.
1.3.3 - Tiorredoxina em bactérias
Tiorredoxina 1 (Ec-Trx1) e Tiorredoxina 2 (Ec-Trx2) são duas redutases presentes no
citoplasma de E. coli. Ec-Trx1, que contém 108 aminoácidos, tem sido o grande paradigma da
superfamília das Trxs. A Ec-Trx1 é necessária para o crescimento de vários bacteriófagos
incluindo T7, M13 e F1 (Russel, 1991). Para esta função, Ec-Trx1 se liga a uma DNA
polimerase codificada pelo genoma viral e aumenta a sua processabilidade pela remodelação
da proteína para favorecer a interação com o DNA e outras proteínas de replicação (Ghosh et
al., 2008, Hamdan et al., 2005).


38

Em 1974, Chamberlim e colaboradores isolaram uma cepa mutante com eliminação
completa da Ec-Trx1, entretanto observou-se a existência de outras proteínas citoplasmáticas
capazes de reduzir a ribonucleotídeo redutase. A partir de então, as buscas por outras
moléculas doadoras de hidrogênio se intensificaram, levando à descoberta de várias
glutarredoxinas e de uma segunda tiorredoxina, Ec-Trx2 (Miranda-Vizuete et al., 1997).
A Ec-Trx1 é uma oxidase que promove a formação da ligação dissulfeto (Debarbieux
e Beckwith, 1998). Da mesma forma, tanto a Ec-Trx1 quanto a Ec-Trx2 promovem a
formação da ligação dissulfeto em um citoplasma mais oxidado em cepas mutantes para TrxR
(Bessette et al., 1999; Stewart et al., 1998).
Embora os dois genes codificantes para Trxs não sejam essenciais para a viabilidade
de E. coli (Ritz et al., 2000), a Trx 1 é necessária para a viabilidade de uma série de outras
bactérias, por exemplo, Sphaeroides rhodobacter (Pasternak et al. 1997), Bacillus subtilis
(Scharf et al. 1998), Anacystis nidulans (Muller e Buchanan, 1989) Synechocystis sp. PCC
6803 (Navarro e Florêncio, 1996).
As Trxs também são capazes de interagir com um grande número de proteínas,
apresentando propriedade de chaperona (Caldas et al., 2007). Em E. coli as Trxs se associam
com Hsp90 e GroES, ambas relacionadas com enovelamento e degradação de proteínas
(Kumar et al., 2004). Sugerindo assim, que as Trxs interagem favoravelmente com as
proteínas.
A análise do proteoma de E. coli resultou na identificação de várias proteínas
tiorredoxina-alvo (Kumar et al., 2004). Um total de 80 proteínas foi encontrado associadas a
Trx1, implicando a participação da tiorredoxina em pelo menos 26 processos celulares
distintos que incluem a divisão celular, regulação da transcrição, transdução de energia, o
dobramento de proteínas e degradação, e várias vias biossintéticas.


39

Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio são geradas por células de mamíferos e
células de plantas como uma estratégia de defesa contra infecções bacterianas. Portanto, as
tiorredoxinas não são importantes apenas para a resposta ao estresse oxidativo em bactérias
não patogênicas, mas também podem influenciar a sobrevivência de patógenos em células do
hospedeiro. Mycobacterium leprae abriga uma gene híbrido de tiorredoxina-tiorredoxina
redutase que aumenta a sobrevivência intracelular do Mycobacterium smegmatis (Wieles et
al., 1997).
As Trxs desempenham importantes funções celulares em todos os organismos vivos.
Em bactérias, os genes codificantes para Trx são frequentemente regulados por fatores
externos e de certa forma esta proteína interfere na expressão de muitos outros genes
importantes (Zeller e Klug, 2006; Messens e Collet, 2006).
1.3.4 - Tiorredoxina em fungos
Estudos genômicos têm mostrado que as Trxs de levedura têm funções similares nos
outros organismos. As leveduras apresentam dois genes que codificam Tiorredoxinas
citoplasmáticas (Trx1 e Trx2) que são importantes durante condições normais de crescimento
(Gan, 1991; Muller, 1991). A supressão de ambos Trx1 e Trx2 em Saccharomyces cerevisiae
afeta o ciclo celular, resultando em uma fase S prolongada e um intervalo G1 reduzido e são
auxotróficos para aminoácidos sulfurados (Muller, 1991).
Na levedura S. cerevisiae, existem duas Trxs citosólicas (Sc-Trx1, Sc-Trx2) e uma
mitocondrial (Sc-Trx3) (Herrero et al., 2008). Mutantes para Sc-Trx3 são hipersensíveis ao
hidroperóxido. A Sc-Trx3 parece funcionar como um antioxidante contra EROs geradas nas
mitocôndrias (Pedrajas et al., 1999). Em S. cerevisiae as tiorredoxinas (Trx1 e Trx2) e a TrxR
também são requeridas para proteção contra estresse redutivo induzido por ditiotreitol (DTT)
(Trotter e Grant, 2002).


40

O fungo patogênico Cryptococcus neoformans codifica duas tiorredoxinas (Trx1 e
Trx2) que são transcricionalmente induzidas em resposta ao estresse oxidativo e nitrosativo,
além de serem importantes fatores de virulência (Missall et al., 2004, Missall e Lodge, 2005).
Demasi et al. (2006) demonstraram que a tiorredoxina peroxidase I é extremamente
importante na proteção de leveduras com disfunção mitocondrial devido a sua capacidade de
atuar tanto como antioxidante, chaperona e moduladora da expressão gênica.
Estudos relacionados ao estresse oxidativo em S. cerevisiae foram realizados neste
mesmo organismo por Le Moan e colaboradores (2006), onde em um estudo proteômico de
oxidação dos grupos tióis mostraram a importância do sistema Trx frente ao estresse
oxidativo gerado por H2O2. Os autores observaram que, na presença de H2O2, as células
desprovidas do sistema Trx funcional, apresentavam um aumento das enzimas relacionadas
com o metabolismo de H2O2. Este resultado demonstra a alta eficiência do sistema Trx na
redução do H2O2 nesta levedura.
A proteína Trx foi também observada em Schizosaccharomyces pombe, tendo sido seu
gene isolado e caracterizado, correspondendo à primeira descrição deste gene neste organismo
(Cho et al., 2001). Em 2002, outro gene codificante para uma putativa Trx mitocondrial
(Trx2) foi clonado e sequenciado neste mesmo fungo (Lee et al., 2002).
Linhagens de S. cerevisiae usadas para fabricação de vinhos, adaptadas para a
fermentação anaeróbica, sofrem estresse oxidativo quando são cultivadas em condições
aeróbicas para propagação de biomassa no processo industrial. Gómez-Pastor e colaboradores
(2010) demonstraram que a super expressão de trx2 nessas linhagens as torna mais resistentes
ao estresse oxidativo, ou seja, apresentam uma defesa redox reforçada e aumentaram os níveis
de biomassa produzida.


41

Da Silva Dantas e colaboradores (2010) mostraram que a Trx1 em C. albicans, além
da sua atividade antioxidante, apresenta um papel importante na coordenação da resposta as
EROs por múltiplas vias de sinalização e auxiliam na sobrevivência do fungo no hospedeiro.
Em trabalho apresentado pelo nosso grupo, por Domingos (2006), foi realizada a
caracterização de um cDNA de 811 pb, designado como Pbtrx1, que codifica para uma
proteína, PbTRX1, de 116 resíduos de aminoácidos com massa molecular predita de ~12 kDa
e pI de 5,2. PbTRX1 apresentou um motivo de sítio ativo conservado (WCGPC) entre as
Trxs. A análise filogenética da PbTRX1 e Trxs de outros organismos localizou a PbTRX1 no
clado de fungos. Foi também realizada a predição da estrutura secundária da PbTRX1, que
apresentou um padrão característico formado por cadeias-β que estão envolvidas por α-
hélices. Foi realizada a expressão heteróloga em E. coli e a expressão e purificação parcial da
proteína recombinante foi obtida. Foi demonstrado que a rPbTRX1 apresenta atividade
redutora de insulina e que os níveis de transcritos de Pbtrx1 foram maiores nas células
leveduriformes tratadas com H2O2 do que nas células não tratadas e a partir destes resultados,
é possível creditar uma importante participação da PbTRX1 contra EROs, assim como
descrito para outros organismos.
É possível que PbTRX1 aumente a sobrevivência de P. brasiliensis no hospedeiro,
protegendo o fungo contra espécies reativas de oxigênio e, desta maneira, permitindo o
progresso da infecção.
1.4 - Sistema de expressão heteróloga em Pichia pastoris
Nas últimas décadas, algumas espécies de leveduras têm sido utilizadas como sistemas
alternativos de expressão por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae. Dentre esses novos
sistemas, destaca-se a Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica, ou seja, que é capaz de


42

crescer em meio de cultura contendo metanol como única fonte de carbono (Torres e Moraes,
2000).
A levedura metilotrófica P. pastoris tem sido amplamente descrita como um sistema
adequado de expressão de proteínas heterólogas devido algumas propriedades favoráveis
como: altos níveis de expressão sob o controle do promotor AOX1 que permite a transcrição
dos produtos gênicos a ele fusionados sob regulação de metanol e integração do cassete de
expressão no genoma da levedura de forma estável (Cereghino e Cregg, 2000). Este sistema
de expressão heteróloga pode ser utilizado tanto em pesquisas básicas, quanto em produção
em escala industrial (Cereghino et al., 2002).
Por se tratar de um microrganismo eucarioto este modelo de expressão faz com que
proteínas que necessitem de modificações pós-traducionais possam ser expressas conservando
sua estrutura o mais próximo possível da proteína nativa, possibilitando a utilização destas
proteínas recombinantes como antígenos vacinais e outros produtos de utilização na área
farmacêutica (Macauley et al., 2005). Tais modificações podem ser, por exemplo, formação
de pontes dissulfeto, dobramento correto da proteína recombinante, processamento do
peptídeo sinal e adição de lipídeos e glicosilação (O- e/ou N- ligadas) (Cereghino e Cregg,
2000; Daly e Hearn, 2005).
Ao contrário de outras leveduras utilizadas para expressão de genes heterólogos como
S. cerevisiae, a P. pastoris não realiza hiperglicosilação da proteína secretada, não
interferindo, portanto nos processos de enovelamento e dobramento finais da proteína madura
(Cregg et al., 1989). Devido a esses fatores citados acima, P. pastoris tornou-se uma
hospedeira de uso popular, e vários genes foram clonados e expressos utilizando este
microrganismo (Zhang et al., 2009). Baseado em pesquisas no banco de dados PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), a utilização de P. pastoris como meio para


43

expressão de proteínas heterólogas aumentou de 4% a 17% do total de 1995-2009 (Sørensen,
2010).
Nas leveduras metilotróficas, o metanol é inicialmente oxidado nos peroxissomas pela
ação das enzimas álcool oxidase (AO), catalase e dihidroxiacetona sintase. Durante o
crescimento de P. pastoris em metanol, a enzima AO constitui a proteína mais abundante da
célula chegando a representar 30% das proteínas celulares totais (Couderc e Baratti, 1980).
A expressão da AO é induzida na presença de metanol e reprimida na presença de
glicose ou glicerol. A enzima AO é codificada por dois genes distintos: AOX1 (95% da
atividade de AO) e AOX2 (15% da atividade de AO) (Cregg et al., 1999). Em células expostas
ao metanol como única fonte de carbono, o início da transcrição a partir do promotor de
AOX1 é altamente eficiente e comparável aos promotores dos genes expressos da via
glicolítica. O promotor de AOX1 é controlado pela fonte de carbono adicionada ao meio de
cultura, a indução da expressão de proteínas heterólogas em P. pastoris é facilmente obtida
em todas as escalas, desde frascos até grandes fermentadores (Cregg et al., 2007).
As leveduras metilotróficas apresentam uma via específica para a utilização do
metanol como única fonte de carbono e energia (Fig. 5). As reações iniciais ocorrem no
peroxissoma, seguidas por subseqüentes etapas metabólicas no citoplasma. Os peroxissomas
tem função indispensável durante o crescimento, uma vez que abrigam três enzimas chaves
para o metabolismo do metanol (AO, a catalase e a dihidroxiacetona sintase). O metanol entra
no peroxissoma e é oxidado por oxidases específicas para gerar formaldeído e peróxido de
hidrogênio o qual é decomposto em água e oxigênio molecular por uma catalase. O
formaldeído produzido é direcionado tanto para a via catabólica, onde é utilizado como
energia, quanto para a via anabólica, para a geração de biomassa. A reação inicial chave dessa
última via é catalisada pela dihidroxiacetona sintase, liberando dihidroxiacetona e
gliceraldeído 3-fostato. Estes compostos com três carbonos são posteriormente assimilados


44

dentro ddo citosol. A dihidrox

xiacetona é fosforilada por uma dihidroxiace
d etona quinasse e, em
uma poosterior reaçção de aldo

olase com gliceraldeíd
do 3-fosfato ela form
ma uma fruttose-1,6-
bifosfatto que é connvertida em

m glicose-6-ffosfato por uma fosfataase. Dentro da via cataabólica o
formalddeído é oxidado
o paara formatto por um
ma formaldeído dessidrogenasee sendo
subseqüüentemente oxidado para

p dióxido
do de carbo
ono pela en
nzima form
mato desidrrogenase
(Cereghhino e Creggg, 2000; Geellissen, 20000).
Figura 5 - Via mettabólica da oxidação doo metanol em e formaldeído na leveedura P. pa astoris. A

enzima Álcool Oxiddase (1) cattalisa a oxiddação de metanol m em formaldeído,
f , sendo estee produto
utilizadoo para geraçção de energ gia e bioma ssa. (2), Caatalase; (3), Formaldeídoo desidrogen nase; (4),
Formatoo desidrogenaase, (5), Diiidroxiacetonaa sintase; (6 6), Diidroxiacetona quinaase; (7), Fru
utose 1,6-
Bifosfatoo aldolase; (88), Frutose 1,6-bisfosfataase (adaptado
o de Cereghino e Cregg, 2000).
O
Os mecanissmos pelos quais
q ocorreem a transfo
ormação e a integraçãoo em P. pastoris são
por adiçção ou por substituiçãão gênica (F

Fig. 6) (Creegg et al., 1993). A fo
forma com a qual o
cassete de expressãão se integraa no genom

ma de P. passtoris possib
bilita caracteerizar três fenótipos
f
diferenttes, que se relacionam

m com a haabilidade daa levedura em
e metaboolizar metan
nol. Tais
nsis em Pichia pa
astoris

45

fenótipoos são o Mut+

M (Meth us), nos qu
hanol Utiliization Plu uais as linhhagens hosspedeiras
apresenntam os genees AOX1 e AOX2

A funccionais no seeu genoma e possuem crescimentto que se
aproxim o pela leveddura selvageem, o fenótiipo MutS (M

ma daquele apresentado
a Methanol Uttilization
Slow), ddependente da fraca traanscrição doo gene AOX

X2 uma vezz que possuui o gene AO
OX1 não
funcionnal, e por fim

m o fenótip
po Mut- (M
Methanol Utiilization Miinus) que poossui os do
ois genes
AOX inativos impoossibilitando

o a metabollização de metanol,
m e, não cresceendo na ausência de
outras ffontes de carrbono.
Figura 6 – Integraçção no genom ma de P. paastoris, por inserção

i (A e B) e por ssubstituição
o do gene
(C). A fiigura apresennta como exeemplo o genee de interessee. (Adaptado
o de Daly e H
Hearn, 2005)).
A integraçãão no genom
ma pode ocoorrer via recombinação
o homólogaa quando o vetor de
expressãão contém regiões qu

ue são hom
mólogas no
o genoma de
d P. pasto
toris e, porrtanto, a

nsis em Pichia pa
astoris

46

integração pode ocorrer através da inserção do gene ou substituição [Fig. 6 (A-C)]. A
integração pela inserção do gene pode resultar em vários eventos de integração de múltiplas
cópias a uma taxa de 1-10% dos transformantes (Clare et al., 1991). As transformações onde
ocorre a substituição do gene alvo geralmente resultam em transformantes de cópia única que
são geralmente geneticamente mais estáveis (Romanos et al., 1992; Clare et al., 1991).
A substituição de genes é alcançada pela digestão do vetor de expressão de tal forma
que o terminal 5’ e o 3’do vetor correspondam às regiões AOX1 5’ e 3’ do locus
cromossômico do AOX1. A transformação, portanto, resulta na retirada sítio específico do
gene AOX1 (Fig. 6 C). Este evento ocorre com uma frequência de 5-25 % dos transformantes
(Sreekrishna et al., 1997; Romanos, 1995)
O primeiro passo quando se objetiva expressar a proteína é considerar se a expressão
será intracelular ou secreção extracelular. P. pastoris tem sido usada tanto para a obtenção de
proteínas recombinantes intracelulares quanto para secretadas (Tabela 1). Essa escolha
depende da proteína a ser expressa. Se a proteína alvo não é secretada no seu sistema nativo,
por exemplo, então induzir a proteína a passar através do sistema secretor pode resultar na
alteração desta por glicosilação ou a falta de outras modificações pós-transducionais que
podem ser essenciais.
Muitas proteínas já foram produzidas com sucesso em P. pastoris utilizando sistema
de expressão intracelular, como por exemplo, as proteínas associadas à membrana como o
antígeno de superfície da hepatite B (Vassileva et al., 2001). A purificação de proteínas
expressa intracelularmente, no entanto, pode ser mais difícil do que para as proteínas
secretadas (Rees et al., 1999).


47

Tabela 1 – Exemp
plos de protteínas de fu
ungos expreessas em P.. pastoris
(* Trx1
T de Alicciclobacillus acidocaldarrius expressa em P. pastooris)
E
Existem muitos
m vetorres comerccialmente disponíveis
d que podem
m ser usad
dos para
expressaar as proteeínas heterrólogas em P. pastorris. Os vetores geralm

mente são do tipo
integrattivo. A prim
meira geração de vetorres de exprressão para P. pastoriss, como pH
HIL-D2 e
pPIC9, contêm o gene funcion

nal histidinaa desidrogen
nase (HIS4)), que pode ser usado como
c um
marcadoor de seleçãão da transfo

ormação.
C
Como outroos eucarioto
os, P. pastorris é eficien
nte para geraação de ponntes dissulfeeto e tem
sido usaada com suucesso para expressar pproteínas qu

ue contêm muitas
m ponttes dissulfettos. Para
facilitarr a secreçãoo, a proteínaa recombinaante deve caarregar umaa sequênciaa sinal. O sinal mais

nsis em Pichia pa
astoris

48

comumente usado é o fator-α de S. cerevisiae (Daly e Hearn, 2005). A seqüência sinal
consiste de 19 aminoácidos (pré) seguidos por 66 resíduos (pró) contendo sítios de
glicosilação N-ligados e um sítio de processamento da endopeptidase Kex2. Este sinal é
responsável pelo transporte da pró-proteína (sem o pré-peptídio) pelo RE e sua subseqüente
clivagem. A pró-proteína é transportada pelo Golgi onde o pró-sinal é clivado pela Kex2
liberando a proteína madura (Daly e Hearn, 2005).
Como P. pastoris, normalmente secreta poucas proteínas endógenas, a purificação da
proteína recombinante a partir do sobrenadante de cultura é uma tarefa relativamente simples.
Um das grandes desvantagens do sistema de expressão em P. pastoris é a proteólise de
peptídeos secretados. Entretanto, algumas soluções para esse problema têm sido relatadas, por
exemplo, a utilização de linhagens deficientes em proteases (Romanos, 1995).
A linhagem de P. pastoris utilizada neste trabalho é a SMD1168 que é defeituosa para
a enzima vacúolo peptidase A (pep4). Esta enzima é responsável pela ativação da
carboxipeptidase Y e protease B1 e, portanto, a SMD1168 também é deficiente nestas
proteases (White et al., 1994). Linhagens como KM71, GS115 e SMD1168 são defeituosas
para o gene histidina desidrogenase (HIS4). A sua utilização permite que os transformantes
sejam selecionados com base em sua capacidade de crescer em meio de cultura sem histidina.


]âáà|y|vtà|ät
"A ignorância gera confiança com mais frequência do que o conhecimento:

são aqueles que sabem pouco, e não aqueles que sabem muito,
que tão positivamente afirmam que esse ou aquele problema
jamais será resolvido pela ciência."
Darwim


50

2 - Justificativa
Em trabalho realizado anteriormente pelo grupo, cDNA codificante para Trx1 do
fungo P. brasiliensis (número de acesso AY376435) foi isolado da biblioteca de cDNA e
caracterizado. Este cDNA foi clonado em vetor de expressão pGEX 4T-3 e transformado em
E. coli. A proteína recombinante foi produzida e purificada, entretanto em quantidades
reduzidas, o que limitou bastante a realização de outras análises.
Por experiência adquirida em trabalhos anteriores, realizados pelo grupo de pesquisa, e
como já descrito por outros pesquisadores a levedura P. pastoris representa um excelente
modelo de expressão heteróloga a ser empregado quando se deseja produzir maiores
quantidades de proteína recombinante. A expressão heteróloga da Trx 1 utilizando este
sistema é muito importante, pois maiores quantidades de proteínas recombinantes podem ser
obtidas, possibilitando a realização de novos estudos e abordagens sobre a PbTRX1.
Visando a produção da Trx1 e dando continuidade ao trabalho realizado, foi proposto
a expressão do cDNA da Trx1 de P. brasiliensis na levedura metilotrófica P. pastoris
objetivando níveis maiores de produção do que os alcançados quando produzida em E. coli.


bu}xà|äÉá
“É um engano capital teorizar antes de ter dados, inconscientemente

começa-se a deformar os fatos para se adaptarem às teorias,
em lugar de adaptar as teorias aos fatos.”
Sherlok Holmes, em Um escandalo em Boêmia, por Arthur Conan Doyle


51

3 - Objetivos
3.1 – Objetivo Geral:
Este trabalho teve como objetivo geral clonar o cDNA codificante para a proteína
Tiorredoxina 1 (Trx 1) de P. brasiliensis e expressá-lo em P. pastoris, visando a obtenção da
proteína em maior quantidade para sua a posterior caracterização bioquímica e aplicação em
processos biotecnológicos.
3.2 – Objetivos Específicos:
3.2.1 - Clonar o cDNA da Trx1 nos vetores de expressão pHIL-D2 e pPIC9, visando a
construção de vetores para expressão intracelular e extracelular da Trx1.
3.2.2 - Transformar a levedura P. pastoris com os vetores de expressão pHIL-D2/Trx1
e pPIC9/Trx1.
3.2.3 - Analisar a integração do cassete de expressão nas células de P. pastoris.
3.2.4 – Selecionar, por ensaios de micro-fermentação em placa Deep Well,
transformantes de P. pastoris capazes de produzir a Trx1.
3.2.5 – Selecionar, por meio de fermentação em frasco de cultura, os transformantes
de P. pastoris produtores de tiorredoxina 1.


`tàxÜ|tÄ x
`°àÉwÉá
No meio do caminho tinha um método...

Tinha um método no meio do caminho...
(Parafraseando Carlos Drummond em “no meio do caminho”)


52

4 - Material
4.1 - Microrganismos
4.1.2 - Bactérias
As linhagens bacterianas utilizadas para manipulação de DNA foram DH5-α e
XL1Blue (Tabela 2). Tanto as células selvagens quanto as transformadas foram cultivadas
em meio LB (ver seção de meios de cultura) estocadas a -80 ºC em glicerol 25% estéril.
Tabela 2 - Linhagen de E. coli utilizada e seu respectivo genótipo.
Linhagem Genótipo Referência do fornecedor
DH5-α endA1 recA1 hsdR17 supE44 gyrA96 thi-1 (Sambrook e

relA1 ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) Tetr
Russel , 2001)
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
XL1Blue supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 Stratagene, La Jolla,

thirelA1 lac-F’[proAB + laclq LacZ
CA
ΔM15Tn10 (tetr)]
4.1.3 - Levedura
A linhagem da levedura P. pastoris utilizada neste trabalho foi a SMD1168
(Invitrogen) (Tabela 3), deficiente na produção de histidina, pelo fato do gene his4 (codifica a
enzima histidinol desidrogenase: uma das enzimas da via biossintética de histidina) apresentar
uma mutação que inativa a enzima HIS4 e uma mutação para o gene que codifica para
proteinase A (PEP 4) permitindo a seleção do vetor de expressão contendo o gene his4 após a
transformação, sendo protease deficiente. Estoques das culturas selvagem e transformadas
foram acondicionados a -80 ºC em meio MD contendo 25% de glicerol estéril.


53

Tabela 3 - Linhaggem de P. pa
astoris utiliizada e seu
u respectivo
o genótipo.
Linhhagem Genótipo Fenótipo

F Referênciia do forneccedor
SMD
D 1168 Δ
Δpep4::URA
A3 Δkex1: ::SUC2 H -, Mut+
His (Cereghinoo e Cregg, 2000)
2
hiis4 ura3
4.2 - Veetores
pGEM®-T
4.2.1 - p
U
Utilizado nas clonagen
ns de fragm
mentos de DNA
D amplifficados por PCR. O pllasmídeo
possui uuma timina ligada a cad

da uma das extremidad
des 3’, o qu
ue impede a recircularizzação do
plasmíddeo e melhoora a eficiên

ncia de ligaação de pro
odutos de PC
CR, pois allgumas poliimerases
termoesstáveis com
mo a Taq, adicionam uma aden
nina nas ex
xtremidadess 3’ do fragmento
amplificcado (Fig. 7) (Promeega Biotechh®, número de catálogo: A13660). A seleeção dos
recombiinantes é feeita pela ausência da atiividade β-laactamase naa presença dde X-gal e IP
PTG.
Figura 77. Representtação esquem mática do mmapa físico do

d vetor parra clonagem m de produto o de PCR
pGEM®- T (Fonte: Promega). Esse E vetor poossui 3,0 kb e apresenta o gene de ressistência a am mpicilina
(Ampr) ccomo marca de seleção, origem
o de reeplicação do fago F1 (ori), parte do geene lacZ quee codifica
o fragmeento amino terminal
t da enzima
e β- lacctamase, sítio
o múltiplo de clonagem e os promoto ores T7 e
SP6 flannqueando a reegião de clon
nagem.

nsis em Pichia pa
astoris

54

4.2.2 - p
pHIL-D2
P
Possui 82099 nucleotídeeos, apresennta o gene de
d resistênciia a ampicillina, uma orrigem de
replicaçção de E. cooli, a região
o promotoraa e terminad
dora do gene AOX1 flaanqueando o cassete
de expreessão e o geene HIS4 in
nativo (His--) e sequênccia para aneelamento doos oligonuclleotídeos
5’ AOX
X1 e 3’ AOX
X1 (Fig. 8).
Figura 8 - Representação esqu uemática doo mapa físico o do vetor pHIL-D2

p paara expressãão em P.
pastoris.. Esse vetor possui
p 8,2 kb
b, possui o g ene de resisttência a ampiicilina comoo marca de seeleção em
bactéria,, origem de replicação
r em
m bactéria (ppBR322), marca de seleçção auxotróffica HIS4, prromotor e
terminaddor AOX1 (Fonte: Invitro ogen).
4.2.3 - p
pPIC9
P
Possui 8,0 kb,
k o promo
otor AOX1 rregulável po
or metanol, o terminadoor de transccrição do
gene AO
OX1 (TT), a sequênciaa codificadoora do pepttídeo sinal (sinal
( de seecreção) do gene do
fator α de S. cerevisae flanqueando o sítiio de policllonagem, a origem de rreplicação e o gene
de resisstência a am
mpicilina funcionais em
m E. coli, os
o sítios parra integraçãão no genom
ma de P.
pastoriss em HIS4 ou
o AOX1, numa
n regiãoo de múltip
plos sítios de
d clonagem
m, marca dee seleção
auxotrófica para leveduras (H

HIS4) e seequência paara anelameento dos olligonucleotídeos 5’
AOX1 e 3’ AOX1 (F
Fig. 9).

nsis em Pichia pa
astoris

55

Figura 9 - Represeentação esquemática doo mapa físiico do vetorr pPIC9 paara expressã ão em P.
pastoris.. Esse vetor possui
p 8,0 kb
b, possui o g ene de resisttência a ampiicilina comoo marca de seeleção em
bactéria,, origem de replicação
r em
m bactéria (ppBR322), maarca de seleçção auxotrófi fica HIS4, prromotor e
terminaddor AOX1 (F Fonte: Invitro
ogen).
4. 3 – E
Enzimas
 E
Endonucleaases de restrrição
Enzim
ma Sítio de clivagem
m Tamp ão Tem
mperatura dee incubaçãoo Proceedência
Xho I C^T
TCGA G Redd 37 ºC
C Ferm
mentas
EcoR I GÂ
AATT C Orangge 37 ºC
C Ferm
mentas
Not I G C^^G G C GC Orangge 37 ºC
C Ferm
mentas
Bgl III A^G
GATC T Orangge 37 ºC
C Ferm
mentas
Sac I G A G C T^C Bluee 37 ºC
C Ferm
mentas
 E
Enzima T4 DNA ligasee (GIBCO®
®)
 R
RNAse A (QIAGEN)
 T
Taq DNA polimerase
p (PHT
( e Inviitrogen)
 P
Proteinase K (Fermentas).

nsis em Pichia pa
astoris

56

4.4 - Marcadores
4.4.1 - Marcadores de DNA
 DNA do Fago λ digerido com EcoR I e Hind III.
 GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use, 100-3000 bp (Fermentas,
número de catálogo: SM1153).
 KiloBase™ DNA Marker (GE Healthcare, número de catálogo: 27-4004-01).
4.4.2 - Marcadores de Proteína
 BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen, número de catálogo: 10747-012).
 LMW Calibration Kit For SDS Electrophoresis (AmershamTM, número de catálogo:
17-0446-01).
4.5 - Kits de Uso Específico em Biologia Molecular
 Eluição do DNA do gel de agarose: Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega Corporation©, número de catálogo: A9381).
 Extração de DNA plasmidial: Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System
(Promega Corporation©, número de catálogo: A1330), QIAprep Spin Miniprep Kit
(QIAGEN, número de catálogo: 27106) e QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit (QIAGEN,
número de catálogo: 12963).
 Defosforilação de DNA: Calf Intestinal alkaline phosphatase (CIAP) (Promega
Corporation©, número de catálogo: M1821).
4.6 - Oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos foram sintetizados pela Invitrogen e foram diluídos para 5
pmoles/μl (concentração de trabalho). A tabela 4 relaciona os oligonucleotídeos utilizados no
trabalho.


57

Tabela 4 - Oligonucleotídeos utilizados.

Oligonucleotídeo Sequência Sítio de
restrição
TRX.fwd1 5’-CACGÂATTCCTACGACGCATGCTTC-3’ EcoR I
TRX.rev1 5’-CACGÂATTCCAATGGTTGTCCAC-3’ EcoR I
TRX.fwd2 5’-CCTC^TCGAGGGCACAATGGTTGTCC-3’ Xho I
5’ AOX1 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ -
3’ AOX1 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ -
A sequência de ancoramento dos oligonucleotídeos está representada em negrito. A sequência
sublinhada representa os sítios de restrição adicionados.
4.7 - Ferramentas de Bioinformática
 Busca de sequências: GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
 Alinhamento: Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) (Altschul et al., 1990).
 Alinhamento: Sequencher 4.1.4 (Genecodes, Inc, Ann Arbor, Michigan USA) DNA
sequence assembly software.
 Desenho dos oligonucleotídeos: Gene Runner V 3.05 (Spruyt and Buquicchio, 1994)
(http://www.generunner.net/).
 Análises de restrição: NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/) (Vincze et
al., 2003).
 Análises de estrutura de proteínas: ExPAsY (http://ca.expasy.org/) (Gasteiger et al.,
2003).
4.8 - Meios de Cultura e soluções
Os meios de cultura e soluções utilizados para cultivo de microrganismos foram
esterilizados em autoclave a 120ºC por 20 minutos.


58

4.8.1 - Meios para Cultivo de Bactérias
Meio Luria-Bertani - LB
Peptona de caseína 1,0% (p/v)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)
NaCl 1,0% (p/v)
O pH foi ajustado para 7,2.
Meio LB ágar - LA
Foi adicionado ágar bacteriológico 1,2% (pv) ao meio LB.
Meio SOB
Bacto-Triptona 20,0 g/L
Extrato de Levedura 5,0 g/L
NaCl 0,6 g/L
KCl 0,5 g/L
pH ajustado para 7,2.
Meio SOC
SOB 100 mL
Glicose 20,0 mM
MgCl2 5,0 mM
MgSO4 5,0 mM
As soluções de glicose, MgCl2 e MgSO4 foram esterilizadas por filtração em membrana
milipore 0,22 μm.


59

Solução Estoque de Ampicilina
Ampicilina 10 mg
Água destilada (q.s.p) 100 mL
4.8.2 - Meios para Cultivo da Levedura P. pastoris e Soluções Estoque
Meio YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)
Extrato de Levedura 1,0% (p/v)
Peptona de caseína 2,0% (p/v)
Glicose 2,0% (p/v)
A glicose foi autoclavada separadamente por 20 min a 0,5 atm.
Meio YPD-Ágar
Meio YPD acrescido de ágar bacteriológico a 1,2% (p/v).
Meio MD (Minimal Dextrose Medium)
YNB (Yeast Nitrogen Base Without Amino acids) (Difco) 1,34% (p/v)
Dextrose 1% (p/v)
Biotina 4x10-5 (v/v)
Meio BMM (Buffered Minimal Methanol)
YNB 1,34% (p/v)
Metanol 1% (v/v)
Fosfato de potássio 100 mM (v/v)


60

Meio BMG (Buffered Minimal Glycerol)
YNB 1,34% (p/v)
Glicerol 1% (p/v)
Fosfato de potássio 100 mM (v/v)
Meio de crescimento - Meio BMGY-U (Buffered Glycerol Complex Medium)
Uréia 1,34% (v/v)
Extrato de levedura 1% (p/v)
Peptona 2% (p/v)
Fosfato de potássio pH 6,0 100 mM
Ampicilina 50 μg/mL
Glicerol 1%
Meio de indução - Meio BMMY-U (Buffered Methanol Complex Medium)
Uréia 1,34% (v/v)
Extrato de levedura 1% (p/v)
Peptona 2% (p/v)
Fosfato de potássio pH 5,0 100 mM
Casaminoácidos 2%
Ampicilina 50 μg/mL
Metanol 1%


61

Para preparo dos meios BMGY-U e BMMY-U, uma solução contendo extrato de
levedura, peptona e uréia foi autoclavada separadamente por 20 minutos e depois foram
adicionados os demais reagentes previamente esterilizados por filtração (Biotina, Metanol,
Ampicilina) ou por autoclavagem (casaminoácidos, glicerol e Tampão Fosfato de Potássio),
adicionando água estéril para completar o volume.
YNB (Yeast Nitrogen Base) - Solução estoque de 10X
YNB* (Yeast Nitrogen Base Without Amino acids) (Difco) 3,4% (p/v)
Sulfato de amônio (NH4SO4) 10% (p/v)
Esterelizada por filtração em membrana microbiológica com poros de 0,22 μm (MilliporeTM)
e estocada a 4°C. *(s/ aminoácidos e s/ sulfato de amônio).
Tampão Fosfato de Potássio 1 M, pH 6,0
K HPO 132 mM
2 4
KH PO 686 mM
2 4
Esterilizada em autoclave por 20 minutos e estocada a temperatura ambiente.
Biotina - Solução estoque 500X
Biotina 0,02% (p/v)
Esterelizada por filtração em membrana microbiológica com poros de 0,22 μm (MilliporeTM) e
estocada a 4°C.
Glicerol – Solução estoque
Glicerol 50% (v/v)


62

4.9 - Transformação da Levedura P. pastoris por Eletroporação
Sorbitol 1 M
Sorbitol 18,21 g
4.10 - Lise Celular de Levedura
Tampão Breaking
Fosfato de sódio pH 7.4 50 mM
PMSF 1 mM
EDTA 1 mM
Glicerol 5%
4.11 - Extração de DNA Plasmidial
Solução I
Tris-HCl pH 8,0 25 mM
EDTA 10 mM
Glicose 50 mM
Solução II (Preparada no momento do uso)
NaOH 0,2 M
SDS 1,0% (p/v)
Solução III - (pH 4,8-5,0)
Acetato de Sódio 3,0 M
Ácido acético 2,0 M


63

Solução RNAse A
RNAse A 10 mg/mL
Tampão TE
EDTA 1,0 mM
4.12 - Soluções para eletroforese em gel de agarose
Solução de brometo de etídeo 1% (p/v)
Brometo de etídeo 1,0 g
Água destilada 100 mL
Tampão de corrida para eletroforese em gel de agarose - TEB (10X)
Triz base 0,89 M
Ácido bórico 0,89 M
EDTA 0,08 M
Tampão de amostra para DNA (10X)
TEB (20X) 50% (v/v)
Glicerol 30% (v/v)
Azul de bromofenol 0,25% (p/v)
Xilenocianol 0,25% (p/v)


64

4.13 - Soluções para os ensaios imunológicos (Western e Dot blotting)
Tampão de fosfatase alcalina (APB)
NaCl 100 mM
MgCl2 50 mM
Bloqueio – Western e Dot blotting
Leite em pó desnatado Molico 5% (p/v) dissolvido em PBST 1X.
Solução reveladora para Western e Dot blotting
Para revelação foram utilizados os reagentes NBT (Nitro Blue Tetrazole) e o BCIP (5-
Bromo-4-Cloro-indolil fosfato) (Promega). Para preparar 5 mL da solução reveladora
adicionavam-se 33 μL do estoque de NBT e 66 μL do estoque de BCIP em 5 mL de APB,
nesta ordem para se evitar a precipitação dos reagentes.
Membrana de nitrocelulose
®
 Hybond-C Extra Amersham Bioscience (Número de catálogo: RPN303E).
4.14 - Anticorpos
Nome Produzido em Titulação Origem Num. Cat.
Anti-IgG Cabra 1:2000 Sigma® A3687

Coelho (AP)*
Anti-TRX Coelho 1:1000 Sigma® T0803
*AP, conjugado a Fosfatase Alcalina


65

4.15 - Soluções para análise de proteínas em gel de Poliacrilamida Desnaturante (SDS-
PAGE)
Ácido tricloroacético (TCA)
Um volume de 1 mL de água destilada foi adicionado a 50 g de ácido tricloroacético. Após
todo o ácido ser dissolvido, adicionou-se água destilada suficiente para um volume final de 50
mL e a solução obtida foi estocada a 4ºC.
Persulfato de amônio (P.A.) 10% (P/V)
P.A. 1g
Água destilada (q.s.p.) 10 mL
Dodecil sulfato de sódio (SDS) - 20%
SDS 20,0 g
Água destilada 100 mL
Tampão de amostra para proteína (2x)
Tris-HCl 1 M pH 6,8 200 mM
SDS 4,0% (p/v)
β-Mercaptoetanol 4,0% (v/v)
Glicerol 20,0% (v/v)
Azul de bromofenol 0,1% (p/v)
Acrilamida: Bis-acrilamida (39:1)
Acrilamida 39% (p/v)
Bis-acrilamida 1% (p/v)
A solução foi filtrada em papel de filtro e estocada ao abrigo da luz a 4ºC.


66

Tris-HCl 1 M - pH 8,8
Trizma Base 18,2 g
Àgua destilada 100 mL
O pH foi ajustado com HCl fumegante.
Tris-HCl 1,5 M - pH 6,8
Trizma Base 12,1 g
O pH foi ajustado com HCl fumegante.
Tampão de corrida – Tris-glicina 5X (estoque)
Trizma Base 15,1 g
Glicina 72,0 g
SDS 5,0 g
Água destilada (q.s.p) 1 L
Preparo dos géis
Reagentes Gel concentrador Gel de separação Gel de separação

4% 15% 5%
Acrilamida: Bis-acrilamida 0,6 mL 2,9 mL 0,97 mL
(39:1)
Tris-HCl 2 M pH 8,8 - 1,5 mL 1,5 mL
Tris-HCl 1 M pH 6,8 0,51 mL - -
Água deslitada 4,2 mL 2,8 mL 4,8 mL
SDS 20% 120 μl 195 μl 195 μl
Persulfato de Amônio 10% 60 μl 30 μl 30 μl
TEMED 9 μl 6 μl 6 μl
Para separação dos géis de gradiente de separação, as soluções 15% e 5% devem ser
preparadas separadamente e misturadas no momento do uso.


67

4.16 - Revelação das Proteínas por Coloração do Gel com Nitrato de Prata
Solução de Fixação
Metanol (99,8%) 500 mL
Ácido acético Glacial (99,7%) 120 mL
Formaldeído (36,5 a 38,0%) 1 mL
Solução de Lavagem
Etanol (99,8%) 500 mL
Solução de Tratamento
Tiossulfato de Sódio 20 mg
Solução de Equilíbrio
Nitrato de Prata 0,2 g
Formaldeído (36,5 a 38,0%) 75 μL
Solução de revelação
A solução estoque de carbonato de sódio foi preparada dissolvendo-se o carbonato em água
destilada para a concentração final de 6%. A solução reveladora foi preparada misturando-se
98 mL da solução estoque de carbonato de sódio com 2 mL da solução de tratamento e
adicionado 0,05% de formaldeído a 37%.


68

Solução de parada
Ácido Acético Glacial (99,7%) 120 mL
4.17 - Revelação das proteínas por coloração do gel com Azul de Comassie
Solução corante
Comassie blue R-250 0,2% (p/v)
Etanol 40% (v/v)
Ácido Acético Glacial 10% (v/v)
Água destilada (q.s.p.) 1000 mL
Solução descorante para gel corado com Comassie Blue
Ácido Acético Glacial (99,7%) 7 mL
4.18 - Outras soluções de uso rotineiro
Azida Sódica – Solução estoque 100X
Azida sódica 5% (p/v)
Esta solução era utilizada na conservação dos tampões PBS e PBST e nas soluções
estoque dos anticorpos em concentração final de 0,05%.


69

Tampão PBS (Phosphate-Buffered Saline) 10X, pH 7,4
NaCl 1,37 M
KCl 27 mM
Na2HPO4 100 mM
KH2PO4 20 mM
Tampão PBST 1X, pH 7,4
NaCl 0,137 M
KCl 0,0027 M
Na2HPO4 0,01 M
KH2PO4 0,002 mM
Tween 20 0,5% (v/v)


70

5 – Métodos
5.1 - Cultivo e manutenção de microrganismos
As bactérias foram cultivadas a temperatura de 37 ºC em meio LB. A linhagem SMD
1168 da levedura P. pastoris foi cultivada em meio YPD ágar a 30 ºC por 3 dias e estocada a
4 ºC. A cada 90 dias foi realizado um novo repique.
5.2 - Digestão de DNA com endonucleases
As digestões de DNA com enzimas de restrição foram realizadas em sistemas de 10 a
100 μL, durante 1 a 16 h (estipulados de acordo com a quantidade de DNA a ser digerido). Os
tampões e as temperaturas de reação foram utilizadas de acordo com as indicações dos
fabricantes, utilizando-se cerca 10 a 20 U de enzima para cada micrograma de DNA a ser
digerido.
5.3 - Eletroforese de ácidos nucléicos em gel de agarose
A eletroforese em gel de agarose foi utilizada para análise e avaliação da qualidade,
quantificação do DNA e análise de fragmentos de DNA (De-Sousa, 2003). A agarose foi
preparada em concentrações de 0,8 a 1,0% (p/v) em tampão de corrida TEB 0,5X e contendo
0,5 μg/mL de brometo de etídeo. As amostras eram aplicadas no gel e submetidas à
eletroforese, como descrito por Sambrook e Russel (2001). Para visualização e
fotodocumentação do DNA utilizou-se a incidência de luz ultravioleta em transiluminador,
Eagle Eye II (Stratagene, La Jolla, CA, EUA).
5.4 - Reações de defosforilação
Para prevenir a religação de vetores linearizados contendo extremidades coesivas, foi
utilizada a enzima CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) (fonte: Promega) para catalisar


71

a hidrólise de grupos 5’- fosfato terminais. A reação foi realizada seguindo as instruções do
fabricante.
5.5 - Ligação de fragmentos de DNA (Vetor-Inserto)
Os sistemas de ligação foram feitos de modo que a razão molar entre o vetor e o
inserto ficasse entre 1:3 e 1:5. A enzima T4 DNA ligase foi utilizada com os tampões de
reação fornecidos pelos fabricantes. Os sistemas foram incubados a 4 ºC durante a noite e,
então, utilizados para a transformação de bactérias.
5.6 - Preparação de células bacterianas competentes para choque térmico (CaCl2)
O preparo de células de E. coli competentes para choque térmico foi realizado como
descrito por Cohen (1972) com modificações. As células de E. coli da linhagem desejada
foram crescidas em 5 mL de meio LB e incubadas a 37 ºC durante a noite e sob agitação a
250 rpm. Em seguida, 1 mL do pré-inóculo foi adicionado a 30 mL de meio LB e essa cultura
foi incubada a 37 ºC sob agitação (250 rpm) até atingir uma D.O.600 de 0,2 a 0,3. As células
foram coletadas por centrifugação a 3.000 x g por 10 minutos a 4 ºC e ressuspendidas em 10
mL de CaCl2 100 mM estéril gelado. Em seguida as células foram submetidas a uma nova
centrifugação nas mesmas condições. Finalmente, as células foram aliquotadas em tubos
eppendorf (50 a 100 μL por tubo) e estocadas a -80 ºC.
5.7 - Transformação de E. coli por choque térmico
Uma alíquota de célula competente previamente preparada foi utilizada para cada sistema de
ligação. As células foram retiradas do freezer -80 ºC e mantidas no gelo até o uso. Em
seguida, foram adicionados 5 μL do sistema de ligação às células, e as mesmas foram
novamente incubadas no gelo por 30 min. Após este período, as células foram submetidas a


72

um choque térmico a 42 ºC por 50 s e, o sistema foi incubado no gelo por 2 min.
Posteriormente, foram adicionados 800 μL de meio SOC ao sistema e incubado por 1 hora a
37 ºC sob agitação a 150 rpm. Em seguida as células foram centrifugadas por 10 min a 3500
rpm e ressuspensas no volume desejado em placas contendo LB ágar com ampicilina (100
μg/mL), e X-gal e IPTG quando necessário. As placas foram incubadas a 37 ºC durante a
noite.
5.8 – Preparação de DNA plasmidial em média escala por lise alcalina (adaptado de
Sambrook e Russel, 2001)
Uma colônia da linhagem bacteriana de interesse foi inoculada em 5 mL de meio LB
contendo ampicilina (100 μg/mL). Esse pré-inóculo foi incubado por aproximadamente 16 h a
37 ºC sob agitação de 200 rpm. Após este período 300 μL da pré-cultura foi inoculada em 30
mL de meio LB contendo ampicilina (100 μg/mL), nas mesmas condições de crescimento do
pré-inóculo. A cultura bacteriana foi submetida a centrifugação a 12.000 g por 10 min. As
células foram ressuspensas por agitação em 2 mL de solução I e incubadas em gelo por 5 min.
A suspensão foi homogeneizada gentilmente por inversão do tubo com 4 mL de
Solução II, e posteriormente foram adicionados 3 mL de Solução III, homogeneizada
novamente por inversão. O lisado foi submetido a centrifugação a 10.000 g por 5 min e o
sobrenadante foi transferido para um novo tubo ao qual se adicionou 7,5 mL de isopropanol,
seguindo-se uma homogeneização e posterior centrifugação a 10.000 g durante 10 min à
temperatura ambiente. O precipitado foi ressuspenso em 2 mL de tampão TE, e seguidamente
foi adicionado 1,1 mL de acetato de amônio 7,5 M e homogeneizado vigorosamente.
Essa suspensão foi submetida a centrifugação a 10.000 g por 15 min, e o sobrenadante
transferido para outro tubo, ao qual foi adicionado 7,5 mL de etanol 100% e homogeneizado
por inversão. Essa solução foi centrifugada a 10.000 g por 5 min e o precipitado lavado com 5


73

mL de etanol 70%. Repetiu-se a centrifugação anterior para remover o álcool e após secagem
à temperatura ambiente o sedimento foi ressuspenso em 500 μL de TE contendo 5 μL de
RNAse 10 mg/mL.
5.9 - Precipitação de DNA
Ao DNA plasmidial extraído foi adicionado 0,5 volume de acetato de amônio 7,5 mM,
2,5 volumes de etanol 100 % gelado e 1 μL de glicogênio, procedendo-se a incubação a -20
ºC durante a noite. No dia seguinte as amostras foram submetidas à centrifugação a 12000 g,
por 40 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e, em seguida, adicionou-se 1 mL de
etanol 70 % gelado. Foi feita nova centrifugação a 4000 g¸ por 5 minutos, sendo o
sobrenadante novamente descartado. O precipitado foi seco, ressuspendido em 10 μL água
MilliQ contendo RNAse e estocado no freezer a -20 ºC.
5.10 - Purificação de fragmentos de DNA em gel de agarose
Após digestão dos plasmídios dos produtos de PCR com as enzimas de restrição
apropriadas, os fragmentos de DNA contendo as sequências de interesse eram aplicados em
gel de agarose e submetidos a eletroforese. Os fragmentos de DNA eram recortados do gel de
agarose e purificados utilizando-se o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega), conforme as especificações do fabricante.
5.11 - Purificação e clonagem dos produtos de PCR
A purificação foi realizada com o kit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System)
(Promega). A quantificação do produto de PCR foi realizada em gel de agarose 0,8% por
comparação da intensidade de bandas com DNA de concentração conhecida. Para realizar a
clonagem dos fragmentos de PCR com o vetor de clonagem pGEM-T (Fig. 7) foi utilizada a


74

razão molar inserto/vetor de 3:1. As transformações foram realizadas utilizando células de E.
coli da linhagem XL1 blue.
pGEM-T é um vetor de clonagem que possui um gene de resistência a ampicilina e o
gene codificador da β-galactosidase (lac z) (Fig. 7). O sítio de clonagem encontra-se dentro
do gene lac z¸ possuindo em suas extremidades os promotores SP6 e T7. A ligação do inserto
no sítio de clonagem, interrompe o gene lac z, logo, células bacterianas transformadas com
esta construção não produzem a enzima β-galactosidase e são identificadas em meio seletivo
(contendo: ampicilina, IPTG e X-GAL) por apresentarem coloração branca.
Foram selecionadas colônias transformantes brancas para a minipreparação plasmidial
e posteriormente foi realizada digestão para verificação da presença do inserto. O inserto pode
então ser purificado do gel de agarose 0,8% com auxílio do kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega).
5.12 - Desenho dos oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação do cDNA de interesse foram
desenhados com base na sequência do cDNA da TRX1 de P. brasiliensis, depositada no
banco de dados, GenBank, do National Center for Biotechnology Information (NCBI), código
de acesso: AY376435. Foram adicionados aos oligonucleotídeos, sequencias referentes aos
sítios de restrição necessários para a clonagem do cDNA aos vetores. Os oligonucleotídeos
foram desenhados utilizando o programa GeneRunner 3.01.
5.13 - Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As amplificações realizadas pela técnica de polimerização em cadeia foram feitas
utilizando-se como molde 10 ng DNA plasmidial (pGEX-TRX1) purificado, 0,2 mM de
dNTPs, tampão da Taq DNA polimerase, 1,5 a 3 mM de cloreto de magnésio, 1 U de Taq


75

DNA polimerase (Invitrogen), 10 a 30 ρmol de oligonucleotídeos iniciadores 5' e 3’, em um
volume final de reação de 25 μL. As reações foram realizadas nas seguintes condições:
desnaturação inicial (94°C – 3 min), 35 ciclos de desnaturação (94°C –1:30 min), anelamento
(55 ºC – 1:30 min), extensão (72°C – 1:30 min) e extensão final (72°C – 10 min). As reações
de PCR com Taq DNA polimerase (Invitrogen) foram realizadas de acordo com as
recomendações do fabricante.
5.14 - PCR de colônia
As colônias a serem utilizadas foram retiradas da placa seletiva com o auxílio de
ponteiras de micropipetas esterilizadas e estas foram encostadas em placa seletiva apropriada
(placa réplica) e, em seguida, usadas como molde para a PCR através da adição de parte da
colônia pela micropipeta na solução da reação. A placa foi incubada na temperatura
apropriada e a solução de PCR foi levada ao termociclador.
As amplificações foram realizadas sob as mesmas condições da PCR de DNA
purificado, exceto desnaturação inicial que procedeu-se a 94 ºC por 10 minutos.
5.15 - Sequenciamento de DNA e análise das sequências de nucleotídeos
As amostras foram enviadas para Macrogen Inc. (http://dna.macrogen.com/eng/)
(Shipping Address: Macrogen Inc. - 908 World Meridian Center. 60-24 Gasan-dong;
Geumchun-gu Seoul, Korea 153-023) juntamente com os oligonucleotídeos desenhados com
base na sequência da Trx1. As sequências obtidas foram analisadas com auxílio do programa
Sequencher 4.1.4 (Gene Codes Corporation). A seqüência consenso foi submetida a
comparação com aquelas depositadas no GenBank utilizando-se o BLAST (basic local
alignment tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) e alinhadas.


76

5.16 - Preparo de células competentes de P. pastoris
As células de P. pastoris foram inoculadas em 10 mL de meio YPD em erlenmeyer de
125 mL de capacidade e incubada a 30 ºC por 24 h sob agitação de 200 rpm. Após este
período, 50 μL do pré-inóculo foi adicionado a 200 mL de meio YPD em erlenmeyer de 1 L e
incubado sob as mesmas condições do pré-inóculo até atingir a DO600 entre 1,3 a 1,5.
Posteriormente, as células foram coletadas por centrifugação a 1.500 g por 5 min a 4 ºC e
ressuspensas em 250 mL de água destilada estéril gelada. Seguidamente foram submetidas à
centrifugação nas mesmas condições anteriores e ressuspensas em 125 mL de água destilada
estéril gelada. As células foram centrifugadas e ressuspensas em 10 mL de sorbitol 1 M
gelado, posteriormente foram centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de sorbitol 1 M gelado
para um volume final de aproximadamente 1,5 mL. As células competentes foram utilizadas
imediatamente na transformação, pois apesar das células poderem ser congeladas, sua
eficiência diminui significativamente.
5.17 - Transformação de células de P. pastoris por eletroporação
As células de P. pastoris foram transformadas por eletroporação, conforme descrito
por Scorer e colaboradores (1994) com modificações, utilizando o aparelho GenePulser (Bio-
Rad). Para a transformação, 80 μL de células competentes foram homogeneizadas com 10 μg
de DNA plasmidial (previamente linearizado) em 10 μL de Tampão TE. A mistura foi
transferida para uma cubeta de 0,2 cm gelada e incubada em gelo por 5 min. As células foram
submetidas à eletroporação de acordo com os seguintes parâmetros: 1,5 kV, 25 μF e 400 Ω.
Imediatamente após o choque, foi adicionado 1 mL de sorbitol 1 M gelado, e o conteúdo da
cubeta foi transferido para um tubo de microcentrífuga estéril. Um volume de 200-600 μL foi
semeado em placas de Petri contendo meio MD sem histidina para seleção dos transformantes


77

com o vetor contendo a marca auxotrófica HIS4 e o crescimento das colônias ocorreu a 30ºC
por 3 a 4 dias.
5.18 - PCR de colônia de levedura (adaptado Akada et al., 2000)
5.18.1 - Extração do DNA da levedura
Um procedimento simples para o isolamento de DNA de leveduras para uso como
molde para PCR foi realizado pelo tratamento prévio com SDS, sendo suficiente para a
extração de DNA cromossômico de células de levedura. Colônias de leveduras transformadas
foram ressuspensas em um volume de 30 μL de SDS 0,2 % e submetidas a agitação intensa
por aproximadamente 20 s. Para melhor eficiência da extração foi necessário trabalhar com
células frescas. As células que permaneceram por muito tempo na geladeira não apresentaram
boa extração por este método. Em seguida, a mistura foi incubada por 4 min a 90 ºC e
submetida à centrifugação por 1 min a 3000 g. Posteriormente o sobrenadante foi transferido
para um novo tubo e estocado a -20 ºC.
5.18.2 - Reação de PCR
A PCR foi realizada em um termociclador (Applied Biosystems – 2400), utilizando a
enzima Taq DNA polimerase e tampão recomendado pelos fornecedores. Os
oligonucleotídeos utilizados estão listados na Tabela 4. A reação foi feita para um volume
final de 50 μl, incluindo, 5 μl do DNA genômico extraído, 5 μl do tampão da enzima, 1,5 μl
de MgCl2, 1 μl da mistura de 10 mM dNTPs (dCTP, dGTP, dATP, dCTP), 0,75 μl de cada
oligonucleotídeo a 10 μm e 1 U da enzima taq DNA polimerase (Invitrogen) e 0,25 μl de
Triton X-100 25% para um concentração final de 0,05%. Foi realizada uma curva para
determinação da melhor concentração de Triton X-100 e SDS na reação. A adição de Triton
X-100 permitiu a amplificação em concentrações elevadas de SDS.


78

As amplificações foram realizadas nas seguintes condições: desnaturação inicial (94
ºC – 2 min), desnaturação (94 ºC – 1 min), anelamento (55 ºC – 1 min), extensão (72 ºC – 1
min) e extensão final (72 ºC – 7 min). Posteriormente, os produtos da amplificação foram
analisados em gel de agarose 1%.
5.19 - Expressão do gene da Trx1 em P. pastoris.
Para a expressão do cDNA da Trx1 em P. pastoris foram utilizados os vetores de
expressão pHIL-D2 e pPIC9 (Figuras 8 e 9, respectivamente). Para a construção do vetor
pHIL-D2/Trx1 (pHTRX1), o cDNA foi clonado após o promotor do gene AOX1, permitindo
a expressão intracelular da proteína recombinante. Para a construção do vetor pPIC9/Trx1
(pPTRX1), o cDNA foi clonado após o peptídeo sinal, o fator-α de S. cerevisiae, permitindo a
expressão extracelular da proteína recombinante.
5.19.1 - Construção dos vetores de expressão
O cDNA da Trx1 de P. brasiliensis clonado no vetor pGEX-TRX1 (Domingos, 2006)
foi utilizado como molde para a amplificação utilizando os oligonucleotídeos apresentados na
Tabela 4.
5.19.1.1 - Construção do vetor pHTRX1 – Construção 1
Para a construção do vetor pHTRX1 (Fig. 10), o cDNA da Trx1 foi amplificado com
os oligonucleotídeos TRX.fwd1 e TRX.rev1 contendo o sítio de restrição para a enzima
EcoRI nas duas extremidades (5´ e na 3´). O produto amplificado foi analisado em gel de
agarose 0,8%, em tampão TEB (0,5X) e visualizado pela coloração com brometo de etídeo
para a confirmação da amplificação. O produto da PCR foi purificado usando o kit de
purificação de DNA genômico Wizard® (Promega Corporation, EUA) de acordo com as
instruções do fabricante e em seguida digerido com EcoR I por 3 h a 37 ºC. Após 3 h, o


79

sistema de digestão foi submetido a inativação térmica a 60 ºC por 15 min para a inativação
da enzima.
Posteriomente, o produto de PCR digerido foi purificado utilizando o kit Wizard®
(Promega Corporation, EUA) e usado para ligação direta no vetor pHIL-D2. O plasmídio
pHIL-D2 (1 μg) também foi digerido com a enzima EcoR I a 37 ºC por 3 h e em seguida
defosforilado com a enzima CIAP. O produto de PCR (~20 ng) digerido e purificado foi
ligado ao vetor de expressão pHIL-D2 (20 ng) na razão de 1:5, utilizando a enzima T4 DNA
ligase e tampão desta enzima de acordo com orientações do fabricante (GIBCO) por 18 h a 4
ºC. Posteriormente, 5 μl do sistema de ligação foram utilizados para transformação de células
de E. coli DH5α, por choque térmico (método descrito anteriormente, item 4.7). Após a
transformação, as células foram plaqueadas em placas contendo ampicilina (100 μg/mL), e
das colônias que cresceram, quinze foram escolhidas, denominadas pHTRX1-1, pHTX1-2 até
pHTRX1-15 e posteriormente foram selecionadas para realização de PCR de colônia. Em
seguida, foram escolhidas três colônias para extração de DNA plasmidial. O DNA extraído
foi digerido com EcoR I e analisado com gel de agarose 0,8% para confirmação da presença
do inserto. Os cassetes de expressão foram submetidos a sequenciamento na Macrogen Inc.
para a análise da orientação correta do inserto.


80

Figura 110 – Vetor de expressã ão construíd do para pro odução de Trx1

T intraceelular em P.. pastoris
(pHTRX X1). A sequuência de nucleotídeos
n do cDNA da Trx1 está representtada no detaalhe. Em
vermelhoo estão repreesentadas as sequências ddos sítios de restrição.
5.19.1.22 - Constru
ução do veto
or pPTRX11 – Constru
ução 2
P
Para construução do vettor pPTRX 1 (Fig. 11),, foi realizaada a amplifficação na presença
p
dos oliggonucleotíddeos TRX.fw

fwd2 e TRX
X.rev1, com
m sequências flanqueaadoras conttendo os
sítios dde restrição para as en

nzimas Xhoo I e EcoR I. As condições da aamplificaçãão foram
descritaas no item 5.13. O produto ampllificado foii analisado em gel de agarose 0,,8%, em
tampão TEB (0,5X

X) e visualizzado pela ccoloração co
om brometo
o de etídeo para a conffirmação
da ampplificação. O produto da PCR fooi purificad

do usando o kit de puurificação de
d DNA
genômicco Wizard®
® (Promegaa Corporatioon, EUA) dee acordo com
m as instruçções do fabrricante e
em seguuida foi inseerido no vettor de clonaagem pGEM

M-T e transfo
formado em
m E. coli XL1 blue.

nsis em Pichia pa
astoris

81

Três clones obtidos na transformação foram escolhidos (pGTRX1-1, pGTRX1-2,
pGTRX1-3) e cultivados em 5 mL de meio LB a 37ºC por 16 h a 180 rpm, posteriormente foi
realizada extração de DNA plasmidial. 1 μg do DNA plasmidial foi digerido com a enzima de
restrição Xho I e EcoR I a 37 ºC por 3 h. O produto da digestão foi submetido à eletroforese
em gel de agarose 0,8%, o fragmento de aproximadamente 380 pares de base foi eluído do gel
e utilizado para clonagem no vetor de expressão pPIC9.
O plasmídio pPIC9 (1 μg) também foi digerido com as enzimas Xho I e EcoR I a 37ºC
por 3 h. O cDNA do clone pGTRX1-1 eluído foi ligado ao vetor de expressão pPIC9 na razão
de 1:5, utilizando a enzima T4 DNA ligase e tampão desta enzima de acordo com orientações
do fabricante (GIBCO) por 18 h a 4 ºC. Posteriormente, 5 μl do sistema de ligação foram
utilizados para transformação de células de E. coli DH5α, por choque térmico. Após a
transformação, as células foram plaqueadas em placas contendo ampicilina (100 μg/mL), das
colônias que cresceram, quinze foram escolhidas, denominadas pPTRX1-1, pPTX1-2 até
pPTRX1-15 e posteriormente foram selecionadas para realização de PCR de colônia. Em
seguida, foram escolhidas três colônias para extração de DNA plasmidial. O DNA extraído
foi digerido com Xho I e EcoR I e analisado com gel de agarose 0,8% para confirmação da
presença do inserto. Os cassetes de expressão foram submetidos a sequenciamento na
Macrogen Inc. para a análise da orientação correta do inserto.


82

Fig. 11 - Vetor dee expressão construído para produção de Trrx1 extracellular em P. pastoris
(pPTRX X1). A sequuência de nu ucleotídeos do cDNA da Trx1 esttá representa
tada no detaalhe. Em
vermelhoo estão repreesentadas as sequências ddos sítios de restrição.
5.19.2 - Transform
mação de céélulas de P. pastoris
A transform
mação foi realizada uutilizando o DNA lin
nearizado ((~10 μg) e células
competeentes de P.. pastoris, conforme iinstruções contidas

c no
o manual dde expressão
o em P.
pastoriss da Invitroogen (Origin

nal Pichia E
Expression Kit, númerro do catáloogo: K1710
0-01). A
eletropooração seguiu as condiçções já menncionadas (5

5.17).
O DNA plaasmidial do clone denom

minado pHTRX1-1 foii linearizadoo com Sac I por 3 h
a 37 ºC X1, gerandoo o fenótipo His+ Mut+ (Methanool utilization

C para inserçção em AOX n plus) e
com Noot I por 3 h a 37 ºC para

p H + MutS
substituuição do geene AOX1, gerando o fenótipo His
(Methannol utilization slow). Os

O plasmídeeos linearizaados foram precipitadoos como desscrito no
o em 10 μl de tampão TE e poste
item 4.99 e o precippitado foi ressuspenso
r teriomente utilizado
u
para a trransformaçãão de P. passtoris.

nsis em Pichia pa
astoris

83

O DNA plasmidial do clone denominado pPTRX1-1 foi linearizado com Sac I por 3 h
a 37 ºC para inserção em AOX1, gerando o fenótipo His+ Mut+ e com Bgl II por 3 h a 37 ºC
para substituição do gene AOX1, gerando o fenótipo His+ MutS. Os plasmídeos linearizados
foram precipitados ressuspensos em 10 μl de tampão TE e posteriomente utilizado para a
transformação de P. pastoris.
O vetores pHIL-D2 (Sac I e Not I) e pPIC9 (Sac I e Bgl II) também foram linearizados
com as enzimas de restrição e foram utilizados para transformação de P. pastoris funcionando
como controle negativo da expressão.
Após a transformação, as células foram plaqueadas em meio MD. Dentre os clones
crescidos em cada placa, 100 de cada condição foram escolhidos aleatoriamente e transferidos
para uma nova placa de meio MD (enumeradas de 1 a 100) e crescidos de 3 a 4 dias até o
crescimento das colônias. Esse procedimento foi repetido por 4 vezes em meio seletivo, para
certificar a integralização dos insertos.
5.19.3 - Seleção dos transformantes produtores da Trx1
Primeiramente foi realizada a seleção dos transformantes produtores da Trx1 em placa
do tipo deep well (96 poços) seguindo o método apresentado no item 5.19.1. Noventa e seis
clones foram crescidos e induzidos a produzir a Trx1. Para analisar a produção, foi realizado
ensaio imunoenzimático do tipo Dot Blot para avaliar qualitativamente a produção.
Paralelamente, foi realizado PCR de colônia de levedura para detectar a presença do
inserto nos clones transformantes. Foram selecionadas dez colônias de transformantes
contendo os cassetes (vetor com inserto) e duas colônias dos controles (vetor vazio) para
realização da PCR de colônia seguindo o protocolo descrito no item 5.18. Posteriormente,
quatro colônias de cada condição foram escolhidas para realização de produção em frasco de
250 mL.


84

5.19.3.1 - Seleção por Dot Blotting
As colônias de P. pastoris obtidas na transformação foram selecionadas inoculando as
leveduras em meio líquido BMG em placas do tipo Deep well (placa de 96 poços com fundo
redondo). As placas foram vedadas com filme plástico e incubadas por três dias a 30ºC a 200
rpm para crescimento das células. Após este período as células foram centrifugadas por 15
min a 3000 g e ressuspensas em meio BMM, sendo posteriormente incubadas por quatro dias
a 30ºC para a indução da produção da enzima recombinante na presença de metanol, sendo
que a cada 24 h foi acrescentado metanol para uma concentração final de 0,5%. Após este
período as células foram centrifugadas por 15 min a 3000 g e o sobrenadante de cultura
descartado para os clones de expressão intracelular e coletado para expressão extracelular.
Para a análise da produção da enzima Trx1 intracelular, inicialmente as células de P.
pastoris foram tratadas, permitindo a permeabilização da parede celular. A lise das células de
levedura foi efetuada por ruptura mecânica. Após a centrifugação, o precipitado celular foi
ressuspenso em 100 μL de tampão Breaking 1X, submetido a agitação vigorosa com esferas
de vidro (tamanho de 0,5 mm) durante 30 s e em seguida mantido 30 s no gelo, sendo este
processo repetido por oito vezes para o rompimento da parede celular por atrito. O extrato
periplasmático foi separado por centrifugação a 8.000 g por 10 min, e em seguida estocado a
4 °C até o momento do uso.
Para análise por Dot Blotting, adicionou-se 5 μL dos extratos protéicos obtidos
diretamente a uma membrana de nitrocelulose. Com a membrana seca, contendo as proteínas
ligadas, foi adicionada a solução de bloqueio e incubado por 1 h a temperatura ambiente sob
agitação branda. Após esse período, a membrana foi lavada 3 vezes com PBST 1X e
posteriormente incubada por 2 h a temperatura ambiente com anticorpo primário sob agitação
branda. Em seguida, procedeu-se o processo de lavagem por 3 vezes com PBST 1X. Logo
após, foi incubado com o anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina em um título


85

de 1:2000 por 2 h. Ao término desse processo, a membrana foi mais uma vez lavada com
PBST 1X por 3 vezes para remoção do anticorpo conjugado.
Posteriormente a membrana foi lavada com 10 mL de tampão APB (tampão da
fosfatase alcalina) adicionando-se a solução reveladora NBT/BCIP. O aparecimento das
bandas foi controlado visualmente. Após a reação, lavou-se a membrana com água destilada
para se retirar o excesso de solução reveladora e interromper a reação da enzima.
5.19.4 - Análise do perfil de proteínas produzidas pela P. pastoris em condições de
indução (adaptado do Manual do Kit de Expressão em P. pastoris).
Os transformantes que produziram uma quantidade maior de enzima no teste do dot
blotting e que amplificaram no PCR de colônia de levedura foram selecionados e testados
quanto à capacidade de produção enzimática em frascos erlenmeyer de 250 mL de
capacidade, contendo 50 mL de meio BMGY-U como pré-inóculo. As culturas foram
incubadas a 30ºC com agitação constante de 200 rpm até atingirem a DO600 entre 15 e 20. As
células foram centrifugadas a 3000 g durante 15 min, lavadas com água destilada estéril e
ressuspensas no meio BMMY-U. As colônias foram incubadas a 30ºC durante cinco dias,
sendo que a cada a cada 24 h foi acrescentado metanol para uma concentração final de 1 %, e
retiradas alíquotas de 1 mL, onde 0,9 mL foram para análise da cinética de produção e 100 μl
para a leitura da densidade celular. As alíquotas foram submetidas à centrifugação a 10.000 g
durante 10 min e o sobrenadante coletado para as amostras de produção extracelular e
descartado para as amostras de produção intracelular. Para a análise da produção da enzima
Trx1 intracelular, foi realizada a lise celular, já descrita anteriormente.


86

5.20 - Análise de proteína em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)
5.20.1 - Preparo da amostra de sobrenadante de cultura
Um volume de 900 μL das amostras protéicas foi precipitado na presença de 100 μL
de TCA 100%, homogeneizadas e incubadas em banho de gelo e água por 1 h, em seguida
foram submetidas à centrifugação a 8000 g a 4ºC durante 10 min. O sedimento resultante da
centrifugação foi lavado três vezes com 500 μL de acetona gelada, sendo repetida a
centrifugação nas mesmas condições citadas anteriormente. O sedimento resultante foi
ressuspenso em 30 μL de tampão de amostra e analisado imediatamente ou estocado a -20ºC
até a análise em gel SDS-PAGE.
5.20.2 - Condições da eletroforese em gel de poliacrilamida
A eletroforese de proteínas foi conduzida em gel desnaturante de poliacrilamida
segundo descrito por Laemmli (1970). As amostras do sobrenadante precipitado por TCA e
do extrato periplasmático contendo a enzima recombinante foram ressuspendidas em tampão
de amostra de proteína. Antes da aplicação no gel, as amostras foram fervidas durante 5 min
para a desnaturação das proteínas e logo em seguida colocado no gelo. As amostras foram
aplicadas em um sistema de gel de gradiente separador de 15% e 5 % e concentrador de 4%.
A eletroforese foi realizada por 3 h em voltagem de 120 V. Como marcador de massa
molecular para proteínas foi utilizado o “BenchMark Protein Ladder” (Invitrogen) e LMW
Calibration Kit For SDS Electrophoresis (Amersham).
5.21 - Coloração com nitrato de prata
Ao término da corrida, as bandas protéicas presentes no gel foram reveladas
utilizando-se o método descrito por Blum e colaboradores (1987). O gel foi incubado, sob
agitação moderada, durante 1 h na solução fixadora, em seguida, lavado 3 vezes na solução de


87

lavagem por 20 min cada vez. Após as lavagens, o gel foi incubado na solução de tratamento
por 1 min, lavado 3 vezes com água destilada por 30 s cada uma e, em seguida, incubado na
solução de equilíbrio por 20 min. Novamente o gel foi lavado com água destilada por 2 vezes
de 20 s e revelado com a solução de revelação. A reação foi interrompida, após o
aparecimento das bandas, transferindo-se o gel para a solução de parada.


exáâÄàtwÉá x
W|ávâááûÉ
Conhecimento do real é luz que
sempre projeta algumas sombras.
Nunca é imediato e pleno.
As revelações do real são recorrentes.
O real nunca é “o que se poderia achar”,
mas é sempre o que se deveria ter pensando.
(Gaston Bachelard)
Interessa-nos a verdade? Tem alguma importância?

...Onde a ignorância é uma benção é loucura ser sábio...
(Thomas Gray)


88

6 - Resultados e discussão
Ao escolher e trabalhar com sistemas de expressão heteróloga, alguns
questionamentos podem surgir como, por exemplo, qual sistema é adequado para que a
proteína de interesse seja expressa em altos níveis? Uma vez expressa, esta proteína é
funcional? Manteve características importantes para que a sua estrutura não tenha sido
alterada? Estas e muitas outras indagações poderão surgir, entretanto existem diferentes
sistemas de expressão a disposição que podem ser selecionados na tentativa de minimizar as
dificuldades que levam ao insucesso na obtenção do produto desejado.
Uma avaliação cuidadosa das características da proteína recombinante, juntamente
com a sua aplicação deve ser considerada ao selecionar o método de expressão. Infelizmente,
existem circunstâncias em que a escolha não é óbvia e vários hospedeiros devem ser avaliados
(revisado por Brondyk, 2009).
De acordo com a literatura, aproximadamente 39 % das proteínas recombinantes são
produzidas por E. coli, 35 % por células Ovário de hamster chinês (CHO), 17 % por
leveduras, 10 % por outro sistema de mamíferos e 1 % por outra bactéria e outros sistemas
(Demain e Vaishnav, 2009).
Uma característica interessante de P. pastoris é a possibilidade de se obter alta
densidade da proteína heteróloga em condições de cultura apropriadas. Estabelecida as
condições, a cultura de P. pastoris pode chegar entre 10 a 30 g/L de massa seca (Gellison et
al., 1992; Cregg, 2007).
O sistema de expressão de proteínas heterólogas em P. pastoris apresenta várias
vantagens, em relação aos sistemas que utilizam bactérias. No caso da expressão heteróloga
de PbTrx1 existem vantagens adicionais, já que P. brasiliensis e P. pastoris são exemplos
próximos de eucariotos e podem apresentar similaridade quanto ao processamento pós-


89

traducional do produto gênico. Estas características são desejáveis, pois possibilitam a
expressão da proteína recombinante PbTrx1 corretamente processada, possibilitando assim a
obtenção de uma proteína recombinante ativa.
A proteína gp43 de P. brasiliensis foi expressa como corpo de inclusão, insolúvel e
manteve-se fusionada com a GST (Glutationa-S-Transferase) quando expressa em E. coli
(Diniz et al., 2002). Posteriormente, foi produzida em P. pastoris com sucesso sob a forma
solúvel e glicosilada e pode ser usada para diagnóstico da paracoccidioidomicose (Carvalho et
al., 2008).
Digilio e colaboradores (2003) expressaram a Trx1 de Aliciclobacillus acidocaldarius
(AliTrx1) em P. pastoris visando produzir maiores quantidades que o obtido em E. coli
(Bartolucci et al., 1997). Foram obtidos 0.9 g/L de proteínas secretadas no meio de cultura,
cerca de 90 vezes mais do que a AliTrx1 produzida em E. coli.
O papel desempenhado pela Trx no funcionamento das células abriu as portas para a
sua aplicação biotecnológica para a solução de uma série de problemas relacionados à
nutrição e a medicina, bem como a redução da alergenicidade de alimentos e aumento da
digestibilidade, em doenças inflamatórias, controle da progressão das viroses, na inativação
de várias neurotoxinas presentes em venenos (Buchanan et al., 1994; Lozano et al., 1994; Del
Val et al., 1999; Li et al., 2009). Algumas proteínas heterólogas são produzidas sob a forma
de agregados insolúveis, a sua solubilidade pode ser aumentada usando para isso a fusão de
seus genes (co-produção) ao gene da Trx de E. coli (LaVallie et al., 1993; Yasukawa et al.,
1995; Zhan et al., 2003; Chen et al., 2005; Tomala et al., 2010).
Com objetivo de alcançar níveis de produção maior do que os obtidos pela expressão
em E. coli e para posterior estudo da proteína recombinante procedeu-se a clonagem do gene
codificante para expressão de Trx1 em P. pastoris.


90

6.1 – Obtenção do cDNA/Trx1
Em trabalho realizado anteriormente pelo grupo, o cDNA codificante para Trx1 do
fungo patogênico humano P. brasiliensis (número de acesso AY376435) foi isolado da
biblioteca de cDNA e caracterizado. Este cDNA foi clonado em vetor de expressão pGEX 4T-
3 e transformado em E. coli. O plasmídeo pGEX-TRX1 foi utilizado como molde para as
amplificações. O produto da amplificação do gene delimitado pelos oligonucleotídeos
específicos e conservando os códons de iniciação e terminação originais, resultou num
fragmento de aproximadamente 380 pares de bases, correspondendo ao quadro aberto de
leitura (ORF) do cDNA que codifica Trx1 acrescido de 18 pb que correspondem aos sítios de
clivagem das enzimas de restrição e sítios de ancoragem à sequência molde (Fig. 12).
Os sítios de restrição para a enzima EcoR I foram adicionados às extremidades 5’ e 3’
do gene, para que fosse possível a clonagem no vetor pHIL-D2. Para a clonagem no vetor
pPIC9, foram adicionados os sítios de restrição para as enzimas Xho I e EcoR I nas
extremidades 5’ e 3’, respectivamente.


91

Figura 12 - Análisee eletroforética em gel de agarosee 0,8%, cora ado com brrometo de etídio,
e do
produtoo de amplificcação relativvo ao cDNA A trx1 obtido o por PCR. 1- Marcadorr de massa molecular
m
– 100 pbb ladder (Feermentas); 2 - Produto daa amplificaçção (fragmen
nto de DNA de aproximaadamente
380 pb)) utilizando como mold de o plasmíddeo pGEX-TRX1 e os oligonucleootídeos TRX X.fwd1 e
TRX.revv1; 3 - Produuto da ampliificação (fraggmento de DNA
D de apro
oximadamennte 380 pb) utilizando
u
como moolde o plasmmídeo pGEX--TRX1 e os ooligonucleotíídeos TRX.fw fwd2 e TRX.rrev1.
6.2 – Cllonagem doo cDNA/trx

x1 no vetor pHIL-D2 e pPIC9
A
Algumas ettapas interm
mediárias fo
foram necesssárias paraa obter a coonstrução final
f dos
vetores de expresssão pHTRX

X1 e pPTRX
X1 (Fig. 10
0 e 11). A subclonagem
s m em pGE
EM-T foi
uma esttratégia utiliizada para o inserto desstinado ao vetor

v pPIC9
9, para que ffosse possív
vel obter
insertoss com sítioss de restriçãão adequadoos para a trransferênciaa do cDNA

A/trx1 em co
ondições
corretass de fase de leitura paraa o vetor de expressão.
O produto de
d PCR desstinado ao vvetor pHIL-D2 (Fig. 12
1 – linha 22) foi purifi
ficado do
gel de agarose e digerido co

om a enzim
ma EcoR I. Posteriorm
mente, o fraagmento fo
oi ligado

nsis em Pichia pa
astoris

92

diretam
mente ao vetor pHIL-D
D2 previam
mente linearrizado com EcoR I e defosforilaado para
evitar a recircularizzação, levan

ndo a constrrução do veetor pHTRX
X1.
O produto de
d PCR desttinado ao veetor pPIC9 (Fig. 12 – linha
l 3) tam
mbém foi pu
urificado
do gel de agarosee e posterio

ormente liggado ao vettor pGEM--T. O vetorr pGEM-TR
RX1 foi
introduzzido em céllulas da lin

nhagem XL 1-blue de E.
E coli por choque térm
mico e triadas com
auxílio da coloraçção das colônias (braancas ou azzuis). Foram selecionnadas sete colônias
brancas para realizzação de ex

xtração de DNA plasm
midial e posterior clivvagem com Xho I e
EcoR I ppara verificcação da preesença do innserto e puriificação (Fiig. 13).
Figura 113 – Análise eletroforética em gel de agarose 0,8 %, corrado com brrometo de etídio, e do
produtoo da digestãoo do vetor pGEM-TRX
p X1. MM – Marcador de peso p molecullar (KiloBasee™ DNA
Marker); I – Vetor inntacto. Clonees 1 a 7 - é ppossível obseervar o produ
uto da digesttão no quadrro branco
(um fraggmento de ~ 380 pb) corrrespondendoo ao fragmento do cDNA A/Trx 1, moostrando o suucesso da
construçção.
O fragmentto correspondente ao ccDNA/Trx 1 do clone 1 foi purifficado do gel

g e em
seguidaa inserido noo vetor pPIC

C9, previam
mente linearizado com as
a enzimas de restrição
o Xho I e
EcoR I,, gerando o vetor pPT

TRX1. A cloonagem do cDNA/Trxx 1 foi direccionada de modo a
entrar em
m fase com
m o peptídeo
o sinal do fat
ator-α de S. cerevisiae
c codificado
c ppelo vetor.

nsis em Pichia pa
astoris

93

O
Os vetores pHTRX1 e pPTRX1 fforam introd
duzidos em células da linhagem DH5α
D de
E. coli por choque térmico. Foram seleecionadas quinze

q colô
ônias de cadda construçção para
verificaação da pressença do inserto por PC

CR de colô
ônia com oss oligonucleeotídeos esp
pecíficos
(Fig. 144).
Figura 114 – Análisee eletroforéttica em gel de agarose 0,8 %, cora ado com broometo de ettídio, dos
transforrmantes por PCR de colônia. Fooram selecio onados 15 clones
c de ccada constru
ução. Foi
verificadda a presençaa de um frag
gmento de approximadam mente 380 pb,, corresponddendo ao cDNNA/trx 1.
Os clonees selecionados (quadrado branco) fforam subm metidos à extração de DN NA plasmidiial. MM-
marcadoor de peso molecular
m (100 bp DNA L Ladder). Con
nstrução 1 – PCR de colôônia para con
nfirmar a
presençaa de inserto nas
n células dee E. coli trannsformadas com
c o vetor pHTRX1;
p Coonstrução 2 – PCR de
colônia para confirm mar a preseença de inseerto nas célu ulas de E. coli transforrmadas comm o vetor
pPTRX11.
Em seguuida, foram
m selecionaados aleato
oriamente três transfo
formantes de
d cada
construçção (pHTR
RX1-1, pHT
TRX1-3, pH
HTRX1-12 e pPTRX1-1, pPTRX
X1-4 e pPTR
RX1-10)
para exttração de DNA

D plasm
midial para vverificação da presença do insertoo por clivag
gem. Os
transforrmantes seleecionados estão represeentados na figura

f quadro brannco). A clivagem do
12 (q
DNA pplasmidial liberou

l m fragmentoo de aproximadamentee 380 pb correspondendo ao
um
cDNA ddo gene trx11, conformee esperado ((Fig. 15).

nsis em Pichia pa
astoris

94

Figura 115 – Análise eletroforética em gel de agarose 0,8 %, corrado com brrometo de etídio,
e do
produtoo da digestãoo dos vetorees pHTRX1 e pPTRX1. MM- marc cador moleccular; 1, 3 e 5- vetor
pHTRX X1 intacto; 2,
2 4 e 6- perrfil da digesstão dos vetores: pHTRRX1-1, pHT TRX1-3 e pH HTRX1-
12 com a enzima EcoR
E I; 7, 9 e 11 – vetoor pPTRX1 intacto; 8, 101 e 12 – peerfil da digeestão dos
vetores pPTRX1-11, pPTRX1--4 e pPTRX X1-10 clivaados com asa enzimas X Xho I e EccoR I. O
quadro bbranco mosstra o fragmmento de 3800 pb, liberaddo por partee dos vetorees.
Com o objetivo
o de confirmar a sequênciia do cDNA
A e verificcar a orienttação do
inserto, os vetores pHTRX1-1

1, pHTRX1 -3, pHTRX
X1-12 e pPT
TRX1-1, pPPTRX1-4, pPTRX1-
10 foram submetiddos ao sequ

uenciamentto. Para issso as amosttras de DN
NA plasmidial, bem
como oos oligonuclleotídeos (T

Tabela 4), fforam enviados a Maccrogen Inc. para realizzação do
sequencciamento. As
A sequênciias obtidas foram anallisadas utiliizando o sooftware Seq
quencher
4.1.4 (G
Genecodes, Inc,
I Ann Arrbor, Michiigan USA) para
p a avaliação da quaalidade e mo
ontagem
dos conntigs dos frragmentos (Fig. 16). A sequênciia resultantte foi subm
metida ao programa
p
BLAST
T, disponíveel na página eletrôniica do NC
CBI (http://w
www.ncbi.nnlm.nih.gov
v/), para
comparaar com as sequências depositadas

d no banco de
d dados e apresentou
a iidentidade de
d 100%

nsis em Pichia pa
astoris

95

com a ssequência doo cDNA trxx1 de P. braasiliensis (A

AY376435) e um e-vallue = 0.0, in
ndicando
que o fr
fragmento clonado nos vetores pH
HIL-D2 e pP
PIC9 corressponde ao ggene codificcador da
tiorredooxina 1. Toddos os veto

ores analisaddos apresen
ntaram sequ
uência hom
mologa a Trx
x1 de P.
brasilieensis e o innserto foi introduzido na orientaação corretaa (in framee). Para a etapa
e de
transforrmação em P.
P pastoris foram escollhidos os veetores pHTR
RX1-1 e pPPTRX1-1.
Figura 116 - Repressentação dass sequênciass de nucleotídeos obtid das a partir do sequencciamento
dos plassmídeos pHIIL-D2 e pPIIC9 no qual o cDNA/trx x1 foi clonad
do. A – Sequuência obtidaa do vetor
pHTRX1-1; em azull o sítio paraa o oligonuclleotídeo 5’ AOX1
A (868-888), em veermelho o síttio para a
enzima E EcoR I, em amarelo o códon
c de iniiciação (ATG G), em negriito a sequênncia correponndente ao
cDNA/trrx1, em lilás o codon de terminação (TGA), em verde claro o sítio para o oligonucleeotídeo 3’
AOX1 (1036-1056). B – Sequênccia obtida doo vetor pPTR RX1-1; em azzul o sítio paara o oligonu
ucleotídeo
5’ AOX1 (855-875),, em cinza o sítio para o pprimer α-fato
or (1152-117
72), em verdee escuro o sítio para a
enzima X Xho I, em amarelo
a o có
ódon de iniciiação (ATG), em negrito a sequênccia correspon ndente ao
cDNA/trrx1, em lilás o códon de terminação ((TGA) e em verde claro o sítio para o oligonucleeotídeo 3’
AOX1 (1327-1347).

nsis em Pichia pa
astoris

96

6.3 – Transformação de P. pastoris
Após a confirmação da orientação correta dos insertos nos vetores pHIL-D2 e pPIC9 e
da elevada identidade com a sequência da proteína nativa de P. brasiliensis foi iniciada a
transformação da levedura P. pastoris. Os transformantes de E. coli contendo os vetores
pHTRX1-1 e pPTRX1-1 foram submetidos à nova extração de DNA plasmidial.
O DNA plasmidial extraído foi linearizado para formação do cassete de expressão e
posterior integração no genoma da levedura. As células de P. pastoris foram transformadas
com duas construções diferentes do vetor pHTRX1, duas do vetor pPTRX1, bem como os
controles pHIL- D2 e pPIC9, sem inserto. As construções foram as seguintes:
A – O vetor pHTRX1 foi linearizado com a enzima de restrição Sac I para liberação do
cassete de expressão e inserção no lócus gênico AOX1 da levedura (gerando o fenótipo Mut+)
(Fig. 17) e linearizado com a enzima de restrição Not I para a liberação do cassete de
expressão e da região promotora e terminadora do gene AOX nas laterais (gerando o fenótipo
MutS) (Fig. 18).
B – O vetor pPTRX1 foi linearizado com a enzima de restrição Sac I para liberação do cassete
de expressão e inserção em AOX1 (gerando o fenótipo Mut+) (Fig. 17) e linearizado com a
enzima de restrição Bgl II para a liberação do cassete de expressão e a região promotora e a
terminadora do gene AOX nas laterais (gerando o fenótipo MutS) (Fig. 19).
C – O vetor vazio pHIL-D2 digerido com Sac I e Not I (dado não mostrado).
D – O vetor vazio pPIC9 digerido com Sac I e Bgl II (dado não mostrado).


97

Figura 17 - Repressentação do os vetores liinearizados para forma ação dos caassetes de expressão
introduzzidos na levedura P. pastoris. A-Veetor pHTRX1 1 mostrando a posição dee clivagem dad enzima
de restrição Sac I. B -Vetor pPT TRX1 mostraando a posiçção de clivaggem da enzim ma Sac I. C- Análise
eletroforrética em gell de agarose 0,8
0 %, coraddo com brom meto de etídio
o, do produtoo da clivagem
m por Sac
I. MM M - Marcadoor de peso molecular; 1 e 4 – Vetores pHIL L-D2 e pPIC C9 não lineearizados,
respectivvamente; 2 e 3 – Vetor pHTRX1 linnearizado co om Sac I; 5 e 6 – Vetor pPTRX1 lin nearizado
com Sacc I.

nsis em Pichia pa
astoris

98

Figura 118 – Represeentação do vetor

v pHTR RX1 linearizzado para formação do ccassete de expressão
introduzzido na leveedura P. pastoris. A- Vettor pHTRX1 1 . B – Repreesentação doo cassete de expressão
e
linearizaado com a enzima
e Not I.
I C - Análiise eletroforéética em gell de agarosee 0,8 %, corrado com
brometo de etídio, dod produto da M - Marcador de peso molecular; I - Vetor
d clivagem ppor Not I; MM
pHIL-D22 não lineariizado; II - Veetor pHTRX 1 linearizado
o com Not I, liberando doois fragmentos, sendo
s integra noo genoma da levedura é representado
que o caassete de exppressão que se r o pelo fragmeento de ~
5700 pb..

nsis em Pichia pa
astoris

99

Figura 119 – Representação do vetor

v pPTRRX1 linearizado para formação do ccassete de expressão
introduzzido na leveedura P. passtoris. A- Veetor pPTRX11 . B – Repreesentação doo cassete de expressão
e
linearizaado com a enzima
e I C - Anál ise eletroforrética em gel de agarosee 0,8 %, corrado com
Bgl II.
d produto da clivagem ppor Bgl II; MM
brometo de etídio, do M - Marcaador de pesoo molecular; I - Vetor
pPIC9 nnão linearizaddo; II - Veto
or pPTRX1 llinearizado com
c Bgl II, liberando
l doois fragmento
os, sendo
que o caassete de exppressão que se
s integra noo genoma da levedura é representado
r o pelo fragmeento de ~
6000 pb..
O
Os cassetes de expreessão pHIL
L-D2/trx1/N
Not I e pP
PIC9/trx1/Bggl II favorrecem a
substituuição do lóccus de AOX

X1 nocauteaando o gen
ne AOX1, dessa
d formaa o metabollismo de
metanoll é realizadoo apenas po

or AOX2, leevando assiim a um creescimento leento em meetanol, o
t ntes MutS. A expulsão de AOX1 ocorre em um

que caraacteriza os transforman ma frequênccia de 1-
5 a cadda vinte trannsformantess (Sreekrishhna et al., 1997). Os cassetes

c pH
HIL-D2/trx1
1/Sac I e
pPIC9/ttrx1/Sac I podem see integrar em diferen

ntes regiõees do genooma, apressentando
crescim Mut+. Os controles

mento normaal em metaanol, o quee caracterizza os transfformantes M c

nsis em Pichia pa
astoris

100

negativos utilizados foram os vetores pHIL-D2 e pPIC9 sem inserto linearizados com as
mesmas enzimas de restrição utilizadas para linearizar os cassetes de expressão.
Alguns relatos na literatura sugerem que para a expressão intracelular, é preferível
usar células com fenótipo MutS, pois eles terão níveis baixos da proteína álcool oxidase e a
proteína heteróloga expressa pode ser purificada com mais facilidade. Para secreção, qualquer
uma das construções Mut+ ou MutS podem ser usadas (Sreekrishna et al., 1997). O ideal para
um dado produto é testar a expressão em ambos os contextos (Cos et al., 2005).
Abdelmoula-Souissi e colaboradores (2007) expressaram um supressor de tumor
humano (P53) em P. pastoris tanto na forma intracelular como na forma secretada e
analisaram os fenótipos Mut+ e MutS. A P53 produzida intracelularmente foi produzida com
sucesso tanto pelo MutS quanto na construção Mut+, já a produzida na forma secretada foi
produzida em maior quantidade na construção MutS que, apresentou não apenas um aumento
na produção da P53, mas também na sua secreção.
Vassileva e colaboradores (2001) expressaram o antígeno de superfície da hepatite B
(HBsAg), que apresenta vários domínios transmembrana, em P. pastoris e concluíram que a
secreção não é uma boa estratégia para a expressão de HBsAg em linhagens MutS. Não foi
observada uma grande diferença no nível de expressão de IFN-λ 1 (intérferon lambda) de
humano em P. pastoris comparando os fenótipos MutS e Mut+, onde os níveis de proteína
produzida foi de 65 mg/1-1, representando cerca de 57 % do total de proteínas secretadas (Xie
et al., 2007). Embora não seja claro qual fenótipo “Mut” é mais sensível ao acúmulo de
metanol, vários pesquisadores publicaram opiniões diferentes a esse respeito. Stratton e
colaboradores (1998) e Chiruvolu e colaboradores (1997) alegaram que Mut+ são mais
sensíveis ao acúmulo de metanol; enquanto Kim e colaboradores (1997), Clare e Romanos
(1995) e Romanos (1995) propuseram que o oposto era verdadeiro.


101

A
Após a lineearização, oss cassetes fo
foram introd
duzidos na levedura
l P. pastoris SM
MD1168
competeente por elletroporação

o. Os transsformantes foram seleecionados ppela capaciidade de
crescer em meio seletivo sem

m histidinaa por quatrro repiques consecutivvos. Foram obtidos
aproxim
madamente sessenta transforman
t ntes por μg
μ de DNA. Para oos repiquess foram
selecionnados cem colônias

c de cada constrrução (Fig. 20).
Figura 220 - Represeentação das placas de cu

ultivo dos trransformanttes de P. passtoris obtidos.
A determinação do gen
nótipo de uttilização do
o metanol e a verificaçãão da integrração do
cassete de expressão no geno

oma da leveedura P. pa
astoris podee ser realizaada pela técnica de
PCR. Foi realizadaa PCR de colônia

c de lleveduras, por
p se trataar de um m
método de sccreening
m testados dez transfformantes de cada

rápido e simples (Mirhendi et al., 20007). Foram
construçção e doiss transform

mantes dos controles negativos.
n Para as am
mplificaçõees foram
utilizadoos os oligonnucleotídeo
os 5’ AOX1 e 3’ AOX1
1 (tabela 4)). Os produt
utos da ampllificação
dos vetoores vazioss, pHIL-D2 e pPIC9, ccorrespondeem a 188 pb

p e 492 pbb, respectiv
vamente.
Como o cDNA da Trx1 tem aproximada

a amente 380 pb o produ
uto esperadoo para o pH
HTRX1 é
de 568 ppb (188 + 380

3 = 568) e o produtoo esperado para
p o casseete de expreessão pPTR
RX1 é de
872 pb (496 + 380 = 872). O resultado ddas amplificcações está representad

r do na figura
a 21. Foi
utilizadoo como conntrole positiv

vo o DNA pplasmidial obtido
o e não
o linearizaddo.

nsis em Pichia pa
astoris

102

Figura 221 – Análisee eletroforéttica em gel d

de agarose 0,8
0 %, corad do com brommeto de etíddio, para
confirm
mar a presença do cDNA A/trx 1 nas ccélulas de P.. pastoris. MM-
M marcadoor de peso molecular;
m
1 a 10 – Ampliconss derivados de colônias diferentes; 11 e 12 – Controles,
C veetor vazio; 13
1 e 14 -

nsis em Pichia pa
astoris

103

Controles positivos (DNA plasmidial). A – pHTRX1/Sac I; B - pHTRX1/Not I; C – pPTRX1/Sac I; D

– pPTRX1/Bgl II.
No caso da seleção de transformantes Mut+, é possível visualizar duas bandas. Uma
correspondendo ao tamanho do cassete de expressão e a outra para o gene AOX1 nativo
(aproximadamente 2,2 kb). No caso da integração por substituição do AOX1 (MutS), é
possível ver apenas a banda correspondente ao cassete de expressão. De acordo com o
observado na figura 21, não foi possível observar o fragmento de 2,2 kb nos possíveis
integrantes Mut+. Isto possivelmente se deva à baixa processividade da enzima utilizada.
6.4 – Análise da produção de Trx1 por P. pastoris em placa Deep-weel
Os transformantes foram analisados quanto à capacidade de produzir e secretar a
tiorredoxina recombinante (rTrx1). Para seleção dos transformantes produtores da rTrx1
foram selecionados noventa e seis (96) de cada construção, correspondendo a trezentos e
oitenta e quatro no total (384). A seleção foi realizada após cultivo em meio BMMY para a
indução da proteína recombinante na presença de metanol, em placas do tipo Deep weel (com
96 poços). Os sobrenadantes de cultura e o extrato periplasmático dos transformantes foram
coletados após 4 dias de indução e analisados por Dot Blotting para verificação da presença da
proteína (Trx1). Foram escolhidos inicialmente dez clones (os mesmos do PCR de colônia de
levedura) para análise pelo Dot Blotting (Fig. 22).


104

Figura 22 – Análise por Dot Blotting daa produção o da proteín na recombiinante Trx1 por P.
pastoriss. 5 μl do sobrenadan nte de cultuura (A- pP PTRX1/Bgl II; B- pPT TRX1/Sac I e seus
respectiivos controoles negativ
vos C1 e C C2) e do lisado celu ular (C- pH HTRX1/ No ot I; D-
pHTRX X1/Sac I e seus respecttivos controoles negativos C3 e C4 4) foram apllicados direetamente
na memmbrana de niitrocelulosee. Procedeu--se o bloqueeio e a revelação onde foi utilizad
do o anti-
Trx feito em coelhoo como antiicorpo prim
mário e anti-IgG de coellho feito emm cabra conjjugado à
fosfatasse alcalina como
c secunndário. Os ttransformanntes analisaddos nessa pprimeira etaapa estão
represenntados de 1 a 10. Foi utilizado ccomo contro ole positivo
o a Trx1 proroduzida emm E. coli
(C5).
O sobrenaddante de culttura (SC) doo restante dos transform

mantes (96 dde cada con
nstrução)
também ot Blotting (dados não

m foi analisaado por Do o mostradoss). Não foi possível deetectar a
presença da Trx1 no
n SC dos transforman
t ntes (pPTRX
X1/Bgl II e pPTRX1/Sa
Sac I). Apesar disso,
quatro ttransformanntes (denom TRX1-1, 2, 3 e 4) foram

minados pPT m selecionaados para ex
xpressão
em frassco de culttura, visand

do expressãão em maiior escala. Quanto à análise do
o extrato
periplassmático, foii possível observar

o quue os transfformantes analisados
a (pHTRX1/ Not I e
pHTRX
X1/Sac I) mostraram
m a presença da rTrx1, porém os controles negativos também
reagiram
m com o anticorpo
a an
nti-Trx1. Issso possivelmente se deve a nãoo especificiidade do
anticorppo policlonaal e provav P. pastoris. Não foi

velmente peela presençaa de Trx naa levedura P
realizadda a análise para os deemais transfformantes (os de expreessão intraccelular), visto que o

nsis em Pichia pa
astoris

105

resultado, devido aos fatores acima citados, seria o mesmo para os demais. Escolhemos quatro
transformantes denominados pHTRX1-1, 2, 3 e 4 para realização da produção em frasco.
Alguns autores relataram que não conseguiram detectar a proteína desejada no meio de
cultura devido às propriedades estruturais da proteína que podem influenciar a eficiência de
secreção e/ou a sua estabilidade (Cereghino et al., 2002).
6.5 - Análise da produção da proteína rTrx1 em frasco pela levedura P. pastoris
Este experimento teve como finalidade a de determinar a produção da Trx1 em frasco
e verificar o perfil de proteínas no sobrenadante de cultura e no extrato periplasmático. Os
transformantes selecionados foram os que apresentaram integração do cassete de expressão
(analisados por PCR). Os transformantes selecionados na etapa anterior, bem como os
controles negativos foram cultivados em BMMY-U, e as alíquotas do sobrenadante e do
extrato periplasmático foram coletadas em diferentes tempos (de 0, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e
120 h) e analisadas quanto ao perfil de proteínas em SDS-PAGE (Dados não mostrados).
No caso da produção intracelular, foi visualizada uma banda, muito fraca, entre as
bandas de 10 e 15 kDa do MM (Fig. 23). Não foi possível verificar a presença da banda
correspondente ao produto do gene da Trx1 nos transformantes pPTRX1, cuja banda esperada
seria de aproximadamente 12 kDa (Fig. 24). Em função dos resultados da produção da
proteína intracelular ter sido muito escassos em termos de quantidade de proteína, a estratégia
será em segundo momento estabelecer uma cinética melhor de produção e procurar protocolos
alternativos de extração de proteínas de leveduras que sejam mais eficientes.


106

Figura 23 - Anállise do perrfil eletrofo rético de proteínas

p do
d extrato periplasmá ático dos
transforrmantes quee integraramm o cassete de expressão pHTRX1/Sac 1 e pH HTRX1/Not I de P.
pastoris em gel de poliacrilamid
p da (15%) coorado por co omassie. 1- Controle
C neggativo (Transsformante
com pH HIL-D2 vazioo); Poço 2 e 3 – Extraato periplasm mático do trransformantee pHTRX1-1 1/Sac I e
pHTRX1-3/Sac I; 4 e 5 – Extratoo periplasmáático do transsformante pH
HTRX1-1/NoNot I e pHTRX X1-3/Not
I; 6 – Maarcador de massa
m molecu
ular.
Figura 24 - Análiise do perfiil eletroforéético de prroteínas do sobrenadan ante de culttura dos

transforrmantes quee integraramm o cassete de expressão pPTRX1 1/Sac 1 e pPPTRX1/Bgl II de P.
pastoris em gel de poliacrilamid
p da (15%) coorado por co omassie. 1- Controle
C neggativo (Transsformante
com pPIIC9 vazio); Poço 2 e 3 – Sobrenaadante de cultura c do trransformantee pPTRX1-1 1/Sac I e
pPTRX11-3/Sac I; 4 e 5 – Sobrenaadante de cuultura do tran
nsformante pPPTRX1-1/Bggl II e pPTRX1-3/Bgl
II; 6 – M
Marcador de massa
m moleccular.

nsis em Pichia pa
astoris

107

Digilio e colaboradores (2003) obtiveram sucesso com a produção de Trx1, utilizando
o vetor pPIC9, o que não foi o caso deste trabalho, apesar da evidência do sucesso da
integração do cassete de expressão no genoma da levedura. A ausência de expressão rTrx1 no
SC desencadeou várias reflexões, dentre elas que o problema poderia estar relacionado com a
não reconstituição do sítio de kex2 na sequência, logo o peptídeo sinal não foi processado e a
proteína foi retida intracelularmente.
Em função deste fato, o sedimento celular da produção em frasco, que havia sido
armazenado, foi lisado para liberação do extrato periplasmático e o mesmo analisado por Dot
Blotting e em gel SDS PAGE, e para confirmação do ocorrido à proteína realmente não foi
secretada, ficando retida intracelularmente (dados não apresentados).
Reforçando a hipótese, foi relatada a retenção intracelular de proteínas recombinantes
em protocolos de expressão por meio do sistema de P. pastoris em fragmentos de anticorpos
scFV (Gasser et al., 2006) e tripsinogênio humano (Maurer, 2003, apud, Gasser et al., 2006,
p.360).
A sequência preproteína do fator-α de S. cerevisiae vem sendo usada com sucesso para
a expressão de proteínas heterólogas na forma secretada em P. pastoris. Tem sido
demonstrado que a produção do fator-α “maduro” a partir da molécula precursora ocorre pela
ação de peptidases em sítios específicos dentro do precursor (Ghosalkar et al., 2008).
O processamento do peptídeo sinal envolve três passos. Primeiro, a remoção do pré-
sinal pela peptidase no RE. Segundo, a endopeptidase Kex2 reconhece o duplo par de
resíduos Lys- Arg no pró-sinal. Este processo é rapidamente seguido pela clivagem da
repetição Glu-Ala (EAEA) por Ste13 (Fig. 25). A eficiência desse processo pode ser afetada
pela sequência de aminoácidos presentes em torno do sitio de clivagem. Por exemplo, é
sabido que a eficiência de clivagem, tanto de Kex2 quanto de Stel3, pode ser influenciada pela


108

proximiidade de ressíduos de prrolina. Além

m do mais, a estrutura terciária
t forrmada pela proteína
exógenaa pode prooteger os siitios de clivvagem de suas respecctivas proteeases (Cereeghino e
Cregg, 22000).
Figura 225 - Região C-terminal

C do fator-α m
mostrando os
o sítios de clivagem de K 13.
Kex2 e Ste1
D
Durante a produção
p da
d proteína heteróloga precedida pela sequênncia prepro
oteína do
fator-α em célulass de levedurras, pode ssurgir uma situação qu

uando o sítitio para dip
peptidase
Stel3 see mantém e a repetição

o EAEA nãoo é completamente rem
movida da reegião N-term
minal da
proteínaa madura (B
Brake et al., 1984; Godda et al., 200
00; Carresi et
e al., 2006)).
C
Carresi e coolaboradorees (2006) uttilizaram o vetor de ex
xpressão pPPIC9 para ex
xpressão
do cDN
NA da cerrato-platanin
na (CP) doo fungo Ceratocystis
C fimbriata em P. pa
astoris e
obtiveraam em um primeiro
p ex
xperimento a proteína secretada acrescida dee quatro resíduos na
região N
N-terminal (EAEA),
( in
ndicando quee o produto
o do gene ST
TE13 não fooi capaz de eliminar
essa seqquência. Parra obter a rCP sem nennhuma sequ

uência adiciional no N--terminal, o gene cp
foi clonnado com Xho

X I / Eco
oR I no sittio de clonaagem do pllasmídeo pPPIC9 sem inserir a
sequênccia de Glu-Glu-Ala-Alla (EAEA) após o sítiio de KEX2

2, o mesmoo feito por Brake e
colaboraadores (19884).
T
Três caracteerísticas ind
dependentess poderiam ser associad
das com o aaumento/dim
minuição
do nível de expressão: (i) a raara ocorrênccia de regiõ

ões ricas em
m AT no cD
DNA está associado
com um
m nível de expressão
e elevada, (ii) um alto po
onto isoeléttrico está asssociado co
om a não

nsis em Pichia pa
astoris

109

detecção da proteína; (iii) a ocorrência de proteínas homólogas na levedura está associada
com um sucesso geral no experimento de expressão (Boettner et al., 2007).
Apesar da experiência com a expressão de proteínas, ainda é trabalhoso encontrar a
combinação correta de proteína e hospedeiro, isso é uma questão de "tentativa e erro" e depois
para melhorar a produção de proteína quando finalmente se obtêm sucesso na expressão
(Yokoyama, 2003).


VÉÇvÄâáÆxá x
cxÜáÑxvà|ätá
(...) Divino emplasto, tu me darias o primeiro lugar entre os

homens, acima da ciência e da riqueza, porque eras a genuína e direta inspiração do céu. O
acaso determinou o contrário; e ai vos ficais eternamente hipocondríacos. (...)
Memórias Póstumas de Braz Cubas - Machado de Assis.


110

7 - Conclusões e Perspectivas
Com base nos resultados obtidos neste trabalho foi possível concluir que:
 O cDNA correspondente ao gene trx1 de P. brasiliensis foi clonado nos vetores de
expressão pHIL-D2 e pPIC9, para expressão intracelular e extracelular,
respectivamente. Os vetores construídos foram submetidos ao sequenciamento sendo
confirmada a orientação do inserto (in frame) e foi verificada a homologia com a Trx1
de P. brasiliensis.
 O procedimento de clonagem em células de leveduras P. pastoris dos vetores
contendo o gene trx1, foi realizado e permitiu a obtenção de clones de leveduras
transformantes. Foi confirmada a integração do cassete de expressão no genoma da
levedura P. pastoris.
 O sistema adotado para expressão intracelular da Trx1 utilizando a linhagem
SMD1168 de P. pastoris e o vetor pHIL-D2 apresentou baixos níveis de produção da
proteína recombinante PbTrx1 que, posteriormente, serão otimizados.
 Não foi possível detectar a proteína recombinante com o sistema adotado para
expressão extracelular da Trx1 utilizando a linhagem SMD1168 de P. pastoris e o
vetor de secreção pPIC9, apesar do sucesso da integração do cassete de expressão.


111

A partir destas conclusões têm-se como perspectivas:
 Como o sítio de Kex2 não foi reconstituído, repetir a estratégia de expressão em pPIC9,
permitindo o correto processamento do peptídeo sinal.
 Realizar o procedimento de otimização das condições de temperatura, pH, fonte de
carbono, aeração entre outros para melhorar a eficiência da produção intracelular e
proceder a purificação da proteína recombinante.
 Decifrar estrutura tridimensional da proteína recombinante.
 Determinação da relação existente entre estrutura e função por meio de experimentos de
mutações sitio-dirigidas.
 Analisar as possíveis interações da Trx1 com outras moléculas.
 Avaliar potenciais aplicações biotecnológicas, especialmente na nutrição e na medicina.



exyxÜ£Çv|tá
u|uÄ|ÉzÜöy|vtá
(...) os poderes sem precedentes que a ciência
põe agora a nossa disposição devem ir
acompanhados de uma grande atenção ética e
preocupação por parte da comunidade científica...
além de uma educação pública
apoiada fundamentalmente na importância da ciência e a democracia.
(Carl Sagan em O mundo assombrado pelos demônios)


112

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Orientadora: Rossália Santos Amorim Jesuíno

Universidade Federal de Goiás

Clonagem e expressão da tiorredoxina 1 de

Lorena Cardoso Cintra

Orientadora: Rosália Santos Amorim Jesuíno

Co-orientadora: Fabrícia de Paula Faria

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Goiânia – Goiás – Brasil,

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Cintra, Lorena Cardoso.

Orientadora: Profª. Drª. Rosália Santos Amorim Jesuíno; Co-

1. Fungo – Paracoccidioides brasiliensis. 2. Pichia pastoris.

Dissertação desenvolvida no Laboratório de Biotecnologia de Fungos do Departamento de

Profa. Dra. Rosália Santos Amorim Jesuíno – Orientadora – Presidente da banca

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,

Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus – Examinador interno

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,

Profa. Dra. Raphaela de Castro Georg – Examinador externo

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,

Profa. Dra. Kênya Silva Cunha - Examinador interno

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,

Profa. Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva - Examinador externo

Departamento de Microbiologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,

Aos melhores e amados pais, Ivair e Wilzon,

"Pensamos em demasia e sentimos bem pouco. Mais do que de máquinas, precisamos de

E é com a frase de Charlie Chaplin que eu inicio agradecendo a minha orientadora,

Agradeço também a Fabrícia, a minha co-orientadora, que muito me ensinou sobre a

Aos companheiros e amigos do laboratório de biotecnologia de fungos, por

A nossa casa é aqui

Ou no mais desolado lugar

Ao sempre prestativo Syd e seus pseudônimos (Sydney, Sylvio, Sydnelson e sempre

Ao Guilhermar (figura!), um exemplo de determinação e esforço. Você que sempre diz

A Ilítia e sua mente borbulhante, Byancarine, Dâmaris, Matheus, Andreia, queridos

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A pequena Liliane, minha companheira de república (ex-república), obrigada pela

Ao meu amigo Rodolfo (freudflistone), meu amigo para assuntos aleatórios,

Tenho amigos para saber quem eu sou,

Ao pessoal do laboratório da Profa. Elisangêla, a Flávia, Aline e César. Minhas

A melhor secretária-amiga-canceriana Gleizilene ou simplesmente, a Gleice. Você me

A Anézia, por sempre limpar toda bagunça que fazíamos no lab.

Ao companheiro de pedreiragem no RU, Eduardo, meu amigo cantor de sertanejo

Agradeço também ao melhor estimulante do mundo: o café nosso de cada dia.

Aos criadores do Google, não seria nada sem vocês. rs

A capes, pela bolsa concedida.

(…)I'll take your part

Livros são papéis pintados com tinta.

Quanto melhor é quando há bruma.

Grande é a poesia, a bondade e as danças...

E mais do que isto

4.10 - Lise Celular de Levedura 62

Clonagem e expressão do gene da tiorredoxina 1 de Paracoccidioides brasiliensis em Pichia pastoris

5.20 - Análise de proteína em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) 86

7 – Conclusões e perspectivas 110

8 – Referências bibliográficas 112

Clonagem e expressão do gene da tiorredoxina 1 de Paracoccidioides brasiliensis em Pichia pastoris

Figura 2 - Estrutura da tiorredoxina de E. coli por RMN (Ressonância magnética 34

como dissulfeto redutases.

Figura 4 - Estrutura da proteína Trx1 e Trx2. 35

Figura 5 - Via metabólica da oxidação do metanol em formaldeído na levedura P. 45

Figura 6 - Integração no genoma de P. pastoris, por inserção (A e B) e por 45