JI fl,t UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGíA VEGETAL 1 N iii IIuIIII5IOI*I 53095416 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE wo~cas un samaeza sena ~wsa.UtYOffifl»t nasr &VflVUb&b OQCAL SIOL 1’ESIS DOCTORAL Autor: JOSE DIRECTOR DIRECTORA Arturo Velasco Negueruela María José Pérez Alonso (U V0B0 Directora Madrid 1994 Dulzura de felicidad y fantasía estallido de verata y de sopa de tomate. A esos ojos de refrán azul, de amor infinito. A ti abuela Nasta debo mi vida mi carácter y mi ilusión. No nos dejar¿s nunca!, pues siempre estarás a nuestro lado. (José Antonio López Sáez) AGRADECIMIENTOS Agradezco a la Profa. Dra. María José Pérez Alonso y al Prof. Dr. Arturo Velasco Negueruela, directores de esta Memoria Doctoral, su amistad y múltiples enseñanzas, así como la constante supervisión de mi trabajo. Así mismo, quisiera agradecer a la Profa• Dra. Eugenia Ron Alvarez, el haberme introducido en este “mundo de la investigación” y aconsejado en todo momento. Al Prof. Dr. Carlos Vicente Córdoba, Director del Departamento de Biología Vegetal 1 de la Universidad Complutense de Madrid, por acogerme y pennitirme el uso del material e instalaciones del mismo. Al Departamento de Celulosas del I.N.I.A., Madrid, (Dra. Concepción García Vallejo, Elvira y Estrella), al Dr. Jesús Sanz Perucha del Instituto de Química Orgánica General (C.S.I.C.), y a la Dra. Ana San Felix del Instituto de Química Médica (C.S.I.C.) por su imprescindible colaboración en la metodología empleada. Al Prof. Dr. H.D. Zinsmeister, Director del Departamento de Botánica de la Universidad de Saarlandes, Saarbriicken (Alemania) por permitirme la estancia en su Laboratorio durante tres meses, así como al resto del Equipo de Investigación Interdepartamental de la Universidad de Saarlandes, en particular al Prof. Dr. H. Geiger, supervisor de mi trabajo y amigo, y a mis compañeros Ariane, Ríidi, Michaela, Judith, Marion, Ludwig, Ralph, Hannelore, Andrea K., Andrea 5., Cristina y Ursula. A los Prof. Dr. R. MUes, Prof. Dr. T. Eicher y Prof. Dr. H. Becker, de la misma Universidad, por su simpatía, ayuda y enseñanzas. A Miguel Cunat-Walter (Departamento de Química-Física, Universitát des Saarlandes), amigo y barcelonista acérrimo, traductor inesperado. A ¡van A. Valdespino (me New York Botanical Garden, U.S.A.) por sus comentarios, consejos y material facilitado. A los Drs. M. Onraedt (Malonne, Bélgica), Dr. Jinwoong Kim (Seoul National University, College of Pharmacy, Seoul, ¡Corea) y Dr. E. Hegewald (Forschungszentrum Jiilich, Alemania) en agradecimiento por las muestras vegetales y patrones químicos enviados. A los Drs. ¡CH. Lee (The University of North Carolina, Chapel Hill, USA), Dr. Carlos Vicente Córdoba (Departamento de Biología Vegetal ¡-Fisiología, Universidad Complutense, Madrid), Dr. Richard Spjut (World Botanica] Associates, Laurel, Maryland, USA), Drs. Gordon Cragg y Anthony B. Mauger (Department of Health & Human Services, National Cancer Institute, N.C.I., USA), Dra. Rosa Castaldo Cobianchi (Dipartamento di Biologia Vegetale, Universitá degli Studi di Napoli Federico II, Italia), Dra. Itziar Aguinagalde (Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos, Universidad Politécnica, Madrid) y al Dr. Vanden Berghe (Universiteit Antwerpen, Bélgica> por realizar los ensayos anti-VIH, antitumorales y antimicrobianos así como diferentes bioensayos acerca de las propiedades antibióticas de los flavonoides identificados en la presente Memoria Doctoral. A mis compañeros del Departamento de Biología Vegetal 1, en especial a Belén, Elena, Ascen, Luis, Miguel, Arancha, Marta (y Javi), Graciela y María, y profesores del mismo, por su interés y amistad. A Milagros, Paco, Roge y Laura, por su cariño y por soportarme en las mil salidas al campo 1 y venir conmigo al “fin del mundo’. Un recuerdo especial a Pedro y Raquel. Al Prof Enrique Pandolfi (Universidad de Montevideo, Uruguay) y su familia, Lydia y Juanpi, por su impagable compañía y conversación, y por compartir la soledad de la gran “urbe china”. Agradezco así mismo a la Comunidad Autónoma de Madrid el haberme concedido una Beca Predoctoral, así como una Ayuda para Estancias Breves en Centros de Investigación en el Extranjero, sin las cuales, difícilmente podría haber salido hacia delante este trabajo. A mi familia, a mis padres, hermano y ambas abuelas. A “Raqui”, “Manchi” y “Humprey”. A “Chacal”, “Galgo”, “Tigre”, “Cris”, “Rascallús” y tantos otros, por su soledad. A todos ellos les agradezco profundamente su ilusión y confianza. Finalmente, no debo olvidarme y jamás lo haré, de mi difunto “Ford Fiesta” (M-5561-JN), santo y seña de mis salidas al campo, hotel improvisado de musgos, hepáticas, aromáticas y demás seres vivientes. Quedó exhausto en mitad del camino, allí donde ya se huele Alemania, pero por desgracia no la llegó a conocer. En su honor y por su recuerdo, me propuse olvidarme de mis miedos y cobardías: «hablé alemán sin saberlo y entendí inglés sin saber cómo, olvidé y sigo olvidando». Sin ti esta Tesis sería nada y “tú” lo fuiste todo. II INDICE 1. INTRODUCCION 1 2. JUSTIFICACION DEL TRABAJO 3. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS 3.1. La familia Bartramiaceae Schwaegr. 3.1.1. Subfamilias de Bartramiaceae Schwaegr. 3. 1.2. Las especies ibéricas del género Bariramia Hedw. 3.1.2.1. Bartramia halleriana Hedw. 3.1.2.2. Bartramia ithyphylla Brid. 3.1.2.3. Barirainia pom¿formis Hedw. 3.1.2.4. Bartramia arieta Brid. 3.2. Flavonoides 3.2.1. Flavonoides en musgos 3.2.2. Relaciones entre la composición flavonoidica de Musci y otros taxones 3.3. Actividad Biológica 3.3. 1. Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida 4. MATERIAL Y METODOS 4.1. Material biológico 4.2. Flavonoides 4.2.1. Extracción 4.2.1.1. Metodología auxiliar 4.2.1.2. Metodología general 4.2.2. Técnicas analíticas 4.2.2.1. Cromatografia 4.2.2.2. Espectrofotometría de ultravioleta 4.2.2.3. Resonancia Magnética Nuclear 4.2.2.4. Espectrometría de Masas 4.2.2.5. Hidrólisis ácida 6 4.3. Actividad Biológica 5. RESULTADOS 5.1. Flavonoides 5.1.1. Análisis mediante TLC de la familia Banramiaceae Schwaegr. 5.1.2. Resultados cromatográficos de las especies centrales de la Memoria Doctoral 5. ¡ .2. 1. Bartramia halleriana Hedw. 5.1.2.2. Bartramia ithyphylla Brid. 5.1.2.3. Bartramia ponuformis Hedw. 5.1.2.4. Banramia siTjcta Brid. 5.1.2.5. Dicranum scopariuni Hedw. 5.1.3. Resultados analíticos de los compuestos identificados 5.1.3.1. Compuesto 1 5.1.3.2. Compuesto II 5.1.3.3. Compuesto III 5.1.3.4. Compuesto IV 5.1.3.5. Compuesto V 5.1.3.6. Compuesto VI 5.1,3.7. Compuesto VI 5.1.3.8. Compuesto VIII 5.1.3.9. Compuesto IX 5.1.3. lO. Compuesto X 5.1.3.11. Compuesto XI 5.1.3. 12. Compuesto XII 5. 1.3. 13. Compuesto XIII 5.1.3.14. Compuesto XIV 5.1.3.15. Compuesto XV 5.2. Actividad Biológica: anti-VIH 7 7 9 14 16 17 18 19 21 24 38 43 50 58 58 69 69 69 71 75 75 90 93 98 100 101 107 107 108 136 136 137 139 142 145 148 148 153 158 163 168 173 179 184 189 194 200 205 211 213 215 217 6. DISCUSION 6.1. Flavonoides 6.1.1. Identificación de compuestos 6. 1 1.1. 5’ ,3 “-dihidroxi-amentoflavona (Compuesto 1) 6.1.1.2. 5’ ,3’ ‘-dihidroxi-robustaflavona (Compuesto II) 6. 1 .1.3. Filonotistlavona (Compuesto III) 6.1.1.4. 2,3-dihidro-filonotisflavona(Compuesto IV) 6.1. 1.5. Dicranolomina (Compuesto V) 6.1.1.6. Bartramiaflavona (Compuesto VI) 6.1.1.7. Anhidro-Bartramiaflavona (Compuesto VII) 6.1.1.8. Bartramia-Triluteolina (Compuesto VIII) 6.1. 1.9. Epi-Bartramia-Triluteolina (Compuesto IX) 6.1.1.10. Ciclo-Triluteolina (Compuesto X) 6.1.1. 11. 5 ‘-hidroxi-amentoflavona (Compuesto XI) 6.1 .1.12. Acido Bartrámico (Compuesto XII) 6.1.1.13. Diosmetina-7-O-triglicósido (Compuesto XIII) 6. 1 1. 14. Apigenina-7-O-triglicósido (Compuesto XIV) 6.1.1.15. Luteolina-7-O-neohesperidósido (Compuesto XV) 6.1. 1 16. Otros compuestos fenólicos: ácidos fenólicos y cumarinas 6. 1.2. Flavonoides en Bartramiaceae Schwaegr. y Dicranaceae Schimp. 6.1.2.1. Distribución de flavonoides en Bartramiaceae Schwaegr. . . . 6.1.2.2. Flavonoides y estatus taxonómico 6.1.2.3. Flavonoides en Dicranaceae Schimp. 6.1.2.4. Variación fenológica de la composición flavonoidica 6.1.2.5. Variación de la composición flavonoidica según la localización geográfica 6.2. Actividad Biológica 7. RESUMEN Y CONCLUSIONES 220 221 221 221 226 232 237 242 247 255 259 262 268 274 280 284 285 286 287 288 288 298 302 302 304 305 309 8. BIBLIOGRAFíA 313 ANEXOS 340 JI [>íJFk©]DILBC O]. ~QPI El trabajo de investigación que se presenta se engloba dentro del Proyecto de Investigación PB88-0133, subvencionado por la D.G.I.C.Y.T., titulado “Estudio de la capacidad de síntesis de flavonoides en musgos (Bryopsida) en relación con el nivel de organización anatómica y los patrones de desarrollo protonemático”, como consecuencia del cual, se ha llevado a cabo la presentación de distintos trabajos y comunicaciones a congresos fruto de las investigaciones realizadas acerca de la composición flavonoidica de diversas especies de musgos (Cordero, 1990; Estébanez, 1991; LópezSáez, 1992; Ron & col., 1990 y 1992; Geiger & col., 1993b). En la presente Memoria Doctoral nos hemos centrado particularmente en el Estudio Quimiosistemático y de Actividad Biológica de los Compuestos Flavonofdicos aislados e identificados en la familia Bartramiaceae Schwaegr. Una gran variedad de sustancias químicas han sido utilizadas en la Sistemática Vegetal. Ésta incluyó primeramente moléculas y metabolitos como el ADN (ácido desoxirribonucleico), las proteínas o los lípidos, y posteriormente los llamados “metabolitos secundarios”, como los alcaloides, terpenoides y compuestos fenólicos entre los que se incluyen los flavonoides. Dichos metabolitos secundarios muestran una distribución más restringida que los metabolitos primarios. A su presencia limitada a determinados taxones, y su aparición, muy probablemente deban ese significado ecológico, sistemático y filogenético tan importante que permite usarlos como trazadores quimiosistemáticos (Belí & Charlwood, 1980; Swain, 1980; Seigler, 1981; Zinsmeister & Miles, 1990). Además, como señalaba Erdtman (1956), desde un punto de vista taxonómico, las sustancias de mayor valor parecen ser aquellas que no intervienen directamente en las vías metabólicas principales, a las cuales denominó metabolitos secundarios. La mayoría de los conocidos son de origen vegetal (Belí & Charlwood, 1980; Gibbs, 1974; Hegnauer, 1962-86>, aunque muchos de ellos han sido identificados en hongos, bacterias o animales marinos sésiles (De Ley & Kersters, 1975; Scheuer, 1973; Turner, 1971). ¿Cúal es el valor que posee esa gran variedad de productos del metabolismo secundario con que cuenta el Reino Vegetal?. ¿Es acaso un “capricho” de la evolución, una diversidad innecesaria? (Swain, 1977a). Difícil contestación se puede ofrecer a estas preguntas si aún no conocemos una gran parte de los metabolitos secundarios y, en muchos casos, se desconoce por completo su actividad biológica. Surge pues, necesariamente, la obligatoriedad de realizar trabajos de investigación en ambos sentidos que nos permitan no sólo elucidar estructuras químicas y llegar a conclusiones sistemáticas, sino también conocer el modo de acción de dichos compuestos y el porqué de su presencia en los vegetales. Con seguridad, el papel desempeñado por dichos metabolitos secundarios supondrá una importante función en el vegetal, relacionada posible y directamente con su propia evolución (Swain, 1974, 1975, 1977b y 1980). La evolución y origen de los briófitos todavía permanece oscura en cuanto al eslabón directo que los relaciona con su antepasado (Smith, 1986). Su problemática evolutiva supone un reto tanto para los investigadores en Sistemática Vegetal como para los paleobotánicos (Miles, 1989; Herout, 1990; Seeligmann, 1990). Hoy en día, aún podemos preguntarnos cuál es el origen de las plantas 1 verdes (espermatófitas), briófitos y pteridófitos, cómo se han desarrollado y diferenciado. Los botánicos han considerado estas cuestiones desde distintos puntos de vista: citológico, ecológico, morfológico y paleontológico. Tradicionalmente han sido consideradas básicamente dos hipótesis acerca de la evolución de los briófitos. La primera es la “Teoría progresiva”, donde se supone que los briófitos tienen su origen en las algas verdes y que los pteridófitos derivan a su vez de éstos. La segunda hipótesis, la “Teoría reducionista”, considera que las algas verdes han sido el antepasado de Rhyniophyta, a partir de las cuales han evolucionado briófitos y pteridófitos. Ambas hipótesis han sido ampliamente discutidas y ambas tienen defensores y detractores (Asakawa, 1986). Dichas cuestiones se complican aún más si consideramos particularmente el posible origen mono- o polifilético dentro de los propios briófitos (Smith, 1986). Las características bioquímicas, en cambio, no han sido debidamente consideradas o se las ha prestado poca atención, a la hora de estudiar las interrelaciones entre algas, briófitos y pteridófitos, cuando, en cambio, poseen un alto interés quimiosistemático y filogenético, fruto de los propios resultados obtenidos (Swain, 1980). Durante los últimos 25 años, los estudios fitoquimicos de briófitos han agregado una serie de nuevas características, con la ayuda de criterios adicionales, en la clasificación de dichos vegetales. En este sentido se ha ampliado notablemente el campo de estudio, sobre todo en cuanto a metabolitos secundarios se refiere. Terpenos, flavonoides y lípidos, durante estos últimos años, han sido la base de numerosas investigaciones sobre la fitoquimica de briófitos, tanto desde el punto de vista de su composición química, su fisiología, propiedades antibióticas, como su quimiosistemática. Terpenos y compuestos fenólicos han sido, y son en la actualidad, los metabolitos secundarios más investigados en B¡yophyta (Múes, 1989 y 1990). No obstante, el número de trabajos relativos a la química de briófitos a pesar de su rápido incremento en este último cuarto de siglo, no pasa de los 700, de ahí que surjan inexcusables dificultades, de gran índole, a la hora de evaluar los datos químicos de que se disponen, tanto por fitoquímicos como por taxónomos (MOes, 1985). La primera publicación sobre la química de los briófitos se debe a Lohmann (1903), quien reconoce la presencia de aceites esenciales en los cuerpos oleiferos de ciertas hepáticas que actúan como inhibidores de la depredación por caracoles. Dos años después, Míllíer (1905) publica un trabajo acerca de los aceites esenciales de cuatro nuevas hepáticas. Después de un periodo cercano a los 60 años, durante los cuales únicamente aparecen algunas nuevas investigaciones concernientes a la química de musgos y hepáticas (Molisch, 1911; Kozlowski, 1921), es a partir de 1956 cuando se produce el primer realzamiento de dichos estudios. Un equipo japonés (Fujita & col., 1956), comienza la investigación sobre los aceites esenciales en hepáticas mientras que un equipo sueco (Bendz & col., 1962), aporta la primera estructura completa de un flavonoide para varias especies del género Bryum Hedw. Así mismo, se inician en 1963 los importantes trabajos de Huneck (1963, 1967, 1969 y 1983) sobre la química de briófitos. Posteriormente, y de manera constante, se ha ido incrementando el número de trabajos publicados al respecto. Markham & Porter (1978a) discuten el significado de los compuestos químicos en la evolución y sistemática de briófitos. Asakawa (1981 y 1982) enfatiza la importancia quimiotaxonómica de terpenoides y aromáticos lipofílicos en hepáticas; 2 mientras que Huneck (1983) menciona en su profunda revisión bibliográfica, la importancia de terpenoides y compuestos fenólicos, especialmente flavonoides, en la clasificación de los briófitos. Finalmente, Suire (1975), Suire & Asakawa (1979 y 1982) y Zinsmeister & col. (1991), realizan una extensa recopilación sobre diversos metabolitos primarios y secundarios de briófitos, donde ponen de manifiesto su importante actividad biológica. Lo que al fin y al cabo queda claramente puesto de manifiesto es que, distintos metabolitos, tanto del metabolismo primario como secundario, pueden ser utilizados sin discusión como importantes marcadores quimiosistemáticos (Anderson & col., 1974; Asakawa, 1986; Asakawa & col., 1979a; Beutelmann & col., 1992; Cody & col., 1986; Harborne, 1975 y 1993; Huneck, 1983; Miles, 1989; Seigler, 1981; Zinsmeister & col., 1991; López-Sáez, 1992). Así mismo, la actividad biológica que muestran muchos de estos compuestos, sobre todo sus propiedades antibióticas (Asakawa & col., 1978 y 1980b; Becker, 1989; Benesová & flerout, 1972; McCleary & col., 1960; McCleary & Walkington, 1966; McClure, 1986; Van Hoof & col., 1981; Wolters, 1964a y b; Zinsmeister & Miles, 1987; Zinsmeister & col., 1987 y 1991), ofrece un campo de investigación novedoso y amplio, cuyos resultados pueden ser sumamente interesantes, de ahí que a través de nuestro trabajo hayamos querido refrendarIos. Entre ellos y durante las dos últimas décadas, se ha acumulado mucha información sobre los lípidos y ácidos grasos de musgos (AI-Hasan &col., 1989, 1990y 1991; Gellerman&col., 1975; Hartmann&col., 1986; Grimsley&col., 1981; Koskimies-Soininen & Nyberg, 1987; Marsili & col., 1972; Radwan 1975; Sievers, 1992; Solberg, 1983; Somersalo & col., 1986; Vandekerkhove & col., 1984) así como sobre el significado quimiosistemático de éstos (Beutelmann & col., 1992; Kohn & col., 1987). En cuanto a terpenoides, desde hace bastante tiempo, se conoce que los musgos no producen ni forman “cuerpos oleiferos” y, consecuentemente, se ha considerado que carecen de terpenos y otros variados compuestos lipofílicos, sí presentes en hepáticas (Miles, 1990). En cambio, sí parece haber quedado demostrado, a la vista de las numerosas investigaciones realizadas, que la mayoría de las hepáticas cuentan principalmente con los terpenoides y otros compuestos aromáticos lipofílicos, como los elementos constituyentes de los cuerpos oleiferos (Asakawa, 1990). No obstante, la ausencia de cuerpos oleiferos en musgos, no es óbice para que éstos sí puedan sintetizar otro tipo de terpenoides, que no forman parte de los denominados “aceites esenciales”. Así lo ponen de manifiesto Zinsmeister & col. (1991), quienes citan en su trabajo de recopilación, la presencia en musgos de monoterpenos, diterpenos, triterpenos y tetraterpenos. Al contrario que mono- y sesquiterpenos, los diterpenos aparecen comúnmente tanto en musgos como en hepáticas, aunque más frecuentemente en las últimas (Herout, 1990; Huneck, 1983). Hasta el presente, más de 200 nuevos compuestos correspondientes a terpenoides, han sido aislados y sus estructuras elucidadas en Hepaticae (Huneck, 1983). Asakawa (1990) realiza una excelente revisión de éstos, que incluye básicamente los típicos esqueletos sesqui- y diterpénicos que aparecen en hepáticas. Así mismo, afirma, al igual que Huneck (1983), la ausencia de mono- y sesquiterpenos en las clases Musci y Anthocerotae. Una recopilación de las propiedades farmacológicas de éstos y otros compuestos de briófitos es expuesta por el mismo autor y Marsiíi & col. (1972). A los esqueletos monoterpénicos se debe generalmente el fuerte olor que desprenden algunas 3 hepáticas (Zinsmeister & col., 1991). Todos los monoterpenos conocidos de hepáticas corresponden, casi enteramente, a compuestos ya conocidos en las plantas vasculares (Connolly, 1990). En cambio, de los sesquiterpenos se conocen aproximadamente 50 estructuras diferentes, únicamente aisladas en hepáticas (Zinsmeister & col., 1991). Entre ellas se incluyen los barbatanos (gimnomitranos), pinguisanos, 2,3-seco-aromadendrenos, miltailanos y vitranos (Connolly, 1990; Huneck, 1983; Zinsmeister & col., 1991; Asakawa, 1982). En musgos han sido identificados diterpenoides de cadena abierta tales como el fitol en Dicranum etongatuin Scheleich. (Ekman & Karunen, 1980), y genaril-geraniol (hexadehidro derivado diterpénico) en esporas de Polytrichum commune Hedw. (Liljenberg & ¡Carunen, 1978); así como otros diterpenos en Saelania glaucescens (Hedw.> Broth.: ent-kaurenoides (diterpenoides tetracarbocíclicos) (Nilsson & Martensson, 1971). Los derivados isoprenoides de 30 átomos de carbono (triterpenos) son mucho más raros en briófitos que sus homólogos mono-, sesqui- y diterpenos (Herout, 1990). Huneck (1983) recoje un total de 15 triterpenos identificados en musgos. Estos compuestos, en musgos, son básicamente del tipo fernano, tales como el ácido ursólico, y compuestos intermediarios entre triterpenoides y esteroides (Asakawa & col., 1979a). Entre ellos podemos citar al escualeno, identificado en Mnium cuspidatum Hedw. y Mniwn med¡um B.S.G. (Gellerman & col., 1972 y 1975), y diversos derivados del hopano (Asakawa & col., 1979a; Marsili & Morelli, 1968 y 1970; Marsili & col., 1971), como los más representativos. Los triterpenos derivados de los tipos fernano y hopano no han sido identificados hasta el momento en algas ni hepáticas, de ahí que posean un significado quimiosistemático relevante (Asakawa & col., 1979a y b, 1980a). En contra de lo expuesto por Asakawa (1990), Koponen & col. (1990) ponen de manifiesto la presencia de monoterpenos, en diversas especies de Splachnaceae Grey. & Arnott, familia que peculiarmente engloba distintas especies cuya dispersión esporal se realiza por insectos, de ahí que exhiban un olor de atracción característico. Entre ellos, deben destacarse el a-felandreno y ¡3felandreno en Splachnwn !uteum Hedw. y Sptachnum rubrum Hedw., así como el a-pineno en la última especie. Finalmente, debemos citar la presencia de una lactona sesquiterpénica, la 15metoxiansamitocina P-3, en dos especies de musgos (Sakai & col., 1988), que muestra una importante actividad antitumoral. En Bartramiaceae no se ha conocido hasta hace poco, ningún trabajo relativo al componente terpenoidico. Las únicas referencias son la de Strain (1958) sobre los carotenoides de Philonotis fontana (Hedw.) Brid. y la de López-Sáez (1992) sobre los terpenoides y otros compuestos volátiles del género Bartramia Hedw. No obstante, tanto la química de lípidos como de compuestos terpenoidicos jugará un papel fundamental en trabajos futuros sobre la química y sistemática de musgos (López-Sáez, 1992; Zapp, 1992; Sievers, 1992). Hecho similar puede afirmarse de cumarinas y ácidos fenólicos (Anhut, 1992; ¡Cinzel & Walland, 1966; Jung, 1993-94; Salm, 1994; Gross, 1981; Davidson & col., 1989; Trennheuser, 1992), esteroles (Chiu & col., 1985), así como de los alcaloides del tipo alantoina principalmente (Anhut, 1992). Sin lugar a dudas, y tal y como se revela en la actualidad, son los compuestos fenólicos, 4 principalmente flavonoides, los que acaparan la mayoría de trabajos sobre quimiosistemática y filogenia, ya no sólo de gimnospermas (Niemann & Van Genderen, 1980; Quinn & Gadek, 1981>, y angiospermas (Bate-Smith, 1963; Harborne, 1977; Crawford, 1978; Gornalí & col., 1979; Oershenzon & Mabry, 1983; Kubitzki & Gottlieb, 1984; Seeligmana, 1990; Harborne & Turner, 1984; Greger, 1985; Hegnauer, 1986), sino también de pteridófitos (Cooper-Driver, 1980; Markham & Moore, 1980; Cooper-Driver & Haufler, 1983; Wollenweber, 1981 y 1982) y hepáticas (Campbell & col., 1979; Markham & col., 1977). En musgos, dichos estudios quimiosistemáticos están aún iniciándose, a pesar de que el número de trabajos aumenta constantemente. Basta con comparar los datos expuestos por MUes & Zinsmeister (1988), con los de Miles (1990), entre los que se puede observar un incremento notable en el número de especies estudiadas y compuestos cuya estructura ha sido elucidada. Los constituyentes fenólicos de briófitos se pueden dividir en dos grupos: los que poseen un solo anillo aromático y, los que poseen dos o más. Los compuestos del primer grupo (alquilfenoles, éteres y glicósidos fenólicos, ésteres y ácidos fenólicos) son muy comunes en hepáticas, y pocas veces se han detectado en musgos (Mues & Zinsmeister, 1988>. Los compuestos del segundo grupo se subdividen a su vez en ésteres, bibenzilos, bisbibenzilos, flavonoides y otras estructuras variadas aromáticas. Todos ellos, excepto flavonoides y esfagnorrubinas se conocen únicamente en hepáticas. Los flavonoides se han utilizado profusamente como marcadores en taxonomía vegetal (BateSmith, 1963; Cody & col., 1986; Harborne, 1975, 1984 y 1993; Seeligmann, 1990; Swain, 1980). Existe en general una tendencia evolutiva de incrementar la complejidad estructural de los flavonoides desde la línea algal hasta las angiospermas (Izlarborne, 1967; Swain, 1986). De hecho se conoce la existencia de flavonoides estructuralmente sencillos en algas (Markham & Porter, 1969), de ahí que amparados en el postulado anterior sea fácil imaginar una linea evolutiva que relacione directamente algas con musgos. Generalmente se ha supuesto la presencia de compuestos primitivos de baja complejidad estructural en plantas igualmente primitivas (Richardson, 1983), o lo que es lo mismo, “cuanto más elevado es el nivel de organización de un vegetal, tanto más compleja es su capacidad biosintética” (McNair, 1935; Erdtmann, 1956; Seeligmann, 1990). No obstante, esta llamada “Doctrina de correlación” guarda numerosas dificultades en base al uso de tal generalización. Así por ejemplo, las 3-deoxiantocianinas fueron consideradas bajo el apelativo de “compuestos primitivos” tras ponerse de manifiesto su presencia en helechos, aunque investigaciones posteriores mostraron su también igual presencia en angiospermas (Gornalí & col., 1979). Hecho semejante puede afirmarse de la presencia de auronas en algunas familias de angiospermas así como en briófitos, lo que podría sugerir una evolución paralela (Markham & Porter, 1978b). Bajo este punto de vista, con perspectivas, por un lado, de contribuir a un mejor conocimiento de los caracteres químicos de este grupo botánico que son los musgos y, en cierta manera, como una contribución más para poder aclarar su confuso y oscuro origen filogenético, presentamos nuestro trabajo, que nos permitirá, en un futuro, aproximarnos a las relaciones de parentesco que existen entre el rango taxonómico elegido y otros cercanos a él. Así mismo, no hemos querido dejar pasar la oportunidad de realizar pruebas de actividad biológica de los flavonoides aislados e identificados en Bartramiaceae Schwaegr. y Dicranaceae Schimp., pues como la bibliografía así lo atestigua, los resultados esperados en un principio debían ser sumamente interesantes, esperanzadores y novedosos. 5 2~ JXLJO~JOL.¿L CAQOROR IDEiL ÍLiÑkJ3BÉ.1KD El confuso origen filogenético de los musgos, la posibilidad de utilizar ciertos compuestos de ellos aislados, por su actividad biológica, como puede ser antibiótica o antitumoral, y la escasez de estudios quimiosistemáticos para este grupo botánico, constituyen la razón que nos llevó a realizar y presentar nuestro trabajo. El porqué de la elección de los flavonoides como trazadores quimiosistemáticos objeto de la presente Memoria Doctoral, creemos que ha quedado suficientemente contrastado en los comentarios aportados en el apartado anterior. Ante todo, nos hemos centrado en el estudio de los flavonoides, por ser éstos los trazadores quimiosistemáticos mayormente estudiados en musgos. No obstante, en un trabajo anterior (Memoria de Licenciatura) ya realizamos un ensayo preliminar para detectar la presencia de otros trazadores del metabolismo secundario (terpenoides) y primario (lípidos), en base a la relevancia que están adquiriendo dichos compuestos en estos últimos años en la química de musgos. La elección del material biológico recayó en la familia Rartramiaceae Schwaegr. por no haber sido apenas estudiada en este sentido y por reunir una serie de requisitos imprescindibles, tales como la importancia de los datos hasta ahora aportados: presencia de biflavonoides y macrociclos con posible interés antibiótico, triflavonoides y ácidos flavonoidicos. Así mismo, y en referencia a las cuatro especies ibéricas del género Bartramia, objeto de nuestra Memoria Doctoral, debemos decir que de acuerdo a la bibliografía, todas ellas se citaban como localizadas en la provincia de Madrid (Acón, 1988), lo que facilitó enormemente la elección del material biológico objeto de nuestra investigación. No obstante, debemos dudar de la cita de Cillero (1944) para B. halleriana Hedw. por la inexistencia de pliego testigo y tratarse de una especie de óptimo pirenaico-cantábrico (Casas & col., 1985-1992). También se llevo a cabo el estudio de la composición flavonoidica de Dicranum scoparium Hedw., en base a la identificación en un ensayo previo de un nuevo biflavonoide hasta el momento no descrito, que a su vez nos sirvió como fuente de patrones químicos. En cuanto a las investigaciones emprendidas acerca de la actividad biológica de los flavonoides aislados e identificados, éstas se llevaron a cabo dada la importancia actual, en el camino de estudiar la posible utilización de los flavonoides de musgos frente al virus del sida, ya que la importancia médica y social derivada de dichos estudios, podría en principio ser de más valor que otros ensayos de bioactividad. 6 1k kJÑ’lLii~CCJF~LD J~~E?2 1~i1Bibi[QG?~3Áú?1kD©O 3.1. La familia Bartramiaceae Schwaegr. La familia Bartramiaceae Schwaegr. es una de las más distintivas familias de musgos, fácilmente reconocibles por sus globosas y a menudo asurcadas cápsulas (Griffin III & Buck, 1989). De hecho, fue gracias a la morfología de la cápsula, cuando se puso más énfasis en el estudio de la familia y se describió ésta por primera vez (Schwaegrinchen, 1830). Las especies de la familia Bartramiaceae quedan definidas por tratarse de especies típicamente erectas u ocasionalmente decumbentes, en ocasiones de tamaño pequeño pero robustas. Los caulidios son normalmente simples, fastigiados o irregularmente pinnados, y ocasionalmente pueden presentar innovaciones “subflorales” en las ramas a menudo puestas de manifiesto por un color rojizo y aparentemente tomentosas (Griffin III & Buck, 1989). Los filidios más comunes en la familia son de morfología lanceolada-acuminada, ovado-lanceolada y ovado-elíptica, imbricados y anchos, con base abrazadora, extrechos u ocasionalmente crispados, secundos o circinados en sequedad, y algunas veces más o menos falcados en los ápices de las ramas, longitudinalmente estriados a lisos, generalmente engrosados. Pelos axilares de morfología variable, algunos de 2 células, otros de 1-2 (-4) células basales a menudo pigmentadas, y otras veces con pigmentos confinados únicamente a las paredes transversales de las células intercalares, con células terminales hialinas más o menos globosas y algo elongadas, con o sin pared apical normalmente estrechada. Los pelos axilares han sido utilizados por Griffin III & Buck (1989) en la separación taxonómica de las distintas subfamilias de Bartramiaceae. Los gametófitos pueden ser monoicos (autoicos o sinoicos) y dioicos. La seta es frecuentemente elongada, más bien extrecha y raramente flexuosa a arqueada, y ocasionalmente muy corta con la cápsula inrersa no visible. Las cápsulas están ligeramente inclinadas o son horizontales, raramente erectas o péndulas, subglobosas u ovoides, raramente cilíndricas. Son generalmente estegocárpicas o raramente cleistocárpicas. Existen cápsulas simétricas según su apertura o asimétricas con apertura oblicua. Opérculo típicamente aplanado y umbonado, a menudo cortamente cónico o rostrado. El peristoma puede ser doble o simple o estar incluso ausente, existiendo por lo general en la familia una tendencia a su reducción, que normalmente va acompañada de cápsulas erectas o inmersas (Griffin III & Buck, 1989). Más información acerca de sus caracteres microscópicos (SEM) pueden ser consultados en Shaw (1985). Las esporas a menudo papilosas, son globosas, ovoides o reniformes, nunca apendiculadas. La caliptra es pequeña, cuculada y glabra. Kabiersch (1937) proporciona una ingente sumario sobre la diversidad morfológica de la familia. Distintos conceptos han sido utilizados en un intento de establecer la filogenia y sistemática de la familia: ornamentación de los rizoides (Hirohama & Iwatsuki, 1980), anatomía del caulidio (Haberlandt, 1886; Kawai, 1982 y 1989; Ron & col., 1992; Velasco & col., 1991), morfología de los pelos axilares (Griffin III, 1990; Griffin III & Buck, 1989), ornamentación esporal (Griffin III & Acuña, 1983; Hirohama, 1977; Estébanez & col., 1992), desarrollo protonemático (Alcalde, 1994; Abella & col., 1992; Saito, 1959; Nishida, 1978; Nehira, 1983; Matteri, 1968), fitoquimica (Ron & col., 1992; Taylor & col., 1970; Velasco & col., 1991) y número cromosomático (Fritsch, 1982). 7 . Debemos así mismo destacar los trabajos de Kabiersch (1936) sobre la filogenia de Bartramiaceae en relación con las Mniaceae Schwaegr. La familia Bartrarniaceae se subdivide en tres subfamilias (Oriffin III & Buck, 1989), y agrupa unas 425 especies (Augier, 1966), bien diferenciadas, propias de las regiones tropicales del globo, siendo algunas especialmente abundantes en el Hemisferio Sur (Hirohama & Iwatsuki, 1980). En la clave que se acompaña a continuación se establece la separación en las 3 subfamilias de Bartramiaceae, y se aporta además una clave anexa para sus 11 géneros. Clave taxonómica de las subfamilias y 2eneros dc Bartram¿aceae 1. Filidios gruesos dispuestos en 5 filas, células de los filidios mamilosas, rizoides lisos, opérculo rostrado, pelos axilares de morfología interruedia entre las otras dos subfamilias .. Subfam. Conustomoideae Co¡wstomum. 1. Filidios nunca dispuestos en 5 filas, células papilosas o lisas. rizoides papilosos, opérculo cónico a umbonado 2 2. Plantas con innovaciones subflorales, pelos axilares cortos con células también cortas terminados en una célula globosa, esporas usualmente ornamentadas y espinosas Subfam. Breutelioideae.... 3 2. Plantas sin innovaciones subflorales, pelos axilares largos de células elongadas y con una célula terminal no inflada, esporas por lo general sólo papilosas Subfam. Bartramioideae ... 7 3. Plantas normalmente robustas, fihidios aplicados, con células alares diferenciadas Breutelia. 3. Plantas pequeñas, filidios no aplicados, sin células alares diferenciadas .. 4 4. Caulidios foliáceos, filidios ovados muy rudimentarios con células lisas Quathtamba. 4. Caulidios con tilidios extendidos, en su gran mayoría lanceolados, con células papilosas 5 5. Células de los tilidios con una Única papila diminuta, célula apical de los pelos axilares colapsada, cápsulas lisas y cilíndricas con el cuello bien diferenciado Fieischerobryum. 5. Células de los filidios con papilas prominentes, célula apical de los pelos axilares globosa, cápsulas asurcadas o sólo arrugadas, sin cuello 6 6. Caudilidos sin hialodermis. seta corta de 2-3 mm de largo, número cromosomático n= 7,8 ,4nacolja. 6. Caulidios con hialodermis, seta eiongada, número Cromosomático n= 6. 12 PÁllonofis. 7. Filidios no dispuestos en filas, células de los filidios papilosas, pelos axilares sin una célula terminal engrosada en su ápice 8 7. Filidios dispuestos en 3 filas (trísticos), células de los filidios no papilosas, pelos axilares con una célula terminal engrosada en su ápice 10 8. Células de los fihidios papilosas sobre la luz, pelos axilares con células basales oscuras y el resto hialinas Ftowersia. 8. Células de los filidios papilosas por proyección de las células terminales, pelos axilares con paredes oscuras entre las células pero éstas siempre hialinas 9 9. Cápsulas exertas, caulidios con bialodermis Bar/randa 9. Cápsulas inmersas, caulidios sin bialodermis Lelometa 10. Cápsulas pequeñas, oscuras y lisas, endostoma ausente ~atoscopium. 10. Cápsulas grandes, no oscuras ni lisas, endostoma presente Plogiopus. 8 3.1.1. Subfamilias de Bartramiaceae Scbwaegr. 1. Subfamilia Bartramioideae, en la que se incluyen los géneros Bartramia Hedw., Catoscopium Brid., Leiomela (Mitt.) Broth., Plagiopus Brid., y Flowersia Griffin & Buck. la. La familia Catoscopiaceae Brid. que incluye el género Caroscopium es en la actualidad considerada sinónima de Bartramiaceae (Griffin III & Buck, 1989>, de tal manera que así la trataremos en esta Tesis, aunque floras menos recientes como las de Engler (1924), Herzog (1909 y 1926) y Augier (1966) consideren ambas familias por separado. Flowers (1935) y Lindberg (1879) ya tomaban en consideración las mismas conclusiones de Griffin III & Buck (1989). Adicionalmente, el género 1-ja sido también ubicado dentro de la familia Meesiaceae Schimp., por Limpricht (1893) y Schimper (1855). El género Catoscopium cuenta con una única especie en el mundo, C. nigrituin (Hedw.) Brid., la cual tiene importantes relaciones morfológicas con otro género de la subfamilia, Plagiopus, de ahí que se le incluya dentro de Bartramioideae. En ambos géneros, los filidios están dispuestos en tres filas, aunque más fuertemente en Plagiopus. Lb. El género fiartramia consta aproximadamente de unas 100-110 especies (Augier, 1966; Hirohama & Iwatsuki, 1980), siendo junto con Philonotis el género más numeroso de la familia. Cuatro de ellas se distribuyen por la Península Ibérica y son objeto central de esta Memoria Doctoral. Corley & col. (1981) proponen tres secciones en la sistemática del género: lb. 1.- Sección fiartramia (sección Eubartramia C. MUII., según Engler, 1924 y Herzog, 1926), que engloba aproximadamente unas 11 especies y que incluye a las especies europeas e ibéricas B. halleriana Hedw. (= fi. norvegica Lindb.), y fi. pomiformis Hedw. (=firyum pomiforme L.), que también viven en Asia (Engler, 1924), y en el caso de B. pomformis también en Norteamérica; así como fi. mossnianniana C. Múlí., que vive en Tasmania y Patagonia, y a otras especies que se distribuyen por Japón y Corea (fi. crispata Schimp., fi. hakonensis Besch., fi. stenophylla Card., etc.). Ib.2.- Sección Ithyphyllae Kindb. (sección Vaginella C.Mtill. según Engler, 1924 y Herzog, 1926), que engloba unas 79 especies que se distribuyen por Sudáfrica (fi. hampeana C. Millí., y fi. asperrinm (Hamp.) C. Múlí), Africa Oriental (fi. ruwenzoriensis Broth.), Sudamérica y Centroamérica (fi. humilis Mitt., fi. costaricensis C. Múlí., fi. microstoma Mitt.), Himalaya (fi. leptodonta Wils., y 8. subpellucida Mitt.) y Europa (fi. ithyphylla Brid. (= fi. breviseta Lindb.) y B.subulata B.,S. & C.). lb.3.- Sección Strictidium C. Múlí. (sección Strictidium C. MOlí., según Engler, 1924 y Herzog, 1926), con unas 19 especies, dentro de las que se incluye fi. striaa Brid., que se distribuye por la Región Mediterránea y Macaronésica (López-Sáez, 1992), llegando incluso a Inglaterra y California (Engler, 1924; Herzog, 1926); fi. ambigua Mont., que vive en Perú, Bolivia y Chile (Engler, 1924); 9 fi. substricra Schimp., y B. afro-stricta C. Mtill., que se distribuyen por Sudáfrica (Herzog, 1926), fi. strictula C. Millí., del Kilimanjaro (Engler, 1924). Las especies de esta sección se distribuyen principalmente por Sudamérica y Sudáfrica, excepto fi. stricta que alcanza incluso la Europa mediterránea. y lc. El género Leiomela está contituido por 16 especies (Hirohama & Iwatsuki, 1980), estando la gran mayoría de ellas distribuidas por Sudamérica, como por ejemplo L. aristata (Mitt.) Broth., y L. lutescens (Hamp.) Broth., excepto L. javanica (Ren. et Card.) Broth., que vive en Java (Engler, 1924). íd. El género Plagiopus es un pequeño género con únicamente 3 especies en el mundo (Hirohama & Iwatsuki, 1980), siendo la especie más conocida E. oederiana (Sw.) Crum & Anderson (= P. oederi (Gunn.) Limpr.), que vive en la Península Ibérica, además de en Asia Central e Himalaya, Japón y Norteamérica. Las otras dos especies son E. crassinervis Mitt., y E. javanicus (Doz. et Molk.) Fleish., de Java. le. El género Flowersia de reciente creación por Griffin III & Buck (1989) está muy cercano y se ha segregado de Anacolia, y de hecho varias especies de este último género hoy pertenecen a Flowersia, caso de A. campylopus (Schimp. ex C. Míill.) Fransén, que hoy es F. campylopus (Schimp. ex C. Molí.) Griffin & Buck. El género fue nombrado en honor de Seville Flowers (1900-1968), toda una autoridad en la familia Bartramiaceae. 2. Subfaniilia Breutelioideae Griffin & Buck, que engloba los géneros fireutelia Schimp., Philonotis Brid., Anacolia Schimp., Fleischerobryum Loeske y Quathlamba Magilí. 2a. El género Breutelia que da nombre a la subfamilia, es otro de los géneros más numerosos de la familia, con cerca de 100-104 especies (Augier, 1966; Hirohama & Iwatsuki, 1980), muchas de las cuales se han diferenciado en la región tropical del Hemisferio Sur. Breutelia es probablemente el género más avanzado de la subfamilia. Su gran tamaño y sus caulidios a menudo divididos contrastan con Philonotis y géneros cercanos. Una de las especializaciones de fireutelia son precisamente sus filidios aplicados, en los cuales se diferencian células alares y células intercalares en los pelos axilares. Así mismo, la ornamentación esporal ofrece una sensible diferenciación respecto Philonotis, pues en fireutelia las esporas son mucho más papilosas a espinosas. En base al gran número de especies del género, Griffin III & Buck (1989) diferenciaron dentro de él 5 secciones, que además tipificaron: 2a. 1.- Sección Breutelia (sección Rubreutelia Broth., de acuerdo a Engler, 1924 y Herzog, 1926), tipificada por fi. arcuata (Sw.) Schimp. Esta especie es considerada hoy como sinónima de fi. ch¡ysoconza (Hedw.> Lindb., la única especie del género que vive en Europa. Engloba especies sudamericanas como fi. subtomentosa (Hamp.) Jaeg., de Brasil, africanas como fi. d(ffracta Mitt., 10 de Camerún o fi. kiliniandscharica (C. Millí.) Par., del Kilimanjaro, o de Java y Filipinas como fi. arundínifolia (Dub.) Fleisch. 2a.2.- Sección Anacoliopsis (C. Múlí.) Broth. Fue descrita inicialmente por Míllíer (1901) como una sección del género fiartramia. La especie que tipifica la sección es fi. affinis (Ilook.) Mitt., frecuente en territorio australiano. 2a.3.- Sección Polyptychium (C. Malí.) Broth., descrita también inicialmente como una sección de fiartramia por Múller (1874). Tipificada por la especie peruana fi. polygastrica C. MOlí. Todas sus especies son de distribución sudamericana. 2a.4.- Sección Acoleus (C. Mill.) Broth., que inicialmente fue descrita como una sección de fiartramia por Múller (1901). La especie tipo es fi. chrysea (C. Malí.) Jaeg. En ocasiones es posible que nos encontremos con la denominación A coleos para la sección, ya que este nombre fue el que usó por primera vez MOller (1874>, pero no quedó validado nomenclaturalmente. Ya en 1901, MuJer utilizaba la correcta denominación Acoleus. La sección engloba especies de distribución principalmente sudamericana y caribeña (Engler, 1924). 2a.5.- Sección Lycopodiobryum (C. Malí.) Broth.,también originalmente descrita por Miller (1901), como una sección dentro de fiartramia. Griffin III & Buck (1989) consideran que la especie B. elongata (Hook.f. & Wils.) Mitt., incluida en esta sección por Engler (1924), debe ser transferida a la sección toletes. 2b. El género Philonotis es el más numeroso de toda la familia fiartramiaceae, ya que cuenta con más de 150-174 especies, de ecología muy variada (Augier, 1966; Hirohama & Iwatsuki, 1980). De acuerdo a Engler (1924) y Griffin III & Buck (1989), el género consta de 6 secciones: 2b.1.- Sección Philonotula (B.S.G.) Jaeg., de especies todas ellas autoicas o dioicas pero ninguna sinoica. Engloba especies de distribución europea y macaronésica (P. rigida Brid.), Japón (P. savatieri Besch.), Sudamérica (P. curvata (Hamp.) Jaeg., P. platensis Par.), Africa (P. flavinervis (C. Malí.) Par., P. strictula Card.) y Asia (1’. palustris Mitt., P. radicalis (Palis.) Brid.). 2b.2.- Sección C’atenularia (C. Malí.) Par. Las especies más conocidas son P. scabr¡folia (Hook. f. & Wils.) Braithw., y P. yezoana Besch. & Card. La primera es abundante en Sudáfrica y Ecuador, llegando ingluso a Oceanía. 2b.3.- Sección Leiocarpus Broth., que engloba especies caracterizadas por ser erectas y de cápsulas simétricas, con esporófitos provistos de un perístoma simple. Sus especies se distribuyen por el Kilimanjaro africano caso de P. schróderi Broth., Africa occidental (P. calornicra Broth.), Java (P. tjibodensis (Fleisch.) Broth., Hawaii (P. hawaiica C. Malí.) o Tahití (P. runcinata C. Mill.). 11 2b.4.- Sección E’uphilonotis Limpr., constituida por especies dioicas. Agrupa especies de amplia distribución como P. marchica (Willd.) Brid., que vive en Europa y Córcega, Argelia, Corea y Norteamérica; P. leptocarpa Mitt. del Himalaya; P. turneriana (Schwaegr.) Mitt., que vive además del Himalaya en Java, Japón, China y en el archipiélago de las islas Sandwich; P. falcata (Hook.) Mitt., del Tibet, India, China, Japón e India; P. andina Brid., de Ecuador; P. gourdonii Card., de la Antártida; y otras especies de distribución básicamente europea como P. caespitosa Wills., P. calcarea (Bryol.) Schimp., y P. fontana (L.) Brid., la especie posiblemente más abundante y mejor conocida, de la que además se conoce el contenido biflavonoidico (ver Anexos 1 y 2). 2b.5.- Sección Pseudo-Mniobiyum Broth., con especies también en su mayoría dioicas. La especie tipo y la única que compone la sección es P. vagans (Hook. f. & Wils.) Mitt., que se distribuye por Sudamérica (Chile y Patagonia). 2b.6.- Sección Pseudo-Philonotis Fleisch., que consta únicamente de 3 especies: P. longicollis (Hamp.) Mitt., de Java e Himalaya, P. eurybrochis Ren. et Card., también de Java y P. wallisii (C. Mill.) Jaeg., de las Islas Filipinas. El antiguo género fiartramidula, que englobaba unas 20 especies (Engler, 1924; Hirohama & Iwatsuki, 1980), fue descrito originalmente por Schimper (in Bruch & col., 1836-1855) en firyologia Europaea (4, fasc. 29/30, monogr. 1, Pp. 55, 1846), tomando como especie tipo fi. wilsonii B.S.G. En la actualidad ha sido considerado como una variante polifilética de Philonotis e incluido dentro de este género (Griffin III & Buck, 1989). Después de su inicial descripción hace más de 150 años, más de 40 especies que pertenecieron a fiartramidula, han sido posteriormente transferidas a los géneros Bartramia, Breutelia y Philonotis. 2c. El género Anacolia cuenta con unas 7 especies en el mundo (Hirohama & Iwatsuki, 1980), que se distribuyen por Sudamérica (A. setifolia (Hook & Arnott) Jaeg., A. subsessilis (Tayl.) Broth.), Centroamérica (A. intertexta (Schimp.) Jaeg.), Europa y Región Macaronésica (A. webbii (Mont.) Schimp.), Norteamérica hasta Alaska (A. menziesii (Turn.) Par., y A. baueri (Hamp.) Par.) y Africa (A. abyssinica (C. Mill.) Flowers) (Engler, 1924). Tanto A. setifolia como A. abyssinica han sido incluidas en el género Flowersia (Griffin III & Buck, 1989). Griffin III & Buck (1989) consideran al género Anacolia como el menos evolucionado de la subfamilia, por su aspecto típico de fiartramia y por su plesiomórfico número cromosomático n= 7,8; aunque le incluyen dentro de la subfam. Breutelioideae por la presencia cualificada de innovaciones subflorales, de pelos axilares bicelulares, y por la especial morfología de la cápsula y esporas. 2d. El género Fleischerobryum es un pequeño género con sólo 4 especies que se distribuyen principalmente en Asia tropical (Hirohama & Iwatsuki, 1980). Sus hábitats son similares a los de Philonotis, aunque no poseen tanta amplitud ecológica, y existen notables diferencias en la morfología de los pelos axilares (ver clave anexa). 12 2e. El género Quathlamnba fue recientemente descrito por Magilí (1987), a partir de una única especie surafricana (Q. debilicostata Magilí). Gametofíticamente se trata de un género único dentro de la familia fiartramiaceae debido a la morfología foliácea de su caulidio así como a los filidios más o menos ovados y rudimentarios de células lisas. Sin embargo, el esporófito es similar al antiguo género Bartramnidula que ha sido recientemente sinonimizado con Philonotis (Griffin III & Buck, 1989). 3. Subfamilia Conostomoideae Griffin & Buck, monotípica pues incluye únicamente al género Conostomum Sw. Este género consta aproximadamente de unas 14 especies (Hirohama & Iwatsuki, 1980), muchas de las cuales viven en el Hemisferio Sur. Griffin III & Buck (1989), consideran a este género el menos especializado de la familia Barrramíaceae, aunque no se pueda decir que no tengan ninguna especialización concreta sino más bien lo contrario, ya que conducirían a toda una serie de caracteres plesiomórficos definidos. Presenta filidios dispuestos en 5 filas, rizoides completamente lisos (Hirohama & Iwatsuki, 1980), pelos axilares formados de 3 células todas ellas de aproximadamente el mismo tamaño, con la célula basal solamente algunas veces de color marrón oscuro, células del filidio mamilosas y raramente papilosas y opérculo rostrado a umbonado cónico, con número cromosomático n= 8. Los pelos axilares son los menos especializados de toda la familia (Griffin III & Buck, 1989), correspondiendo al denominado tipo “bryoide”. El número cromosomático de n= 8 es considerado de manera generalizada como un carácter plesiocárpico. Engler (1924) reconoce 3 secciones dentro del género Conostomum: 3a. 1.- sección Cleistocarpidium Broth., a la que pertenece la especie sudamericana C. cleistocarpum Herz. 3a.2.- sección Pseudo-Bartramidula Broth., monotípica como la anterior, con una única especie C. curvirostre Mitt., de distribución austral. 3a.3.- sección Eu-Conostomum Broth., que engloba unas 10 especies de distribución principalmente austral, bien sudamericana como C. aequinoctiale Schimp., y C. macrotheca Herz., o europea (C. tetragonum (Dicks.) Lindb.. y C. boreale 5w.). 13 3.1.2. Las especies ibéricas del género Bartramia Hedw. En la Península Ibérica la familia Bartramiaceae está representada por siete géneros (Casas, 1991): Plagiopus, con una sola especie, P. oederiana (Sw.) Crum & Anderson; los géneros también monoespecíficos Conostomum, fireutelia y Anacolia, cuyas especies representadas son C. tetragonum (Hedw.) Lindb., fi. chrysocoma (Hedw.) Lindb., y A. webbii (Mont.) Schimp. (endemismo de las regiones mediterránea y macaronésica); el género Philonotis, el más numeroso con nueve especies: P. calcarea (B. & 5.) Schimp., P. fontana (Hedw.) Brid., P. hastata (Duby) Wijk & Marg., P. marchica (Hedw.) Brid., P. rigida Brid., P. seriata Mitt., P. tomentella Mol., P. arnelli Husn., y P. caespitosa Jur. El género Catoscopium es incluido fuera de la familia Bartramiaceae como integrante único de la familia Catoscopiaceae por Casas (1991), aunque en la presente Memoria Doctoral lo incluiremos dentro de Bartramiaceae, subfamilia fiartramioideae, de acuerdo a Griffin III & Buck (1989). Su única especie ibérica es C. nigritunz (Hedw.) Brid., de la que apenas se conocen dos localidades ibéricas en el Pirineo (Casas & col., 1985-1992). Finalmente, el género fiartramia Hedw., objeto central de la presente Tesis, en la Península Ibérica consta de cuatro especies, según la reciente revisión de Casas (1991): Bartramia halleriana Hedw., Bartramia ithyphylla Brid., fiartramiapom¡formis Hedw., con dos variedades: var. elongata Turn., y var. pomiformis, y Bartramia stricta Brid. La determinación del material biológico, se realizó de acuerdo a la siguiente clave analítica, para las cuatro especies ibéricas del género flartramia, elaborada a partir de Smith (1980) y Crum & Anderson (1981), así como con otras anotaciones propias (López-Sáez, 1992) (Fig. 3.1.): 1- Filidios de base ensanchada, blanquecina y laminar: B. ithyphylla Brid. 1- Filidios sin las características anteriores 2 2- Células rectangulares o casi rectangulares en todo el filidio, células opacas, cápsula simétrica de debiscencia apical, perístoma simple: fi. stricta Brid. 2~ Células basales del filidio rectangulares, células de la zona media del filidio cuadrangulares a rectangulares, células no opacas, traslúcidas, perístoma doble, cápsula asimétrica de dehiscencia oblicua 3 3- Plantas verde glauco, seta de 5-20 mm de longitud, cápsula exerta: fi. pomiformis Hedw. 3-Plantas verdes a verde parduzco ceniciento, seta curvada de 2-3 mm de longitud, apenas visible, usualmente inmersa entre los filidios: B. ha//enana Hedw. A continuación, se aportan algunos datos sobre la biología, ecología y corologia de las cuatro especies ibéricas del género, para lo cual seguiremos básicamente a Casas & col. (1985-1992) y Smith (1980) junto a algunos apuntes particulares. Los mapas de distribución que se adjuntan (Figs. 3.2.-3.5.) se han tomado de Casas & col. (1985-1992). 14 1 1 pl Hl si H2 ~\UUU& ¡2 S2 P2 % ‘3 H3 y~a8c~9di 53 ~‘ ¡44 U Fig. 3.1.: 1, Filidios; 2, células basales; 3, células de la zona media del filidio; 4, cápsulas; H, B.halleriana; 1, B.ithyphylla; P, B.pomifornds; S, B.stri cta. 15 3.1.2.1. Bartramza halleriana Hedw., Spec. Musc.: 164 (1801). Planta de hasta 15 cm de caulidio tomentoso principalmente en su base que forma céspedes de color verde oscuro a pardo-verdosos. Se trata de una especie monoica autoica o sinoica), con los fihidios superiores a menudo crispados en sequedad, o bien erecto-patentes cuando hay humedad, en ocasiones subsecundos, de morfología más o menos lanceolada y subulados, con el margen recurvado en la zona de inserción al caulidio y dentado desde la mitad del filidio hasta el ápice. Nervio excurrente. Células de la parte basal rectangulares y células de la zona media del filidio cuadradorectangulares, pelúcidas y mamilosas. Seta curvada y corta de no más de 2-3 mm de longitud, y que por lo general es poco visible quedando inmersa entre los filidios. La cápsula es similar a la de fi. pomiformis aunque algo más ancha en sequedad. Esporas de 20-24 gm, tipificadas por Estébanez & col. (1992). Rizoides papilosos (Hirohama & lwatsuki, 1980). Caulidio perteneciente al tipo anatómico IV (Velasco & col., 1991), diferenciado en epidermis, parénquima, endodermis e hidroma. Especie rara, propia de la base y grietas de rocas graníticas de la mitad norte de la Península Ibérica, principalmente del pre y Pirineo y Cordillera Cantábrica (Fig. 3.2.), De lugares húmedos y sombreados en el piso del haya y del pino. De ecología mesófila, esciófila, humícola y terrícola, indiferente con preferencia por sustratos silíceos. Acompaña entre otras a Webera cruda (L.) Bruch. y Amphidium mnougeotii Schpr. Distribución general mesotérmica cosmopolita, encontrándose en Europa, Asia (Caúcaso, Himalaya, Tibet, China), Africa (Kilimanjaro), Norteamérica incluyendo Hawaii, Sudárnerica, Australia y Nueva Zelanda. -AV o rl Ii Ñ -.--————-— LI ~ __ —— — o 1 u— Hg. 3.2¿ Mapa de cksttuzión úc fi. hafleriana Hedw. en EspaLa; Portugal. 16 3.1.2.2 Bartramia ithyphylla Brid., Musc. Rec. 2 (3): 132 (1803). Planta sinoica de caulidio tomentoso en su parte inferior y de tamaño no superior a 0.5-4.0 cm que forma céspedes laxos de color verde claro a verde-amarillento. Los filidios son erectos, rígidos a flexuosos o crispados en sequedad, más o menos lanceolados, subulados a rectangulares y blanquecinos. La base del fihidio es esta especie es muy peculiar ya que está muy ensanchada en forma de hombro hialino y de ella parte el resto del fihidio hasta el ápice muy adelgazado. El margen es plano o ligeramente serrulado y el nervio excurrente. Las células basales del filidio son claramente rectangulares y grandes además de hialinas, mientras que las de la zona media son rectangulares pero más delgadas, opacas y manúlosas. La seta es estrecha y mide entre 1-3 cm. La cápsula es como la de fi. pomiformis aunque en ocasiones más ancha, sobre todo en humedad. Las esporas son reniformes y papilosas, de 29-40 ¡xm y fueron tipificadas por Estébanez & col. (1992). Rizoides papilosos (Hirohama & Iwatsuki, 1980). Caulidio de tipo anatómico IV (Velasco & col., 1991), diferenciado en epidermis, parénquima, endodermis e hidroma. Número cromosomático n= 12, 12 (10 + 2m) ó 6 (5 + m). Forma céspedes fértiles, más o menos altos, generalmente finos, que llegan a los 6 cm. Es común en grietas de rocas silíceas y suelos húmicos, en prados y grietas de rocas graníticas, así como en suelos descalcificados de las montañas calcáreas, principalmente en la media y alta montaña (pisos del pino y del haya), en los pisos subalpino y alpino ibéricos, sobre los 3000 m de altitud. Rara en el piso montano puede llegar a encontrarse a los 1000 m. De ecología mesófila, fotófila, humícola, terrícola-saxícola, caíd fuga y tolerante. En la Península Ibérica es bastante común, sobre todo en zonas montañosas, no conociéndose localidades canarias. Poco frecuente en Portugal, está ausente en Madeira y Azores (Fig. 3.3.). Acompaña formando céspedes esciófilos a Aulacomnium androgynum (Hedw.) Schwaegr., Tonula subulata Hedw., Bryum capillare Hedw. y Eurhynchium praelongum (Hedw) B.,S. & G. Especie de distribución mesotérmica boreal, vive en Europa desde Rusia a las Islas Británicas, Islas Feroes, Islandia, Centro y Norte de Asia, China, Norte y Este de Africa, Norteamérica, Méjico y Patagonia. Todos los ejemplares ibéricos revisados por Casas & col. (19851992) y los recolectados por nosotros pertenecen a la variedad Uhyphylla. Fig. 3.3.: Mapa de distriouzió~ de .8. ithyphyl2a Brid. en la España y Portugal. “7 3.1.2.3. Rartramia pomiformis Hedw., Ann. Bot. 1: 527 (1805). Planta monoica (autoica o sinoica) de 0.5-8.0 cm, verde clara a verde amarillenta. Forma céspedes convexos, densos y amplios, a veces pulvinulares y siempre copiosamente fructificados. Los caulidios de 10-100 mm son muy tomentosos en la base. Filidios de lineado a lanceolados, densos, finos y flexuosos. Su margen está fuertemente dentado en la parte superior. El nervio es dentado al dorso, excurrente y las células son papilosas. Las células basales son rectangulares o cuadradorectangulares, y las células de la zona media del filidio son aovado-cuadrangulares. Seta larga y estrecha que mide entre 5-25 mm, y que sostiene una cápsula globosa, estriada y asimétrica, curvada al secarse. Esporas papilosas, de morfología esférica a elipsoidal, de color pardo, que miden de 20 a 26 gm. Su tipificación fue llevada a cabo por Estébanez & col. (1992). Rizoides papilosos (Hirohama & Iwalsuki, 1980>. Número cromosomálico n= 9 (8 + m), 8 ó 8 (7 + m). Caulidio diferenciado en cuatro tejidos (epidermis, parénquima, endodermis e hidroides), perteneciente al tipo anatómico IV (Kawai, 1989; Ron & col., 1992; Velasco & col., 1991). Crece en sustratos ácidos y descalcificados, tales como taludes húmedos o humus, fisuras de rocas, en bordes de caminos, paredes rocosas, generalmente en lugares umbrosos y silíceos. Tiene preferencia por el piso montano superior llegando al subalpino. Aparece en pinares, robledales, hayedos, encinares y en el sur en los pinsapares, entre los 700 y 1300 m de altitud, aunque en la región Mediterránea llega a descender a los 150 m. Es rara en Canarias, donde sí es abundante fiartramia También rara en Madeira y Azores. En la Península Ibérica es la especie más abundante de la familia (Fig. 3.4.), mucho más que Bartramia ithyphylla. Lloret (1986) refiere que esta especie está ligada a un cierto intervalo de alturas, generalmente a cotas más elevadas donde suele poseer indices de ocupación más altos entre los 1400 y 1700 m. Podríamos definirla como una especie de ecología terrícola y rupicola, preferentemente esciófila, y con preferencia por bordes húmedos o cercanías de fuentes y arroyos, mesófila y calcífuga. Suele acompañar entre otros a Polytrichumformosum Hedw., Pogonatum aloides (Hedw.) P. Beauv., Fissidens bryoides Hedw., Tortula subulata Hedw., Polytrichum juniperinum Hedw., Hypnum cupresszforme Hedw., Eurhynchiumpulchellum (Hedw.) Jenn., Dicranum scoparium Hedw., y fiartra¡nia ithyphylla Brid. Distribución general mesotérmica cosmopolita, boreal-montana. Se distribuye por Gran Bretaña, Islas Feroes y Europa Central, Caúcaso, Norte y Centro de Asia, Himalaya, China, Japón, Madeira, Norteamérica, Tierra del Fuego y Nueva Zelanda. Respecto a su fenología en la Península Ibérica disponemos de los datos de Lloret (1987), para el Pirineo Central, que sustentan que la maduración de los gametangios se produce entre junio y julio y la dehiscencia (arquegonios de color marrón, anteridios vacíos) entrejulio y agosto. Dicha fenología concuerda con la que presenta Bartrarnia ithyphylla. El esporófito posee la seta ya formada entre abril y mayo en ambas especies, siendo tal maduración más tardía a mayor altitud. En general, y durante el invierno, el musgo se encuentra en fase de elongación de seta, siendo en primavera, una vez formada ésta, cuando se produce la meiosis, liberándose la esporas durante el verano. Frecuentemente se encuentra, a parte de la variedad tipo pomiformis, la var. elongata Turn. stricta. 18 :1. .6 <o. . j0 . ‘~.0 Y.. rl 1 Fig. 3.4.: Mapa de distribución de E. pomiformis Hedw. en España y Portugal. 3.1.2.4. Bartramia stricta Brid., Muse. Rec. 2(3): 132 (1803). Planta sinoica de hasta 3 cm y por lo general de pequeño tamaño, de caulidio tomentoso. Los folidios son erectos, muy rígidos en sequedad, lanceolados y acuminados, con base que no abran al caulidio como ocurre en fi. ithyphylla y fi. halleriana, de margen plano o escasamente recurvado en su parte inferior y nervio excurrente. Tanto las células basales del filidio como las de la zona media son siempre cuadrangulares y muy opacas, lo que diferencia muy bien esta especie de fi. pomiformis. La seta es estrécha y globosa de casi 1 cm, y la cápsula es globosa, y por lo general es la de menor tamaño de todas las especies ibéricas. A diferencia de fi. pomiformis, la cápsula es simétrica con abertura apical y no ladeada. Las esporas son papilosas de 26-32 gm y han sido tipificadas por Estébanez & col. (1992). Rizoides papilosos (Hirobama & Iwatsuki, 1980). Caulidio perteneciente al tipo anatómico IV (Velasco & col., 1991), diferenciado en epidermis, parénquima, endodermis e hidroma. Abundante y siempre fértil, forma pulvínulos o céspedes densos de color verde glauco o pardo en taludes arcillosos o pobres en cal, en suelos esqueléticos de rocas graníticas, gneis, rocas basálticas, etc, pero muestra preferencia por los esquistos. Se encuentra en toda la región Mediterránea, en el dominio dA Quercion. Predomina entre los 200-700 m, pero también se encuentra a los 1700 itt. Mu” Q&fliUi¡ LII Lb isias Canarias, en altitudes comprendidas entre los 200 y 1550 m. 19 Más rara en Azores y Madeira. Saxícola en zonas elevadas y terrícola en zonas xéricas generalmente soleadas. Mesófila y silicícola. Vive formando céspedes apretados con Poivtrichum junz~erinum Hedw. y suele acompañar a Hypnum cupress¿fonne Hedw. Más frecuente en el occidente peninsular sobre todo en la provincia corológica Luso-Extremadurense. Distribución general en España por la Región Mediterránea y Macaronesia (Fig. 3.5.). Especie sumamente interesante, por ser únicamente abundante en cantidades suficientes, como para realizar un estudio químico profundo sobre su contenido flavonoidico, en la Península Ibérica e Islas Canarias, estando ininimnamente representada en Gran Bretaña y Centrocuropa. De distribución suboceánica-inediterránea, vive en Europa y Macaronesia, Siria, Libia, Argelia, Camerún, Norteamérica, Australia y Tasmania. 4 Fig. 3.5.: Mapa 4e distribución de E. stricta Brid. en España y Portugal. 20 3.2. Flavonoides Los flavonoides son polifenoles naturales que se encuentran muy extendidos en el Reino Vegetal, cuya presencia es posible en todas las partes de la planta (hojas, raíces, polen, néctar, flores, frutos, semillas y madera) aunque los presentes en las hojas han sido los más analizados (Richardson, 1983). Forman un grupo de compuestos fenólicos caracterizados por poseer un núcleo de quince carbonos con dos anillos fenólicos, con una estructura común C6-C3-C6 en la que dos anillos de benceno están unidos por un elemento de tres carbonos (Fig. 3.6.), distinto según la naturaleza del flavonoide (Fig. 3.7). Sobre este núcleo común pueden presentar distintos sustituyentes. Grupos hidroxílicos aparecen en distintas posiciones de los anillos aromáticos. Estos grupos hidroxilos pueden a su vez, estar libres o bien unidos por enlace 0-glicosídico a un azúcar (mono-, di- o trisacárido). En ocasiones, pueden presentarse flavonoides con azúcares generalmente simples, unidos mediante enlace carbono-carbono (C-glicósidos) (Alston, 1968). 2 .3 1 4 5 II 43 o Fig. 3.6.: Estructura general del esqueleto de flavona. Los primeros flavonoides fueron identificados en el siglo XIX como recoge Richardson (1983). Hacia 1975 cerca de 1300 compuestos flavonoidicos habían sido ya caracterizados (Harborne & col., 1975), aunque en la actualidad el número de flavonoides identificados únicamente en plantas vasculares sobrepasa ya los 4000 (Harbome, 1988a). Cerca del 2% del total de carbonos fotosintetizados por las plantas son convertidos en flavonoides, o compuestos relacionados como los taninos (Das & Law, 1990; Markham, 1982). Considerada la colonización del medio terrestre por los vegetales, como el posible origen de los briófitos, el reforzazniento de sus paredes celulares tuvo que jugar un papel sumamente importante en dicha conquista. Es por ello que trabajos pioneros en la química de briófitos, así como de su ontogenia, se centraban en la posible presencia de lignina en tales organismos. Bland & col. (1968), Farmer (1953) y Farmer & Morrison (1964), en Sphagnum L. y Siegel (1962 y 1969) sobre Polviríchales admiten la presencia de lignina. Erickson & Miksche (1974) en cambio, en dos especies de politricáceas y una de esíacuáceas, ofrecían resultados totainiente opuestos. A tal respecto, Hébant (1 Q74 anunraba la tC~Siflb ce;.tam:aa¿iór¡ de lignina procedente dc! iiurnu~ en los musgos australianos 21 “‘. «¾‘. .1 U) U) ‘ti c JH~ — II o rw~v~- 3-OL FLAVANONA FLAVONA (Dihidrotiavona) (Catequina) o 0% ~CHO ‘-OH QXC~OH o OH FLAVONOL FLAVAEONOL “CH CH ‘OH FLAVAIq—3 , 4-DIOL (Leucoantocianidina) (DihidrOflavOflOl) H ANTOCIANIDINA Pterocarpanos Rotenoides OH .0j4 044 OH HO 0 O OH Flavonoides preni lados II o CHALCONAS O BIFLAVONOIDES (Amentof lavona> ~E~Q Nt o KIÁ=cs DIHIDROCHALCoN1~s Fig. 3.7.: Estructura de los principales tipos flavonoidicos. 22 Co AURONAS gigantes de Polytrichales estudiados por Siegel. Las nuevas investigaciones de Miksche & Yashuda (1978) sobre el mismo material vegetal, concluyen la ausencia definitiva de lignina. No obstante, el gran número de estudios posteriores realizados sobre el tema, han concluido la sí existencia de “compuestos lignoides” (Giannasi & Crawford, 1986; Lewis & Yamamoto, 1990; Wilson & col., 1989) en musgos, aunque como tal se refieren a C-glicoflavonas, biflavonoides y ácidos fenólicos. De esta manera, y en la actualidad, se podría afirmar que los briófitos no han sido capaces de sintetizar lignina, aunque por contra, sí sintetizan otra gran y variada gama de compuestos fenólicos, básicamente flavonoides, que comparten la ruta biosintética de la lignina, y a los que ya Czapek (1899), auguraba esa posible función como compuestos que refuerzan la pared celular. Es por ello, que los flavonoides entrañan una importancia primordial, aún no desvelada, en la supervivencia de los briófitos a lo largo de la historia geológica y climática de La Tierra que, con seguridad, habrá supuesto la diversificación en los distintos tipos flavonoidicos, como consecuencia de las adaptaciones de tales vegetales al medio y, por tanto, permite en la actualidad utilizarlos como “fuente de información” taxonómica (Herzfelder, 1921; Crosby & Magilí, 1981). Markham (1988 y 1990), Swain (1974 y 1977a), Lowry & col. (1983) y Brehm & Krell (1975) ya refieren la posible función y produción de los flavonoides por las “plantas verdes”, en su colonización del medio terrestre, como protección contra la luz ultravioleta, cuya incidencia podría haber sido 10 veces más intensa en esa época de lo que es en la actualidad. No se sabe, con certeza, la extensión de la capa de ozono en la atmósfera terrestre en el momento en que surgieron las plantas vasculares. Lo que parece evidente es que la ausencia total o parcial de ésta, permitiría el acceso de parte de la radiación ultravioleta del sol que dañaría a los vegetales que crecían en estos medios primogenios. De ahí, que los vegetales tuvieran necesidad de disponer de unas sustancias que actuaran como “filtros” frente a dicha radiación. Esta fue, probablemente, la función primitiva de los flavonoides y otros compuestos de tipo fenilpropanoide (Kubitzki, 1987). Mezclas de flavanonas, flavonas, dihidroflavonoles y flavonoles en las vacuolas de las células epidérmicas de las hojas sirven como filtros, reduciendo la radiación UV-B y Uy-A que atraviesa la capa de ozono de la atmósfera terrestre. Se ha demostrado que la capa de células epidérmicas en las que se acumulan los flavonoides, protegen a las capas inferiores de células mesofilicas, absorbiendo un 90% de la radiación UV-B (Robberecht & Caldwell, 1978). Wilson & col. (1989) postulan que la rigidez que poseen los musgos puede ser debida a la existencia de taninos o polímeros de hidroxibenzofurano, con una función fisiológica semejante a la de la lignina. McClure (1986) insiste incluso en la compartimentalización de los flavonoides en tejidos diferenciados, como por ejemplo la epidermis, que explicaría claramente la localización y función de este tipo de compuestos en los briófitos. Este tipo de compuestos fenólicos constituye además y, como ya se ha expuesto con anterioridad, una base muy importante en la química de musgos y hepáticas (Huneck, 1983). 23 3.2.1. Flavonoides en Musgos. Durante bastantes años se cuestionó la presencia de flavonoides en briófitos. La primera cita en la literatura sobre flavonoides en briófitos corresponde a Molisch (1911), aunque la estructura de dicho compuesto, referida a la saponarina, no fue elucidada hasta 50 años más tarde como recoge Markham (1990). Paul (1908) ya citaba antocianinas en Sphagnum spp. No obstante, son Bendz & col. (1962) quienes aislan e identifican por primera vez flavonoides en briófitos: dos glucósidos de una antocianidina poco común, la luteolinidina, en Bryum cryophilurn Mart. De las tres subclases de musgos consideradas por Vitt (1984), dentro de la clase Bryopsida, ni en Sphagnidae ni Andreaeidae se han aislado o identificado flavonoides, excepto esfagnorrubinas (Miies, 1990). Unicamente, se conocen flavonoides como tales en Bryidae, aunque trabajos recientes están poniendo de manifiesto la posible síntesis de flavonoides por especies de Andreaeidae (Becker, 1986; Seeger, 1992). Después del trabajo pionero de McClure & Miller (1967) en quimiotaxonomia de musgos, surgieron nuevas investigaciones sobre e] tema, que arrojaron resultados sumamente interesantes: aislamiento de un glicósido de 5-deoxidihidroflavonol en Georgia pellucida (L.) Rabh. (Vandekerkhove, 1977a); 7-ramnoglucósido de apigenina (5,7,3’-triofl-flavona) en Hylocomium splendens (Hedw.) B.S. & G. (Vanderkerkhove, 1977b); apigenina y 7-ramnósido de apigenina en Pleurozium schreberi (Willd.) Mitt. (Vanderkerkhove, 1980); saponarósido, schaftósido, isoschaftósido, neoschaftósido, isoneoshaftósido, vicenina-2, crisoeriol y diversos 6,8-di-C-glicósidos en Ptagiomnium undulatum (Hedw.) T.Kop., y saponarósido, en Píagioinnium cuspidatum (Hedw.) T. Kop. (Freitag & col., 1986; Vandekerkhove, 1978a); diversos glicósidos de luteolina (5,7,3’,4’- tetraOH-flavona), apigenina y diosmetina, así como una biflavona de la luteolina (5’,8”-biluteolina) en Dicranum scoparium Hedw. (Osterdahí, 1979a y b); isoflavonas en Bryum capillare Hedw. (Anhut & col., 1984); glucurónidos aislados por primera vez en musgos (Miles & col., 1986), etc. Todos estos trabajos en relación a los compuestos identificados, y las especies de las que se aislaron, quedan expuestos en los Anexos 1 y 2. En base a toda esta información, y si le añadimos la presencia de auronas (Weitz & Ikan, 1977), de 3-deoxiantocianidinas (Bendz & col., 1962), de biflavonoides macrociclicos (López-Sáez, 1992; Seeger, 1992; Salm, 1992; Seeger & col., 1991; Salm & col., 1993), de triflavonoides (Seeger & col., 1992b; Seeger, 1992), así como de hipnogenoles y otros dihidroflavonoles (Sievers, 1992; Sievers & col., 1992), en distintas especies de musgos, se apoya la propuesta de que los musgos no son embriobiontes primitivos y, de que comparten una fuerte afinidad con las plantas vasculares habiendo ido bioquimicamente hablando, muy paralelos en su evolución (Ron & col., 1990; LópezSáez, 1992). Posteriormente, otro gran número de nuevos compuestos flavonoidicos han sido aislados también en briófitos, muy especialmente por Markham & Porter (1978a), quienes realizan una excelente revisión. Dos años después Zinsmeister & Miles (1980), ofrecen una nueva recopilación de todos los conocimientos existentes sobre los flavonoides en briófitos. Ternai & Markham (1976), Markham & col. (1987), Pelter & col. (1976), Nilsson (1973) y Agrawal (1989), publican así mismo algunos trabajos sobre ‘3C RMN y ‘H RMN de flavonoides. No debemos olvidar el excelente trabajo 24 de Mabry & col. (1970), de consulta necesaria para la identificación sistemática de los flavonoides. Las sucesivas recopilaciones de Harborne & col.(1975), Harborne & Mabry (1982), Harborne (1988a) y Harborne (1993), recogen todos los conocimientos y trabajos relativos a flavonoides, entre los que se encuentran incluidos aquellos referidos a nuevos compuestos flavonoidicos identificados en briófitos (Markham, 1988). No obstante, la función que muchos flavonoides realizan en las plantas en general (Wollenweber & Dietz, 1981; Bruneton, 1991; Harborne & col., 1975) y, en los briófitos en particular, no está aún bien comprendida, lo que aumenta si cabe, no sólo el interés por identificar nuevos compuestos flavonoidicos en briófitos, sino también, por conocer que función cumplen y cual es el significado fisiológico y filogenético de su presencia en musgos y hepáticas. Hay que tener en cuenta que de las 10.000 especies y 700 géneros estimados de musgos (Schofield, 1985), sólo cerca de 320 especies (3.2 %) y 120 géneros (17%) han sido químicamente estudiadas, respecto a algún tipo de compuesto orgánico o inorgánico (Miles, 1990). De éstas, en 160 (1,6%) especies y 73 (10,4%) géneros se ha realizado el ensayo preliminar flavonoidico (Múes, 1990; Múes & Zinsmeister, 1988); de los cuales, han sido elucidadas 239 estructuras químicas correspondientes a flavonoides: 177 flavonoides para hepáticas (116 estructuras completamente identificadas y las otras 61 parcialmente) y 62 en musgos (51 completas y 11 parcialmente identificadas). Sólo de 21 especies de musgos (0,2%) han sido aislados e identificados algún flavonoide (Miles, 1990). Lo que sí parece quedar claro tras estos estudios, es una clara diferenciación entre la química flavonoidica de hepáticas y musgos, ya que sólo el 6% (MOes & Zinsmeister, 1988), de los estructuras conocidas son comunes a ambos. Es bien conocido que, en muchos casos de hepáticas y algunos de musgos (p.c. Miles & col., 1986), el patrón flavonoidico es un excelente marcador en la delimitación de las especies de briófitos. De manera semejante, pero a un nivel superior, se puede aceptar la existencia de marcadores específicos en hepáticas (tricetina: flavona-di-C-glicósido) y musgos (biflavonas) (Miles, 1990). De acuerdo a lo anteriormente expuesto, el interés por estudiar nuevas especies e identificar nuevos compuestos aumenta más, si cabe, ante las cifras tan bajas que barajamos. Se abre así un campo de investigación realmente importante, que reviste mayor interés, y con seguridad tomará mayor relevancia cuando el número de trabajos y especies estudiadas sea mucho más alto; de tal manera que, al menos, se puedan establecer las pautas que siguen las relaciones filogenéticas entre los distintos rangos taxonómicos. En resumen, los musgos exhiben una gran variedad de tipos flavonoidicos (ver Anexos 1 y 2), que incluye flavonas C- y 0-glicósidos, auronas, isoflavonas, biflavonoides, triflavonoides, 3deoxiantocianidinas y otras variadas estructuras de esqueleto flavonoidico (ver Fig.3.7 Pp. 22). Sin embargo, mientras que la presencia de flavonoles y dihidroflavonoles ha sido dudosa hasta los trabajos de Sievers (1992) y Sievers & col. (1992), únicas citas existentes sobre la identificación de este tipo de compuestos en musgos, no puede decirse lo mismo de proantocianidinas y 3-hidroxiantocianidinas cuya identificación no puede ser considerada como clara y convincente (ver Anexo 2). Esto puede indicar que la ruta biosintética que conduce a tales compuestos es esencialmente inoperativa en musgos (Markham, 1990). Sin lugar a dudas, de los compuestos fenólicos identificados en musgos, son los biflavonoides y los triflavonoides los que revisten un mayor interés, también para nosotros, por ser específicos de 25 musgos, estando ausentes en hepáticas y antocerotas (Geiger, 1990), y en base a los resultados de nuestro trabajo (identificación en Rartramiaceae Schwaegr.) y al hecho de que, hasta el momento, la mayor parte de los flavonoides identificados en la familia Bartra¡niaceae han sido precisamente biflavonoides junto a un triflavonoide y un ácido flavonoidico (ver Anexo 2). Los biflavonoides son dímeros de flavonoides, cuya presencia es constante en Psilotales, Selaginellales y Gimnospermas, con excepción de Onetales y Pináceas (Geiger, 1990). La química y quimiotaxonomía de estos compuestos ha sido revisada regularmente por Baker & Ollis (1961), Baker & col. (1963), Geiger & Quinn (1975, 1982, 1988) y Geiger (1990). Mientras que en plantas vasculares, la mayoría de las biflavonas aisladas están basadas en la flavona apigenina y sus derivados metiléter, las identificadas en musgos lo están respecto de la luteolina (comúnmente dímeros de luteolina) sin metilar, sobre todo derivados hidroxilados (2,3- ó 2” ,3’ ‘-dihidro-derivados) (Seeger & col., 1990). Muy recientemente se han identificado en musgos algunos biflavonoides derivados de la apigenina (Seeger & col., 1992a y 1993b), lo que abre aún más la gran variabilidad de los biflavonoides de musgos. En general, los monómeros flavonoidicos implicados en el biflavonoide suelen ser flavonas y flavanonas, con un patrón de oxigenación muy simple: 5,7,4’ y ocasionalmente 5,7,3’,4’ (Markham, 1982). La unión de ambas unidades suele estar constituida por un enlace carbono-carbono, aunque ocasionalmente se dan los enlaces tipo éter (Geiger & Quinn, 1975). Dentro de los tipos más comunes para los enlaces C-C se incluyen: enlace 6,8” apigenina-apigenina (grupo de la agatisflavona), enlace 8,8” apigenina-apigenina (grupo de la cupresoflavona), enlace 3’,8” apigeninaapigenina (tipo amentoflavona), enlace 6,3”’ apigenina-apigenina (tipo robustaflavona) y enlaces 3,8’’ entre diversas flavonas y flavanonas. Los enlaces tipo éter incluyen básicamente los tipos hinokiflavona (enlace interfiavonoidico en 6,4”’) y ochnaflavona (enlace en En musgos, la gran mayoría de los biflavonoides son tipo C-C, conociéndose únicamente biflavonoides con enlaces tipo éter entre ambos monómeros en Hypnurn cupresszforme Hedw. (Sievers, 1992; Sievers & col., 1992), lo que abre un nuevo abanico de posibilidades, si cabe, a la química biflavonoidica de musgos. La ocurrencia de biflavonoides glicosilados es muy rara y restringida en general a gimnospermas (Alston, 1968; Markham, 1982; Geiger & Quinn, 1975), no habiéndose detectado por el momento en musgos (Anexo 2). Los primeros biflavonoides aislados en musgos se identificaron en Dicranum scoparium (Lindberg & col., 1974), representando la primera cita de este tipo de compuestos fuera de las plantas vasculares. Dímeros de isoflavona-flavona fueron identificados respectivamente como bryoflavona y heterobryoflavona en Bryurn capillare (Geiger & col., 1987). Este tipo de biflavonoides nunca antes había sido puesto de manifiesto, si bien si se conocían dímeros isoflavona-isoflavano en leguminosas. Posteriormente, y muy recientemente, se han ido identificando un variado número de estructuras biflavonoidicas, siendo la de mayor relevancia la bartramiaflavona, aislada en Bartramiapoíniformis (Seeger & col., 1991; Seeger, 1992; López-Sáez, 1992), y Bartramia halleriana (Salm, 1992; Salm & col., 1993), por tratarse de un biflavonoide macrocíclico. Finalmente queremos destacar la identificación de dos nuevos tipos flavonoidicos en musgos: los triflavonoides y los ácidos fenólicos, por presentarse ambos en la familia botánica objeto de 26 nuestro estudio (Seeger & col., 1992b; Seeger, 1992). En cuanto a su localización celular y subcelular, ésta apenas ha sido estudiada. Gadek & col. (1984) demuestran la presencia de biflavonoides en las cutículas foliares, lo que sugiere una función protectora frente a la depredación, que igualmente podrían desempeñar en musgos (Ron & col., 1992). De acuerdo a lo expuesto por Gadek & col. (1984), Geiger & Quinn (1988), postulan posteriormente que los biflavonoides de musgos pueden realizar, al igual que los presentes en las superficies foliares de plantas vasculares, una importante función en los mecanismos de defensa contra invasiones fúngicas o depredación de insectos. Las referencias de Czapek (1899) respecto a la presencia de compuestos fenólicos en las paredes celulares de un largo número de briófitos y, las afirmaciones de Geiger (1990) acerca de esa posible localización de los biflavonoides de musgos, van precisamente en el camino de admitir la fisiología supuesta anteriormente. La compartimentalización en tejidos diferenciados, caso de la epidermis, de los compuestos flavonoidicos apoyaría aún más las suposiciones antes expuestas. El poder antibiótico de estos compuestos (Cody & col., 1986; Van Hoof & col., 1981; Zinsmeister & col., 1987 y 1991; Zinsmeister & Miles, 1987), apoya igualmente esta idea. Todos los comentarios anteriores vienen además refrendados por el hecho de que especímenes de herbario de más de 100 años han sido válidos para una análisis flavonoidico (Harborne, 1967), y así mismo, flavonoides han sido igualmente aislados de fósiles de 25 millones de años de antigúedad (Niklas & Gianassi, 1978). El descubrimiento de la localización de los flavonoides en general y, de los biflavonoides en particular, en las células de los musgos, aportaría una información valiosisima sobre su funcionalidad, el porqué de su acumulación y, ofrecería además, un nuevo punto de vista en el que apoyar la filogenia de este grupo botánico que consituyen los briófitos. En su mayoría, los biflavonoides aislados en musgos, son mucho más polares que los de otras plantas (Geiger, 1990). Esta diferente polaridad, más notable respecto a los biflavonoides de gimnospermas, podría ir relacionada con sus zonas de acumulación: en las zonas hidrofílicas de las paredes celulares, caso de los biflavonoides más polares de musgos y, en la cutina, en el caso de los biflavonoides más lipofílicos de gimnospermas. En resumen, podríamos afirmar que la química flavonoidica es día a día más compleja, sobre todo en musgos, como lo demuestra la identificación de biflavonoides macrociclicos (Seeger & col., 1991; Seeger, 1992; Salm, 1992; Salm & col., 1993; López-Sáez, 1992), de triflavonoides (Seeger, 1992; Seeger & col., 1992b; Hahn, 1993), de hipnogenoles y otros dihidroflavonoles (Sievers, 1992; Sievers & col., 1992), de dímeros flavona-aurona (Weyand, 1993; Geiger & Markham, 1992), y aurona-aurona (Hahn, 1993; Hahn & col., 1994; Geiger & col., 1993a), y finalmente, fuera de briófitos, de tetraflavonoides (Tih & col., 1992; Fig. 3.8.), espiroflavonoides (Baba & col., 1992; Fig. 3.9.), e incluso de flavonoides dorados en &reptomyces spp. (Anyanwutaku & col., 1992). 27 Fig. 3.8. Estructura del tetraflavonoide Lophiroflavano A. “o .4 “o O ‘~‘~ OH “O Fig. 3.9. Estructura del espiroflavonoide Genkwanol B. La metodología usada en la actualidad, tanto en el proceso de extracción como analítica, puede explicar ese gran progreso experimentado por la química flavonoidica en general y biflavonoidica en particular de musgos, sobre todo en referencia a muchas de las especies que fueron estudiadas aflos atrás, particularmente por MeClure & Miller (1967), que había ofrecido un resultado negativo en cuanto a la presencia de flavonoides en ellas y en la actualidad se ha demostrado la identificación de flavonoides en muchas de éstas. Es por ello, que creemos necesario acometer la revisión a través de nuevos estudios de tales especies, pues algunas de ellas están ofreciendo resultados sumamente espectaculares, caso deHypnum cupress¡forme, Campylopus spp., Auiacomnium spp., etc. 28 A. Estado actual de conocimiento. La recopilación de los diversos tipos flavonoidicos identificados en musgos (Anexo 1), pone de manifiesto que únicamente se conocen flavonoides como tales en la subclase Bryidae y no en Sphagnidae ni en Andreaeidae. No obstante, debemos decir que en Sphagnidaese conoce la existencia de unas antocianidinas un tanto especiales, conocidas como esfagnorrubinas, pero en cambio no se ha detectado la presencia de ningún otro tipo flavonoidico. En Andreaeidae, en los últimos años se está postulando la posible existencia de flavonoides (Becker, 1986) y cabe la duda sobre si sintetizan biflavonoides (Seeger, 1992). Por el momento dichos datos quedan a la espera de su confirmación. En resumen, la química flavonoidica de musgos parece ir encaminada a que la síntesis de flavonoides es exclusiva de la subclase considerada como más evolucionada, la subclase Bryidae, estando ausentes por el momento en Sphagnidae y Andreaeidae. Suire & Asakawa (1979) separan sin dificultad las tres subclases de Mu.sci entre ellas y respecto a las clases Hepaticae y Anthocerotae atendiendo a la presencia del ácido lunulárico y de la D-metionina. Los musgos de la subclase Biyidae exhiben una enorme variedad de tipos flavonoidicos, que incluye flavonas (agliconas, C- y 0-glicosiladas), isoflavonas e isoflavonas 0-glicósidos, auronas, 3deoxiantocianidinas, chalconas, ácidos flavonoidicos, aldehidos flavonoidicos, biflavonoides y triflavonoides (ver Fig. 3.7 pp. 22). Las flavonas que sintetizan los musgos son por lo general derivadas de la apigenina o de su hidroderivado la luteolina, tales como vitexina, crisoeriol o diosmetina. Entre las flavonas identificadas se encuentran ya no solo las propias agliconas (apigenina y luteolina), sino sus derivados glicosilados. Los azúcares pueden unirse a la molécula de flavona mediante enlaces de tipo C-, Oy O-C-. En musgos se conocen flavonas-O-glicósidos, flavonas-O-diglicósidos, así como derivados tri- y tetraglicosilados. Los azúcares más frecuentes que se unen a dichas flavonas son respectivamente la glucosa y en menor medida la ranmosa. Los flavonoles en musgos son escasos y por lo general derivan del kaemferol (3-OHapigenina). Se ha identificado la aglicona correspondiente así como derivados 0-glicósidos y diglicósidos. Al igual que los flavonoles, las isoflavonas se han citado pocas veces en musgos, y en concreto, exclusivamente en la familia Bryaceae. Por lo general, las isoflavonas de musgos son derivadas del orobol y de la pratenseina, tanto a nivel de aglicona como de 0-glicósidos y Odiglicósidos. En cuanto a los biflavonoides, son sin duda el mejor marcador flavonoidico, específicos de musgos, y que permiten diferenciar sin problemas la composición flavonoidica de éstos respecto a las hepáticas, de las cuales están ausentes. Su identificación por primera vez en Dicranum scoparium supuso una gran sorpresa, aunque hoy en día dichos compuestos se conocen en bastantes especies y, día a día su naturaleza es más variada. En el apartado siguiente trataremos más en profundidad los biflavonoides de musgos así como los triflavonoides. Auronas, chalconas, ácidos flavonoidicos y aldehidos flavonoidicos tienen una representación minoritaria en la química flavonoidica de musgos. Sólo se ha identificado por el momento una aurona en la especie Funaria hygrometrica (Funariaceae) aunque se conocen biflavonoides con dos dímeros 29 de aureosidina. La única chalcona conocida en musgos en un derivado 0-glicosilado, cuya estructura está aún por determinar en Plagiomnium (Mniaceae). Los ácidos flavonoidicos se identificaron por primera vez en Bartramia pomiformis, y la estructura elucidada fue denominada ácido bartrámico, que en realidad posee un monómero de luteolina sustituido en C-8 por un grupo ácido. El otro ácido flavonoidico conocido es el ácido hipnico de Hypnum cupressiforme, derivado de un dihidroflavonol. Es esta última especie se identificó así mismo el único aldehido fiavonoidico conocido, también derivado de un dihidroflavonol. Las antocianidinas de musgos corresponden básicamente a dos tipos de estructura. Unas derivadas de la luteolinidina, tanto 0-glicósidos como 0-diglicósidos, identificadas en Rryum spp., y Splachnum spp., y las otras, las esfagnorrubinas del género Sphagnum, tienen una estructura muy peculiar que ha hecho que ciertos autores las consideren compuestos fenólicos no flavonoidicos. La presencia de 3-deoxiantocianidinas, de biflavonoides y triflavonoides macrocíclicos, hipnogenoles y chalconas, así como de dihidroflavonoles, viene en resumen a indicarnos, que los musgos no son embriobiontes primitivos, sino que comparten una fuerte afinidad con las plantas vasculares, por lo que bioquimicamente hablando, habrán tenido una evolución paralela. Día a día se identifican nuevos flavonoides en musgos, e incluso algunos de ellos incluyen tipos flavonoidicos hasta ahora no descritos en musgos (chalconas, biauronas, etc.), e incluso ciertas estructuras son completamente novedosas en la química de los productos naturales, como lo fueron en su momento los biflavonoides macrociclicos, y tras esta Tesis Doctoral lo son los triflavonoides macrocídlicos. Si pasamos ahora a analizar la presencia de cada uno de los tipos flavonoidicos en cada uno de los taxones considerados, tendremos en cuenta que, en primer lugar, obviaremos las subclases Sphagnidae y =4ndreaeidaepor carecer éstas de flavonoides en sentido estricto. En 11 de los órdenes de la subclase Bryidae en los que se estudió la composición flavonoidica, se identificó al menos la presencia de flavonoides. Unicamente en 3 no se detectó ningún flavonoide (Buxbamiales, Tetraphidales, Rolytrichales). El orden Dicranales, considerado como el menos evolucionado de la subclase Rryidae de los que fueron investigados, se caracteriza por sintetizar básicamente dos tipos de flavonoides: de un lado flavonas glicosiladas y de otro biflavonoides. La presencia de agliconas flavónicas se demostró únicamente en una especie de Ditrichaceae, mientras que los derivados 0-glicosilados se conocen únicamente en Dicranum scoparium de Dicranaceae. Los biflavonoides en el orden se identificaron en una especie de las familias Ditrichaceae, Bryoxiphiaceae, Eustidiaceae y Rhabdoweisiaceae; en dos especies de Dycnemonaceae y en 17 especies de Dicranaceae. En esta última familia, todas las especies investigadas se caracterizaron por sintetizar biflavonoides, excepto Dicranella hochreutineri y Leucoloma serrulatum, aunque dichas especies han sido únicamente estudiadas por MeClure & Miller (1967), cuyo trabajo necesita una profunda revisión, como ya se ha comentado anteriormente. Unicamente en las familias Leucobryaceae, Calymperaceae y Schistostegaceae del orden Dicranales no se pudo identificar ningún flavonoide. En resumen, el orden Dicranales se caracteriza por sintetizar básicamente biflavonoides, excepto Dicranum scoparium, que también sintetiza flavonas 0-glicosiladas. El segundo orden considerado, Fissidentales, ha sido poco estudiado pero se ha demostrado 30 la existencia de biflavonoides en una única especie de Fissidentaceae, aunque el resto no parecen sintetizarlos. Dichos resultados estarían próximos a los del orden anterior. En el orden Buxbamiales no se ha demostrado por el momento la presencia de flavonoides, por lo que debemos sospechar que carecen de ellos. El orden Pottiales sigue la tónica anterior, ya que se han identificado únicamente biflavonoides en una especie de Encalyptaceae y cuatro de Pottiaceae. En el orden Grimmiales se conocen sólamente biflavonoides en tres especies de Grimmiaceae y una de Phychomitraceae, y ningún otro tipo de flavonoide. De nuevo, nos encontraríamos con que estos primeros órdenes, supuestamente menos evolucionados, de la subclase Bryidae. se caracterizan por sintetizar casi exclusivamente biflavonoides. En el orden Funariales, la situación cambia sensiblemente respecto a los órdenes anteriores, ya que a los biflavonoides identificados en dos especies de Funariaceae y una de Splachnaceae, hay que sumar otros tipos flavonoidicos tales como auronas en Funariaceae y antocianidinas en Splachnaceae. Es difícil precisar si la aparición de estos dos nuevos tipos flavonoidicos ha de considerarse o no como un carácter más evolucionado respecto a los órdenes anteriores. De hecho, se conocen antocianidinas en la subclase Sphagnidae, aunque de una estructura muy especial, y de la misma manera, se conocen biflavonoides formados por dímeros con aurona (incluso biauronas) en Dicranaceae del orden Dicranales. De acuerdo a lo anterior, podría postularse que la síntesis de antocianidinas, auronas, flavonas y biflavonoides ha de considerarse como un carácter poco evolucionado o plesiotípico en musgos. El siguiente orden considerado, el orden Bryales, permite en cierta manera tomar los postulados anteriores como válidos, ya que puede servir de “frontera” entre los órdenes menos evolucionados y los más evolucionados de la subclase Bryidae. En el orden B¡yales y más concretamente en la familia tipo, Bryaceae, los tipos flavonoidicos identificados son muy numerosos, ya que se conocen flavonas (3 especies), flavonas-O-glicósidos (6 especies), flavonas-C-glicósidos (3), isoflavonas (2), isoflavonas-O-glicósidos (2), antocianidinas (4), flavonoles (1), flavonoles-Oglicósidos (2) y biflavonoides (6). La síntesis de isoflavonas y flavonoles, de acuerdo a lo anterior, podría ahora considerarse como un carácter evolucionado en musgos, frente a los órdenes anteriores que no sintetizan dichos tipos flavonoidicos. La identificación en dicha familia Bryaceae de biflavonoides formadas con monómeros de isoflavona (brioflavona y heterobrioflavona) podría confirmar lo antes expuesto, y reafirmamos en que el orden Biyales y más concretamente la familia Bryaceae servirían de frontera, entre los órdenes menos evolucionados y los más evolucionados de la subclase Biyidae. Las isoflavonas y sus derivados tienen estructuras que simulan a los esteriodes (Swain, 1986), y a otros controladores del crecimiento y desarrollo de ciertos depredadores potenciales, por lo que pueden interferir en dichos procesos. Así mismo, ciertas estructuras poliméricas como proantocianidinas y biflavonoides, pueden unirse a proteínas, incluido enzimas, y a otros polímeros tales como polisacáridos y ácidos nucleicos (Swain, 1986), favoreciendo la función defensiva de las isoflavonas contra la depredación. En Bryaceae se sintetizan tanto isoflavonas, antocianidinas como biflavonoides, lo que sugiere que la síntesis de isoflavonas en la familia es una especialización particular frente a la depredación por insectos, ya que en ninguna otra familia ni género de musgos 3’ se sintetizan. En la familia Mniaceae del orden Rryales se cumplen perfectamente todos los postulados anteriores, ya que al igual que en Bryaceae, se reconocen biflavonoides (4 especies), flavonas-O-Cglicósidos (6 especies), flavonas-C-glicósidos (8), flavonas (6), flavonas-O-glicósidos (10), y el carácter supuestamente más evolucionado, la síntesis de flavonoles-O-glicosilados en una especie. Así mismo se identificó una chalcona (0-glicósido) en una única especie, cuya presencia debe considerarse así mismo como un carácter de poca evolución, ya que su síntesis apenas requiere pocos pasos metabólicos (Fig. 3,10), aunque primero se debe confirmar su estructura. En otras seis familias del orden Bryales, o bien sólo se han identificado biflavonoides (Rhizogoniaceae, Hypnodendraceae, Leptostoinataceae, Meesiaceae) o ni siquiera se conoce la síntesis de flavonoides (Spiriden¡aceae). En Timmiaceae se sabe de la síntesis de flavonoides pero no se han descrito biflavonoides. En las dos familias restantes estudiadas en el orden Bryales se conoce la existencia de biflavonoides tanto en Bartramiaceae como en Aulacomniaceae, pero a diferencia de los órdenes anteriores e incluso del resto de familias de su propio orden, se han identificado en ambas triflavonoides e incluso en Bartramiaceae triflavonoides cíclicos. Así mismo, en Bartramiaceae se conocen bifiavonoides macrocíclicos y ácidos flavonoidicos. Todos estos caracteres (ciclación molecular, adición de un tercer monómero, existencia de ácidos flavonoidicos) han de considerarse como bastante evolucionados respecto a los anteriores órdenes o familias de Rryales que no los poseen. Así mismo, la existencia de triflavonoides en Aulacomniaceae y en Bartramiaceae habla en favor de su gran parentesco filogenético. Pasando ya a un orden supuestamente más evolucionado, el orden Ortotrichales, se conoce la síntesis de biflavonoides en cuatro especies de Ortotrichaceae, pero no de algún otro flavonoide que pudiera considerarse como un carácter de mayor evolucion. En el orden Leucodontales la situación es similar al orden anterior, ya que se conoce la síntesis de biflavonoides en nueve familias (Racopilaceae, Neckeraceae, Leucodontaceae, Hedwigiaceae, Meteoriaceae, Ptychomniaceae, Cryphaceae, Cyrtopodaceae, Lepyrodontaceae), de flavonas O- y C-glicosiladas en Hedwigiaceae, y en el resto de familias, o sólo se sabe que sintetizan flavonoides (Pterobryaceae) o que no los sintetizan (Fontinalaceae, Climaciaceae, Anomodontaceae, Thamniaceae, Phyllogoniaceae, Prionodoneaceae). En resumen, se sigue observando la supuestamente poco evolucionada síntesis en musgos de biflavonoides y flavonas, sin añadir ningún carácter de mayor evolución. En el orden Hookeriales, de nuevo, o bien se desconoce la existencia de flavonoides en Hookeriaceae o sólo se han identificado biflavonoides en Hypopterygiaceae. El orden I-Iypnales va a confirmar, sin embargo, muchos de los postulados antes expuestos. En la familia menos evolucionada del orden, Leskeaceae, no se han identificado flavonoides al igual que en Echinodiaceae y Rhytidiaceae; mientras que en Thuidiaceae, Amblystegiaceae, Brachyteciaceae, Entodontaceae, Plagiotheciaceae, I-Iypnaceae, Sematophyllaceae, Lembophyllaceae e Hylocomiaceae se conoce la síntesis de biflavonoides. En Antblystegiaceae se han identificado también antocianidinas, y en Hylocomiaceae flavonas y flavonas-O-glicosiladas, considerados todos estos caracteres como de poca evolución, y que confirman lo hasta ahora hipotetizado. Es 32 precisamente en la familia tipo, en Hypnaceae, donde se demuestra la existencia de ciertos caracteres que permiten considerar al orden Hypna les como más evolucionado respecto a los anteriores. Tales caracteres son la síntesis de flavonoles, de ácidos flavonoidicos, de aldehídos flavonoidicos y de biflavonoides formados por dímeros de flavonol y dibidroflavonol. Todos estos caracteres han de considerarse en conjunto como un carácter bastante evolucionado, sobre todo la identificación de derivados de dihidroflavonol. El orden Seligerales no añade nada nuevo a lo ya conocido, pues únicamente se sabe de la síntesis de biflavonoides en Seligeraceae. Es precisamente el orden Tetraphidales, y su familia tipo Tetraphidaceae, la que viene a confirmar mediante la síntesis (al menos dudosa) de dihidroflavonoles, que éste es un carácter que supone cierta evolución con respecto a los órdenes que no sintetizan dihidroflavonol. La síntesis en Tetraphidaceae de dihidroflavonoles (Vandekerkhove. 1977a), ha de considerarse como un carácter apotípico que explica la posición del orden Tetraphidales como uno de los más evolucionados de la subclase Bryidae junto al orden Hypnales. La no síntesis de biflavonoides en Tetraphidales explicaría así mismo, que este orden sea ciertamente más evolucionado que Hypnales que silos sintetiza. En el último orden de la subclase, en Polytrichales, no se conoce la síntesis de flavonoide alguno, ni siquiera biflavonoides o flavonas, excepto los datos dudosos expuestos para Pogonatum spp. En cambio sí se conoce la síntesis de otros compuestos cercanos a los flavonoides como son las cumarinas (Jung, 1993-94), también identificadas en el orden anterior. En resumen, las investigaciones sobre la química flavonoidica de musgos no han hecho sino comenzar, a pesar de los numerosos y productivos avances logrados en los últimos años. Cualquier tipo de manifestación o conclusión de índole taxonómico o sistemático que se haga a nivel global sobre la composición flavonoidica de musgos, será al menos incompleta, ya que como los resultados demuestran, los principales descubrimientos están aún por llegar. A medida que se reinvestigan aquellas especies en las que se suponía conocer la composición flavonoidica, se identifican en ellas nuevos flavonoides antes no descritos. Por todo ello, las conclusiones que antes derivaron de tales conocimientos deben revisarse y ponerse al día, sobre todo los trabajos de McClure & Miller (1967), y trás un profundo análisis poder albergar al menos, algún tipo de hipótesis preliminar sobre las relaciones filogenéticas existentes entre musgos, hepáticas y antocerotas, y entre éstos (briófitos) con las algas o con los pteridófitos. Podríamos finalmente hipotetizar acerca de la evolución sufrida por la composición flavonoidica de musgos, de acuerdo a lo antes expuesto: 1. La síntesis de antocianidinas en la subclase Sphagnidae ha de considerarse como un carácter poco evolucionado, que nos permite afirmar que esta subclase es la más primitiva de musgos. Esta afirmación, sin embargo, debemos tomarla con precaución, pues si bien es cierto la presencia de antocianidinas en la subclase menos evolucionada de musgos, también lo es que la síntesis de antocianidinas requiere numerosos pasos en la ruta biosintética (Fig. 3.10), lo que de acuerdo a Swain (1986) no es típico de organismos poco evolucionados. No obstante, la particular estructura de las esfagnorrubinas de Sphagnidae nos permiten mantener tales postulados. 33 2. En la subclase Andreaeidae no hay antociadinidas pero si posiblemente flavonoides, por lo que parece ser más evolucionada que la subclase anterior. 3. En la subclase Bryidae, la más evolucionada de todas, los órdenes más primitivos se caracterizan por sintetizar básicamente auronas, flavonas y biflavonoides, y excepcionalmente chalconas. De hecho, y como refleja la Fig. 3.10, tanto la síntesis de flavonas como de biflavonoides requiere de pocos pasos biosintéticos a partir de la flavanona mediante una flavona-sintasa. Esta poca elaboración de la ruta biosintética tanto de flavonas como de biflavonas (biluteolinas) habla en favor del carácter plesiotípico que su presencia en musgos posee. Lo mismo puede afirmarse de las chalconas, ya que constituyen la estructura básica a partir de la cual se biosintetizan el resto de flavonoides (ver Fig. 3.10). El orden Bryales supone la frontera entre los órdenes menos evolucionados de la subclase (con flavonas, auronas y biflavonoides) y los más evolucionados. En dicho orden se aunan caracteres considerados de poca evolución (flavonas, biflavonoides y los relictos bioquímicos de antocianidinas y chalconas) con otros que suponen un paso evolutivo notable (síntesis de flavonoles, isoflavonas, triflavonoides, ácidos flavonoidicos y ciclación molecular). A partir de dicho orden Bryales parece existir una tendencia a reducir la síntesis de flavonoides, aunque órdenes más evolucionados siguen presentando nuevos caracteres que suponen un nuevo paso evolutivo, como ocurre con la síntesis de dihidroflavonoles y aldehidos flavonoidicos en fzlypnales. En particular, la síntesis de dihidroflavonoles, parece ser un paso evolutivo notable que podría culminar definitivamente la evolución de la complejidad estructural de los flavonoides de musgos. En Tetraphidales se mantiene la síntesis de dihidroflavonoles pero se pierde definitivamente la de biflavonoides, y así mismo se comienza la sustitución de los flavonoides por cumarinas, que se ve culminada en Polytri chales, el orden más evolucionado de musgos, en el cual la tendencia es a no sintetizar flavonoides y sí cumarínas. No obstante, algunos autores como Suire & Asakawa (1979), inciden en el origen polifilético de las tres subclases de Musci, lo que permitiría explicar la presencia de antocianidinas en Sphagnidae. 34 ¿—O H — pr Dan tu c jan i d 1 n a 3—OH—antociaflidifla fi avaflO 3Oi u’ 0U1/ xx Ea o O o OB E HO flavano—3 O pterDrarpaflo 4—diol 1 fi ayuno1 HO i a sufí avona ¿—deoxlRO proantocianidina MO j O fi avanoflfl 1 (dihidrOfiavon~~í) 3—deDX1~ -antocianidina —e fiavan—4—oi OH + OH en C—3 i fi avona RO O fi avofla RO LIGNINAS O flavaflofla 1 r4~ alcohOiCS OB cinámicos R0~ esti OH 1 ben OS m bi chal cuna ácidos beflzi cinámicos. Y 3 f cfi la lan ma U + acetatoS 3 fCz] 1 C.—C~,.) Fig. 3.10.: Esquema evolutivo de la biosíntesis de flavonoides (Swain, 1986; Stafford, 1991) 35 los B. Biflavonoides y Triflavonoides en Musgos. Los biflavonoides de musgos poseen una amplia variedad estructural, fundamentada no sólo en la naturaleza de los monómeros sino también en los tipos de uniones interfiavonoidicas. La naturaleza de ambos monómeros en los biflavonoides de musgos es variada, aunque por regla general la mayoría derivan de la luteolina, una flavona tetrahidroxilada derivada de la apigenina. Los biflavonoides más comunes en musgos son pues las biflavonas, y más concretamente las biluteolinas, siendo el tipo de enlace la única variación más sobresaliente. Así, entre las biluteolinas más frecuentes nos encontramos con la filonotisflavona (enlace 2’,8”), la dicranolomina (2’,6”), 5’,3”’-diOHamentoflavona (5’,8”) y 5’,3”’-diOH-robustaflavona(5’,6”). En los últimos años se han identificado algunas biflavonas formadas por un monómero de apigenina y otro de luteolina, tales como la 5’-OHrobustaflavona o la 5’-OH-amentoflavona. Incluso se conoce la existencia de biapigeninas en Jlomalothecium lutescens (Brachytheciaceae). Se conocen así mismo dímeros de flavona-flavanona como la 2,3-dihidro-filonotisflavona o 2,3-dihidro-dicranolomina que son las más frecuentes, formadas por un monómero de tuteolina y otro de eriodictiol. Menos frecuentes son los dimeros apigenina-naringenina (flavona-flavanona). En 6 familias (Brachytheciaceae, Hypnaceae, Entodontaceae, Meteoriaceae,Amblystegiaceae, Thuidiaceae) se conocen además dímeros de flavanona derivados de la naringenina (binaringeninas). Los dimeros isoflavona-flavona son exclusivos del género Bryum y son del tipo orobol-luteolina con enlaces 5’,8” y 5’,6”. La identificación de biflavonoides con un monómero de aurona, concretamente de aureosidina es muy cercana en el tiempo. Se conocen dimeros aurona-flavanona en tres especies del género Campylopus de la familia Dicranaceae, formados por un monómero de aureosidina (aurona) y otro de eriodictiol (flavanona) unidos mediante un enlace del tipo 5’,6”. Las biauronas son exclusivas de la familia Aulacomniaceae y están formadas por dos monómeros de aureosidina. Entre los biflavonoides más notables identificados, debemos destacar la bartramiaflavona y la anhidrobartramiaflavona, por ser ambos macrocíclicos y exclusivos de la familia Bartramiaceae, y por suponer la ciclación molecular un notable paso evolutivo en la química flavonoidica de musgos. Hasta el momento, todos los biflavonoides nombrados poseen uniones interfiavonoidicas de tipo C-C, aunque en Jclypnum cupresszforine se conocen así mismo biflavonoides con enlaces de tipo éter. Precisamente en dicha especie se conocen los únicos biflavonoides con monómeros de dihidroflavonol y flavonol. Los triflavonoides, identificados por primera vez en Bartramiapomiformis pueden, de igual manera, cumplir la función de marcadores específicos de musgos frente a hepáticas. Por el momento, los identificados son todos ellos triluteolinas, por lo general con enlaces del tipo de la filonotisflavona, aunque en esta Memoria Doctoral se ha identificado la primera triluteolina macrociclica denominada Ciclo-Triluteolina. En la Tabla 3.1., queda resumida toda esa inmensa variedad de tipos estructurales, monómeros y uniones interfiavonoidicas de los biflavonoides de musgos. Sólo se incluyen aquellas familias en las que se identificó la estructura de algún biflavoide, y no aquellas en las que sólo se conoce la presencia de biflavonoides de forma general. 36 Tabla 3.1.: Biflavonoides de musgos: tipos de monómeros y enlaces. Th Na D~cranaceae Qr + AM Df ~‘ + r r rr t 6 6” + + + + Dycnemonaceae + + + Gr,ntnnaceae + + + B,yaccae + + + Mniaceae + + + Á~Iacomniaceae + + + + + + Bartramiaceae + + + + + + Heilwigiaceae + + Leacoilontaceae + + + + + + s’r + Thuidiaceae + + Amblystegiaceae + + Eniodontaceae Brachy,heciaceae Hylocon,iaceae + + + + + 4- + + + + + + + + + 4’~ o. r’ + + + + -4- s~o. #“~ 4 Meteoriaccae Hypnaceae s s” + + Lu:Iuteolina, Ap:apigenina, Erzeriodictiol, Na:naringenina, Or:orobol, Auzaureosidina, Df:dihidroflavonol, Kf:kaemferol. Harborne (1977) consideraba la presencia de biflavonoides en 12 familias de Angiospermas como un relicto bioquímico primitivo, que obviamente no podemos admitir en briófitos donde, la complejidad estructural de los biflavonoides alcanza su grado máximo. Con seguridad, la síntesis de los biflavonoides es una de las especializaciones químicas que han experimentado los musgos, y como sugería Geiger (1990), como una respuesta frente a la radiación ultravioleta del sol en la conquista de la superficie terrestre. Sin embargo, debemos admitir, de acuerdo a la Fig. 3.10., que la síntesis de biflavonoides requiere de muy pocos pasos metabólicos, lo cual es típico de organismos primitivos (Swain, 1986). Gornalí & col. (1979) sugieren que un determinado tipo flavonoidico (carácter) tiene tres estados definidos: primitivo, avanzado y muy avanzado. El primitivo y el muy avanzado, a menudo, fenotípicamente son el mismo (Richardson, 1983). Esta acepción explicaría la síntesis de biflavonoides en organismos primitivos como los musgos y su existencia en ciertas monocotiledóneas (Geiger & Quinn, 1988). Ahora bien, todo lo antes mencionado no es más que una generalización aceptable siempre y cuando nos refiramos a biflavonas. Pero como ya se mencionó, en musgos se conocen biauronas, dímeros con dihidroflavonol y flavonol, biapigeninas, biluteolinas, etc. Toda esta inmensa variedad de estructuras biflavonoidicas de musgos, algunas exclusivas de ellos, así como la ciclación molecular 37 y la adición de un tercer monómero para constituir triflavonoides, no explican sino la alta especialización que los musgos poseen en la síntesis de biflavonoides y triflavonoides. En resumen, debemos aceptar que los musgos son organismos primitivos desde un punto de vista morfológico y ontogenético, pero su evolución química ha ido muy paralela a la de las angiospermas, ya que en cierta manera comparten numerosas afinidades, sobre todo en su composición flavonoidica. 3.2.2. Relaciones entre la composición flavonofdica de Musci y otros taxones. La evolución de los flavonoides en el pasado, ha sido considerada bajo distintos puntos de vista, tanto quimiotaxonómicos como filogenéticos, basados en la acumulación final de diversos productos del metabolismo en distintos grupos vegetales, especialmente entre las angiospermas (Harborne, 1988a). Recientemente, similares estudios de índole quimiosistemática, bajo un prisma recopilatorio, se llevaron a cabo en briófitos y pteridófitos (Markham, 1988 y 1990). Probablemente, la función que los flavonoides pudieron llevar a cabo durante los primeros pasos de la evolución y conquista de los territorios emergidos, fue la de servir a los vegetales como “filtros’ de la luz ultravioleta. Este atractivo concepto, considerado como válido por muchos autores (Geiger, 1990), supone sin embargo la existencia de altas concentracciones de flavonoides, lo cual es una dificultad añadida a la hora de argumentar las ventajas que esta función pudiera desempeñar en los primeros estados evolutivos de las plantas terrestres. Presumiblemente, las primeras enzimas capaces de llevar a cabo la síntesis de flavonoides no fueron tan abundantes como algunas de las actuales ni tan eficaces, ya que esa alta concentración de flavonoides requerida no se había acumulado inicialmente (Stafford, 1991). Al mismo tiempo, los mecanismos que permitieron dicha acumulación en las vacuolas celulares en una concentración efectiva como filtro de la luz ultravioleta, coevolucionaron con otros que permitieron su transporte hacia las paredes celulares. Muy posiblemente, los primeros compuestos fenólicos que sirvieron de filtros contra la luz ultravioleta fueron los fenlípropanoides (Kubitzki, 1987), ya que poseen coeficientes de absorción efectivos, aunque lógicamente menores que los flavonoides por su peso molecular más bajo. El desarrollo de un sistema enzimatico “primordial’ supuso la síntesis de flavonoides a partir de éstos por la adición de acetatos (ver Fig. 3.10) y su posterior acumulación. Posteriormente, la aparición de especializaciones morfológicas entre diversas partes del vegetal, con la diferenciación de frutos, raíces, hojas, tallos y órganos reproductores, introdujo paralelamente una evolución de los sistemas enzimáticos relacionados con la síntesis de flavonoides. Aumentó el número de funciones que éstos podían desempeñar y su complejidad. De acuerdo a Kubitzki (1987), los primeros vegetales que conquistaron los territorios emergidos que aún mantenían la humedad necesaria, procedían de la línea algal de las Carofíceas, directamente emparentadas con el grupo acuático de las algas verdes o Clorofíceas. Presumiblemente, estos incipientes vegetales terrestres desarrollaron células con una gran vacuola central, para el almacenamiento de agua, tal y como ocurre en Nitella y en las fanerófitas. Dicha vacuola, pudo servir al mismo tiempo de lugar de almacenaje de grandes cantidades de compuestos fenólicos del tipo 38 fenilpropanoide (C6-C3) y de los flavonoides (C15) posteriormente sintetizados. En las formas actuales de las Charophyceae, tales como Nitella o Chara, se cree que la conquista del medio acuático fue una adaptación secundaria respecto de las primitivas formas terrestres (Chapman, 1985). La presencia de flavonoides en las carófitas actuales es cuestionable (Markham, 1988), aunque sí parecen ser capaces de sintetizar ciertas flavonas C-glicosiladas, como Nitella hookeri que contiene 6,8-di-C-glicósidos de apigenina y luteolina, también identificados tentativamente en Chara (Markham & col., 1969; Swain, 1975). Los organismos pluricelulares, presumiblemente adquirieron un control hormonal que les permitió la síntesis de fenilpropanoides, seguida de la de flavonoides muy simples tales como flavanonas, flavonas y dihidroflavonoles (Stafford, 1990). La capacidad de acumulación en cantidades significativas de dichos compuestos fenólicos en las vaculas centrales de sus células, les permitió utilizarlos como una “defensa química” frente a la luz Uy-A y UV-B. Contra ambas, los flavonoides son mucho más efectivos que los fenilpropanoides (Stafford, 1991). Dentro de dichos organismos pluricelulares, las primeras y pioneras plantas terrestres que conquistaron el suelo fueron la línea de los briófitos, que sintetizan principalmente flavonas y biflavonas, flavonoides ambos que requieren de pocas vías metabólicas y por tanto, de un sistema enzimático no demasiado complejo. Un avance evolutivo es evidente por el grado de elaboración de una determinada ruta metabólica (Markham, 1990). De esta manera, aquellos compuestos cuya síntesis requiera muchos pasos metabólicos y por tanto de un sistema enzimático complejo, no estarán presentes en los organismos más primitivos (Swain, 1986). En este sentido, los briófitos cumplen a la perfección su rol de vegetales bastante primitivos, ya que sus dos tipos flavonoidicos básicos (flavonas y biflavonas) requiere pocos pasos biosintéticos (ver Fig. 3.10). Sin embargo, la química flavonoidica dentro de los briófitos es sensiblemente distinta en cada uno de los grupos. Los musgos (clase Musci) se han especializado en la síntesis de biflavonoides, de las que carecen las otras dos clases (Hepatícae y Anthocerotae). Las hepáticas (Hepaticae) sintetizan al igual que musgos, flavonoles, flavonas y auronas, pero no dihidroflavonoles ni biflavonoides. A diferencia de los musgos, en hepáticas se conoce la síntesis de flavanonas (agliconas) y de un tipo especial de flavonas, las tricetinas-di-C-glicosiladas, cuya síntesis no pueden llevar a cabo los musgos (Zinsmeister & Miles, 1980). Esta diferente composición flavonoidica de las diversas clases de Bryophyta, habla en pos del origen polifilético del grupo, ya que como afirma Asakawa (1986) no existen afinidades químicas notables entre las tres clases de briófitos. Las hepáticas según este autor tendrían un ancestro dentro del grupo de las algas pardas posiblemente, mientras que los musgos procederían de la línea de las algas verdes. Suire & Asakawa (1979), llegan incluso más lejos, ya que afirman que los datos químicos existentes dentro de la clase Musci, que consideran antinaturales, podrían indicar la existencia de tres grupos o subclases bien definidos que podrían separarse como clases distintas. Según ellos, dentro de briófitos existirían 5 clases: Hepaticae, Anthocerotae y las tres subclases incluidas en Musci (Sphagnidae, Andreaeidae y Bryidae). Los briófitos en general, y los musgos en particular, bioquimicamente hablando parecen estar más cercanos a las plantas vasculares, sobre todo a los pteridófitos, que a las algas verdes (Suire & Asakawa, 1979). Ciertos taxones alcanzan grados de complejida biosintética muy cercanos a los de ciertas familias avanzadas de las angiospermas, mientras que otros en cambio son mucho menos 39 avanzados. Esta heterogeneidad química de los briófitos, en cualquier nivel de clasificación, es similar a la de su diversidad morfológica, lo que concuerda plenamente con esa inmensa variabilidad de su composición flavonoidica (flavonas, biflavonoides, flavonoles, isoflavonas, antocianidinas, dihidroflavonoles, auronas, chalconas, etc.) (ver Fig.3.7. pp. 22). Las plantas vasculares más primitivas (Psilopsida) contienen biflavonas y trazas de otros Oglicósidos (Cooper-Driver, 1980), que también aparecen respectivamente en Selaginellales y en las más primitivas Lycopsida (Voirin & Jay, 1978). Las biflavonas, que aparecen principalmente en los pteridófitos más primitivos (Psilotales, Selaginellales), comparten este mismo criterio en las más primitivas gimnospermas (Cycadates, Ginkgoales) y angiospermas (Swain, 1974). Los otros dos órdenes deLycopsida, Lycopodiales e Isoetales, contienenúnicamente flavonas-O-glicósidos. La clase Sphenopsida, relacionada mediante su registro fósil con los licopodios, muestra un único avance en la química flavonoidica, contiene flavonoles, lo que indica su habilidad para introducir un grupo hidroxilo en posición C-3 (3-OH) de la flavanona precursora, junto a proantocianidinas y procianidinas. Estas nuevas características biosintéticas, que incluyen una mayor elaboración del sistema enzimático, son propias de los miembros más avanzados del Reino Vegetal, y probablemente su síntesis ocurrió durante el Devónico (Swain, 1980). La existencia de flavonoles, antocianidinas y dihidroflavonoles en musgos, juega el mismo papel que en pteridófitos, y su presencia en ciertas especies (Hynum cupress¿forme pe.) es indicativa de un mayor grado de evolución respecto a otros musgos incapeces de llevar a cabo su síntesis. Los musgos y hepáticas, a pesar de su primitivo registro fósil y de la presunción de que son los progenitores de todas las plantas terrestres, son tan avanzados como Sphenopsida en su habilidad para para producir una gran diversidad de estructuras flavonoidicas (flavonoles, flavonas trihidroxiladas en el anillo B, etc.). Como afirma Swain (1980), parecería que, en base a ello, hasta cierto punto podríamos considerar que los briófitos procederían de la reducción morfológica de los vástagos de las plantas vasculares en el curso de la evolución, o bien, han experimentado un avanze paralelo a una “primitiva” clase botánica de angiospermas hoy extinta. La presencia de biflavonoides en musgos y en los más primitivos pteridófitos, es una evidencia más de la afinidad química existente entre ambos (Asakawa, 1986; Geiger & Quinn, 1988), sustentada por una posible y ya mencionada evolución paralela, asociada con seguridad a la defensa contra predadores. Así mismo, la ausencia de biflavonoides en hepáticas, de acuerdo a Smith (1986) sugiere una similaridad química entre éstas y las algas pardas. Los helechos “verdaderos” (Filicinae), ofrecen nuevas estructruras flavonoidicas respecto a Sphenopsida. Producen también flavonoles y protantocianidinas (excepto Ophioglossales), así como 3-deoxiantocianinas, flavonoides C- y 0-metilados, acumulan chalconas y dihidrochalconas (Wollenweber, 1981). En los Filicales, que parecían carecer de biflavonoides (Cooper-Driver, 1980), se han identificado últimamente ciertos derivados metilados de la amentoflavona en Osmunda regalis L. y las poco comunes hegoflavonas (uniones 6’,6”) en Cyathea spinulosa Wall. La ocurrencia de biflavonoides (serie de la amentoflavona) en los miembros más primitivos de Filicales, debe considerarse como un carácter plesiomórfico en los helechos, que en cambio son inherentes en otras plantas vasculares ancestrales que contienen biflavonoides (Selaginellales pe.). En gimnospermas, tanto Cycadales (series de la amentoflavona e hinokiflavona) como Taxales 40 (derivados de la amentoflavona) tienen biflavonoides. En Coniferales sólo Lepidotharnnusde la familia Podocarpaceae posee una estructura con esqueleto biflavonoidico de podocarpusflavona (Geiger & Quinn, 1988). El resto de las especies de Podocarpaceae tienen derivados de la amentoflavona y en menor medida de hinokiflavona. La misma diversidad biflavonoidica se observa en la familia Taxodiaceae. En Cupressaceae se han identificado cupresoflavona en Platycladus orientalis (L.) Franco, pero faltan los biflavonoides en otras especies. También se conocen biflavonoides en Araucariaceae, Cephatotaxaceae y Pinaceae (sólo en Abies Mill., y Picea A.Dietr.), así como un espiroflavonoide en Larix gmelini (Rupr.) Rupr., de las pináceas, como recojen Geiger & Quinn (1988). Todos estos datos, refuerzan el punto de vista por el cual la ausencia de biflavonoides en la mayoría de las especies de Pinaceae es debida a su pérdida secundaria a lo largo de la evolución, dentro de las vías metabólicas que estaban presentes en las primitivas coníferas. Geiger & Quinn (1988), recogen la identificación de biflavonoides en 32 géneros de 15 familias de angiospermas, tanto de dicotiledóneas como monocotiledóneas. La gran diversidad de puntos de acumulación de los flavonoides en las angiospermas (raíces, hojas, frutos, semillas, polen, etc.), sugiere una amplia multitud de funciones: filtros de la luz ultravioleta durante la colonización en el Silúrico de los territorios emergidos, proteción contra depredadores e invasión fúngica, antibióticos, etc. Los biflavonoides que se han identificado en las plantas terrestres, tanto en briófitos (musgos) como en la línea de los traqucófitos (plantas vasculares), parece poco probable que tengan un origen común, sino que la hipótesis más válida es su desarrollo independiente (Geiger & Quinn, 1988). La identificación de series de amentoflavona debe pues ser tomada como un carácter primitivo (Geiger & Quinn, 1975), en base a su reciente descubrimiento en Fílicales. Desde un punto de vista evolutivo, los datos existentes indican una rápida evolución de las estructuras flavonoidicas básicas (chalconas, flavanonas, flavonas) durante el periodo Devónico (400 millones de años atrás), seguida de un largo periodo de relativo estancamiento, hasta el mismo momento en que se produce el dominio territorial de las angiospermas en el Cretácico medio (130 millones de años). Los cambios originados a lo largo de la evolución en la estructura flavonoidica básica o “primordial”, que dieron lugar a esa enorme diversidad de estructuras existentes tanto en musgos como en angiospermas, son debidos a la importancia funcional de proteger a los vegetales contra la luz, herbívoros primitivos y fitopatógenos. Tras el Cretácico, los cambios ocurridos presumiblemente derivarían de procesos de coevolución con diversos polinizadores (aves, insectos) y herbívoros (mamíferos, reptiles) (Stafford, 1991). En el curso de la evolución, la diversidad flavonoidica ha dependido estrechamente de un incremento del número de rutas biosintéticas requeridas (Swain, 1980), para producir nuevas estructuras (p.c. isoflavonas), y en segundo lugar, de la habilidad de los vegetales para emplear ciertas rutas y conseguir aumentar la complejidad de los más primitivos flavonoides (p.e. flavonas). Ambos pasos forman parte de un proceso evolutivo constante, que ha tenido fiel reflejo en la composición flavonoidica de musgos: tanto biflavonas como isoflavonas podrían adaptarse a tales planteamientos, sobre todo aquellas estructuras que requieren ciclación molecular y adición de un 41 tercer monómero. Por comparación con las angiospermas, podríamos afirmar que la estructura de los flavonoides identificados en musgos, es indicativa de la existencia de ciertos niveles de evolución biosintética, paralelos a la diversidad morfológica del grupo. Estos hechos se manifiestan sobre todo en la familia Bryaceae, que es capaz de sintetizar diversos flavonoles, incluso derivados glicosilados, que de acuerdo a la Fig. 3.10 necesitan en su síntesis de al menos tres pasos metabólicos (chalconaflavanona-dihidroflavonol-flavonol). Resumiendo finalmente, podemos afirmar que existe una tendencia general a lo largo de la evolución, a aumentar la complejidad estructural de los flavonoides desde la línea algal hasta las angiospermas (Harborne, 1967; Swain, 1975). Sin embargo, aunque esta doctrina es bastante clara en la mayoría de los casos, no siempre puede explicar la existencia de los primitivos biflavonoides en musgos y monocotiledóneas, o la existencia de auronas en las angiospermas más evolucionadas así como en musgos. Por todo ello, creemos que no se puede realizar ninguna afirmación generaliza en el sentido de admitir, en base a la composición flavonoidica, que los flavonoides de musgos son más primitivos que los de angiospermas. Más bien, la hipótesis más manejable sería la de una evolución paralela pero independiente, que en el caso de los musgos iría encaminada, salvo excepciones, a una especialización concreta en la síntesis de biflavonoides, así como de otras estructuras trimonoméricas (triflavonoides). La evolución de un sistema enzimático único hacia la vía metabólica que conduce a las ligninas, permitió una mayor evolución y diversificación morfológica y ecológica de las plantas vasculares. Los briófitos carecen de este sistema enzimático, y por ende, son incapaces de sintetizar lignina, lo cual les obligó a seguir dependiendo del medio y a especializarse en la síntesis de flavonoides, consiguiendo estructuras a menudo más complejas en los taxones más evolucionados. Muy diversos compuestos químicos se han utilizado como criterio de determinación evolutiva, así como del establecimiento de las relaciones taxonómicas y filogenéticas existentes entre los vegetales. Uno de ellos son los flavonoides, que han demostrado sufienciente eficacia y verosimilitud en ciertos niveles taxonómicos, pero plantean ciertos problemas cuando se intenta analizar su evolución desde las algas hasta las angiospermas. Obviamente, una comparación directa entre las secuencias de nucícótidos de ácidos nucleicos homólogos entre distintos taxones vegetales, proporcionaría la información más fiable y concreta del proceso de la evolución. Sin embargo, tal información es extremadamente limitada y se precisa acudir a otros criterios, como en nuestro caso la composición en flavonoides. 42 3.3. Actividad Biológica El potencial terapeútico moderno se nutre en buena parte de los principios activos de las plantas, ya sean aislados de ellas u obtenidas por síntesis. La ventaja del empleo de los vegetales es que, junto a sus principios activos, existen en muchos casos otros constituyentes de acción sinérgica que potencian su acción y la hacen más completa y duradera que el principio o principios activos aislados (Navasquillo, 1992). El hombre depende muy extrechamente del “Mundo Vegetal”, sin embargo, a lo largo de muchos milenios no ha sido aún capaz de alcanzar un conocimiento completo de las plantas más comunes. En la actualidad, en todo el mundo, se está produciendo una fuerte corriente de interés por las plantas como elementos terapeúticos, en un rama de la medicina que ya desarrollaron con profusión ciertas culturas históricas. En la antigiledad, algunas plantas eran consideradas sagradas por sus propiedades terapeúticas reconocidas, y su efecto se suponía debido a “cierto” poder mágico, sin necesidad de explicarse su mecanismo de acción. Hoy en día, se conocen varios centenares de plantas con acción terapeútica probada y, aunque nos alejamos en cierta medida de ese ritual mágico que veneraban nuestros antecesores, no es bien cierto que aún se sigue desconociendo el mecanismo de acción de muchos de los compuestos de naturaleza vegetal (Harborne, 1984). Podemos pues afirmar que la utilización de los recursos terapeúticos vegetales es aún incierta e inagotable y los principales descubrimientos están aún por investigar (Navasquillo, 1992). Muchos compuestos bioactivos han sido aislados en bacterias, hongos, líquenes y otros vegetales (Zinsmeister & col., 1991). No obstante, únicamente ciertos grupos botánicos han sido utilizados bajo este punto de vista, habiéndose excluido otros, entre ellos los briófitos, por no proporcionar productos de interés farmaceútico (Schneider, 1985). Sin embargo, como afirman Zinsmeister & col. (1987, 1991) y Zinsmeister & MOes (1987), tal parecer debe revisarse concienzudamente, pues los resultados y conocimientos hoy obtenidos hablan en este sentido. Es muy posible, que en base a nuevas investigaciones, el estatus de los briófitos dentro de la propia farmacognosia sea bien distinto y se revele como muy importante (Becker & col., 1992; Hedenás, 1991). Con nuestro trabajo hemos pretendido apoyar este camino y dotar a la medicina y/o farmacia de una nueva fuente de productos de origen natural: los musgos. Aunque los briófitos no han sido todavía considerados como plantas de importancia medicinal o bien tóxica, mientras que silo han sido el resto del Reino Vegetal (Becker & Wurzel, 1987; Schneider, 1985), distintas preparaciones obtenidos de ellos han sido notablemente utilizadas en la medicina popular de China y por los indios norteamericanos (Ando & col., 1984). Durante la Primera Guerra Mundial, Alemania y sus aliados tomaron ventaja en base a las especiales propiedades antibióticas de distintas especies de Sphagnum L. (Zinsmeister & col., 1991). Posteriormente, leñadores de los bosques de Norteamérica y Europa, durante mucho tiempo fueron susceptibles a la aparición de distintas dermatitis, haciéndose famoso el tratamiento con hepáticas del género Frullania L. La observación de que muchos briófitos no eran comidos por animales, hizo especular acerca de la existencia de agentes endógenos con actividad protectora. Es también notable añadir que aún no han sido detectados virus en briófitos (Nienhaus, 1985). Tampoco se ha podido 43 demostrar la degradación bacteriana ni fúngica en vástagos vivos del musgo Drepanocladusfluitans (Hedw.) Warnst. (Satake & col., 1990). Por todo ello creemos que no se debe despreciar a los briófitos como una nueva fuente de productos naturales, sino todo lo contrario. Abrir, si cabe, nuevos campos de investigación dentro de la biología, farmacia y medicina. Entre las distintas actividades biológicas conocidas para los compuestos de briófitos podemos citar, entre otros, los efectos alergénicos, la acción citotóxica y citostática, actividad cardiotónica, acción carcinogenética y antiinflamatoria, actividad antibacteriana y antifúngica, actividad antidepredación, regulación del crecimiento y desarrollo de la planta e inhibición enzimática (Zinsmeister & col., 1987 y 1991). Los briófitos son muy difíciles de degradar en base a una actividad fúngica o bacteriana, ya que son capaces de producir antibióticos, tales como poligodial, norpinguisano y cinamólido, inhibidores de la actividad microbiana (McCleary & col., 1960; McCleary & Walkinton, 1966; Asakawa, 1981; Huneck, 1983; Zehr, 1990). La mayor dificultad para los microorganismos debe encontrarse en la matriz orgánica de la pared celular, básicamente consistente en los polisacáridos, que son muy resistentes a la degradación microbiana (Satake & col., 1990). La producción de sustancias antimicrobianas es característica en las células vivas, lo cual puede explicar la presencia de algunos hongos únicamente en células descompuestas viejas o en vástagos muertos. Las relaciones entre Sphagnum spp., y el hongo Lyophyltum spp., son un ejemplo de la combinación musgo-descomponedor (Redhead, 1981; Grasso & Scheirer, 1981; Scheirer & Dolan, 1983; Simon, 1987). Una completa recopilación sobre las interrelaciones hongo-briófito es expuesta por Felix (1988). Debemos señalar a tal respecto que la invasión de las células del musgo por hitas fúngicas no siempre es causa de muerte como consecuencia de la protección que aporta la membrana celular del propio musgo (Racovitza, 1959). ¿Puede jugar un papel primordial la existencia de flavonoides en dichas membranas?. Banerjee & Sen (1979), plantean el interrogante anterior ante la “minúscula” cantidad de briófitos parasitados por hongos en relación al número de especies existentes y en base al hecho de la posible existencia de barreras a nivel anatómico, inmunológico o químico, de probada actividad antimicrobiana. Desde un punto de vista ecológico es curioso e interesante observar que los briófitos opongan una seria resistencia a la infección fungica en condiciones naturales y no en cambio en condiciones axénicas (Simon, 1987). La degradación bacteriana de briófitos no fue conocida hasta 1984, cuando se evidencia la invasión por bacterias en los vástagos vivos de la hepática Jungermannia vulcanicola Steph., la cual cuenta con monoterpenos en sus cuerpos oleiferos, y en Scapania undulata (L.) Dum., que cuenta con sesquiterpenos (Satake & Miyasaka, 1984; Satake & Shibata, 1986; Yokouchi & col., 1984). Es por ello que se puede afirmar la existencia de notables diferencias en la producción de compuestos bloactivos entre las hepáticas y los musgos, esperándose que las mayores diferencias residan precisamente en la matriz orgánica de la pared celular (Satake & col., 1990). Hasta el momento, y como ya se ha referido con anterioridad, no se ha podido demostrar la degradación bacteriana en las 44 células vivas de musgos, hecho que sí ha ocurrido en hepáticas; lo que confirma nuestro interés por estudiar los compuestos bioactivos de posible actividad farmacológica de este grupo botánico. Lo que tampoco se conoce hasta la actualidad son asociaciones de virus con briófitos de carácter mutualista (Horvath, 1977). Hemos querido finalmente realizar una pequeña recopilación sobre los distintos trabajos existentes acerca de las propiedades antibióticas de los musgos como fuente bibliográfica de consulta obligada, así como exponer algunos comentarios al respecto: Madsen & Pates (1952) y Pates & Madsen (1955), citan los poderes inhibidores de ciertos musgos y hepáticas (Sphagnum portoricense Hampe, S. strictum Sulí., Conocephalum conicuin (L.) Dum., y Dumortiera hirsuta Dum., sin referirse al tipo de compuesto activo ni al tipo de inhibición. Belkin & col. (1952-53) refieren la actividad de Polytrichumjuniperinum Hedw., frente al Sarcoma 37. Cuatro años más tarde, Wren (1956), cita de nuevo el poder medicinal de la última especie. Ramaut (1959), muestra el efecto inhibidor de estractos de Sphagnum spp., frente al crecimiento de Sarcina ¡¡¿tea, posiblemente como consecuencia de su acidez. En 1960, McCleary & col., realizan el primer estudio profundo acerca de las propiedades antibióticas de 12 especies de musgos frente a 9 microorganismos (bacterias y hongos), ofreciendo únicamente un resultado positivo Anomodon rostratus (Hedw.) Schimp., Orthotrichum rupestre Schleich. ex Schwaegr., y Mnium cuspidatum Hedw. Aunque no refieren el compuesto químico causante de tal actividad inhibidora, por el tipo de extracción que realizan y por los conocimientos que hoy se poseen, bien podrían tratarse de flavonoides. Curiosamente, de entre esas nueve especies que dan resultado negativo, aquellas en las que se conoce el contenido flavonoidico (Hygroamblystegium irriguum (H. & W.) Loesk., Bryum argenteum Hedw., Polilla wahlenbergii (W. & M.) Andr., B¡yum pallescens Sch. ex Sch., Sphagnum spp., y Polytrichum spp.), se caracterizan todas ellas por no sintetizar biflavonoides, cuando en el caso de Bryum argenteum, B. pallescens y Pohlia wahlenbergii existen otras especies de su género respectivo que silo hacen. En cuanto a las otras tres especies que ofrecen resultados negativos (Grimniia wrightii (Sulí.) Aust., Ceratodon stenocarpus (Hedw.) Brid., y Hedwigia albicans P. Beauv.), no se conoce la presencia de biflavonoides en los dos primeros géneros, y su identificación en Hedwigia spp., es dudosa (Ósterdahl, 1976; Osterdahí & col., 1976). De las tres especies que resultan positivas frente a los microorganismos, sí se conoce la presencia de biflavonoides en Plagiomnium cuspidatum (Hedw.) T. ¡(op. (=Mnium cuspidatum). En el género Orthotrichum Hedw., no se ha hecho ningún estudio al respecto, y para la última especie sólo disponemos del antiguo ensayo realizado por McClure & Miller (1967), que denotaba la ausencia de flavonoides en Anomodon rostratus (Hedw.) Schimp., aunque muchas de las especies que ofrecían resultados negativos para tales autores han sido revisadas posteriormente, concluyéndose en muchos casos la existencia de flavonoides y biflavonoides (LópezSáez, 1992). Años más tarde, Wolters (1964a y b), ofrece una corta revisión sobre las propiedades antibióticas de briófitos, donde pone de manifiesto la actividad antifúngica de Diplophyllum albicans (L.) Dum., Pogonatuin aloides (Hedw.) P. Beauv., y Plagiotheciumdenticulatum Br., no habiéndose estudiado hasta el momento el contenido flavonoidico de las especies de musgos antes citadas (ver 45 Anexo 1). De nuevo, McCleary & Walkington (1966), emprenden su segundo estudio sobre las propiedades antibióticas de diferentes especies de musgos, poniendo de manifiesto una fuerte capacidad de inhibición frente a los microorganismos GafJkya tetragena y Staph¿ylococcus aureus de las siguientes especies, entre las 50 estudiadas: Atrichum angustatum (Brid.) ¡3. & 5., y A. undulatum (Hedw.) P. Beauv., en los cuales no se conoce la presencia de flavonoides pero sí de cumarinas (Jung, 1993-94; ver Anexo 1); Dicranum fuscencens Sm., y D. scoparium Hedw., habiéndose identificado en la última especie un biflavonoide por Osterdahí (1979 a y 1983), Ron & col. (1990) y Lindberg & col. (1974); Funaria americana Lindb. ex Sulí. (no estudiado su contenido flavonoidico); Hylocomium proliferum Hedw., Mnium glabrescens Kindb., y M. insigne Kindb., que son especies en las que no se conoce ningún trabajo acerca de sus flavonoides, aunque otras especies de los géneros respectivos sí contienen biflavonoides; Polytrichum commune Hedw., P. juniperinum Hedw., y P. piliferum Hedw. (contienen cumarinas según Jung, 1993-94); Pseudoisothecium stolonzferum Lindb. (no se ha estudiado su composición flavonoidica); Rhytidiadelphus triquetrus (IIedw.) Warnst., según Vandekerkhove (1977b), no posee flavonoides, aunque tales resultados deberían revisarse pues otra especie del género, R. squarrosus (Hedw.) Warnst., en la que el mismo autor citaba igualmente la ausencia de flavonoides, sintetiza 5 biflavonoides (Seeger & col., 1990; Seeger, 1992); Plagiotheciumundulatum (Hedw.) B.S.G., es un caso similar al anterior, pues Sievers (1992) realiza únicamente un estudio muy concreto sobre la presencia/ausencia de tres biflavonoides en dicha especie; Sphagnum cuspidatum Ehrh. ex Hoffm., 5. macrophytlum Bernh. ex Brid., y 5. palustre L., de composición química un tanto especial, son especies caracterizadas por sintetizar un tipo concreto de antocianidinas exclusivas del género, las esfagnorubinas (Anexo 2). Del estudio de McCleary & Walkington (1966), resulta particularmente interesante la reflexión que realizan acerca del ataque de musgos por distintos microorganismos y las referencias que ofrecen sobre distintos especimenes muscicolas de herbario, que no necesitan de un tratamiento previo de conservación, tal y como se realiza con el resto de vegetales. No es hasta 5 años más tarde, cuando Hartwell (1971) refiere de nuevo las propiedades antitumorales de distintas especies del género Polytrichum Hedw., entre ellas P. commune Hedw., y otras indeterminadas. En el mismo año, Gupta & Singh (1971), demuestran la actividad antibacteriana de dos especies de musgos de los géneros Barbula Hedw.. y Timmiella (De Not.) Limpr., frente a 33 especies de bacterias. Posteriormente, Banerjee (1974) y Banerjee & Sen (1979), estudian la actividad antibiótica de 52 especies de briófitos, frente a 12 microorganimos (bacterias y hongos), poniendo de manifiesto una inhibición positiva de un 56% (29 especies) de las especies estudiadas frente a bacterias y una nula actividad antifungica, citando así mismo la mayor ocurrencia de substancias antibióticas en hepáticas que en musgos y antocerotas. El hecho de utilizar disolventes puros en el proceso de extracción (acetona, metanol y etanol al 100%), sin ese 10-20% necesario de agua hace que la extracción de biflavonoides con dicha metodología sea muy difícil (Geiger, 1990), lo que podría explicar que algunas de las especies de musgos estudiadas por tales autores, que poseen biflavonoides, hayan dado un resultado de actividad antimicrobiana negativo, caso de las especies del género 46 Campylopus Brid., y B¡yum Hedw. (Anexo 1). Entre los musgos que ofrecen resultado positivo en el ensayo antimicrobiano de Banerjee (1974) y Banerjee & Sen (1979), destacamos Campylopus laetus (Mitt.) Jaeg., Philonotis falcata (HK.) Mitt. (especie de la familia Bartramiaceae efectiva contra Bacillus su/Milis), Hypnum plumaeforme Wils., Rhodobryum giganteum (Schwaegr.) Par., y Mnium Ion girostrum Brid., por tratarse de especies cuya composición flavonoidica es desconocida pero sí se conoce la existencia de biflavonoides en otras especies de los géneros respectivos. Posteriormente, Van Hoof & col. (1981), realizan un estudio más profundo de actividad antimicrobiana, entre las que incluyen por primera vez la actividad antivirica. Entre las 20 especies de briófitos que estudian, queremos destacar, dentro de aquellas en las que se conoce el contenido flavonoidico, precisamente Brachythecium rutabulum (Hedw.) B.S.G., y Mnium hornum Hedw., que poseen una escasa o nula actividad antibacteriana, antifúngica e incluso antivírica, siendo además dos especies caracterizadas por no contener flavonoides (Wyatt & col., 1991b; Sievers, 1992; Vandekerkhove, 1980). En el poío opuesto, encontramos Dicranum scoparium Hedw., e Hypnum cupresszforme Hedw.. especies que demuestran un gran poder de inhibición de la actividad microbiana, conociéndose en ambas la presencia de biflavonoides (Osterdahí, 1979a y 1983; Ron & col., 1990; Lindberg & col., 1974; Sievers, 1992; Sievers & col., 1992). Por el tipo de extracción que realizan Van Hoof & col. (1981) de los compuestos briofiticos, con etanol 80%, mucho nos tememos que la actividad antimicrobiana de éstas dos últimas especies se deba precisamente a su contenido flavonoidico, ya que tal metodología de extracción es la que habitualmente se usa para biflavonoides (Geiger, 1990). Castaldo-Cobianchi & col. (1986 y 1988), llevan a cabo un estudio sobre la actividad antibiótica de la hepática Conocephalum conicum (L.) Dum., y los musgos Mnium undulatum Hedw., y Amblystegium riparium (Hedw.) Br. Eur. (= Leptodictyum riparium (Hedw.) Warnst.), frente a 8 bacterias patógenas. Sus estudios ponen de manifiesto una importante actividad antibacteriana de los extractos acetónicos obtenidos con el método de McCleary & col. (1960), precisamente en los cuales se supone está contenida la mayor parte de los flavonoides existentes en tales especies. Además, tales autores ofrecen interesantes comentarios acerca del fenómeno de antibiosis que poseen los briófitos (musgos y hepáticas) en relación a ciertos simbiontes o comensales, que con ellos conviven en el suelo, tanto bacterias como hongos. De las dos especies de musgos únicamente se conoce la composición flavonoidicade Ptagioinnium undulatum (=Mnium undulatum), que sintetiza básicamente flavonas O- y C-glicosiladas (¡(oponen & Nilsson, 1977; Osterdahí, 1979a y c; Bendz & col., 1966; Harborne, 1967; Vandekerkhove, 1978a). Ya más recientemente, un equipo americano (Spjut & col., 1986 y 1988), representante del Instituto Nacional contra el Cáncer (N.C.I.), emprende los primeros estudios profundos sobre la posibilidad de utilizar los briófitos (musgos, hepáticas y antocerotas) como antitumorales. En el primero de ellos, (Spjut & col., 1986), realizan ensayos antitumorales con 97 géneros de musgos, 16 de hepáticas y 1 de antocerotas. Setenta y cinco de los extractos obtenidos de especies de los géneros referidos resultaron tóxicos, mientras que 43 fueron activos. Dicha actividad antitumoral, se manifestó principalmente en las familias Dicranaceae Schimp., Grimmiaceae Arnott, Mniaceae Schwaegr., Neckeraceae Schimp., Thuidiaceae Schimp., Brachytheciaceae G. Roth., Hypnaceae Schimp., y 47 Polytrichaceae Schwaegr. Los autores sugieren que los briófitos son una prometedora fuente de productos naturales, ya que en ellos cabe la posibilidad de descubrir e identificar nuevos compuestos con actividad biológica. La posibilidad de que dicha actividad biológica en briófitos pueda ser el resultado de fenómenos alelopáticos, puede deberse a la habilidad de los briófitos para acumular sustancias tóxicas. Finalmente, queremos resaltar la existencia de excelentes recopilaciones al respecto de las propiedades farmacológicas de los distintos compuestos procedentes de briófitos, entre los que se incluyen lípidos y ácidos grasos, flavonoides, terpenoides y ácidos fenólicos (McClure, 1975; McClure & Miller, 1967; Huneck, 1969 y 1983; Asakawa, 1981 y 1990; Asakawa & col., 1978 y 1980b; Wolters, 1964a y b). El principal problema con que se cuenta, es el desconocimiento acerca de qué compuesto es el responsable de tal actividad antimicrobiana, de ahí que toda la recopilación bibliográfica que anteriormente hemos presentado, la hayamos intentado correlacionar con la presencia/ausencia de biflavonoides en las especies de musgos estudiadas. En nuestro trabajo, como ya se ha expuesto con anterioridad, nos hemos centrado en un único tipo de compuestos: los flavonoides, y particularmente los biflavonoides, cuya función en la planta debe ser muy importante aunque no es del todo conocida. En el área biológica los flavonoides poseen una actividad polivalente, ya que entre otras, se conocen sus propiedades antibióticas, antifúngicas e incluso virostáticas (McClure, 1975 y 1986; Ghisalberti, 1979; Konig & Dustman, 1983; Levin, 1971; Van Hoof & col., 1981; Abou-Karam & Thomas Shier, 1992; Mori & col., 1987; Gnanamanickam & Mansfield, 1981; Wood & Jellis, 1984; Selway, 1986; Bertram, 1989; Spilková & Hubik, 1988 y 1992); antifertilidad (Mandich & col., 1984), su capacidad de inhibición del crecimiento larvario y del ataque por insectos y otros animales (Elliger & col., 1980 a y b; Hedin & Waagea, 1986; Kubo & col., 1983; Chan & col., 1978; Denno & McClure, 1983); inhibición enzimática (Shu-Chen & col., 1992; Shimizu & col., 1984; Beretz & col., 1979; Gaudette & Holub, 1990); propiedades antitumorales y anticancerosas (Lee & col., 1981; Bertram, 1989; Constantinou & col., 1990; Bracke & col., 1990; Dani & col., 1990; Deak & col., 1990; Richardson, 1992), antihepatotóxicas (Iwu, 1985) y pueden interferir en el crecimiento de semillas (Rice, 1984). Algunos de ellos son los pigmentos de las plantas, las antocianinas (McClure, 1975 y 1986), dando color a flores, frutos y hojas (Harborne, 1967 y 1986; Czygan, 1980), aunque sin embargo, la mayor parte de las flavonas y flavonoles son incoloros. El elemento común de estos compuestos es un núcleo básico: el 2-fenil cromano (Bruneton, 1991). Así mismo, en los últimos años se está demostrando la utilidad de los flavonoides y otros compuestos fenólicos en la caracterización de diferentes alimentos de origen vegetal, entre ellos los vinos (Etievan & Schilich, 1988; Tomás-Lorente & col., 1989), zumos de frutas (Elkins & col., 1988; Galensa, 1988), etc. Parecen desempeñar igualmente un papel regulador como inhibidores del trasporte de auxinas (Jacobs & Rubery, 1988). Finalmente, los flavonoides son los típicos compuestos fenólicos que, gracias a su estructura química, se comportan como potentes antioxidantes y quelatos de metales (Pincemail & col., 1990; McClure, 1975). Esta actividad está extrechamente relacionada con lo antes expuesto, pues supone unas ventajas ecofisiológicas enormemente trascendentales, evitando la peligrosa actividad oxidante de ciertos metales (Swain, 1986). 48 Por el mismo motivo, los flavonoides, apoyados en esa estructura química de enlaces conjugados y anillos aromáticos (ver Fig.3.6 Pp. 21), debieron suponer la primera barrera que los briófitos presentaron a la destructiva luz ultravioleta en su conquista del medio terrestre, puesto que Geiger (1990) ya señala que algunos flavonoides pueden ligarse fuertemente a las paredes celulares de briófitos. El mejor ejemplo lo tenemos en el musgo Bryum argenteum Hedw., especie cosmopolita que vive incluso en la Antártida, cuyo contenido en flavonoides se incrementa considerablemente cuando el agujero en la capa de ozono polar, que entre otras funciones sirve de pantalla contra las radiacciones ultravioletas, se agranda (Hedenás, 1991). Incluso, diversas modificaciones bioquímicas sufridas por los compuestos de los musgos, pudieron jugar un papel fundamental en su evolución y sobre todo, en la defensa contra distintos organismos (Swain, 1986). La estructura molecular, las pautas de hidroxilación, glicosilación, metilación, etc., parecen jugar un papel fundamental en la actividad biológica de muchos flavonoides, ya que existe una relación muy extrecha entre la estructura molecular y su actividad (Cody & col., 1986; Elliger & col., 1980; Hedin & Waagea, 1986; Albert, 1971; Spilkova & Hubik, 1992). Finalmente, únicamente hemos pretendido hacer una recopilación lo más exhaustiva posible de las distintas actividades biológicas que poseen los flavonoides, sin extendernos demasiado pues sería materia para otro trabajo, por su dimensión y variedad, y porque el objetivo de nuestro estudio se centrará primordialmente en la actividad biológica de los biflavonoides de los musgos estudiados en esta Memoria Doctoral. Además, existen excelentes recopilaciones al respecto (Cody & col., 1986 y 1988; Chopra & Bhatla, 1990; Das, 1990; Harborne, 1967, 1986, 1988a y b, 1993; Harborne & Mabry, 1982; Harborne & col., 1975; Swain, 1977a; McClure, 1975). De todas ellas debemos destacar las de Spilkova & Hubik (1988 y 1992), quienes hacen un repaso exhaustivo a las diversas actividades biológicas de los flavonoides, entre las que recogen: antimicrobianos, espasmolíticos, antivirales, función hepatoprotectiva, analgésicos, antialergénicos, antiulcerosos, antitumorales, etc. Sin lugar a dudas los biflavonoides, objeto principal de nuestro trabajo, son uno de los grupos de productos naturales más interesantes (Foo & col., 1992), tanto desde el punto de vista químico como del de sus propiedades farmacológicas, antiinflamatorias, antihepatotóxicas y antimicrobianas (Beretz & col., 1986, Shimizu & col., 1984; Iwu, 1985 y 1986; Chakravarthy & col., 1981), incluyendo las antihistamínicas. Juegan igualmente un papel defensivo en la predacción de las plantas por hongos e insectos (¡(ubo & col., 1983; Lowry & col., 1983; Swain, 1975; Krolicki & LamerZarawska, 1984; Geiger & Quinn, 1988; Ron & col., 1992). 49 3.3.1. Síndrome de Imnunodeficiencia Adquirida. A continuación, puesto que los ensayos de Actividad Biológica de la presente Memoria Doctoral se llevaron a cabo sobre cultivos celulares infectados con VIH (Virus de la Imnunodeficiencia Humana), creemos conveniente dedicar un capítulo a resumir algunos aspectos tales como el descubrimiento de la enfermedad y el estado actual en que se encuentra. A. Antecedentes En junio del año 1981, y tras uno de los múltiples exámenes rutinarios a que se somete la documentación procedente de todos los estados americanos que llegan a la institución, los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) de Atlanta (Georgia, Estados Unidos), dieron a la luz un informe sobre un extraño tipo de neumonía que se había diagnosticado a lo largo de los ocho meses anteriores. El informe señalaba así mismo, que la afección se había diagnosticado en tres hospitales de Los Angeles en cinco varones jóvenes, de raza blanca, sin ningún otro tipo de patología y que tenían en común su condición de homosexuales. La infección en un principio se creyó causada por el protozoo Pneumocystis carinii, rarísimo en patología humana, donde sólo se advierte como responsable oportunista de infecciones en enfermos con una merma “brutal” de sus defensas. Casi al mismo tiempo, tanto en California como en Nueva York, se detectó un crecimiento anormal en la declaración de los casos diagnosticados como sarcoma de Kaposi, un tumor maligno de los capilares de desarrollo lento y propio de varones mayores de sesenta años. Los pacientes eran también homosexuales y con una evolución letal muy rápida (1 ó 2 años), y muchos de ellos padecían al mismo tiempo una neumonía concomitante por P. carinhi. Todos estos hechos, que parecían albergar un paralelismo desmesurado, pusieron en alerta a los epidemiólogos, acerca de un proceso que presentaban numerosos elementos extraños. En el verano de 1982, se pudo finalmente definir la aparición de un síndrome caracterizado por la existencia de enfermedades habitualmente consideradas oportunistas en pacientes con una baja respuesta inmunitaria. Se le dió el nombre de Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SiDA), con un conjunto de cuadros clínicos caracterizados por una alteración subyacente de la inmunidad celular, y que se manifestaban esencialmente bajo la forma del sarcoma Kaposi e infecciones graves por gérmenes oportunistas en personas jóvenes previamente sanas (BES., 1989). Junto ala neumonía por P. carinnii, se advirtió la frecuente aparición de diarreas producidas por Cryptosporidium muris o Isospora be/Ii, meningitis por Cryptococus neoformans y encefalitis por Toxoplasma gondil, procesos todos ellos infrecuentes. Lo impreciso de su denominación, evidenció en su vaguedad la confusión inicial de los médicos ante un proceso desconocido. Se abandonaron así algunos de los nombres que la enfermedad tuvo en un primer momento como gay cancer o GRID (Gay-Related Immune Deficiency). Los primeros casos de SIDA fueron descritos en homosexuales por Michael Gottlieb en Los Angeles y a partir de ese momento, el número de casos se ha multiplicado y la enfermedad, que inicialmente parecía centrada en determinados núcleos urbanos de los Estados Unidos, se ha hecho presente en Europa y el resto de los continentes. La repercusión social en los paises más afectados 50 es importante y el temor ante este síndrome, en ocasiones por falta de una adecuada información, ha llevado a ciertas formas de rechazo social de determinadas personas, por características tan diversas como la nacionalidad (haitianos) o sus prácticas sexuales (homosexualidad). La etiología de la enfermedad ha suscitado muchas teorías, orientándose en los primeros momentos a la búsqueda de factores causales entre los rasgos característicos del tipo de vida de los homosexuales, en los que se describieron los primeros casos. Así se valoraron entre otras posibles causas, la importancia de drogas como el nitrito de amilo, de las infecciones de repetición o el estímulo antigénico del propio semen (BES., 1989). Pero ya desde el inicio, la enfermedad no apareció asociada a los homosexuales en general, sino a un subgrupo de esta colectividad con activa vida sexual, de manera que uno de los primeros estudios “caso-control” entre homosexuales sanos y afectos de SIDA, se evidenciaba una mayor frecuencia de ciertas infecciones en los homosexuales enfermos que en los controles (sífilis, enterovirus, citomegalovirus y Epstein-Barr), así como un mayor número y variabilidad de compañeros sexuales. Al ampliarse el espectro de grupos de riesgo con la aparición de casos entre haitianos, drogadictos y hemofílicos, y conocerse algo más de los mecanismos de transmisión, pasó a considerarse con más interés la posibilidad de un agente transmisible, probablemente un virus (BES., 1983; Carreras, 1991). Uno de los primeros gérmenes objeto de atención fue el citomegalovirus (CMV), que ya antes de la aparición del SIDA había sido incriminado como posible agente causal del sarcoma de Kaposi (cáncer frecuente en el curso del SIDA, que afecta aproximadamente al 35% de los pacientes enfermos de SIDA y que se caracteriza por la presencia de placas o nódulos cutáneos de color azul o pardo, que se encuentran no sólo en la piel sino también en los ganglios, pulmones y en casi todas las vísceras). Estudios seroepidemiológicos previos habían puesto de manifiesto una asociación de este virus con el sarcoma, habiéndose encontrado anticuerpos en pacientes europeos y americanos estudiados en los años setenta. En personas afectadas por el SIDA que a su vez presentaban el sarcoma de Kaposi, se evidenció también un alto volúmen de anticuerpos para CMV. Hasta el momento, la infección por el CMV parece ser endémica en la población homosexual y su transmisión se hace a través del semen y de la orina, por lo cual no parecía ser el agente causal directamente implicado en el SIDA, aunque ésto no significa que la asociación del CMV con la enfermedad sea causal. Junto a los citomegalovirus, el virus de Epsein-Barr y el de la hepatitis B, fueron otros dos de los iniciales candidatos a los que se supuso responsables de la afección, pero muy pronto hubo de deshecharse esta atribución por las características absolutamente novedosas de la enfermedad (Carreras, 1991). Datos posteriores, demostraron que los pacientes con SIDA estaban infectados además por el virus de la leucemia linfocitaria T humana (HTLV) (BES., 1983). Este retrovirus se aisló de los linfocitos y de la sangre periférica de personas que presentaban el síndrome. También por hibridación se detectó la presencia de secuencias del ácido nucleico de HTLV en linfocitos de 2 de los 33 pacientes con SIDA que se estudiaron (C.D.C., 1983), y por inmunofluorescencia indirecta se demostró la existencia de anticuerpos contra antígenos de superficie de linfocitos infectados por HTLV en 19 de los 75 enfermos con SIDA (25%). En sujetos que presentaban una linfoadenopatía o aumento 51 considerable de tumores en los ganglios linfáticos (considerada posible precursora de SIDA) también se encontraron anticuerpos análogos en 6 de 23 casos. Incluso investigadores del National Cancer Institute de los Estados Unidos (Profesor Robert Gallo y su equipo) llegaron a aislar en mayo de 1984 el retrovirus HTLV-III en pacientes con SIDA. El primer retrovirus del tipo HTLV (Human T Ceil Leukemia Virus) que fue identificado fue el HTLV-I, por el Dr. Rober Gallo en 1980. Dicho retrovirus HTLV-I era causante de la leucemia aguda de las células T (linfocitos con intensa actividad inmunitaria al producir sustancias que facilitan la acción de los macrófagos) y estaba difundido regularmente por Africa, el Caribe y Japón. En 1982 se hallaba otro retrovirus patógeno en el hombre, el HTVL-II, productor de la leucemia de células pilosas y que se transmitía por la sangre, el contacto sexual y de la madre al hijo (Carreras, 1991). La conjunción de varias circunstancias indujo a suponer que un retrovirus debía ser el agente productor del SIDA. Era indudable que se trataba de una enfermedad transmisible que podía adquirirse por contacto sexual, transmisión materna y trasfusión de sangre y hemoderivados. Además, se advertía en los enfermos una afectación muy selectiva de linfocitos T colaboradores como en las infecciones por HTLV-I y HTLV-II. El aislamiento antes comentado del HTLV-III en 1983, vino a confirmas tales sospechas. A pesar de que la asociación del HTLV con el SIDA ha sido puesta pues de manifiesto, como en el caso del CMV no pareció tratarse del agente causal directo y concreto. Las diferentes manifestaciones clínicas de la leucemia de células T y del SIDA, así como la gran diferencia existente entre la incidencia de ambas, por ejemplo en Japón, donde la primera tiene una incidencia altísima y el SIDA no se conocía todavía en 1983, serían datos que se opondrían a una etiología común de ambas enfermedades. Con los datos que se poseían no podía en modo alguno considerarse al HTLV como agente causal de la enfermedad del SIDA, aunque cabria la posibilidad de que el virus actuara como un germen oportunista en personas con la inmunidad celular previamente disminuida. Todos los datos conocidos hasta ese momento, en cierta forma resumidos, tendían a poner de manifiesto que el SIDA tenía un agente causal probablemente vírico, que tenía las mismas vías de transmisión que la hepatitis B, siendo las más probables la sexual o más raramente la parenteral, a través de jeringuillas o sangre contaminada. No existían evidencias de transmisión por contactos ocasionales entre las personas, ni a través del los alimentos, aire u objetos. Sin embargo, el descubrimiento definitivo del virus del SIDA vino amparado por una expectación paralela, debida a la patente de su descubrimiento. El posible retrovirus no reaccionaba frente a los reactivos específicos HTLV-I y HTLV-II. La inmediata constatación de que tampoco crecía en los linfocitos T4 a los que destruía o cuyo crecimiento impedía, así como las imágenes obtenidas a través del microscopio electrónico, diferentes a las conocidas del HTLV-I, llevaron a los investigadores franceses del Intituto Pasteur en Francia, Luc Montagnier y su equipo, a identificar en mayo de 1983, el virus como LAV (LymphadenopathyAssociated Virus), virus ligado al síndrome linfadenopático, en una proporción muy elevada de pacientes con SIDA, que no pertenecía a la serie de retrovirus humanos sobre los que el Dr. Gallo y su equipo venían trabajando (HTLV). En mayo de 1984, el Dr. Gallo y su equipo presentaban al HTLV-III en la revista Science como el responsable del SIDA, y que parecía coincidir plenamente con el virus LAV aislado por el Dr. Montagnier, así como con el denominado ARV (AIDS Related Virus) aislado por el Dr. Levy y 52 sus colaboradores en 1984. Todas estas coincidencias no hicieron sino someter a la investigación sobre el agente causal del SIDA en un mundo de confusiones sobre la patente del descubrimiento. En 1986, el Comité de Taxonomía de Virus propuso la denominación 111V (Human Inmunodeficiency Virus) o VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana), frente a las ya conocidas HTLV-III, LAV o ARV, y que aceptada por la Organización Mundial de la Salud (O.M.S.) fue impuesta. 8. El Virus de la Imnunodeficiencia Humana 8.1. Patogenia. El SIDA es una enfermedad causada por la destrucción del sistema inmunitario un virus llamado VIH inicialmente denominado LAV, ARV o HTLV-III. Se trata enfermedad adquirida debida al virus y no hereditaria. Este virus se encuentra en las sexuales (semen, flujo vaginal), saliva, lágrimas y en la sangre (linfocitos especialmente, por causa de pues de una secrecciones pero también en el suero). Se trata de un virus lábil a la temperatura (se inactiva a 560 C en 30 minutos) y a diversos antisépticos corrientes (hipoclorito, fenol, glutaraldehído agua oxigenada, etc.). Hoy en día los dos sistemas de transmisión predominantes son las relaciones sexuales, tanto heterosexuales como homosexuales, y el uso compartido de agujas y jeringuillas contaminadas. El sistema inmunitario humano actúa ejerciendo su acción por todo el organismo, gracias especialmente a un tipo de glóbulos blancos de la sangre, los linfocitos, producidos por los órganos linfáticos. Existen básicamente dos tipos de linfocitos, los linfocitos T que atacan directamente al agente invasor y, los linfocitos B que son los encargados de procucir unas sustancias denominadas anticuerpos para combatir al patógeno. Estos anticuerpos son específicos de cada microbio y su presencia en el organismo indica que éste ha estado en contacto con el microbio en cuestión. En la actualidad éste es uno de los métodos actuales de detección del SIDA en el hombre, previa detección de los anticuerpos respectivos mediante la prueba serológica del SIDA. Un tipo especial de linfocitos T, los llamados linfocitos T4 son los encargados de “reconocer” al organismo o microbio invasor, y dar lugar a la señal de alerta al resto de linfocitos T y B que actuarán en defensa del organismo. El virus del SIDA tiene la particularidad de poder destruir progresivamente el sistema inmunitario humano, ya que ataca directamente al “centro de control o mando” de éste, es decir, destruye directamente a los linfocitos T, incluso antes de que dichas defensas hayan podido organizarse para combatirlo. Tras ser destruido el sistema inmunitario, los signos y síntomas del SIDA aparecen, y el organismo enfermo está desde ese momento expuesto a numerosas infecciones por otros gérmenes oportunistas, que en condiciones normales no serían capaces de vencer al sistema inmunitario. Como los demás virus, el VIH no puede sobrevivir de forma independiente, ya que únicamente puede vivir en el interior de una célula. Para poder infectar a unas células como los linfocitos T4, el virus del SIDA (VIH) debe insertar su código genético compuesto de ARN en el código genético de los linfocitos T4 formado por ADN básicamente. Estos dos “programas”, ARN y ADN no son compatibles, y por eso el virus debe transformar previamente su código genético ARN 53 en un código ADN, lo cual realiza gracias a una enzima particular que posee, la transcriptasa inversa. Cuando el VIH ha implantado su código genético en el de los linfocitos T4, se multiplica a expensas de éstos y, finalmente, los destruye. De esta manera, el sistema inmunitario de va debilitando progresivamente. El virus primeramente se adhiere y luego penetra en la célula linfocitaria, gracias a la transcriptasa inversa, integrándose en el ADN celular donde puede permanecer latentepara replicarse a medida que el linfocito T4 es estimulado, convirtiéndose éste así en una verdadera “fábrica” de material genético que codifica proteínas víricas que, previa lisis celular, pasan al torrente circulatorio o directamente a otra célula (Verger, 1988). De esta manera, a medida que la infección avanza, va destruyéndose una parte esencia del sistema inmune, los linfocitos 14, que en los estadios finales pueden llegar a desaparecer. El VIH no sólo infecta a los linfocitos T4 sino que también, de forma crónica, lo hace con otra variedad de glóbulos blancos, los macrófagos, así como en células nerviosas o monocitos, pero escasamente o nada en los linfocitos B y en la mayoría de células del organismo. Los macrófagos tienen un papel importante en la inmunidad, ya que son los responsables, en especial, de la fagocitosis. Además, son las primeras células del sistema inmunitario que entran en contacto con el virus y los demás elementos invasores. Con la disminución de los linfocitos 14 disminuye también la producción de interleucina-2 y otros mediadores, en consecuencia la actividad de las células 18 y la función normal de las células NK (natural killer), la de los linfocitos B y la de los monocitos se ve alterada. Las células NK tienen una función antivírica y antitumoral específica (Verger, 1988). La alteración de los linfocitos B se manifiesta por su incapacidad de producir anticuerpos adecuados a los estímulos antigénicos, produciendo un exceso de inmunoglobulinas de forma totalmente anárquica, que las células 18 no pueden frenar. Por último, el papel que juegan los factores genéticos en la adquisición y progresión de la infección, sólo empieza a conocerse parcialmente y no siempre son interpretados de manera similar. B.2. Etiología y Estructura. El primer virus del SIDA aislado, conocido como Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH-1 o tipo 1) es una partícula extremadamente pequeña (1/10000 mm). Se trata de un virus ARN de configuración icosaédrica, constituido por una cápsula de proteínas (envoltura externa) que rodea la molécula de ARN portadora del código genético del virus. El conjunto de este núcleo está envuelto por una cubierta compuesta de proteínas y lípidos (Fig. 3.11). Pertenece a la familia Retroviridae, caracterizada por poseer una enzima característica, la transcriptasa inversa (Verger, 1988). La escuela francesa (Montagnier & col.), defiende la tesis de que los retrovirus pertenecen a la subfamilia Lentiviridae, que actúan en algunos animales como virus lentos en el Sistema Nervioso Central, contra la defendida por los norteamericanos (Gallo & col.), que defienden su pertenencia a los HTLV que actúan más bien como oncogénicos. Las proteínas de la cubierta son importantes, ya que permiten la adhesión del virus a los linfocitos 14 y su penetración en las células. Algunas partes de las proteínas de la cubierta inducen una fuerte respuesta inmune, por lo que son indispensables para la elaboración de una vacuna (Montagnier, 1993). Hay, sobre todo, un bucle (ver Fig. 3.11.) expuesto en la superficie de estas 54 G PAlo ¿3FAA ene va no Fig. 3.11.: Representación esquematica de la estructura molecular del VTH. proteínas, que induce anticuerpos capaces de neutralizar especialmente la infecciosidad del virus. Se ha logrado cultivar el VIH en cultivo celular y se obtiene en suficiente cantidad para fabricar antígenos para las pruebas de laboratorio (ELISA p.c.), pero su cultivo no está al alcanze de los laboratorios clínicos. Posteriormente se aisló un segundo virus en el Instituto Pasteur y en el Hospital Claude Bernard (Paris) a partir de un foco de SIDA existente en el oeste de Africa, y que fue denominado VIH-2 (Montagnier, 1993). El VIH-2 es un virus de la misma familia que el VIH-1 pero con algunas diferencias, sobre todo en las proteínas de la cubierta. El VIH-2 no siempre se detecta con las pruebas serológicas utilizadas para el VIH-1. Hoy en día se dispone de pruebas específicas para el VIH-2 y se utilizan como tales en la práctica. VIH-1 y VIH-2, aunque diferentes en algunos elementos de su estructura, producen, sin embargo, la misma enfermedad: el SIDA. El VIH-2 es, no obstante, menos virulento que el VIH-1. El VIH-1 es el virus más importante que se conoce en lo que concierne al SIDA. Su código genético está demasiado alejado del de VJH-2 para sostener que éste pueda derivar de aquél por simple mutación (Montagnier, 1993). Sin embargo, es posible que provenga de un virus existente en el chimpancé, denominado STLV (Simian T-CelI Leukemia Virus), causante de la leucemia de las células T. El VIH-1 según esta teoría habría existido desde hace mucho tiempo en algunas poblaciones humanas aisladas que lo toleraban medianamente bien. El VIH-2 es un pariente relativamente próximo al virus de los monos africanos (mono verde, mono mangabey). La hipótesis más probable que se maneja respecto a su origen, sería el paso, más o menos antigúo, de este virus entre el mono (especie receptáculo que lo toleraría relativamente bien) y el hombre (nuevo huésped del virus no preparado para recibirlo). Sin duda, este virus, al igual que el VIH-1, causa el SIDA en el hombre, aunque su transmisión es más difícil, y una vez transmitido, causa la enfermedad con menor frecuencia y rapidez que el VIH-1. Las distintas cenas del VH-1 hasta ahora descritas en diferentes ateas geográficas, no difieren fundar.t ntaimente e:: :;u composícion genética, excepto en el gen que codifica la envoltura, lo cual 55 puede suponer una dificultad para encontrar una vacuna efectiva. A parte del VIH-1 y el VIH-2 (tipo 2 o LAV-2) se ha descrito recientemente el HTLV-IV en prostitutas asintomáticas del Africa del Este. C. Estado actual de la enfermedad. El número de casos de SIDA declarados a la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el mundo, hasta diciembre de 1992 es de 625.241 (Montagnier, 1993). El ritmo actual es de aproximadamente unos 10.000 casos nuevos declarados al mes, por lo que se estima que el número real se acerca a a los 2.500.000 afectados. Las personas que han sido infectadas por el VIH no desarrollan necesariamente el SIDA. La OMS estima que en el espacio de 10 años el 60% de las personas seropositivas evolucionan hacia el SIDA, el 20% presentan manifestaciones menores de la enfermedad, y el 20% restante permanecen indemnes a toda sintomatología. Aunque el número de seropositivos es diftcil de precisar, y más, cuando aún hoy, muchos casos no se declaran, se puede afirmar que alrededor de 14 millones de personas están ya infectadas por el virus del SIDA (seropositivos) en el mundo. Las 3/4 partes están en Africa. En muchos paises en vías de desarrollo la epidemia, desgraciadamente, se halla sólo en sus inicios. Si no se encuentra rápidamente un tratamiento eficaz, se producirá, inexorablemente, un aumento de casos de SIDA y de muertes producidas por esta enfermedad. La OMS prevé un crecimiento importante de la epidemia en los años 90, y estima el número de casos de SIDA en 13-18 millones para finales de siglo. El número de personas seropositivas se acercará entonces a los 30-40 millones (Montagnier, 1993). La gran mayoría de los nuevos casos se registrarán en los paises en vías de desarrollo. D. Posibilidades de Tratamiento. La evolución de la enfermedad conocida como SIDA sigue siendo considerada en la actualidad como muy grave, ya que por el momento, no se dispone de un tratamiento curativo válido al 100%. No obstante, si es cierto que se poseen en la actualidad medios que permiten tratar algunas de las manifestaciones relacionadas con el SIDA, y mejorar la calidad de vida de los enfermos, así como su supervivencia. Por eso, es sumamente importante que los seropositivos reciban una asistencia médica precoz. y ésta sólo es posible en la medida en que las personas afectadas conozcan su estado, lo cual es el principal argumento a favor de la prueba de detección voluntaria. El SIDA, a pesar de todo, es una enfermedad reciente, y por ello es difícil sino imposible, precisar por el momento cuál será su evolución más allá de los diez años. Aunque sí queda claro que un número de seropositivos en buen estado de salud después de 10 años de evolución, desgraciadamente desarrollarán la enfermedad más adelante (sino se dispone entonces de tratamiento), es cierto que el tiempo máximo del periodo de incubación en aún desconocido. Existen una serie de factores, tales como la predisposición personal o las infecciones recurrentes que activan el sistema 56 inmunitario, que en cierta manera pueden ayudar a retrasar la manifestación del SIDA impidiendo su evolución. Desde los primeros signos de flaqueza del sistema inmunitario (menos de 200 linfocitos T4, p.e.) es posible administrar un tratamiento preventivo destinado a evitar la aparición de infecciones como la pneumocistosis (aerosol de pentamidina, cotrimoxazol, Dapsona...), la toxoplasmosis (pirimetamina, Dapsona...), incluso la tuberculosis. La mayor parte de las infecciones pulmonares, cerebrales y cardiacas asociadas al SIDA pueden igualmente tratarse de forma eficaz por medio de antibióticos, antimicósicos, antiparasitarios y antiviricos. Estos tratamientos permiten hoy controlar muy a menudo los episodios de infecciones oportunistas. El tratamiento del sarcoma de Kaposi puede mejorarse mediante ciertas quimioterapias solas (Daunorrubicina liposomal) o asociadas al Interferón o al GM CSF (dos factores que actúan sobre la multiplicación celular). Entre los productos contra el virus eficaces en el laboratorio, el AZT (Azidotimidina o Retrovir) es el que tiene hoy un uso más extendido junto al ddl (Montagnier, 1993). Otros productos están en curso de evaluación (ddC, TIBO, Antiproteasas). Mediante distintos mecanismos, todos estos medicamentos bloquean la multiplicación del virus en el organismo. Sin embargo, ninguna de estas terapias permite una erradicación completa y definitiva del virus. No obstante, la investigación va por buen camino y las esperanzas están abiertas al futuro. Nuestra investigación, y en particular los ensayos realizados con los flavonoides aislados e identificados en musgos van encaminados a aumentar éstas. Es posible que las asociaciones entre estos diferentes medicamentos (AZT + ddl, AZT + ddC + Interferón ...) sean más eficaces que la utilización individual de cada uno de estos productos. De hecho, así ha quedado puesto de manifiesto en el reciente Congreso sobre el virus de la inmunodeficiencia humana celebrado en Tokio (Japón) en el presente año de 1994. Respecto al tratamiento de la enfermedad en el estadio precoz de la infección por el virus del SIDA, sólo el AZT ha demostrado hasta hoy cierta eficacia (Montagnier, 1993). La profilaxis, de momento, es el único medio eficaz de lucha contra la propagación del SIDA. Sobre todo, los esfuerzos han de ir mayoritariamente dirigidos a evitar el contagio. 57 \\~rAL’~ ‘~ ho rx~rtt JLVitL\I w att [KL4>7 IP![LW [tAWQJtú 4.11. Material Biológico De la mayor parte del material biológico utilizado en este trabajo se depositó un pliego testigo en los herbarios de la Facultad de Biología de la Universidad Complutense de Madrid (MACB) y del Departamento de Botánica de la Universidad de Saarlandes, Saarbrticken, Alemania (SAAR). Las autorías correspondientes proceden de Engler (1924) salvo aquellas modificaciones propuestas por Griffin III & Buck (1989), Corley & col. (1981) y Corley & Crundwell (1991). La relación de las muestras poblacionales utilizadas es la que figura a continuación: Anacolia intertexta (Schhnp.) Jaeg. BOLIVIA: Dep. Cochamba, prov. Ayopaya, Tarucani, alt. 4440 m, Shady cliffs, Leg.: Marko Lewis 79-2436 A. Anacolla laevisphaera (Tayl.) Hower COLOMBIA: Dep. de Cundinamarca, ferme de Sasaima, alt. 1500 m, Leg.: M. Onraedt 5944. FRANCIA: La Reunión, Cirque de Mafate, sol volcanique, alt. 1600 m, Leg.: M. Onraedt 9082. Anacolia laevisphaera (Tayl.) Hower (= Bartramia rosea Herzog) ECUADOR: near Quito, on páramo, 3000 m, Leg.: Marko Lewis. Anatolia menziesil (mm.) Paris ESTADOS UNIDOS: California, Mendocino Co, about 5 miles W of Calpella, on cliff face, Leg.: Schofield & Thomas 28970. Anatolia subsessilis (TayI.) Broth. COLOMBIA: Dep. de Cundinamarca, ferme de Sasaima, alt. 1500 m, Leg.: M. Onraedt. Anacolia webbii (Mont.) Schimp. ESPAÑA: CANARIAS: Tenerife, Aguamansa, La Caldera, 6-VIII-1989, Leg.: Siegel, Det.: R. Miles; Tenerife, Monte de la Esperanza, IX-1971, Leg. & Det.: Acuña. ESPAÑA: SEVILLA: Pruna, 26-V-1972, Leg. & Det.: Silvestre. Bartramia afro-ithyphylla Broth. RUANDA: Pref. de Ruhengeri, Mt. Karisimbi, Hagenia-Hypericum forest (with moss balís on branches) in the saddle between Mt. Visoke and Mt. Karisimbi, 3000-3300 m. alt., on rock, 13-IX-1991, Leg.: T. Pócs, Det.: J.P. Frahm. 58 Rartramia angustifolia Mitt. COLOMBIA: Meta, Páramo de Himapaz, Cerro Nevado, alt. 4050 m, Leg.: Antoine M. Cleef 805. VENEZUELA: Estado Mérida, 19-11-1985, Leg. & Det.: D. Griffin III. Bartramia halleriana Hedw. BELGICA: Vallée du Bayelon, sur schistes humides, Leg.: M. Onraedt 11846 ESPAÑA: CANTABRIA: Sierra de la Corta, 214-1992, Leg.: JA. López-Sáez & P.Peón, Det.: J.A. López-Sáez. FRANCIA: Alpes, Gorges de la Diosaz (Chamonix), Leg.: M. Onraedt 11852. SUIZA: Canton des Grissons, Le Prese, sur rochers en pessiére, alt. 1400 m, Leg.: M. Onraedt 8441. Bartramia ithyphylla Brid. ESPAÑA: LERIDA: Lago Ratera, en pinar de Pinus uncinata, en el P.N. de Aigiles Tortes i Lago 5. Mauricio, 2-XI-1991, Leg. eL DeL.: JA. López Sáez. ESPAÑA: MADRID: Puerto de Canencia, en pinar de pino silvestre, 10411-1988, Leg. et Det.: ME. Ron. ITALIA: Val d’ Aosta, Val Veny, rochers ombragés, alt. 1500 m, Leg.: M. Onraedt 14428. NORUEGA: Geiranger, rcher, en fóret de Bouleaux, Leg.: M. Onraedt 12110. Bartramia longifolia Hook. BOLIVIA: Dep. La Paz, prov. Lare-Caja, Nevado Jankho Voma, alt. 4180 m, Boulders piles, Leg.: Marko Lewis 79-1459. Bartramia mathewsii Mitt. COLOMBIA: Cundinamarca, Páramo de Palacio, musgo epilitico, alt. 3800 m, Leg.: Antonie M. Cleef 4033. Bartramia mossmanniana C. Mml. PERU: Apurimac, Pass Socchacasa, alt. 3000 m, Leg.: E. Hegewald. Bartramia papillata Hook. f. & Wils. NUEVA ZELANDA: South Island, Southland, Milford Sound Road near Holly Ford Valley turn off. Bartramia patens Brid. PERU: Huancavelica, Ichoquenus, 4150 m, Leg.: E. Hegewald. Bartramia polytrichoides C. MDII. BOLIVIA: stones along cascade in wooded humid ravine, alt. 3250 m, Depto. La Paz, NNW of Chuma, Leg.: Marko Lewis 79-1047. 59 Bartramia pomiformis Hedw. BELGICA: Malonne, Vallée du Landoir, psammite famennier, alt. 100 m, Leg.: M. Onraedt 11753. ESPAÑA: AVILA: Mijares, borde de la garganta, en granito, 4-1-1992, Leg.: J.A. López Sáez & P. Peón. Det.: JA. López Sáez; Hoyocasero, monte 43 “Pinar de Hoyocasero”, en pinar de pino silvestre, 1280 m, 14-XII-1991, Leg. et Det.: JA. López Sáez; Guisando, Nogal del Barranco, en encinar supramediterráneo, 23-11-1991, Leg. et Det.: JA. López Sáez; carretera de Pedro Bernardo a 5. Esteban del Valle, valle del Tiétar, 1140 m, en granitos, 1-111-1992, Leg.: .l.A. López Sáez & P. Sáez, Det.: JA. López Sáez; Candeleda, Garganta Lóbrega, 770 m, 8-V-1992, Leg. et Det.: JA. López Sáez. ESPAÑA: CACERES: Parque Nacional de Montfragile, cta. de Torrejón el Rubio a Villareal de 5. Carlos, en encinar-alcornocal, 295QE50, 21-XI-1991, Leg. et Det.: J.A. López Sáez; Cta. de Villarreal de 5. Carlos a La Bazagona, Portilla del Tiétar, 295QE51, 2-11-1991, Leg. et Det.: JA. López Sáez; Guadalupe, 28-VI-1992, Leg.: J.A. López Sáez & M. Tapia, Det.: J.A. López Sáez. ESPAÑA: HUESCA: Valle de Ordesa, en hayedo-abetal, 2-VIII-1991, Leg.: JA. López Sáez & P. Peón, Det.: J.A. López Sáez; Valle de Ordesa en hayedo-abetal, 26-X-1991, Leg. et Det.: J.A.López Sáez. ESPAÑA: MADRID: Montejo de la Sierra, en hayedo (Galio-Fagetum), 30TVL66, 27-1-1991, Leg.: J.A. López Sáez & P.Peón, Det.: J.A. López Sáez; Montejo de la Sierra, robledal, 30TVL64, 27-1-1991, Leg.: JA. López Sáez & P.Peón, Det.: JA. López Sáez; Carretera de Navas del Rey a Pelayos de la Presa junto al Embalse de Picadas, en encinar y pinar de pino piñonero, 18-1-1991, Leg.: JA. López Sáez & M.J. Pérez Alonso, Det.: J.A. López Sáez; Navas del Rey, en encinar, subida al Puerto de la carretera a Pelayos de la Presa, 8-II1992, Leg.: JA. López Sáez & P. Peón, Det.: J.A. López Sáez; Presa de El Villar, Embalse del Atazar, en encinar, 30TVL63, 27-1-1991, Leg. et Det.: JA. López Sáez; Puerto de Canencia, en pinar de pino albar, 1-V-1990, Leg. et Det.: J.A. López Sáez; Puerto de Canencia, en pinar de pino silvestre, 10-XII-1988, Leg. et Det.: ME. Ron; El Escorial, silla de Felipe II, en robledal, 25-11-1990, Leg. et Det.: JA. López Sáez. ESPAÑA: NAVARRA: Orbaiceta, hayedo en la margen izquierda del río Irati, a 7 km del pueblo, 13-X-1990, Leg.: B. Estébanez, Det.: J.A. López Sáez. ESPAÑA: SEGOVIA: El Espinar, estación de FFCC, en pinar de pino albar junto al río Moros, 15V-1990, Leg. et Det.: JA. López Sáez. ESPAÑA: TOLEDO: Navahermosa, fuentes del río Estena, en robledal, 26-IX-1989, Leg.: Ron, Velasco, Llover & Buades, Det.: JA. López Sáez. ITALIA: Val d’ Aosta, Semporcher, alt. 1600 m, Leg.: M. Onraedt 14517. NORUEGA: distr. Nordland, Mo i Rana, rocher en pessiére, alt. 150 m, Leg.: M. Onraedt 11515. Bartramia potosica Mont. BOLIVIA: Dep. Cochabamba, prov. Ayopaya, base of serranias Tarucani, alt. 4500 m, Leg.: Marko Lewis 79-2463 A. COLOMBIA: Cundinamarca, cta. P0 de Palacio a Rio Chuza, alt. 3675 m, Leg.: A.M. Cleef 5429. 60 Bartramia pruinata Herzog BOLIVIA: Prov. Murillo, 572 m slightly NE of Millími, stable cliffs, 4980 m, Leg.. Marko Lewis 79- 1740. Rartramia ntfescens Card. BOLIVIA: stones along cascade in wooded humid ravine, alt. 3250 m, Depto. La Paz, NNW of Chuma, Leg.: Marko Lewis. Bartramia ruwenzoriensis Broth. ZAIRE: Prov. Kivu, Kahuzi-Biega Nat. Park., Mt. Kahuzi, Elfin-forest like Syzygium stand and Erica heath along summit traid, 3140-3200 m. alt., below rock overhang, 3-IX-1991, Leg.: T. Pócs, Det.: J.P. Frahm. Bartramia stricta Brid. ESPANA: CACERES: Parque Nacional de Montfragile, ribera del río Almonte, 7-111-1992, Leg.: JA. López Sáez & M. Tapia Ariza, Det.: JA. López Sáez; Jaraicejo, río Almonte, 305TJ69, 21-XI-1991, Leg. et Det.: JA. López Sáez; Jaraicejo, cruce con el río Almonte, sobre muro de pizarra, en encinar, 305TJ69, 2-11-1991, Leg. et Det.: J.A. López Sáez; P. N. Montfragúe, en la cta. de Torrejón el Rubio a Villareal de 5. Carlos, en alcornocal, 295QE50, 2-11-1991, Leg.: J.A. López Sáez & P. Peón. Det.: JA. López Sáez. ESPAÑA: MADRID: Navas del Rey, en encinar, subida al puerto de la ctra. a Pelayos de la Presa, 8-11-1992, Leg. et Det.: J.A. López Sáez; Cta. de Navas del Rey a Pelayos de la Presa, en encinar junto al embalse de Picadas y pinar de pino piñonero, 18-1-1991, Leg.: JA. López Sáez & M.J. Pérez Alonso, Det.: J.A. López Sáez; Villa del Prado, en el cauce del tamujar, 23-111-1992, Leg. et Det.: J.A. López Sáez. Bartramia vulcanica Brid. FRANCIA: La Réunion, isla (Africa), Maído blocs de basalte, alt. 2180 m, Leg.: M. Onraedt 1822. Breutelia afflnis (Hook.) Mitt. NUEVA ZELANDA: South Island, Southland, Milford Sound Road near Holly Ford Valley turn off, Leg.: M. Onraedt. Breutelia allionii Broth. BOLIVIA: prov. Camacho, NNW of Chuma, cliffs below summit, alt. 4630 m, Leg.: Marko Lewis. Breutelia arundinifolia (Dub.) Fleisch. FILIPINAS: Luzon, Bagnio, Talus de la route, alt. 1550-2350 m en direction du Mont Sto. Tomas, 27-XII-1984, Leg.: M. Onraedt 84.L. 10943. 61 Breutelia austro-arcuo.ta (C. MOil.) Par. BOLIVIA: prov. Murillo, from 1 km upstream from Chaca Pampa, alt. 3650 m, humid area of highest shrubs, Leg.: Marko Lewis 82-466. Breutelia azorica (Mitt-) Card. PORTUGAL: Azores, Sao Miguel, SN 155, 5-VI-1981, Leg. et Det.: G. Schwab. Breutelia boliviensis Herzog BOLIVIA: Camacho, NNW of Chuma, cliffs below summit, alt. 4630 m, Leg.: M. Lewis 79-911. Breutella chrysea (C. MtiII.) Jaeg. PERU: Amazonas, Calla-Calla between Balsan and Leimabamba, 3100 m alt., Leg.: E. Hegewald. Breutelia chrysocoma (Hedwj Lindb. ESCOCIA: Scotish Highland, Lochstach See, Am FeIs, 19-VII-1989, Leg.: Ch. Millíer, Det.: Ch. Millíer & R. Miles. ESPANA: ASTURIAS: Covadonga, V-1970, Leg. & Det.: R.M.Simó. Breutelia deflexifolia Card. PERU: Cuzco, Aguas Calientes by Machu Pichu, on rocks, alt. 2100 m, Leg.: E. Hegewald 8774. Breutelia diffracta Mitt. RUANDA: Pref. de Ruhengeri, Mt. Karisimbi, Alcbemilla johnstonii vegetation interrupted by boulders on the E-slope in the alpine belt, 4350 m alt. on soil, 14-IX-1991, Leg. & Det.: J.P. Frahm. Breutella elongata (Hook. f. & Wilsj Mili. NUEVA ZELANDA: South Island, Southland, Milford Sound Road near Holly Ford Valley turn off, Leg.: M. Onraedt. Breutelia eugeniae Aongstr. ISLA MAURICIO: Le Pouce, roches volcaniques ensoleillés, alt. 550 m, Leg.: M. Onraedt. Breutella humbertii P. Varde & Ther. RUANDA: Pref. de Ruhengeri, Mt. Karisimbi, Alchemilla johnstonii vegetation interrupted by boulders on the E-slope in the alpine belt, 4350 m alt. on soil, 14-IX-1991, Leg. & Det.: ¿LP. Frahm. Breutelia integnfolia (Tayl.) Jaeg. BOLIVIA: prov. Larecaja, Millipaya, boulders in sloping bog., alt. 4050 m, prov. Larecaja, Leg.: Marko Lewis 79-1395. 62 Breutelia lorentzii (C. MilL) Par. BOLIVIA: prov. Larecaja, Canyon just NE of Sorata, alt. 3000 m, exposed bank of trail, Leg.: Marko Lewis 79-1180. Breutelia mniocarpa Scbiinp. BOLIVIA: prov. Carecaja, Nevada Jankho Uma, aboye Mina St. Antonio, alt. 4280 m along glacier fed creek, Leg.: Marko Lewis 79-1483. Breutelia patens Herzog BOLIVIA: prov. Guillacollo, head of río Suturi, alt. 4450 m shady cliff, Leg.: Marko Lewis 79- 2600. Breutelia pendula (Hook.) Mitt. ISLANDIA: North Island, near Lake Waikaremoana, Leg.: G.F. Jarolina, janv. 1948 de 1’ herbier of G.O.K. Sainsbury. Breutelia polygastrica (C. MilL) Brotb. BOLIVIA: prov. Larecaja, Chilcani, alt. 3250 m, pastures, Leg.: Marko Lewis 82-259 A. Breutelia squarrosa Jaeg. VENEZUELA: Estado de Mérida, environs de Aguadá (tiéf), alt. 3452 m, páramos: endroits ombragés, Leg.: M. Onraedt. Breutetia stuhlmannii Broth. RUANDA: parc des Volcans, Bysoke, créte du cratére, alt. 3600 m., Leg.: De Sloover Jean-Louis 13448. ZAIRE: Prov. Kivu, Kahuzi-Biega Nat. Park, Mt. Biega, Erica rugegensis stand covering the main Biega ridge from 2600 m to the summit 2705 m on soil, 28-VIII-1991, Leg. et Det.: J.P. Frahm. Breutelia subarcuata (C. Mill.) Schimp. BOLIVIA: prov. Larecaja, Canyon just NE of Sorata on soil in wooded humid ravine, alt. 3150 m, Leg.: Marko Lewis 79-1 198. Breutelia tomentosa (Brid4 Jaeg. NICARAGUA: Dep. Matagalpa, vicinity of Aranjuez, alt. 1200 m, among grasses on wet clay roastbank, Leg.: Richards Donald 3740. 63 Catoscopium nigritum (Hedw.) Brid. ESPAÑA: HUESCA: Puerto de Benasque, en el suelo del robledal, 4-111-1990, Leg. & Det.: JA. López-Sáez. Conostomum cleistocarpum Herzog BOLIVIA: Dep. La Paz, prov. Murillo slightly NE of Milluni, alt. 4730 m, stony hilís, Leg.: Marko Lewis 79-1637. Conostomum macrotheca Herzog BOLIVIA: Dep. Cochamba, prov. Ayopaya, Tarucani, alt. 4440 m, Shady cliffs, Leg.: Marko Lewis 79-2436 A. Conostomum pentastichum (Brid.) Lindb. PERU: Ayacucho, Pass Tapuna, between Tambo and Ayna, rocks, 3800-4420 m alt., Leg.: E. Hegewald. Conostomwn pusillum Card. & Brotb. PERU: Ayacucho, Pass Tapuna, 2500 m, between Tambo and Ayna, Leg.: E. Hegewald. Conostonwm tetragonum (Hedw.) Lindb. SUECIA: Kassevage, Stugan bei Abisko, Lappland, 23-VIII-1964, Leg. et Det.: E. Sauer. Conostomum tetragonum (Hedw.) Lindb. (= Conostomztm boreale Sw.) NORUEGA: Lac Tyin, sol humide couvert par la neige, alt. 10>78 m, Leg.: M. Onraedt 7123. Letomela bartramioides (Hook.) Par. PERU: Amazonas, between Ingenio and Pomacochas, rocks and trees, Leg.: E. Hegewald. Letomela deciduifolia Herzog PERU: Amazonas, between Ingenio and Pomacochas, 900 m, Leg.: E. Hegewald 1986. Lejomela lopezii Griffin COLOMBIA: Cundinamarca, P0 de Palacio, Lag. de Buitrago, alt. 3680 m., Leg.: A.M. Cleef 6733. Lejomela piligera (Hainpe) Broth. BRASIL: Rio de Janeiro, Serra do Mar, zwischen Parati und Cunha An Zelswánden im Regenwald, alt. 1200 m, Leg.: J.P. Frahm. Philonofis andina (Mitt.) Jaeg. COLOMBIA: Cundinamarca, Páramo de Palacio, Lagunas de Buitrago, alt. 3600 m, Leg.: Antoine M. Cleef & T. van der Hammer 4973. 64 Philonotis amellhi Husn. ALEMANIA: Saarland, Felsen an der Bahn, N der Alten van Heisterberg, 6-11-1986, Leg. et Det.: R. Miles. ESPAÑA: AVILA: Puerto del Pico, 13-X-1984, Leg. & Det.: Ron & Soria. Philonofis australis (Mitt.) Par. ISLA MAURICIO: Le Pouce, roches volcaniques ensoleillés, alt. 550 m, Leg.: M. Onraedt. Philonofis caespitosa Jur. ALEMANIA: Erlenbruuch bei Reimsbach am Wegrand, ¡(reis Merzig, 9-IV-1986, Leg.: R. Miles, Det.: E. Sauer. ESPAÑA: GUADALAJARA: Sierra del Bulejo, 17-111-1986. Leg.: Ayala, Herguido, Mazimpaka & Ron, Det.: Ayala & Ron. Philonofis calcarea (B. & S.) ScbimpAUSTRIA: Kalktuffquelle, Bárental, 1400 m, 26-VII-1980, Leg. et Det.: R. Miles. BELGICA: prov. de Luxembourg, Forges de Buzenol, au bord de 1’ eau, Leg.: M. Onraedt. ESPAÑA: TOLEDO: Castillo de Bayuela, 9-111-1982, Leg. & Det.: E. Fuertes. NORUEGA: Nordland, env. Narvik sol au bord d’ un lac, Leg.: M. Onraedt 11687. ¡‘hilonofis capillaris Lindb. NORUEGA: environs de Srjotli, Mocher suintant, alt. 1200 m, Leg.: M. Onraedt 7647. Philonofis fontana (Hedw.) BiId. ESPAÑA: SEGOVIA: subida al Puerto de la Quesera, hayedo, 19-IV-1992, Leg.: JA. López Sáez & M. Tapia Ariza, Det.: M.E. Ron. ESPANA: TOLEDO: Navahermosa,fuentes del río Estena, 26-IX-1989, Leg.: Ron, Velasco, Jover & Buades, Det.: Ron & JA. López Sáez. FRANCIA: Jura, Col de Rothenbach, rocher calcaire suintant, Leg.: M. Onraedt 11900; Jura, Lac d’ Iley, sol humide, Leg.: M. Onraedt 10573. Phionofis glaucescens (Hornscb.) Brotb. COLOMBIA: Meta, bord du Rio Guayariba, rochers sous couovert forét tropicale, Leg.: M. Onraedt 026. Philonofis hastata (Dub.) Wijk. & Marg. ISLA MAURICIO: Le Pouce, roches volcaniques ensoleillés, alt. 550 m, Leg.: M. Onraedt 191. 65 Philonotis heterophylla Mitt. SRI LANKA: Nuwara tliya, falaise de grés, alt. 1000 m, Leg.: M. Onraedt 9445. Philono fis lancifolia Mitt. SRI LANKA: Nuwara tliya, Lover’s Leaf Talís, alt. 1900 m, sur granit humide, Leg.: M. Onraedt 2858. Philonofis laxissima C. Mill. ISLA MAURICIO: Magenta, rochers baslatiques suintants, alt. 500 m, Leg.: M. Onraedt 461. Philonofis marchica (Hedw.) Brid. BELGICA: prov. de Luxembourg, Carlsbourg, alt. 440 m, riviére á eau limpide et froide, Leg.: M. Onraedt 7650 m. ISLANDIA: W-Island, Snaefellness, Miklholtshreppur, 19-VIII-1987, Leg.: M. Neitzke, Det.: R. Miles. Philonofis revoluta Br. jav. FILIPINAS: Luzón, Bagnio talus de la routa, alt. 1550-2350, Leg.: M. Onraedt 10975. Fhilonofis rígida Brid. ESPAÑA: ASTURIAS: en los alrededores de Cangas de Tineo, 4-11-1991, Leg. & Det.: LA. LópezSáez. Philonofis seabrifolia (Rook. 1’. & Wils.) Braithw. PERU: Pasco, along road from Cerro de Pascoto Lima via Canta, north of Huayllay, km. 224.4, on soil,4160m alt., Leg.: Vitt 21734. Philonofis secunda (Toz. & Molk.) Br. jav. FILIPINAS: Luzon, Ifugas prov. Bontoc, Talns de la route, alt. 1100-1300 m, 2-11-1987, Leg.: M. Onraedt 12148. Philonofis seriata Mitt. FRANCIA: Mont Aigual, 30-VII-1983, Leg.: R. Múes, Det.: E. Sauer. SUIZA: Canton des Srisons, Col de La Bermica, pré marécagluse, alt. 2300 m, Leg.: M. Onraedt 11580. Philonotis sphaerocarpa (Hedw.) Brid. NICARAGUA: Dep. Matagalpa, vicinity of Aranjuez, alt. 1300 m on wet day bank along trail, Leg.: Donald Richards 3791. 66 Philonotis tenuis Mitt. COLOMBIA: Meta, bord du Rio Guayariba, rochers sous couovert forét tropicale, Leg.: M. Onraedt. Philonotis thwaítesii Mitt. SRI LANKA: Nuwara tliya dist Kotmale, sur rocher ensoleillé, alt. 1200-1430 m, Leg.: M. Onraedt 8919; Nuwara tliya talus de granit, alt. 1850 m, 8-111-1976, Leg.: M. Onraedt 3182. Philonofis !jibodensis (Fleiscb.) Brotb. FILIPINAS: Ile Mindoro, environs du Mont Halcon, en forét humide, alt. 750 á 1400 m, 29-11-1988, Leg.: Edw. Salgado 12116. Philonofis tomentella Molí. AUSTRIA: auf Mineralboden im Schmelzwasser, Glockner Massiv, 2200 m, 30-VIII-1985, Leg.: R. Miles, Det.: E. Sauer. NORUEGA: dist. Finnland, a Berlevag, bord de 1’ Ocean glac. arctique, Leg.: M. Onraedt 11670. Philonotis turneriana (Schwaegr.) Mitt. EE.UU.: HAWAII: Oahu, Waianag Mount, Metrosideros-Cheirodendron moss forest, very wet roadside areas, alt. 4000 ft., 22-11-1975, Leg.: W.J. Hoe 3350-O. Ph/tonofis zinc/nata (Schwaegr.) Brid. PERU: Amazonas, Saullamur between Balsas and Leimebamba, on rocks and trees, Leg.: E. Hegewald. Plagiopus oederiana (Sw.) Crum. AUSTRIA: an Felsspalten auf Kalk im Bodental, Kárnten, 16-VII-1980, Leg.: R. Múes. FRANCIA: Haute Savoie, La Grande Chartreuse, alt. 1000 m, rochers calcaires, Leg.: M. Onraedt 12421; Les Causses, rochers calcaires, Leg.: M. Onraedt 7667. SUIZA: Canton de Tribourg, blocs calcaires, alt. 1600 m, Schwarzsee Col des Neuschels, Leg.: - M. Onraedt 7665. Así mismo, se dispuso de otro material vegetal no perteneciente a la familia Bartramiaceae, para la obtención de “patrones” químicos de compuestos conocidos, parte de los cuales constituían la base química de los biflavonoides de musgos: Dicranum scoparium Hedw. ALEMANIA: Saarland, valle de Kirheler, entre Kirhel y Lantzhirchen, en hayedo, 3-XII-1992, Leg.: López Sáez, Geiger, Jung & Miles, Det.: López Sáez. ESPAÑA: AVILA: Lanzahita, en pinar de pino resinero, 750 m alt., 15-1-1993, Leg. & Det.: JA. López-Sáez. 67 ESPAÑA: MADRID: Puerto de Canencia, en pinar de pino silvestre, 18-111-1992, Leg. & Det.: J.A. López-Sáez. Ron & col. (1990), Osterdahí (1979a, 1983) y Lindberg & col. (1974), denuncian la presencia en este musgo del biflavonoide 5~ 8”-biluteolina, también identificado en Bartramiaceae (ver Anexo 2). La identificación previa en nuestro trabajo mediante ensayo de un nuevo biflavonoide en esta especie (Geiger & col., 1993b), y la posibilidad de obtener patrones biflavonoidicos con los que trabajar igualmente en Bartramiaceae nos hicieron llevar a cabo el estudio del componente biflavonoidico de Dicranum scoparium como ya quedo manifiesto en la Justificación de la Memoria Doctoral. Selaginella denticulata (Li Spring. ESPANA: CACERES: P.N. Montfrague, de Torrejón el Rubio a Viflarea] de 5. Carlos, en encinar subhúmedo y alcornocal, 295QE50, 21-XI-1991, Leg. et Det.: J.A. López Sáez; P. N. Montfragile, cta. de Torrejón el Rubio a Villareal de 5. Carlos, en alcornocal, 295QE50, 211-1991, Leg.: J.A. López Sáez & P. Peón, Det.: J.A. López Sáez. ESPAÑA: MADRID: Villa del Prado, en el cauce del tamujar, 23-XII-1992, Leg. et Det.: J.A. López Sáez. Voirin (1972), refiere la presencia de amentoflavona en esta especie, y de biflavonas únicamente en el género. Posteriormente, López-Sáez & col. (1994a y b), identifican un total de 7 biflavonoides: amentoflavona, robustaflavona, hinokiflavona, tetrametileter de amentoflavona, criptomerina B, isocriptomerina y sotetsuflavona. Selaginella selaginoides (L.) PB. ex Scbrank & C.I3XP. Mart. ESPANA: SANTANDER: Borleña, en el sotobosque del castañar, 4-XI-1991, Leg. & Det.: JA. López-Sáez. López-Sáez & col. (1994a y c), refieren la presencia en esta especie de 3 biflavonoides: amentoflavona, robustaflavona e hinokiflavona. 68 . 4.2. Flavonoides 4.2.1. Extracción El primer y primordial paso consiste en la limpieza exhaustiva de cada una de las muestras para eliminar restos fúngicos y tierra, acículas de pinos, líquenes u otros restos orgánicos que pudieran contaminar la muestra y concluir en resultados erróneos. Dicho material debe permanecer durante unos días a temperatura ambiente para secarse por completo. Deben eliminarse incluso los rizoides y conseguir un perfecto secado del material vegetal para poder trabajar así con el peso correcto y real, eliminando en la medida de lo posible la mayor cantidad de agua. El siguiente paso consistió en la extracción en si propiamente dicha, siguiendo básicamente dos tipos de metodología: una metodología auxiliar (métodos 1-8) y una metodología general (método 9). Los métodos de extracción utilizados, en general, se han basado en la deslipidización previa de la muestra mediante un disolvente apolar (cloroformo, hexano, etc.) y la extracción posterior de los compuestos fenólicos con disolventes de mayor polaridad. El solvente utilizado en la extracción de los flavonoides en general y de los biflavonoides en particular, depende largamente de la propia naturaleza del compuesto y del material vegetal de partida (Geiger & Quina, 1975). Así por ejemplo, el tricloroetileno y el cloroformo han sido utilizados para extraer la kayaflavona y otros biflavonoides (Geiger & Quinn, 1975). En el caso de los musgos, tales disolventes se antojan excesivamente apolares y su uso es inútil en la extracción de biflavonoides, por lo que es aconsejable utilizar disolventes más polares, tales como metanol, etanol y/o acetona con un 10-20% de agua (Geiger, 1990). Siegel (1988) afirma que los biflavonoides se extraen con facilidad con un 65-75% de metanol, mientras que los flavonoides di y triglicosilados necesitan en cambio un 20-40% de metanol únicamente. Las metodologías de extracción seguidas han sido las siguientes: 4.2.1.1. METODOLOGíA AUXILIAR <métodos 1-8’> Nos sirvió como banco de pruebas para estudiar la capacidad de distintos disolventes en la extracción de flavonoides. En este caso fue necesaria la pulverización de las muestras (gametófito + esporófito) para facilitar de esta manera la extracción de los compuestos fenólicos. Posteriormente, cada una de las muestras, por separado, se sometió a percolación en caliente en aparato Soxhlet (López-Sáez, 1992). En todos los casos, se utilizó en la extracción de las muestras muscícolas, tanto gametófito como esporófito conjuntamente. Los métodos auxiliares son los siguientes: METODO 1- 10) cloroformo, 20) metanol 90%. Miles (1988) propone la extracción con metanol 80%, muy especialmente para glicósidos pues son los flavonoides que más frecuentemente se 69 presentan en briófitos. Así mismo refiere la deslipidización previa y eliminación de agliconas lipofílicas, previa extracción con cloroformo, metanol puro o acetato de etilo. METODO 2- 10) cloroformo, 20) metanol 90%, METODO 3~ U’) cloroformo, 20) acetona 90%, 30) 30) acetona 90%. metanol 90%. METODO 4- Directamente con metanol 90%. METODO 5- 10) cloroformo, 20) etanol 80% (Seeger & col., 1990 y 1991). Tiene la ventaja de la menor toxicidad del etanol frente al metanol. METODO 6- 10) cloroformo, 20) etanol 100%, 30) etanol 70%, 40) metanol 70%. Las fracciones obtenidas de las dos últimas extracciones se concentraron y unieron hasta obtener un concentrado de aproximadamente 60 ¡nl. A esta solución de 60 ml se añadieron 100 ml de agua en ebullición. Tras dejarse enfriar se obtuvo un precipitado que se desechó y una solución acuosa. Esta última fue lavada en un embudo de decantación durante 3 veces y sucesivamente con 100 ml de cloroformo, acetato de etilo y n-butanol, obteniéndose las subfracciones clorofórmica, acetato de etilo, n-butanol y acuosa final que fue desechada. Fue preciso utilizar sulfato sódico anhidro para deshidratar las subfracciones de acetato de etilo y n-butanol. METODO 7- 10) cloroformo, 20) metanol 90% y posterior purificación de dicha fracción con hexano. La fracción metanólica purificada se llevó a sequedad y se diluyó en una mezcla de cloroformo-metanol-agua (10:9:1). De esta manera se obtuvo una nueva subfracción metanólica 90%, siendo eliminadas el resto de subfracciones. La purificación con hexano permite observar con mayor claridad y viveza los colores de las manchas obtenidas en la cromatografía en capa fina. METODO 8- etanol 100%, 30) etanol 70%. Es una modificación del método 6. Las fracciones etanol 100% y etanol 70% se unen y se sigue el proceso ya descrito en el método 10) cloroformo, 20) 6, hasta obtener las subfracciones clorofórmica, acetato de etilo y n-butanol. La fracción resultante de la primera extracción con cloroformo, y a diferencia del resto de métodos en que es desechada, es lavada sucesivamente con éter de petróleo y tolueno, obteniéndose así dos nuevas subfracciones: éter de petróleo y la resultante de la unión de las subfracciones clorofórmica y toluénica, siguiendo un método semejante al expuesto por Chawla & col. (1974), para isoflavonas-C-glicósidos. En todos los casos las fracciones correspondientes a la extracción con cloroformo se desecharon (excepto en el método 8), así como la fracción etanol 100% del método 6 y la fracción hexánica del método 7, ya que aplicadas alicuotas de dichas fracciones en los sistemas de cromatografía en capa fina elegidos, se demostraba la inexistencia en ellas de flavonoides. Las fracciones acetónica y metanólica de los métodos 2 y 3, dado que tras la cromatografía en capa fina ofrecían los mismos resultados, se unieron en cada caso. 70 . Cada una de las fracciones resultantes, sea cual fuere el método de extracción utilizado, fue posteriormentelavada cuatro veces, con la mezcla dimetílformamida (DMF):agua:éter dietílico(4:1:8) (Geiger & col., 1988; Geiger, 1990; Seeger & col., 1990 y 1991), mediante la llamada “Distribución de Craigt~; que permite remover las clorofilas aún existentes, distribuyendo el extracto en dos fracciones, una superior de éter etílico que elimina los restos de clorofilas y grasas, y una inferior acuosa-DMF, más polar, que extrae los flavonoides (Markham, 1982). Todas las fracciones resultantes de eter etílico fueron desechadas. De acuerdo a los resultados obtenidos, dedujimos que lo más adecuado es seguir el método básico propuesto por Múes (1988), previa deslipidización con cloroformo y extracción seguida de los flavonoides con metanol 80%, o, en su defecto con etanol 80%, de menor toxicidad (métodos 1 y 5). Se debe evitar excesivos fraccionamientos (métodos 6 y 8) pues las subfracciones obtenidas (clorofórmica, acetato de etilo, n-butanol), además de tener menor riqueza flavonoidica (cualitativa y cuantitativa), no separan alternativamente distintos compuestos en cada subfracción, sino que cada una de ellas separa los mismos pero en distintas concentracciones. Sí parece ser recomendable el lavado de los extractos metanólicos/etanólicos con hexano, pues elimina gran cantidad de impurezas, dando mayor nitidez a los colores cromatográficos. Finalmente el fraccionamiento con DMF:agua:éter etílico es igualmente obligado, por la mejoría notable que se observa en la eliminación de impurezas, y por ello puede sustituir al lavado con hexano, ya que además permite una concentracción mucho mayor de los compuestos polifenólicos. La extracción con metanol-agua (9:1) o etanol-agua (9:1), es recomendable para biflavonas, las cuales no se extraen con metanol puro, cloroformo o diclorometano (Geiger, 1990; Ron & col., 1990). Es preciso al menos un 10-20 % de agua en la extracción. 4.2.1.2. METODOLOGíA GENERAL (método 9> La extracción denominada “general” se lleva a cabo con grandes cantidades de material biológico, generalmente 200 ó 300 gramos. Esta, a diferencia de los métodos auxiliares, se realiza en frío, sumergiendo el musgo dentro de recipientes de vidrio de capacidad suficiente, en los disolventes respectivos y siempre sin pulverizar. Es aconsejable remover el extracto de vez en cuando con paleta de plástico para facilitar el proceso. En nuestro caso hemos seguido en todo momento las recomendaciones del Prof. Dr. Hans Geiger (Universidad de Saarlandes, Saarbrñcken, Alemania), utilizando únicamente disolventes polares (metanol y posteriormente acetona). Resulta esencial que el solvente contenga aproximadamente un 10-20% de agua, porque aumenta no sólo la solubilidad de los biflavonoides (por ej. la 5’,3”’- dihidroxi-robustaflavona es escasamente soluble en 100% de acetona pero lo puede ser fácilmente en un 80%), sino que también se facilita su extracción de las paredes celulares (Geiger, 1990). A diferencia de las metodologías auxiliares, no se utiliza primeramente un disolvente apolar para deslipidizar y eliminar clorofilas, aunque en ocasiones puede ser aconsejable utilizar por ejemplo cloroformo, para eliminar un alto contenido de clorofilas y facilitar el trabajo (Salm, 1992). Debido a la polaridad de los biflavonoides de musgos, éstos no son generalmente extraídos 71 con diclorometano o cloroformo, disolventes que se suelen usar primordialmente para la eliminación de lípidos. No obstante, si se utiliza como primer paso un disolvente apolar, es aconsejable realizar siempre un ensayo cromatográfico en TLC de dicho extracto clorofórmico (p.e. en celulosa/acético 40%) para detectar la posible presencia de flavonoides menos polares (Geiger, 1990). El extracto correspondiente a cada una de las distintas extracciones sucesivas es filtrado en vacío con filtros Rundfilter de 150 mm de diámetro y, evaporados a sequedad en rotavapor, al cual va acoplado igualmente una bomba de vacío. Básicamente se utilizaron dos tipos de bomba: una de Bilchi 165/S Vacuum Controller y otra de Vaccumbrand modelo Vakuum-Controller CVC 24. La temperatura adecuada de trabajo en ambos casos es de 400 C. a una presión de vacío ideal en el caso del metanol, cercana a 320 mbares. Los extractos así obtenidos son chequeados en TLC, tomando una pequeña alicuota del extracto previamente a su evaporación a sequedad total. El ensayo se realiza en placas de poliamida-6 en el sistema Stahl (ver apartado 4.2.2.1.: “Sistemas Cromatográficos”), permitiéndonos conoceren cada momento la concentración de cada uno de los extractos sucesivos y con ello cuando debe finalizar el proceso de extracción, o bien, cuando se debe cambiar el disolvente de extracción cuando la concentración en flavonoides sea baja o nula. De cada extracto se aplican en TLC aproximadamente 10 ¡tI correspondientes a 5 microcapilares. Una vez conocida la concentración de cada extracto parcial, si se debe seguir el proceso de extracción se pueden ir uniendo a los anteriores, así hasta que se sepa que se debe finalizar el proceso, en cuyo caso todos los extractos parciales resultantes pueden unirse en uno final total. Es muy posible, que como consecuencia de la alta concentración en distintos compuestos en los extractos parciales o en el final total, el recipiente de trabajo posea en su zona superior un halo negro sumamente adherido al vidrio, correspondiente a clorofilas, azúcares, etc., fiel reflejo de que la concentración y material vegetal utilizados para el estudio flavonoidico han sido suficientes. Este halo u otros restos adheridos pueden disolverse mediante un agitador de ultrasonidos Bandelin Sonorex TK 20. Es posible que igualmente, en el fondo del recipiente de trabajo se forme un “sirope” básicamente compuesto de azúcares difíciles de solubilizar. En este caso es preferible utilizar primeramente acetona 80% (para solubilizar los azúcares) o metanol 60%, disolver en la medida de lo posible tal sirope, mediante agitación manual continuada del recipiente y evaporar de nuevo a sequedad el extracto para disolver el sirope anteriormente formado. Una vez que el extracto total (procedente de la unión de todos los extractos parciales) está evaporándose a sequedad, justo antes de la sequedad total cuando dicho extracto es más o menos semiliquido, se debe filtrar previamente en vacío para eliminar restos de partículas o filidios que puedan existir en el extracto, e impedir un desarrollo normal del trabajo. Una vez filtrado el extracto final se lleva a sequedad total en rotavapor. En caso de que algún extracto debamos conservarlo durante varios días, es aconsejable antes de introducirlo en un refrigerador, añadirle unos ml de acetona (de acción bactericida), metanol al 80% (no puro pues puede romper ciertas moléculas flavonoidicas sobre todo las glicosiladas) y añadir igualmente unos ml de ácido acético, pues los compuestos fenólicos son en general bastante inestables en medio básico (Markham, 1982). Los procesos de extracción seguidos con cada muestra, los litros de solvente utilizados y el 72 tiempo empleado son los siguientes: Bartramía ithyphylla Bríd. Material vegetal empleado (gametófito + esporófito): 120 gr. Extracciones: 2~ 3~ 4~ ~a U’ extracción: 5 1 de metanol 80% (48 h.), extracción: 5 1 de metanol 80% (24 h.), extracción: 4 1 de metanol 80% (48 h.), extracción: 4 1 de acetona 80% (48 h.), extracción: 4 1 de acetona 80% (24 h.). Bartramía halteriana 1-?edw. Material vegetal empleado (gametófito + esporófito): 185 gr. Extracciones: ]a extracción: 5 1 de metano] 80% (48 h.), 2~ extracción: 5 1 de metanol 80% (72 h.), 30 extracción: 4] de metano] 80% (24 h.), 4á extracción: 4 1 de acetona 80% (48 h.), 5~ extracción: 4 1 de acetona 80% (24 h.), 6~ extracción: 4 1 de acetona 80% (24 h.). Bartramia pomiformis Hedw. Material vegetal empleado (gametófito + esporófito): 250 gr. Extracciones: 1’ extracción: 5 1 de metanol 80% (48 h.), Y’ extracción: 6 1 de metanol 80% (48 h.), 3á extracción: 5 1 de metanol 80% (24 h.), extracción: 5 1 de metanol 80% (72 h.), 5~ extracción: 5 1 de acetona 80% (48 h.), 40 60 extracción: 5 1 de acetona 80% (76 h.), extracción: 4 1 de acetona 80% (24 h.), 8~’ extracción: 4 1 de acetona 80% (24 h.). 70 Bartramia stricta Brid. Material vegetal empleado (gametóf¡to + esporófito): 200 gr. Extracciones: i ~ extracción: 4 1 de metanol 80% (24 h.), 20 extracción: 4 1 de metano] 80% (48 h.), 30 extracción: 3 1 de metanol 80% (96 h.), 40 extracción: 3 1 de metanol 80% (24 h.), 5~ extracción: 2 1 de metanol 80% (24 h.), 6’ extracción: 2 1 de acetona 80% (24 h.), 70 extracción: 2 1 de acetona 80% (72 h.), 8~ extracción: 2 1 de acetona 80% (24 h.), 90 extracción: 2 1 de acetona 80% (24 h.). 73 Dicranum scoparium Hedw. Material vegetal empleado (gametófito + esporófito): 285 gr. Extracciones: ia extracción: 111 de metanol 80% (48 h.), 2” extracción: 9 1 de metanol 80% (96 h.), 3~ extracción: 8 1 de metanol 80% (24 h.), 4” extracción: 7 1 de acetona 80% (24 h.), 5~ extracción: 8 1 de acetona 80% (24 h.), 6” extracción: 7 1 de acetona 80% (48 h.). Una vez seco el extracto total, se le somete a la llamada Distribución de Craig (Geiger, 1990; Geiger & col., 1988; Seeger & col., 1990 y 1991), que permite eliminar clorofilas, carotenoides y otros restos lipofílicos, pudiendo aislar el contenido flavonoidico en una fracción separada (ver apartado 4.2.1.1.). La distribución en si consiste en tratar el extracto seco total con la mezcla dimetilformamida (DMF):agua:éter etílico (4:1:8). Para ello se preparan previamente 650 ml de tal disolvente (200:50:400), separándose en un embudo de decantación en dos fases: una superior básicamente de éter etílico, y otra inferior DMF-acuosa. El uso de agua nos permite precisamente conseguir esa separación, pues si usamos únicamente OME y éter sólo se formaría una fase, pues son miscibles. El primer paso consiste en solubilizar el extracto seco utilizando únicamente la fase inferior (DMFagua) que previamente habíamos separado del embudo de decantación, hasta hacerlo soluble totalmente. Se utiliza en este caso unos 105 ml aproximadamente de la fase DMF-acuosa. Una vez solubilizado, la solución resultante se pasa a un nuevo embudo de decantación, y se le añade una cantidad equivalente de la fase de éter etílico (aproximadamente 150 mí), tras lo cual se debe agitar muy bien el embudo eliminando los gases del éter y esperar aproximadamente 1/2-1 h. a la separación en dos fases de la solución. Estas dos primeras fases las llamaremos respectivamente ETER 1 (posee básicamente clorofilas) y DMF 1. A continuación la fase DMF 1 se pasa a un segundo embudo de decantación y se le añaden otros 150 ml de éter etílico, repitiéndose el proceso anterior y obteniéndose dos nuevas fases: ETER 2, que elimina restos de clorofilas no eliminados por la fase ETER 1 y, la fase anterior DMF 1 lavada por segunda vez con éter. El proceso de repite una tercera vez en un tercer y nuevo embudo de decantación, obteniéndose una nueva fase ETER 3 y la fase DMF 1 que ya se separa en un erlenmeyer. A continuación se retoma la fase ETER 1 y se le añaden 105 ml del solvente DMF-agua previamente preparado, obteniéndose al cabo de 1/2-1 h. dos fases, la misma fase ETER 1 lavada con DMF-agua y una nueva fase que llamaremos DMF-2, la cual, al igual que se hizo con la DMF-1, es lavada sucesivamente en los embudos correspondientes a las fases que resultaron ETER 2 y ETER 3. El proceso se repite una tercera vez, añadiendo otros 105 ml. del disolvente DMF-agua a la fase ETER 1 y lavando posteriormente la fase DMF-3 resultante dos veces en las fases ETER 2 y ETER 3. Al final de todo el proceso dispondremos de seis fracciones correspondientes a cada una de 74 > las fases, que recogemos en erlenmeyer separados: ETER 1, ETER 2, ETER 3, DMF 1, DMF 2 y DMF 3. Es importante en cada paso agitar muy bien e] embudo de decantación correspondiente, eliminar gases etéreos y permitir una buena y rápida separación de las dos fases resultantes. Las seis fracciones así obtenidas fueron posteriormente cromatografiadas en TLC, en el sistema stahl-poliamida 6 (ver apartado 4.2.2.1.) para cada una de las muestras. Generalizando para las cinco especies estudiadas, podemos afirmar que las tres fracciones etéreas (ETER 1, ETER 2, ETER 3) únicamente contenían clorofilas, por lo que se desecharon. Las fracciones DMF 2 y DMF 3 contenían un bajo contenido en flavonoides (manchas de color violeta claro en e] ensayo en TLC) y bajo igualmente en clorofilas, por lo que no se desecharon pero fue necesario lavarlas sucesivamente con nuevo solvente (éter etílico) hasta eliminar definitivamente los restos de clorofilas contaminantes. La fracción DMF 1 en cambio, no contenía clorofilas y si un alto y rico contenido en flavonoides (manchas color violeta oscuro en el ensayo en TLC). Tras lo anterior, las tres fracciones libres de clorofilas (DMF 1, DMF 2, DMF 3) se unieron y llevaron a sequedad en rotavapor. La evaporación del DMF es difícil, siendo recomendable para unas condiciones de trabajo de 400 C., añadir unos ml de acetona y evaporar a velocidad muy baja, hasta conseguir llegar al punto de ebullición del DMF, que se consigue a una presión de 10 mbares con la ayuda de una bomba de vacío acoplada al sistema de evaporación. Generalmente no hace falta evaporar todo el extracto disuelto en DMF hasta sequedad total, lo que facilita si cabe el proceso por la dificultad de tal evaporación, sino que se puede evaporar hasta que resten aproximadamente unos 50 ml de extracto (“solución aceitosa” no “siruposa”) que se someterán a otras pruebas analíticas y preparativas tales como la Cromatografía en Columna. En adelante, estos extractos o soluciones aceitosas finales, recibirán la denominación de “Extracto General”, específico para cada una de las especies estudiadas, y de acuerdo a él nos referiremos en metodologías posteriores tales como la Cromatografía en Columna. 4.2.2. Técnicas Analfticas 4.2.2.1. Cromatoarafía A.- Cromato2rafía en Capa Fina (T.L.C. Dado que los compuestos polifenólicos se presentan generalmente en forma de mezclas complejas, todos los métodos utilizados para su análisis incluyen una técnica de separación, generalmente cromatográfica. La Cromatografía en Capa Fina (1. L. C.) resulta por este motivo enormemente válida y útil. En nuestro trabajo hemos seguido todas las recomendaciones aportadas por MOes (1988) y Harborne (1984), utilizando placas de 20 x 20 cm, con el punto de aplicación a los 2 cm y un frente de 15 cm. En las cromatografía monodimensionales (1D-TLC) la aplicación de 75 la muestra se hace en banda de aproximadamente 1 cm, y en las bidimensionales (2D-TLC) en un punto (pa) de cerca de 0.5 cm de diámetro a 2 cm de cada uno de los lados de la placa (Fig. 4.1 y 4.2.). Es necesario advenir que, tras desarrollarse la primera dimensión de las 2D-TLC se debe secar perfectamente la placa, eliminando cualquier resto del primer solvente, dc manera que no interfiera en el desarrollo de la segunda dimensión en un nuevo solvente. Las placas cromatográficas utilizadas poseen las siguientes fases estacionarias: cromatofolios PL de plástico, preextendidos con Polianiida-6 Polygram, de 0.1 mm de espesor, de - Macherey-Nagel (MN). cromatofolios AL de aluminio, preextendidos con Poliamida 11 F-254, con indicador de - fluorescencia, espesor de capa de 0.15 mm de Merck. cromatofolios PL de plástico, preextendidos con celulosa E con indicador de fluorescencia, de 0.1 - mm de espesor de Merck. cromatofolios PL de plástico, preextendidos con celulosa sin indicador de fluorescencia, de 0.1 mm - de espesor de Merck. cromatoplacas extendidas preparativas y analíticas de celulosa, sin indicador de fluorescencia, de 0.25 rmn de espesor. Se preparan haciendo una suspensión con 60 gr. de celulosa para TLC de Merck y 210 ml de agua destilada, suficiente para 10 placas (Markham, 1982). Se mezcla eliminando todos los grumos posibles formados en la papilla. Para ello se puede utilizar un agitador de ultrasonidos Bandelin Sonorex TK 20, tras lo cual se extiende la papilla en cromatoplacas de vidrio (previamente - deslipidizadas con acetona) de 20 x 20 cm y se dejan secar. trente 15 cm 2 cm 20 cn Fig. 4.1.: mc MONODIMENSIONAL (1D-TLC) frente 1 <15 cm) 2 cm 20cm Fig. 4.2.: mc BIDIMENSIONAIL (2D-ThC) 76 > Dado que los resultados obtenidos con las cromatoplacas extendidas previamente en el laboratorio eran semejantes a los obtenidos con aquellas preextendias procedentes de distintas casas comerciales, aunque con menor nitidez tanto en la separación de los compuestos como en su coloración, se emplearon únicamente con fines preparativos. Así, y de acuerdo con los resultados obtenidos, se utilizaron básicamente en el aislamiento del denominado Compuesto VI (Bartramiaflavona), siendo su purificación posteriormente realizada por otros métodos. La relación de solventes utilizados en T.L.C. (Markham & Wilson, 1988 y 1989; Múes, 1988; Markham, 1982) y la fase estacionaria en la que se desarrollaron es la siguiente (los solventes únicamente son válidos durante una semana, tras la cual debe prepararse un sistema nuevo, siendo aconsejable anotar la fecha de preparación en la cubeta cromatográfica): A. 1. Cromatografía monodimensional (1D-TLC’ Z1: Acético 15% en celulosa (1-3 h.). Z2: Acético 40% en celulosa (2-4 h.). Z3: TBA = t-butanol:acético:agua (3:1:1) en celulosa (6-7 h.). Es aconsejable utilizar una fuente de calor tal como una estufa de calefacción por aire, para conseguir una desarrollo cromatográfico más rápido, pues este sistema es bastante lento. P1: STAHL = AEBFW = acetato de etilo:metiletilcetona:fórmico:agua (5:3:1:1) en poliamida (1-2 h.) (Stahl, 1967). P2: AWE = Acetona:agua:acético (6:2:2) en cromatoplacas de poliamida (1-2 h.). La aplicación de las muestras en las placas de cromatografía se realizó mediante una microjeringa Hamilton-Bonaduz, en aplicaciones que iban desde los 7 a los 30 ¡tI dependiendo de la concentracción de la muestra. A.2. Cromatografía bidimensional (2D-TLC’ A la vista de los resultados hasta ahora obtenidos, es evidente que la gran mayoría de los biflavonoides de musgos poseen más o menos la misma polaridad (Geiger, 1990). Es por ello que se debe buscar un sistema cromatográfico bidimensional adecuado que nos proporcione una separación razonable de los distintos compuestos. En nuestro trabajo se utilizaron dos tipos de sistemas cromatográficos bidimensionales: Z3-Z1: Se utilizó el disolvente TBA para desarrollar la placa en la primera dimensión y acético 15% para la segunda, en placas de celulosa (Mabry & col., 1970; Miles, 1988). En este sistema la mayoría de los biflavonoides presentan un alto Rf en TBA y apenas migran en acético 15%, excepto los biflavonoides macrocíclicos (Seeger & col., 1991; Seeger, 1992; Salm, 1992; López Sáez, 1992) (Fig. 4.3.). 77 P1-P2: Stahl (5:3:3:1) para la primera dimensión y AWE (acetona:agua:acético) (6:2:2) para la segunda, en placas de poliamida-6 (Stahl, 1967; Salm, 1992; Seeger, 1992). Es un buen sistema para biflavonoides pues al contener acetato de etilo el primer solvente impide el desarrollo cromatográfico de muchos monoflavonoides, sobre todo flavonas. Con este sistema además, la mayoría de los biflavonoides poseen un valor de Rf medible en ambas dimensiones, a diferencia del anterior, en el que en la dimensión del acético 15% apenas se desarrollan y en IBA tienen un Rf generalmente muy alto (Fig. 4.4.). Fig- 4.3.: Movilidad de los biflavonoides más comunes en musgos en el sistema 2D-ThC acético 15%-TBA en celulosa. Fig. 4.4.: Movilidad de los biflavonoides m~s comunes en musgos en el sistema 2D-TLC StahlAWE en poiamida-6. En todos los casos se prepararon apronniadamente 100-150 ml de solvente para cada cubeta de cromatografla, cantidad suficiente para garantizar un buen desarrollo, sin que el disolvente llegue al punto de aplicacion. 78 E.- Reveladores Cromatográficos El color o la fluorescencia es un indicativo válido del compuesto con el que estamos trabajando. Si éste es un biflavonoide, su color o fluorescencia es reflejo claro de los monoflavonoides que lo forman (Geiger, 1990). Una vez desarrolladas las 1D-TLC (monodimensionales) o la 2D-TLC (bidimensionales) se procedió a observar las manchas aparecidas bajo la luz ultravioleta. Para facilitar el proceso, y como medio de distinción de los tipos flavonoidicos se usaron una serie de reveladores específicos de flavonoides (Miles, 1988; Geiger, 1985; Vioque, 1984): B.1.- Amoniaco (NH3, 25%): las manchas púrpuras oscuras correspondientes a flavonas o flavonoles con un grupo hidroxilo libre en posición 4’- del anillo E cambian a una fluorescencia amarilla o amarilla verdosa tras ser sometidas a vapores de amoniaco. En el caso de no producirse tal cambio con los vapores de NH3 es probable que se trate de un flavonoide inespecífico en cuanto al tipo, con el oxígeno en posición 4’del anillo B sustituido o ausente el grupo hidroxilo en tal posición (ver Fig. 3.6 pp. 21). B.2. - Naturstoffreagenz A (NA). Neu (1957) propone el empleo de complejos de ácidos diarilbóricos y de oxialquilanúnas como reactivos de derivados de la fenil-benzo--y-pirona. El reactivo comercializado ha sido el difenilborato de aminoetanol (PEG 400), también llamado Naturstoffreagenz A, Natural Product Reagent A y Flavognost (Fig. 4.5), notablemente recomendado en la Farmacopea Europea (Brasseur & Angenot, 1986) que ha resultado ser un muy interesante y válido revelador cromatográfico de biflavonoides, aunque también es útil con otros flavonoides y compuestos fenólicos. El NA es en sí un buen reactivo como revelador de flavonoides pues éstos tienen grupos hidroxilos libres y, los electrones del oxígeno son atraídos por el boro del NA. WC —I O CH2 NH E Fig. 4.L: Estructura química del Naturstoffreagenz A (NA). El NA se prepara en una solución metanólica al 0.3% que se pulveriza sobre la placa de cromatografía formando con las manchas existentes complejos irreversibles, al contrario que el 79 amoniaco. Igualmente, se puede pulverizar posteriormente con polietilenglicol al 2% en metanol, para conservar mejor el color de las manchas y hacerlos más vivos. Si manchas púrpuras reveladas con NA cambian a colores verdes o amarillo verdosos fluorescentes, se trata con seguridad de compuestos que poseen un grupo OH- libre en posición 4’del anillo B, o hidroxilos adjuntos sustituidos en posiciones 3’- y/o 5’- (4>-OH, 4’-OH- 3’,5’diOCH3, 4’-OH- 3’-OCH3). En el caso de que el cambio de color sea hacia colores amarillos o naranja-amarillentos fluorescentes, se tratará de compuestos que pueden presentar: o-diOH en posiciones 3’,4’- del anillo B, tres grupos hidroxilos adjuntos y libres en posiciones 3’,4’,5’- del anillo E o bien, o-diOH en 4’,5’- y -OCH3 en 3’ (ver Fig.3.6 Pp. 21) Las manchas azules fluorescentes o azul violáceas, suelen corresponder a ácidos cinámicos, sobre todo las azules fluorescentes, u otros ácidos fenólicos derivados del cafeico. Así mismo, tonos más oscuros azulados pueden corresponder a flavonoides glicosilados, generalmente en 1 y/o 5 de flavona (Geiger, com.per.; Wagner & col., 1983). Generalmente el color de los biflavonoides bajo la luz ultravioleta (360 nm) es el de una mancha oscura, violeta/púrpura, cuya fluorescencia tras revelar con NA se torna hacia colores amarillos o naranjas fluorescentes (Geiger, 1990). No obstante, hay dos casos especiales dignos de mención y que hemos creído importante señalar aquí: 1. Por una parte, nos encontramos con los biflavonoides macrocíclicos, bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona, cuyo color no cambia tras ser revelados con NA o vapores de amoniaco, lo que los hace fácilmente distinguibles del resto de biflavonoides (Seeger, 1992; Salm, 1992, López Sáez, 1992). 2. Otro caso curioso es el de los biflavonoides que cuentan con una mitad monoflavonoidica de eriodictiol (flavanona de la luteolina), cuyas manchas a la luz de la lampara de ultravioleta (360 nm), al igual que el propio eriodictiol, viran a color rojo intenso con el tiempo tras ser reveladas con NA (Geiger, 1990; Wollenweber, 1981; Anhut & col., 1989b; Geiger & Bockel, 1989). Tal es el caso, por ejemplo, de los 2,3-dihidro-biflavonoides, que viran todos ellos a color rojo con el tiempo tras ser expuestos a vapores de NA (Geiger, 1990). Por todo lo anterior, en el apartado correspondiente al “Ensayo para biflavonoides” y, en la exposición de los resultados, hemos distinguido e identificado con relativa facilidad la presencia de ambos macrociclos, bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona, así como de la 2,3-dihidro filonotisflavona, fácilmente identificables por su fluorescencia y típico Rf (Seeger, 1992). B.3. Benedict. Revelador de grupos o-dihidroxilo en compuestos fenólicos. Se prepara de acuerdo - a Reznik & Egger (1961) y Krebs & col. (1967), a partir de dos soluciones previas (1 y II) (MOes, 1988). A la luz visible, los flavonoides revelados con dicho reactivo se observan de color amarillo limón verdoso. A la luz ultravioleta, los compuestos con un grupo hidroxilo libre en 4’-OH del anillo B muestran una fluorescencia verde o azul clara, mientras que los que poseen agrupamientos o-diOH en ese mismo anillo muestran una fluorescencia oscura (ver Fig. 3.6 Pp. 21). En el caso de tratarse de compuestos cuyo color previo al uso del revelador es ya púrpura 80 oscuro, la utilización del reactivo de Benedict no es muy útil. C.- Ensayo nara Biflavonoides El estudio se realizó básicamente de acuerdo a Seeger (1992) y Anhut (1992), junto con las recomendaciones de Markham (1982) y Stahl (1969). Es un método rápido que, con poca cantidad de material biológico, nos permite conocer la ausencia/presencia de flavonoides en la muestra y definir el tipo flavonoidico correspondiente. Ciento cincuenta a doscientos miligramos de material vegetal limpio y seco, se sumergen en 20-25 ml. de metanol 80% en un erlenmeyer de 100 ml. Así permanece dicho material durante 24 h. extrayéndose el componente flavonoidico, tras las cuales, el extracto es filtrado y evaporado a sequedad en rotavapor (no más de 400 C.). En el caso de que el material biológico de partida tenga un exceso de tierra y sea difícil eliminar ésta, es aconsejable utilizar al menos 300 mg. de material vegetal limpio y seco. Los filtros utilizados son de Schleicher & Schilll (5 & 5) Rundfilter de 90 y 110 orn, de diámetro. El extracto filtrado y evaporado a sequedad es posteriormente disuelto en 1 ml de acetona:metanol:agua (5:4:2). La solución así obtenida es cromatografiada en 2D-TLC en el sistema TBA/ácido acético 15% (Z3-Z,) en placas de celulosa (ver Pp. 77-78). Este primer ensayo cromatográfico nos sirve para confirmar la presencia/ausencia de flavonoides y aproximar el tipo flavonoidico. Los biflavonoides, como ya se ha referido con anterioridad, poseen un bajo o nulo Rf en acético 15% y muy alto en TBA. La placa es así mismo revelada con los reactivos específicos anteriormente descritos (amoniaco, NA) y observada en lámpara de luz ultravioleta (254 y 366 nm). Normalmente, la cantidad de extracto aplicado en la cromatografía es de 7.5-8 alicuotas de un capilar de 3 cm de altura por 0.1 mm de diámetro interno, equivalentes a 2 ¡tI por capilar (aproximadamente 16 ¡tI). Las placas de celulosa utilizadas son cromatoplacas extendidas preparativas y analíticas (ver apartado 4.2.2.1.). La solución anterior, una vez cromatografiada en el primer ensayo, es de nuevo evaporada a sequedad en rotavapor a no más de 400 C. y, posteriormente, disuelta en 10 ml de acetato de etilo, pasándose la nueva solución obtenida a un embudo de decantación. El erlenmeyer que contenía la solución original es lavado a continuación con 10 ml de agua destilada que también se pasan al mismo embudo de decantación anterior. El proceso se repite sucesivamente con otros 10 ml de acetato de etilo y 10 ml de agua destilada. Los 40 ml del embudo de decantación son a continuación agitados manualmente, eliminando los gases que se puedan producir, tras lo cual se debe esperar 1/2-1 h. para permitir la separación en dos fases claras del contenido del embudo: una superior de acetato de etilo que contendrá primordialmente los biflavonoides y, otra inferior acuosa que se desecha o bien se cromatografía en el sistema acético 40%/celulosa (Z2) si se sospecha por su color la presencia de flavonoides no aislados en la fracción de acetato de etilo. La fase acetato de etilo se separa de la acuosa y se recoge en un matraz llevándose 81 posteriormente de nuevo a sequedad en rotavapor (no más de 400 C.), tras lo cual el extracto seco obtenido es disuelto nuevamente en 0.5 ml de acetona 100%, y posteriormente cromatografiado en 2D-TLC en placas de poliamida-6 en el sistema Stahl-AWE (P1-P2) (ver Pp. 77-78), observándose luego las cromatoplacas en lámpara de luz ultravioleta (254 y 366 nm) antes y después del revelado con reactivos específicos (amoniaco, NA). Se aplican en la cromatografía aproximadamente 8-10 alicuotas (20 ¡tI) del microcapilar anteriormente descrito. Este segundo ensayo es más específico para biflavonoides y puede aproximar el tipo biflavonoidico aunque no es exclusivo. Como ya se ha comentado con anterioridad (ver apartado 4.2.2.1. B), el ensayo biflavonoidico nos permite diferenciar con relativa facilidad los biflavonoides macrociclicos del resto de biflavonoides, así como los 2,3-dibidro biflavonoides y, en particular, la 2,3-dihidrofilonotisflavona. Es por ello que en la exposición de los resultados del ensayo realizado con las distintas especies de la familia Bartramiaceae, se haga precisamente hincapié, en la presencia/ausencia de bartramiaflavona, anhidrobartramiaflavona, 2 ,3-dihidrofilonotisflavona, otros 2,3dihidrobiflavonoides y otros flavonoides. En todos los casos, excepto cuando se especifique en los resultados, el ensayo se realizó conjuntamente de las fases gametófito y esporófito sin separar. De manera general, podemos afirmar que únicamente se procedió a separar gametófito de esporófito, en los ensayos realizados con las cinco especies que fueron objeto central de la presente Tesis, mientras que en el resto no se llevó a cabo dicha separación. - D.- Cromatografía en Panel (preparativa) Se realizó según las indicaciones de Mabry & col. (1970) y Markham (1975), en papel Whatman 3MM de 57 cm de largo por 43 dc ancho. La muestra se aplicó a 6.5 cm de la base, con un frente de 50.5 cm en sentido descendente. El disolvente utilizado fue Acético 15% (1\2 1), pues era el que mejor se acomodaba a los resultados previamente obtenidos en las TLCs respectivas. Se realizaron un total de 12 cromatogramas preparativos (6 por cada especie), aplicando alicuotas de los extractos metanólicos de Bartramia pom¡iformis y Bartramia halleriana de distintas localidades, ya que en todos ellos se detectó la presencia del Compuesto Vi, que es aquel que intentamos aislar en cantidades suficientes mediante la cromatografía en papel preparativa. El tiempo aproximado de desarrollo del cromatograma fue de unas 16 horas. Tras el desarrollo de la cromatografía preparativa se extrajo del papel la mancha correspondiente al Compuesto VI mediante percolación en Soxhlet con metanol-agua (1:1). El extracto obtenido se llevó a sequedad en un rotavapor para eliminar el disolvente y se purificó posteriormente. De esta manera se obtuvieron un total de 40 mg purificados del Compuesto VI. La extracción del compuesto del papel es preferible realizarla con metanol-agua (1:1) que con metanol-agua (9:1), pues una alta concentracción de metanol descompondría el papel en sus fibras de celulosa, haciendo más difícil la purificación posterior, afectando así mismo al espectro de ultravioleta 82 > que se pueda obtener del flavonoide extraído. Normalmente, utilizaremos la mezcla metanol-agua (9:1) para extraer los compuestos fenólicos del material biológico en vivo y, la mezcla metanol-agua (1:1) para extraerlos del papel o fase estacionaria. E.- Cromatografía en Columna (C.C.’ El uso de esta técnica se centra en el aislamiento de flavonoides a una mayor escala cuantitativa. Básicamente se trata de la separación de una mezcla en disolución de distintos compuestos flavonoidicos, en una columna provista de un adsorbente (celulosa, silicagel, poliamida, etc.) y la subsecuente elución de cada compuesto, individualmente o en una mezcla de un número mucho menor de compuestos (en este caso se utilizarían posteriormente nuevas columnas) con los solventes apropiados. En nuestro trabajo hemos utilizado primordialmente la cromatografía en columna con dos fines: por un lado, el aislamiento de biflavonoides u otros flavonoides, en cantidades necesarias para poder aplicar posteriormente ciertas técnicas analíticas tales como la Resonancia Magnética Nuclear o la Espectrometría de Masas y, por otro lado, para la purificación de cada uno de los compuestos previamente aislados por la misma cromatografía en columna o técnicas afines como la cromatografía en papel preparativa. Se siguieron básicamente las recomendaciones de Mabry & col. (1970), Seeger (1992), Hostettmann & Hostettmann (1982) y Markham (1975 y 1982). Así mismo, queremos expresar que la separación en bandas de la columna cromatográfica, correspondientes cada una de ella a los distintos flavonoides a aislar, puede hacerse visible por la coloración amarilla de éstas a la luz del día o bien por el uso de una lámpara de luz ultravioleta (366 nm), en cuyo caso las bandas flavonoidicas se ven de color violeta (claro y oscuro) y su recolección es sumamente sencilla en recipientes separados, ya que el proceso se convierte con este método en un proceso simple y sencillo (Markham, 1982). A la luz ultravioleta la banda de clorofilas en la columna posee color rojo intenso y la correspondiente a los lípidos más polares que no se eliminaron con el DMF se ven de color marrón claro y oscuro. Otros compuestos tales como ácidos fenólicos o tetraterpenoides pueden visualizarse por su color azul fluorescente o azul violáceo a la luz ultravioleta en la columna. En el caso de que las bandas no sean visibles, se deben colectar fracciones a intervalos regulares (cada 25-50 mI) y, chequear cada una de las fracciones por separado en TLC (acético 40%/celulosa p.e.), para determinar qué compuesto poseen, y saber así cuáles de ellas pueden unirse y cuáles no. Un colector de fracciones automático, en este caso, es ideal para facilitar tal trabajo. Los compuestos aislados y purificados por los distintos sistemas de cromatografía en columna (CC) son llevados a sequedad en rotavapor, depositados en un recipiente de vidrio adecuado y posteriormente introducidos en un Desecador de Silicagel que nos permite eliminar los restos que pudieran existir de agua en los compuestos teóricamente puros. Así permanecen durante 2-3 días en el desecador sin presión alguna o bien puede utilizarse una bomba de presión durante 20-30 minutos. 83 Fueron utilizadas los siguientes tipos de Columnas Cromatográficas: E.1. Columna de Sephadex LH-20 de Sigma. El sephadex es un gel compuesto de moléculas de dextrano que tiene la particularidad de separar los distintos compuestos de la mezcla de acuerdo a su tamaño molecular. El sephadex del tipo LH-20 es un gel de dextrano hidroxipropilado, diseñado para usarse con solventes orgánicos o mezclas con agua (Markham, 1975). Se trata de un sephadex lipofílico, que consigue que la atracción de la muestra por el gel sea la menor posible. De esta manera, el mismo gel (sephadex) es capaz de eliminar grasas y otros compuestos afines de la mezcla, permitiendo el paso a través de él de los compuestos fenólicos de nuestro estudio. El tamaño de separación de partículas oscila entre las 25 y 100 micras, que corresponden al tamaño de la trama del gel. Compuestos menores a dichas medidas no son separados, y los mayores no atraviesan el gel. El sephadex está compuesto de partículas de dextranos que forman un entramado. Las partículas de bajo tamaño serán las que se separen más tarde, siendo por ello las de mayor tamaño tales como biflavonas y glicósidos las que antes se separan. Este tipo de adsorbente está específicamente destinado para el uso de solventes orgánicos (Markham, 1982), siendo especialmente recomendado para la purificación final de distintas agliconas flavónicas, biflavonoides y glicósidos que han sido previamente aislados por otros métodos cromatográficos como la cromatografía en colunma de poliamida. El tipo de solvente que se utiliza depende mucho de la polaridad del compuesto problema, lo que se ha de comprobar previamente mediante 2D-TLC en celulosa o poliamida. Así por ejemplo, en el caso de tratarse de un flavonoide glicosilado, es conveniente desarrollar la CC de Sephadex con un 25-30% de metanol, mientras que si se trata de un biflavonoide o una aglicona monoflavónica se suele usar al menos un 80% de metanol como disolvente cromatográfico. Se utilizaron columnas a las que se incorporó un algodón en su base y en las cuales se evitó sobremanera la formación de burbujas de aire que deformaran el frente cromatográfico. Es aconsejable preparar la columna con gel de sephadex y el disolvente a utilizar y dejarla desarrollarse únicamente con él durante un corto tiempo, y no con la muestra problema, de tal manera que la columna se estabilize correctamente, y una vez así no se produzca un desarrollo excesivamente rápido de la cromatografía. El gel de sephadex se preparó con 6 gramos de sephadex LH-20 y 30 ml de metanol (relación de 1:5). El metanol es generalmente un solvente conveniente para este tipo de columna aunque, algunas veces, puede necesitarse agua al principio del proceso para disolver la mezcla flavonoidica (Markham, 1982). Dicho gel se mantuvo a reposo durante una noche para permitir el embebimiento del sephadex en el metanol. Sobre la columna se eluyó posteriormente una solución suficientemente concentrada de la muestra problema. Geiger (1990) refiere el uso de acetona:metanol : agua (2:1:1) como un buen solvente para este tipo de columna, especialmente válido para la purificación de biflavonoides. Así mismo, Nilsson & col. (1973), refieren el uso de etanol 80% en vez de la mezcla metanólica usual. 84 El gel de sephadex puede reciclarse fácilmente con sólo metanol al 100% y un posterior lavado con metanol 80%. Cuando se prepara el gel, es frecuente la formación de grumos que si no son eliminados podrían dar lugar a deformaciones en la columna. Estos fueron fácilmente eliminados mediante un Agitador de Ultrasonidos de Bandelin Sonorex TX 52-H o en ocasiones con el modelo TX 20. E.2. Columna de poliamida-6 microcristalina de Macberey-Nagel (MN-polyamid SC 6). Este tipo de cromatografía se usó básicamente como método previo de aislamiento de flavonoides, para posteriomente utilizar otros métodos cromatográficos tales como la columna de sephadex en su purificación. Generalmente es conveniente tras la CC de poliamida realizar una CC de sephadex, aunque hayamos conseguido aislar un único compuesto, pues las fracciones aisladas por CC de poliamida pueden poseer oligómeros procedentes de la ruptura del polímero de poliamida, cuya presencia podría deformar los posibles espectros de RMN o EM que posteriormente realizáramos. Estos pueden, en cambio, eliminarse fácilmente si tras la CC de poliamida se emprende una CC de sephadex que nos ayuda, además, a una completa purificación del compuesto o muestra inical problema. En cuanto a la metodología hemos seguido básicamente a Seeger (1992) y Salm (1992) (para una columna de 11): un vaso de precipitados de 2 1 se llena aproximadamente hasta 11 con poliamida6 microcristalina, añadiéndose agua destilada hasta conseguir una pasta semiliquida. Tras ello, se deja reposar la poliamida durante 24 h. para permitir el embebimiento de la poliamida en el agua, al cabo de las cuales se debe eliminar el agua sobrante. Se añaden de nuevo algunos ml de agua para suspender restos de poliamida aún no diluidos consiguiendo finalmente una pasta ‘semiliquida” que puede ya depositarse en la columna cromatográfica. Una vez depositada ésta, se debe abrir la llave inferior de la columna para permitir la salida del agua sobrante, hasta que la columna de poliamida quede estabilizada, sin grietas ni oquedades y con un frente más o menos uniforme. Es importante no dejar dicho frente de desarrollo sin cubrir por el solvente pues la columna se secaría y debería repetirse el proceso al agrietarse ésta. En general, deben dejarse aproximadamente unos 5 cm de solvente por encima del nivel del frente. Una vez preparada la columna de poliamida, se puede ya depositar en el frente el extracto problema. Este corresponde al que denominamos extracto DMF-acuoso en el proceso de extracción de flavonoides, el cual había sido previamente evaporado hasta aproximadamente 50 ml en rotavapor a no más de 400 C. Esos 50 ml de solución “aceitosa” se mezclan con 100 ml de la pasta semilíquida de poliamida-6 para cromatografía en columna que previamente habíamos preparado, removiendo vigorosamente. Tras ello, se añade agua destilada hasta aproximadamente 1 1 total, pues los biflavonoides no son solubles en agua y sí en DMF, y al utilizar agua son capaces de adsorber a la poliamida y permitir su separación a lo largo de la columna cromatográfica, eliminándose el DMF. Suspendida la poliamida-6 con el extracto flavonoidico, se deposita tal contenido en la columna, procurando en todo momento tener el frente de desarrollo estable. El DMF se eliminará junto al agua y, los flavonoides irán depositándose junto a la poliamida, en forma de partículas de 85 poliamida, en el frente de la columna. Es conveniente, en cualquier caso, evitar fuentes laterales de frío que ladearían el frente de desarrollo cromatográfico, por lo que es aconsejable recubrir la columna de vidrio con papel de aluminio que la aisle del ambiente exterior. Una vez eliminada gran parte del agua y DMF por la parte inferior de la columna, y cuando el solvente ésta aproximadamente a unos 2 cm por encima del frente que ya posee las partículas de poliamida con flavonoides, puede irse añadiendo los distintos solventes de elución en orden de apolaridad creciente. De cada uno de los solvente se utiliza 1 1, pues éste es el volumen de la columna. Siempre se debe añadir el mismo volumen de solvente del que tenga la columna (Salm, 1992). Geiger (1990) recomienda el uso de un gradiente de acetona:agua, que es el que hemos seguido en nuestra metodología. Se utilizó basicamente un gradiente acetona:agua desde 1:9 hasta 8:2. En general, y dado que trabajábamos primordialmente con biflavonoides, las subfracciones correspondientes a los solventes acetona 10% hasta 40% se desechaban pues no contenían biflavonoides, excepto en el caso de Dicranum scoparium que poseía flavonoides monoméricos en tales fracciones que, también fueron aislados e identificados. A partir del solvente acetona 50% se comienzan a recolectar fracciones de 100 mí, mediante un colector automático de fracciones (10-20 mí) aunque las subfracciones correspondientes a biflavonoides no aparecen en general hasta el solvente acetona 70%. Cada una de las subfracciones que se van obteniendo es chequeada en TLC monodimensional en el sistema acético 40%/celulosa (aplicación de una sola alicuota de microcapilar de dos microlitros), para comprobar aquellas que poseen o no flavonoides, y cuales pueden o no unirse si poseen el mismo contenido flavonoidico (ver pp. 77-78). Las fracciones con un sólo compuesto pueden purificarse directamente con CC de sephadex, mientras que las que posean 2 ó más pueden volver a pasarse por la CC de poliamida o aún mejor por la CC de sephadex que además de purificarnos la muestra nos separa incluso en nuestro caso los distintos compuestos de cada muestra problema. Es aconsejable utilizar junto a cada litro de disolvente respectivo un 2% de ácido acético, o bien un 5% de acético únicamente a partir del solvente acetona 80% (p.e. 800 ml de acetona, 150 ml de agua destilada y 50 ml de ácido acético), en compensación de los grupos “amina” de la poliamida. En general, y aunque hemos afirmado que se utiliza únicamente 1 1 de cada solvente, equivalente al mismo volumen de la columna, debemos decir que del último solvente, acetona 80%, no debemos especificar una cantidad determinada a utilizar pues es el solvente con el que mayormente se extraen los biflavonoides. Por ello, se van utilizando distintos litros de acetona 80% hasta que el test en TLC de las subfracciones respectivas nos diga que se puede finalizar el proceso de aislamiento en la columna cuando la concentracción en flavonoides sea muy baja o nula. La purificación y lavado de la poliamida (Fig. 4.6.) para su reciclado y posterior uso, se puede llevar a cabo con metanol puro o metanol:acetona (1:1). En el caso de ser una poliamida ya muy usada, es conveniente reciclarla además usando también metóxido sódico en el lavado. 86 Fig. 4.6.: Esquema detallado de la composición química de la Poliamida-6 en su uso para el aislamiento de compuestos fenélicos. E.3. Fase Reversa (RiP). La cromatografía en fase reversa (Reverse Phase) es un sistema de cromatografía en columna bastante lipofílico, más aún dependiendo de la cadena de carbonos que se utilize: RP-18 (18 carbonos) o bien RP-8 (8 carbonos). En realidad la RP es una modificación de una típica columna de silicagel generalmente bastante polar, a la que se le añaden cadenas carbonadas de 8 ó 18 carbonos que hacen variar sustancialmente la polaridad de la fase estacionaria, que en el caso de la RP es relativamente apolar. En sí, la RP es es realidad una MPLC (middle precision liquid chromatography). Generalmente este sistema de cromatografía va asociado a una bomba de vacío que facilita enormemente el proceso~ El uso de la Rl> en la presente Memoria Doctoral se llevó a cabo en dos momentos: a’> para eliminar clorofilas del extracto primitivo obtenido en la extracción general con eloroflonno, acetona y metanol y, b) para separar los flavonoides ya purificados del disolvente utilizado en la RMN (DMSO-d6). Para el primer caso lo normal es utilizar metanol 70% para separar los flavonoides de las clorofilas que se quedan en la superficie de la columna y, posterionnente, usar metanol 100% para desarrollar las clorofilas y limpiar así la columna. En e] segundo caso, el DMSO se puede eliminar fácilmente desarrollando la columna únicamente con agua 3-4 veces, y aislando posteriormente el biflavonoide inicialmente disuelto en DM50 con acetona:agua:rnetanol (2:1:1). La columna de Rl> utilizada fue de RP-l8 de 20-45 micras (Fig. 4.7). Inicialmente se mezcló la RP-18 con metanol 100% para hacer la pasta previa, la cual se lavó seguidamente tres veces más con metanol 100% usando una bomba de yacío, de tal manera que se eliminaran posibles contaminantes de la Rl> tales como panículas de polvo, lípidos y otras clorofilas que pudieran existir. Nuevos lavados se realizaran 3-5 veces can agua únicamente. A continuación se depositó la muestra problema en el frente cromatográfico y posteriormente se utilizaron los disolventese antes comentados. 87 Cuando se usa asiduamente la columna de RP, es aconsejable su lavado para evitar contaminaciones. Para ello se usa una mezcla cloroformo:metanol (1:1) con un 5% de ácido fosfórico, y posteriormente se realiza un nuevo lavado con metanol 100%. 12a a— vacto Fig. 4.7.: Diagrama esquemático de una columna de RiP-lS usada para recuperar flavonoides del DMSO-4 después del anilisis por RMN. En resumen, el esquema básico de aislamiento y purificación de los flavonoides identificados en esta Memoria Doctoral por Cromatografía en columna, consté básicamente de 2 pasos: Aislamiento de los compuestos de la mezcla flavonoidica mediante una columna de poliaxnida-6. Las columnas respectivas se fueron denominando como Pl, P2, P3 ...(columnas de poliamida-6 de Machery-Nagel de 11 de capacidad, 90 cm de longitud y 6 cm de diámetro, con gradiente de acetona:agua desde porcentajes de 1:9 hasta 8:2, siempre añadiendo un 2% de acético. De cada uno de los porcentajes respectivos (1:9, 2:8, 3:7, 8:2) se utilizó 1 1 excepto en el caso del gradiente 8:2 en que fueron necesarios 6 1 de acetona 80%). 20. Purificación de cada uno de los compuestos aislados en la columna de poliandda-6 mediante columnas de sephadex LH-20, que se denominaron respectivamente como 51, S2, 53 (columnas de Sephadex LH-20 de 0.5 1 de capacidad, 40cm de longitud y 3.5 cm de diámetro, utilizando como solvente acetona:metanol:agua (2:1:1) hasta agotamiento del contenido flavonoidico). En ciertos casos, tras la columna de poliamida-6, se obtuvieron fracciones no totalmente puras, es decir, que contenían uno o más compuestos. En dichas ocasiones, la columna de sephadex correspondiente cumplió una doble función: aislamiento de la mezcla no resuelta por la columna de poliamida-6 y purificación de cada uno de los compuestos que se aislaban. En la especie Bariramia striera, fue necesario utilizar una columna de Sephadex LH-20 (de 0.5 Ide capacidad, 40cm dc longitud y 3.5cm de diámetro), con solvente metanol 80 % para separar 10. ... ... los compuestos triflÑ”onoídi¿os ccc aparecían en una misma tracción tras la inicial columna de poiia~úida y una ~gL:i:d? cIumnu Ct~ suphadex con el disolvente ~ubirual.. 88 > E.- Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC’ Durante los últimos años se ha advertido un rápido incremento de la popularidad de este técnica analítica (Markham, 1982). Una adecuada y crítica revisión sobre los conocimientos recogidos en la literatura es expuesta por Pryde & Gilbert (1979). Básicamente, la HPLC es un tipo de Cromatografía en Columna, que utiliza un material de relleno formado a base de partículas de pequeño tamaño y forma regular. La resolución del HPLC es bastante superior a la de la TLC, aunque los tiempos de retención se mueven en un rango relativamente estrecho cuando se analizan compuestos flavonoidicos. Dado que el cromatógrafo de HPLC iba acoplado a un detector de diodos, pudimos por su espectro de ultravioleta (UV), distinguir fácilmente diferentes tipos flavonoidicos: 6-OH-flavonas (350 y 285 mn), otros monómeros de flavonas (350 y 270 nm), isoflavonas (261 287sh y 334 sh) y biflavonoides (261 350 nm) (Siegel, 1988; Siegel & col., 1989). Esta técnica ofrece además un método de análisis cuantitativo de los componentes flavonoidicos de una disolución problema, poseyendo un alto nivel de resolución y sensibilidad, incluso con cantidades menores a los 50 ng. La cromatografía líquida de alta resolución, ha utilizado un variado rango de combinaciones entre el material de empaquetamiento o relleno de la columna y el disolvente. Una excelente revisión de éstas es aportada por Kingston (1979). En el mayor número de los casos, se han utilizado columnas cromatográficas del tipo C-18, que parecen ser las más convenientes en este tipo de análisis, con un material de empaquetamiento de sílice, al que se suele enlazar un hidrocarburo (Markham, 1982). Los solventes en cambio son mucho más variados: agua/metanol, agua/metanol/acético y agua/acetonitrilo, han sido utilizados sucesivamente para cromatografiar flavonas, flavonoles, dihidroflavonoles, catequinas, antocianidinas y flavonoides glicosilados. Gradientes agua/metanol conteniendo un 3% de ácido fórmico (Markham & col., 1988) o un 5% de ácido acético (Siegel & col., 1989; Siegel, 1988), han sido usados tanto en trabajos analíticos como semipreparativos, en la identificación y aislamiento de biflavonoides (Geiger, 1990; Briangon-Scheid & col., 1982; Stein, 1988b; Siegel, 1988; Siegel & col., 1989). La habilidad de la cromatografía líquida de alta resolución para resolver mezclas naturales de compuestos flavonoidicos ha sido establecida por Galensa & Hermann (1980), Galensa (1988), Hardin & Stutte (1980). Niemann & Koerselman-Kooy (1977), Niemann (1980), Strack & col. (1979), Briangon-Scheid & col. (1982), Siegel & col. (1989), Becker & col. (1977), Strack & Krause (1978), Wollenweber (1981 y 1982) y Sendra & col. (1988). En nuestro caso, la metodología empleada es la expuesta por Siegel & col. (1989) y Siegel (1988), junto a las recomendaciones aportadas por Briangon-Scheid & col. (1982), Stein (1988b), Seeger (1992) y Wilschke & Rudolph (1988). El cromatógrafo de HPLC utilizado es un Hewlett Packard, con un sistema de inyector de bombas serie 1050, con detector de diodos 1040 M serie II (Meier & Sticher, 1986), y columna de nucleosil 120-5 C 18, de 250 mm de longitud y 4 mm de diámetro interno. El solvente utilizado fue un gradiente linear agua-metanol desde un 30 a un 70% de metanol durante 40 minutos (Figura 4.8.), con una concentracción constante de ácido acético al 5% y un flujo de 1 mí/mm. El agua fue 89 desionizada y filtrada con un filtro Millipore de 0.45 ~m. No es aconsejable utilizar acetona como solvente para HPLC, pues ésta absorbe en el ultravioleta en un rango que llega hasta los 330 nm, por lo que su espectro podría confundirse con el de un flavonoide <Engelhardt, 1977). Los alcoholes en general, absorben por debajo de 200 nni, con lo que no interferirán ni se confundirán, con los espectros correspondientes a flavonoides. Por ello es preferible utilizar metanol (absorbe sobre 210 un» o etanol en vez de acetona, como solventes para HPLC. Así mismo, se incorporé un paquete informático, en el que se instaló una biblioteca con patrones conocidos de distintos compuestos flavonoidicos, y se estableció un rango de semejanza de 960, como el punto de validez comparativa entre el compuesto problema y el patrón de la biblioteca. Dicho rango de semejanza fue establecido por la casa comercial Hewlett Packard. esarrDl lo crornatográfico de HPLC dE una mezcla flavonoidica HA TIEMPO 30 ~ ‘o 20 40 Fig. 4.8.: Metodología de trabajo en HiPLC. 4.2.2.2. Esuectrofotometría de Ultravioleta La espectrofotometría de absorción ultravioleta (UV) es tal vez la técnica más asequible y mayormente utilizada en el análisis de la estructura molecular de flavonoides (Markha.m, 1982). Nos permite, no sólo conocer el tipo estructural flavonoidico, sino también, sus pautas de oxigenación, la localización de azúcares o grupos metilo unidos a los anillos fenólicos. Los trabajos de Markham & Mabry (1975), Mabry & col. (1970), Jurd (1962), Harborne (1967 y 1984> y Jay & col. (1975) aportan valiosas compilaciones sobre espectros de absorción ultravioleta referentes a flavonoides. Es una técnica asociada a las transiciones de niveles electrónicos de energía. Corresponde a transiciones energéticas en el intervalo comprendido entre 1200 y 400 mg. Dichas transiciones se producen entre un orbital enlazante y otro antienlazante, o bien, entre orbitales atómicos y moléculas antíenlazantes. La longitud de onda de la luz absorbida es una medida de la separación de energía entre los 90 orbitales afectados. Las mayores diferencias de energía se observan cuando se excitan electrones ir (120-200 nm), pero esta zona es de poca utilidad práctica. Por encima de los 200 nm la excitación corresponde a electrones de orbitales p, d, ir y 5, en especial sistemas conjugados 8, donde se puede predecir mediante las reglas de Woodward, la longitud de onda a que absorberá una determinada conjugación. El espectro ultravioleta se realiza normalmente sobre una disolución muy diluida de la sustancia a medir. Para conocer la absorción se recurre a la ecuación: siendo I~ e 12 las intensidades de la luz emitida y absorbida, 1 la longitud en cm que ha de recorrer el rayo incidente en la solución absorbente y ( el coeficiente de extinción molar en moles por cm3. Las medidas han sido realizadas en dos espectrofotómetros de ultravioleta-visible: en primer lugar en un Perkin Elmer modelo Hitachi 200 y en segundo lugar en un UV-160 A Recording Spectrophotometer de Sbimadzu, provistos de una lámpara de Deuterio para las medidas en el ultravioleta, que se realizaron básicamente entre los rangos de 185 a 380 nm y 210 a 440 nm en otras ocasiones. El espectro obtenido se obtuvo en un registrador Hitachi 200. La velocidad de barrido fue de 60 nm/minuto, idéntica a la carta del registrador, de forma que el espectro registrado cada cm equivale a 10 nm. Se realizaron básicamente dos tipos de medida: por un lado medimos la longitud de onda máxima y por otro, la intensidad (1), que nos mostraron el comportamiento fl.V.-VIS del compuesto problema frente a los reactivos usuales en este tipo de análisis (Harborne, 1984; Markham, 1982; Markham & Mabry, 1968; Mabry & col., 1970; Wolfbeis & col., 1984): metóxido sádico, tricloruro de aluminio, ácido bórico, ácido clorhídrico y acetato sádico. La adición de cada uno de estos reactivos se verá reflejada en el espectro mediante dos posibles tipos de efectos: a) efecto batocrómico: aumento de la longitud de onda máxima. b) efecto ipsocrómico: disminución de la longitud de onda máxima. El espectro típico consiste en dos absorciones máximas en los rangos 240-285 mn (banda II) y 300-550 (banda 1) (Tabla 4. 1.), que en la mayoría de tipos flavonoidicos equivale a un patrón de oxigenación 5,7,4’ (Markham, 1982). Las distintas variaciones en la absorción en el espectro para los dos rangos antes definidos, vendrán dadas por los patrones de hidroxilación y el grado de subtitución de dichos hidroxilos. Se pueden, en este sentido, establecer algunas generalidades (Baker & col., 1963; Markham, 1982): Cambios en la sustitución del anillo A quedan reflejados en la absorción de la banda fi, mientras que alteraciones en la sustitución en los anillos B y C tienden a ser más aparentes en la absorción en - la banda 1 (ver Fig. 3.6. Pp. 21). Metilaciones o glicosilaciones (especialmente de los hidroxilos 3,5,7 y 4’) son causa de cambios cortos en las oscilaciones del espectro, sin, al parecer, ser importante la naturaleza del azúcar del glicósido. - 91 - Oxigenaciones adicionales, especialmente hidroxilaciones, generan cambios en la absorción del espectro que suponen una larga oscilación de éste, por ejemplo, en la banda 1 las 3,5,7-triOH flavonas absorben a 359 nm, las 3,5,7,4’-OH flavonas a 367 nm, las 3,5,7,3’,4’-OH flavonas a 370 nm y, las 3,5,7,3’,4’,5’-OH flavonas a 374 nm. BII(nm) ]31 (nm) Flavonoides tipo 250-280 250-270 250-280 250-280 245-275 310-350 330-350 330-360 350-385 3 10-330 320 300-330 340-390 380-430 465-560 Pavonas Biflavonoides Flavonoles (3-OH sustituido) Flavonoles (3-OH libre) Isoflavonas Isoflavonas (5-deoxy-6,7-dioxy) Flavanonas y dihidroflavonoles Chalconas Auronas Antocianinas y antocianidinas 275-295 230-270 230-270 270-280 Tabla 4.1.: Rangos de absorción ultravioleta para los principales tipos de fiavonoides (Markham, 1982; Harbome, 1984). La preparación de los reactivos se realizó de acuerdo a Mabry & col. (1970) y Markham (1982). Se usó como “blanco metanol. Después de la medida del espectro en metanol, se añadieron 3 gotas de metóxido sódico y se registró el nuevo espectro, así como el espectro producido a los 5 minutos, tras la descomposición del metóxido sódico. Registrados los 3 espectros, se procedió al lavado exhaustivo de la cubeta donde se deposita la solución problema (1 x 1 cm de base y 2 cm de altura, 2 ml de volumen) y se realizó el mismo proceso, registrando otra vez el espectro en metanol, añadiendo 6 gotas de tricloruro de aluminio y registrando el espectro, y posteriormente sin eliminar el AId3, se añadieron 3 gotas de ácido clorhídrico y se registró el nuevo espectro. Finalmente, tras un nuevo lavado y espectro base en metanol, se añadió a la cubeta una solución de acetato sódico que alcanzó 2 mm de altura, resgistrándose el espectro producido y, en esa misma solución, posteriormente, se añadió hasta 1 mm más, una solución de ácido bórico y se registró el espectro final. Debemos reseñar, que la espectrofotometría de ultravioleta no es una buena técnica analítica de identificación de biflavonoides y/o triflavonoides, sobre todo cuando estos están doblemente unidos (biflavonoides o triflavonoides macrocíclicos), ya que en este tipo de compuestos macrocíclicos se pierde la polaridad de la molécula y, por tanto, varía notablemente la respuesta del cromóforo frente a los reactivos usuales de la espectrofotometría de ultravioleta. Si un biflavonoide está formado por dos unidades monoflavonoidicas iguales, por ejemplo dos luteolinas en una biluteolina, esta técnica en cambio si es realmente válida, pues la respuesta de ambos monómeros es la misma y se pueden deducir algunos resultados acerca de su posible estructura. En el caso de los biflavonoides formados por dos monómeros flavonoidicos distintos, por 92 ) ejemplo una flavona y una flavanona, los resultados obtenidos por la espectrofotometría de ultravioleta provendrán de ambos monómeros, y en realidad se tratará de una mezcla de las respuestas procedentes de cada uno de ellos, por lo que no se pueden otorgar con rotundidad a ninguno de los dos monómeros en concreto. Por ello, el uso de la espectrofotometría de ultravioleta en la identificación y elucidación de estructuras flavonoidicas correspondientes a biflavonoides y triflavonoides, debe ser tratada con mucho cuidado. 4.2.2.3. Resonancia MaRnética Nuclear (RMN El uso de la RMN en la identificación de flavonoides es notable en la actualidad, no revistiendo mayor problema en el caso de los biflavonoides (Geiger, 1990). No queremos, sin embargo, extendernos demasiado en la explicación de esta técnica analítica, por existir publicaciones al respecto suficientemente contrastadas, algunas de ellas específicas de biflavonoides (Mabry & col., 1970; Agrawal, 1989; Markham & col., 1982 y 1987; Agrawal & Rastogi, 1981; Chan & col., 1977; Kalinowski & col., 1984; Markham & Mabry, 1975; Schilling, 1985; Gtinther, 1983; Clark, 1987; Markham & Geiger, 1993; Geiger & col., 1993a). No obstante, hemos creído adecuado el presentar algunos puntos concernientes a los dos tipos de resonancia magnética nuclear utilizados: H RMN y ‘3C RMN. En general, la metodología seguida es la que se relaciona en el Anexo 2, desde un punto de vista comparativo, para cada uno de los compuestos identificados en este trabajo, junto a la bibliografía antes reseñada. A. ‘II RMN. Resonancia Magnética Nuclear de Protón. Entre las aplicaciones típicas de esta técnica en la elucidación de flavonoides se encuentran: la definición del patrón de oxigenación de los tres anillos del flavonoide; la determinación del número y posición de los grupos metoxilo; la distinción entre isoflavonas, tiavanonas y dihidroflavonoles; la determinación del número de azúcares presentes y si están a o fi unidos y, finalmente, la detección de cadenas laterales hidrocarbonadas tales como metilos o prenilos C- u O- unidos (Markham, 1982). El espectro de ‘U RMN aparece predoniinantemente en el rango de 0-10 p.p.m., tomando como señal de referencia la del tetrametilsilano (TMS), arbritariamente definida como O p.p.m. Sólamente los protones producen señales (resonancia) en este rango y, protones químicamente idénticos son representados por la misma señal. El tamaño de ésta (integral) es proporcional al número de protones que representa. Así por ejemplo, una señal que representa un grupo -OCH 3 (metoxilo) integrará tres veces el valor de la señal que representa un solo protón (Markham, 1982). La posición de la señal en la escala 0-10 p.p.m., denominada “desplazamiento quinilco” define hasta cierto punto el tipo de protón que representa. Los protones correspondientes a los anillos A y B aromáticos del flavonoide aparecen representados en los valores 6.0-8.0 de la escala antes definida (ver Fig. 3.6. Pp. 21). En general, la cantidad de muestra requerida para esta técnica es mínima (5-25 mg), aunque 93 depende mucho del espectrómetro de trabajo. Una relación de los solventes más comunes utilizados es aportada por Markham (1982). Entre ellos, destacamos básicamente dos: el DMSO-d~ (hexadeuterodimetil sulfóxido) utilizado en nuestra investigación, que es un buen solvente para agliconas y glicósidos flavonoidicos; y tiene la ventaja de que en condiciones anormales, permite la detección de las señales correspondientes a los protones de los grupos -OH (Clark, 1987) y, por otra parte, el CCI4-TMS éter que, básicamente, consiste en convertir los flavonoides en sus trimetilsilil (TMS) éter derivados, solubles en CCI4 (tetracloruro de carbono), realizándose el espectro sin problemas. Así mismo, este segundo solvente cuenta con la ventaja añadida de existir un largo número de espectros comparativos de flavonoides TMS-éteres (Mabry & col., 1970). Un estudio contrastado y comparativo entre el uso de ambos solventes es expuesto por Clark (1987) y parcialmente por Mabry & col. (1970). De manera general podemos afirmar que el espectro de RMN de protón de los biflavonoides, se caracteriza por la existencia de dos picos sobre 13 ppm, y de uno sobre 12 ppm y otro sobre 13 ppm en el caso de los 2,3-dihidrobiflavonoides (Seeger, 1992). En el caso de los triflavonoides, generalmente aparecen 3 picos sobre 13 ppm (Seeger, 1992; Voigt, 1993). Estos picos que aparecen generalmente sobre 12-13 ppm corresponden a la señal del protón en posición 5 del grupo hidroxilo de una luteolina, ya que se establece un puente de hidrógeno entre este hidroxilo del anillo A y el correspondiente oxígeno en posición 4 del anillo C. La presencia de un sólo pico sobre 12 ppm indicaría que se trata de un flavonoide monomérico derivado de la luteolina. En el caso de los biflavonoides aparecen dos picos o señales sobre 12-13 ppm lo que nos indica la existencia de dos grupos hidroxilos libres en posición 5 en cada uno de los monómeros del biflavonoide. El pico existente en 5.4 ppm es típico del eriodictiol y, por lo tanto aparece en los biflavonoides con una unidad monomérica de flavanona. Las señales correspondientes a los protones de los anillos A y C generalmente se sitúan entre 6.1 y 6.7 ppm, mientras que los del anillo B llegan incluso a 9 ppm. Los protones del anillo heterocíclico, es decir del C, aparecen generalmente por debajo de 5.5 ppm. Así por ejemplo, y refiriéndonos a los protones del anillo B, se da el caso de que cuando éstos se encuentran sobre carbonos simétricos y no son hidroxílicos, caso de los protones en 3’ y 5’ ó de 2’ y 6’, las señales que aparecen son las mismas, por lo que los protones en 3’-5’ ó 2’-6’ aparecen en el espectro como sendos dobletes, generalmente sobre 7.0 ppm (J= 8 Herzios) (ver Fig. 3.6. Pp. 21). Los protones en C-6 y C-8 de flavonas, flavonoles e isoflavonas que cuentan con el típico patrón de sustitución 5,7-dihidroxi- quedan reflejados en el espectro de RMN por dos dobletes (J= 2.5 Hz) en el rango 6.0-6.5 ppm. El doblete para H-6 aparece a valores de ppm más bajos que la señal para H-8, debido al fuerte apantallamiento del oxígeno próximo al C-8. En flavanonas (algunos biflavonoides identificados en la presente Memoria Doctoral están constituidos por un monómero de flavanona) y dihidroflavanonas con 5,7-dihidroxi- sustitución como patrón, las señales para los protones del anillo A están situados a mayor rango (valores de ppm más bajos) que los correspondientes para flavonas y flavonoles (ver Fig. 3.7. Pp. 22). El único protón en el núcleo flavonoidico que ofrece una señal en la misma región del espectro que los protones en C-6 y C-8 de 5,7-dihidroxi- flavonas y flavanonas es el protón en C-3 de flavonas, que aparece como un singlete cerca de 6.3 ppm. Ocasionalmente sin embargo, los protones en C-3’ y C-5’ dan señales que también aparecen en esta región del espectro. 94 En flavonas con patrón 5,7-dihidroxilación los protones en C-6 y C-8 aparecen como dobletes (1= 2.5 Hz) y se distinguen bien del singlete del protón en C-3. Sin embargo, muchas flavonas tienen por ejemplo un único protón en el anillo A (pe. 5,6,7,- ó 5,7,8- con patrón de sustitución) y en estos compuestos el único protón del anillo A produce un singlete que está a menudo en la misma región del espectro que la señal para el protón de C-3 (ver Fig. 3.6. Pp. 21). En los flavonoides 3’,4’-oxigenados, tales como la luteolina y sus derivados (biluteolinas) con 3’,4’-diOH, el espectro resultante de los protones del anillo B es algo más complejo que en los flavonoides únicamente 4’-oxigenados. El protón en C-5’de flavonas y flavonoles 3’,4’-oxigenados aparece como un doblete entre 6.7-7.1 ppm (J = 8.5 Hz), y las señales para los protones en C-2’ y C-6’ sobre 7.2-7.9 ppm. Las posiciones relativas de las señales para los protones en C-2’y C-6’ pueden usarse para distinguir los 3’-metoxi-4’-hidroxi- de los 4’-metoxi-3’-hidroxi sustituidos en el anillo B de flavonoles, debido a los diferentes efectos de apantallamiento existentes de los grupos OHo metoxi- (ver Fig. 3.6. Pp. 21). Diferentes patrones espectrales son observados para isoflavonas, flavanonas y dihidroflavanonas 3’,4’-oxigenadas. Estos compuestos muestran un complejo multiplete (usualmente 2 picos), para los protones en C-2’, C-5’ y C-6’ en la región 6.7-7.1 ppm. Los cambios químicos para los protones del anillo B en estos flavonoides dependen claramente de si el protón está situado en posición orto- o para- respecto de una función oxígeno. En flavanonas 3’,4’-dioxigenadas, alguno de cuyos ejemplos se presentan en los biflavonoides identificados en la presente Memoria Doctoral, los protones en C-2’, C-5’ y C-6’ están en orto- o para- respecto del oxígeno sustituido y tienen por ello un desplazamiento químico similar (ver Fig. 3.7. Pp. 22). En los protones del anillo C existe una considerable variación en los desplazamientos químicos que se producen para los protones según el tipo de flavonoide que se trate. En todo caso, el espectro resultante dependerá del nivel de oxidación del anillo C. El protón en C-3 de flavonas muestra un singlete cerca de 6.3 ppm que usualmente se solapa con la señal producida por los protones del anillo A. La señal para el protón en C-2 de flavanonas aparece como un doble doblete (dd) o a veces como un cuadruplete (q) con J~,=5 Hz y J,~= 11 Hz, cerca de 5.2. ppm como resultado del acoplamiento del protón en C-2 con los 2 protones de C-3. Los protones de C-3 se acoplan cada uno con los demás (J = 17 Hz) en adición a la interacción spin-spin que ocurre con el protón en C-2. Los protones en C-3 aparecerán como dobles dobletes (dd) cerca de 2.8 ppm La señal correspondiente al solvente, el DMSO-d6, aparece normalmente sobre 2.6 ppm, por lo que no interfiere en la interpretación del resto del espectro. Las medidas del espectro de ‘H RMN se realizaron en un aparato Bruker AM 400 con una frecuencia de 400 MHz, a 25 0 C. (temperatura ambiente) tomando como solvente de referencia el DMSO-d6, siguiendo en todo momento las indicaciones de Salm (1992), Seeger (1992) y Voigt (1993). 3C de Así mismo, se realizaron espectros COSY (Correlated Spectroscopy) de ‘H-’H y ‘H-’ los Compuestos BP-1, BS-5A y BS-3 a 200 MHz de frecuencia y temperatura ambiente, en una aparato Bruker AM 400, con DMSO-d 6 como solvente de referencia (Geiger & col., 1993a). Los espectros COSY nos permiten establecer el acoplamiento existente entre los protones de una 95 determinada molécula (‘H-’H COSY), así como poder asignar ciertos protones a sus respectivos carbonos (‘H-’3C COSY). La estructura de los biflavonoides puede deducirse en la mayoría de los casos por sus espectros de ‘H RMN y ‘3C RMN, si existen asignamientos completos en la bibliografía, referentes a los monómeros que componen el biflavonoide. Sin embargo, esta posibilidad no siempre se produce, y en en el caso de los biflavonoides de musgos es frecuente. Es entonces, cuando se hace necesario establecer una correlación entre los espectros de ‘H RMN y ‘3C RMN, que nos permita asignar todas las señales registradas. Esta correlación se puede lograr mediante las técnicas de correlación C-H y H-H (COSY). Con el descubrimiento reciente de los triflavonoides en musgos, este tipo de técnicas analíticas supone una ayuda adicional e imprescindible en la elucidación estructural de tales compuestos (Geiger & col., 1993a). B. 3C RMN. Resonancia Magnética Nuclear de Carbono-13. La Resonancia Magnética Nuclear de ‘3C en el caso de los flavonoides, se aplica para el establecimiento del número total de átomos de carbono de la molécula, tanto de los carbonos oxigenados en el núcleo flavonoidico como del número de carbonos en el azúcar si éste lo hubiere; para la identificación de las uniones C- y O- por azúcares; en la determinación de los puntos de unión interglicosídicos; para la identificación de los acil sustituyentes y el lugar de acilación, y finalmente, en la determinación del lugar donde se presentan C-uniones (pe. en C-glicósidos, biflavonoides, etc.) (Agrawal, 1989; Markham, 1982). La abundancia natural del isótopo ‘3C es sólo del 1.1 %. La resonancia de ‘3C ocurre predominantemente en el rango 0-200 p.p.m. respecto del tetrametilsilano (TMS), pudiendo cada carbono representar una señal diferente. En contraste con la resonancia de protón, la intensidad de la resonancia de ‘3C no necesariamente refleja el número de carbonos que representa y, por ello, la integración del espectro de ‘3C es raramente de valor. En general, ambos tipos de RMN deben usarse conjuntamente para obtener resultados más acordes y con mayor facilidad (Geiger, 1990; Geiger & col., 1993a). Agrawal (1989), Chan & col. (1977) y Markham & col. (1982 y 1987) ofrecen un gran número de espectros de ‘3C RMN de referencia, como punto de comparación para numerosos estudios. La cantidad de muestra necesaria es igualmente pequeña, aunque algo mayor que para la resonancia de protón, pues basta con 20-50 mg (Geiger, 1990). Los solventes utilizados en general son los mismos que en la RMN de protón (Clark, 1987). Centrándonos en los biflavonoides, debemos decir que la mayoría de ellos cuentan con uniones carbono-carbono entre sus dos monómeros flavonoidicos, con el anillo A de uno de ellos al menos implicado generalmente en el enlace interfiavonoidico (Geiger & Quinn, 1975; Chan & col., 1977). La Resonancia Magnética Nuclear de ‘3C permite establecer la estructura química de los biflavonoides, así como de los átomos de carbono implicados en el enlace intenflavonoidico (Agrawal, 1989). En el biflavonoide, los cambios químicos que se producen en las señales de los carbonos implicados en el enlace interfiavonoidico, respecto a sus unidades monoméricas, suponen señales 96 situadas en un campo más bajo, es decir, valores de ppm más altos, aunque en general y en el resto de carbonos no se producen cambios químicos considerables. Así por ejemplo, algunas biflavanonas derivadas de la naringenina, tales como la binaringenina, poseen uniones C-C entre dos unidades de naringenina que pueden estar a o 13 orientadas. Debido a la unión interflavonoidica, la resonancia de C-3 se muestra entre 46.8 y 51.2 ppm, es decir, entre 3-7 ppm más altas respecto a la unidad monomérica de naringenina. Los cambios químicos en C-2 y C-3 dependen en sí de la orientación del grupo fenilo respecto de C-2 y del tipo de enlace interfiavanónico de que se trate. Excepto la sikokianina A, el resto de biflavanonas muestran 13 señales en su espectro de resonancia de 3C debido a la superimposición de las señales correspondientes a las unidades monoméricas. Las señales correspondientes a C-2 y C-3 de ambos monómeros tienen una absorción diferente e independientes a 81.3-83.1 y 49.4-50.8 ppm en biflavanonas con geometría cis-trans para C-2/C-3 y C-2”/C-3 (Agrawal, 1989). En el caso de las flavanoflavanonas, es decir, biflavonoides formados por una unidad monomérica de flavona y otra de flavanona, los espectros de ‘3C resuftantes son sumamente variados dependiendo de la naturaleza química de ambos monómeros. Agrawal (1989) sumariza numerosos ejemplos al respecto de los cambios químicos que se producen en los diversos subtipos de flavanoflavanonas así como de otros biflavonoides (ver Fig. 3.7. Pp. 22). Respecto a las biflavonas, biflavonoides cuyas dos unidades monoméricas son flavonas, ocurre lo mismo que en el caso anterior, ya que las posibilidades de unión interflavonoidica son variadísimas. Así por ejemplo, la señal correspondiente a los átomos de carbono implicados en el enlace interfiavonoidico en la agatisflavona (8,6”-biapigenina) y en la cupresoflavona (8,8”-biapigenina), aparece sobre 103.6 y 99.4 ppm en la agatisflavona y 98.7 ppm en la cupresoflavona. La resonancia para C-8 de ambas unidades monoméricas de flavona en los casos descritos, se muestra a 100.0 y 102.0 en el caso de la 4,4” ‘-diO-metil-cupresoflavona. Otra subcategoría de biflavonas poseen uniones C-C entre los carbonos C-5’ ó C-6’ de una flavona y C-6 ó C-8 de la otra unidad de flavona. En este grupo de biflavonas se encuentran la robustaflavona (identificada en Selaginella spp. por López-Sáez & col., 1994 a, b y c) y la 5’,3”’diOH-robustaflavona (identificada en musgos, ver Anexo 2) que pertenecen al tipo de unión interfiavonoidica 5’-6”. La señal correspondiente al carbono C-5’ en ambos compuestos absorbe a 120.8 y 120.2 ppm respectivamente (Agrawal, 1989). La señal para C-6 aparece sobre 103.5 ppm en la robustaflavona y sobre 108.9 en la 5’,3”’-diOH-robustaflavona (Agrawal, 1989). Por su parte, la amentoflavona y la 5’ ,3”’-diOH-amentoflavona (5’,8’ ‘-biluteolina) son biflavonas que presentan una unión interfiavonoidica del tipo 5’-8”. Las señales de resonancia para C-5’ y C-8” aparecen a 123.1, 105.2 y 123.7 y 105.3 respectivamente (Geiger & col., 1987). La señal para C-5’ en la 5’,8’ ‘-biluteolina, aislada e identificada en musgos, absorbe a 120.6 ppm (Osterdahí, 1983; Geiger & col., 1987). Una comparación entre los cambios químicos ocurridos en las señales correspondientes a los carbonos del anillo B de dichas biflavonas, con respecto a sus unidades monoméricas de referencia, revela un aumento en los valores de ppm del orden de 3-5 ppm para C-5’ debido al efecto del enlace interfiavonoidico (Agrawal, 1989) (ver Fig. 3.7. Pp. 22). Unicamente hemos pretendido mostrar algunas de las características fundamentales que 97 muestra la RMN de ‘3C de los biflavonoides, de ahí que hayamos elegido el centrarnos en los derivados de amentoflavona y robustaflavona, por ser éstos los que básicamente se presentan y se han identificado en musgos. Para finalizar, diremos que las medidas del espectro de ‘3C RMN se realizaron en un aparato Bruker AM 400 con una frecuencia de 100 MHz, a 250 C (temperatura ambiente) usando como solvente el DMSO-d 6, siguiendo en todo momento las indicaciones de Salm (1992), Seeger (1992) y Voigt (1993). Del Compuesto BS-SA se realizó además un espectro DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) en un aparato Bruker Gerát a 200 MHz de frecuencia usando el solvente DMSO-d6, a temperatura ambiente. Este tipo de espectro permite distinguir el tipo de carbono (cuaternario, terciario, secundario o primario) que estamos estudiando, desdoblando las señales respectivas a cada tipo de carbono respecto del espectro general. 4.2.2.4. Espectrometría de Masas (E.M. El empleo de la EM como técnica analítica es de reciente introducción, ya que es a partir de 1960 cuando se establecen sus pautas de utilización, habiendo revolucionado las investigaciones en el campo de los productos naturales a partir de ese momento (Harborne, 1984). El valor de esta técnica es que únicamente requiere microgramos de la muestra problema para llevarse a cabo (Harborne, 1984; Markham, 1982). En esencia, nos permite determinar el peso molecular, establecer la distribución de los sustituyentes en ambos anillos A y B del flavonoide y determinar la naturaleza y lugar de unión de los azúcares en los flavonoides C- y O- glicosilados (Markham, 1982). Un espectro de masas de un flavonoide consiste en una serie de señales, cada una de las cuales representa un fragmento cargado procedente del flavonoide “inicial” o “problema”, siendo el espectro el resultado de un impacto de electrones originado con el espectrómetro. Las señales son expuestas en una serie de líneas sobre un papel cuadriculado o bien de forma numérica, y ordenadas acorde a los valores de m/z (peso molecular por unidad de carga) de los fragmentos que representan. En el espectro de masas, la intensidad de la señal es proporcional a los niveles de carga individual de los fragmentos producidos por el impacto electrónico. La señal de mayor intensidad es el pico base, asignándosele el 100% de intensidad, estando el resto de señales referidas porcentualmente respecto de ésta. Markham (1982), Mabry & Markham (1975), Harborne (1984), Audier (1966), Domon & Hostettmann (1985), Howe & Jarman (1985), Schréder (1991), Wollenweber & Dietz (1979) y Geiger & Schwinger (1980), aportan suficiente bibliografía sobre la metodología a seguir con esta técnica en el caso de los flavonoides, así como la interpretación de sus espectros. En nuestro trabajo nos hemos basado metodológicamente en las referencias anteriores y en la expuestas en el Anexo 2 para cada compuesto en particular desde un punto de vista comparativo. De acuerdo a Geiger (com. per.) el EM de impacto de electrones no es tan exacto para los 98 — biflavonoides como el FAB modus (Fast Atom Bombardment con átomos de xenon) de ahí que optáramos por el segundo método (Fenselau, 1984). La técnica FAB-EM permite, a diferencia de la EM por impacto de electrones, poder analizar mediante espectrometría de masas isótopos estables y. cuantificar y cualificar la mezcla de ellos. En esencia, la técnica FAB consiste en que la muestra es presentada en una matriz líquida de baja volatilidad, que es “bombardeada” mediante un flujo relativamente alto de partículas neutras tales como átomos de argon o xenon (Fig. 4.9. y 4.10.). WPS—Erl ~n a 1 i r actor~ P~ar-ita1 la E ~r ~ .L—. 7 muestra Fig. 4.9.: Esquema de la técnica FAB-EM. o /7 glicetol Fig. 4.10.: Representación esquemática de la matriz líquida. Los espectros de masas se realizaron en un aparato MAl 90 de Fa. Finnigan, en Modo Negativo (“Negative Modus”) excepto para BP-1 que también se utilizó el Modo Positivo, siguiendo las indicaciones de Domon & Hostettman (1985), Fenselau (1984), Seeger (1992) y Salm (1992>, mediante el método de ionización FAB realizado sobre una matriz de glicerina o de glicerina-metanoi con xenon (1-5 >d, FAB-Target, 4-8 KeV) (Schróder, 1991). En el modo positivo, cada señal representa [M + 111¼mientras que en el modo negativo es [M - Hf (Fenselau, 1984). En el caso del Compuesto BS-3 (Compuesto X), las medidas se realizaron sobre un Analizador de Masas de Lasa Micropore (LAMMA) sobre una matriz de ácido nicotinamídico (Voigt, 1993). La pobre solubilidad del Compuesto X en los solventes más comunes, incluso en el 99 DMSO-d6, nos impidió obtener el espectro de masas (FAB-MS) correspondiente en las matrices de trabajo usuales (glicerina o glicerina-metanol). Por ello, y de acuerdo a lo expuesto por Seeger & col. (1993b) utilizamos para el Compuesto X una matriz sólida de ácido nicotinamidico, obteniendo el espectro de masas correspondiente en un analizador de masas bajo un modo diferente, mediante ionización inducida por laser (LAMMA-espectro). 4.2.2.5. Hidrólisis Acida La hidrólisis ácida permite romper los flavonoides-O-glicósidos por el enlace glicosídico establecido entre el flavonoide y la molécula de azúcar. El tiempo que tarda en ocurrir la hidrólisis en cada glicósido depende estrechamente de la naturaleza del/los azucar/es que lleva unido. Así se establece un orden de más a menos tiempo de ocurrencia de la hidrólisis, según el azúcar sea el glucurónido» glucósido = galactósido » rhamnósido. Los flavonoides C-glicosilados no se hidrolizan con esta técnica. La metodología seguida es básicamente la aportada por Markham (1982) y McClure & Miller (1967). Se realizó sobre la muestra del Compuesto VI, previamente aislado y purificado (10 mg). Los 10 mg del compuesto problema (Compuesto VI) se disolvieron en 30 ml de ácido clorhídrico 2 N (preparado con 5,8 mí de ClH 10.5 N y 24,2 ml de I~I2O), y se añadieron unas gotas de metanol para facilitar la disolución. A continuación dicha solución se sometió primeramente a una hidrólisis en caliente de 2 horas, a reflujo, y trascurridas éstas, se extrajeron pequeñas alicuotas para cromatografiarlas en TLC. Estas, fueron previamente disueltas en un mismo volumen de éter etílico para remover el agua. La fase acuosa fue eliminada, mientras que la etérea (una vez eliminado todo el agua restante con SO4Na2) se llevó a sequedad y disolvió en unas gotas de metanol 80% y se cromatografió. La misma solución inicial, sin retirarla de la fuente de calor, permaneció otras 2 horas a reflujo, hasta un total de 4 horas de duración de la hidrólisis, tras lo cual se extrajeron igualmente nuevas alicuotas, con las que se siguió el procedimiento antes descrito, siendo posteriormente cromatografiada la fase etérea correspondiente a la hidrólisis a las 4 horas. Las dos submuestras así obtenidas: H-2 (procedente de la hidrólisis a las 2 horas) y H-4 (hidrólisis a las 4 horas) fueron posteriormente cromatografiadas en TLC en los sistemas cromatográficos acético 15%-celulosa y TBA-celulosa en mono y bidimensional (ver Pp. 136-137). De acuerdo a Markham (1982): Si la hidrólisis ha ocurrido, se deberá observar una reducción del Rf, si se trata de un flavonoide 0-glicósido, o menos comúmnente, si está bisulfatado o se trata de un O-glicosilado-C-glicósido. En caso de no producirse hidrólisis, el glicósido es un C-glicósido o posiblemente el azúcar sea un glucurónido. Bien puede darse el caso de que el flavonoide no esté glicosilado, con lo que tampoco debería producirse hidrólisis. Si la hidrólisis es parcial, es muy posible que el azúcar sea un glucurónido, ya que como antes se ha indicado, son los flavonoides que se glicosilan con dicho azúcar los que necesitan mayor tiempo de hidrólisis. Por ello, habría moléculas totalmente hidrolizadas y otras no, de ahí que la hidrólisis sería parcial. - - - 100 4.3. Actividad Biológica Se realizaron ensayos de actividad biológica, concretamente anti-VIH, de los compuestos previamente identificados en esta Memoria Doctoral, de ¡os que se dispuso de cantidad suficiente (Tabla 4.2.). Seguimos el método descrito por Lee & col. (1981), así como las referencias y recomendaciones aportadas por Banerjee & Sen (1979), Van Hoof & col. (1980 y 1981), Zehr (1990) y leven & col. (1979) respecto a actividad antifúngica y antibacteriana; y Vanden Berghe & col. (1978 y 1986), más las indicaciones propuestas por Van Hoof & col. (1980 y 1981). para la actividad antivírica. Debido a que el método propuesto por los anteriores autores se refería principalmente a ensayos contra los virus de la polio y herpes, creímos conveniente, dado que tratábamos con el virus del SIDA, introducir ciertas modificaciones metodológicas de acuerdo a los postulados de Biotech Research Laboratories (Dr. Lee, com. per.). Así mismo, se utilizaron en los ensayos otros flavonoides monoméricos y biflavonoides, que tomamos como patrones de referencia, por lo general también aislados de musgos, pero de familias botánicas distintas a la que es objeto de estudio en esta Tesis Doctoral. De esta manera, tales compuestos nos sirvieron como punto de comparación para delimitar la importancia de la estructura química en la actividad biológica correspondiente (Selway, 1986) y, a su vez, por existir en ciertos casos referencias bibliográficas concernientes a ellos, contribuyeron a completar profundamente el estudio de actividad biológica emprendido, dada además la gran escasez de investigaciones en este sentido existentes. Tabla 4.2.: Relación de Compuestos en los que se ensayo actividad anti-VIH. MUSIXtÁ PÉOCflSNCIÁ Filonotisflavo Bartram¡a pomifo 2 5’,3”’-diOH-robustaflavona Baríramia ha//enana 3 Dicranolomina Bartramia stricta 4 2,3-dihidro-filonotistiavona Bartranna ¡thyphylla 5 Hartramiafiavona Bartramia pomiformis 6 5’,3”’-diOH-amentoflavona Bartramia siricta 7 Ciclo-Triluteolina Bartramia stricto 8 Amentofiavona Setaginella denticulata 9 Saponarina Ptagiomnium cuspidatum lO Quercetina Patrón Comercial 11 Luteolina-7-O-neohesperidosido Dicranum scoparlum 12 Lucenina-2 Hedwigia culata 13 Apigenina-7-O-triglieósido Dicranum scaparzum 14 Isoorientina-3’-O-soforósido Plagiomnium cuspidatum 15 Friodictiol Patrón Comercial 101 En todos los casos, se necesitaron siempre 10 mg de partida de cada una de las muestras puras, aisladas de musgos o de procedencia comercial (Fa. Roth., Alemania), en los ensayos amiVIH. que posteriormente fueron ensayadas a diversas concentracciones. Numerosos flavonoides de origen natural poseen actividad antiviral (Beladi & col., 1965 y 1977; Borel & col., 1976; ~utting & col., 1949 y 1953; Guttner & cok ¡982; Selway, 1986). y su existencia y funcionalidad se conoce desde hace más de 40 años. En estos últimos años, el desarrollo de una quimioterapia viral evolucionada, camina en pos de la síntesis en laboratorio de estructuras flavonoidicas, con una actividad antiviral superior a la de los flavonoides de origen natural. Chalconas, flavanos y flavonas son por el momento los flavonoides básicos en los que se están intentando conseguir derivados sintéticos activos contra virus (Van Hoof & col., 1984a y b; Selway, 1986). Por el momento no se conoce actividad anti-VIH de chalconas ni flavonas, pero si se sabe de ciertos flavanos activos contra algunos serotipos rinovirales in vitro (Bauer & col., 1981) así como de la actividad antivírica de otros tipos flavonoidicos (Vanden Berghe & col., 1986; Veckenstedt & Pusztai, 1981; Vrijsen & cal., 1984). Para poder establecer un punto de comparación entre nuestras muestras y otros tratamientos ya iniciados contra el SIDA, se utilizó como patrón de referencia el DDC o ddC, ya que éste es el que usan los Biotech R. Laboratories, quienes realizaron los ensayos anti-VIH a partir de las muestras aisladas en la presente Memoria Doctoral. Las iniciales UDC corresponden a la abreviatura de la dideoxicitidina, que es un Inhibidor de la Transcriptasa Inversa (enzima vírica que permite la transcripción del ARN vírico a AUN). Esta es una de las tres drogas que en la actualidad se usa con más frecuencia en el tratamiento de infecciones por SIDA en el hombre, junto a otros inhibidores de la transcriptasa inversa tales como el AZT y el flUí o ddl (dideoxiinosina), a las que ya nos referimos con anterioridad en el apanado de Antecedentes y cuyas estructuras quedan reflejadas en laFig. 4.11. Oh .iN.) no 1NJ.LMJ ti Nt-it ti CfriuA Cti~ U~ ti Njtl Avaid A!! oti NH H,C’S) 1 SCJ NaO,S~ SO,N. 4N. Fig. 4.11.: Estructura molecular de algunas drogas utilizadas en el tratamiento del SIDA. 102 La Tabla 4.3. presenta un relación de las principales drogas que causan inhibición de la replicación del VIH-1 (Sarín, 1988). Tabla 4.3.: Drogas inhibidoras de la replicación del VIH-1. ~‘O51BLS MODO ~ ACCiON Ava,oUAvsrona Agliatana al VIH 1 e Impide su líberlad Foacanaet Inhibidor de la 1 ranacríptasa Inversa Suramina Inhibidor de La Tranacriptasa Inveraa AZT Inhibidor de la Tranacriplasa Inversa, fmaíiza la cadena de ADN Ribavarina Bloques al ARNrn Dídeoxyeitíduaa (dde) Inhibidor de la Tranacriptasa Inversa, finaliza la cadena de ADN Análogos de la Amfoteríc,na Unen el coleaterol a la Cnwaella del Vll-l-l Por el momento, y gracias a la inestimable ayuda de los Dr. K.H. Lee y Dr. Yoshiki Kashiwada (Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, U.S.A.), pudimos ensayar las muestras flavonoidicas procedentes de musgos frente a la droga control DDC en los Biotecb Research Laboratories (A Boston Biomedica Company, Rockville, Maryland, U.S.A.). Se utilizaron en su caso, diversas concentracciones de la droga patrón (ddC) hasta encontrar el momento en que se producía una supresión completa, lo que era indicativo de que el sistema de ensayo que se iba a utilizar era el correcto. Una vez establecido el sistema de ensayo mediante el patrón ddC, se procedió a ensayar cada una de las 15 muestras flavonoidicas reflejadas en la Tabla 4.2. El método de ensayo elegido fue un método de tipo ELISA para detectar un antígeno virico en el suero o en un cultivo de células libres en suspensión, concretamente el antígeno p24. A. Medio de Cultivo. Los cultivos celulares se llevaron a cabo en un medio muy similar al propuesto por Geran & col. (1972) y Vanden Berghe & col. (1978 y 1986). Básicamente, se llevaron a cabo cultivos en placa de Petri, en forma de monocapas de células en crecimiento, en las cuales se inoculaban diluciones diversas de una suspensión viral (VIH-1). Después de la absorción de las partículas infecciosas de virus por las células huéspedes, las monocapas eran cubiertas con un medio que contenía agarosa, de tal forma que las nuevas partículas víricas formadas pudieran ser localizadas en la sobrecubierta de agar sólido. Las partículas de nuevas formación procedían lógicamente de las células en cultivo inicialmente infectadas que infectaron a sus adyacentes, y que al cabo de cierto tiempo sufrían un proceso de degeneración fruto de la actividad vírica. Estas áreas de células muertas, que se denominaron “placas”, eran visualizadas mediante tinción de la monocapa celular con un colorante “vital” como el rojo neutro (Vanden Berghe & col., 1986). Las placas que no absorbían dicho colorante aparecían como zonas no teñidas. Por regla general, una placa procede de una única partícula infecciosa, de tal forma que éste es un buen método para calcular la tasa de reproducción de las partículas víricas originales. Dichas placas pudieron así mismo detectarse microscópicamente, mediante determinación de células multinucleadas o por inmunofluorescencia. 103 No pudimos, sin embargo, disponer de más información al respecto de dichos métodos de cultivo y detección de las partículas víricas, por ser propiedad intelectual de los laboratorios antes mencionados. De hecho, se ha logrado cultivar el VIII en cultivo celular y se obtiene por lo general. suficiente cantidad como para fabricar antígenos para las pruebas de laboratorio, pero su cultivo no está al alcance de la mayoría de los laboratorios clínicos, y aquellos que han desarrollado un método de cultivo lo tienen lógicamente patentado. Debido a que se nos brindó la oportunidad de ensayar los flavonoides aislados en esta Memoria Doctoral, frente al virus del SIDA, preferimos en cualquier caso acometer tal investigación. 8. El antígeno pU. El virión del HTLV-III (VIH) es una esfera que transversalmente mide unos 1000 angstrom (ver Fig. 4.12). La panícula está recubierta por una membrana, formada por dos capas de material lipídico, que procede de la membrana externa de la célula hospedadora. De la membrana sobresalen ciertas glicoproteinas a modo de protuberancia, formadas por dos componentes: una primera proteína (GP-120) que sobresale de la membrana, que aparece anclada en una segunda proteína (GP-41) que la atraviesa de un lado a otro. Cada protuberancia consta de 3 series de moléculas proteínicas. La envuelta lipídico-proteinica antes nombrada, engloba al “núcleo” del virión, formado por dos nuevas cubiertas proteínicas, una exterior (pis) y otra interior (p24). En su interior se encuentran, además, el ARN virico y la enzima retrotranscriptasa. Biotech Research Laboratories y muchas otras compañías biomédicas, han desarrollado y establecido un Método ELISA para la detección del antígeno p24 en el suero o cultivos celulares, que es el que nosotros seguimos. Fig. 4.12.: Virién del VIH-1. 104 C. El método o test ELISA. Este tipo de prueba, por regla general, pone de manifiesto la presencia de los anticuerpos producidos por el organismo como reacción frente a la existencia de diversos antígenos de origen virico como puede ser la proteína p2’t. La metodología que se sigue en este caso se denomina “indirecta’, ya que no se detecta directamente el virus sino los anticuerpos producidos, mediante una reacción química coloreada al formarse el complejo antígeno-anticuerpo. Para ello, lo que normalmente se realiza es poner en contacto el suero de un paciente posiblemente portador del VIH con sus anticuerpos respectivos, con una solución provista de microcúpulas que contienen el antígeno vírico correspondiente. De esta manera, si el suero contiene anticuerpos contra el virus del SIDA, éstos se unirán al antígeno formando un complejo antígeno-anticuerpo, que por medio de una reacción química se colorea y nos permite deducir que se trata de una persona portadora. Si el medio permanece incoloro la prueba lógicamente es negativa y se trata de una persona sana. La intensidad de color, generalmente, es proporcional a la tasa de anticuerpos presente. El método ELISA que seguimos, propuesto por Biotech Research Laboratories, consiste en utilizar poblaciones celulares de una línea concreta de linfocitos T, conocida como células 119 (Mitsuya & Broder, 1986; Perno & col., 1988; Baba & col., 1987; Balzarini & col., 1991). La línea H9 es una línea clónica de linfocitos T que, permite la replicación del VIH, pero es parcialmente resistente al efecto citopático, por lo que el cálculo de la concentración del antígeno p24 en ellas, es un índice que permite medir la infectividad viral y la replicación (Popovic & col., 1984). Se utilizaron dos poblaciones de células H9 distintas: unas que fueron tratadas con diversas drogas (flavonoides y ddC patrón) y otras no, pero ambas infectadas con VIH. Ambas poblaciones se llevaron a cultivo, y en el caso de las tratadas, con distintas concentraciones de droga <100, 20, 4 y 0.8 gg/ml) así como con el propio medio (control). Después de 4 días de cultivo, se recogió el sobrenadante que contenía las partículas víricas libres en suspensión. A éste se le añadió un detergente, que permitía romper la cubierta del virus, dejando libre la cápsula proteínica del núcleo del virión. De esta manera la proteína p24 podría ser liberada por las partículas víricas tras las lisis celular, y ser detectada mediante el test ELISA por inmunofluorescencia (Mitsuya & col., 1984 y 1987; Perno & col., 1988). La detección del antígeno p24 se llevó a cabo mediante un método indirecto como cuantificación de la cantidad existente del virus, que sin embargo es del todo fiable y aceptable. Por cada ensayo se utilizaron 5 cultivos para cada concentracción de droga y 5 control. D. Medidas de actividad. DA. Porcentaje medio de p24 (% p24): esta primera medida viene referida a la concentración del antígeno p24 en los cultivos celulares infectados tratados en relación a los no tratados. Los Biotech Research Laboratories nos facilitaron únicamente su significado biológico, pero no la manera de llevar a cabo su cálculo matemático. De acuerdo a ello, se establecieron 3 niveles de efectividad de la droga: 1) 2) 3) * ** *** valor de % p24 entre 50-69% valor de % p24 entre 25-49%. valor de % p24 menos del 25%. 105 La droga patrón ddC pertenecía al nivel de efectividad ***, por lo que ha de ser una droga sumamente eficaz. Lógicamente, el valor de esta medida, si la droga es efectiva al menos inhibiendo la replicación del virus, será siempre menor en aquellos cultivos celulares tratados con agentes de ensayo (muestras flavonoidicas) que en los no tratados, pudiendo llegar a ser negativo según los resultados que nos fueron facilitados. Podríamos pues afirmar que, mientrs más bajos sean los valores del % p24, incluso negativos, más efectiva es la droga. D.2. Valor de CC50 (concentración citotóxica): este valor se refiere a la concentración del agente de ensayo o droga que inhibe el 50% del crecimiento de las células que no habían sido previamente infectadas con VIH. En realidad, es una medida de la toxicidad de la droga. Podría ser un error considerable considerar que la muerte celular es debida a la replicación vírica, cuando se debe realmente a la droga ensayada, de ahíla importancia de este valor (Bauer & col., 1981). También se conoce este valor como 1C50. Desde un punto de vista terapeútico, interesa que este valor sea lo más alto posible, es decir, que la droga pueda ser tóxica a concentracciones muy elevadas. D.3. Valor de EC~: valor que se refiere a la concentracción de la droga que inhibe la replicación del virus en un 50%. Su cálculo se lleva a 24 cabo mediante gráfica, a travésdedeuna Ja (Balzarini & una col.,determinación 1991). Se trata en realidad reducción la producción antígeno medida de en la actividad de ladel droga. Desdep un punto de vista terapéutico, lo que interesa es que este valor sea lo más bajo posible, es decir, que se inhiba la replicación de virus con la concentracción de droga más baja posible. DA. Indice Terapéutico: este índice se establece por regla general, de acuerdo a una droga patrón así como respecto a una línea celular concreta. Por ello, cada laboratorio lo establece independientemente de acuerdo a ambos factores. Así por ejemplo, el indice terapéutico del AZT considerado en el Instituto de Química Médica (CSIC, Madrid) es de 2.000 (Dra. Ana San Félix, com. per.), mientras que nosotrosutilizamos el establecido por los Biotech Research Laboratories con el valor de 25.000 en referencia a la droga patrón ddC. En cambio, Baba & col. (1987) consideran un índice terapeútico para el ddC de 616, pero utilizan cultivos celulares de células MT4 y no H9 como nosotros. En cualquier caso, se puede afirmar, que un compuesto puede considerarse que tiene actividad antiviral, siempre que su índice terapeútico sea mayor de 10 (Dra. Ana San Félix, com. per.). Es decir, una droga tendrá un indice terapeútico notable siempre que logre inhibir la replicación del virus con una concentracción muy baja (EC 50) que sea tóxica solamente a concentracciones muy altas (CC50). Se calcula pues, a través del cociente entre la toxicidad del producto (CC50) respecto a su actividad (EC50). También se conoce con las siglas 1.5. (Indice de selectividad) y lo que viene en resumen a ofrecer es una medida de la “seguridad” de la droga. D.5. Porcentaje medio de supervivencia celular: es el cociente entre el número de células que sobreviven en los cultivos infectados y tratados con droga frente al número de células totales de cultivos no infectados (calculado en 1.59 millones). D.6. Toxicidad de la droga: mide el limite de supervivencia celular frente a una determinada concentracción de droga. Se considera que una droga no es tóxica cuando sobreviven más del 70% de las células en cultivos controles que no estaban infectados. Si se produce una muerte celular superior al 70% del total de células se considera que dicha concentración de droga es tóxica. 106 t~ ]RTR~ES1UIWLLLD©~? 5.1. FLAVONOIDES En primer lugar se presentan los resultados correspondientes a las cromatografias bidimensionales realizadas en un total de 79 especies de la familia Bartramiaceae, excluidas las 4 especies objeto central de esta Memoria Doctoral. En dichos ensayos, se refleja mediante la simbologia anexa la identificación tentativa de algunos de los biflavonoides más representativos. En segundo lugar, se relacionan los resultados cromatográficos de las 5 especies estudiadas en profundidad en la presente Memoria doctoral (4 Bartramiaceae y 1 Dicranaceae) indicándose también la posición en las cromatografías respectivas de cada uno de los compuestos identificados tanto en TLC como en HPLC. Posteriormente, se presentarán los resultados correspondientes a cada uno de los compuestos aislados y/o identificados en este trabajo: TLCs, UV, EM y RMN. Dado que gran parte de los compuestos identificados lo fueron a su vez en todas o la gran mayoría de las cinco especies estudiadas, hemos preferido presentar únicamente los resultados de cada uno de los compuestos, generalizando éstos para todas las especies, con el único fin de evitar un exceso de reiteración en los resultados. Así por ejemplo, el Compuesto 1 correspondiente a la 5’,3’’’dihidroxi-amentoflavona, fue identificado en todas las especies estudiadas (Bartramia pomiformis, B. hatieriana, B. stricta, B. ithyphylla y Dicranumscoparium). Con el fin de evitar la presentación cinco veces de los espectros de EM, UV, 3C RiMN y 1H RMN, correspondientes al compuesto en sí aislado de cada una de las especies nombradas, lo cual creemos innecesario, hemos preferido presentarlos unitariamente, pero eso si, estableciendo la relación existente entre el Compuesto 1 y el correspondiente en cada una de las especies. Los mismos comentarios pueden aceptarse para el resto de compuestos identificados y/o aislados en este trabajo. En los espectros de ultravioleta de cada uno de los compuestos, se indican: de un lado la longitud de onda que viene reflejada en nm sobre el eje de abscisas y, de otro la intensidad en amstrongs sobre la vertical o eje de ordenadas. En las tablas correspondientes a los espectros de H-RMN y 3C-RMN las constantes de acoplamiento vienen reflejadas entre paréntesis. Junto a cada valor de ppm quedan, en ocasiones, indicados mediante la siguiente simbologia, los desdoblamientos de los picos correspondientes a cada señal: s, singlete; d, doblete; t, triplete; dd, doble doblete; q, cuadruplete y m, multiplete. 107 5±1.Análisis mediante TLC de la familia Rartramiaceae Schwaegr. Como ya se ha comentado anteriormente se estudió mediante cromatografía en capa fina, la composición flavonoidica de 79 especies pertenecientes a la familia Bartranuiaceae, correspondientes a un total de 8 géneros: Anacolia (5 especies). Bartramia (14 especies sin incluir las 4 que son objeto central de la Memoria Doctoral), Breutelia (23), Catoscopium (1), Conostomum (6), Lelomela (4), Philonotis (25) y Plagiopus (1). Los sistemas 2D-TLC elegidos fueron respectivamente Z1-Z3 en celulosa (C) y P1-P2 en poliamida-6 (P6) (ver Pp. 77-78). f1 y f2 representan los frentes de desarrollo cromatográfico en cada una de las dimensiones. A continuación se presentan las cromatografías bidimensionales, respectivas a las 79 especies referidas, en ambos sistemas cromatográficos. La tabla que se anexa a continuación, representa toda la simbología utilizada en los resultados obtenidos en las 158 cromatografías bidimensionales. Tabla 5.1.: Simbología utilizada en las ThC5 respectivas. t COLOkBS t CÓMMJES!OS A, amaríllo ciar a, Anhídrobartramiaflavona Af, amaríllo fluorescente b, Bartramíaflavona Am, amarillo oscuro c, Dicranolomina AN, amarillo anaranjado d. 2,3-dihidro-filonotisflavona f, Filonotisílavona Azf, azul fluorescente It, Filonotisflavona y/o Dicranolomina r, 5’,3”’-diOH-robustat’lavona O, gris 1,5,3” ‘-diOH-amentoflavona Mc, marrón claro tr, 5’,3”’-d¡OH-amentoflavona y/o 5’,3”’-diOHrobustaflavona NC, naranja claro .:3~;T~ ddIM NO, naranja oscuro Línea continua, observable UV R, rojo (con el tiempo) Línea discontínna, observable sólo con NA VC, violeta (púrpura> claro 4. Sutomas 0ronmtográ&os tvw ~ Ve, verde C, celulosa, fi frente TBA, V frente AcOlzt 15% VeA, verde amarillento P6, poliamida-6: fi frente AWE, 12 frente STAHL 108 fltl4nacnlía .webbii C ® ®: ‘ /ni O .4 9 Á.4&..., flt4nacolia menziesíi ~‘t) 7f~t 6 — ‘401k, 4r~ ¡b.~ 4 £2 (4 t l4nacolia subsessilis ~LlA 5Ñ 3 0 ~72 -f~ X’\,J NJOIAÑ -r Q Q Ans/&~ f2 f2 u’ tt 1 Anacolia JaevisphaerajP6 -1 -‘7 £2 flAnacolia intertexta C gk@ ~ -e QN.4~., ¡ -/>~(~Iflo 00t b&~/Ki >~<~t~~r ~ 9 ÓMC/M, .4 £2 1 ffl Bartramía rosea CI) r 1. o VCMu¶, 0twsMn, O fil Bartramia rosea -~-o Ve/NG -1k V01An ‘«IV. P6 ~ VC I~’•~’~ ? VotqO ¡ t O A*,I~r, 9 ‘e hE £2 1 fi Bartramia papillata O fltnartramia papillata PE —-e ,q -f gobio 4$. :yA~ ~4/And,/ ‘~ ~ ~ 1OYGIA<, £2 ti, Bar tramia mossmanniana O 1 O O~¡Me Q 1~”~ k) -/An~i -I ‘Jo, o g ‘Nc go ¡go NCI A>, 1CL>..~ £2 fi? Bartramia mathewsii ¡~¿1 .~ .. <41’ Bartramía ¿nassmanniaflap6 O . -‘ 9Aft’ -‘7 12 £2 st Bartramia angusti toIiaC cg? Bartramia angusti toliaPój -/ kv. 00 — u (?) -I At Axs~ 2. :1 ‘-en Q -- -~/ £2 fi Bartramia rufescene O te.— dAa VC/AÑ ‘de IAg .1 -I Q Ai Art/Am -‘1 £2 fil Bartramia patens O ‘Jc/AW ~ ~oJM4 -/ !sN Q %tIU £2 O 1.,.,.. OA4~A4 O&~M-~~ £2, cli, ti c. <4 Bartramia runenzoriensis £2 fltfiar- traía patosica O fltBartramia potosica Pó cf -1 c A’ r t -He. 9~I&n~ -~ £2 £2 ~e 4 II fi .Bartramia vulcaníca E £2 t fi Bartramia pruinata O Bar tramia pruin~2ta PÓ 1~’ sr 9 ~M ~ (144 e- -9 MLj>.., U O r’(= .9— -t £2 A.” O £2 4 a st <4 4$ f1¶Breutelia chrysea O .2~ -, A.’ 7Am ->2 f2 PÓ flfBreutelia chrysea 1’ Go (2 “.—‘ MO Gd’IA. ¡Am —~ £2 it Br0utelia tomentosa ‘e.’ t:AN c Oit g A”” Kb, ¡Alt. A.’ ¡u ij f2 fi Breutelia stuhlmanniit Qvc 1k.’ Q Q ‘¿¿Nt O~ -‘7 £2 ¶ fi Breutelia pendula ~ QA.’IA.’ 0 ,e—, O>AxZ ~ Nc. O‘Je ¡>.s, Din lAv,~1 O O\ o ~ ¿zt O f1¶Breutelia pendida PÓ e’ • — —I “‘ ‘—e ‘e ~ e £ £2 ‘ ‘SI -IA.. it.. £2 -~ 4! fi Breu tejía 4 fi mniocarpa’C Breutelia avnniocarpa —/ Ai st .-e-~ O lAn pdO 9 I&¶ ~L lA’,, -n £2 fl¶ Bren tejía patens O £2 fl¶ Eren teJía patens E e’.’ o 9AmIAm QQ *1k., t £2 fi Breutelia squarrosa O fi Breutelia squarrnsa 1>6 Mt e” — AtJAu — e — e,. - e © ‘¿C/NC ¡Am QA.t. -~ 1 £2 12 Bren tel ja pal ygas trica C It Breu te) ja pal ygastricaP6 V~ kl)0 o AiI&1 o— -IA~ * jA... ir~O Q “cl—’ Y -.JÁr’~ ‘it ¡A>, -/ u’ £2 £2 fi Breu teJía lorentzij SI fi Breu teJía lorentzji O S’.lA~ PE -Iba c -1t4t E2joi,&c l&m -t £2 0 -lA>~ -~ £2 U--- Breutel la austro—atcuata ‘d0¡b0e~ 5~oi&in (4 it Breu tel ja austro—arcua ta F6 o ~ ® •02<flt e..’ ~ -/MC -itt 1Mt NjOJMO~Z,t y’ Ik~ —e, 9 —7 £2 Breutelia integritoliaP6 CAl ‘e ,-\ :••\ -/ A.” ‘-‘e-ID •r.~~’ • r -JAn, r. <~/ -.. ‘~4 .9k. . - - -/ -T £2 flf Breutelia eugeniae -/ rN Ant 4¡Al 0d u filflreutelia eugeniae O O OAiJA~ ohin flI%~ fhA.’ O 0At¡Ajt -. ¡t Qfl .~ O/-MI • Am ‘~‘~ O 0km ¡ hr. flErsutelia elongata Y An —-SI e.- ¡ ~&m U-,.’ e,, Itt ~fNe SI u” Qn¡A> ~1. a cE:, CL)n ik~ -4 £2 ‘->/ £2 -~ fltfir-euteiia elongata 6 900?rn PE /t fi Breu teJía aftjnís O PÓ ntBre’¿..¿telia aftinís 62 O e~ Al ‘4 DII a qI‘-c~e.’ -. 9Ai tiobiO .—,u. ¿C/A., O~ ~jB —, £2 eutelia azanca Ml y-. O £2 fil Br-eutelia azanca e -~ 6 e,—” ej ¡ Dl ~ tU,wdr 9 NC ¡A., •e. -Ide e Dffi ,k¡g -w humbertil O £2 f~l Breutel la humbertil -, P6 II’ e....’ / Al -I As, • ‘fi lilreutelia o-!&IG . •2 ‘£2 £2 SI fi Breutelia djttracta O OO‘de ¡‘It 9 fl Breutelia -/ kffi st O óoiiviensÉc -1 rx ‘~ Al Al £2 fiflreutelia allionjí 1 ‘---<y4— O flffireutelia allínnii -I A.’ -e’ ¼) e,. -/ e. -\ Ai <cf: - t. -I -. 4Áre. e—’ -4 £2 1 . e—ee 4 fifireutelia Breutelia subarcuata0 -- 1>6 subarcuata Idi! - ¡ It QV’/A>,O - Il~ —1w QA.IIAA e/wc ->5, £2 <4 ‘P Conos tosus cl el s tocarpus ‘Ano £2 Conos tamus clejstocarpum e e..’ ‘~o ¡sc 24 tiC tt ‘¿CAJO ~ Q ee ::: — nl e-e’ -Ip’ e Q A.. -a; 0 f2 £2 fi ¶ Conosto¿num bo¿-eale O ‘ ‘ fi Conos too,um boreale 26 ;~‘~? ‘¿CIAN V~ #O -‘it te.—Oib’.,‘¡tttt k~ nc,I.4 12 £2 e? cee U fi Conostomiza macrothecaC OAIJh, ~ II fi Conos tomua aacrotflecaF6 st %JIe MC tIJ? ‘J¿l&, Q’¿~l’ft ej.’ £2 £2 t fi Conos tomuz tetragonumC 1 El Conos tomuz tetragonuraPó o QQ‘~eNc OinjA. O Am LA.., b,eCe ¡lic. fis. -a, £2 £2 ti it ji fi Lejomeja deciduitoliafl 1~ ~. ¡A” Y CA QNC lá,. / ht 20 ¿CIA.’ U hiedA,. <41 1>6 fItLeiomela pjlígEra e— e - O ~ o wrnc £2 fi Catoscapium nigritumO 00\ ~0 , AiiM t.lItLlt e..’—, e’—.” 5jc O #‘iiAt •‘1 e’ —¡A.’ o Q At /» £2 SI SI fi Philc,notis revaluta 1>6 52 Am/NC -/ ~ A”~IiS~, e) Ibq No 4 lPhjlonotjs scabritoliaC ej Philonotjs scabri tolla 26 ¿e’ ~ rj” ~ 4,’ 4-~ •/ ‘JCe INC — -fl ‘ID St tC 1>~m M ~%t -a, £2 SI flPhilonotis uncinata O 8ba -t £2 lAr, 1=t ¶ £1 Phhlonotjs uncinata — ee ~, >a lAn, -1w’ —/ K~ o”’ iA,t. hin ¡A,, -4 12 ¡Kiwi 1>6 fiPhhlonotjs arnellís O SI it 0t1&Js flphilonotis 1>6 arflellii NO — ‘‘e oO ‘ri(¿b’tt ;Iij Chi voIn~’9L. e. o -/A., ‘e e. >dt4eew QA.. it~ kj~ -e. £2 it fi Philonotis fi Phj lonotís caespitosa caespi tosap6 -Itt — e. -It’.’ v/ gOk~c -9 fi. -1 o /3> ÑA. ‘StA., £2 £2 fiPhjlonotis sarchica O fi Phjlono~jg ‘¿ti 9,... r marchica -dAt 1>6 - ¡A. J o Nt”,.1 eIh~ - lA.., ~ fl’~ 4,,- - tu — ni e ~—/A.. e’--, - t ‘-lAn .4, £2 o .5 Ptnlonotís sphaerocarpa o /báO OO M’WA.’ IV’\ ¡ Mt O Peri/Am —7 £2 SI fijPhilonotis fontana O 1 fi Phjlono~j fontana 5 ;‘..M ¿E9A1¡A.’ -‘fl —lIÉ 1>6 6 AtIAí - Palu A~iAj [e; O~LI ~ eee/ £2 £2 It fi Philonotjs calcarea’ • ‘JLIkC. <nl kYUQJy ‘&r,~ ¡4Am DA,, —1 O O~ flPhjlonotis calcarea It4~ oO O (di VG o A<! ¡i bel ‘4C¡Avj kn 9 N.’1J 05/oíA., -/ ¡A.’ (S bu 4 e cx e 1 A. 1 -. -‘ A- 12’ U fi Phjionotis australisc e rNVCIAn £2: fi Phi.lonotis australib P6 Q~EA5~ Y4 e, e- . ‘e.i4k~ e.... -IbA -J A.’ A.’ “(e WC -4 12 filPÍúíonotis tenuje O £2 flef 1>6 Phjlonotii~ tenujs e e. e Al/A.’ ‘jet A.’ lA.’ e ee iCrtiBt 0q) -/ U A.’ -s £2 ir fi Philonotjs NoIAn~ tíAs. fi íaxissimaC Philonotis íaxjssimaPE o .e o o IrY /47) VOIwrfl re.-’ e e - ‘Ai. —— — e ÁIIM 4hs.. esee £2 fi? Ph.zlonotis andina O O —7 £2 fl¶Philonotis andina 1>6 ‘-It ‘eIAm (fl - It,,.~ — e — ee e — -fi— -Ita o o fljAt ‘en.o-~t -ql -It ÑA.., -e e • e— - - - ¡A. 12 £2 fi’tPhilonotis secunda 1>6 ?Jl Oc ‘t-/A.sN flhJv-7t - IAv~ • e •/4,i, —a. £2 ~ 1 Philonotjs 4t —e Philonntis iancitoliaC 1>6 lancitolia It’.’ ,0 (jj~ oe~ - 5/ClAn WO~t9t (4~~ - -nec e — — e 1? e e - 1kv. e e e e e e £2: 12 -r c “4? Philonotis heter-ophyl Ja9 -Ii - e ej-a 0vo ~ iiu, e e wJAr VOteAc—’7g. -IAl — e ee - - ‘dotAn, O*IAn, - (A., £2 £1 Phiionotj s capillaris ‘¿CIA.. ‘ce SI flPhílc,notis capillarisPG ‘aI&~, (?) ~ o ‘-a ~ ‘6¿¡DM -Ii. e ‘ti! o 9A~ ®~ e ‘e - - ci? Philonatis heterophylla e e e e 2k: 4~~~¡&M47C £2 y fi Philonotis ¿4.? turneríana o VQ1>~ e? R ¡2 0 :r~ ~* e e e— e eiAr~ e., ‘ -INC ee ‘As, -* £2 PI>í 1 onotía tjibodensisC e.’ C; e?’ fi Philonotis tjíbodensis ev-~ Al/4-il ‘¿0h44 ‘¿CIA- o-ofin o lEt ‘¿4/MG -a, 12 ej fi Philonotís Q hastata C ‘SC/AM 1K liv ‘¿tít’,, lA, ‘e e -~ £2 f2 ~6 hilonotis tomentellalP6’ {~1 Philonotis tomen tejía O -IAfl NO/No—) a O ,-3/2 —I 2?¡4 <I o •e.~ t/~4L tr -/4*, ‘4 £2 Cd’ ce lonotis glaucescens fPhi -(As, ½) Cd Phi 1 ono tis glaucescens 5/01,40 (>y¿Ltaj.a y) /4.. o o Y0A40-)2 ~CINC o A414< nc ‘¿CIA” ->2 ~-Iflr.. f2 Philonotis thnaitesii O ¶ fi Philonotis thnaitesiipó QqCING 2/.’ Ir - o «¡&ft’e e lAn, ‘flIÑOqg dA.. - - -‘u £2 ríAn, a £2 fl¶ Philonotis rígida O fi? Philonotis rígida 1>6 dO) ‘.0 e-’ 4¾ e-, kV --cd 4 ‘JOMO-?R O2)3 ¡Dm cjfj~1 Q Am lAs. fi Pía giopus oederiana O 5/O ¡Mt £2: £2 00 ‘Jo ~ fi? Píagiopus oederiana 1>6 C~).dOi~Io NO ‘¿GIAI~ JO lA1 -‘Am -iAL Volvo e---. -I ncc, •l A— £2 A*~ -¡4 ~=wQ ¡‘e/o o V’Ih.n e-> £2 Sele2. Resultados cromatograficos de las especies centrales de la Memoria Doctoral. 5.1.2.1. Rartramia halleriana Hedw. En las Figuras 51 y 5.2 vienen representadas las 2D-TLC realizadas con B. halteriana (gamet¿f¡to + esporófito) tanto en celulosa como en poliamida-6. Salvo para los compuestos, el resto de la simbología es la que refleja la Tabla 5.1. La numeración de los compuestos es la misma en TLC y HPLC, y queda expuesta tras los resultados de HPLC. Fig- 5.1.: Cromatografía bidimensional de E. haiJeriana en celulosa. Fig. 5L: Cromatografía bidimensionál de B.halleriana en poliamida-6. La Figura 5.3 ofrece el cromtogrania de HPLC procedente de B. halleriana (gainetófito + esporófito), en el que se indican los tiempos de retención y posición relativa de cada uno de los compuestos identificados, cuya simbología coincide con la utilizada en las 2D-TLC anteriores. 136 5 aoo 150 Ib a E 00 50 4 1 2 0 lO 20 30 40 Fig. 5.3.: HPLC de B. halleriana. Numeración de los comunestos BH-1 BH-2 BH-3 BH-4 BH-5 BH-6 Bartrandaflavona Anhidrobartramiaflavona 5’,3” ‘-dihidroxi-amentoflavona ‘-dihidroxi-robustaflavona Filonotisflavona 2,3-dihidro-filonotisflavona (a y b corresponden a ambos diastereómeros) 51.2.2. Bartranúa ithyphylla Brid. En las Figuras 5.4 y Si vienen representadas las 2D-TLC realizadas con B. ithyphylla (gainet¿f¡to + esporófito) tanto en celulosa como en poliamida-6. Salvo para los compuestos, el resto de la simbología es la que refleja la Tabla 5.1. La numeración de los compuestos es la misma en TLC y HPLC, y queda expuesta tras los resultados de HPLC. 137 Fig. 5.4.: Cromatografía bidimensional de B. ithyphylla en celulosa. Fig. 5.5.: Cromatografía bidimensional de 8. ithyphylla en poliamida-6. La Figura 5.6 ofrece el cromatogrania de HPLC procedente de B. ithyphylla (game5fito + esporofito), en el que se indican los tiempos de retención y posición relativa de cada uno de los compuestos identificados, cuya simbologia coincide con la utilizada en las 2D-TLC anteriores. -e It O 1 160 ±4 t20~ 400 4 E 4 b 40 20 ±0 tO 30 Fig. 5.6.: BPLC de B. ithyphylla. 138 40 . Numeración de los compuestos 81-1 81-2 BI-3 81-4 BI-5 81-6 81-7 Filonotisflavona Dicranolomina 5’,3”’-dihidroxi-amentoflavona 2,3-dihidro-filonotisflavona (a y b corresponden a ambos diastereómeros) 2,3-dihidro-biflavonoide 5 ‘-OH-amentoflavona p-OH-benzoico (4-OH-benzoico) 81-5 se identificó mediante cromatografía en capa fina como un 2,3-dihidro-biflavonoide, ya que al poco tiempo de revelar con NA la placa cromatográfica, el color de la mancha observada a la luz ultravioleta viraba a color rojo, lo cual es indicativo de la existencia de un monómero flavanónico de eriodictiol. No obstante, no se detectó con claridad su presencia en el espectro de HPLC ni se pudo aislar en cantidad suficiente, por lo que su identificación definitiva no fue posible De acuerdo a los datos bibliográficos de que disponemos y tomando como referencia su movilidad cromatográfica, puede tratarse de la 2,3-dihidro-5’,3”’-amentoflavona o bien de la 2,3-dihidro-dicranolomina. El primero de ellos ha sido identificado en otra especie de la familia, concretramente en Philonotis fontana (Geiger & Bokel, 1989); mientras que el segundo 2,3-dihidro-biflavonoide, ya fue identificado tentativamente en B. ithyphylla por López-Sáez (1992). El Compuesto 81-7 fue identificado mediante cocromatrografia por HPLC como el ácido pOH-benzoico. Los derivados del ácido benzoico pueden, de acuerdo a Wilson & col (1989), sugerir la existenciade taninos o polímeros de hidroxibenzofurano, responsables de la rigidez de los musgos. Su existencia en briáfitos, tanto musgos como hepáticas, ha sido puesta de manifiesto en varias ocasiones por Asakawa (1986), MUes & Zinsmeister (1988), Wilson & col. (1989) y Zinsmeister & col. (1991). En la presente Memoria Doctoral, hemos querido únicamente reflejar su presencia en Bartramia irhyphylla, sin entrar en más detalles sobre su aislamiento e identificación, pues éstos se salen de los objetivos previstos. 5.1.2.3. Bartramia pomjformis Hedw. En las Figuras 5.7 y 5.8 vienen representadas las 2D-TLC realizadas con B. pomiformis (gamet¿fito + espordfito) tanto en celulosa como en poliamida-6. Salvo para los compuestos, el resto de la simbología es la que refleja la Tabla 5.1. La numeración de los compuestos es la misma en TLC y HPLC, y queda expuesta tras los resultados de HPLC. 139 Fig. 5.7.: Cromatografía bidimens¡onal de B. pomiformis en celulosa. flt 0%‘¿‘¡mc — Iw.Ihe. •ee-. o lt’Imo Ciba £2 — —I Fig. 5.8: Cromatografía bidimensional de B. pomifornzis en poliamida-6. La Figura 5.9 ofrece el cromatograrna de HPLC procedente de E. pom~formis (gametófito + espordfito). en el que se indican los tiempos de retención y posición relativa de cada uno de los compuestos identificados, cuya simbología coincide con la utilizada en las 2D-TLC anteriores. 4 300• a a 3 10 20 30 Fig. 5.9.: IIPLC de E. pomiformis. 140 40 . Numeración de los comDuestos RP-1 RP-2 BP-3 BP-4 Bartramiaflavona Anhidrobartramiaflavona 5’ 3” ‘-dihidroxi-amentoflavona Filonotisflavona BP-5 2,3-dihidro-filonotisflavona (a y b corresponden a ambos diastereámeros) BP-6 BP-7 BP-8 AcCí Dicranolomina Bartramia-Triluteolina Acido Bartrámico Acido Clorogénico En el aislamiento y purificación del extracto metanólico procedente de B. pomiformis mediante cromatografía en columna se aislé un compuesto de naturaleza desconocida que denominamos BP-X. Dicho compuesto no pudo ser identificado por TLC y se requirieron de otras técnicas analíticas tales como RMN y EM para su identificación. Los resultados derivados demostraron que en realidad BP-X es una mezcla de 3 triflavonoides (Seeger, 1992): de un lado la Bartramia-Triluteolina (BP-7) y de otro, otros 2 triflavonoides que, no pudieron ser identificados por no ser posible la separación entre ellos ni disponer de cantidad suficiente para un análisis más fino. Hemos creído conveniente hacer aquí esta aclaración dado que BP-X aparece en el esquema metodológico de CC pero no fue identificado en las TLC, respectivas, lo que podría conducir a una confusión. Los resultados procedentes de la analítica realizada sobre el Compuesto BP-X se presentan por ello junto a los de la Bartramia-Triluteolina. La Tabla 5.2 ofrece los resultados acerca del estudio de la composición flavonoidica de diversas muestras de B. ponuformis procedentes de distintas localidades, cuya procedencia concreta aparece en la relación de pliegos expuesta en el apartado de “Material y Métodos”: Tabla 5.2: Composición flavonoidica de B. pomiformis en distintas localidades. (+, presencia, coi~su~rros - ausencia) SN 5P2 5P3 BP4 BPS BPÓ BP7 BP8 Guisando + + + + + + + + Caneada + - + + + * + +- Ordesa + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -¡- Mazar ElEscorial - + 141 Acido Clorogénico + Sel.2e4. Rartramia stricta Brid. En las Figuras 510 a 5.13 vienen representadas las 2D-TLC realizadas con B. siricla, procedentes tanto del gametófito como del espordfito, en celulosa y en poliamida-6. Salvo para los compuestos, el resto de la sinibología es la que refleja la Tabla 5.1. La numeración de los compuestos es la misma en TLC y HPLC, y queda expuesta tras los resultados de HPLC. Fig. 5.10.: Cromatografía 2D del gametófito de B. stricta en celulosa. F¡g. 5.11.: Cromatografía 2D del esporófito de B. stricta en celulosa. nl e,.’ 00?~ -t .44.. (e’ anis. ~-~— cf e -0— ‘u— ce. Fig. 5.12.: Cromatografía 2D del gametófito de B. stricta en poliamida-6. 142 . fi? qn: e, — ¡ 3: e.., e— el- -r 12 Fig. 5.13.: Cromatografía 2D del esporófito de 8. stricta en poliamida-6. La Figura 5.14 ofrece el cromatograma de HPLC procedente de 8. stricta (gainetdfito + espor¿fito), en el que se indican los tiempos de retención y posición relativa de cada uno de los compuestos identificados, cuya simbología coincide con la utilizada en las 2D-TLC anteriores. t toe I00 , c so. so‘o. so. 30 2< 5~A2 6 ‘o. lo t0 lo so Fig. 5.14.: HPLC de 8. stricta. Numeración de los comnuestos BS-1 No identificado (posible isómero de la Ciclo-Triluteolina) Filonotisflavona BS-3 Ciclo-Triluteolina BS-4 Dicranolomina asces Mezcla de Triflavonoides (separados por CC) RS-SA Bartramia-Triluteolina RS-SCA Epi-Bartramia-Triluteolina BS-6 5’,3”’-dihidroxi-amentoflavona 85-7 5’,3”’-dihidroxi-robustaflavona 85-8 posiblemente 2,3-dihidro-filonotisflavona (a y b corresponden a ambos diastereómeros) BS-2 143 El Compuesto 85-1 fue aislado mediante CC y se detectó igualmente su presencia en las TLC, respectivas, aunque no dispusimos de cantidad suficiente para poder emprender un estudio analítico profundo e identificarlo completamente. No obstante, podemos decir que se trata de un compuesto relacionado con la Ciclo-Triluteolina (BS-3) de la misma manera que lo están la Bartramiaflavona y la Anhidrobartramiaflavona. Por todo ello, hemos creído conveniente presentar los resultados derivados de su estudio junto a los de la Ciclo-Triluteolina. El Compuesto 85-5 que fue aislado mediante CC y detectado en TLC, hubo de ser sometido a nuevos procesos de aislamiento mediante CC con metanol al 80 %, ya que los resultados de la analítica realizada sobre él (RMN principalmente), denotaban la existencia de diversos tipos de uniones interfiavonoidicas y un número de señales excesivo, lo que sugería que BS-5 debería tratarse realmente de una mezcla de varios flavonoides. En realidad, BS-5 está compuesto: por un lado de RSSA (Epi-Bartramia-Triluteolina) y por otro de BS-X que también fue aislado mediante CC pero no identificado en TLC. BS-X se corresponde con BP-X, ya que es una mezcla de tres triflavonoides: Bartramia-Triluteolina (BS-5.1) y otros dos triflavonoides desconocidos que no pudieron ser aislados ni identificados. El Compuesto BS-8 no pudo ser aislado mediante CC pero se demostró su presencia mediante TLC y HPLC. Por sus características cromatográficas (fluorescencia, Rf, tiempo de retención) y por tratarse de un 2,3-dihidro-biflavonoide (Geiger, 1990), suponemos que se trata de la 2,3-dihidrofilonotisflavona, ya que es precisamente el biflavonoide más abundante de este tipo (2,3-dihidro) descrito en la familia Bartranñaceae. La Tabla 5.3 ofrece los resultados acerca del estudio de la composición flavonoidica de diversas muestras de B. sitjcta procedentes de distintas localidades, cuya procedencia concreta aparece en la relación de pliegos expuesta en el apartado de “Material y Métodos”: Tabla Si: Composición flavonoidica de .8. stricta en distintas localidades. (+, presencia, ausencia) - 1 B52 B53 11S4 555 BS6 B87 BSS EPicadas + + + 1. + . + Villadeiprado + + + -4- + + + + 1- + + + + + + + + -v + + WCAL*D4». ¡araicejo Montfragúe - 144 5e1e2.Se Dicranum scoparium Hedw. Dicranuin scoparium fue la primera especie dentro de los musgos donde se identificó una biflavona (Lindberg & col., 1974), denominada 5’,3”’-dihidroxi-amentoflavona. Cuando Osterdahí (1983) estudié el contenido flavonoidico de esta especie, únicamente detectó la presencia de un biflavonoide, ya que en su trabajo sólo analizaba aquellas fracciones solubles en agua, con lo que pasaba por alto muchas otras que también contenían biflavonoides. Dada la similitud de compuestos biflavonoidicos identificados en esta especie respecto a los de la familia Bartramiaceae, llevamos a cabo en ella un ensayo preliminar sobre su composición flavonoidica, en el que pusimos de manifiesto la existencia de un nuevo compuesto biflavonoidico no detectado anteriormente en los trabajos realizados en Dicranum scoparium, por lo que decidimos estudiar en profundidad su composición flavonoidica. A pesar de no pertenecer a la familia Bartramiaceae, objeto central de estudio de la presente Memoria Doctoral, decidimos no obstante incluirla en ella por parecernos los resultados lo suficientemente interesantes como complemento adicional, y por servimos los compuestos aislados de Dicranum scoparium como patrones químicos En las Figuras 5.15 a 5.17 vienen representadas las 2D-TLC realizadas con D. scoparium, procedentes tanto del gametéfito como del esporófito, en celulosa y en poliamida-6. Salvo para los compuestos, el resto de la simbología es la que refleja la Tabla 5.1. La numeración de los compuestos es la misma en TLC y HPLC, y queda expuesta tras los resultados de HPLC. Fig. 515.: Cromatografía 2D del gmneídtiío de D. scoparium en celulosa. Fig.5.16.: Cromatografía 2D del gametáfito de D.scoparium en poliamida-6. 145 . Fig.5.17.: Cromatografía 2D del esporófito de D.scopariun¡ en poliamida-6. La Figura 5.18 ofrece el cromatogrania de HPLC procedente de D. scoparium (gametóflto + esporófito), en el que se indican los tiempos de retención y posición relativa de cada uno de los compuestos identificados, cuya simbología coincide con la utilizada en las 2D-TLC anteriores. 14 0 1 Izo lo 5 £0 20 o 10 20 Time 30 tmnin. Fig. 5.18.: HPLC de D. scoparium. Numeración de comnuestos DS-1 5’,3”’-dihidroxi-amentoflavona DS-2 DS-3 DS-4 DS-5 DS-6 DS-7 DSe 55,3~5 ‘-dihidroxi-robustaflavona flavonoide/biflavonoide glicosilado No identificado Apigenina-7-O-triglicósido Luteolina-7-O-neohesperidósido Diosmetina-7-O-triglicósido 2,3-dihidro-biflavonoide 146 40 El Compuesto DS-3 no pudo ser aislado mediante CC en cantidad suficiente para una analítica profunda, aunque sí se detectó su presencia mediante TLC. Por sus características cromatográficas puede tratarse de un monoflavonoide glicosilado o de un biflavonoide glicosilado (Geiger, com.per., Voigt, 1993). No queremos extraer más comentarios al respecto y dejar por el momento su identificación como provisional hasta estudios posteriores, ya que los biflavonoides glicosilados son bastante raros, y por el momento sólo se conocen en ginmosperinas (Geiger & Quinn, 1975>. El Compuesto DS-4 aislado por CC. parecía poseer una naturaleza no fenólica de acuerdo a los resultados obtenidos por TLC, por lo que en un principio obviamos su estudio dentro de la presente Memoria Doctoral. Por sus características de movilidad cromatográfica y fluorescencia al ultravioleta parecía tratarse de un tetraterpenoide u otro derivado isoprénicode cadena largay abierta, nunca de naturaleza flavonoidica. Sin embargo, los resultados de la RMN parecían en cambio que podía admitirse una naturaleza fenólica. No podemos por el momento establecer su estructura con claridad, por lo que está siendo objeto de estudio analítico en la actualidad. El Compuesto DS-7 no se aislé mediante CC pero sí fue identificado por cromatografía comparativa con patrón en TLC como la Diosmetina-7-O-triglicósido. El Compuesto DSe no pudo ser aislado mediante CC pero sí se detectó su presencia en la 2DTLC en poliamida-6 del espor¿fito de D. scoparium aunque no en el gamet¿fito. Este compuesto, por sus características cromatográficas (color rojo con el tiempo tras revelar con NA>, se corresponde con un 2,3-dihidro-biflavonoide (Geiger, 1990; Wollenweber, 1981), en el que uno de los dos monómeros es la fiavanona eriodictiol. El hecho de presentarse únicamente en el espor¿fito y no en el gamet¿fito nos hizo sospechar del porqué no pudimos aislarlo mediante CC, ya que no se dispuso de material esporofítico suficiente de partida para su aisiamiento en cantidades necesarias para una buena analítica. Dada su naturaleza de 2,3-dihidro-biflavonoide, puede en realidad tratarse de la ya nombrada 2,3-dihidro-filonotisflavona, con la que coincide en sus características cromatográficas, aunque por el momento se desconoce dicho biflavonoide en la familia Dicranaceae (Anexo 2). No obstante, se conoce por otra parte la existencia de 2,3-dihidro-biflavonoides en otras especies de la familiaflicranaceae, concretamentela 2” .3’ ‘-dihidro-5 “3,, ‘-dihidroxi-robustaflavonaenDicrano/oma robustum y Dicranoloma bit/ardí eh (Markham & col., 1988) y de la 2,3-dihidro-dicranolomina en D. robustum (Markham & col., 1988). Comparando los resultados cromatográficos del Compuesto DSe observamos que estos coindicen con los de la 2,3-dihidro-dicranolomina, aunque por el momento preferimos mantener tales hechos como provisionales hasta que obtengamos material suficiente para su análisis. 147 Sele3. Resultados Analíticos de los Compuestos Identificados. 5d.3.1. COMPUESTO 1 (EH-3, BI-3, BP-3, BS-6, DS-1) (5’,3” ‘-dihidroxi-amentoflavona o 5’, 8’‘-bUuteotina) En la Tabla 5.4 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto 1, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (Pp. 108). Tabla 5.4.: Datos cromatográficos del Compuesto 1. Compuesto 1 Fluorescencia UV(350nm) yo 5’ 3”’-diOHamentoflavona’ yo +NH, yo yo yo Am Am Am + Benedict Rf~ yo yo 26 5 4 41 4 5’3”’-diOIzl2 amentoflavona yo 40 83 90 24 53 31 5~ 3•~c -diOH-amnenioflavona segdu Lindberg & col. (1974) 3” -diOH-awnernoflavona segs5n Seeger & col. (1990) (ver Pp. 77-78 para los sistemas cromatográficos) En la Tabla 5.5 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto 1, con y sin la ayuda de reactivos específicos. Tabla 5.5.: flatos de espectroscopia de uy del Compuesto 1 (sb=’ hombro). MeO!) 256 288sf, 353 237sf, 281sf, 349 NaOMe 236sh 270 394 269 398 4fiX) AId, 271 367sh 417 273 285sf, 382sh 419 AId, + lIC! 257sf, 272sf, 295sf, 357 381sh 270sh 293sf, 358 371sf, NaOAc 268 404 263 276sf, 364 NaOAe + }IJBO, 269 405 263 276sf, 376 datns pnccdntcs de, Salve, (!~2} 148 La Fig. 5.19 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto 1 frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.20 presenta el Espectro de Masas del Compuesto 1. e SSO .62dA o .OOA M 210.0 25 2’17 -20<’ 50.0< MIl/DIO. •440.C4NOI —10.0 4-Ci.ONM 93 352>17 ‘9; ¡ +~ 440.0 ‘2 rl alo.’. 28 2,17 •93 1 ¡5 5e.4<MM’DIO.) 56 .0< MII ‘DI O 4 4 Cv 448 .eHM 440.8941 0 .2C~wj OelSCOI ¿“e e-” O. 296 +0.OOA 2’17 ‘92 440 > ú 6.552~I 448.8NM 218.6 2’17 92 1553 50.e<Nr,D1O., 446.0941 Fig. 5.19.: Espectros de Ultravioleta del Compuesto 1. O... ,ot,~ *0.6’ Scta, 060 0 S*0.S 1200.00 .1,27 0,tcev RIC 140307*0 t ff12000 ‘ •peekO 00 000 070 .20—40 569 500— 1. •0~ •0- 40 ‘PO 20 O0 Y. LI t ¡91 100 113 ?~‘. 200 ‘U ‘MI jI - liiiiUI ‘~1 IVA’ ‘00 000 7’ 500 072 *00 U’ 6~7 II 701 700 701 790 1 31 56.9(HII’DIUe , ¡5 MM “ti 218.9 ‘e 1 • cd *‘01Q- 000 Fig. 5.20.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto 1. 149 ~40-8 CL.1$9A En la Tabla 5.6 se muestran los resultados de la ‘3C-RMN del Compuesto 1 comparados con la bibliografía aneja correspondiente (5’,3”’-dihidroxi-amentoflavona y luteolina). En la Fig. 5.21 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto 1. En la Tabla 5.7 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto 1, estableciendo al igual que para la ‘3C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.22 y 5.23 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto 1, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.22) y el intervalo 5.7-7.5 ppm (Fig. 5.23). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Salm (1992) y Voigt (1993). OH OH 5 OH 1 HO t4~ 1 o OH OH O Estructura Molecular del Compuesto 1 150 Tabla 5.6.: Datos de ‘ 3C-RMN del Compuesto 1. ~stet 2 164,0 163.9 2” 164,0 164,0 3 102,9 102.9 3 102.5 102,5 4 182,0 181,9 4” 181.5 181,5 5 161.4 161,4 5” 160,4 160,4 6 98.6 98,7 6” 98.6 98,6 7 164,0 164,0 7” 162,0 161.7 8 93,8 93.8 8” 104,1 104.0 9 157.3 157,3 9” 154,5 154,5 lO 103,7 103.6 10” 103,7 103,6 1’ 120.4 120,6 1”’ 121,8 121,8 2 112,0 112,1 2”’ 113,7 113,7 145,5 145,5 3” 145,8 145.8 4 148.5 148.2 4”’ 149,4 149,4 5’ 120,1 120.0 5’’’ 115,5 115,5 6’ 122,2 122,2 6”’ 118,6 118,6 5,3-DhA: 5’,3”’-diOH-an,eníoflavona según Geiger & col. Luteolina según Markf,am (1988). & col. (1082). 151 164,5 103,3 182,2 162,1 99,2 164,7 94,2 157.9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119.3 Fig. 5.21.: Espectro de ‘ 3C-RMN del Compuesto 1. Tabla 5.7.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto 1. s~ 1 3 6,64 s 6,65 o 3” 6,óSs 672 o 6 6,18 d (2) 6.21 d (2) 6 6.37 o 6.41 8 6,42 d (2) 6<45 d (2) 6,47 d (2) 2’ 7,48 d (2) 7.51 d (2) 7,43 *1(2) -— 6,92 *1 (8) 7,77*1*1 (2:9) 5e 6’ 7.49 *1 (2) 7.52 *1 (2) 2”’ 7,06*1(2) 709*1(2) 5”’ 6,67 *1 (8) 6.70 *1 (8) 6’” 7.04 ¿Id (2:8) 7.07*1*1 (2:8) 011-5 I3SUs on-s’ 13,13 6,69 6.22 d ‘S’,3”’-UHA: 5¾3”’-diOH-amentothvona según Geiger & col. (1988). ‘Luteolina según Geiger & ccl. (1987). Eig. 5.22.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto 1 152 (leOd3eO ppm). Fig. 513.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto 1(5.7-7.5 ppni). L1.3.2. COMPUESTO II (BH-4, BS-7, DS-2) (5; 3” ‘-dihidroxi-robustaflavona o 5’, 6’‘-biluteolina) En la Tabla 5.8 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto II, que son así mismo comparados con la bibliografia respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. 108). (pp. Tabla 5.8.: Datos cromatográficos del Compuesto II. 5.3’ “-dí0H-robustaflavona’ Compuesto II 5’ 3’ “-*11011robustaflavona Fluorescencia Rf, UV(35Onon) ‘¿O +NH, yo +NA Am + Ber.edict yo 2, 2, ‘¿O 2 ‘¿O ‘¿o Am Am ‘¿o II 3 22 34 22 25 54 34 31 22 16 5’.3”’-diON-robustaflavonasegúnSeqer (1992). 2 5.3~~~diOHe-robussat1avona según Stein (1988b). (ver pp. 77-78 para sistemas croinatográfocos) En la Tabla SS se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto II, con y sin la ayuda de reactivos específicos. 153 Tabla 5.9.: Datos de espectroscopia de UV del Compuesto II (sh= hombro). <~=p»~ JI MeOH 223sh 266sh 360 255 264 280sf, 357 NaOMe 272sf, 406 270 331 407 MCI 3 272 299sh 425 272 301sf, 367 426 AICI, + ¡Idi 274sh 294sh 362 385sh 263sf, 273sf, 298sh 361 NaOAe 269 400 271 327 408 NaOAc + H,BO, 268 302sf, 407 265 380 datos procedentes de Stein (19881,) La Fig. 5.24 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto II frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.25 presenta el Espectro de Masas del Compuesto II. 1 09 0-loo vI ‘U - 06~4 ‘.9 ‘.9 56.0<MII’DlO 45*3 .~HM ‘OH O • •-,•.. 2~ ~ -. 11• ___________________________________________ 500- 450<’ .:- u’ • 205.0 2’O9 9? ‘-~ ¡ U O 9~ nr 450~ 01’>- <4p1 • 6.04 4503v O e 074,4 0N’i -00,, A., O 106 —<DIO. Oe, ‘.9 266.0 2/69 •93 56.0’.94’.l’D1O. .‘ 450.6<494 450.0 0.096<4 •C¡ I~63 200.6 2’Ot •93 50.O<MM’0h’.’. ‘.911 4503v •• 450.0941 0-101,4 %o~ 6.266 • 4,’0J’,9. o~ Y ‘-e------e----. 1756 288.8 2’8I 92 SSeB(MMCU>e) 456.OMM 456.6 6.409A ~~69 286.6 2~6I 92 50.6<NII’D1’.’. 450.6941 Fig. 5.24.: Espectros de Ultravioleta del Compuesto II. 154 , MM 458... Oe21O~ nEc. .404>93 Cae nl 993 G0eí~BOL ti -VE -— ESOJ~ ~B Modo’ o~r’ ~eg a.... 90.0 Uooc.• S4Mel •.—ke bate, mt ¡0093 9>0 6» 36 .31—51 1000-09 oc.iVED re.- —e flw0~W ar..te1~oOl’ 0>? e e O St LS “.• 0053790 •32fl0•O O 900 93.99—’ 349 E, r ‘e ‘It 6i~ Ii 900 ‘so Fig. 5.25.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto II. En la Tabla 5.10 semuestran los resultados de la 13C-RMN de] Compuesto II comparados con la bibliografía aneja correspondiente (5’,3”’-dihidroxi-robustaflavona y luteolina). En la Fig. 5.26 queda representado el espectro de 13C correspondiente al Compuesto 11. En la Tabla 5.11 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto II, estableciendo al igual que para la ‘3C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.27 y 5.28 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto II, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.27) y el intervalo 6.1-7.9 ppm (Fig- 5.28). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Salm (1992) y Voigt (1993). OH OH 1 HO OH 1 1 o HO OH O O OH OH Estructura Molecular del Compuesto II. 155 Tabla 5.10.: Datos de “C-RMN del Compuesto II. CÉbwmu 2 estoIt 2 163.7 163,6 2” 164,1 ¡64,0 3 103,2 102,8 3” 102,1 102,7 4 281,2 181,6 4’’ 181,1 181.5 5 162,5 162,3 5’’ 159,11 159,1 6 98,5 98,7 6” 108,9 108,9 7 165,5 164.0 7” 162.5 162.3 8 93,6 93,4 8” 93.6 93,8 9 157,2 157,2 9” 156,3 156.2 10 103.5 103,6 20” 103,5 103,4 1’ 121.9 121,5 1”’ 120,8 121,9 2 112,1 III? 2’’ 113,1 ¡13,3 3’ 145,9 145,8 3”’ 145,6 145,7 4’ 148,5 148,6 4”’ 150,3 149.6 5’ 120,3 120.2 5,’ ¡15,9 116,0 6’ 122,3 121,9 6”’ 120,3 119,9 5.3-DHA: 5’,3”’-diOH-robusuf¡avona según Becker & col. (¡986). Lutcolina según Markban, & col. (1982). 156 164.5 ¡03,3 182,2 162,1 99,2 164,7 94.2 157,9 104,2 ¡22,1 113,8 146.2 150.1 116,4 119,3 33 31 3 Vi ~33~ ~ Ii 4~J~ el [fi 1~ .•• ¡~LU4ÉÉtMMh¡NUJiU~eMkádÉ~Éi¡ ‘0 Fig. 5.26e: Espectro de ‘ e e4~~ 3C-RMN del Compuesto II. Tabla 5.11.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto II. t. 3 6,55s 6,58s 6,69s 3’ 6.50s 6,53 6 6,14*1(2) 6,16 *1(2) 6.22*1 8 642 d (2) 6,44 d (2> 647 *1 (2) 8” 6,24 6,265 2’ 7,18 *1 (2) 7,20 d (2) 7,43 *1 (2) 6’ 783 d (2) 7,82 d (2) 7,77 ¿Id (2;9> 2”’ 7.39m 7,39m 5’” 6,89 *1 (8) 6,89 d (8) 6”’ 7.39 m 739 m 011-5 ¡3,02s OReS” 13,285 ‘5’.3”’-DHA: 5’,3”’-diOH-robussaflavona según Markl,arn & co¡. (1988). ‘Luteolina según Geiger & col. (1987). ¡ Fig. 5.27.: II Espectro de ‘H-RMN del Compuesto II 157 (leOA3eO ppm). ¡ ‘11 kLx ~JQ Fig. 518.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto 11(6.1-7.9 ppm>. 5.1.3.3. COMPUESTO LII (BH-5, BI-1, BP-4, BS-2) (Filonotisflavona o 2’, 8’ ‘-biluteolina) En la Tabla 5.12 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto III, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (PP. 108). Tabla 5.12: Datos cromatográficos del Compuesto m. F¡uoresceneia Rf, Compuesto III FI¡onotisflavona’ Filonotksfiavona IJV(3SOnmn) ‘¿O ‘¿O ‘¿O +NH, ‘¿O +NA Am Am Aros + Benedict ‘¿O z, 58 46 30 2, 65 74 75 2, 83 77 23 33 54 42 42 45 1’, 2 2 FI¡onosisflavona según Salt,, (1992). Filonotisflavona según Seeger (1992). (ver PP. 77-78 para sistemas cronsatográfleos) En la Tabla 5e13 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto III, con y sin la ayuda de reactivos específicos. 158 ]! Tabla £13.: Datos de espectroscopia de UY del Compuesto III (sh= hombro). COWPUC$ulrn tlhuothtlnoa MeOH 255sf, 345 242sh 346 NaOMe 269 330sh 400 262 400 271 303sh4¡9 271 283sf, 393sf, 419 A¡CI, + HC¡ 260sh 299sf, 357 390sh 257 281sh 358 NaOAc 269 299sf, 408 266 397 NaOAe + 1I,BO, 270409 268 402 ‘datos procedentes de Salnve (1992). - La Fig. 5.29 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto III frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.30 presenta el Espectro de Masas del Compuesto III. ocio Wee~e ‘0eV 6~, 05* H cz<4 1’ 00 II 5 0 e 1 <4/DIO. Cv 4< II •92 =./~I 1 1 50 .0’ F4II.’DI’ 200.0 450 .01411 4 SC’ •0 .00,4 MLI 3. 005*- JI 2$ 2 00 . O 2/01 •93 500’ •4$4’DJO e ‘-e. ‘~1 Ir, ‘450.,, o 450.0HII O - ‘00 4 ••011J .3 260.0 II 21 2/01 50.0< MM’DI O e •93 F¾50.OMM MII MII 450.0 0.132A1 200e0 It 47-;2.’ 05 HM 200.6 11 34 2’6l e93 50.6(MM’DIV. 3 450.BHM 450.0 8.2554 97 200.8 II 52 2,61 ‘n Fig. 5.29.: Espectros de Ultravioleta del Compuesto III. 159 50.0’MM,DIO ¡ •0 .60,4 .3 456.0MM 58 e 0< MM ‘DIO 45(5 .0MF1 0>171<4 MM 45(5.0 O .0~14,4 twa ie.t’ 5,—e’ .r 5 — 5*5 tCJ••J Élepe’e ••.t•.fl-’ •Iert i¡,ise<2 VII.? It Si ata-. FI e~j e-•Let• •tCAJ< (It’> cts, Uf ti • taj” ue.Pteh~ e.e 7’6•.~ - bis,e •ftek.e(. it?..” saer ‘st. a’. u— -2 0— St’ 5’?.? 553eV 1] _____________ - 45 •. e. ‘u Pt• “O Fig. 5.30-: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto III. En Ja Tabla se muestran los resultados de la ‘3C-RMN del Compuesto III comparados con la bibliografía aneja correspondiente (filonotisflavona y luteolina>. En la Fig. 5.31 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto III. En la Tabla 5.15 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto III, estableciendo al igual que para la ‘3C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.32 y 5.33 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto III, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5e32) y el intervalo 5.7-7.3 ppm (Fig. 5.33). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Salm (1992) y Voigt (1993). 5.14 HO OH e OH OH o Estructur-e Molecular del Compuesto III 160 Tabla 5.14: Datos de 13C-RMN del Compuesto III. 2 Csrb~rn~s Cern flwwttiflaveit 2 166,7 166,5 2’ 163,8 163,8 3 106,5 106,4 3” 102,5 102,4 4 181,9 181,7 4” 181,3 181,1 5 161,2 161,1 5’ 160,5 160,3 6 98,6 98,6 6” 98,3 98,3 7 163,8 ¡63,7 ‘7” 161,3 161,4 8 93.1 93,0 8” 103,5 105,5 9 157,3 ¡57,2 9” 154,4 154,3 10 103,1 102,9 10” 103,3 103,2 1’ 124.0 124,0 1’,, 121,8 121,7 2 118,6 ¡18,7 2”’ ¡13,6 113,5 3’ 144,4 144,3 3”’ 145,6 145,7 4’ 148,5 148,3 4” 149,6 149,4 5’ 114,6 114,6 5”’ 115,6 115,5 6’ 120,7 120,5 6’’ 118.8 118.9 Filonotisflavona según Geiger & Bokel (1989). Luteolina según Markham & col. (1982). 161 164,5 103,3 182,2 162,1 99,2 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119,3 1 3 ~ i.Il~ ,n.aw# ~. _ :..v~eeej4,t±MeUj Ih1~Li¿.LLL 5 hie),teJiL4jleeÁ¶i J Fig. 531.: Espectro de ‘3C-RMN del Compuesto 111. Tabla 5e15e: Datos de ‘H-RN1N del Compuesto III. -c’m” pj,~’’ 3 6e068 6,06s 6,69s 6 5.75 d (2) 555 *1 (2) 6,22 d (2) 8 6,07 *1 (2) 6,07 *1 (2) 6,47 d (2) 5 7,01 os 7,01 *1 (8:5) 6.92 *1 (9) 6’ 7,24 *1 (8:5) 7.24 *1 (8:5) 7.77 dd (2;9) 3” 6.62 s 6.62 6” 6,27 a 6,27 2” 7.01 os 7.02 *1 (2> 5”’ 6,74 *1 (8) 6,74 d (9) 6” 7,01 os 7.00 ¿Id (2;9) 011-5 12,73 011-5” 13.01 Filonoúsflavona según Geiger & Boke¡ (1989>. ‘Lweo¡’ma según Geiger & col. (1987). ¶ fl JJ Fig. 532.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto 111(1.0-13.0 ppm). 162 « Fig. 5.33.: Espectro de ‘H-RIVIN del Compuesto III (5.7-7.3 ppm). 5.1.3.4. COMPUESTO IV (BH-6, BI-4, BP-5, BS-8) (2, 3-dihidro-filonotisflavona o 2, 3-dihidro-2 ~8’‘-bUuteolina) En la Tabla 5.16 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto IV, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (Pp. 108). Tabla 5.16.: Datos cromatogrífleos del Compuesto IV. Fluorescencia Compuesto EV 2,3-dihidro-fiIoa,oasfla~ona’ 2 2,3-*1ihidro-fa¡onotisflavoa,a UV(3SOaun) ‘¿O ‘¿O ‘¿O +NH, ‘¿O + NA AN-rojo con el tiempo + Benedict ‘¿O Am Am-rojo con el tiempo AN-rojo con el tiempo 35 35 33 2, 76 76 68 2, 85 Rl, 76 70 PI 54 70 61 54 ‘ ‘23-dihidro-nImclistv.un ‘egú. Seeger (59921. ‘23dro-fiIomnisflavms aegun Salin (5992). (nf 5153. 71.18 t =mso~r~) ‘Is En la Tabla 5.17 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto 1V, con y sin la ayuda de reactivos específicos. 163 Tabla 5.17.: Datos de espectroscopia de UY del Compuesto TV (sh= hombro). •___________________ Có¡npná~iú IV 2dro.fi~en#isflátouÉL MeOH 254sh 273 288 274 285sh 346 SaOMe 281 322 406 288sh 321 409 273sh 3Olsh 362 279 285sh 352sh 426 AlO, -4- HCI 276sh 3Olsh 359 278 286sh 361 376sh NaOAc 277 298sh 328sh 421 271 305sh 402 NaOAc + H,BO, 280 300sh 421 274 392 AICI 3 dass pnccdc’ns dc Saje,, <¿9921. La Fig. 5.34 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto IV frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.35 presenta el Espectro de Masas del Compuesto IV. ¿Hile REF 1.214,4 260.2941 +0.504 ~0.30,4 re, . 100 (~,DlO. o . ‘80 (<i”D lO.> 37 40.00,4 <411 •0 eOe,4 200.0 2,05 93 50.0<MII>DIO.> 400.0941 400eC’ OeO¿5,4 3 200.0 ? 55 2’6I 92 50.0(MII’DIU. ‘III 450.0 > 456.6<414 8.6174 206,9~ 450.0 9’40 2/05 ‘93 450.6<414 (5e104* 200.0 1002 2’01 93 50.S(NM’DIU.> 450.0<414 456.9 8.066 41 O e 050 (5.68,4 Al; O 1 00 < ÁtD¡U .3 < s,0IV. *0.68,4 208.0 9 49 2’01 SOt’(MM’DTU .;‘ ~P1 45(5.9 93 3 .0.00,4 20(5.9 tt407 2-~’n ‘93 Fíg. t .34: &:patros d~ Ultravioleta del Compuesto IV. 164 5OeOUlN/DS”e 45k 5 N II ‘450.0 .‘‘‘W’s’?’.V4et 0 1,1.1 ¡nt.n tIC 1,rt CRIF ¡sin 573.2 H’,t-?s 573.2 Pí»’ ¡688.66 1 171258 E fl14558 “tases: 288 > ‘698 9 53táti 338 •?U •E,85 Sil 180- 275 68-e el 68— 46— se, 241 4’, 573 [25? 213 ¡ 555 11J i:lSg’ 1 el 286 445 I...l ‘1 e 589 468 388 1~ 585 a. 768 680 888 F¡g. £35.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto IV. 3C-RMN del Compuesto IV comparados En la Tabla 5.18 se muestran los resultados de la ‘ con la bibliografía aneja correspondiente (2,3-dihidro-f¡lonotisflavona y luteolina). En la Fig. 5.36 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto IV. En la Tabla 5.19 quedan reflejados los resultados de la ‘1-iT-RMN del Compuesto IV, estableciendo al igual que para la 13C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5 ~37y 5.38 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto IV, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.37) y el intervalo 4.9-7.2 ppm (Fig. 5.38). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Salm (1992) y Voigt (1993). OH HO H 1 OH OH 6 OH OH O 9y~ 3? 4. O Estructura Molecular del Compuesto IV 165 Tabla 5e18.: Datos de “C-RMN del Compuesto IVe Éri~dk*I’ t3.dJM*o4om4iÑhavn~ 78,3 77,1 -76,8 - 163,6 - 163,6 42,2 44,5 - 42,2 - 102,5 - 102,7 196,2 196,0 - ¡96,0 - 182,0 - 182,0 163,4 163,6- 164,1 5” 160,4 - 160,4 162,1 - 160,5 -160,5 6 95,6 - 95,6 - 95,7 95,6 - 95,6 6” 98,4 -98,4 99,2 - 98,5 -98,5 7 166,7 - 166,5 - 7” 162,1 - 162,1 164,7 - 161,7- 161,7 8 94,7 - 94,5 - 94,8 94,7 - 94,6 8” 103,7 -103,7 94,2 - 103,8 - 103,8 9 163,0- 163,0 - 162,8 163,1 - 163,1 154,8 - 154,7 157,9 - 154,9 - 154,8 10 101,4- 101,4 - 101,7 101,5 - 101,5 10” 102,4 - 102,4 104,2 - 102,1 - 102,1 1’ ¡29,0 - 128,6 - 129,4 129,4 - 129,0 1”’ 121,8 - 121,6 122,1 - 122,0- 121,7 2 118,7 - 118,7 - 2”’ 113,5-113,8 119,3 3’ 143,6 - 143,5 - 3”’ 145,5- 145,5 116,4 4’ 145,2 - 145,4 - 4”’ 149,5 - 149,5 150,1 - 149,6 - 149,5 5’ 114,7- 114,7 - 145,1 114,8-114,8 5”’ 115,4 -115,4 146,2 - 115,6 - 115,5 6’ 117,0- ¡17,0 - 114,2 117,1 - 117,1 6”’ 118.7 - 119.3 113.8 - 118.6 - 1193 166,6 ‘Luteolina y Eriodictiol según Harborne & Mabiy (1982). >2,3-dihidro-ñlonotistlavona según Geiger & Bokel (1989). * ** Componente principal Componente secundario 166 166,5 - 166,4 1 me al ¡tea, e,a?S? se, ev .100 te’.’, Le t•e,r’ e. ea.S.S.?a 0.~e? 5’ ~uk1LALj¡ Ji 1.-e-e e,00 Ce> ,.e ‘a ele msa ¡e? It? 2? lO en .0 lO ~? St II OC flg. 5.36e: Espectro de ‘3C-RMN del Compuesto TV. Tabla 5.19.: Datos de 1H-RMN del Compuesto IV. Cnp~e#t# iv . 5 01*1*1 (¡2 2) 5.09 dd (¡2.2) 5,08 ¿Id (13:3) 5,00 dd (13.3) 327*1*1(17 14) 3.05*1*1(17.14) 2.96 ¿Id (17:¡3) 3.18 ¿Id (17;13) 2 59 ¿Id (18 ) 4 2.19*1*1 (16,-) 4 2.22 *1*1 (17:3) 2,60 dd (17,3) 5 78 *1 (2) 582 d (2) 5,80 d (2) 5,76 d (2) 8 543 *1 (2) 5,76 d (2> 5,73 *1 (2) 5,42 d (2) 5 6,91-7,10 m 4 6.9¡-7.¡0 ni 4 6,94-7,08 ni 4 6,94-7.08 ni 4 6 6,9¡-7,¡0 mA 6,9¡-7,1O ni 4 6.94-7.08 ni 4 6,94.7,08 rosS 3 6.62s 6.66s 6.54s 6.51 6 6,35 s 6.34 s 6.33 s 6.33 2”’ 6,91-7,10 ni 4 6,91-7,10 ni 4 6.94-7.08 m 4 6,94-7.08 m 4 5”’ 6,75 d (8) 674 d (8) 6,72 *1 (8.5) 6,73 *1 (8.5) 6”’ 6,91-7.10 ¡u 4 6.92*1*1(9.-) 4 6,89*1*1 (8,5;!) 6,94-7,08 ni 4 011-5 12,05s 1194s 011-5” ‘2,3-dihidro-filonotisflavona según Geiger & hkel (1989). te — Componenio principal ()y Componente secundario (**) La rehc¡óoa este ambos diasrercómeros esde ¡:¡,2. al contrario que en Geiger & Rokel (¡989). tS~ Seña¡es correspondientes a ¡os 2 hidrógenos situados en posición 3 de la mitad flavanónica de¡ biflavo~. 4 Señales no resueltas. 4 Multiptete no analizable. 167 u JJ.L. 3 1’ Fige> 5.37.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesta IV (1e043.O ppm). e;>, 4JUAe.00eeSVII Fig. 5.38.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto IV (4.9-7.1 ppm). 5.1.3.5. COMPUESTO V (BI-2, BP-6, BS-4) (Dicranolomina o 2’, 6’ ‘-bUuteolina) En la Tabla 510 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto V, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1 (PP. 108). Tabla 5.20.: Datos cromatográficos del Compuesto V. Fluorescencia Rf~ Compueslo’¿ Dicrano¡omina’ Dicrano¡omina’ ¡3V (350 nios) ‘¿O ‘¿O ‘¿O +NH, YO ‘¿O ‘¿O +NA Am Am Am + Benedicí ‘¿O 2, 45 17 ¡7 2, 59 69 69 2, 83 81 1’, 20 54 54 pl 37 43 43 Dicranolomina según Seeger (1992) éui Banramiaponnformis. 2 Dicranolomina según Secger (¡992) en Anacoha ovebhii. (ver pp, 77-78 para sistemas cromasográficos) 168 En la Tabla 5.21 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto V. con y sin la ayuda de reactivos específicos. Tabla 5.21.: Datos de espectroscopia de Uy del Compuesto y (sh= hombro). CtwrnzestoV MeOR 254 288sh 344 NaOMe 267sh 327 399 AId, 274 299sh 422 AICI, + ¡<CI 270 294sh 366 NsOAc 266 328sh 395 272 303sh 406 NaOAc + ¡<31103 2693% 264 274sh 3Olsh 360 390sh ‘dstee pac’dc,tn ele Mrkhan, & col. <19881. La Fig. 5.39 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto V frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.40 presenta el Espectro de Masas del Compuesto V. 4? eStO 250.0 940 2—IZ Zte t<NK’OOU. 400.0 93 210.0 00- t’Z’I2 SSe 0<NN/flOV. 53 ‘ Lesee, ‘e400?,900Z=.eI 04-004 ‘e— 4C 2’52 13 420.09’ .0 e 0 04 9.4300 210.0 10.07 e 2’02 -93 5úe0~tfl’SIVe *40.BUM .090 -s 3’ Y 000 JI?.? 959 Jfl3 SS- 440 e e, ‘0.000 SS 200.9 It 20 3fl3 50- 0e,NM~O0/e 93 Fig. 5e39: Espectros de Ultravioleta del Compuesto V. 169 U Cc’e,,e,: he,de Cr,r 4,4<414 II —YE L11É ES<A’< 0’> OP L’ U je, F Mor,: 264-9 P,ak: U 3 3 1 Irl.—t 260 66 O 264.8 0,40.80 p.aks: 700 3 52’ •ku 2 80— 563.5 2?4.’1 292-9 66— 3,4Sá 69. $ 4,4— 338.9 CU2 —“ .naasAsAUa 2* u 1 iI~ ~ 3¿.’ 41<-? 459.0 ¡ 200.9 254.:’ 590.6 ¡dLW. ¡Lb., e Lja LtflLJUIe6eJ lU?•~ ‘>.0C” U 500 <Jfl: tiLle,. 1 ¡~il~ eX. aiiJL¡’I LIS 405.3 500 ti5eM5MA.S~ .~.[. 68.8 Fig. Se4Oe: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto Va En la Tabla 5.22 se muestran los resultados de la 13C-RMN del Compuesto V comparados con la bibliografía aneja correspondiente (filonotisflavona y luteolina). En la Fig. 5,41 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto V. En la Tabla 5.23 quedan reflejados los resultados de la ~H-RMNdel Compuesto V, estableciendo al igual que para la ‘3C-R.MN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.42 y 5,43 representan los espectros de tH-RMN correspondientes al Compuesto y, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1,0-13.0 ppm (Fig. 5.42) y el intervalo 5,9-7.5 ppm (Fig. 5.43). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Salm (1992) y Voigt (1993). 1 HO E OH OH o o u ‘—a 5— OH Estructura Molecular del Compuesto V. 170 ¡ Tabla 5.22.: Datos de 13C-RMN del Compuesto V. 2 2 166,3 166,5 2” 163,9 163,8 3 106,2 106,4 3 103,3 102,4 4 181,6 181,7 4” 181,2 181,1 5 161,2 161,1 5” 158,7 160,3 6 98,6 98,6 6” 107,9 98,3 7 163,6 163,7 7’’ 161,8 161,4 8 93,1 93,0 8 93,3 103.5 9 ¡57,3 157,2 9” 156,2 154,3 10 102,8 102,9 10” 103,3 103,2 1’ 123,7 124,0 1”’ 120,2 121,7 2 119,7 118,7 2”’ 113,3 113,5 3’ 144,2 144,3 3” 145,7 145,7 4’ ¡48,2 148,3 4”’ 149.6 149,4 5’ 114,3 114,6 5”’ 116,0 115,5 6’ 121,5 120,5 6”, 118.9 118.9 Filonotisflavona según Geiger & Bolcel (1989). Luteolina según Markham & col. (1982). 171 164 103,3 182,2 162,1 99,2 164,7 94.2 157,9 104,2 122,1 113.8 146,2 150,1 116,4 119,3 9991 11 4: U ‘1 ‘4”-> 112 2?Ñ ~1~1 [J W*rá Fige> 5.41.: Espectro de ‘3C-RMN del Compuesto V. Tabla 5.23.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto V 6,04s 6,03 s 6,69 6 5,96d(2) 5,%d(2) 6,22d(2) 8 6.08 *1 (2> 6,08 *1 (2) 6,47 d (2) 5 6,94 *1 (8,5) 6e93 *1(8.5) 6.92 d (9) 6’ 7,¡8 *1 (8,5) 7,18 *1 (8,5> 7,77 dd (2:9> 3” 6.6Ss 6.69s 8” 654 s 6.52 2”~ 7,42 d (2) 7,41 d (2) 5,” 6,89 *1 (8) 6.89 *1 (8) 6”’ 7.43 ¿Id (9:2) 743 dd (8:2.5) 011-5 1278 • 3 - 011-5” 13,¡3 Dscrsno¡omjma según Geíger & Bokel (¡989). ‘Luseo¡ina según Geiger & co¡. (1987). r / -ú flg. 5.42.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto V (1.0-13.0 pprn). 172 71 Fig. 5.43.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto V (5.9-7.5 ppm). 5.1.3.6. COMPUESTO VI (BP-1, BH-1) (Bartramiaflavona o 2-hidroxi-2, 3-dihidro-2 ; 8’ ‘4,2” ‘-biluteolina,> En la Tabla 5.24 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto VI, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (pp. 108). Tabla 5.24.: flatos cromatográficos del Compuesto VI. P¡uoreseencia Rl. U’¿(350nm) Compuesto ‘¿1 ‘¿O +NH, yo +NA ‘¿O + Renedict ‘¿O Banramiaflavona ‘¿O 1 Earnamiaflavona’ ‘¿O ‘¿O ‘¿O 2, 70 69 71 2, 76 77 75 2, 6? 63 67 50 51 46 55 51 54 1’, .C8e.sn S.egrr <l8.’i2>. Ba,vamiaUlavsUa orgún 5.Im <0992>. <‘cf p~ 7148 para lasrm.s erUxnatoslátecss> fl*lvnme.flsVO(eU En la Tabla se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto VI, con y sin la ayuda de reactivos específicos. 5e25 173 > Tabla 5.25.: Datos de espectroscopia de UY del Compuesto VI <sh= hombro). Rset*o& cattpento VI MeOH 263 276sh 328sf, 263 291 3¡Ssh NsOMe 276 392sh 269 344 AIC¡ 3 268 3¡6sh 364sh 275 3¡¡ 3SOsh MCI, + HC¡ 263 312 364 27¡ 321 368 ¡‘laOAc 273 388sh 266 322 NaOAc + ¡<,110, 258sh 304sh 340 262 293 326sh dates pTsccdeflrs de Seeger <29921. La Fig. 5.44 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto VI frente a los reactivos específicos en cada caso. La Hg. 5.45 el Espectro de Masas del Compuesto Vi. 9eSMtiU>’CSH presenta e 5Q~ REF S4 O - U Qe (A’DIO.> 15. 288.8 I’29 93 ID 5,4”?’ ‘4 PI .50.0 2Q0(MII,DJ’J. 35(5 OMM ú .065,4 ?0.(5<t4M”DIO.> III’> 350.0 228.0 15 ‘29 42 93 .,e.O*IK e3v’rI=e REF SA”? •0 .88,4 REF’ 22(5.8<4,5 1.112,4 ‘0.50,4 O e ‘88 < 0e>’D¡U .1 8. 200 < ,4’DIV .3 ¾ •Q.00,4 15 2G 208.0 2/29 93 $4,5? ‘O” 28.O<HVI’DIO> 350.0 228 350.Ot4M REF’ .0.88,4 25 SI 228.8<4K l-’29 eS 93 2,4.0<MPI’DJO. 3 4808<4” ‘4 00 e.076E >:1’1 . E’ 2.275.. a-Q .58,4 1 •‘ .50,4 AXES 0.206 < <~D1U e> o. lee ,4/D¡tJ. e’ Y <411 228 25 3? 1/39 20.0<MM/DJO. ‘93 35*- .0<411 > •8 .80,4 35(5.0 C’ .49C¡,4 2558 22(5.0 1729 ‘93 Fig. 544e: Espectros de Ultravioleta del Compuesto VI. 174 McI 48(5.0 40(50>1,5 sIe> 4,4 e,vI Igl’ It,’ SU? 51910 019? 00’ 500’ 215 2?! 1 6e,— ‘0 VS .--eI 400 40 25? 20’ 241 r :5 -eCl 359 4$> 20? - 30? 202 ~ ¡ . Sf0 •~ ‘1 2e,t eSO 4$Ó 0500 tt 41? 6000 0?’? Fig. 5.45.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto VI. En la Tabla 5.26 se muestran los resultados de la ‘3C-RMN del Compuesto VI comparados con la bibliografía aneja correspondiente (filonotisflavona y luteolina). En la Fig. 5.46 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto VI. En la Tabla 5.27 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto VI, estableciendo al igual que para la ‘3C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.47 y 5.48 representan los espectros de íH~RMN correspondientes al Compuesto VI, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.47) y el intervalo 17-7.4 ppm (Fig. 5.48). Así mismo se presentan los resultados procedentes del Espectro COSY (‘H-’H) realizado en el Compuesto VI (Fig. 5.49). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Seeger & col. (1991) y Salm (1992). O OH ~ 5 HO 0H .0 HO H OHO H Estructura Niolecular del Cornrnwsto VI. 175 OH OH Tabla 5.26.: Datos de 13C-RMN del Compuesto VI. cwbon~ C cs» V~ ~Zom 102,6 200,0 166,5 168,0 168,4 163,8 48,7 sec 55,3 sec 106,4 108,6 t 109,0 t 102,4 194,3 195,2 181,7 182,0 182,3 181,1 160,8 162,2 161,1 5” 158,2 160,0 160,3 6 94,5 u 95,0 t. 98,6 6” 98,5 t. 98,5 te 98,3 7 164,3 165,3 163,7 7” 162,4 162,6 161,4 8 104,1 105,1 93,0 8’ 103,8 104,1 103,5 9 ¡56,7 149,3 157,2 9’ 154,8 155,1 154,3 10 100,2 100,5 102,9 10” 103,1 103,7 103,2 1 129,4 132,1 124,0 1”’ 126,4 127,1 121,7 2’ ¡19,6 120,9 118,7 2”’ 118,3 118,3 113,5 3’ 144,7 144,7 144,3 3”’ 144,4 144,4 145,7 4’ 145.3 145,8 148,3 4”’ 146,7 147,0 149,4 5’ 113,7 t. 114,5 t. 114,6 5’’ 113,1 t. 113,6 t. 115,5 6’ 119,9 t. 122,5 t. 120,5 6”’ 117.4 t. 117>4 t. Filonotisflavona según Geiger & Bokel (1989). 118.9 Luteolina según Markf,ani & col. (1982). Los carbonos secundarios (sec.) y terciarios (u) fueron determinados 176 por la técnica DEPT. 182,2 162,1 99,2 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119,3 “‘en / <elOe>e 1 Sr 5’ Sm 50 9Vf’ 4 y no ‘.0 ib ~;. lEal” Iii • hm me los me mo va e. Sm ml Fig. 5.46.: Espectro de ~C-RMN del Compuesto VI. Tabla 5.27-: Datos de 111-RMN del Compuesto VI. Caflva&W CtwifltVt” , fl*Mtistbv,át • ‘~l1s*~] 7.37s 6 2,36 *1 (17) 3,40 *1 (15) 2,92 d (17)?’?’ 5.38 *1 (15) 5,82s 5,90s 5.75 d (2) 6.22 d (2) — 6,07 *1(2) 6.47*1(2) 8 — - 7,43*1(2) 6,78 d (8) 6,84 *1 (8) 7,01 d (8,5) 6,92 d (9) 7e14 *1 (8) 7.40*1 (8) 7,24 d (8.5> 7.77 dd (2;9) 3” 6.28 s 6,32s 6.62 6” 5,78s 5.785 6.27s — 7,02d(2) - 674 *1 (8) 6.65 *1 (8) 6,89 d (9> - 6”’ 6.78 *1 (8) 6,80 d (8) 7.00 ¿Id (2:9) - 011-5 12,08s 1286s - 011-5” 12.79s ¡2,995 - 2’ 5e 2”’ 5”’ . ‘Fi¡onoúsflavona según Geiger & Bokel (¡989). 2Luteo¡ina según Geiger & ccl. (¡987) * Señales correspondientes a ¡os 2 hidrógenos situados en posición 3 de la mitad ** E¡ espectro CO5Y revela un *1&bi¡ acoplamiento entre estos dos pnroan. 177 flavanónica del biflavonoide. ‘CO. aUlo.’ 001 ,e,m,,. UNU OC .SC~ le,’ ‘NCC 5.?•C PO el-. Fig. £47.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto VI (1.0-13.0 ppm). I1 11 —3-e’ Fig. 5.48.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto VI (5.7-7.4 ppm). A Fig. 5.49.: Esnecíro COSI’ (111-’W del Compuesto VI. 178 / UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGíA VEGETAL 1 lrnMuImflhuI * 5309541679* UNIVERSIDAD COMPLUTENSE FLKVONQU>ES m~4 BAflUSCEAR SunWAEGL (MUSCI~ bkYO?RYTA>~ ASPECtOS QUIMÍOSJflEMXflVOS Y &VWIDA»£IOLQQIC& TESIS DOCTORAL JOSE Autor: DIRECTORA DIRECTOR María José Pérez Alonso Arturo Velasco Negueruela ¿u tw~ \J V0B0 Directora Madrid 1994 0B0 El Compuesto VI es una mezcla de dos ciclo-oxo tautómeros, de ahí que tanto en la Tabla 5.26 como en la Tabla 5.27, se reflejen por separado los resultados de los espectros de 3C y >HRMN para cada uno de los tautómeros. Los resultados procedentes del Tratamiento del Compuesto VI con clorhídrico 2N, tanto a las 2 horas ([1-2) como a las 4 horas ([1-4), fueron los siguientes: Z -Sistema Acético 15%/celulosa: a) en [1-2 se observa la presencia de dos manchas de Rf 66 y 52, frente al Rf de 70 del Compuesto VI patrón sin tratar. Estos resultados apuntan a una posible hidrólisis parcial del Compuesto VI a las 2 horas de tratamiento con ácido. b) en [1-4: igual resultado que en [1-2. Z 3 -Sistema TBA/celulosa: a) en [1-2 se observan dos manchas de Rf 82 y 70. b) en [1-4 se observa una única mancha de Rf 70. 5.1.3.7. COMPUESTO VII (BH-2, RP-2) (Anhidro-RartramiaJlavona o 2’,8’ ‘-8,2” ‘-biluteotina) En la Tabla 5.28 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas croniatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto VII, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1 (Pp. 108). Tabla 5.28.: Datos eromatográficos del Compuesto VII. 2 Compuesto vii Fluorescencia Anhidro-Bartramiaflavona’ Ba,tran,¡aflavona VO VG 53 74 ‘71 84 79 75 81 74 67 65 54 46 54 65 54 UV(3SOnn» yo +NH~ yo +NA VO + Benediel VG Rt It yo Anhideu,-BnrÚan,iafav,x,a según Salns (199W RarÚa,daflavona según Sale, (1992). (ver flp. 77-78 para sisterras crcenatsgrút’irsns) 179 yo En ¡a Tabla 5.29 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto VII, con y sin la ayuda de reactivos específicos. Tabla 5.29.: Datos de espectroscopia de UY del Compuesto VII (sh = hombro). Aúlflm-flrtnSah- R*S4fr* MeO>! 258 281sh 329s1, 257 269sh 302sh NaOMe 274 321sb 273 288sh MCI, 272 314s1a 357sh 271 284s1a 365 MCI, + HCI 263 3O4sh 363s1, 264 275sh 368 NaOAc 267 298sh 266 2SOsh 309sh 266 300sh 266 280sh 309sh NaOAc + H,BO, dale, pre,oOCtWfl OC aoje, IJW¿2 La Fig. 5.50 muestra los respectivos espectros de ultravioJeta del Compuesto VII frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.51 presenta el Espectro de Masas del Compuesto VII. — ‘t;lli. •a.seo 0 25 210.0 =~Ia 93 20. 000M~Olu 40o.0.~o 20.0’”,, OIl.> 400.•000 galga ‘0.01 =fl2 •‘2 400.0 0.069* •0.50A 0—00* 230.0 20.0<..M,Dly.> II 400.0 0056 2.’12 93 400. 060 005’0 0.590 0%t, I04~ 251 2’’: 0’ ~3 .0.•0& 20. lt~t0 =10-~ =L SS Fig. 550.: Espectros de Ultravioleta del Compuesto 180 o VII. 100’ SO” SO’ —l 48’ 243 O——. JI.~ a” j 3g~ ‘It 2*5 203 235 ír =00 ¡ 2k 58? JI 55l 459 501~ 4” <09 708 Fig. 5.51.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto VII. En la Tabla 5.30 se muestran los resultados de la ‘3C-RMN del Compuesto VII comparados con la bibliografía neja correspondiente (filonotisflavona y luteolina). En la Hg. 5.52 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto VII, así como el realizado bajo la técnica DEPT (Seeger, 1992; Seeger & col., 1981). En la Tabla 5.31 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto VII, estableciendo al igual que para la 13C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.53 y 5.54 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto VII, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.53) y el intervalo 5.7-7.4 ppm (Hg. 5.54). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Seeger & col. (1991), Geiger & col. (1993) y Salm (1992). O OH OH HO OH O Estructura Molecular del Compuesto VII 181 ¡ Tabla 5.30.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto VII. Cadron~ C~~nijteSto VII Fitonó#~f1vmn Liteofln~ 2 167,1 166,5 ¡64,5 2” 167,1 163,8 3 108,9 t. 106,4 3 108,9 t. 102,4 4 181,8 181,7 4” 181,8 151,1 5 160,4 161,1 5” 160,4 ¡60,3 6 98,6 t. 98,6 6” 98,6 f. 98,3 7 163,0 163,7 7” 163,0 161,4 8 103,1 93,0 8’ 103,1 103,5 9 154,6 157,2 9” 154,6 154,3 10 102,7 102,9 10” 102,7 103,2 1’ 125,5 124,0 1”’ 125,5 121,7 2 119,1 118,7 2”’ 119,1 113,5 3’ 144,4 144,3 3’ 144,4 145,7 4’ 147,0 148,3 4”’ 147,0 149,4 5, 113,9 u 114,6 5”’ 113,9t, 115,5 6’ 118,7 t. 120,5 119,3 6”’ 118.7 u 118.9 -. Filonotistlavona según Geiger & Bokel (1989). Luteolina según Markham & col. (1982). Los carbonos terciarios (1.) fueron determinados por la técnica DEPT. 182 103,8 182,2 162,1 99,2 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 JJ’hi”i ,sr. it ‘“ fi ‘r’ 1 flT W Fig. 5.52.: Espectro de ‘3C-RMN (y DEPU del Compuesto VII. Tabla 5.31.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto VII. CowSsbVS~ ‘ Fiha&hvet 3 6.26. 6,06. 6,69. 6 574, 5.75 d (2> 6,22 d (2> 6.07 d (2> 6.47 d (2> 8 2 7,43 d (2) 5’ 6.73 d (8) 7,01 d (8.5) 6.92 d (9) 6 6.80 d (8> 7,24 a (8.5) 7.77 oId (2;9) 3” 6,26. 6.62. 6” 5,74, 6,27, 2”’ 7,02 d (2> 6.73d(8) 6,89d(9> 6”’ 6.80 d (8) 7.~> dd (2;9) OH-5 12.64. 011-5 .2.64 1’l~il<>[IS II iVOiia seguro Utlgt E £ ‘Luteolirco segur, Geiger & col. 1 :. ‘~‘K ¿. o. 183 ¡ .111. Fig. 5.53.: Espectro de ‘HRMN del Compuesto VII (1.0-13.0 ppm). ‘11 ~ 41j ~ Fig. 5.54.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesta VII (5.7-7.4 ppm). 5.1.3.8. COMPUESTO vm (BP-7, BS-5.1) (Bartramia-Triluteolina o 2; 8,;2” 8”’‘-triluteolina) En la Tabla 5.32 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto VIII, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1 (Pp. 108). Tabla 5.32.: Datos cromatogréficos del Compuesto VIII. fluorescencia Com~esto VIII Bnans.Tnhjoeoijna Bamnm,atlava,W UV(350,mn) VO VO yO +NH, YO +NA Am Am VO + BenedicÉ YO 32 25 7! 25 60 75 63 69 67 26 32 46 Sl 2! 54 Rf. 1’ 0.ro,nsjafl.,oo,.. ..soo,s S.l’,o ¡0920 PP. ~‘~5 Ot5O5~ cnnloMa ¡e,, 0,ál’otono 184 En la Tabla 5.33 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto VIII, con y sin la ayuda de reactivos específicos. Tabla 5.33.: Datos de Especfroseopta de ¡IV del Compuesto VIII <sh= hombro). Itnadfr. úw*pu*sto lUX MeOH 220sh 256 346 225sh 256 346 NuOMe 270 332sh 395 225sh 270 329s1, 398 AId, 272 296sh 418 273 3OIsh 410 AId, + HCI 262sh 299sh 355 263 307sh 350 397sh NaOAc 265 387 2SSsh 348 NaOAc + H,BO, 265 390 260 368 ‘don pr~edemc. de Seejo. (1992). La Fig. 5.55 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto VIII frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.56 presenta el Espectro de Masas del Compuesto VIII. ‘0.000 259.0 IL’07 2’12 50.0(99/050. 33 4=0.0 420.00” .0.094 0.0460 112: 295.9 ‘93 se. .<“M—oIo.> 440.9009 2•5.• 50.9100. 2.’13 sen *40.9 .03,4 4 .006 .75* . ¡ jo 2l0.9 2.í2 ~92 .9 .9•4 430.000 0.307* •i.t0 VOZ ‘93 L~- ~lO. .•N o 440.9 0.5370 •0.506 •9.750 *4. 10105 0.090 20. .0 II 59 =.‘Lr 50. 0<00,OTu’ •0.999 . =95.0 ~03 jI 32 50. Ot0jOU•Llhd.. =‘l2 •93 Fig. 5.55.: Espectros de Ultravioleta del Compuesto VIII. 185 2?4.S 053.3 ~l. 1 2•S Fig. 5.56.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto VIII. En la Fig. 5.57 queda representado el espectro de ‘t correspondiente al Compuesto VIII realizado bajo la técnica DEPT (Seeger, 1992; Seeger &‘ col., 1981). En la Tabla 5.34 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto VIII. Las Fig. 5.58 y 5.59 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto VIII, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.58) y el intervalo 5.3-7.2 ppm (Fig. 5.59). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se neja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Seeger & col. (1991), Geiger & col. (1993) y Salm (1992). ti a — 1 Fig. 5.57.: Espectro DEPT de ~C-RMN del Compuesto VIII. 186 . Putees - Tabla 5.34.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto VIII. CSmposto VB! t Lugeofina FfrnotMlsvout II Ile ¡lid II lid fi 3/3”] 3”” 6,05s 6,14s 6,18s 6.Oós 6,62s 6,69s fi 6/6” /6”” 5,34 «2) 5,67s 5,70s 5,75 0(2) 6,27s 6.22 «2) E 8 / 8” / 8”” 6.01 0(2) — — 6.07 0(2) - 6,47 0(2) — — 6,64d(2) - 7020(2) 7.430(2) E 5’I5”’! 5””’ 691 0(8) 6.81 d(8) 6,12 0(8) 7.01 0(8,5) 6,74 0(9> 698 0(8) E 6’ 7.10 0(8) 7,06 6,43 dd(8;2> 7,24 0(8,5) 7.~ dd(9;2) 744 00(8:2) 13.02s 13.Ols 1288s l3.ms ¡ ~ 6”’ 1 6 0(8) OH 5/5/5,”’ 1288s l2,89s F¡Ionot¡stlavona según Getger & Bokel (1989) y Seeger (¡992). ‘Luteolina según Geiger & col. (¡987) y Seeger (1992). 1. II, III representan cada uno de los monómeros del triflavonoide (1 i, monómero izquierdo; II c, monomero medio y iii d, monómero derecho) o en SU caso del biflavonoide ‘lo 044 014 n 0 III 0<4 Estructura Molecular del Compuesto 8. k~hh [. . — ¡ .yei... Fig. 5.58.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto VIII (1.0-13.0 ppm). Fig. 5.59.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto VIII (5.3-7.2 ppm). 187 Junto a los resultados de la Bartramia-Triluteolina, hemos creído conveniente presentar los correspondientes al Compuesto BP-X o BS-X, cuya naturaleza ya se comenté con anterioridad. Dicho compuesto es en realidad una mezcla de otros tres triflavonoides y fue inicialmente citado en Bartramiapomifonnis (Seeger, 1992) aunque no se identificó totalmente la naturaleza química de los compuestos que componían la mezcla denominada “BP-X’. Este compuesto, que coincide totalmente con BS-X tiene al menos un 50% de Hartraniia-Triluteolina y el resto corresponde a otros dos triflavonoides, ya que el espectro de masas (Sg. 5.60) al igual que en los datos aportados por Seeger (1992), no ofrece señal alguna correspondiente a biflavonoides y sí un pico de triflavonoide coincidente para los tres compuestos que forman la mezcla BP-X o BS-X. El RMN de protón (Fig. 5.61) indica la existencia de tres uniones diferentes entre los monómeros flavonoidicos, lo que supone la existencia al menos de tres triflavonoides distintos. Dada su complejidad se hicieron diversas pmebas en TLC, con el fin de aislarlos. En el sistema de TLC en celulosa, se utilizaron concentraciones de ácido acético desde el 15% al 40% no consiguiendo en ningún caso separarlos, permaneciendo el Compuesto BP-X/BS-X como una única mancha en la TLC en todos los casos. El principal problema con que nos encontramos fue que en la mezcla, cuando intentábamos separar sus tres compuestos bajo unas condiciones de temperatura de 5~ C., rápidamente los tres triflavonoides que la componían se volvían a unir como uno solo a temperatura ambiente. Por ello, decidimos que la mejor manera de conocer la verdadera naturaleza de los otros 2 triflavonoides componentes, era mediante ciertas y especiales técnicas de RMN, de las que no pudimos disponer durante la investigación realizada con motivo de esta Tesis Doctoral. Por ello preferimos postergar dichas investigaciones para futuros trabajos científicos, en los cuales sí pudieramos disponer de la metodología adecuada para ellos. El hecho de que la Bartrainia-Triluteolina sea precisamente uno de los triflavonoides que componen el Compuesto BP-X/BS-X, nos hizo incluir los resultados derivados de su analítica junto a ésta. Fig. 5.60.: Espectro de Masas del Compuesto BP-X. <ti ¡ 1 Fig. 5.61. Espectro de 1H-RMN del Compuesto BP-X. 188 5.1.3.9. COMPUESTO lix (RS-SA) (Epi-Bartramia-Triluteollna o 2 ‘,8’‘,2”’, 8”’‘-triluteolina) El Compuesto IX resultó ser un diastereoisómero del Compuesto VIII, y de hecho, tanto en las TLC y CC respectivas aparecían como una sola mancha de desarrollo cromatográfico idéntico, que por regla general impedía su separación y purificación. Sólo mediante ciertas técnicas complejas de RMN (COSY) se pudo elucidar su estructura. Por todo lo anterior, se comprende fácilmente que tanto la movilidad cromatográfica (RO del Compuesto IX, su color bajo la luz ultravioleta tras el uso de reactivos específicos, así como sus espectros respectivos de ultravioleta y masas, sean idénticos a los del Compuesto VIII, y por ello no los reflejamos aquí, ya que son los mismos que figuran en las respectivas Tablas 5.32, 5.33 y Hg. 5.56. En la Tabla 5.35 se muestran los resultados de la 13C-RMN del Compuesto IX comparados con la bibliografía aneja correspondiente (filonotisflavona). En la Hg. 5.62 queda representado el espectro de >3C correspondiente al Compuesto IX realizado a 20.0 MHz, así como el espectro-DEPT (Fig. 5.63). En la Tabla 5.36 quedan reflejados los resultados de la 1H-RMN del Compuesto IX, estableciendo al igual que para la 13C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Hg. 5.64 y 5.65 representan los espectros de 1H-RMN correspondientes al Compuesto IX, a 400 y 200 MHz respectivamente, comprendidos entre el intervalo 5.6-7.2 ppm (Fig. 5.64) y el intervalo 6.7-7.2 ppm (Fig. 5.65). Así mismo quedan recogidos los espectros COSY (‘H-’H) (Hg. 5.66) y (‘H-’3C) (Fig. 5.67) de correlación C-H realizados. Los átomos de carbono e hidrógenos del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía Seeger (1992) y Voigt (1993). 5 HO 1 1 OH,, OH II OH o OH OH II nI OH o OH 3—’ <O—, o Estructura Molecular del Compuesto IX. 189 Tabla 5.35.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto IX. 2 166,7 2” 164,6 2”” 165,6 3 106,1<. 106.4t~ 3” 106,lt. 102,4<. 3”” 102,4i. 4 181,5 181.7 4’ 181,4 181,1 4”” 181,9 5 161,1 161,1 5” 160,4 160,3 5”” 160,6 6 98,7 1. 98,6 1. 6” 98,3 1. 98,3 L 6’” 99,11. —- 7 163.9 163,7 7” 161,3 161,4 7”” 161,3 8 93.51. 93.01~ 8” 103,5 103,5 8”” 103,7 9 157,3 157.2 9” 154,6 154,3 9”” 155,2 10 102,9 102,9 10” 103,4 103,2 10”” 102,7 1’ 123,8 124,0 121,9 121,7 1””’ 123,8 2’ 118,7 118,7 190 C~now1X 2 118,7 113,5 t. 2’”’ 113,7 t. 3’ 144,2 145,7 3”’ 145.6 145,7 3””’ 144,1 4’ 148.4 148.3 4”’ 149,6 140,4 4””’ 148.6 114,5t. 114,6L 5”’ 115,7t. 115,5t. 5””’ 114.3t 6’ 120,7 t. 120.5 1 6”’ 118,lt. 118,9i 6””’ 120.7 L Pilonotisflavona según Geiger & Bokel (1989>. Los carbonos terciarios (o.) fueron deteminados por Ja ¡Étnica DFPT. ¡ ¡ 70 ‘0 ¡ ‘ 0 tt~ Fig. 5,62.: Espectro de ‘‘0 30 20 <0 , 0C-RMN del Compuesto IX (200 MHz). 191 pw¡k41k¿kr&b4 ~~¿r~4wtY~srX<) Q~k4tkh) Y! 14 Fig. 5.63.: Espectro de “C-RMN (DEPT) del Compuesto IX. Tabla 5.36.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto IX. II II e III <1 1. Ud H 3 /3’’ ¡ 3’’’’ 5,91s 5,60= 6,6k 6,06= 6,62= 6,69= E 6/6’’ /6’’” 6,11 d(2) 6,14 6,6k 5,75 «2) 6,27= 622 d(2) lJ8jS”i8”” 5,750(2> — — 6,070<2> - 6470<2) 112’ /2”’ /2””’ — — 7,03d(2) 7,020(21 743d(2) U 5’ 7 5’’’ /5”’’’ 6,76 «8) 6,73 d(8) 6,97 d(8) 7,01 «ss> 6,74 0(9) 698 d(8) U 6’ /6”’ 1 6”’’’ 7,17 d(8) 7,12 d(8) 6,98 dd(8;2) 7,24 «8,5> 7,~ dd(9;2) 7 4404(82) OH 5 1 5’’ /5’’’’ 12,88= 12,89s ¡3,02= 13,01= 12,88= segt’ ~jMI Geiger GeigffUBokéV(N89) & col. (1987) y SeegerYS~j~ (1992>. 1, II, III repreZCtnn cadauno de los ¡n>&neroa del uiflavco,ide (Ii, monómero izquierdo; Ile, mondn,ero medio y ¡lid, nntmero derecho) Fulo,,ooisfiavona. 13 00= R~ioliiLioia 2jjjflj~ ji. o en su caso y Fig. 5.64.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto IX a 400 MHz. 192 del bíflavonoide it 72 ‘1 70 60 68 Sl Fig. 5.65.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto IX a 200 MHz. flg. 5.66.: Espectro COSY (‘H-’H RMN) del Compuesto IX. ijkjji ‘ji Fig. 5.67.: Espectro COSI’ QH-~C RMN) del Compuesto IX. 193 5.1.3.10. COMPUESTO X (BS-3) (Ciclo-Triluteolina) En la Tabla 5.37 vienen reflejados los valores de Rf del Compuesto X en los distintos sistemas cromatográficos realizados, así como el color de absorción al Uy y tras la aplicación de reveladores específicos. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (pp. 108). Tabla 5.37.: Datos cromatográficos del Compuesto X. Compuesto 3< Fluorescencia Rl, IJY(3SOnm) yO +NH, YO +NA Am + Bcuedict YO Bartramia-Triluteolina’ Bartramiaflavona’ VG Am VO 2, 44 25 71 71, 74 60 75 23 67 69 67 25 32 46 33 28 54 según Seeges ¡992). Banramiaflav”na según Sa¡m (¡992). eser PP. n-~5 p=rasis¡emascrom’atísgráfluos) B’artramis’Tn¡uteoIina En la Tabla 5.38 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto X, con y sin la ayuda de reactivos específicos. La Fig. 5.68 representa gráficamente estos espectros. Los resultados de la Espectroscopia de Masas realizada sobre el Compuesto X mediante un Analizador de Masas LAMMA de Laser Microprobe en ácido nicotinamídico, reflejaron la existencia de un pico al que se le otorgó un 100% de intensidad a 852 m/z. Tabla 5,38.: Datos de Espectroscopia de 13V del Compuesto X (sh= hombro>. MeOll 267 339sh 253 265sh 289 348 NuOMe 270 396sh 266 327sJi 401 AId, 269 272 300sh 324sh 422 AId, + HCI 268 349sh 260 268sh 294sh 354 380sh NaOAe 267 376s1, 267 322sh 384 NaOAc + H,BO, 267 382sh 260 371 datos procedentes de Geiger & col. (1988) 194 ’ .eú.. ¡ ~ fleo •0. 004, 0*’, HM 440.o 210.0 ¡ 5O.O<NS’31V. ¡=12 210.0 2/15 ‘9= 50.0<Nfl’0l0.> 44V..0MM MM 440.0 0.015* 0.oe~,. 440.ONfI •1 .00— TM.0I’e / \ 0.?0o •0.01,— 50,e<I4¡,’oj<J. >15 ‘02 ‘ 440.ONM “A 440.0 Zj 0.0 0.03rA 12 It tI ¿‘¡5 ‘93 50.0< Ni1’OIu. 9 44U.000A 440.0 0.039* .56’. 3O~% 210.0 ~ HM 440.0 IX’ 0 215’ ‘93 440.OHH 00.,B00 0.04=0 ¡2Zj 210.8 2,15 .93 =0.0<00’8’OIU. 9 ‘40.0.4” 44M 440.0 0.065* Fig. 5.68.: Espectro de Ultravioleta del Compuesto X. La Tabla 5.39 ofrece los resultados del espectro de 13C-RMN realizado sobre el Compuesto X. En la Fig. 5.69 queda representado el espectro de 13C correspondiente al Compuesto X. En la Tabla 5.40 quedan reflejados los resultados de la 1H-RMN del Compuesto X. Las Hg. 5.70 y 5.71 representan los espectros de 1H-RMN correspondientes al Compuesto X. comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm a 400 MHz (Fig. 5.70) y el intervalo 5.8-6.8 ppm a 200 MHz (Fig. 5.71). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Seeger & col. (1991), Geiger & col. (1993) y SaIm <1992). Así mismo se realizó un espectro CQSY (‘H-13C) de correlación C-H (Hg. 5.72) (Geiger & col., 1993a) del Compuesto X. 195 Tabla 5.39.: Datos de 13C-RMN del Compuesto X. Carbonos ~nj.jps,g~~t~ A~’”’’> C~rbouns 0-2 164,8 0-2” 164,8 0-2”” 164,8 0-3 106,7 108,9 0-10”” 0-3” 106,7 108,9 0-1’ 0-3”” 106,7 — 0-1”’ 0-4 181,1 181,8 0-1””’ 0-4” 181,1 181,8 0-2’ 04”” 181,1 --- 0-2”’ 0-5 160,4 160,4 0-2””’ 0-5” 160,4 160,4 0-3’ 05”” 160,4 —- 0-6 98,0 98,6 0-3””’ 0-6” 98,0 98,6 04’ 0-6”” 98,0 — 04”’ 0-7 162,4 163,0 04””’ 147,6 — 0-7” 162,4 163,0 0-5’ ¡¡4,6 ¡13,9 0-7”” 162,4 — 0-5”’ 114,6 113,9 04 103,3 103,1 0-5””’ 114,6 — 04” 103,3 103,1 0-6’ 118,6 118,7 04”” 103,3 — 0-6”’ 118,6 118,7 0-9 154,6 154,6 0-6””’ 118,6 0-9 154,6 154,6 datos X de la A,jhidrobamant¡allavona según Seeger (1992) Estructura Molecular del Compuesto X. 196 — ¡ Iii LMÉÑXL A ~ ~%rt’rQ srA ¡pon’) ‘30 ‘0 $60 ‘40 150 ¡~o ~0 ¡¡0 00 flg. 5.69.: Espectro de “C-RMN del Compuesto X. Tabla 5.40.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto X. 2 frotoas Com#nasw 1’ H-3 5.935 5,74s 6,06s 5,93s 5,74s 6,62s 5,93s —- —- H-6 6,32s 6,26s 6,07d (2) 14-6” 6,32s 6,26s 6,27s 14-6”” 6,32s -— 11-8 --- —- 5,75d (2) 14-2”’ -— —- 7 ,02d (2) 14-5’ 6,lOd (8) 6,80d (8) 70k! (8) 6,70d (8) 6,SOd (8) 6,74d (9) 6,70d (8) —- 11-6’ 6,34d (8) 6,73d (8) 7,24d (8) 14-6”’ 6,34d (8) 6,/3d (8) 7.OOdd (2;9) 11-6””’ 6,34d (8) —- 011-5 l2,66s 12,64s 014-5” 12,66s 12,64s 014-5”” l2, 66s “ a~bai’~»~ -— datos procedentes de Seeger (1992>. datos procedentes <le Geiger & Bokel (¡989), 197 Pllotstsftavmm ¡¡ Fig. 5.70.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto X a 400 MHz. St 54 E ‘ — Fig. 5.71.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto X a 200 MHz. _—tAj_ SQ 2 rs tú Fig. 5.71: Espectro COSI’ (‘H-’3C RMN) dei Compuesto X. 198 Finalmente, hemos querido presentar junto a los resultados de la Ciclo-Triluteolina Tq~ del Compuesto BS-1, que como ya se refirió con anterioridad está íntimamente relacionado con la CicloTriluteolina, dc a misma manera que lo están la Bartrarniaflavona y la Anhidrobartramiaflavuna. El Compuesto RS- 1 se intentó aislar mediante CC en polianiida pero apenas se obtuvieron trazas poco definidas. De acuerdo a Geiger (com.per.), BS.-1 podría tratarse del compuesto resultantc ~e la deshidratación de la Ciclo-Triluteolina y cambiar hacia ésta (BS-3) en el interior de la columna cromatográfica. Mediante deshidratación en medio ácido de BS-3 podría obtenerse el otro ccmpuesío que se correspondería con BS-I, aunque el problema que se planteé fue la imposibilidad de eÑtablecer la correspondiente comparación entre BS-1 y el compuesto obtenido por deshidratación de BS-3, por no poseer Compuesto 135-1 con el que comparar ya que, rápidamente, incluso a50 C,,se transiurmaba en el interior de Ja columna. Unicamente hemos podido realizar los espectros de Ultravioleta del Compuesto 135-1, que se presentan en la Fig. 5.73, ya que no pudimos disponer de cantidad suficiente para acometor otras técnicas ana!íticas. tic’ 3- •0~ 0” XI’ ‘e’ <‘:00’ 5’>. 0~j ojo. tI’’’. • 50. 93 ¿4> ¡ LIC:. ‘3,005 I _________________________________________________________ Fig. 5.73.: Espectros de ultravioleta del Compuesto BS-1. 199 5.1.3.11. COMPUESTO XI (BI-6) (5‘-OH-Amentoflavona o Iuteolina-5’, 8’ ‘-apigenina) En la Tabla 5.41 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto XI, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (Pp. 108). Tabla 5.41.: Datos cromatográficos del Compuesto XI. compuesto XI 5’-OH-amentoflavona yo yo YO YO +NA Am Am + Benedict YO YO 3 6 59 58 89 91 71 40 ______________ Fluorescencia IJV(350nm> +NH 3 Rf~ 37 5 -O¡l’aInenInflavn’í’a segI~ Geiger & t1. I~00) en rIaeIontIIIIim flofliIn. (ver pp. 77-70 paTa sis¡emas XrIImatográfICIJs) En la Tabla 5.42 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto XI, con y sin la ayuda de reactivos específicos. Tabla 5.42.: Datos de Espectroscopia de 11V del Compuesto XI (sh hombro). R~4t~És CCPtM# Xl MeOH 265 291sh 343 253 265sh 289 348 NaDMe 272 325sh 388 266 327sh 401 AICt 272 3Oósh 352 410 272 3msh 342sh 422 AICI, -s- IlCí 255 269,1=304 345 260 268sh 294sh 354 380=1= NaOAc 269 313sh 371 267 322sh 384 263 360 260 371 NaOAe + 1131103 I1aII}=prílIXTuellíes Ge t,eíger & CIII. (1900>. 200 La Fig. 5.74 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto XI frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.75 presenta el Espectro de Masas del Compuesto XI. 450 0.8’ 0,6’ O’’ 0.2’ 450 Fig. 5.74.: Espectros de T.Jltravioleta del Compuesto XI. 5! le 30 1 1. u 08. 5t lál <u u. ~. ,a. fl ‘fl •88 SU Fig. 5.75.: Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto XL 201 55* 604 Oh En la Tabla 5.43 se muestran los resultados de la ‘3C-RMN del Compuesto Xl comparados con la bibliografía aneja correspondiente (amentoflavona y 5’,3”’-dihidroxi-anientoflavona). En la Fig. 5.76 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto XI. En la Tabla 5.44 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto XI, estableciendo al igual que para la ‘3C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.77-A y 5.77-B representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto XI, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.Oppm a400 MHz (Hg. 5.77A) y el intervalo 6.0-7.7 ppm a 200 MHz (Fig. 5.77-B). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992), Geiger & col. (1988 y 1993a). OH II. 1 OH 2 1 HO •40 O £ OH OH o Estructura Molecular del Compuesto XI 202 Tabla 5.43.: Datos de 13C-RMN del Compuesto XI. ¡ C~rbono~ 2 Auwntflvos~ Sa S~-4QWamwto? 2 163,8 164,1 163,9 2” 164,2 164,3 164,0 3 103,0 103,2 102,9 3” 102,6 102,8 102,5 4 182,2 181,9 181,9 4’’ 181,7 182,2 181,5 5 161,1 161,6 161,4 5” 160,7 160,8 160,4 6 99,0 98,8 98,7 6” 98,9 99,1 98,6 7 164,2 163,9 164,0 7” 162,6 161,9 161,7 8 93,9 94,2 93,8 8’’ 104,4 104,1 104,0 9 157,5 157,6 157,3 9” 154,7 154,7 154,5 10 103,8 104,0 103,6 10” 103,8 104,0 103,6 1’ 120,5 120,3 120,6 1”’ 121.6 121,4 121,8 2 112,0 131,6 112,1 2’” 128,3 128,3 118,6 3’ 146,2 116,4 145,5 3”’ 115,8 116,0 145,8 4’ 149,0 159,6 148,2 4”’ 161,7 161,1 149,4 5’ 120,4 121,7 120,0 5’” 115,8 116,0 115,5 6’ 122,5 127,9 122,2 6’’’ 128.3 128.3 118.6 Amentoflavona según Markham & col. (1987). 5,3’ “-diOH-amentoflavona según Geiger & col. (1988). 203 ,o.a ~oo’j I,n.., ~O’.¡ 50.0 iflOd Fig. S.7&: Espectro de ~C-RMN del Compuesto XL Tabla 5.44.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto XI. “y ‘4 3 6,77s 6,74 s 6.68 6 6,25 d (2) 6,22 d (2) 6,21 d (2) 8 6.49 d (2) 6,50 d (2> 6.45 0 (2> 8,07 0 (2) 751 d (9) 7,19 d (9) 7,9900 (2$) 7.52 d (2~ 6.81 o 6.72 6,45 o 6.41 $ 7.510(9> 7,09d(2) 6,77 tI <9) 6,77 d (9> 6,700 (8) 7570 (9) 7.07 dd (2;8) 13,09 o 13,01 12,97s Amento3i~VWna sej/iffMark¡¡am & ce. (1SIL<~). 5’,3”’-diOFI’amentoflavorc¡ según Geiger & col. (1988). 13.14 o 204 Fig. 5.77 - A: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto XI a 400 MHz. 1 Fig, 5.77 - 9~1 1 B: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto XI a 200 MHz. 51.3.12. COMPUESTO XII (BP-8) (Ácido Bartrámico o luteolina-8, 2’‘-ácido protocatéquico) En la Tabla 5.45 se exponen los resultados procedentes de los distintos sistemas cromatográficos realizados, en los que se puso de manifiesto la identificación del Compuesto XII, que son así mismo comparados con la bibliografía respectiva. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (pp. 108). En la Tabla 5.46 se presentan los resultados de la Espectroscopia de Ultravioleta realizada sobre el Compuesto XII, con y sin la ayuda de reactivos específicos. La Fig. 5.79 muestra los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto XII frente a los reactivos específicos en cada caso. La Fig. 5.78 presenta el Espectro de Masas del Compuesto XII, 205 Tabla 5,45.: Datos cromatográficos del Compuesto XII. Fluorescencia UV(350nm) Compuesto XII Filonotisflavona’ 2 Filonotistlavona YO VO YO Am Am YO Am + Benedicí Rf, YO 4 20 46 30 4 52 74 75 4 63 77 32 33 54 36 42 45 Pílonotisflavona segun Salm (1992). Filonotisflavona según seeger (1992). (ver PP. 77-78 para sistemas cromatográfleos> Tabla 5.46.: Datos de espectroscopia de UV del Compuesto XII (sh= hombro). E*»pfleS~1T L#itsfrt MeOH 255 274sh 294 34 253 265s1s 289 NaOMe 271 404 266 327sh 401 AICI, 276 308s1, 335s1, 429 272 3msh 324s1, 422 AICI, + HCI 261sh 279sh 297s1, 357 393sh 260 268sh 294sh 354 380s1, NaOAc 268 341 267 322sh 384 NaOAc ‘4- 1131103 232 262 3OIsh 372 260 371 procedentes de Geiger & col. (1988). E “*0.: II ‘05 ‘1,0* jICOIE Crí It LS 00.1.1 C,’J 000.1 2’¡.E loEjo 1 3415 *0’0’ ]fl.á liC 1 9 PjM~ ‘e- nEO, E4,EE 55,2 21 •j.l0.S 14*3*0< • PEIEE ‘42 “s.j <‘810 h50<0 Sola ‘3’., jo,.. ‘e 204.’ ¡ ‘datos 114 2 215.t fl III’ II .‘,4I.U*&SJ&S.S*MS SSE LU* MW !i~ 4,’., ‘jo., .1 III 1*’ ‘4* Fig. 5.78. Espectro de Masas (FAB-EM) de~ Compuesto XII. 206 < 4< 2/ls 4>~I~> . 50.CtIar,0¡I’, ‘9= IX 07 ¿“IP 50,0< MMDI”, ‘93 . 250.0 HM 200.0 440>1< u 01470 ¡la Os’, e, I~o0&c ½ =80.0 50. 0’NIt’0l’.’. ‘ =10.0 ¿‘IP ‘0= HM 440.’:’ It $5. 9<NM.’OSV. 44< >14 000 ‘85’ 440.0 543 ‘80 05>1 “0.00* ¿¡0.0 ¡705 ¿‘12 ‘93 5t.OIMIV’DS0I. 14” 440.01 440.0MT.3,2’X3.~ las Oso 17 2 _____________________________________ 50.0’ItM,0SV. ‘ 210.0 52 9= 4412.0 440.014 Fig. &79: Espectros de Ultravioleta del Compuesto XII. En la Tabla 5,47 se muestran los resultados de la ‘3C-RMN del Compuesto XII comparados con la bibliografía aneja correspondiente (filonotisflavona y luteolina). En la Fig. 5.80 queda representado el espectro de ‘3C correspondiente al Compuesto XII. En la Tabla 5.48 quedan reflejados los resultados de la ‘H-RMN del Compuesto XII, estableciendo al igual que para la ‘3C-RMN, la correspondiente comparación entre los datos proporcionados por el compuesto problema y los aportados por la bibliografía. Las Fig. 5.81 y 5.82 representan los espectros de ‘H-RMN correspondientes al Compuesto XII, comprendidos respectivamente entre el intervalo 1.0-13.0 ppm (Fig. 5.81) y el intervalo 6.4-7.5 ppm (Fig. 5.82). Los átomos de carbono e hidrógeno del compuesto problema se asignaron mediante comparación con la bibliografía que se aneja en cada tabla, así como de acuerdo a Seeger (1992) y Seeger & col. (1992b). 207 HO <1 OH HO HO 01-1 OH O Estructura Molecular del Compuesto XII Tabla 5.47.: Datos de “C-RMN del Compuesto XII. 2/2” CÓgutqXU ¡63,6 I1h~wt. ¡66,5 313” 102,1 4/4” Ysó~jót.’ ~ 1 ~‘ ~‘St— ~ 163,8 ¡63,9 - 106,41. 102,4 E 102,8 - 182.0 1817 181,1 181.6 - 5/5” ¡59,7 161,1 160.3 ¡61,4 6/6” 98.4 98,6 t. 98.3 u 98.8 - 7/7” 161,7 163,7 ¡61.4 164,1 - 818” 104,8 93,0t. 103,5 93,8 - 9/9” 154,3 157,2 154,3 157.2 10110” 103.4 102,9 ¡03,2 103,7 - I’11”’ ¡21,9 124,0 121,7 121,5 - 113,5 118.7 113,5s. 113,3 - ¡45,4 ¡44.3 145.7 145.7 - ¡49,3 148.3 ¡49.4 ¡49.6 - 515”’ 115,5 ¡¡4,61. 115,5 t. 116,0 - 6’/6”’ 118,4 120,5 t, ¡18,9 u 118,9 1/1” • 123,3 - - 121,7 212” • 120,6 - ‘ - 115,1 3/3” • ¡43,8 - - . ¡44.8 414” * 148,7 - - - ¡49,9 5/5<’ • 113.6 - - - 116,5 6/6” • 122,1 - - 121.8 COOH 167,7 3’13”’ Filonot,sflavona según beiger & 2 Luieolina según Markbam ccl. & ‘ , Sotel <¡9~9), <u): monómero dereeho, <1982). los aubonos del ácido protocatéquico. Los carbonos tercIarios Sucron determn¡nados por cl método DE?!. tu: inooornero izquierdo. 0 Resonancias correspondientes a 1’ :~t’~: :i:;!L>”’t~’ 11< ! 208 ¡67.2 jo jo . E. I• ‘‘ íj 11< II. ,,, jo jo E’ Ij < < la Fig. 5.80.: Espectro de 13C-RMN del Compuesto XII. Tabla 5.48.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto XII. tóntss 1~1t flhnú 0 Wte0tA «» LtaéQ” A4 ?tettnUgs, 3/3” 6,56s 6,06s 6,62s 6,69s - 6/6” 6,25s 5,75 d<2) 6,27s 6,22 d<2) - 8/8” — 6,07 d(2) — 6,47 d(2) - 6,98 d(2) - 7,02 d(2) 7,43 d(2) - - 5’15”’ 6,69 d(8,5) 7,01 d<8,5) 6<74 d(9) 6,92 d(8> 6,93 dd(9;2) 7,24 .1(8,5) 7,00 dd(9;2) 7,44 dd(8;2) OH-5/5” 12,98s 12,73s 13,Ols 13,OOs - 2 - - - 7,32 .1(2) 5/5” 6,88 .1(8,5) - - - 6.77 .1(8) 6/6” 7,39 d(8.5) - - - 7,27 dd<8;2) Filonodsfla4ona según Geiger & Bokel (1989), (0): monémero dereeho, ‘Luteolina según Geiger & col. (1987). * Resonancias correspondientes a ¡os protones del ácido protocatAqu¡co. fi ~ (5’): monÓmero ‘izquierdo. un ~Sa~j%HJ u 11 i ,.ia la 5< Fig. 5.81.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto XII (llaO-13.0 ppm). 209 0= a” ‘1 1’1 Fig. 5.82.: Espectro de ‘H-RMN del Compuesto XII (6.47.5 ppm). Dado que el Compuesto XII, que fue identificado como el Acido Bartrámico, poseía una estructura molecular típica de un flavonoide monomérico, pero en posición C-8 portaba un grupo ácido, concretamente el ácido protocatéquico, decidimos incluir junto a los resultados del Compuesto XII los relativos a dicho ácido, que han sido debidamente comparados en las Tablas 5.47 y 5.48. La Fig. 5.83 muestra el espectro de ultravioleta del ácido protocatéquico, mientras que en la Pig. 5.84 se ofrece su espectro de masas. Fig. 5.83.: Espectro de Ultravioleta del Acido Protocatéqulco en MeO)!. ‘SS’, Fig. 5.84.: Espectro de Masas del Acido Protocatéquico. En la Fig. 5.85 se muestra el espectro de 13C-RMN del Acido protocatéquico mientras que la Fig. 5.86 ofrece el espectro de H-RMN del mismo compuesto. 210 1. 1.’ II 9 Fig. 5.85.: Espectro <le ‘3C-RMN del Ácido Protocatéquico. Fig. 5.86.: Espectro de 1H-RMN del Acido 5.1.3.13. COMPUESTO XIII (1)5-7) (Diosmefina-7-O-triglicósido o 4 ‘-metiléter-7-O-triglicósido-apigenina) El Compuesto XIII se identificó en Dicranum scoparium (DS-7) pero únicamente en la TLC, no pudiendo ser aislado y purificado mediante CC. No obstante, y dado que se identicó fácilmente por cromatografía comparativa con patrón, hemos creído conveniente, al igual que para los Compuestos XIV y XV, presentar los resultados disponibles, a pesar de tratarse de flavonoides glicosilados, y no de biflavonoides o triflavonoides que son el objeto “central” de esta Memoria Doctoral. La Tabla 5.49 recoge los resultados de los diversos sistemas de TLC realizados, en los que se puso de manifiesto la presencia del Compuesto XIII. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla 5.1. (Pp. 108). La Tabla 5.50 contiene los resultados de la espectroscopia de ultravioleta realizada sobre el Compuesto XIII. 211 Tabla 5~49~: Datos cromatográticos del Compuesto XIII. I)iosmetina27-Otriglicésidó’ Compuesto XIII Fluorescencia IJV(350nm) VG ‘JO + N1~I 3 VeA VeA + NA ‘VG 4’ Benedict Rl, z2 z3 ¡2• pl 1 Diosmaina-7-O-trig¡icós’sdo según Ósterdahl (19’78h). (ver pp. 77-78 para sistemas croratográf’ícos) Tabla 5.50.: Datos de espectroscopia de ultravioleta del Compuesto XIII. ‘1 haedv*M ~,~““$‘~‘i ‘Comp neto $W MeOH 256 270 342 252 267 343 NaGMe 269 330 391 266 325 383 AId, 266sh 274 296sh 370sh 386 265sh 272 294sh 365sh 384 AId!2 + CIII 268sh 275 296sh 364 382sh 264sh 274 294sh 357 381sh NaOAc 2SSsh 268 340 258sh 266 339 NaOAc + H3B0, 2SSsh 268 347 254sh 266 345 Diosmetina-7-O-Irigl¡c&¡do según Osterdahl (¡978h). cc>0 CH2OH HO o O CH 3 HO HO OH 0CM3 O CH3 HO OH Estructura Molecular del Compuesto XIII 212 5.12.14, COMPUESTO XIV (1)5-5) (Apigenina-7-O-triglicósido o 5,3 ‘-diOH-7-triglicósido-flavona) La Tabla 5.51 recoge los resultados de los diversos sistemas de TLC realizados, en los que se puso de manifiesto la presencia del Compuesto XIV, Las abreviaturas son las que figuran en la Tabla 5.1. (Pp. 108). La Tabla 5.52 contiene los resultados de la espectroscopia de ultravioleta realizada sobre el Compuesto XIV. La Fig. 5.87 ofrece los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto XIV frente a reactivos específicos. Tabla 5.51.: Datos cromatográficos del Compuesto XIV. Compuesto XIV Fluorescencia UY(3SOnm) YO Apigenina4-O. 1 triglicósido ‘JO + NH, VeA VeA +NA Am Am + Benedict YO 39 4 40 - 46 Pl 45 - P 2 - Apigenina-7-O-Ir¡g¡ic~sido según Nilsson & col. (¡973). (ver Pp. 77-78 para sistemas cromatográficos) CH2OH OH HO o O CH3 HO OH OH O O HO CH3 HO OH Estructura Molecular del Compuesto XIV 213 Tabla 5.52.: Datos de espectroscopia de ultravioleta del Compuesto XIV. RncttvM Cúwpu~$tu Apfruino7O4nuflv4stde MeOH 268 334 270 335 NaOMe 237sh 269 291sh 345sh 385 254 269 307sh 390 274 295sh 342 371s1’¡ 277 301 351 383 AId3 + HCI 275 295sh 340 372sh 278 301 345 383 NaOAc 266 337 260 270 295sh 390 NaOAc + H3B03 268 334 270 341 t AICI 3 Apigenina7-O-¡rigl’icúsido según Nilsson & ccl. (1973) ‘6.4<4 NOM e’í,’. a,”Dij. 14” 0’4 50.oíw,.ot’j. 2’ZD la’. ‘“ 44’> ‘1314> ‘1 ¡ ~6U 25* ‘E ‘la =‘Z3 55.0<14>305V 1 •44.0 ‘5¿ ‘.1.24, ‘4.0<0 ‘0.000 210.0 ‘~ 400.0140 4.OZ2 6 2’Z 50.0’nnIoit>, ‘fi~ ¡ 3’:) ‘‘‘,‘u”. “3 la’-E’---- ‘“e— >41 >23 44la.1314r ‘>.O3oaj ______________ 1>>’ ____________________________________________ 32) ‘3 Fig. 5.87.: Espectros de ultravioleta del Compuesto XIV. 214 5.1.3.15. COMPUESTO XV (1)5-6) (Luteotina-7-O-neohesperidósido o 4‘-OH-7-O-neohesperidósido-apigenina) La Tabla 5.53 recoge los resultados de los diversos sistemas de TLC realizados, en los que se puso de manifiesto la presencia del Compuesto XV. Las abreviaturas son las que aparecen en la Tabla Sil. (pp. 108). La Tabla 5.54 contiene los resultados de la espectroscopia de ultravioleta realizada sobre el Compuesto XV, La Fig. 5.88 ofrece los respectivos espectros de ultravioleta del Compuesto XV frente a los reactivos específicos utilizados. La Fig. 5.89 muestrael espectro de masas del Compuesto XV. Compuesto XV Fluorescencia . Tabla 5.53.: Datos cromatográficos del Compuesto XV. Luteolina-tÓ-neohespi UV(350nm) yo yo + NH, VeA veA +NA Am Am + Benedice yo Rl> 4 20 18 63 63 40 33 23 1% - LuteolIna’7’0-nelnesperidósido según Ste’m & Zin=me¡ster(l%’8J>. (ver pp. 77-78 para s’istemas cromatográficos) Tabla 5.54>: Datos de espectroscopia de ultravioleta del Compuesto XV. Cwt4 ~W MeOH 2lSsh 255 264sh 254 267sh 348 NaOMe 265 286sh 389 263 295sh 388 233sh 273 291sh 325sh 419 235 272 297sh 320 367gb 424 AlO3 + HC¡ 266sh 272 289sh 354sh 384 260 273sh 294sh 359 380sh NaOAc 262 397 259 362 400sh NaOAc + 113B0, 263 381 259 372 MCI 3 ‘Luteoilna-7-0-neohesperidósido según SIejo (¡9881=). 215 Nat~ e .50< ‘“‘01>1. ‘‘113< ‘la 2 250., ¿lo.’> y.,.:; 0> 50.u’ <an’Oi”.’ nr 1~ 1 b~&4oA~ Oir “0 1 cal,’’’> 1 >0 ‘1 Y 50.’>>””’ 01V.’ •aO.*1413 la’’>’ fin.’. e- ‘la’” lala~>.jo14fl Áta3fl A — 5<. 0IE’fl’ 01V. ¿10.6 •4’>..’ I.OV5la . 210.6 ‘~53’~~ jI %Z:g~5 1~~~~ ‘1 1’ ¡ e 1 la.. ‘ ÓOE 0’. IX, ‘““O.. alo’” rl,’’ laíj.u.,,e’0i’,. ‘..lan,*14~ 011 ‘>.¶;5’, Fig. 5.88.: Espectros de ultravioleta del Compuesto XV. 100 595 80 60 e 4, 448 256 ni/e I se ó 617 411 ido 200 300 400 500 Fig. 5,89.: Espectro de masas (FAB-EM) del Compuesto XV. 0Ff 6” ‘OH 3 Estructura Molecular del Compuesto XV. 216 600 5.2. ACTIVIDAD BIOLOGICA: ANTI-VIH. La Tabla 5.55 recoge los valores respectivos de CC50 (gg¡ml) y de EC50 (p.gIml), así como los valores del Indice Terapeútico, establecido para la droga control en 25.000 La Tabla 5.56 ofrece los resultados del estudio de actividad anti-VIH de las 15 muestras flavonoidicas frente al patrón ddC. En dicha tabla se recogen los valores del porcentaje medio de supervivencia celular en cultivos infectados y tratados con drogas (% superv. cel.), la evaluación de la efectividad de la droga ensayada (Eval.), la toxicidad referida a la concentracción de la droga que permite una supervivencia del 70% de las células en cultivos no infectados (droga no tóxica) o una muerte celular superior al 70% (droga tóxica) y el porcentaje medio del antígeno vírico p24. Para cada droga (muestra flavonoidica), se presentan los resultados correspondientes a diversas concentracciones (gg¡ml) ensayadas. Las concentracciones superiores o inferiores de cada droga que no aparecen en la tabla, no ofrecieron resultados significativos que impliquen su ubicación en ella. El número de células totales H9 de los cultivos no infectados fue de 1.59 millones. El valor de p24 de los cultivos no tratados (control) osciló entre 6624 pg/ml y 5255 pg/ml en los cinco cultivos realizados, y su cálculo fue la media entre ellos cinco. Tabla 5.55.: Valores de algunos índices del ensayo anti-VIH. q/ml~ _____________ E% &zglm» ¡Mice Tcr*pel$Uco 3 pura ‘>20 a «100 50 ‘>0.4 a «2 4 pura 25 20 ‘>0.8 a «4 7 9 pura pura ‘>20 a «100 20a«100 » ‘>100 80 10 pura 20 2 11 pura ‘>100 20 12 pura ‘>100 42 13 pura 0100 52 14 pura ‘>100 60 lalalaS 4.3 10 ‘>5 ‘>2.4 ‘>1.9 ‘>1 7 15 pura 4 0.8 5 Valor de CC ji 50: este valor se refiere a la concentraccién del agente de ensayo o droga que inhibe el 50% del crecimiento de las células que no habían sido previamente infectadas con VIII. Valor de EC50: valor que se refiere a la concentraccién de la droga que inhibe la replicacién del virus en un 50%. Indice Terapéutico: Se calcula a través del cociente entre la toxicidad del producto (CC,~) respecto a su actividad (PC50). 217 Tabla 5.56.: Resultados de los ensayos ant¡-VIH de 15 muestras flavonoidicas. I~zEaga. Cl1~1Rmttafi1ti6~ % mts~tt.1*. e~I :.:‘.:::~:s 1 20 0 98 no tóxica ¡99 4 1 06 no tóxica 133 08 101 notóxica 150 20 085 notóxica 257 4 ¡ 02 no tóxica 244 08 100 notóxica 186 016 líO no tóxica 137 20 090 notóxica 69 4 0.91 no tóxica 109 0.8 0.97 no tóxica 114 20 0.98 no tóxica 59 4 0.99 no tóxica 123 0.8 1.00 no tóxica 119 100 0.68 tóxica -10 20 0.92 no tóxica 108 4 0.92 no tóxica 115 0.8 0.96 no tóxica 84 20 0.87 no tóxica 129 4 0.88 no tóxica 120 0.8 0.98 no tóxica 70 20 0.91 no tóxica 56 4 0.94 no tóxica 99 0.8 0.94 no tóxica 88 20 0.95 no tóxica 77 4 0.95 no tóxica ¡59 0.8 0.95 no tóxica 141 100 0.82 no tóxica 39 20 0.93 no tóxica ¡23 4 0.94 no tóxica 104 0.8 0.97 no tóxica 109 20 0.53 tóxica -8 4 0.80 no tóxica 27 0.8 0.88 no tóxica 78 2 3 4 5 6 7 8 9 10 218 :.:X:s:X :~~: ~fi~4~d:k ..:X.~>~:<.>>’X.>viX.%.:~jfl I~jal. * * ** ** 11 12 13 14 15 ddc ‘Ved ~ 100 0.74 no tóxica -7 20 0.92 no tóxica 47 4 0.95 no tóxica 105 0.8 0.97 no tóxica ¡06 100 0.76 no tóxica ‘9 20 0.85 no tóxica 92 4 0.86 no tóxica 100 0.8 0.92 no tóxica 159 100 0.87 no tóxica 4 20 0.92 no tóxica ¡49 4 0.94 no tóxica 150 0.8 0.94 no tóxica 117 100 0.73 no tóxica 16 20 0.88 no tóxica ¡38 4 0.91 no tóxica 164 0.8 0.97 no tóxica ¡25 20 0.41 tóxica -37 4 0.49 tóxica -28 0.8 0.86 no tóxica 42 10.5 0.92 no tóxica -21 2.1 0.94 no tóxica -28 0.42 0.96 no tóxica -33 0.084 0.99 no tóxica -42 ** Porcentaje medio de p24 (% p24): Su cálculo se realiza a partir de la relación entre el incremento de p24 de los cultivos tratados respecto a los no tratados (control)~ Según su valor se consideraron tres niveles de efectividad de la droga: 1) 2) 3) * valor de % p24 entre 50-69% valor de % p24 entre 2549%. valor de % p24 menor del 25%. Porcentaje medio de supervivencia celular (% superv.cel.): es el cociente entre el número dc células que sobreviven en los cultivos infectados y tratados con droga frente al número de células totales de cultivos no ** *** infectados (calculado en 1.59 millones). Toxicidad de la droga: mide el límite de supervivencia celular frente a una determinada concentración de droga. Se considera que una droga no es tóxica cuando sobreviven más del 70% de las células en cultivos controles que no estaban infectados, Si se produce una muerte celular superior al 70% del total de células se considera que dicha concentración de droga es tóxica. Concentración de la droga: en ~M. 219 r YCV’> ‘rs’ y En la presente Memoria Doctoral se aislaron e identificaron un total de 15 compuestos con estructura flavonoidica. De ellos, 8 fueron biflavonoides, 3 triflavonoides, 1 ácido flavonoidico y 3 flavonoides glicosilados. En primera instancia presentaremos las discusiones respectivas a la elucidación de la estructura de cada uno de dichos compuestos, cuya identificación fue demostrada básicamente por TLC, HPLC, UV, EM y RMN. A continuación, se discutirán algunos aspectos tales como la distribución de los flavonoides en las familias Bartramiaceae y Dicranaceae, su validez taxonómica y la variación existente en la composición flavonoidica respecto a la fenología y localización geográfica. Finalmente, se discutiran los resultados de los ensayos anti-VIH realizados a partir de los compuestos flavonoidicos aislados en la presente Memoria Doctoral junto a otros patrones químicos. En la siguiente tabla, resumimos toda la simbología utilizada en el apanado de resultados, relativa a los compuestos que fueron identificados en la discusión. NOM3RE. SIMDOL enTLC enespedss COMPUESTO 1 5’,3”’-díOH-arnentotlavona t 8H3, 813, BP3, 856, DSl COMPUESTO II 5’,3”’-diOH-robustaflavona r 8H4, 887, DS2 COMPUESTO III Ñlonotísflavona f 8H5, 811, 8P4, 852 COMPUESTO IV 2,3-dihidro-ti!onotisflavona d BH6, 814, BPS. 858 COMPUESTO V Dicranolomina c 812, BP6, 854 COMPUESTO VI Bartramiaflavona 1, BEl, BPI COMPUESTO VII Anhidrobaetramiaflavona a 8H2, BP2 COMPUESTO VIII Bartramia-Triluteolina - 8P7, 885.1 COMPUESTO IX Epi-Bartramia-Triluteolina - 8S5.A COMPUESTO X Ciclo-Triluteolina - 8S3 COMPUESTO XI 5’-OH-amentoflavona - 816 COMPUESTO XII Acido Bartrámico - 8P8 COMPUESTO xm Diosmetina-7-O-triglicósido - 1357 COMPUESTO XIV Apigenina-7-O-triglicésido - 1355 COMPUESTO XV Luteolina-7-O-neohesperidósido - 1356 220 6.1. FLAVONOIDES 6.1.1. Identificación de Compuestos 6.1.1.1. 5’, 3”’- DIHLDROXI-AMENTOFLAVONA (Compuesto 1) (5’,8’ ‘-biluteolina) La gran parte de los biflavonoides de origen natural poseen uniones interfiavonoidicas de tipo carbono-carbono (C-C). Sus estructuras son por ello difíciles de determinar, especialmente cuando los carbonos C-6 ó C-8 están implicados en el enlace C-C entre ambas mitades flavonoidicas (Osterdahí, 1983; Geiger & col., 1993a). El Compuesto 1 que identificamos como 5’,3” ‘-diOH-amentoflavona, es sin lugar a dudas uno de los biflavonoides de musgos mejor conocido, ya que fue el primer biflavonoide que se describió, concretamente en Dicranwn scoparium (Lindberg & col., 1974), y, como demuestra lo expuesto en el Anexo 2, es el biflavonoide que se ha identificado mayoritariamente en musgos. De hecho, se conoce en un total de 21 especies pertenecientes a familias muy diversas. Dentro de la familia Bartramiaceae se ha identificado en las cuatro especies objeto central de nuestro estudio doctoral (Bariramia hatieriana-BH 3, Bartramia ithyphylla-BI 3, Bartramia pomiformis-BP 3 y Bartraniia stricta-ES 6) y se conoce también enAnacolia webbi¡ (Seeger & col., 1993a; Seeger, 1992), Breutelia chiysoconza (Salm, 1994) y Philonotis fontana (Geiger & Bokel, 1989); así como en Dicranum scoparium (DS 1) de Dicranaceae. El Rf del Compuesto 1 es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (flavonoide no glicosilado) o biflavónica (Miles, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-LS % y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TEA. Este primer resultado y su parecida movilidad cromatográfica con la 5’,3”’-diOH-amentoflavona en el sistema P1-P2 en poliamida-6, nos hicieron pensar ya desde el principio que el Compuesto 1 se correspondía con tal biflavona. El Compuesto 1 exhibe además, unas características cromatográficas en capa fina muy semejantes a las de la luteolina (5,7,3’,4’-tetraOH-flavona) (Markham & col., 1988), ya que al ser observado a la luz ultravioleta muestra una absorción de color púrpura o violeta oscuro que cambia a la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar con NA. Este cambio observado es típico de flavonoides o-diOH en 3’,4’ o bien en 4’,5’ (en el anillo E). De acuerdo a Geiger (1990), el color de los biflavonoides a la luz ultravioleta (360 nm) es el de una mancha oscura, violeta o púrpura, que con NA vira a tonalidades amarillo-anaranjadas. Estos datos concordaban con los que obtuvimos para el Compuesto 1, por lo que dedujimos que debía tratarse de un biflavonoide, y muy posiblemente derivado de la luteolina, concretamente una biluteolina. El color que se observaba tras revelar con amoniaco y reactivo Benedict, apoyaban, de acuerdo a Miles (1988) y Krebs & col. (1967), que el Compuesto 1 era un flavonoide que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente podía tratarse de una 222. biluteolina. El espectro de absorción ultravioleta de la 5’,3’’’-dihidroxi-amentoflavona es aproximadamente el de la luteolina (Tabla 5.5.) (Markham & col., 1988), ya que este biflavonoide es una biluteolina, y por lo tanto el espectro obtenido es en sí la suma de los dos espectros correspondientes a ambos monómeros de luteolina que se solaparían como uno solo. Comparando el espectro de ultravioleta del Compuesto 1 con el de la 5’,3”’-diOH-amentoflavona (Tabla 5.5.) se observa un paralelismo muy acusado de acuerdo a los datos expuestos por Salm (1992), lo que de nuevo vino a confirmar que el Compuesto 1 podía ser dicha biflavona. Analizando detenidamente los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto 1 vemos que, de manera general, se corresponde con el típico espectro de un biflavonoide (Markham, 1982; Harborne, 1984; Salm, 1992) pues absorbe aproximadamente entre 250-280 nm en la banda II y, entre 3 10-350 nm en banda 1. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente ipsocrómico en la banda II, lo que es indicativo de flavonas que poseen agrupamientos o-diOH en el anillo E. El espectro en NaOAc supone un efecto batocrómico marcado de +8 ¡un (268-256) en la banda II, indicativo de que se trata de una flavona con un grupo OH en posición 7 (7-OH). Al añadir H3B03 no se observa ningun cambio ya que tanto la banda 1 como la II permanecen inalterables. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo B. El espectro en AICI3 respecto del de MeOH, supone un efecto batocrómico de + 15 ¡un (271 por 256) en la banda II y de +41 nr (394-353) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5-OH) que se confirma tras estudiar el nuevo espectro resultante de añadir CIH. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto 1 debía ¡ratarse de una flavona (o dímero de ella) con un agrupamiento o-diOH en posición 3’,4’ del anillo E, y con dos hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es claramente la luteolina, y dado que hemos deducido con anterioridad que era posiblementeun biflavonoide, debía tratarse de una biluteolina. Queda por analizar cúal es la posición del enlace de unión interfiavonoidico entre ambos monómeros de luteolina. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto 1 muestra un ión [M H]~ de 569 um, que confirma su estructura de biluteolina (C30H18O1j, ya sospechada por los resultados previos de la espectroscopia de ultravioleta y que concuerda con resultados ya publicados respecto de la 5’,3’ diOH-amentoflavona (Osterdahí, 1983; Eecker & col., 1986; Seeger, 1992). Dicho espectro de masas se corresponde claramente con el de una octahidroxibitiavona (biluteolina) con unión interfiavonoidica de tipo C-C entre los anillos El ydeAhlas de amboscorrespondientes monómeros (Seeger, 13C-RMN la asignación señales a cada1988). carbono se En el espectro de realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Osterdahí, 1983) (ver Tabla 6. la al final de la discusión del compuesto). En caso de tratarse de un biflavonoide simétrico, al comparar las señales correspondientes a cada átomo de carbono con las del correspondiente monómero, cada señal de éste debe tener al menos dos equivalentes en el biflavonoide. La presencia de ,dos señales a 182,0 y 181.5 ppm son debidas a 2 átomos de carbono carbonílicos correspondientes a dos flavonas, concretamente a C-4 y C-4”. La similitud de señales entre ellos, y con respecto a la señal correspondiente de la luteolina (C-4), parece indicar que el Compuesto 1 debe ser un dímero de luteolina (biluteolina). En los espectros de ‘3C-RMN de los 5,7- ~1 222 dihidroxiflavonoides (como la luteolina), las señales para C-6 y C-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para C-6 manifiestamente a campo menor (es decir a valores de ppm mayores) respecto de C-8 (Osterdahí, 1983). En la luteolina, la señal para C-6 aparece a 99.2 ppm y la de C-8 a 94.2 ppm. Si el Compuesto 1 es una biluteolina, en dicho rango de 90-100ppm deberían aparecer 4 señales: dos correspondientes a los carbonos del anillo Al y otras dos del AH. Como se refleja en la Tabla 6. la, sólo aparecen tres señales dentro de dicho rango: una a 93.8 ppm y dos a 98.6 ppm. La de menor valor de ppm se asignó por lo dicho antes a C-8 y las otras dos de valores de ppm más elevados a C-6 y C-6”. La ausencia de una cuarta señal en el rango 90 a 100 ppm indica que C-8” debe estar sustituido, y que debe tratarse de un carbono cuaternario, ya que no se encuentra señal equivalente en el otro monómero (C-8) ni en la luteolina. Estos resultados pueden ser indicativos de que precisamente C-8’’ (del anillo AII) es el carbono que interviene en el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas. La intensa señal a 104.1 ppm, que no aparece dividida, y que debe corresponder a un carbono cuaternario, es asignada a C-8’’. Las dos señales a 102.9 y 102.5 ppm son asignadas a C-3 y C-3”. Entre las tres señales más intensas restantes, las dos menos intensas a 120.4 y 121.8 son asignadas a C-1’y C-1’’’. Las señales correspondientes a los carbonos de los anillos El y BII, no cuaternarios, encuentran fácil correspondencia con los del anillo fi de la luteolina, salvo C-5’ y C-5”’. Sólo una de ellas (C-5’ o C-5”’) encuentra su señal correspondiente en las señales de la luteolina. Dado que con anterioridad habíamos deducido que uno de los carbonos que intervenían en el enlace interfiavonoidico era C-8’’ del anillo AII, el otro carbono implicado debería pertenecer al anillo fil, es decir C-5’, mientras que C-5”’ sería el carbono cuya señal coincidiría con la de C-S de la luteolina. La señal a 120.1 ppm corresponde al carbono C-5’, cuya señal se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico (apantallamiento por el hidroxilo existente en C-6”), ya que varía sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la luteolina que se detecta a 116.4 ppm. Las señales inferiores entre 145.8 y 160.4 son asignadas por comparación con el espectro de la luteolina y, se deben a carbonos oxigenados (C-7, C-7”, C-3’, y C-3”’). Analizando finalmente el espectro general de 13C-RMN del Compuesto 1, se observa con claridad que todas las señales pueden asignarse sin problema a las correspondientes de la luteolina, teniendo en cuenta por supuesto que se repiten de 2 en 2 al ser una biluteolina, Las dos únicas señales en que no puede llevarse a cabo tal asignación directa son respectivamente 5’ y 8”, ya que corresponden a los carbonos entre los que se lleva a cabo un enlace interfiavonoidico entre ambos monómeros de luteolina. De acuerdo a los resultados del espectro de 13C-RMN podríamos deducir que el Compuesto 1 es la S’,8”-biluteolina, cuya denominación actual es 5’,3”’-dibidroxiamentoflavona. Si pasamos a analizar ahora el espectro de 1H-RMN (ver Tabla 6. lb al final de la discusión de los resultados), observamos que se detectan 3 señales correspondientes a singletes entre 6,37 y 6,68 ppm, 6 dobletes entre 6,18 y 7,49 ppm y un doble doblete a 7,04 ppm. Respecto a las 2 señales que aparecen en el espectro de 1H-RMN sobre 13 ppm, corresponden ambas a cada uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 en cada uno de los monómeros de luteolina, concretamente OH-5 para la señal a 13.00 ppm y OH-5” para 13.13 ppm. Estos protones en posición OH-5 y OH-5”de los anillos Al y AII respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con 223 el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4” de los anillos CI y CII respectivos. Las señales de los protones del resto de grupos hidroxílicos de la molécula, aparecen bajas y anchas y no como verdaderos picos. Entre 6.1 y 6.7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y C (Seeger, 1992), que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 6.64s y 6.68s ppm para el protón en C-3 y C-3” respectivamente, 6.18d y 6.37s ppm para H-6 y H-6” y 6,42d ppm para H-8, y cuya asignación es sencilla simplemente comparando con los señales propias de la luteolina. Las señales de los protones correspondientes del anillo E aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y C. La señal para los protones H-2’ y H-6’ del anillo B de la luteolina, aparece por regla general sobre 7.2-7.9 ppm como un doblete (Seeger, 1992), de ahí que de acuerdo a ello se asignaron respectivamente H-2’ y H-2”’ para las señales a 7.48d y 7.06d ppm respectivamente, y H-6’ y H-6”’ para las señales a 7.49d y ‘7.04d ppm. El protón del carbono C-5’ de flavonas 3’,4’-dioxigenadas (luteolina) aparece como un doblete entre 6.7 y 7.1 ppm (Seeger, 1992; Salm, 1992). No obstante sólo se deteeta una señal correspondiente al protón situado en C-5”’ a 6.67 ppm y ninguna señal para H-5’ ni H-8”, lo que indica la inexistencia de pro¿ones tanto en C-5’ como en C-8”. Estos hechos se justifican fácilmente si atendemos a que dichos carbonos son precisamente los que intervienen en el enlace interfiavonoidico, y por lo tanto carecen de protones, de ahí que no se detecte ninguna señal para H- 5’ ni H-8”. En resumen, podemos deducir finalmente que el Compuesto 1 se correspondería con la 5’,3”’diOH-amentofiavona (5’,S”-biluteolina), cuya fórmula química queda reflejada en la Fig. 6.1. OH OH L4•~ se 3— ‘It OH 2 1 HO 4., O 4 HO A’ OH OH o Fig. 6W1.: 5’,3”’-diOH-amentoflavona (C0I18O~) (5’,8’ ‘-biluteolina) 224 ¡ Tabla 6.la: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto 1. 2 CQmpusÉú II. 2 164,0 163,9 2” 164,0 164,0 3 102,9 102,9 3” 102,5 102.5 4 182,0 181,9 4” 181,5 181,5 5 161,4 161,4 5” 160,4 160,4 6 98,6 98,7 6” 98,6 98,6 7 164,0 164,0 7’ 162,0 161,7 8 93,8 93,8 8” 104,1 104,0 9 157,3 157,3 9” 154,5 154,5 10 103,7 103,6 lO” 103,7 103,6 1’ 120,4 120,6 1’’’ 121,8 121,8 2 112,0 112,1 2”’ 113,7 113,7 3’ 145,5 145,5 3’’’ 145,8 145,8 4’ 148,5 148,2 4”’ 149,4 149,4 5’ 120,1 120,0 5”’ 115,5 115,5 6’ 122,2 122,2 6”’ 118.6 118.6 ‘ Carbonos S’,3’”-DlfA~ 5’ 3’ según Geiger & col. (1988). “-DHA: 5’ ,3”’-diOH-anientoflavona Luteolina según Markham & col. (1982). 225 teÓ1in~ 164,5 103,3 182,2 162,1 99,2. 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119,3 Tabla 6.lb.: Datos de ‘ll-RMN del Compuesto 1. CU~$#X ‘ £J~”>-NtA” ‘. 3 6,64 s 6,68 s 3” 6,68s ó,72s 6 6.18 d (2) 6.21 d (2) 6 6,37 s 6.41 8 6,42 d (2) 6,45 d (2) 6.47 d (2) 2’ 7,48 d (2) 7.51 d (2) ‘7.43 d (2) ‘-‘ 6,92 d (8) 7.77>1>1 (2:9) 5 6’ ‘7.49 1(2) 7,52 >1(2) 2”’ 7,06>1(2) 7.09d(2) 5”’ 6,67 d (8) 6,70 d (8) 6”’ 7,04 dd (2:8) 7,07>1>1 (2;8) OH-5 ¡3,00s OH-5” 13,13s 6.69 6,22 d ‘5.3-DHA: 5’,3’’-diOH’sn’,entoflavona según Geiger & col. (1988). 2LVLeolina según Geiger & ol. (1987). 6.1.1.2. 5’,3”’- DTRIDROXI- ROBUSTAFLAVONA (Compuesto II) (5’,6’‘-biluteolina) El Compuesto II que identificamos como 5,3” ‘-diOH-robustaflavona, es junto a] anterior (Compuesto 1), uno de los biflavonoides mayormente citados en musgos. Concretamente, se ha identificado en 18 especies (Anexo 2) pertenecientes a familias muy diversas. Su identificación en musgos se llevó a cabo por primera vez en la especie Hylocomium splendens (Becker & col., 1986), y dentro de la familia objeto de estudio de la presente Tesis, se ha identificado en Bartramia halleriana-EH 4 y Bartramia stricta-BS 7, y se conoce también en Anacolia webbii (Seeger & col., 1993a; Seeger, 1992), Breutelia chtysocoma (Salm, 1994) y Philonotis fontana (Geiger & Bokel, 1989); así como en Dicranum scoparium (DS 2) de Dicranaceae. Exhibe unas características cromatográficas en TLC (Rf, absorción al ultravioleta) muy semejantes a las de la luteolina y a las del Compuesto 1 (5’,3”’-diOH-amentoflavona), ya que al ser observado a la luz ultravioleta ofrece un color púrpura (violeta oscuro) que vira hacia fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (tiavonoide no glicosilado) o biflavónica (MUes, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-15% y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TRA. Todo ello nos llevó de nuevo a pensar, como ocurrió con el Compuesto 1, que el Compuesto II podría tratarse de una biflavona (López-Sáez, 1992). Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict 226 o NA, y al igual que en el caso del Compuesto 1, nos llevaron a concluir que el Compuesto II debía poseer grupos o-diOH en 3’,4’ o bien en 4’,5’ (del anillo B) y que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de una biluteolina. Todas las conclusiones derivadas son las mismas que se ejercieron con el Compuesto 1. El espectro de absorción ultravioleta de la 5’,3’’’-dihidroxi-robustaflavona es aproximadamente el de la luteolina (Tabla 5.9.) (Markham & col., 1988), ya que este biflavonoide es una biluteolina, y por lo tanto el espectro obtenido es en sí la suma de los dos espectros correspondientes a ambos monómeros de luteolina, que lógicamente se solaparían como uno solo, Comparando el espectro de ultravioleta del Compuesto II con el de la 5’ ,3”’-diOH-robustaflavona (Tabla 5.9.) se observa un paralelismo muy acusado de acuerdo a los datos expuestos por Stein (1988b), lo que de nuevo vino a confirmar que el Compuesto II podría ser dicha biflavona, y más concretamente una biluteolina. Analizando detenidamente los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto II vemos que, de manera general, como en el caso del Compuesto 1, se corresponde con el típico espectro de un biflavonoide (Markham, 1982; Harborne, 1984; Salm, 1992) pues absorbe aproximadamente entre 250-280 mn en Ja banda II y, entre 3 10-350 tun en banda 1. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +46 (406 por 360 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo B (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico tanto en la banda 1 como en la II, indicativo de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH). La adición de H3B03 al NaOAc no supone ningun cambio significativo en ninguna de las dos bandas del espectro, pues ambas permanecen inalterables. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo E. El espectro en AlCI3 respecto del de MeOH, supone un efecto batocrómico de +49 nm (272 por 223) en la banda II y de +65 (425-360) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5-OH) que se confirma tras estudiar el nuevo espectro resultante de añadir CIH. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto II debía tratarse de una flavona (o dímero de ella) con un agrupamiento o-diOH en posición 3’,4’ del anillo E, y con hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH, así como en 4’-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es la luteolina, y dado que hemos deducido con anterioridad que se trata de un biflavonoide, debía tratarse de una biluteolina. Queda por analizar cual es la posición del enlace de unión interfiavonoidico entre ambos monómeros de luteolina. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto II muestra un ión [M -H] + de 569 um, que confirma su estructura de biluteolina (C30H18012), ya sospechada por los resultados previos de la espectroscopia de ultravioleta, y que concuerda con resultados ya publicados respecto de la 5’,3’’’diOH-robustaflavona (Eecker & col., 1986; Seeger, 1992). Dicho espectro de masas se corresponde con él de una octabidroxibiflavona (biluteolina) con unión interflavonoidica de tipo C-C entre los anillos El y Ah de ambos monómeros (Seeger, 1988). 3C-RMN la asignación de las señales correspondientes a cada carbono se En el espectro de. realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Becker & col, 1986; Seeger, 1992; Voigt, 1993; Salm, 1992) (ver Tabla 6.2b al final de la discusión del compuesto). En caso de tratarse de un biflavonoide simétrico, al comparar las señales correspondientes a cada átomo de carbono con las del 227 correspondiente monómero, cada señal de éste debe tener al menos dos equivalentes en el biflavonoide. La presencia de dos señales a 181.2 y 18 1.1 ppm son debidas a 2 átomos de carbono carbonílicos correspondientes a dos flavonas, concretamente a C-4 y C-4”. La similitud de señales entre ellos, y respecto a la señal correspondiente de la luteolina (04) indica que el Compuesto II debía ser un dímero de luteolina (biluteolina). En los espectros de tsC~RMN de los 5,7dihidroxiflavonoides (como la luteolina), las señales para C-6 y C-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para C-6 manifiesta en un nivel inferior (es decir a valores de ppm mayores) respecto de C-8 (Osterdahí, 1983). En la luteolina, la señal para C-6 aparece a 99.2 ppm y la de 0-8 a 94.2 ppm. Si el Compuesto II es una biluteolina, en dicho rango de 90-100 ppm deberían aparecer 4 señales: dos correspondientes a los carbonos del anillo Al y otras dos del AII. Como se refleja en la Tabla 6.2b, sólo aparecen tres señales dentro de dicho rango: una a 98.5 ppm y dos a 93.6 ppm. Las de menor ppm se asignaron por lo dicho antes a 0-8 y 0-8” y la otra de valor de ppm más elevado a 0-6. La ausencia de una cuarta señal en el rango 90 a 100 ppm indica que C-6” debe estar sustituido, y que debe tratarse de un carbono cuaternario, ya que no se encuentra señal equivalente en el otro monómero (0-6) ni en la luteolina. Estos resultados pueden ser indicativos de que precisamente 0-6” (del anillo AII) es el carbono que interviene en el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas. La intensa señal a 108.9 ppm, que no aparece dividida, y que debe corresponder a un carbono cuaternario, es asignada a 0-6”. A diferencia del Compuesto 1, sí se detectó dentro de dicho intervalo la señal correspondiente a C-8”, lo que indica que en el caso del Compuesto II, dicho carbono C-8” no está implicado en el enlace interfiavonoidico. Sin embargo, la ausencia de una señal en el rango 90 a 96 ppm indica por contra que C-6” está sustituido, ya que es el carbono que interviene en el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas (AII). Las dos señales a 103.2 y 102.1 ppm son asignadas a C-3 y C-3”. Entre las tres señales más intensas restantes, las dos menos intensas a 121.9 y 120.8 son asignadas a C-1’y 0-1’’’. Las señales correspondientes a los carbonos de los anillos El y BII, no cuaternarios, encuentran fácil correspondencia con los del anillo E de la luteolina, salvo 0-5’ y 0-5”’. Sólo una de ellas (C-5’ o 0-5”’) encuentra su señal correspondiente en las señales de la luteolina. Dado que con anterioridad habíamos deducido que uno de los carbonos que intervenían en el enlace interfiavonoidico era C-6” del anillo AII, el otro carbono implicado debería pertenecer al anillo BI, es decir 0-5’, mientras que 0-5”’ sería el carbono cuya señal coincidiría con la de C-5 de la luteolina. La señal a 120.3 ppm corresponde al carbono 0-5’, cuya señal se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico (concretamente por el efecto de apantallamiento de hidroxilo en 0-6 que está muy cercano debido a la existencia del enlace interfiavonoidico) ya que varía sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la luteolina que se detecta a 116.4 ppm. Las señales inferiores entre 165.58 y 120.3 son asignadas por comparación con el espectro de la luteolina y, se deben a carbonos oxigenados (0-7, 0-7”, 0-3’, y 0-3”’). Analizando finalmente el espectro general de 130-RMN del Compuesto II, se observa con claridad que todas las señales pueden asignarse sin problema a las correspondientes de la luteolina, teniendo en cuenta por supuesto que se repiten de 2 en 2 al ser una biluteolina. Las dos únicas señales en que no puede llevarse a cabo tal asignación directa son respectivamente 5’ y 6”, ya que corresponden a los carbonos que intervienen en el enlace interfiavonoidico entre ambos monómeros 228 de luteolina. Las señales correspondientes a los carbonos 0-2’, 0-3’ y 0-6’ se encuentran ligeramente desplazadas respecto a las de la luteolina, como consecuencia del solapamiento que se produce por la cercanía del enlace interfiavonoidicoen 0-5’. Algo similar se produce en la otra mitad monomérica en 0-5” y 0-7” por la cercanía al enlace que existe en 0-6”. De acuerdo a los resultados del espectro de 130-RMN podemos deducir que el Compuesto II debía ser la 5’,6”-biluteol¡na, cuya denominación actual es S’,3”’-dihidroxi-robustafiavona. Si pasamos a analizar ahora el espectro de H-RMN (ver Tabla 6.2a al final de la discusión del compuesto), observamos que se detectan 3 señales correspondientes a singletes entre 6.24 y 6.55 ppm. 5 dobletes entre 6.14 y 7.83 ppm y dos multipletes a 7.39 ppm. Respecto a las 2 señales que aparecen en el espectro de ‘H-RMN sobre 13 ppm, corresponden ambas a cada uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 en cada uno de los monómeros de luteolina, concretamente OH-5 para la señal a 13.02 ppm y OH-5” para 13.28 ppm. Como ocurría en el Compuesto 1, y por regla general en los biflavonoides de musgos (Agrawal, 1989; Geiger & col., 1993a), estos protones en posición OH-5 y OH-5”de los anillos AL y AII respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4” de los anillos CI y CII respectivos. Las señales de protones del resto de grupos hidroxílicos de la molécula, aparecen bajas y anchas y no corno verdaderos picos. Entre 6. 1 y 6.7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y O (Seeger. 1992) que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 6.55 y 6.50 ppm para el protón en 0-3 y 0-3” respectivamente que aparecen como singletes al igual que en la luteolina, 6.14 ppm para H-6 y 6.42 y 6.24 ppm para H-8 y H-8” cuya asignación es sencilla’ simplemente comparando con los señales propias de la luteolina. Las señales de los protones correspondientes del anillo E aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y 0. La señal para los protones H-2’ y H-6’ aparece por regla general sobre 7.2-7.9 ppm como un doblete (Seeger, 1992). de ahí que de acuerdo a ello se asignaron respectivamente H-2’ y H-2”’ para las señales a 7.18d y 7.39m ppm respectivamente, y H-6’ y H-6”’ para las señales a 7.83d y 7.39m ppm. El protón del carbono 0-5’ de flavonas 3’,4’-dioxigenadas (luteolina) aparece como un doblete entre 6.7 y 7.1 ppm (Seeger, 1992; Salm, 1992). No obstante sólo se detecta la señal correspondiente al protón situado en 0-5”’ a 6.89d ppm y ninguna señal para H-5’ ni H-6”, lo que indica la inexistencia de protones tanto en 0-5’ como en 0-6’’. Estos hechos se justifican fácilmente si atendemos a que dichos carbonos son precisamente los que llevan a cabo el enlace interfiavonoidico, y por lo tanto carecen de protones, de ahí que no se detecte ninguna señal para H-5’ ni H-6”. En resumen, podemos deducir finalmente que el Compuesto II se correspondería con la S’,3”’-diOH-robustaflavona (5’,6”-biluteolina), cuya fórmula química queda reflejada en la Fig. 6.2. 229 OH 1 OH 1 OH 1 HO “‘u 1 6 o HO OH O 200 O 3 OH .4 OH Fig. 6.2.: 5’,3”’-diOH-robustaflavona (C~HI3O~) (5’ ,6”-biluteolina) Tabla 6.2a.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto II. pían rx’tal¡W 3 6.55. 6.58. 3’ 6.50. 6,53 6 6.14d(2) 6.16>1(2) 6,22d 8 6.42d (2) 6,44>1(2) 6.47 d (2) 8” 6.24. 6.26. 2 7.18>1 (2) 7,20>1 (2) 7,43 >1 (2) 6’ 7,83 d (2) 7.82>1(2) 7,77 >1d (2:9) 2” 7,39 ni 7.39 ni 5’’ 6,89d(8) 6.89>1(8) 6”’ 7.39 ni 7,39 tu 011-5 13.Ols 011-5’ 13.28. 5.3”-DHA: 5’,3’<-diOH-robustaflavonascgúaMathwn&eol. (¡988). ‘Luteolnia según Geiger & col. (1987). 230 6.69. Tabla 6.lb.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto II. 2 Cárbúnus Vommt~tú II 2 163,7 163,6 2” 164,1 164,0 3 103,2 102,8 3” 102,1 102,7 4 181,2 181,6 4” 181,1 181,5 5 162,5 162,3 5’’ 159,0 159,1 6 98,5 98,7 6” 108,9 108,9 7 165,5 164,0 7” ¡62.5 162,3 8 93,6 93,4 8’ 93,6 93,8 9 157,2 157.2 9” 156,3 156,2 10 103,5 103,6 10” 103,5 103,4 1’ 121,9 121,5 1”’ 120,8 121,9 2 112,1 111,7 2”’ 113,1 113,3 3’ 145,9 145,8 3”’ 145,6 145,7 4’ 148,5 148,6 4”’ 150,3 149,6 5’ 120,3 120,2 5”’ 115,9 116,0 6’ 122,3 121,9 6”’ 120.3 119.9 ‘: 5’,3”’-DHA: 5’ ,3”’-diOH-robustaflavona según Becker & col. (1986). Luteolina según Markham & col. (1982). 231 túSlht*~ 164,5 103,3 182,2 162,1 99,2 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119,3 6.1.1.3. FILONOTISFLAVONA (Compuesto III) (2’ ,8”-biluteolina) El Compuesto III que identificamos como la Filonotisflavona, fue descrito por primera vez en Philonotisfontana (Geiger & Eokel, 1989), y a partir de ese momento ha sido también identificado en otras especies de la familia Bartram¡aceae, como es el caso de las cuatro especies ibéricas del género Bartramia que han sido estudiadas en esta Tesis Doctoral: B. hafler¡ana-BH 5, B. ithyphyllaBI 1, 8. pomiformis-EP 4 y 8. stricta-BS 2. Exhibe unas características cromatográficas en TLC (Rf, absorción al ultravioleta) muy semejantes a las de la luteolina y a las de los dos compuestos hasta ahora referidos (5’,3”’-diOHamentoflavona y 5’,3”’-diOH-robustaflavona), ya que al ser observado al ultravioleta muestra un color púrpura (violeta oscuro) que vira hacia la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (flavonoide no glicosilado) o biflavónica (MOes, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-15% y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TBA, aunque por lo general es algo superior al de los dos compuestos referidos. Todo ello nos llevó de nuevo a pensar, como ocurrió con el Compuesto 1 y el II que debía tratarse de una biflavona (López-Sáez, 1992). Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict o NA, nos llevaron a concluir que el Compuesto III debía poseer grupos o-diOH en 3’,4’ o bien en 4’,5’ (en el anillo E) y que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de una biluteolina. Todas las conclusiones derivadas son las mismas que se ejercieron con los Compuestos 1 y II. El espectro de absorción ultravioleta de la filonotisflavona es aproximadamente el de la luteolina (Tabla 5.13.) (Markham & col., 1988), ya que este biflavonoide es una biluteolina, y por lo tanto el espectro obtenido es en sí la suma de los dos espectros correspondientes a ambos monómeros de luteolina, que lógicamente se solaparían como uno solo. Comparando el espectro de ultravioleta del Compuesto III con el de la filonotisflavona se observa una gran concordancia que nos hace pensar que ambos sean el mismo. Analizando detenidamente los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto III vemos que de manera general, como en el caso de los compuestos anteriores, se corresponde con el típico espectro de un biflavonoide (Markham, 1982; Harborne, 1984; Salm, 1992) pues absorbe aproximadamente entre 250-280 nm en la banda II y, entre 310-350 nm en banda 1. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +55 (400 por 345 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo E (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico tanto en la banda 1 como en la II, indicativo de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH). La adición de H3B03 al NaOAc no supone ningun cambio significativo en ninguna de las dos bandas del espectro, pues ambas permanecen inalterables. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo B, así como la inexistencia de un grupo 3-OH, es decir, que se trata de una flavona y no de 232 un flavonol (Salm, 1992). El espectro en A1013 respecto del de MeOH, supone un efecto batocrómico de + 16 nm (271/255) en la banda II y de +74 nm (419-345) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5-OH) que se confirma tras estudiar el nuevo espectro resultante de añadir CIH, como ya ocurría en los compuestos 1 y II. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto III debía tratarse de un compuesto muy semejante a los compuestos 1 y II, es decir, de una flavona (o dímero de ella) con un agrupamiento o-diOH en posición 3’,4’ del anillo B, y con hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH, así como en4’-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es nuevamente la luteolina, y dado que hemos deducido con anterioridad que se trata de un biflavonoide, debía tratarse de una biluteolina. El Espectro de Masas (FAE-EM) del Compuesto III muestra un ión [M Hl + de 569 um, que confirma su estructura de biluteolina (030H1801j, ya sospechada por los resultados previos de la espectroscopia de ultravioleta, y que concuerda con resultados ya publicados respecto de la filonotisflavona (Geiger & Bokel, 1989). Dicho espectro de masas se corresponde claramente con el de una octahidroxibiflavona (biluteolina) con unión interfiavonoidica de tipo 0-0 entre los anillos AII y BI de ambos monómeros (Seeger. 1988). Lógicamente, el Compuesto III que sería una biluteolina al igual que los compuestos 1 y II, debería tener un enlace interfiavonoidico en el que interviniese al menos un carbono distinto respecto de los que lo hacen en el Compuesto 1 (5’,8”) y el Compuesto II (5’,6’’). 3C-RMNla asignación de las señales correspondientes a cada carbono se En el espectro de ~ directa con la bibliografía (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992; Voigt, realizó mediante comparación -- 1993; Salm, 1992) (ver Tabla 6.3b al final de la discusión del compuesto). La presencia de dos señales a 181.9 y 181.3 ppm son debidas a 2 átomos de carbono correspondientes a dos flavonas, concretamente a 0-4 y 04’’, cuya similitud de señales entre ellos, y respecto a la señal correspondiente de la luteolina (0-4) indica que el Compuesto III debe ser un dímero de luteolina (biluteolina). En los espectros de 130-RMN de los 5,7-dihidroxiflavonoides (como la luteolina), las señales para 0-6 y 0-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para 0-6 a campo menor (es decir a valores de ppm mayores) respecto de 0-8 (Ósterdahl, 1983). Según lo anterior, dentro de dicho intervalo pudimos asignar las señales correspondientes a los carbonos 0-6 y 0-6” en 98.6 y 98.3 ppm respectivamente, y a niveles de ppm más bajos la correspondiente a 0-8 en 93.1 ppm. A diferencia del Compuesto II, sí se detectó dentro del intervalo mencionado, la señal correspondiente a 0-6”, lo que indica que en el caso del Compuesto III, dicho carbono 0-6” no está implicado en el enlace interfiavonoidico. Sin embargo, la ausencia de ima cuarta señal en el rango 90 a 100 ppm indica por contra que C-8” está sustituido, ya que es el carbono que interviene en el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas, y su señal difiere notablemente respecto de la correspondiente en la luteolina. La intensa señal a 103.5 ppm, que no aparece dividida, es asignada a 0-8”. Las dos señales a 106.5 y 102.5 ppm son asignadas a 0-3 y 0-3”. Entre las tres señales más intensas restantes, las dos menos intensas a 124.0 y 121.8 son asignadas a C-1’y 0-1”’. La señal a 118.6 ppm corresponde al carbono C-2’, cuya señal se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico. ya que varía sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la luteolina que se detecta a 113.8 ppm (Geiger & Bokel, 1989). El resto de señales del espectro (0-2, 0-2”, 0-5, 0-5”, 0-7, 0-7”, 0-9, 0-9”, 0-10, 0-10”, 0-2”’, 0-3’, 0233 3’’’, 0-4’, 0-4’’’, 0-5’ y 0-5’”) se identificaron y asignaron de acuerdo a la literatura (Geiger & Bokel, 1989; Salm, 1992), por lo que por la misma multiplicidad y casi iguales desplazamientos químicos (isocronía) que las referencias bibliográficas, la asignación de los carbonos correspondientes a cada señal fue sencilla. La señal correspondiente al carbono 0-5’ es igual a la que ofrece la luteolina, lo que indica que este carbono no interviene en el enlace interfiavonoidico. Analizando finalmente el espectro general de 30-RMN del Compuesto III, se observa con claridad que todas las señales pueden asignarse sin problema a las correspondientes de la luteolina, teniendo en cuenta por supuesto que se repiten de 2 en 2 al ser una biluteolina. Las dos únicas señales en que no puede llevarse a cabo tal asignación directa son respectivamente 2’ y 8’’, ya que corresponden a los carbonos entre los que se lleva a cabo un enlace interfiavonoidico entre ambos monómeros de luteolina. De acuerdo a los resultados del espectro de 30-RMN podemos deducir que el Compuesto III sería la 2’,8”-biluteolina, cuya denominación actual conocida es Filonotisfiavona, en honor a la especie en que se identificó por primera vez (Philonotis fontana). Si pasamos a analizar ahora el espectro de H-RMN (ver Tabla 6.3a al final de la discusión del compuesto) , observamos que se detectan 3 señales correspondientes a singletes entre 6.06 y 6.62 ppm, 4 dobletes entre 5.75 y 7.24 ppm y 3 multipletes a 7.01 ppm. Respecto a las 2 señales que aparecen en el espectro de H-RMN sobre 13 ppm, corresponden ambas a cada uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 en cada uno de los monómeros de luteolina, concretamente OH-5 para la señal a 12.73 ppm y OH-5” para 13.01 ppm. Como ocurría en los compuestos 1 y II, y por regla general en los biflavonoides de musgos (Agrawal, 1989; Geiger & col., 1993a), estos protones en posición OH-5 y OH-5’ ‘de los anillos Al y AII respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4” de los anillos CI y CII respectivos. Entre 6.1 y 6.7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y O (Seeger, 1992) que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 6.06 y 6.62 ppm para el protón en 0-3 y 0-3” respectivamente que aparecen como singletes al igual que en la luteolina, 5.75 y 6.27 ppm para H-6 y H-6”, y 6.07 ppm para H-8, cuya asignación es sencilla simplemente comparando con las señales propias de la luteolina. Las señales de los protones correspondientes del anillo B aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y 0. La señal para el protón H-6’ aparece por regla general sobre 7.2-7.9 ppm como un doblete (Seeger. 1992), de ahí que de acuerdo a ello se asignaron respectivamente H-6’ y H-6”’ para las señales a 7.24d y 7.Olm ppm. El protón del carbono 0-5’ de flavonas 3’,4’-dioxigenadas (luteolina) aparece como un doblete entre 6.7 y 7.1 ppm (Seeger, 1992; Salm, 1992) por lo que H-5’ y H-5”’ fueron asignados para las señales a 7.Olm y 6.74d ppm respectivamente. No se detectaron las señales correspondientes a los protones de 0-2’ y 0-8”, lo que indica la inexistencia de protones tanto en 0-2’ como en 0-8”. Estos hechos se justifican fácilmente si atendemos a que dichos carbonos son precisamente los que intervienen en el enlace interfiavonoidico, y por lo tanto carecen de protones, de ahí que no se detecte ninguna señal para H-2’ ni H-8”. Que el Compuesto III no posee ningún monómero de flavanona (como sí ocurre en el Compuesto IV), se deduce por la posición de la señal con los menores desplazamientos químicos del espectro de H-RMN, observada a 5.75 ppm. El modelo de acoplamiento deducido del espectro estaría en cualquier caso, en consonancia con la conclusión definitiva de que el Compuesto III 234 sea de hecho la Pilonotisflavona. En resumen, podríamos deducir finalmente que el Compuesto III se correspondería con la Filonotisflavona (2’,8”-biluteolina), cuya fórmula química queda reflejada en la Fig. 6.3. HO a OH O Fig. 6.3.: Filonotisflavona (C30H18O~> (2’,8’‘-biluteolina) Tabla 6.3a.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto III. .~.......... Lut*oht !~.... 3 6.06. 6,06. 6.69. 6 5.75 >1 (2) 5.75 >1 (2) 6.22 d (2) 8 6.07>1 (2) 6,07>1 (2) 6,47>1 (2) 5 7,01 ni 7.01 >1 (8:5) 6.92 >1 (9) 6’ ‘7.24>1(8:5> 7.24>1 (8:5) 777 >1>1 (2:9> 3” 6,62. 6,62. 6” 6.27. 6.27 2” 7.01 ni ‘7,02>1 (2) 5”’ 6.74>1(8) 6,74>1(9> 6”’ 7.01 ni 7.00>1>1 (2:9> 011-5 12.735 011-5” 13.01 (¡989). 2LuteoIioa según Geiger & ccl. &(¡987). FúonoostIavona segun Ucager Bokel Como señalan Geiger & col. <1993a), en el espectro de 13C-RMN de la 5’.3”’-diOH-amentoflavona (Compuesto la 5’,3”’-diOH-robustaflatona <Compuesto It), las señales para C-3 y C-3” aparecen generalmente sobre 103 ppm. mientras que en el espectro de la filonotisllavona <Compuesto III) así como de la Dicranolomina (Compuesto y). sólo la resonancia debida a C-3” aparece reflejada sobre 103 ppm. La resonancia de C-3 en cambio aparece cerca de 106 ppm, 1) y de debido a la existencia de un enlace intertlavonoidico muy cercano en el carbono C-2’ (ver Fig. 6.3 y 6.5), que impide la coplanaridad entre los anillos CI y DI que sí existe en los Compuesto 1 y II. resonancia de los carbonos de ambos anillos Cl y DI. 235 Este enlace en 2< interfiere además en la ¡ Tabla 6.3b.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto III. Comm¡esto Uf VUww#Wlawot Lutcoihat 2 166,7 166,5 164,5 2” 163,8 163,8 3 ¡06.5 106,4 3” 102,5 102,4 4 181,9 181,7 4’’ 181,3 181,1 5 161,2 161,1 5” 160,5 160,3 6 98,6 98,6 6” 98,3 98,3 7 163,8 163,7 7” 161,3 161,4 8 93,1 93,0 8’’ 103,5 105,5 9 157,3 ¡57,2 9” 154,4 154,3 10 103.1 102,9 10’’ 103,3 103,2 1 124,0 124,0 1’” 121,8 121,7 2 118,6 118,7 2’” 113,6 113,5 3’ 144,4 144,3 3”’ 145,6 145,7 4’ ¡48,5 148,3 4”’ 149,6 149,4 5’ 114,6 114,6 5”’ 115,6 115,5 6’ 120,7 120,5 6”’ 118.8 118.9 Filonotisflavona según Geiger & Bokel (1989). Luteolina según Markham & col. (1982>. 236 103,3 182,2 162.1 99,2 164,7 94,2 ¡57,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119,3 6.1.1.4.2,3 -DIHIDRO-FILONOTISFLAVONA (Compuesto IV) (eriodictiol-(2’,8”)-luteol¡na) El Compuesto IV que fue identificado como la 2,3-dihidro-filonotisflavona, es un biflavonoide derivado de la filonotisflavona, y fue descrito por primera vez junto con ésta en Philonotis fontana (Geiger & Eokel, 1989). Básicamente, la 2,3-dihidro-filonotisflavona, es uno de los flavonoides más afines a la familia Bartramiaceae, ya que con la excepción de Autacomnium androgynum (Hahn, 1993), no se conoce ninguna otra especie fuera de dicha familia que sea capaz de sintetizar dicho biflavonoide. Se ha identificado también a parte de en Phitonotis fontana, en Anacolia webbii (Seeger & col., 1993a, Seeger, 1992) así como en las cuatro especies del género Bartramia estudiadas en esta Tesis Doctoral (B. halleriana-BH 6, B. ithyphylla-BI 4, B. pomiformis-BP 5 y B. stricta-ES 8. En los ensayos por TLC que realizamos de las numerosas especies de Bartramiaceae, pudimos así mismo identificarlo en multitud de ocasiones, lo que es fiel reflejo de su presencia más o menos continuada en la mayoría de las especies pertenecientes a esta familia. Las características crpmatográficas en TLC del Compuesto IV, son semejantes a las de la luteolina en cuanto al color que se visualiza en la absorción al ultravioleta: púrpura oscuro que cambia a amarillo-anaranjado tras revelar con NA. Tras revelar precisamente con NA y tras un cierto tiempo el Compuesto IV muestra una fluorescencia roja clara. Una reacción similar ha sido observada anteriormente para la 5,7,3’ ,4’-tetrahidroxiflavanona (eriodictiol) y su 7-metiléter (Wollenweber, 1981 y 1982; Geiger, 1990). Estos resultados nos indican que efectivamente el Compuesto IV debe poseer al menos una mitad flavonoidica correspondiente a eriodictiol (flavanona de la luteolina) causante de tal respuesta al NA. Su espectro de absorción al ultravioleta es el resultado de la superposición de los espectros de la luteolina y la dihidroluteolina (eriodictiol) (Tabla 5.17), ya que el mismo comportamiento se observa en otros 2,3-dihidro-biflavonoides, tales como la 2,3-dihidro-dicranolomina y la 2’,3”’dihidro-5’ ,3 ‘-robustaflavona aisladas e identificadas en Dicranotoma robustum (Markham & col., 1988). La naturaleza de la dihidroflavona o flavanona en los dihidro-biflavoides como es el caso del Compuesto IV que estamos tratando, es evidente a partir de sus datos de absorción al ultravioleta, y en particular la absorción a 288 nm que experimenta un característico efecto batocrómico hacia 322 nm en NaOMe (Mabry & col., 1970). Este cambio descritojunto al que ocurre en la banda II de 254 a 277 ¡un con NaOAc indica que tanto el grupo hidroxilo en posición 7- como él de la posición 7”están insustituidos. En general, la información que aporta el espectro de ultravioleta es muy reducida pero concreta, ya que nos viene a decir que el biflavonoide posee un monómero flavanónico, pero el resto de los datos aportados han de tomarse con suma precaución pues son el resultado de la suma de dos espectros: de un lado la flavanona nombrada y de otro, un flavonoide que posiblemente es la luteolina. Los dos picos que se observan en la cromatografía obtenida por HPLC (Fig. 6.4) corresponden cada uno de ellos a los respectivos diastereoisómeros, lo que indica que tenemos ambos (Salm, 1992; Seeger, 1992; Geiger, 1990). En el caso de que en el cromatograma de HPLC ‘ 237 apareciera un único pico, sería indicativo de la existencia de uno sólo de los isómeros, en aquellos biflavonoides que en teoría puedan tener isomería. t Fig. 6.4. Cromatograma de HPLC del Compuesto 4 puro. El FAB-EM del Compuesto IV muestra un pico a 571 um [M H]~ que sugiere la estructura de una dihidro-biluteolina (Markham & col., 1988), es decir, de una biluteolina (569 mu) que ha ganado dos átomos de hidrógeno (569 um + 2 um = 571 um), y por lo tanto se trataría de un producto de dihidratación de la filonotisflavona (Geiger & Bokel, 1989). En el espectro de ‘30-RMN la asignación de las señales correspondientes a cada carbono se realizó mediante comparacióndirecta con la bibliografía (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992; Voigt, 1993; Salm, 1992) (ver Tabla 6.4a al final de la discusión del compuesto). En dicho espectro se detectaron un total de 60 señales, lo cual podía dar lugar a que pensáramos que el Compuesto IV era un tetraflavonoide (de momento no descritos en musgos y excepcionalmente en angiospermas, por lo que descartamos tal posibilidad) o bien un biflavonoide que mostraba las señales correspondientes a sus dos isómeros. Esta última, parecía ser la posibilidad más cierta, ya que dichos datos concordaban con lo obtenido en el cromatograma de HPLC y con las afirmaciones antes realizadas. La presencia de una única señal a 181.8 ppm es típica del carbono situado en 0-4” de flavonas, cuya similitud respecto a la señal respectiva de la luteolina (0-4) indica que el Compuesto IV debía poseer al menos un monómero del biflavonoide que se correspondiera con una luteolina. A diferencia de lo que ocurría en los compuestos anteriores (1-111), no se detecta la señal correspondiente a C-4 con la misma resonancia que 0-4”, de ahí que podamos interpretar que uno de los dos monómeros si es una flavona (el que da la señal para 0-4”) pero el otro no (señal para 0-4 a 196.3 ppm). Como ya habíamos visto con anterioridad en la discusión de la TLC, este segundo monómero debía ser una flavanona y concretamente el eriodictiol. En resumen, podemos llegar a la conclusión de que el Compuesto IV sería un biflavonoide del tipo flavona-flavanona, y más concretamente un dímero de luteolinaeriodictiol. En los espectros de 3C RMN de los 5,7-dihidroxiflavonoides, las señales para 0-6 y C-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para 0-6 a campo menor (es decir a valores de ppm mayores) respecto de C-8 (Ósterdahl, 1983). Según lo anterior, dentro de dicho intervalo - pudimos asignar las señales correspondientes a los carbonos 0-6 y 0-6” en 95.6 y 98.4 ppm respectivamente, y a niveles de ppm más bajos la correspondiente a 0-8 en 94.7 ppm. A diferencia del Compuesto II y al igual que ocurría en los Compuestos 1 y III, sí se detectó dentro del intervalo nMnoionado, la señal correspondiente a 0-6”, lo que indica que en el caso del Compuesto IV. dicho 238 0-6” no está implicado en el enlace interfiavonoidico. Sin embargo, la ausencia de una señal en el rango 90 a 96 ppm indica por contra que 0-8” está sustituido, ya que es el carbono que interviene en el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas y por lo tanto su señal se detectó a 103.7 ppm y no dentro del intervalo mencionado. La señal a 102.5 ppm fue asignada a 0-3’’ por comparación directa con el espectro de la luteolina y del Compuesto III. Esta señal a 0-3” corresponde al monómero flavónico (luteolina). En las biflavanonas, que únicamente poseen 13 señales en su espectro por superimposición de las señales de ambos monómeros, las señales para 0-2/2” y 0-3/3” absorben a 81.3-83.1 y 49.4-50.8 ppm respectivamente en biflavanonas con geometría cis-trans (Agrawal, 1989). En nuestro caso, sise detecta la señal para 0-3 correspondiente al monómero de eriodictiol a 42.4 ppm, y la señal para 0-2 a 77.1 ppm, algo desplazada del intervalo 81.3-83.1 ppm referido pues no se trata de una biflavanona sino de una flavona-flavanona. De hecho, la señal para 0-2’’ fue asignada a 163.2 ppm mediante comparación con la señal de la luteolina, lo que confirma de nuevo que el Compuesto IV posee un monómero flavónico. El resto de las señales, que no se ven tan influenciadas como las anteriores por la naturaleza flavónico/flavanónica del compuesto, fueron asignadas sin problemas respecto de los compuestos anteriores así como de la luteolina, y no varían apenas su resonancia en ambos monómeros. La señal a 118.7 ppm corresponde al carbono 0-2’, cuya señal se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico, ya que varía sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la luteolina que se detecta a 113.8 ppm (Geiger & Bokel, 1989). De acuerdo a los resultados del espectro de ‘SCRMN podríamos deducir que el Compuesto IV sería un dímero flavanona-flavona con un enlace interfiavonoido entre el carbono 0-2’ de la flavanona y 0-8” de la flavona, aunque esta situación es justamente la contraria en el caso del otro diastereoisómero. Estos datos se ajustan perfectamente a carbono un biflavonoide conocido como 2,3-dibidro-filonostisflavona, descrito primeramente en Philonotis fontana, y que ha resultado ser un derivado de la filonotisflavona mediante la adquisión de dos átomos de hidrógeno, como muestra claramente su espectro de masas. Si pasamos a analizar ahora el espectro de ~H-RMN(ver Tabla 6.4b al final de la discusión del compuesto), podemos deducir que la señal que aparece sobre 13 ppm, corresponde a uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5, concretamente OH-5 para la señal a 12.05 ppm en uno de los isómeros y 11.94 ppm en el otro, que realmente equivaldría a la señal OH-5”. Como ocurría en los compuestos 1 y II, y por regla general en los billavonoides de musgos (Agrawal, 1989; Geiger & col., 1993a), estos protones en posición OH-5 y OH-5”de los anillos Al y Ah respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4” de los anillos CI y CII respectivos. Entre 6.1 y 6.7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y O (Seeger, 1992) que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 6.62/6.66 ppm para el protón en 0-3” que aparece como un singlete, 6.35/6.34 ppm para 0-6” también como singlete, 5.78/5.82 ppm para 0-6 que aparece como un doblete (h= 2Hz) y 5.43/5.76 ppm para H-8. Tanto la señal para 1-1-6 como H-8 se encuentran algo desplazadas por el efecto de acoplamiento que suponen los protones en 0-3 del monómero de eriodictiol. Las señales de los protones correspondientes del anillo E aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y 0. 239 Las flavanonas 3’,4’-oxigenadas como el eriodictiol, muestran un patrón espectral complejo, generalmente en forma de un multiplete para H-2’, H-5’ y 8-6’ entre 6.7 y 7.1 ppm (Markham, 1982). Dichos protones, están situados en posiciones orto- o para- respecto del oxígeno sustituido, lo cual influye notablemente, pues da lugar a que dichos protones tengan un desplazamiento químico muy similar o idéntico, no así el protón que se sitúa en posición meta- (Markham, 1982; Seeger, 1992). De acuerdo a lo anterior, la señal para los protones en 8-6’ y 8-6’’’ aparecía a 6.91-7.01 ppm, y al igual que la señal para 8-5’ se mostraba como un multiplete no analizable, de ahí dicha asignación. Respecto a 8-6”’, en el componente minoritario se detectaba así mismo una señal a 6.92 ppm como un doble doblete, propia del monómero de luteolina del biflavonoide. El protón del carbono 0-5’ de flavonas 3’,4’-dioxigenadas (luteolina) aparece como un doblete entre 6.7 y 7.1 ppm (Seeger, 1992; Salm, 1992) por lo que la señal para los protones H-5”’ fue asignada a 6.75/6.74 ppm (J = 8 Hz). No se detectaron las señales correspondientes a los protones de 0-2’ y 0-8”, lo que indica la inexistencia de protones tanto en 0-2’ como en 0-8’’. Estos hechos se justifican fácilmente si atendemos a que dichos carbonos son precisamente los que intervienen en el enlace incerfiavonoidico, y por lo tanto carecen de protones, de ahí que no se detecte ninguna señal para 82’ ni 8-8”. El espectro de ‘H-RMN nos confirma además que el Compuesto IV está constituido por una mezcla de 2 diastereoisómeros (2,3- y 2”,3”- dihidro-filonotisflavona) existiendo atropoisomería, ya que existe un centro de quiralidad en el carbono 0-2, cuyo protón 8-2 se detecta a 5.01/5.09 ppm como un doble doblete (ya que se acopla a los dos protones H-3a y H-3b). Por regla general, la señal para H-2 de flavanonas aparece como un doble doblete cerca de 5.2 ppm. siendo la señal a 5.4 ppm típica del eriodictiol (Markham, 1982), debido al acoplamiento del protón en 0-2 con los dos protones de 0-3 de la flavanona, cada uno de los cuales se acopla con los demás en adicción a la interación spin-spin que ocurre con 8-2. Dichos protones H-3a y H-3b se detectan respectivamente a 3.27/3.05 y 2.59/2.19 ppm como sendos dobles dobletes (ya que tienen un doble acoplamiento: entre ellos y con 8-2). Esto nos viene a demostrar de nuevo la naturaleza flavanónica de uno de los dos monómeros del Compuesto IV. En resumen, podemos deducir finalmente que el Compuesto IV se correspondería con la 2,3-dibidro-filonotisflavona (2,3-dihidro-2’,8”-biluteolina o eriodictiol(2’,8”)-luteolina), cuya fórmula química queda reflejada en la Fig. 6.5. 3 H 1 Ho ,OH OH OH 6 OH O 2” 6 40 r OH Hg. 3. O 6.5.: 2,3-dihidro-filonotisflavona (C~HmOU) (2,3-dihidro-2’ ,8”-biluteolina) 240 OH Tabla 6.4a.: Datos de ‘3C-RMN .tnh,’ ComDuesto IV 2 77,1* - 76,8* 2” 163,2 - 163.2 3 42.4 -42,0 3’’ del Compuesto IV. Lut~olina1 Erlodlctlal’ 2.3-dlbldrolllnnotisflavona2 - 78,3 77,1* ~76,8** 164,5 - 163,6 - 163,6 - 42,2 44,5 -42,2 102,5 - 102,5 103,3 - 102,5 - 102,7 4 196,3 - 196,3 - 196,2 196,0 - 196,0 4” 181,8 - 181,8 182,2 - 182,0- 182,0 5 163,2 - 163,9 - 163,4 163,6 - 164,1 5” 160,4 - 160,4 162,1 - 160,5 -160,5 6 95,6-95,6 - 95,7 95,6-95,6 6” 98,4 -98,4 99,2 - 98,5 -98,5 7 166,7 - 166,5 - 166,6 166,5 - 166,4 7” 162,1 - 162,1 164,7 - 161,7- 161,7 8 94,7 - 94,5 94,8 94,7 - 94,6 8’’ 103,7 -103,7 94,2 - 103,8 - 103,8 9 163,0- 163,0 - 162,8 163,1 - 163,1 9” 154,8 - 154,7 157,9 - 154,9 - 154,8 10 101,4 - 101,4 - 101,7 101,5 - 101,5 10” 102,4 - 102,4 104,2 - 102,1 - 102,1 1’ 129,0 - 128,6 - 129,4 129,4- 129,0 1’’ 121,8 - 121,6 122,1 - 122,0 - 121,7 2 118,7- 118,7 - 117,8 118,4 - 118,8 2”’ 113,5 -113,8 119,3 - 113,6- 113,9 3’ 143,6 - 143.5 - 115,3 143,6- 143,5 3’” 145,5- 145,5 116,4 - 145,6- 145,5 4’ 145,2 - 145,4 - 145,6 145,2 - 145,4 4”’ 149,5- 149,5 150,1 - 149,6- 149,5 5’ 114,7- 114,7 - 145,1 114,8- 114,8 5”’ 115,4 -115,4 146,2 6’ 117,0- 117,0 - 6”’ 1187-1193 ~ 115,6- 115,5 - 114,2 117,1 - 117,1 - 1186-1193 ‘Luteolina y Eriodictiol según Harborne & Mabry (1982). 22,3-dihidro-f¡lonotisflavona según Geiger & Bokel (1989). * Componente principal ** Componente secundario 242. COmp~ettc IV t ‘ Frntoftes ‘ ‘ ‘ z3elhldn3-ftnatwhvona1 ‘ Tabla 6.4b.: Datos de 1H-RMN del Compuesto IV. ‘* 2 5.01 >1>1 (¡2,2) 5.09>1>1 (12:2) 5.08 >1>1 (13.3) 5.t1~ >1>1 (13,3) 3a *‘~ 3,27>1>1(17,14) 3,05>1>1 (17;14) 2.96>1>1 (17:13) 3.18>1>1(17:13) 3b ~ 2,59>1>1 (¡8.-) 4 2,19>1>1(16:-) 4 2.22>1>1(17:3) 2.60 dd (17.3) 6 5,78>1(2) 5,82>1(2) 5.80>1(2) 5.76>1(2) 8 5.43 >1 (2) 5,76>1 (2) 5.73 >1 (2) 5,42 >1 (2) 5’ 6.91-7.10 ni 4 6,91-7,10 m 4 6,94-7,08 m 4 6.94-7,08 m 4 6’ 6.91-7,10 m 4 6,91-7.10 mA 6,94-7.08 m * 6.94-7,08 m 4 3” 6.62 s 6,66s 6.54s 6.51 6” 6.35 s 6,34 s 6,33 s 6,33 2”’ 6.91-7,10 nl A 6,9t-7,10 mA 6,94-7.08 mA 6,94-7,08 ni 4 5”’ 6,75 >1 (8) 6.74>1 (8) 6.72 >1 (8,5) 6,73 >1 <8,5) 6”’ 6,91-7.10 mA 6.92>1>1(9.-) 4 6.89>1>1<8.5:2) 6,94-7.08 niA 011-5 12.05s 11,94s 011-5” 2.3->1ihidro-fllonoíisflavona según Geiger & BokeL (1989). ~ Componente principal (0) y Componente secundario (fl. La relación entre ambos >1iastereómeros es de 11,2. al contrario que en Geiger & Bokel (1989). ~ Señales correspon>1ienles a los 2 hidrógenos situados en posición 3 de la mitad flavanónica del biflavonoide. 4 Señales no resueltas. A Multipletc no analizable. 6.1.1.5. DICRANOLOMINA (Compuesto V) (2’,6”-biluteolina) El Compuesto V que identificamos como la Dicranolomina fue descrito por primera vez en Dicranoloma robustum (Markham & col., 1988) y nombrado en honor a dicha especie. A partir de ese momento ha sido también identificado en algunas especies de la familia Bartramiaceae, como es el caso de tres de las especies ibéricas del género Bartramia que han sido estudiadas en esta Tesis Doctoral: B. ithyp/zylla-BI 2. B. pomifonnis-BP 6 y B. stricta-BS 2. Exceptuando las 4 especies anteriores, también recogidas en la bibliografía (López-Sáez, 1992; Seeger, 1992; Seeger & col., 1992b), se conoce así mismo en Anacolia webbii <Seeger, 1992; Seeger & col., 1993a) y Philonotis fontana (Geiger & Bokel, 1989) de Bartramiaceae, así como enAulacomnium palustre (Hahn, 1993). Al igual que el Compuesto IV (2,3-dihidro-filonotisflavona), la dicranolomina parece ser uno de los biflavonoides más afines a las familias Bartramiaceae, Dicranaceae y Aulacomniaceae. Exhibe unas características cromatográficas en TLC muy semejantes a las de la luteolina y 242 a las de los tres primeros compuestos referidos (5’,3’’’-diOH-amentoflavona, 5’,3’’’-diOHrobustaflavona y filonotisflavona), ya que al ser observado a la luz ultravioleta muestra un color púrpura que vira hacia la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (flavonoide no glicosilado) o biflavónica (MUes, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-15% y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TEA, aunque por lo general es algo superior al de los Compuestos 1 y U. Por regla general, el Compuesto V aparecía a menudo solapado como una única mancha junto al Compuesto III en las TLCs desarrolladas en placas de poliamida-6, mientras que si se utilizaban placas de celulosa su movilidad era muy similar a la de los compuestos 1 y II. Todo ello nos llevó de nuevo a pensar que debía tratarse de una biflavona (López-Sáez, 1992). Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict o NA, nos llevaron a concluir que el Compuesto y debía poseer grupos 0-diOR en 3’ ,4’ o bien en 4’ ,5’ (en el anillo B) y que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de una biluteolina. El espectro de absorción ultravioleta de la dicranolomina es aproximadamente el de la luteolina (Tabla 5.21.) (Markham & col., 1988), ya que este biflavonoide es uná biluteolina, y por lo tanto el espectro obtenido es en sí la suma de los dos espectros correspondientes a ambos monómeros de luteolina, que lógicamente se solaparían como uno solo. Comparando el espectro de ultravioleta del Compuesto V con el de la dicranolomina se observa una gran concordancia que nos hace sospechar que ambos sean el mismo. Analizando detenidamente los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto V vemos que de manera general, como en el caso de los compuestos anteriores, se corresponde con el típico espectro de un biflavonoide (Markham, 1982; Harborne, 1984; Salm, 1992) pues absorbe aproximadamente entre 250-280 nm en la banda II y, entre 3 10-350 nm en banda 1. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +55 (399 por 344 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo B (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico tanto en la banda 1 (+ 51 nm) como en lan (+22 nm), indicativo de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH). La adición de H3B03 al NaOAc no supone ningun cambio significativo en ninguna de las dos bandas del espectro, pues ambas permanecen inalterables. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo B, así como la inexistencia de un grupo 3-OH, es decir, que se trata de una flavona y no de un flavonol (Markham & col., 1988). El espectro en AICI3 respecto del de MeOH, supone un efecto batocrómico de +20 nm (274/254) en la banda II y de +78 nm (422-345) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5OH) que se confirma tras estudian el nuevo espectro resultante de añadir ClH, como ya ocurría en los compuestos 1, II y III. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto V debía ser muy semejante a los compuestos 1, II y III, es decir, una flavona (o dímero de ella) con un agrupamiento o-diOH en posición 3’,4’ del anillo B, y con hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH, así como en 4<-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es nuevamente la luteolina, y dado que hemos deducido con anterioridad que se trata de un biflavonoide, debía tratarse de una biluteolina. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto V muestra un ión [M -Hl + de 569 um, que 243 confirma su estructura de biluteolina (030H1801), ya sospechada por los resultados previos de la espectroscopia de ultravioleta, y que concuerda con resultados ya publicados respecto de la dicranolomina (Geiger & Bokel, 1989). Dicho espectro de masas se corresponde con el de una octahidroxibiflavona (biluteolina) con unión interfiavonoidicade tipo 0-0 entre los anillos BI y AII de ambos monómeros (Seeger, 1988). Lógicamente, el Compuesto y que debía ser una biluteolina al igual que los compuestos 1, II y III, debería tener un enlace interfiavonoidico en el que interviniese al menos un carbono distinto respecto de los que lo hacen en el Compuesto 1 (5’,8’”l, el Compuesto II (5’,6”) o el Compuesto III (2’,8”). 3C-RMN la asignación de las señales correspondientes a cada carbono se En el espectro de ‘ realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Geiger & Bokel, 1989; Markham & col., 1988; Seeger, 1992; Voigt, 1993) (ver Tabla 6.Sa al final de la discusión del compuesto). La presencia de dos señales a 181.6 y 181.2 ppm son debidas a 2 átomos de carbono correspondientes a dos flavonas, concretamente a 0-4 y 0-4’’, cuya similitud de señales entre ellos, y respecto a la señal correspondiente de la luteolina (0-4) indica que el Compuesto V debía ser un dímero de luteolina (biluteolina). En los espectros de 130-RMN de los 5,7-dihidroxiflavonoides (como la luteolina), las señales para 0-6 y 0-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para 0-6 a campo menor (es decir a valores de ppm mayores) respecto de 0-8 (Osterdahí, 1983). Según lo anterior, dentro de dicho intervalo pudimos asignar las señales correspondientes al carbono 0-6 en 98.6 ppm, y a niveles de ppm más bajos las correspondientes a 0-8 y 0-8” en 93.1 y 93.3 ppm respectivamente. A diferencia del Compuesto III, sí se detectó dentro del intervalo mencionado, la señal correspondiente a 0-8” y 0-5<, lo que indica que en el caso del Compuesto V, dichos carbonos no están implicados en el enlace interfiavonoidico. Sin embargo, la ausencia de una cuarta señal en el rango 90 a 100 ppm indica por contra que 0-6” está sustituido, ya que es el carbono que interviene en el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas, y su señal difiere notablemente de la respectiva de la luteolina. La intensa señal a 107.9 ppm, que no aparece dividida, es asignada a 0-6”. Las dos señales a 106.2 y 103.3 ppm son asignadas a 0-3 y 0-3”. Entre las tres señales más intensas restantes, las dos menos intensas a 123.7 y 120.2 son asignadas a C-1’y 0-1”’. La señal a 119.7 ppm corresponde al carbono C-2’, y se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico, ya que varía sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la luteolina que se detecta a 113.8 ppm (Geiger & Bokel, 1989). El resto de señales del espectro (0-2, 0-2”, 0-5, 0-5<’, 0-7, 0-7”, 0-9, 0-9”, 0-10, 0-10”, 0-2”’, 0-3’, 03’’’, 0-4’, 0-4’’’, 0-5’, 0-5’”, 0-6 y 0-6”’) se identificaron y asignaron de acuerdo a la literatura (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992; Markbam & col., 1988>, respecto a la dicranolomina y su 2,3dihidro-derivado, la 2,3-dihidro-dicranolomina. Analizando finalmente el espectro general de 30-RMN del Compuesto V, se observa con claridad que todas las señales pueden asignarse sin problema a las correspondientes de la luteolina, teniendo en cuenta por supuesto que se repiten de 2 en 2 al ser una biluteolina. Las dos únicas señales en que no puede llevarse a cabo tal asignación directa son respectivamente 2’ y 6”, ya que corresponden a los carbonos entre los que se lleva a cabo el enlace interfiavonoidico entre ambos monómeros de luteolina. De acuerdo a los resultados del espectro de ‘30-RMN podemos deducir que el Compuesto V sería La 2’,6”-biluteolina, cuya denominación actual es Dicranolomina, en honor 244 a la especie en que se identificó por primera vez (Dicranoloma robustum). Si pasamos a analizar ahora el espectro de H-RMN (ver Tabla 6.5b al final de la discusión del compuesto), observamos que se detectan 3 señales correspondientes a singletes entre 6.04 y 6.68 ppm, 6 dobletes entre 5.96 y 7.42 ppm y un doble doblete a 7.43 ppm. Respecto a las 2 señales que aparecen en el espectro de 1H-RMN sobre 13 ppm, corresponden ambas a cada uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 en cada uno de los monómeros de luteolina, concretamente OH-5 para la señal a 12.78 ppm y OH-5” para 13.13 ppm. Estos protones en posición 01-1-5 y OH-5’’de los anillos Al y AII respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4« de los anillos Cl y CII respectivos. Entre 6.1 y 6.7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y O (Seeger, 1992) que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 6.04 y 6.68 ppm para el protón en 0-3 y 0-3” respectivamente que aparecen como singletes al igual que en la luteolina, 5.96d ppm para H-6 y 6.08 y 6.54d ppm para H-8 y H-8”, cuya asignación es sencilla simplemente comparando con los señales propias de la luteolina. Las señales de los protones correspondientes del anillo B aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y 0. La señal para los en protones H-6< aparece por regla general sobre 7.2-7.9 ppm como un doblete (Seeger, 1992), de ahí que de acuerdo a ello se asignaron respectivamente H-6’ y H-6”’ para las señales a 7. lSd y ‘7.43dd ppm. El protón del carbono 0-5< de flavonas 3’,4’-dioxigenadas (luteolina) aparece como un doblete entre 6.7 y 7.1 ppm (Seeger. 1992; Salm, 1992) por lo que H-5’ y H-5”’ fueron asignados para las señales a 6.94d y 6.89d ppm respectivamente. No se detectaron las señales correspondientes a los protones de 0-2’ y 0-6” de la luteolina, lo que indica la inexistencia de protones tanto en 0-2’ como en 0-6”. Estos hechos se justifican fácilmente si atendemos a que dichos carbonos son precisamente los que llevan a cabo el enlace interfiavonoidico, y por lo tanto carecen de protones, de ahí que no se detecte ninguna señal para H-2’ ni H-6”. En resumen, podemos deducir finalmente que el Compuesto V se correspondería con la Dicranolomina (2’,6”-biluteolina), cuya fórmula química queda reflejada en la Hg. 6.6. HO 1 OH O OH O o HO- 0~ OH Fig. 6.6.: Dicranolomina (CJ~H 5gOfl) (2’ <6’ ‘-biluteolina) 245 Tabla 6.Sa: Datos de “C-RMN del Compuesto y. ...CarborKs 2 2 pue 166,3 ‘..Eilwwtisfiavona 166.5 2” 163,9 163,8 3 ¡06,2 106,4 3’’ 103,3 102,4 4 181,6 ¡81,7 4” 181,2 181,1 5 161,2 161,1 5” 158,7 160,3 6 98,6 98,6 6” 107,9 98,3 7 163,6 163,7 7” 161.8 161,4 8 93,1 93,0 8” 93,3 103,5 9 157.3 157,2 9” 156,2 154,3 10 102,8 102,9 10’’ 103,3 103,2 1’ 123,7 124,0 1”’ 120,2 121,7 2 119,7 118,7 2<’’ 113,3 113,5 3’ 144,2 144,3 3”’ 145,7 145,7 4’ 148,2 148,3 4”’ 149,6 149,4 5’ 114,3 114,6 5’’’ 116,0 115,5 6’ 121,5 120,5 6”’ 118.9 118.9 Filonotisflavona según Geiger & Bokel (1989). Luteolina según Markham & col. (1982). 246 tuteoliná 164,5 103,3 182,2 162,1 99,2 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146,2 150,1 116,4 119,3 t’ Tabla 6.Sb.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto y. ‘ 3 6,04s 6,03 s 669 6 5.96>1(2) 5,96>1(2) 6.22>1(2) 6.08>1 <2) 6,08>1 (2) 6,47 >1 (2) 5 6.94 >1 (8,5) 6,93 >1 (8,5) 6.92 >1 (9) 6 718d(8.5) 7.18>1(8,5) 7.77>1>1(2:9) 3” 6.68s 6,69 a 8” 6.54 a 6,52 2”’ 7.42>1(2) 7,41>1(2) 5”’ 6.89>1<8) 6.89>1(8) 6” 7.43 d>1 (9:2) 7.43 >1>1<8:25) 011-5 12.78 01-1-5” 13,135 Dicranoloni,na Bokel (1989). 2Luteolina según según GeigerGeiger & col.&(1987). El enlace interfiavonoidicoen posición 2’<6”- en las biluteolinas como la Dicranolomina, crea una doble orto-sustitución respecto a dicho enlace en ambas mitades bifenílicas (ver Fig. 6.6.), que implica tanto al anillo B de una flavona como al anillo A de la otra. Cabe la posibilidad por ello de que el enlace interfiavonoidico tenga rotación libre, pudíendose dar en dicho caso que en ciertas circunstancias podamos distinguir en el espectro de 130-RMN, las señales correspondientes a ambos rotámeros. Aunque tales hechos son difíciles de apreciar, son mucho más comunes cuando tratamos con 2,3-dihidro-2’ ,6”-biluteolinas (Markham & col., 1988). 6.1.1.6. BARTRAMIAFLAVONA (Compuesto VI) (2-bidroxi-2,3-dihidro-2’,8”-8,2”’-biluteolina) El Compuesto VI que identificamos como la Bartramiaflavona (BP-1, HH-1), fue descritopor primera vez en Bartramia pom{formis (Seeger & col., 1991) y posteriormente en la misma especie (López-Sáez, 1992; Seeger, 1992) así como en Bartramia halleriana (Salm, 1992). Exhibe unas características cromatográficas en TLC (Rf, absorción al ultravioleta) muy peculiares, ya que no cambia de color a luz ultravioleta tras aplicar los diversos reactivos específicos empleados, incluyendo el NA, de ahí que sea fácilmente distinguible en las TLCs respectivas, del resto de biflavonoides hasta ahora identificados; al igual que también lo es por su relativa alta movilidad cromatográfica (López-Sáez, 1992; Seeger, 1992; Salm, 1992). En todo momento, el Compuesto VI se observa a la luz ultravioleta como una mancha púrpura oscura, que no cambia de color ni con vapores de amoniaco, NA o reactivo de Benedict, lo que viene a significar que su 247 estructura ha de ser sensiblemente diferente a la de otras biluteolinas tales como los Compuestos I-V. Su alto PS de hasta 70 en acético 15% y 76 en acético 40%, complementado con un Rf también muy alto de 67 en TBA, confirman esas diferencias que deben existir respecto a las biluteolinas típicas ya nombradas. Es díficil, en principio, explicar tal movilidad cromatográfica, ya que por un lado el Compuesto VI sería un compuesto bastante polar al presentar un desarrollo alto en acético 15% (todo lo contrario que las agliconas monoflavónicas o biflavónicas típicas) y, de otro, sería un compuesto relativamente apolar en base a su alto Rf en TBA semejante al de las biluteolinas (Markham, 1982). Incluso en los sistemas cromatográficos desarrollados en placas de poliamida, sus Rfs son así mismo altos en comparación con otras biluteolinas de musgos, ya que tanto en la dimensión del solvente Stahl (Rf de 50) como del AWE (Rf 55) su movilidad es mut alta. Los resultados obtenidos mediante la aplicación de dichos reactivos específicos vinieron sin embargo a confirmar que el Compuesto VI debía poseer grupos o-diOH en 3’ ,4’ o bien en 4’ <5, (en el anillo B) y que poseía al menos un agru~amiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de un compuesto relacionado con las biluteolinas (Markham, 1982; Seeger, 1992), aunque el cambio inexistente de color debía producirse por un impedimento de tipo estructural. Los Rfs del Compuesto VI en la cromatografía bidimensional alejaban, en principio, cualquier posibilidad de que éste correspondiera a una biflavona, sobre todo de las conocidas en musgos. Según Mabry & col. (1970) y Markham (1982), los biflavonoides pueden poseer un Rf alto en TRA pero apenas se desarrollan en la dirección del acético 15%. En nuestro caso, los Rfs eran muy altos en ambos sentidos de la 2D-TLC, lo que cuadraba, de acuerdo a los mismos autores, con una isoflavona o un flavonol ambos glicosilados. La particular estructura tridimensional y cíclica de esta molécula podría explicar ese alto Rf: el macrociclo posee un alto Rf en TBA por ser un biflavonoide, y por ello relativamente apolar, pero se desarrollaba por igual con alto Rf en 15% AcOH, no por ser polar, sino por la nula afinidad del macrociclo por la celulosa (Salm, 1992). Los grupos hidroxilo del macrociclo, que dan polaridad a la molécula, quedan escondidos en su interior, disminuyendo aún más si cabe la afinidad por el disolvente. Así mismo, los grupos hidroxilos en posición 3’ y 3”’ de los respectivos anillos BI y Bu forman puentes de hidrógeno con los hidroxilos correspondientes en posiciones 7’ y 7 de los anillos AII y Al respectivos (ver Fig. 6.7.), disminuyendo así, tanto la afinidad del macrociclo por el disolvente como por la celulosa, de ahí que su Rf en un disolvente polar como el acético 15% sea bastante alto. Salm (1992), en base a la estructura macrocíclica del Compuesto VI, explicó esos Rfs tan altos atendiendo a la casi nula afinidad de dicho compuesto por los distintos solventes empleados, lo que implicaría que se desarrollara prácticamente con el frente, aunque lógicamente quedara mínimamente retenido. Analizando los resultados del espectrode ultravioleta del Compuesto VI vemos que de manera general, su espectro se corresponde con el típico espectro de un biflavonoide o bien de una isoflavona (Markham, 1982; Harborne, 1984; López-Sáez, 1992; Salm, 1992) pues absorbe aproximadamente entre 250-280 nm en la banda II y, entre 310-350 nm en banda 1. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +28 nm (392 por 364 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo B (4<-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico tanto en la banda 1 (+24 nm) como en la II (+ 10 nm), indicativo de la 248 existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH) tanto de flavonas como de isoflavonas. La adición de F13B03 al NaOAc supone un cambio significativo en de las dos bandas del espectro, pues ambas sufren un efecto ipsocrómico de -48 nm (340/388) y -15 nm (258/273) respectivamente. Estos hechos indican la inexistencia de grupos o-diOH tanto en el anillo A como el B de flavona e isoflavonas, ya que en caso contrario se esperaría un efecto batocrómico al menos en la banda 1 (Markham & col., 1982; Mabry & col.. 1970),como ocurre en la luteolina y sus derivados (biluteolinas). El espectro en A1013 respecto del de MeOH, no supone ninguna alteración en las dos bandas del espectro, que igualmente permanecen inalterables al añadir CIH. Estos datos indican de nuevo la inexistencia de odiOH en los anillos A y B así como de 5-01-1, tanto de flavonas como de isoflavonas. Resumiendo, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto VI no debía poseer o-diOH ni en el anillo A ni en el B, así como carecer de un hidroxilo libre en posición 0-5 (5-OH), y sí existir 4’-OH y 7OH. Estos resultados no coinciden prácticamente en nada con los expuestos para los compuestos anteriormente identificados, y ni siquiera con los resultados de la TLC. Según ellos, el Compuesto VI tendría un espectro de isoflavona o biflavonoide, pero no podría ser un luteolina y ni siquierauna apigenina, sino un derivado de la 7,4’-dihidroxi-flavona/isoflavona. Ingham (1983) cita que el 90% de las isoflavonas conocidas son producidas por especies de la subfamilia Papilionoideae de las Fabáceas, lo que nos da una idea de lo particular de la existencia de este tipo de compuestos en el Reino Vegetal. Las primeras isoflavonas descritas en un briófito lo fueron en el musgo Brywn capillare por Anhut & col. (1984). correspondiendo a los tipos orobol y pratenseina. Miles & Zinsmeister (1988) cifran la frecuencia de isoflavonas en musgos en un 6-14% respecto del total de flavonoides identificados. Ante lo anteriormente expuesto y dado que nuestros resultados no se acoplaban a la bibliografíaexistente (Wolfbeis & col., 1984; etc), aceptamos con mayor prioridad que el Compuesto VI fuese un biflavonoide. Estos son cada vez más comunes en musgos, y la mayoría de trabajos que se van publicando ofrecen generalmente algún biflavonoide como nuevo compuesto identificado en la especie de musgo estudiada (Geiger, 1990). Cuando iniciamos el proceso de aislamiento e identificación del Compuesto VI, que finalizó con la lectura de la Memoria de Licenciatura (López-Sáez, 1992), en la familia Bartraniiaceae sólo se conocía la existencia de biflavonoides en J’hilonotis fontana (Geiger & Bokel, 1989), pero los resultados procedentes del Compuesto VI no se correspondían con ninguno de los biflavonoides identificados en dicha especie ni en ninguna otra de musgos. El posterior trabajo de Seeger & col. (1991) vino a confirmar nuestras sospechas de que el Compuesto VI se trataba de un biflavonoide y el porqué de la no coincidencia de nuestros datos con los existentes. Todos nuestros resultados coincidían con los aportados por dichos autores para la Bartramiaflavona, un biflavonoide macrocíclico, que fue la primera estructura de este tipo que se conoció, correspondiente a un biflavonoide, después de las citas de Hauteville & col. (1973),en Populus nigra y Ogiso & col. (1972), en Leucothoe keiskei, referentes a estructuras monoflavonoidicas también cíclicas. En base a la distinta naturaleza que tienen las dos unidades monoméricas del Compuesto VI, flavona y flavonona, así como a la estructura macrocíclica de la molécula, se pudieron explicar esos altos Rfs (nula afinidad tanto por el solvente como por la fase estacionaria), su respuesta a los reactivos específicos (el macrociclo impide una perfecta exposición de los hidroxilos libres impidiento la reacción de color con dichos reactivos), así como el espectro de ultravioleta resultante (los biflavonoides no parecer seguir un modelo espectral fijo, como 249 le ocurre generalmente al resto de tipos flavonoidicos, y más cuando están formados por dos monómeros de naturaleza distinta). En el caso del Compuesto VI, su espectro de ultravioleta corresponde a la suma del espectro de una flavona (luteolina) con el de una flavanona, por lo que la información que de él se puede obtener es prácticamente escasa y a menudo puede conducir a confusión. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto VI muestra un ión [M -H]~ de 585 um y de 587 um [M + 1-l]~, que confirma su estructura de biflavonoide (030H11012), ya sospechada por los resultados previos de la espectroscopia de ultravioleta, y que concuerda con los resultados ya publicados respectode la bartramiaflavona (Seeger & col., 1991). Comparando este espectro de masas con el de una biluteolina como la filonotisflavona (569 mu), el Compuesto VI parece tener al menos un átomo de oxígeno y otro de hidrógeno más que la filonotisflavona (569 + 16 + 1 = 586 Me). Estos datos se explicarían, mediante la adición de una molécula de agua a la filonotisflavona y la existencia de un segundo enlace interfiavanoidico.. Los resultados del tratamiento con ácido clorhídrico fueron clarificadores: a las dos horas de tratamiento con ácido ya se había producido la reacción pues se observan al menos dos manchas de distinto Rf, tanto en el sistema de ácido acético como en el TBA. Una de ellas coincide en el Rf de ambos sistemas aproximadamente con el compuesto problema VI. Esto es indicativo de la existencia de una hidrólisis parcial caso de un glicósido a las 2 horas, o de otro tipo de reacción en caso de ser aglicona; en las que tendríamos, por una parte, algunas moléculas del Compuesto VI totalmente hidrolizadas/reaccionadas y otras sin hidrolizar/reaccionar, lo que explicaría la existencia de esas dos manchas, y la correspondencia del Rf de una de ellas con él del Compuesto VI sin hidrolizar/reaccionar. Continuado el tratamiento con clorhídrico hasta las 4 horas, ya sólo aparece una mancha cuyo Rf es distinto al del Compuesto VI sin hidrolizar/reaccionar, por lo que se puede suponer que a las 4 horas de tratamiento con ácido clorhídrico se ha completado la hidrólisis/reacción, estando todas las moléculas del Compuesto VI hidrolizadas/reaccionadas. De acuerdo a estos resultados y, a lo expuesto por Markham (1982), si a las 2 horas la hidrólisis es parcial pero al menos se ha producido, el Compuesto VI no puede ser ni un flavonoide 0-glicósido (en éste caso la hidrólisis sería total), ni un flavonoide 0-glicósido (no habría hidrólisis). Cabe pues la posibilidad de que se trate de un flavonoide cuyo azúcar sea un glucurónido, pero esta posibilidad es muy remota, menos de acuerdo a los datos que al respecto se tienen sobre flavonoides en musgos: sólo presentan como azúcar de glicosilación el glucurónico, Rhizo,nnium magnifolium y R. pseudopunctatum (Miles & col., 1986). Por ello, dichos resultados parecen concordar más con lo deducido respecto al Compuesto VI en los apartados anteriores y que efectivamente se trate de bartramiaflavona. Este, el Compuesto VI o bartramiaflavona, posee una estructura molecular bastante compleja, ya que se trata de un macrociclo no glicosilado, en el que la hidrólisis difícilmente se produciría, y sí, en cambio una deshidratación, que al realizarse con clorhídrico sería relativamente lenta. Sólo tras un largo tratamiento con el ácido podría producirse la deshidratación y formarse, por tanto, la anhidrobartramiaflavona (Compuesto VII). El anillo bencénico, caracterizado por el fenómeno de la mesomería, es una estructura particularmente estable. Es por ello poco problable que el anillo se rompa en una reacción química o biológica, lo que explica el resultado del tratamiento con clorhídrico realizado sobre el Compuesto VI. y 250 de 130-RMN del Compuesto VI muestra como la gran mayoría de las señales están duplicadas, algo que también ocurre en el espectro de ‘l-I-RMN. Dichos datos vienen a confirmar la existencia en el Compuesto VI de das isómeros diferentes que se encuentran en equilibrio. En la naturaleza se conocen casos de ciertas flavonas que en presencia de agua dan lugar a dos isómeros (2-hidroxi-flavanonas y diaroilmetanos) que son en realidad ciclo-oxo tautómeros (Hauteville & col., 1973; Traub & Geiger, 1975). Los cambios químicos observados así como las multiplicidades existentes en ambos espectros de RMN nos hacen sospechar, en comparación con la literatura antes referida, que el Compuesto VI sea una mezcla equimolecular de dos ciclo-oxo tautómeros. En el espectro de 30-RMN la asignación de las señales correspondientes a cada carbono se realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992; Salm, 1992) (ver Tabla 6.6b al final de la discusión del compuesto). Las señales principales en las que queremos hacer hincapié son las siguientes: En la región baja del espectro (valores de ppm elevados), aparece una señal a 200 ppm correspondiente al grupo carbonilo de 0-2 en la forma oxo (ib), que es precisamente el punto en el que la molécula se abre respecto a la forma ciclo (la). (Seeger & col., 1991). Dos señales sobre 195 ppm atribuidas a los carbonilos en 0-4 de las mitades diaroilmetano y 2hidroxi-flavanona respectivamente tanto de la forma ciclo (la) como de la oxo (ib). Dos señales para 0-4” a 182.0 y 182.3 ppm en cada uno de los tautómeros, son típicas de una flavona, lo que indica que el Compuesto VI está compuesto al menos por un monómero de flavona, concretamente de luteolina. En la región alta del espectro, valores de ppm bajos, aparecen dos señales correspondientes a carbonos secundarios (0-3), tanto de la forma ciclo como la oxo, que fueron asignadas respectivamente a 48.7 (forma ciclo) y 55.3 (forma oxo). Las señales para 0-2<, 0-8”, 0-2”’ y 0-8 son sensiblemente diferentes respecto de las correspondientes de la luteolina, lo que indica que los 4 carbonos deben estar implicados en algún tipo de enlace interfiavonoidico. Comparando ahora el espectro de 130-RMN del Compuesto VI con el de la filonotisflavona, observamos en cambio que las resonancias de 0-2’ y 0-8” son prácticamente idénticas a las de los mismos carbonos en la filonotisflavona mientras que no ocurre lo mismo con 0-2”’ y 0-8. Esto viene a decirnos que el Compuesto VI tiene al menos un enlace entre los dos monómeros del biflavonoide idéntico al de la filonotisflavona, concretamente el enlace entre 0-2< y 0-8”, mientras que 0-2”’ y 0-8 son los otros dos carbonos que intervienen en el segundo enlace interfiavonoidico que en cambio está ausente en la filonotisflavona, de ahí esas diferencias en el Un primer repaso al espectro - - - - - espectro. El resto de señales (0-2”, 0-4”, 0-5, 0-5”, 0-6, 0-6”, 0-7, 0-7”, 0-9, 0-9”, 0-10, 0-10”, 01’, 0-1”’, 0-3’, 0-3”’, 0-4’, 0-4”’, 0-5’, 0-5”’, 0-6’, 0-6”’) se pudieron asignar sin problemas respecto a las correspondientes de la filonotisflavona y luteolina, aunque por lo general con valores de ppm más bajos debido al propio efecto de apantallamiento que causa la estructura macrocíclica de la molécula. La señal para 0-1’ en cambio aparecía con valores de ppm algo más elevados que en la filonotisflavona y luteolina, por la cercanía del punto de apertura de la molécula que rompía en cierta manera ese efecto de apantallamiento, y por la existencia contigUa del enlace flavanónico. Las señales para 0-6/6” y 0-8/8” entre 90-105 ppm indican que el Compuesto VI es un 5,7-dihidroxi-flavonoide - 251 (Agrawal. 1989). De acuerdo a los resultados del espectro de 30-RMN podemos deducir que el Compuesto VI es un biflavonoide cíclico, con dos enlaces interfiavonoidicos C-2’/C-8” y 0-2” ‘/0-8, que uno de los monómeros es la luteolina y que el otro monómero da lugar a que el Compuesto VI esté en realidad formado por dos isómeros (ciclo-oxo tautómeros), uno con el anillo O de cadena abierta o forma “oxo” (2-OH-flavanona) y otro de cadena cerrada o forma “ciclo” (diaroilmetano). A pesar de todo, debemos finalmente decir que muchas de las señales de espectro de 130-RMN no pudieron ser asignadas con certeza a uno u otro tautómero pero sí a su respectivo carbono. Si analizamos el espectro de 1H-RMN (ver Tabla 6.6a al final de la discusión del compuesto), observamos que al igual que el de 30-RMN, cada señal se duplica en dos, cada una de ellas correspondientes al respectivo tautómero. Respecto a las 4 señales que aparecen en el espectro de 1HRMN sobre 13 ppm, corresponden a cada uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 en cada uno de los monómeros, para los dos isómeros. Concretamente se asignaron como OH-5 para las señales a 12.08 ppm (ciclo) y 12.86 ppm (oxo) y OH-5” para 12.79 ppm (ciclo) y 12.99 ppm (oxo). Estos protones en posición OH-5 y OH-5”de los anillos Al y Ahí respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4” de los anillos CI y CII respectivos (Agrawal, 1989; Geiger & col., 1993a). La señal a 7.37 ppm que aparece como un singlete se otorgó al protón del grupo hidroxilo libre en posición 0-2 del ciclo-tautómero, mientras que lógicamente no se detectó dicha señal en el oxo-tautómero por carece de hidroxilo libre en 0-2. Las señales correspondientes a H-3”, H-6/6”, H-5’/5”’ y H-6’/6”’ se asignaron por comparación directa con el espectro de la filonotisflavona, aunque en el caso del Compuesto VI, la resonancia observada se producía lógicamente a valores de ppm más bajo debido al apantallamiento que produce la estructura macrocíclica de la molécula. Al igual que en la filonotisflavona, no se detectó la señal correspondiente a los protones H-2’ y H-8” de la luteolina, lo que indica que dichos carbonos están implicados en un enlace interfiavonoidico similar al que ocurre en la filonotisflavona, es decir (2’,8’’). A diferencia de la filonotisflavona, tampoco se pusieron de manifiesto las señales correspondientes a H-2”’ y H-8, que en la filonotisflavona aparecían a 7.02 y 6.07 ppm respectivamente. Estos datos vienen a confirmar la existencia de un segundo enlace entre los dos monómeros del biflavonoide entre 0-2”’ y 0-8, del que carece la filonotisflavona, y que daría la conformación de macrociclo al Compuesto VI. Finalmente, las 4 señales que se detectan a valores de ppm muy bajos, corresponden a los protones en 0-3 de ambos monómeros (2 señales por cada tautómero). Se asignaron como 2.36 y 3.40 ppm para H-3a en ciclo y oxo, y 2.92 y 5.38 ppm para H-3b en ciclo y oxo respectivamente. Estas señales que se detectan en la parte alta del espectro (valores de ppm bajos> son típicas de los protones en 0-3 de flavanonas, ya que existe un fuerte acoplamiento entre ellos mismos y respecto al protón en 0-2. En el caso del Compuesto VI, las constantes de acoplamiento para dichos protones son relativamente altas, de J= 17 para los protones H-3a y H-3b en el tautómero ciclo y de J= 15 en los mismos protones en el oxo-tautómero. Estas cifras se comprenden perfectamente si atendemos al acoplamiento existente entre ambos protones H-3a y H-3b, entre ellos y el hidroxilo libre en 0-2 en el tautómero oxo y debido al apantallamiento existente por su compleja estructura molecular. En resumen, podemos deducir que el Compuesto VI se correspondería con la 252 Bartramiatlavona, cuya fórmula química aparece en la Hg. 6.7. Es un biflavonoide macrocíclico compuesto de dos ciclo-oxo tautómeros. Uno de sus monómeros es la luteolina y el otro varía dependiendo del tautómero. En el ciclotautómero, la luteolina establece dos enlaces interfiavonoidicos en 0-2”’ y 0-8”, con 0-8 y 0-2’ respectivamente, de una 2-hidroxi-flavanona (2-OH-eriodictiol). En el oxo-tautómero, establece los mismos enlaces y con los mismos carbonos de un flavonoide de anillo O abierto que deriva del diaroilmetano, con un grupo ceto en 0-2 donde se rompe el anillo 0. O OH O OH 5 OH OH HO HO OH OH ‘TI SI OH 8 H OHO Fig. 6.7.: Bartramiatlavona (C~HI8OI) (2-OH-2,3-dihidro-(2’ ,8’ ‘-8,2” ‘)-biluteolina) Tabla 6.6a.: Datos de 1H-RMN del Compuesto VI. COllWtflIO VI ‘<dala) %~‘‘:‘ VottpinS~ VI ‘<oa4’ 011-2 7.375 30 2.36>1(17) 3,40>105) 3b0 2.92>1(17) 5.38>1(15) 6 5.82s 8 ffiknscílavat 606s .69s 5,90s 5 75>1 (2) .22>1 (2) — 607>1(2) .47>1(2> 2’ 5’ .43>1(2) ‘ 6.78>1(8) 6.84>1 (8) 701 d (8. 6’ 7,14>1(8) 740>1(8) 7.24 d (8,5) 3” 6.28s 6.32s 6.62 6’ 5.785 5.78s 6.27s — 7,02>1(2) 2”’ .92>1(9) 7.77>1>1(2:9> - 5”’ 6.74>1<8) 6,65>1(81 6.89>1(9) - 6”’ 6.78>1(8) 6.80>1(8) 7.00>1>1(2:9> - 011-5 ¡2.08 s 12.86s - 011-5’ 12.79s 12.99s Fiionoíisííavona segun Geiger & Eokei 11989). ‘Luteolina según Geiger & col. (1987). Señnles correspondientes a ¡os 2 hidrógenos situados en posición 3 >1e ¡a mitad flavanón’¡ca del biflavonoide. 253 Tabla 6,6b.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto VI. Conmwsm FiItÉUsflÉvaa1 102.6 200.0 166,5 168,0 168.4 163,8 48,7 scc. 55,3 sec. 106.4 ¡08.6 u 109,0 t. 102,4 4 194,3 195,2 181,7 4 ¡82.0 182.3 181.1 5 160.8 162,2 161,1 5” 158.2 160.0 160.3 6 94.Sí. 95,01. 98.6 6” 98.5 u 98,5 1. 98.3 7 164.3 165,3 ¡63,7 7” 162.4 162,6 161,4 8 104.1 105,1 93,0 8” 103,8 104,1 103,5 9 ¡56,7 149.3 ¡57,2 9” 154.8 155.1 ¡54,3 10 100.2 100.5 ¡02,9 ¡0’ ¡03.1 103,7 ¡03,2 1’ ¡29.4 132,1 124,0 1” ¡26,4 127,1 121.7 2’ 119,6 120,9 118,7 2”’ 118,3 118,3 113,5 3’ 144.7 144.7 144,3 3’ 144,4 144,4 ¡45.7 4’ 145,3 145,8 ¡48,3 4” 146,7 147,0 149,4 5’ 113,75. 114,51. 114.6 5” 113.It. l13,6t. 115.5 6’ ¡19.91. ¡22.55. 120,5 Carhnos. ‘Cinpxtesb VI (eic(kÚ .‘ ~. 6”’ ¡17,41. 117,41. Filonotisflavona según Geiger & Boke¡ (¡989). 2 Luteolina según Markbam & col. (1982). Los carbonos secundarios (sIc.) y terciarios (1.) fueron determinados por la tÉcnica OEP’~. 254 118.9 182,2 162,1 99.2 ¡64.7 94,2 157,9 104,2 122,1 113,8 146.2 150.1 116,4 119.3 6.1.1.7. ANHIDRO-BARTRAMIAFLAVONA (Compuesto VII) (2’,8”-8,2”’-biluteolina) El Compuesto VII que identificamos como la Anhidro-Bartramiaflavona (BH-2, BP-2) fue aislado por primera vez en Bariramiapomiformis (Seeger & col., 1991) y posteriormente en la misma especie (López-Sáez, 1992; Seeger, 1992) y en Bariramia halleriana (Salm, 1992). Así mismo, Seeger & col. (1991), obtenían también en Bartramia poiniformis, mediante deshidratación de la bartramiaflavona (Compuesto VI) la anhidrobartramiaflavona, mediante H2504 al 20% a 2500 0. La Anhidrobartramiaflavona posee una complidada estructura tridimensional: los planos formados por las dos mitades de benzocromo (anillos Al CI y Ah CII), están orientados uno respecto al otro con un ángulo de 600, puenteados por los anillos SI y 511, cuyos planos se orientan casi perpendicularmente respecto del plano de benzocromo correspondiente (ver Fig. 6.8 correspondiente al Modelo molecular de la Anhidrobartramiaflavona). El hecho de tratarse de una molécula macrociclica implica que no hay planaridad, y por ello el espectro de ultravioleta resultante es poco indicativo y de escasa validez analítica a la hora de determinar la estructura de la anhidrobartramiaflavona (Salm, 1992). Al igual que ocurría con el Compuesto VI, el Compuesto VII no cambia de color al ser observado a la luz ultravioleta tras aplicar NA, de ahí que sea fácilmente distinguible en las TLCs respectivas del resto de biflavonoides, al igual que también lo es por su relativa alta movilidad cromatográfica (López-Sáez. 1992; Seeger, 1992; Salm, 1992). Todas las consideraciones que ya adujimos respecto a la alta movilidad cromatográfica, a la respuesta al uso de reactivos específicos de TLC y a los resultados de la espectroscopia de ultravioleta del Compuesto VI, pueden aceptarse plenamente para el Compuesto VII. En referencia al FAB-EM, a pesar de ser una biluteolina, la anhidrobartramiaflavona no tiene la señal a 569 um, típica de las biluteolinas, pues pierde dos H~ con el segundo enlace que forma el macrociclo, y ión [M H]~ pasa a ser de 567 um, lo que viene a confirmar que el Compuesto VII es efectivamente una biluteolina 13C-RMN macrocíclica un 6.7b nuevoal segundo (vercon Tabla final de laenlace. discusión del compuesto), las Respecto al espectro de señales para 0-2’, 0-8’’, 0-2”’ y 0-8 son sensiblemente diferentes respecto de las correspondientes - de la luteolina, lo que indica que los 4 carbonos deben estar implicados en algún tipo de enlace interfiavonoidico. Comparando ahora el espectro de 30-RMN del Compuesto VII con el de la filonotisflavona, observamos en cambio que las resonancias de 0-2’ y 0-8” son prácticamente idénticas a las de los mismos carbonos en la filonotisflavona mientras que no ocurre lo mismo con 0-2”’ y 0-8. Esto viene a decirnos que el Compuesto VII tiene al menos un enlace entre los dos monómeros del biflavonoide idéntico al de la filonotisflavona, concretamente el enlace entre 0-2’ y 0-8”, mientras que 0-2”’ y 0-8 son los otros dos carbonos que intervienen en el segundo enlace interfiavonoidico que en cambio está ausente en la filonotisflavona, de ahí esas diferencias en el espectro. El resto de señales del espectro de 130-RMN pueden asignarse sin problemas por comparación directa con las resonancias respectivas de los mismos carbonos de la luteolina y la filonotisflavona. Resumiento lo deducido del espectro de 30-RMN podríamos afirmar que el 255 Compuesto VII sería un bitiavonoide macrocíclico, concretamente una biflavona del tipo biluteolina, con un segundo y nuevo enlace entre 0-2”’ y 0-8 respecto a la filonotisflavona. Al tratarse de una molécula simétrica, en el espectro de ‘H-RMN de la anhidrobartramiaflavona (Compuesto VII) sólo observamos la mitad de los picos, en referencia al número normal que aparece en el resto de biflavonoides (ver Tabla 6.7a al final de la discusión del compuesto). Así por ejemplo, en 13 ppm únicamente encontramos un pico, correspondiente el sólo a las señales de los protones situados en los hidroxilos en posición 5 de ambos monómeros, cuyas señales se solapan por ser simétricos. Todos estos hechos nos podrían confundir y pensar que se trata de un flavonoide monomérico, pero su movilidad cromatográfica ya comentada, y sobre todo, los resultados de la espectrometría de masas nos aclaran realmente que se trata de un biflavonoide. Todas las señales del espectro de H-RMN del Compuesto VII pueden asignarse sin problemas, con las respectivas de la filonotisflavona, aunque por lo general a valores de ppm más bajos, debido al ya comentado efecto de apantallamiento causado por la estructura macrocíclica. Unicamente, respecto a la f¡lonotisflavona, no se detectan las señales correspondientes a H-8 y H-2”’, indicando que dichos carbonos 0-8 y 0-2”’ son los implicados en el segundo enlace interfiavonoidico, que en cambio no posee la filonotisflavona. Como indican Geiger & col. (1993a), la Anhidro-Bartramiaflavona es un biflavonoide derivado de la filonotisflavona, mediante la adición de un segundo enlace interfiavonoidico entre 02”’ y 0-8, que da lugar a una molécula simétrica y macrocíclica. En ella, los dos anillos B están situados por poco casi perpendicularmente respecto a los anillos O respectivos (BI-Cí y Bu-Oíl), lo que da lugar a ese cambio químico en la resonancia de 0-3 sobre 108.9 ppm en el espectro de ‘SCRMN, que alcanza valores de ppm más altos que el mismo 0-3 en la filonotisflavona, donde no existe esa perpendicularidad acusada entre los anillos B-C. La señal en cambio para H-3 en la anhidrobartramiaflavona, se sitúa a valores de ppm más bajos que la misma señal en la filonotisflavona. Esto se debe al efecto “escudo” que ejerce el anillo A respecto de la otra mitad flavónica (Geiger & col., 1993a). Traub & Geiger (1975), en las semillas de Galega offlcinalis L. aislaron el 2,5,7,3’,4<pentahidroxi-flavano-5-glucósido, que al igual que la Bartramiaflavona (Compuesto VI) estaba formado de dos formas tautoméricas, una de ellas de cadena abierta y otra cerrada, interconvertibles entre ellas y con la posibilidad de sintetizar a partir de él la forma deshidratada (luteolina-5glucósido), de la misma manera que puede hacerse con la Bartramiaflavona hacia AnhidroBartramiafiavona. En resumen, el Compuesto VII sería la Anhidro-Bartramiaflavona, una biluteolina de estructura macrocíclica, derivada de la filonotisflavona, y que puede obtenerse como producto de deshidratación de la bartramiaflavona. Su fórmula queda reflejada en la Fig. 6.9. 256 flg, 6.8.. Modelo de ¡~ 1~flav 0»2 O OH ‘5 6 ~Ul HO OH OH OH HO £ £ 4. OH O Fig. 6.9.: Anhidro-Bartramiaflavona (C~H16O~) (2< <8’ ‘-8,2” ‘-biluteolina) Tabla 6.7a.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto VII. FilñotMavoná’ Com¡testa Vil 3 6,26s 6.06s 6,69s 6 5,74s 5.75 d (2) 6.22 d (2) 6,07 d (2) 6,47>1 (2) 8 ‘ Fwtúnes 2’ 7.43 d (2) 5’ 6,73 d (8) 7,01 >1 (8,5) 6.92 d (9> 6’ 6,80 d (8) 7,24 d (8,5) 7.77 dd (2:9) 3” 6,26s 6,62s 6” 5,74s 6.21s 2” 7.024(2) 5”’ 6,73 d (8) 6.894(9> 6”’ 6,80 d (8) 7,00>1>1(2:9) 011-5 12,64s 011-5” 12,64s ‘Filonor,sflavona 2Luteo¡ina según Geiger según Geiger & col. &(1987). Bokel (1989). 257 - Tabla 6.7b.: Datos de 13C-RMN del Compuesto VII. ...Cat~nos Cúm¡~r~tó VII FflóaódsH~’o 2 2 167,1 166,5 2’’ 167,1 163,8 3 108.9 u 106,4 3 108,9 u 102,4 4 181,8 181,7 4’’ 181,8 181,1 5 160,4 161,1 5” 160,4 160,3 6 98,6 t. 98,6 6” 98,6 u 98,3 7 ¡63,0 163,7 7” 163,0 161,4 8 103,1 93,0 8” 103,1 103,5 9 154,6 157,2 9’’ 154,6 154,3 10 102,7 102.9 10” 102,7 103,2 1’ 125,5 124,0 1,’’ ¡25,5 121,7 2 119,1 118,1 2’’’ 119,1 113,5 3 144,4 144.3 3’’ 144,4 145,7 4’ 147,0 148,3 4”’ 147,0 149,4 5’ 113,9 t. 114,6 5’’’ 113,91. 115,5 6’ 118,7 t. 120,5 6”’ 118.7 u 1189 Filonotisflavona según Geiger & Bokel (1989). Luteolina según Markham & col. (1982). Los carbonos terciarios (t.> fueron determinados por la técnica DEPT. 258 LteÓlhxaZ 164,5 103,8 182,2 162,1 99.2 164,7 94,2 157,9 104,2 122,1 113.8 146.2 150,1 116,4 119.3 6.1.1.8. BARTRAMIA-TRILUTEOLINA (Compuesto VIII) (2’,8”,2”’,8””-triluteolina) El Compuesto VIII que identificamos como la Bartramia-Triluteolina, se denominó así por Seeger (1992) y Seeger & col. (1992b) en honor a que se aisló e identificó por primera vez en Bartramiapomiformis. En esta Tesis Doctoral conseguimos aislarlo e identificarlo en la misma especie anterior (BP-7) así como en Bartramia srricta (BS-5.1). Exhibe unas características cromatográficas en TLC (Rf, absorción al ultravioleta) muy semejantes a las de la luteolina y otras biluteolinas (Markham, 1982; Seeger, 1992), ya que al ser observado a la luz ultravioleta muestra un color púrpura oscuro que vira hacia la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (flavonoide no glicosilado) o biflavónica (MOes, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-15% y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TBA, aunque por lo general es algo superior al de la propia luteolina y a ciertas biluteolinas anteriormente descritas. Todo ello condujo a pensar que el Compuesto VIII debía tratarse de una biluteolina o cualquier otro derivado de la luteolina. Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict o NA, nos llevaron a concluir que el Compuesto VIII debía poseer grupos o-diOH en 3’ ,4’ o bien en 4’ ,5’ (en el anillo B) y que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de un derivado de la luteolina. Analizando los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto VIII vemos que, de manera general, como en el caso de compuestos anteriores (dicranolomina o filonotisflavona p.e.), se corresponde con el típico espectro de una flavona (Markham, 1982; Harborne, 1984; Salm, 1992). Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +39 tun (385 por 346 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo B (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico tanto en la banda 1 como en la II, indicativo de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH). La adición de H3B03 al NaOAc no supone ningun cambio significativo en ninguna de las dos bandas del espectro, pues ambas permanecen inalterables. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo B, así como la inexistencia de un grupo 3-OH, es decir, que se trata de una flavona y no de un flavonol (Salm, 1992). El espectro en A1013 respecto del de MeOH, supone un efecto batocrómico de +52 nm en la banda II y de +72 nm (418-346) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5-OH) que se confirma tras estudiar el nuevo espectro resultante de añadir CIH. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto VIII debía tratarse de una flavona o derivado, con un agrupamiento o-diOH en posición 3’,4’ del anillo B, y con hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH, así como en 4<-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es la luteolina. Los dos picos que se observan en el cromatograma de HPLC (Fig. 6.10), corresponden cada uno de ellos a los respectivos diastereoisómeros, lo que indica que ambos están presentes. 259 En el caso de que en el cromatograma de HPLC apareciera un único pico, sería indicativo de la existencia de uno sólo de los isómeros, en aquellos flavonoides que en teoría puedan tener isomería. Dichos diastereómeros son respectivamente el Compuesto VIII o Bartramia-Triluteolina y el Compuesto IX (Epi-Bartramia-Triluteolina). A diferencia de lo que ocurría con el Compuesto IV, que también estaba formado por dos diastereómeros, tanto el Compuesto VIII como el IX pudieron ser aislados por separado mediante 00, de ahí que hayamos preferido considerarlos como compuestos aparte, aunque sean isómeros. Ambos, compuestos VIII y IX fueron identificados en Bartramia stri cta. mientras que en Bartramiapom¡formis sólo se consiguió aislar el Compuesto VIII, aunque el HPLC realizado sobre el compuesto puro aislado de dicha especie también demostró la existencia de dos picos, por lo que posiblemente, también Bartramia pom~formis sintetize el Compuesto IX, que con seguridad forma parte de esa mezcla de diversos triflavonoides que es BP-X. 8 1 - F¡g. 6.10.: Cromatograma de HPLC de los Compuestos 8 y 9. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto VIII muestra un ión [Nl - H]~ de 853 um, que confirma su estructura de triluteolina, que concuerda con los resultados ya publicados respecto de la Bartramia-Triluteolina (Seeger & col., 1992b). Dicho espectro de masas se corresponde claramente con él de una triflavona (triluteolina) con 12 hidroxilos libres en la molécula, con uniones interfiavonoidicas de tipo C-C entre los diversos monómeros de luteolina (Seeger, 1992). Estableciendo la correspondiente comparación entre las resonancias del espectro de 1H-RMN del Compuesto VIII (ver Tabla 6.8a al final de la discusión del compuesto) y el de la filonotisflavona, se observa un total paralelismo entre las señales correspondientes a los mismos carbonos en ambos compuestos, con la salvedad de la existencia de una tercera señal correspondiente al tercer monómero de luteolina. Al igual que en la filonisflavona, y a diferencia de la luteolina, no se detectan las señales correspondientes a H-2’ y H-8”, lo que indica que tanto C-2’ como 0-8” forman parte de un enlace interfiavonoidico entre dos de los monómeros de luteolina, como ocurre en la filonotisflavona. La señal para H-8”” del tercer monómero tampoco aparece en el espectro, indicando que precisamente dicho carbono 0-8”” forma parte del segundo enlace entre el monómero medio y el derecho. A diferencia de la filonotisflavona, la señal para H-2”’ no aparece en el espectro de ‘H-RMN del Compuesto VIII ya que precisamente 0-2”’ es el carbono que lleva a cabo ese segundo enlace interfiavonoidico con 0-8””. En conclusión, el Compuesto VIII seña una triluteolina lineal, ya que no parece quedar manifiesta la existencia de un tercer enlace interfiavonoidico. Los tres monómeros de la triflavona se unirían mediante enlaces 0-0 de la siguiente manera: ler. Enlace entre 0-2’ del monómero izquierdo y 0-8” del monómero central. 260 2t Enlace:entre 0-2”’ del monómero central y 0-8”” del monómero derecho. Este triflavonoide ya ha sido anteriormente descrito y se conoce como Bartramia-Triluteolina (2’,8”,2”’,8””-triluteolina), cuya fórmula queda manifiesta en la Fig. 6.11. E 1 2 1-40 OH ,. 01-4 II 01-4 01-4 OH III (. OH OH, O .1’< 3”.’ u,..’ OH O Fig. 6.11.: Bartramia-Triluteoina (C45H~O18) (2’ ,8’’—2’ ,8’’’’—triluteolina) ‘ Tabla 6.Sa.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto VIII. ‘ ¡Meo’ ‘ ZIIZZIIIIZ H 3/3”!3”’ ¡a ¡le ¡lid Ii lid 6.OSs 6,¡4s 6,18s 6,06s 6,62s 669s 116/6” /6”” 5,34>1(2) 5,67s 5,70s 5,75>1(2) 6,27s 6,22>1(2) Ii 8 ¡ 8” / 3”” 6.01 >1(2) — — 6.03 MI) - 6.47 >1(21 H 2’ 1 2”’ / 2””’ — — 6,64 >1(2) - ‘702 >1(2) 7,43 >1(2) H 5’ /5”’ /5””’ 6,91 d(8) 6,81>1(8) 6<12>1(8) 7.01>1(8.5) 6.74>1(9) 6,98>1(8) H 6/6”’! 6””’ 7.10>1(8) 7,06 >1(8) 6.43 >1>1(8:2) 7.24>1(8,5) 7.00>1>1(9:2) 744>1>1(8:2) OH 5/5”! 5”’ ¡2,88s 12,89s ¡3.02s ¡3,0¡s 12.88s 13,00s Filonotisflavona ~gúii Geiger & Bokel (1989) y Se¿ger IW¿>. ‘Luteolina según Geiger & col. (1987) y Seegei’ (1992). 1. II. III representan cada uno de los monómeros del triflavonoide (1 i. monómero izquierdo: II c, monomero medio y III >1. monómero derecbo) o en su caso del biflavonoide filonotisflavona. 261 6.1.1.9. EPI-BARTRAMIA-TRILUTEOLINA (Compuesto IX) (2’,S”-2”’,8””- triluteolina) El Compuesto IX, que fue identificado como la Epi-Bartramia-Triluteolina en la especie Bartramia stricta (BS-5.A), es en realidad un diastereómero del Compuesto VIII, existiendo la duda sobre su también existencia en Bartramia pomiformis, de acuerdo a lo comentado con anterioridad en el Compuesto VIII. En base a lo anterior, todas las consideraciones que ya adujimos respecto a la movilidad cromatográfica, a la respuesta al uso de reactivos específicos de TLC y a los resultados de la espectroscopia de ultravioleta del Compuesto VIII, pueden aceptarse plenamente para el Compuesto IX. El espectro de masas del Compuesto IX, al igual que el del VIII, ofrecía un ión [M H]~ de 853 um, típico de triluteolinas con 12 hidroxilos libres en la molécula. Sólamente mediante correlación de los espectros de 1H-130 RMN y H-1H RMN mediante el método COSY se pudo llevar a cabo su identificación, ya que tanto en la TLC como en la CC aparecía conjuntamente con el Compuesto VIII. El espectro de 130-RMN (ver Tabla 6.9a al final de la discusión del compuesto) muestra un total de 45 señales, correspondientes a otros tantos carbonos. Según ello, el Compuesto IX debía tratarse un triflavonoide, al igual que el anterior Compuesto VIII, pues un monómero flavonoidico daría únicamente 15 señales. La asignación de cada una de las resonancias respectivas a los carbonos del Compuesto IX se realizó por comparación directa con las que ofrece la filonotisflavona. La coincidencia es prácticamente total entre los dos primeros monómeros del triflavonoide (carbonos numerados como 0, 0’, 0” y 0”’), así como del tercer monómero del triflavonoide que lógicamente no posee la fllonotisflavona, y cuyos carbonos se numeran como 0”” y 0””’. Según ello, el Compuesto IX debería tratarse de un triflavonoide directamente relacionado con la filonotisflavona, es decir, con 3 monómeros de luteolina entre los que se llevan a cabo uniones interfiavonoidicas idénticas a las de la filonotisflavona (2’,8’’). Los enlaces entre los tres monómeros serían respectivamente: 2’,S”- entre el monómero izquierdo y el central del triflavonoide y, 2”’,8””- entre el central y el derecho. Sería al igual que el Compuesto VIII, una 2’,8”-2”’,8””-triluteol¡na. Dado que el resultado es el mismo, deducimos que posiblemente el Compuesto IX fuese isómero del VIII. El espectro de 1H-RMN (ver Tabla 6.9b al final de la discusión del compuesto) muestra básicamente la misma combinación de señales respectivas a los acoplamientos en orto- y meta- que en el Compuesto VIII, lo que concuerda con el resultado del espectro de 130-RMN. En el espectro de ‘H-RMN del Compuesto IX al igual que ocurre en el Compuesto VIII, es posible reconocer las siguientes señales: Un singlete para H-6”, ya que no existe protón libre en 0-8” por intervenir este carbono en el enlace interfiavonoidico, con lo que H-6” no puede acoplarse con ningún otro protón. Un segundo singlete para H-6”” por las mismas razones anteriores, ya que no existe protón libre en 0-8””, por intervenir este carbono en el segundo enlace interfiavonoidico. Por regla general, los protones no acoplados a ningún otro aparecen en el espectro como singletes. Dos dobletes respectivos para H-6 y H-8 que se acoplan entre ellos en posición meta-. - - - - 262 Dos dobletes para H-5’ y H-6’ debido a su orto-acoplamiento. Dos dobletes para ¡1-5”’ y H-6”’, también por orto-acoplamiento entre ellos. Un doblete para ¡1-5””’ por su orto-acoplamiento con H-6””’ en el tercer monómero. Un doblete para ¡1-2””’ por su meta-acoplamiento con H-6<””. Los protones acoplados con otro protón, ya sea en posiciones orto- o meta- aparecen como dobletes en el espectro de protón. Finalmente, un doble doblete para H-6””’, ya que este protón posee un doble acoplamiento en ortocon H-5””’ y en meta- con ¡1-2””’. Los protones acoplados a su vez con otros dos protones en ortoy meta- respectivamente, muestran una señal del tipo doble doblete. Las señales correspondiente a los hidroxilos libres en posición 0-5 en cada uno de los monómeros se asignaron como OH-5 para 12.88 ppm, ÓH-5” a 12.89 ppm y OH-5<”’ a 13.02 ppm respectivamente. A pesar de que las señales correspondientes a cada protón tanto en el Compuesto VIII como en el IX sean muy similares, es bien cierto que se pueden observar algunas diferencias sustanciales. Los protones del anillo fi del tercer monómero del Compuesto IX, muestran frente a las señales respectivas del Compuesto VIII un mayor desplazamiento químico, lo que se traduce en valores de ppm más elevados. Valgan como ejemplo los siguientes datos: la señal para ¡1-2’’’’’ en el Compuesto VIII aparece a 6.56 ppm mientras que en el Compuesto IX lo hade a 7.03 ppm. La señal para ¡1-5””’ se muestra a 6.12 ppm en el Compuesto VIII y a 6.97 ppm en el IX y, finalmente, la señal para ¡1-6””’ en el Compuesto VIII aparece a 6.27 ppm y a valores de ppm más elevados (6.98) en el Compuesto IX. Estas diferencias significativas en las resonancias para los mismos protones entre ambos carbonos, pueden ser debidas a un debilitamiento sustancial del apantallamiento o efecto “escudo” de la propia molécula, pues mientras mayor es dicho efecto menores son los valores de ppm que se registran. Una respuesta parecida a la anterior es la que ofrecen los protones del anillo A. cuyos desplazamientos son por lo general también menores en el Compuesto VIII que en el IX, debido a ese mayor apantallamiento existente en el Compuesto VIII. En los protones H-5’ y ¡1-5<” del anillo B del primer y segundo monómeros, se produce en cambio el efecto contrario, es decir, aparecen por regla general a mayores valores de ppm en el Compuesto VIII que en el IX, mientras que H-6’ y ¡1-6”’ lo hacen por debajo. Esto puede dar una idea de la importancia que tiene la estructura molecular en la respuesta de cada protón en el espectro de H-RMN. El resto de señales son prácticamente idénticas en ambos compuestos VIII y IX. Este fenómeno descrito puede explicarse en base a cierta particularidad del Compuesto IX respecto del VIII. Aunque ambos son triluteolinas con los dos mismos enlaces interfiavonoidicos, puede darse el caso de que alguno de dichos enlaces tenga posibilidad de giro libre. Seeger (1992) afirma que el Compuesto VIII, la Bartramia-Triluteolina, posee dos centros quirales. De acuerdo a ello, el Compuesto IX podría ser fácilmente un diastereoisómero del Compuesto VIII. La única diferencia significativa en el espectro de RMN de ambos compuestos es la basada en un diferente apantallamiento o efecto escudo que ocasiona la estructura molecular. Por ello, la posible estructura del Compuesto IX sería concretamente la de un epímero del Compuesto VIII, por el momento hipotético, en el cual el monómero III estuviera situado con un ángulo de 1800 respecto al monómero 1. El esquema molecular que entonces resultaría, aunque volvemos a repetir que por el momento es una hipótesis, sería el expuesto en la Fig. 6.12. En dicha figura, 1, II y III corresponden a cada uno de los monómeros de luteolina numerados como O y 0’ (1), 0” y 0”’ (II) y 0”” y 0””’ (III) - - - - - 263 respectivamente. En la Bartramia-Triluteolina se reflejó además la posición de los 2 centros quirales establecidos por Seeger (1992) con el símbolo * En el esquema anexo a las fórmulas, cada uno de los monómeros se representa como una línea indicando la posición de los anillos A y B, así como en el centro de dicha línea el grupo oxígeno del anillo O respectivo. ‘ A T JItE t —413 E A ‘. A -.—-~ A C A Han ramia-Triluteolina zo B Epi-Bartramia-Triluteo¡ina o o Oil U 01< o no * si * 1. oz * 9 01< o o” II / \ o / \ nl fl 1~~ Bartramia-Triluteolina O O Epi-Banramia.Triluteolina Fig. 6.12.: Epi-Bartramia-Triluteolina (C.j1~O18) (2’,8’‘—2’ .8” “—triluteolina) ‘ ‘ Tomando en consideración que el primer monómero quedaría representado en la vertical dirigido con el anillo A respectivo hacia la parte superior, y el segundo sobre la horizontal, se puede observar que tanto el monómero 1 como el II tendrían una posición relativa equivalente en los Compuestos VIII y IX. Sin embargo, la diferencia entre ellos radica precisamente en la posición del monómero III respecto al centro quiral existente en el enlace C-2”’IC-8””. Estas diferencias se manifiestan sobre todo en relación a la posición del monómero III respecto al 1. En el Compuesto VIII (Bartramia-Triluteolina). el anillo A del monómero 1 quedaría en frente 264 del anillo B del monómero III. De la misma manera, los monómeros 1 y III se situarían aproximadamente paralelos entre ellos y perpendiculares respecto al monómero íi o central. Esta estructura permitiría la planaridad de la molécula, pero al cerrarse el monómero III sobre el 1 a través del centro quiral en C-2”’/C-8’’”, el apantallamiento que dicha estructura molecular causaría seria bastante mayor que en el Compuesto IX. De esta manera se explicarían fácilmente esos menores valores de ppm de las señales correspondientes al anillo BIII del Compuesto VIII. En el Compuesto IX, la Epi-Bartramia-Triluteolina, se produce un giro de 1800 en el centro quiral situado entre 02”’ y 0-8”” respecto al Compuesto VIII, ocasionando que anillo BIII no quede frente al Al, la molécula es más abierta y por lo tanto el efecto “escudo” es menor, con lo que las resonancias se muestran a valores de ppm más elevados que en el Compuesto VIII. Lógicamente se pierde la planaridad de la molécula. El esquema estructural comentado en la Fig. 6. 12 no puede por ello dibujarse en dos dimensiones, ya que los monómeros se encuentran en planos distintos. No obstante, hemos querido presentar la posible estructura derivada del giro sobre el centro quiral de la EpiBartramia-Triluteolina, aunque manifestando las limitaciones que lógicamente puedan existir por la existencia de diversos planos. 265 Tabla 6.9a.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto IX. Carbonos ‘Compuesto IX Filónotlstbv 2 166,7 166,5 2” 164,6 163,8 2”” 165,6 3 106,1 t. 106,4 r. 3” 106,1 t. 102,4 t 3”” 102.4t. 4 181.5 181,7 4’’ 181,4 181,1 4”” 181,9 5 161,1 161,1 5” 160,4 160,3 5”” 160,6 6 98,7 t. 98,6 t. 6’’ 98.3 t. 98,3 t. 6”” 99,1 í. 7 163,9 163,7 7” 161,3 161,4 7”’’ 161,3 8 93,5 t. 93,0 t. 8” 103,5 103,5 8”” 103,7 9 157,3 157,2 9” 154,6 154,3 9”” 155,2 10 102.9 102,9 10” 103,4 103,2 10”” 102,7 1’ 123,8 124,0 1”’ 121,9 ¡21,7 1”’’’ 123,8 2’ 118,7 118,7 266 Carbonos CompuestoVC. FíIbíiol~s1iavi, 2’’’ 118,7 113,5 í. 2’’’” 113.7t, 3’ 144,2 1457 3”’ 145,6 145,7 3”’’ 144,1 4’ 148.4 148,3 4”’ 149,6 149.4 4 148,6 5’ 114,5 t. 114,6t. 5”’ 115,7 t. 115.5 t, 5””’ 114,3 t. —- 6’ 120,7 É. 120,5 ¡. 6’’’ 118,7 u 118,9 t. 6””’ 120,7 t. —- Fílonotístiavona segsxn Geiger & Hotel (¡989>. Los carbonos terciarios (t.) fueron determinados por ¡a técnica DE?!’. Tabla 6.9b.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto IX. 4..:.. ft~ IuZIIZZlIZiZ Ii ~ H 6/6/6”” 6,11 d(2) ¡¡e ~ 614s III d 6 6,61s ¡¡ 6,06s [íd 6.69s .2L 5.75>1(2) 6,27s 6,22>1<2) 5,75>1(2) — — 6.07>1(2) ‘ 6,47>1(2) H 2’ / 2” / 2””’ — — 7,03 >1(2) - 7,02 >1(2) 7,43 >1(2) H 5’ / 5”’ / 5””’ 6,76>1(8) 6.73 >1(8) 6.97>1(8) 7,01 >1(8.5) 6.74 >1(9) 6,98>1(8) 717>1(8) 712 >1(8) 698>1>1(82) 724>1(85) 700>1>1(92) 744>1>1(82) 1288s 1289s ¡302s 1301s 1288s 1300s OHS/5’’!5’’’ ‘Filonotisflavona según Geiger & Bokel (¡989) y Seeger (¡992). 2Lutco¡ina según Geiger & col, (¡987) y Seeger (1992). II, lI¡ representan cada uno de los monómeros del u-iflavonoi>1e (1 so caso del bijiavonoide filonotisflavona. monómero ‘tzquier>1o: ¡1 e, monomero medio y ¡11 267 >1. monómero derecho) o en 6.1.1.10. CICLO-TRILUTEOLINA (Compuesto X) (Ciclo-Bartramia-Triluteolina) La identificación del Compuesto X como la Ciclo-Triluteolina en Bartramia stricta (BS-3). supone una novedad para la química flavonoidica, ya que hasta el momento no se conocía ningún compuesto de esta naturaleza, los triflavonoides cíclicos. Si bien es cieno, ya con anterioridad se había descrito un triflavonoide lineal en el musgo Bartramia porniformis (Seeger, 1992). Exhibe unas características cromatográficas en TLC (Rf, absorción al ultravioleta) muy semejantes a las de la luteolina y a las de la Bartramia-Triluteolina (Tabla 5.37), ya que al ser observado a la luz ultravioleta muestra un color púrpura (violeta oscuro) que vira hacia la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (Miles, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-15% y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TBA, aunque por lo general es algo superior al de los dos compuestos referidos. Todo ello nos llevó de nuevo a pensar, de acuerdo a los conocimientos que hasta ese momento teníamos sobre los flavonoides en Bartramiaceae, que debía tratarse de una biflavona (López-Sáez, 1992). Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict o NA, nos llevaron a concluir que el Compuesto X debía poseer grupos o-diOH en 3’,4’ o bien en 4’, 5’ (en el anillo B) y que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de una biluteolina o de otro flavonoide también derivado de la luteolina. Comparando el espectro de ultravioleta del Compuesto X con él de la filonotisflavona o con él de la luteolina (Tabla 5.38) se observa una gran concordancia en los datos, que nos hizo pensar que estaban fuertemente emparentados. Analizando detenidamente los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto X, vemos que a diferencia de lo que ocurre en los biflavonoides (absorben aproximadamente entre 250-280 nm en la banda II y entre 310-350 mn en banda 1), el Compuesto X tenía su comportamiento sensiblemente distinto. En la banda II se observaba un pico a 267 nm que sí se correspondía al intervalo biflavonoidico, pero en la banda 1 apenas aparecía siempre un hombro sobre 338 nm (338sh) y no un segundo pico típico de biflavonoides (Salm, 1992; Harborne, 1984). Este primer dato ya nos llevó a pensar que el Compuesto X estaba relacionado directamente con la luteolina y la filonotisflavona, pero muy posiblemente no era un biflavonoide. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeQE se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +58 (396 por 358 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo B (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico en labanda Ide +38 nm, mientras que la banda II no se altera, lo cual es indicativo de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH). Sin embargo, esa ausencia de variación en la banda II del espectro en NaOAc nos hizo sospechar que debía existir alguna inferencia que impidiera una total correspondencia con el respectivo espectro de la luteolina o de la filonotisflavona. La adición de H3B03 al NaOAc no supone ningun cambio significativo en ninguna de las dos bandas del espectro, pues ambas permanecen inalterables. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo B, así como la inexistencia de un grupo 3-OH, 268 es decir, que se trata de una flavona y no de un flavonol (Salm, 1992>. El espectro en A1013 respecto del de MeOH no supone de nuevo ninguna alteración del espectro correspondiente respecto al del MeO¡1, lo cual ya sí es una diferencia bastante significativa respecto al espectro de la luteolina. En caso de tratarse de una biluteolina o de una triluteolina lineal cabría esperarse que el espectro de ultravioleta del Compuesto X fuese cercano a éstas, y presenta no obstante ciertas alteraciones. Lo mismo puede afirmarse de la adición de HOI al espectro en tricloruro de aluminio. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta y a su movilidad cromatográfica, el Compuesto X debía tratarse de un compuesto relacionado con la luteolina o a la filonotisflavona, pero seguramente no es ni una biluteolina ni una triluteolina lineal, pues se detectan sensibles diferencias, sobre todo en su espectro de ultravioleta. El espectro de masas muestra un ión [M]~ de 852 um que ya desde un inicio sugería que el Compuesto X era un triflavonoide. Comparando este dato con el FAB-EM de otro triflavonoide conocido, la Bartramia-Triluteolina (Seeger, 1992), vemos que esta última es un triflavonoide lineal compuesto de tres monómeros de luteolina unidos por enlaces 2’,8”- y 2”’,8””- y su ión [Nl aparece a 853 um (M~ a 854 mu). Según ello, el Compuesto X sería un triflavonoide que habría perdido dos protones respecto a la Bartramia-Triluteolina, por lo que dificilmente podría tratarse de - una Triluteolina lineal. Conociendo la existencia de biflavonoides macrocíclicos como la Bartramiaflavona y Anhidrobartramiaflavona (López-Sáez, 1992; Seeger, 1992; Salm, 1992) sospechamos que el Compuesto X podría tener un comportamiento similar al de éstos respecto de la Bartramia-Triluteolina. De hecho, la existencia de un tercer enlace interfiavonoidico entre los flavonoides extremos del triflavonoide lineal, supondría la pérdida de dos hidrógenos y explicaría ese ión M~ a 852 um. En principio, y de acuerdo a la Espectrometria de Masas podríamos afirmar que el Compuesto X se trataría muy posiblemente de un Triflavonoide Cíclico, seguramente una triluteolina, y muy íntimamente relacionado con la Bartramia-Triluteolina. La anhidrobartramiaflavona tiene un ión [M]~ de 568 um, correspondiente a dos luteolinas monosustituidas (2 x 284), mientras que el ión M~ del Compuesto X equivale a la suma de tres luteolinas monosustituidas (3 x 284= 852), lo que indica finalmente que debe tratarse de una triluteolina. El Compuesto X demuestra su naturaleza cíclica ya que en el espectro de ‘~C sólo se identifican 15 señales y no las 45 que corresponderían a un triflavonoide de cadena abierta (Seeger, 1992). Esas 15 señales que aparecen reflejadas en el espectro de ‘~C del Compuesto X, la CicloTriluteolina, indican que o bien es un flavonoide monomérico, hecho que sabemos no es cierto gracias a su espectro de masas (propio de un triflavonoide), o en su caso debe tratarse de una estructura cíclica, como así ocurre. El hecho de que únicamente aparezcan 15 señales en el espectro se debe a que la Ciclo-Triluteolina es una molécula simétrica, donde las señales correspondientes a cada uno de los monómeros se solapan en su posición respectiva equivalente (ver Tabí 6. lOa al final de la discusión del compuesto). Si se tratase de un triflavonoide de cadena abierta, el número de señales detectadas no sería 15, sino 45, pues no30-RMN existiría laesaasignación simetría de antes nombrada, que sólo se logra si las señales correspondientes a cada la molécula es cíclica. En el espectro de ‘ carbono se realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992; Voigt, 1993; Salm, 1992) respecto de la anhidrobartramiaflavona (Compuesto VII). La 269 presencia de la señal a 181.1 ppm es debida a 3 átomos de carbono correspondientes a tres flavonas, concretamente a 0-4, 0-4’’ y 0-4”’’, cuya similitud de señales entre ellos, y respecto a la señal correspondiente de la luteolina (0-4) indica que el Compuesto X debe ser un trímero de luteolina (triluteolina). En los espectros de ‘30-RMN de los 5,7-dihidroxiflavonoides (como la luteolina), las señales para 0-6 y 0-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para 0-6 manifiesta en un nivel inferior (es decir a valores de ppm mayores) respecto de 0-8 (Osterdahí, 1983). Según lo anterior, dentro de dicho intervalo pudimos asignar las señales correspondientes a los carbonos 06, 0-6” y 0-6”” en 98.0 ppm, y a niveles de ppm más bajos en cambio, no encontramos las respectivas a 0-8, 0-8” y 0-8””. La ausencia de una señal en el rango 90 a 96 ppm indica en este caso que tanto C-8, 0-8” como 0-8”” están sustituidos, ya que son los carbonos que llevan a cabo los enlaces interfiavonoidicos en cada uno de los anillos A implicados pertenecientes a las tres unidades monoméricas respectivas. La intensa señal a 103.3 ppm es asignada a dichos carbonos. La señal a 106.7 corresponde a los carbonos 0-3, 0-3” y 0-3””. La señal a 118.9 ppm corresponde a los carbonos 0-2’, C-2”’ y C-2””’, cuya señal se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico, ya que varía sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la luteolina que se detecta a 113.8 ppm (Geiger & Bokel, 1989) y es por contra idéntica a la de la Anhidrobartramiaflavona. El resto de señales del espectro se asignaron de acuerdo a la literatura (Geiger & Bokel, 1989; Salm, 1992), respecto de la anhidrobartramiaflavona, por lo que por la misma multiplicidad y casi iguales desplazamientos químicos (isocronía) que las referencias bibliográficas, la asignación de los carbonos correspondientes a cada señal fue sencilla. La señal correspondiente a los carbonos C-5’I5”’/5’’’’’ es igual a la que ofrece la luteolina y la anhidrobartramiaflavona, lo que indica que este carbono no interviene en el enlace interfiavonoidico. Resumiendo, podemos decir que las resonancias correspondientes a los carbonos C-8/8”/8”” a 103.3 ppm y C-2’12’ “¡2””’ a 118.9 ppm son casi idénticas a las que ofrecen los mismos carbonos en la anhidrobartramiaflavona (103.1 y 119.1 ppm respectivamente), lo que significa que el Compuesto X tiene tres enlaces interfiavonoidicos que implican los mismos carbonos que en la anhidrobartramiaflavona, es decir 0-8 y 0-2’ en cada uno de los monómeros del triflavonoide. Analizando finalmente el espectro general de ‘30-RMN del Compuesto X, se observa con claridad que todas las señales pueden asignarse sin problema a las correspondientes de la anhidrobartramiaflavona, teniendo en cuenta por supuesto que se repiten de 3 en 3 al ser una triluteolina, además simétrica. De acuerdo a los resultados del espectro de ‘3C-RMN podemos deducir que el Compuesto X es una triluteolina cíclica, que posee el mismo tipo de enlaces interfiavonoidicos que la filonotisflavona y la anhidrobartramiaflavona. En referencia al espectro de ‘H-RMN (ver Tabla 6. 10b al final de la discusión del compuesto) debemos decir que los picos a 8.5, 10.0 y 11.0 ppm son típicos de protones carbonílicos o aminas, pero son demasiado altos respecto de los que presenta el Compuesto X. El pico cercano a 13 ppm, en cambio, es típico de un flavonoide con un grupo OH- libre en posición 5. El hecho de que aparezca un sólo pico sobre 13 ppm, concretamente a 12.66 ppm, parece indicar en principio que se trata de un monómero flavonoidico, pero sabiendo que es un triflavonoide podemos concluir que dicha señal es la misma pero solapada respecto a los hidroxilos correspondientes en posiciones OH-5, OH5” y 011-5””. Las señales entre 8.5 y 11.0 ppm son propias de los protones de hidroxilos, pero éstas 270 en general son anchas y bajas, como ocurre por ejemplo en el espectro de la filonotisflavona, y no tan altas y extrechas como en el espectro de protón del Compuesto X. Entre 6.1 y 6,7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y O (Seeger,. 1992) que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 5.93 ppm para los protones en 0-3, 0-3” y 0-3”” respectivamente que aparecen como un singlete al igual que en la luteolina, 6.32 ppm para ¡1-6, H-6” y ¡1-6””. La ausencia de la señal respectiva al protón H-8 respecto de la anhidrobartramiaflavona viene a demostrar de nuevo la naturaleza cíclica del Compuesto X y la existencia de un tercer enlace interfiavonoidico respecto a la anhidrobartramiaflavona. Las señales de los protones correspondientes del anillo B aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y 0. La señal para los protones en H-6’, aparece por regla general sobre 7.2-7.9 ppm como un doblete (Seeger, 1992), de ahí que de acuerdo a ello se asignaron respectivamente ¡1-6’, ¡1-6’’’ y ¡1-6””’ para la señal a 6.34 ppm, en la cual el efecto de apantallamiento debido a la estructura macrocíclica de la molécula, y a la cercanía del enlace respectivo en 0-2’ que ocasiona acoplamiento con los protones más cercanos tanto de su anillo B respectivo como del anillo O del monómero vecino, ocasiona valores de ppm más bajos respecto a la luteolina. El protón del carbono 0-5’ de flavonas 3’,4’-dioxigenadas (luteolina) aparece como un doblete entre 6.7 y 7.1 ppm (Seeger, 1992; Salm, 1992) por lo que ¡1-5’, ¡1-5”’ y ¡1-5””’ fueron asignados para la señal a 6.70 ppm respectivamente, en los cuales el acoplamiento es menor que en ¡1-6’16’ “16””’ por encontrarse en una posición relativamente externa de la molécula, y no muy cercanos respecto a los protones de los monómeros anexos. No se detectaron las señales correspondientes a los protones de C-2’12”’¡2’’’’’ y C-818”/8’’’’, lo que indica la inexistencia de protones, justificada fácilmente si atendemos a que dichos carbonos son precisamente los que llevan a cabo los enlaces interfiavonoidicos. En resumen, podemos deducir finalmente que el Compuesto X es un triflavonoide cíclico, concretamente una triluteolina macrocíclica, que denominamos Ciclo-Triluteolina, aunque en honor a la especie donde fue identificada (Bartramia stricta), pasamos a denominar dicho compuesto como Ciclo-Bartramia-Tiiluteolina (2’,8”,2”’,S”” ,2””’,8 - Triluteolina), cuya fórmula química queda reflejada en la Fig. 6.13. Los enlaces interfiavonoidicos se llevaron a cabo entre los siguientes carbonos: 1. 0-2’ (anillo BI) y 0-8” (anillo Ah). 2. 0-2”’ (anillo Bu) y 0-8”” (anillo Allí). 3. 0-2’”’’ (anillo BIII) y 0-8 (anillo Al). La Hg. 6.14 muestra el Modelo Molecular del Compuesto X. 271 Fig. 6.14.: Modelo molecular de la Ciclo-Bartramia-Triluteol¡na. OH 1-10 o Fig. 6.13.: Ciclo-Bartramia-Triluteolina (C~H~O~,) (2’,8’’,2’’’,8’’’’,2’’’’’ ,8—triluteolina) Tabla 6.11k.: Datos de UC4U%IN del Compuesto X. X ADIL1 Carbonos Compuesto 164.8 167.1 C-9”” 154,6 164.8 167.1 C-1O 102,8 102,7 164.8 — C-1O” 102,8 102,7 106,7 108,9 C-1O”” 102,8 106,7 108.9 Cl’ 124,9 125,5 tOG,7 — C.I”’ 124,9 125,5 C-4 181,1 181,8 C-1””’ 124,9 C-4” 181,1 181,8 C-2’ 118,9 119,1 CA”” 181,1 — C-2”’ 118,9 119,1 C-5 160.4 160.4 C-2””’ 118,9 160,4 160,4 C-3’ 144,3 144,4 160.4 — C-3”’ 144.3 144,4 98,0 98,6 C-3””’ 144,3 98.0 98,6 CA’ 147,6 147,4 98,0 — C-4”’ 147,6 147,4 162,4 163,0 CA””’ 147.6 162.4 163,0 C-5’ 114,6 113.9 162.4 — C-5”’ 114.6 113.9 10ik3 ¡03.1 C-5””’ ¡14.6 -— C-2 C-3 C-6 C-7 C-8 ~.. 272 ‘ MILi Cmfl~wfl X C~rbomm ‘Conipuesto X. Mb) Carbwiua Cempi~o X Anb2 103,3 103,1 C-6’ ¡18,6 118.7 103,3 --- C-6”’ 118.6 118,7 C-9 154,6 154,6 C-6””’ 118,6 —- C-9 154,6 154,6 datos de ¡a Antídrobartranisaflavona seg,in Seeger <i!’27’ ?rtóns H-3 ‘ Tabla 6.lOb.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto X. Cmfiptststa X Mbldtohafrs»flava~ flu4MstTni’a~ 5.935 5,74s 6,06s 5,935 5,745 6,62s 5,935 H-6 6,32s 6,26s 6,07d (2) ¡-1-6” 6,32s 6,26s 6,27s 6,32s .-- -— H-8 -— --- 5,75d (2) 1-1-2”’ --- --- 7,02d (2) 14-5’ 6,70d (8) 6,SOd (8) 7,Old (8) 14-5”’ 6,70d (8) 6,SOd (8) 6,74d (9) 14-5””’ 6,70d (8) —- 14-6 6,34d (8) 6,73d (8) 7,24d (8) 14-6”’ 6,34d (8) 6,73d (8) 7,00W! (2;9) 1-1-6””’ 6,34d (8) —- 014-5 12,66s 12,64s 014-5” 12,66s l 014-5”” 12,66s 2,64s datot procedentes >1e Seeger (1992), ‘datos procedentes de Geiger & Boke¡ (¡989). 273 6.1.1.11. 5’-Oll-AMENTOFLAVONA (Compuesto XI) (Iuteolina-(5’ ,8”)-apigenina) El Compuesto XI que identificamos como la 5’-OH-amentoflavona, fue descrito por primera vez en Plagiomnium eiatum (Biehí, 1988) de la familia Mniaceae y posteriormente, en esta misma especie (Geiger & col., 1988; Anbut & col., 1989a; Anhut, 1992> y Rhytidiadelp/zus squarrosus (Seeger & col., 1990; Seeger, 1992) de Hylocomiaceae. La primera cita acerca de la síntesis de este compuesto en especies de la familia Bartramiaceae, corresponde a Rartramia ithyphylla (BI-6), estudiada en esta Memoria Doctoral. Exhibe unas características cromatográficas en TLC muy semejantes a las de la luteolina por una parte y a las de la apigenina por otra, así como a las de los tres primeros compuestos referidos (5’,3”’-diOH-amentoflavona, 5’,3”’-diOH-robustaflavona y filonotisflavona) y el Compuesto y (dicranolomina), ya que se observa a la luz ultravioleta dando un color púrpura que vira hacia la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es muy semejante al de cualquier aglicona monoflavónica (flavonoide no glicosilado) o biflavónica (Miles, 1988; Seeger, 1992) ya que apenas se desarrolla en el sistema acético-15% y en cambio prácticamente se mueve con el frente en TBA. En el sistema cromatográfico desarrollado en placas de poliamida-6 presenta un Rf relativamente alto en comparación con los compuestos ¡-III y y en la dimensión del solvente STAHL, que nos hizo pensar que se trataba de la biflavona 5’-OH-amentoflavona (Seeger, 1992). Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict o NA, nos llevaron a concluir que el Compuesto Xl debía poseer grupos o-diOH en 3’ .4’ o bien en 4’,5’ y que poseía al menos un agrupamiento odiOR que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de una biflavona derivada de la luteolina, aunque no podíamos establecer con seguridad que se tratara de una biluteolina pues su movilidad cromatográfica (RO era más alta de lo esperada (Geiger, 1990). El espectro de absorción ultravioleta del Compuesto XI es semejante al de la luteolina (Tabla 5.42.) (Geiger & col., 1988), aunque parece existir solapamiento con el espectro de otra flavona distinta de ésta (Markham, 1982). El espectro obtenido parece corresponder a la suma de dos espectros distintos procedentes de dos flavonas, siendo una de ellas la luteolina. Analizando los resultados del espectro de ultravioleta del Compuesto XI vemos que de manera general, como en el caso de compuestos anteriores, se corresponde con el típico espectro de un biflavonoide (Markhani, 1982; Harborne, 1984; Salm, 1992) pues absorbe aproximadamente entre 250-280 nm en la banda U y, entre 310-350 nm en banda 1. Siguiendo a Markham (1982), en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +45 (388 por 343 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo B (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico tanto en la banda 1 de +28 nm (371-343) como en la II (+4 nm). indicativo de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH). La adición de H3B03 al NaOAc supone un efecto ipsocrómico de -11 nm (360371) en la banda 1 y de -6 nm (263-269) en la banda II. Estos hechos indican la no existencia de grupos o-diOH en el anillo B pues en dicho caso se esperaría un efecto batocrómico de + 12 a +36 274 nm (Markham, 1982). El espectro en AIG3 respecto del de MeOH, supone un efecto batocrómico de +7 nm (272/265) en la banda II y de +6>7 nm (410-343) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5-OH). Por contra, la adición de CIH al tricloruro de aluminio origina sendos efectos ipsocrómicos en ambas bandas, de -17 mt en la banda 11(272-255) y de -65 nm en la banda 1 (410-345). Según esto, se confirman las conclusiones anteriores de que el Compuesto XI no tiene un grupo o-diOH en B, pues entonces se esperaría un efecto batocrórnico en la banda 1 de +3040 nm (Markham, 1982). En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto XI debía ser una flavona (o dímero de ella) sin un agrupamiento o-diOH en el anillo B, con hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH, así como en 4’-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es la apigenina. Sin embargo, los resultados de la TLC indicaban por contra que el Compuesto XI debía tener al menos un agrupamiento o-diOH en B, ya sea en posiciones 3’,4’ o 4’,5’ y que posiblemente derivaba de la luteolina (5’-OH-apigenina). Sabiendo que el Compuesto XI es un biflavonoide y más concretamente una biflavona, es fácil pensar que se trate de un dímero luteolina-apigenina, lo cual explicaría por un lado sus características cromatográficas y por otro, su espectro de absorción al ultravioleta. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto Xl muestra un ión [M -H] + de 553 um, que confirma su estructura de biflavona, ya sospechada por los resultados previos de la espectroscopia de ultravioleta, y que concuerda con resultados ya publicados respecto de la 5’-OH-amentoflavona (Geiger & col., 1988). Dicho espectro de masas se corresponde claramente con él de una beptahidroxibiflavona (Seeger & col., 1990) con unión interfiavonoidicade tipo C-C entre los anillos BI y AlT de ambos monómeros (Seeger, 1988). Este espectro de masas apoyaría además la hipótesis de que el Compuesto XI sea un dímero de luteolina (4 hidroxilos en 5, 7, 3’ y 4’) y apigenina (3 hidroxilos en 5, 7 y 4’). 3C-RMN la asignación de las señales correspondientes a cada carbono se En el espectro de realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Geiger & col., 1988; Seeger & col., 1990) (ver Tabla 6.1 la al final de la discusión del compuesto). Los cambios químicos observados y las multiplicidades de la gran parte de las señales son idénticos a los de la 5’,3”’-diOH-amentoflavona y amentoflavona. La presencia de dos señales a 182.2 y 181.7 ppm son debidas a 2 átomos de carbono correspondientes a dos flavonas, concretamente a C-4 y C-4”, cuya similitud de señales entre ellos, y respecto a las señales correspondientes de la amentoflavona y 5’,3”’-diOH-amentoflavona, indica que el Compuesto XI sería una biflavona derivada de la amentoflavona. En los espectros de 3C~RMN de los 5,7-dihidroxiflavonoides (como la luteolina y la apigenina), las señales para C-6 y C-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para C-6 a campo menor (es decir a valores de ppm mayores) respecto de C-8 (Ósterdahl, 1983). Según lo anterior, dentro de dicho intervalo pudimos asignar las señales correspondientes a los carbonos C-6 y C-6” en 99.0 y 98.9 ppm respectivamente, y a niveles de ppm más bajos la correspondiente a C-8 en 93.9 ppm. Sí se detecté dentro del intervalo mencionado la señal correspondiente a C-6”, lo que indica que en el caso del Compuesto XI, dicho carbono no está implicado en el enlace interfiavonoidico. Sin embargo, la ausencia de una señal en el rango 90 a 96 ppm indica por contra que C-8” está sustituido, ya que es el carbono que lleva a cabo el enlace interfiavonoidico en una de las dos unidades monoméricas. De hecho esta señal concuerda totalmente con la que ofrece la 5’,3”’-diOH275 amentoflavona, lo que indica que como en ésta, C-8” forma parte en enlace de unión entre ambos monómeros flavónicos. La intensa señal a 104.4 ppm, que no aparece dividida, es asignada a C-8”. Las dos señales a 103.0 y 102.6 ppm son asignadas a C-3 y C-3’’. Entre las tres señales más intensas restantes, las dos menos intensas a 120.5 y 120.6 son asignadas a C-l’y C-1”’. La señal a 120.4 ppm corresponde al carbono C-5’, y se encuentra influenciada por el efecto de sustitución en el enlace interfiavonoidico, y no varia sensiblemente respecto de la señal correspondiente de la amentoflavona (121.7 ppm) ni de la 5’,3”’-diOH-amentoflavona (120.0), por lo que sospechamos que al igual que en ambas, el carbono C-5’ forma parte del enlace interfiavonoidico junto con C-8” (Geiger & Bokel, 1989). El resto de señales del espectro (C-2, C-2”, C-5, C-5”, C-7, C-7”, C-9, C-9”, C-10, C-10”, C-2”’, C-3’, C-3”’, C-4’, C-4”’, C-5”’, C-6 y C-6”’) se identificaron y asignaron de acuerdo a la literatura (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992; Markham & col., 1988), respecto a la amentoflavona (5’,8”-biapigenina) y la 5’,3”’-diOH-amentoflavona. Los carbonos C-2’, C-4’ y C-6’ mostraban una resonancia totalmente de acuerdo a las correspondientes a las mismas señales en la 5’,3’’’-diOHamentoflavona, y por contra sensiblemente distintas respecto de las de la amentoflavona, que por regla general ofrecían valores de ppm más elevados. Esto es fácil de entender si atendemos a que uno de los monómeros del Compuesto XI es la luteolina, al igual que en la 5’,3”’-diOH-amentoflavona, y por lo tanto sus señales serán idénticas, mientras que en la amentoflavona, que es una biapigenina, no se produce el apantallainiento típico del hidroxilo en posición 3’ de la luteolina, de ahí que sus valores de ppm sean más altos. En el caso de C-3’, en la luteolina existe acoplamiento entre los hidroxilos en C-3’ y C-4’, lo que no ocurre en la amentoflavona, de ahí esos valores de ppm superiores respectos a los del Compuesto Xl. Por contra, los carbonos C-2”’, C-3”’, C-4”’, C-5”’ y C-6”’ tienen resonancias prácticamente idénticas a las de la amentoflavona, lo que indica claramente que el otro monómero del Compuesto XI es la apigenina. De acuerdo a los resultados del espectro de ‘3C-RMN podemos deducir que el Compuesto XI sería la luteoíina-(5’,8”)-apigenina, cuya denominación actual es 5’-OH-Ainentoflavona. Si pasamos a analizar ahora el espectro de ‘H-RMN (ver Tabla 6.1 lb al final de la discusión del compuesto), observamos que se detectan 3 señales correspondientes a singletes entre 6.38 y 6.78 ppm y 8 dobletes entre 6.25 y 7.66 ppm. En comparación con los espectro de protón de las biluteolinas ya identificadas (compuestos 1-111 y y), se detectan 11 señales en vez de 10. Esto es debido a la existencia de un protón más en el monómero de apigenina en posición H-3”’ como consecuencia de la inexistencia del grupo hidroxilo típico de la luteolina en esa posición. Respecto a las 2 señales que aparecen en el espectro de ‘H-RMN sobre 13 ppm, corresponden ambas a cada uno de los protones del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 en cada uno de los monómeros de luteolina, concretamente OH-5 para la señal a 13.09 ppm y OH-5” para 12.97 ppm. Estos protones en posición OH-5 y OH-5”de los anillos Al y AH respectivamente, establecen sendos puentes de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición 4 y 4” de los anillos CI y CII respectivos. Entre 6.1 y 6.7 ppm aparecen las señales correspondientes a los protones de los anillos A y C (Seeger, 1992) que fueron asignadas de acuerdo a la bibliografía con 6.77 y 6.84 ppm para el protón en 03 y C-3” respectivamente que aparecen como singletes al igual que en la luteolina, 6.25 y 6.44 ppm para H-6 y H-6”, y 6.49 ppm para H-8, cuya asignación es sencilla simplemente comparando con los señales propias de la amentoflavona ola 5’,3” ‘-diOH-amentoflavona. Las señales 276 de los protones correspondientes del anillo 8 aparecen en cambio hasta el intervalo 9 ppm, y por lo general por encima de los valores de ppm de los protones respectivos de los anillos A y C. La señal para los en protones H-6’ aparece por regla general sobre 7.2-7.9 ppm como un doblete (Seeger, 1992), de ahí que de acuerdo a ello se asignaron respectivamente H-6’ y H-6”’ para las señales a 7.62 y 7.66 ppm. No se detectaron las señales correspondientes a los protones de C-3’ y C-5’ de la 5’,3’ “-diOH-amentoflavona, lo que indica la existencia de hidroxilo en posición OH-3’ y que C-5’ está como en el compuesto anterior implicado en el enlace flavonoidico, lo mismo que C-8” del que tampoco se detecta ninguna señal en el espectro de protón. En resumen, podemos deducir finalmente que el Compuesto Xl se correspondería con la 5’OH-Amentoflavona (luteolina-(5’,8”)-apigenina), cuya fórmula química queda reflejada en la Hg. 6.15. En la 5’-OH-amentoflavona, el monómero correspondiente a la luteolina fue numerado como C y C’, mientras que la apigenina lo fue como C” y C”’. OH .4 1 OH 2’ 2 1 HO 40 O 1~ E OH OH O Fig. 6.15.: 5’-OH-Amentoflavona (CmHiSOii) (luteolina-5’ ,8’ ‘-apigenina) No obstante, y debido a ciertos problemas de interpretación que surgieron con el Compuesto XI, hemos querido hacer aquí una aclaración para evitar ciertos problemas puramente metodológicos. En la luteolina, los dos hidroxilos del anillo 8 se sitúan respectivamente en los carbonos 3’ y 4’. Por ello, en cualquiera de las biluteolinas identificadas en esta Tesis Doctoral, cuando llevamos a cabo su numeración química respecto de la luteolina, tuvimos muy en cuenta la posiciónde los grupos OH. Así, en el Cámpuesto 1, la 5’,8”-biluteolina, el carbono C-5’ es el que realiza el enlace interfiavonoidico con el anillo AH del otro monómero y Cl’ y C-4’ portan sendos hidroxilos. Ahora bien, cuando la denominación de un compuesto biflavonoidico se realiza en base a la amentoflavona, pueden surgir cienos problemas ya que no se tiene en cuenta a la luteolina sino la posición de los grupos hidroxílicos. Esto ha dado lugar a que inequívocamente se numeren par igual carbonos que son distintos, y el ejemplo más claro lo tenemos en el Compuesto 1 antes nombrado o en cualquier otro de los también identificados. El Compuesto 1. la 5’.8”-biluteolina se denomina también como 5’,3” ‘-diOH-anientoflavona, es decir, se supone que C-5’ es uno de los carbonos del anillo Al que lleva un grupo hidroxilo y por lo tanto difiere totalmente del mismo easo si realizamos la numeración respecto de la biluteolina, donde interviene en el enlace interfiavonoidico. Estos problemas de índole nior xioiógico no teiié:~an maxor irnortancia si en la bibliografía no existieran errores de asignación 277 de las señales correspondientes a cada carbono por lo antes comentado. En el caso de la 5’-OHamentoflavona, es frecuente encontrar como las señales de la RMN correspondientes a C-5’ se asignan a C-3’ y viceversa. Algo semejante ocurre con C-2’ y C-6’. En ambos casos se trata de carbonos simétricos y por lo tanto sus señales son muy cercanas. Pero en el caso de C-3’ y C-5’ en la luteolina o en una biluteolina, C-3’ porta un hidroxilo y C-5’ no, por lo que se pierde tal simetría y los errores de asignación son graves. Así, es frecuente encontrarnos con resultados que comparan C-2’ de un compuesto con C-6’ de otro, o C-3’ de uno con C-5’ de otro, entendiendo que se trata del mismo carbono. Para eliminar estos malentendidos, en todo momento seguimos las indicaciones de Agrawal (1989), que en su magnífica recopilación de espectros de 3C-RMN de los tipos flavonoidicos conocidos, infería que en el caso de las biluteolina o ‘de la luteolina misma, C-3’ corresponde al carbono que porta el hidroxilo y C-5’ al que en la luteolina no lo lleva. De esta manera, las asignaciones respectivas para C-2’ y C-6’, y C-3’ y C-5’ se invirtieron respecto de algunas citas de la literatura. Tabla 6.lla.: Datos de ‘3C-RMN del Compuesto XL 2 163,8 164,1 163.9 2” 164,2 164,3 164,0 3 103,0 103.2 102,9 3 102,6 102.8 102,5 4 182.2 181,9 181.9 4’ 181.7 182.2 181.5 5 161.1 161,6 161,4 5” 160.7 160,8 160.4 6 99,0 98.8 98,7 6” 98,9 99,1 98.6 7 164,2 163,9 164.0 7” 162,6 161,9 161,7 8 93.9 94,2 93,8 8>’ 184,4 104,1 104,0 9 J57,5 157,6 157,3 9” 154,7 154,7 154,5 10 103,8 104,0 103,6 10” 103.8 104,0 103,6 1’ 120.5 120,3 120.6 1”’ 121,6 121,4 121,8 2’ 112,0 131,6 112,1 2”’ 128,3 ¡28.3 118.6 278 CofripÚ~sIoX1 A~wflavtnat 3’ ¡46,2 116,4 145,5 3>” 115,8 116,0 145.8 4’ 149,0 159,4 ¶48.2 4”’ 161,7 161,1 149,4 5’ 120,4 121.7 ¡20,0 5’’’ 115,8 116.0 115.5 6’ 122,5 127,9 122,2 128.3 118.6 6”’ 128.3 Amentotiavona segun Markbam & col. (1987>. 2 5’ 3”’.diGH.amencoflavona ¾4ÁOH~4nem& según Geiger & col. (1988), Tabla 6.llb.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto XI. Protofi~s . ••. .. t4ÁOa>~4nem :>. 3 6,77s 6,74 s 6,68 6 6,25 d (2) 6.22 d (2) 6,21 d (2) 8 6,49 d (2) 6,501(2) 6,45 d (2) 2 7,55 d (2) 8.07 d (2) 7.51 d (9) 3’ 7,19.1(9) 5, 6’ 7,62.1(2) 7,99dd(2;9) 7,52.1(2) 3” 6,84s 6,81s 6.72 6” 6,44s 6,45s 6,4¡s 2”’ 7,66.1 (9) 7,57.1 (9) 7,09 d (2) 3” 6,77 d (9) 6,77 d (9) 5”’ 6.77.1(9) 6,77.1(9) 6,70d(8) 6”’ 7,66.1 (9) 7,57 d (9) 7,07 dd (2;8) OH-5 13,09 a 13.01 OH-5” 12,97s 13,14s Anaentotiavona segun Markham & col. (¡95/>. %‘,3”>diOH-a,nentoflavona según Geiger & col. (1988). 279 6.1.1J2. ÁCIDO BARTRAMICO (Compuesto XII) (luteolina-(8,2’ ‘)-ácido protocatéquico) El Compuesto XII fue identificado como el Acido Bartrámico, y ya con anterioridad se conocía de Bartramia pomiformis (Seeger, 1992; Seeger & col., 1992b), en honor de cuya especie se denominó la luteolina-(8,2’‘)-ácido protocatéquico. En sí el Acido Bartrámico es un flavonoide un tanto especial, ya que posee por un lado el típico esqueleto monomérico de la flavona luteolina, pero tiene la particularidad de en posición C-8 portar un grupo ácido, y más concretamente el ácido protocatéquico. El compuesto resultante es un ácido con esqueleto de flavonoide, que generalizando, pertenece a los conocidos como ácidos flavonoidicos. Además del ácido bartrámico se conoce otro compuesto similar en Hypnum cupress¡forme (Sievers, 1992), que fue denominado como ácido hípnico. Trennheuser (1992) identificó el ácido protocatéquico en Anthoceros agrestis, por lo que no debe extrañarnos la presencia de éste ácido como un sustituyente más en la molécula de luteolina de ciertas especies de musgos. Exhibe unas características cromatográficas en TLC (Rf, absorción al ultravioleta) muy semejantes a las de la luteolina, ya que se observa a la luz ultravioleta con un color púrpura (violeta oscuro) que vira hacia la típica fluorescencia amarillo-anaranjada tras revelar la placa cromatográfica con NA (Markham & col., 1988). Su Rf es cambio, es sensiblemente diferente al de cualquier aglicona monoflavónica (flavonoide no glicosilado) o biflavónica, ya que sí presenta un desarrollo notable en el sistema acético-15% donde alcanza un Rf de 20, y en cambio en TEA no se mueve con el frente como hacen las agliconas, sino que llega únicamente a alcanzar un Rf de 63. En el sistema desarrollado en poliamida, a menudo aparece solapado con el Compuesto VIII, aunque en celulosa se separan. En ambos casos, la baja concentración en que se presenta hace complicada su identificación por TLC. Los resultados obtenidos mediante la aplicación de reactivos específicos tales como amoniaco, Benedict o NA, nos llevaron a concluir que el Compuesto XII debía poseer grupos o-diOH en 3’ ,4’ o bien en 4’ ,5’ y que poseía al menos un agrupamiento o-diOH que incluía 4’-OH, por lo que fácilmente debía tratarse de un compuesto relacionado con la luteolina, pero en ningún caso parecía tratarse de una biluteolina ni de la flavona en sí misma. Su retención cromatográfica, sobre todo en el sistema Z, (acético 15%/celulosa) con un PS de 20 podría ser indicativo de acuerdo a Seeger (1992) de la existencia de un ácido orgánico en la molécula. Analizando su espectro de ultravioleta, siguiendo a Markham (1982), observamos que en el espectro en NaOMe respecto del de MeOH se observa un efecto claramente batocrómico en la banda 1 de +58 (404 por 346 nm), lo que es indicativo de flavonas que poseen un hidroxilo libre en posición 4’ del anillo E (4’-OH). El espectro en NaOAc respecto al de metanol supone de nuevo un efecto batocrómico pero sólo en la banda II de + 13 nm (268/255), mientras que la banda 1 no se modifica. Estos datos son indicativos de la existencia de hidroxilo libre en posición 7 (7-OH) de una flavona. La adición de H3B03 al NaOAc supone un claro efecto ipsocrómico de -6 mn en la banda II y un efecto batocrómico de +25 mt en la banda 1. Estos hechos vienen a confirmar que se trata de una flavona con o-diOH en el anillo B, así como la inexistencia de un grupo 3-OH, es decir, que se trata de una flavona y no de un flavonol (Salm, 1992). El espectro en AId3 respecto del de 280 MeOH, supone un efecto batocrómico de +21 mt (276/255) en la banda II y de +83 nm (429-346) en la banda 1, lo que indica la existencia de un grupo hidroxilo libre en posición 5 del anillo A (5OH) que se confirma tras estudiar el nuevo espectro resultante de añadir CIH. En resumen, y de acuerdo a su espectro de ultravioleta, el Compuesto XII debía tratarse de un compuesto que posee un agrupamiento o-diOH en posición 3’ ,4’ del anillo B, y con hidroxilos libres en 5-OH y 7-OH, así como en 4’-OH. La flavona que se ajusta a estos datos es la luteolina, aunque como por Rf en TLC habíamos descartado que se tratara de la propia luteolina, debía tratarse de un compuesto muy cercano a ésta que con seguridad portara un grupo ácido causante de ese relativo alto Rf en acético 15% en celulosa, en comparación con la luteolina y las biluteolinas ya identificadas hasta ahora. El Espectro de Masas (FAB-EM) del Compuesto XII muestra unión [M ~H]*de 437 um, con una intensaseñal para M-44 (-CO2) típica de un ácido orgánico para 152 um. Estos datos nos hicieron pensar que el Compuesto XII fuese un monómero flavonoidico, derivado de la luteolina, que portara un grupo ácido en su molécula. 3C-RMN la asignación de las señales correspondientes a cada carbono se En el espectro de ‘ realizó mediante comparación directa con la bibliografía (Geiger & Bokel, 1989; Seeger, 1992) (ver Tabla 6. 12a al final de la discusión del compuesto). En total se detectaron 22 señales, y una de ellas, la señal a 167.7 ppm es típica del carbono carboxílico (-COOH) de los ácidos orgánicos (Seeger & col., 1992b), lo que vino a confirmar lo dicho anteriormente respecto a la existencia de un grupo ácido en la molécula. La señal a 182.0 ppm es debida al átomo de carbono correspondiente a una flavona (Agrawal, 1989), concretamente a C-4, cuya similitud con la señal correspondiente de la luteolina, indica de nuevo que el Compuesto XII debe ser un derivado de ésta. En los espectros de ‘3C-RMN de los 5,7-dihidroxiflavonoides (como la luteolina), las señales para C-6 y C-8 se encuentran siempre entre 90 y 100 ppm, con la señal para C-6 manifiesta en un nivel inferior (es decir a valores de ppm mayores) respecto de C-8 (Ósterdahl, 1983). Según lo anterior, dentro de dicho intervalo pudimos asignar la señal correspondiente al carbono C-6 a 98.4 ppm, pero a niveles de ppm más bajos no encontramos la correspondiente a C-8. La intensa señal a 104.8 ppm, que no aparece dividida, se asignó a C-8 en comparación directa con el espectro de la filonotisflavona. Esta señal correspondiente a C-8 es sensiblemente distinta respecto a la de la luteolina (93.8 ppm) pero similar a la de la filonotisflavona (103.5 ppm), por lo que dedujimos que el carbono C-S del Compuesto XII debía estar implicado, al igual que en la filonotisflavona (C-8”) en algún tipo de enlace. Por su espectro de masas renunciamos a la posibilidad de que el Compuesto XII fuese una biflavona o más concretamente una biluteolina (569 um), por lo que C-8 no tendría que estar implicado en ningún enlace de tipo interfiavonoidico, sino entre un monómero flavonoidico (luteolina) y posiblemente un ácido. Del resto de señales, tanto C-2, C-3, C-5, C-7, C-9, C-l0, C-1’, C-2’, C3’, C-4’, C-5’ y C-6’, se asignaron sin problemas a las correspondiente de la luteolina y la filonotisflavona (monómero derecho), lo que vino a confirmar la estructura “base” de luteolina del Compuesto XII, y la existenciade un único enlace en C-8 al igual que en la filonotisflavona. El resto de señales del espectro de ‘3C-RMN del Compuesto XII, sospechamos que se corresponderían a los carbonos de un ácido orgánico, que se encontraría como sustituyente en el carbono C-8 de una luteolina. Dado que restaban aún por asignar 7 señales correspondientes a otros tantos carbonos, dedujimos que dicho ácido podría corresponderse fácilmente con un derivado del benzoico (anillo 281 bencénico de 6 carbonos más 1 carbono del grupo COOH). Revisando la bibliografía al respecto, sobre este tipo de ácidos y aquellos que se habían identificado en brióf¡tos, encontramos una estructura denominada ácido protocatéquico que se ajustaba perfectamente a tales planteamientos. El ácido protocatéquico es un derivado del ácido benzoico con dos grupos hidroxilos en posición m- y p- respecto al grupo ácido (-COOH) y en posición o-diOH entre ellos (Fig. 6.16). Comparando el espectro de ‘3C-RMN del ácido protocatéquico con esas 7 señales restantes del Compuesto XII pudo llevarse a cabo la asignación de cada uno de los carbonos (Tabla 5.47). Sólamente la señal para C-2 del ácido protocatéquico no encontraba correspondencia con su respectiva en el Compuesto XII (C-2”), por lo que dedujimos que dicho C-2” debía ser el que intervenía en enlace entre el ácido y la luteolina. CQDH 4 E 2. 3 CM Fig. 6.16.: Acido Protocatéquico (C 7H6O,~» Si analizamos el espectro de ‘H-RMN (ver Tabla 6. 12b al final de la discusión del compuesto), observamos que las señales correspondientes a los protones H-3, 11-6, 11-2’, H-5’ y 11-6’ pueden asignarse sin problemas respecto de las correspondientes de la luteolina y la filonotisflavona (monómero derecho), lo que viene a confirmar de nuevo la estructa base de luteolina del Compuesto XU. Respecto a la señal que aparece sobre 13 ppm, a 12.98 ppm como un singlete, corresponde al protón del grupo hidroxilo libre situado en posición 5 de la luteolina, que establece un puente de hidrógeno con el oxígeno correspondiente en posición C-4. La ausencia de la señal correspondiente al protón 11-8 de la luteolina, al igual que3C-RMN, ocurre enque el C-8 monómero derechoen deunla enlace. filonotisflavona, está implicado Las otras indica en concordancia con el espectro de ‘ dos señales restantes a 6.88 y 7.39 ppm respectivamente, se asignaron de acuerdo al espectro de ‘11RMN del ácid¿ protocatéquico como 11-5” y 11-6”. La ausencia respecto al espectro de éste de la señal para 11-2” indica la existencia de un enlace en dicha posición. En resumen, podemos concluir que el Compuesto XII sería una luteolina que en posición 8 se une al carbono 2 (C-2”) del ac. protocatéquico, y cuya denominación es Iuteolina-(8,2”)-ácido protocatéquico. Esta estructura identificada ya por Seeger (1992) en la misma especie (Bariramia pomiformis. BP-8), se denominó en honor a ella como Acido Bartrámico, y su fórmula queda reflejada en la Fig. 6.17. Estas conclusiones concuerdan con la espectrometría de masas ya comentada. El Compuesto XII tiene un ión M~ de 438 um, que corresponde por un lado a la luteolina (C 15H1006) con 286 um (Mt y por otro al ácido protocatéquico <C7H604) con 154 um (Mi. Si sumamos ambas cifras le restamos W que se pierden como en 4 dey 438 um que 2corresponde al Compuesto XII.el enlace entre ambas moléculas tendremos el ión M 282 ji HO 5 OH HO HO OH OH O Fig. 6.17.: Acido Bartrámico (C~H14O10) (luteolina-8,2”-ácido protocatéquico) Tabla 6.lla.: Datos de ~C-RMNdel Compuesto XII. t (0 LSuU M Nat~ <# ltaot. 163,8 163.9 3/3” ¡02,1 106,4 t. 102.4 102.8 4/4” 182,0 181,1 181.1 ¡81,6 5/5” 159,7 161.1 160.3 161,4 6/6” 98,4 98,6 t. 98.3 1. 98.8 7/7” 161,7 163,7 ¡61,4 164.1 - 8/8” 104,8 93.Ot. 103,5 93.8 - 9/9” 154.3 157.2 154,3 157,2 - 10/10” 103,4 102,9 103.2 103,7 - ¡‘/1”’ 121,9 124.0 121.7 121,5 - 113.5 118.7 113,5i. 113.3 - ¡454 144,3 145.7 145,7 - 149.3 ¡48.3 149,4 149.6 ¡15,5 114,6t. 115.51. 116.0 118,4 120,Si. 118,9t. 118,9 - 1/1” • 123,3 - - . 121,7 2/2” * 120,6 - - - 115,1 3/3” • ¡43,8 - - - 144,8 4/4” * ¡48.7 - - - ¡49,9 5/5” • 113.6 . . - ¡¡6.5 6/6” * 122.1 . . - ¡21,8 COOH 167,7 - - - ¡67,2 • Ccw4wSq XII 2/2” 3/3”’ ¡63,6 166.5 1-itonOtlsuavona seglin tseiger & Bokel (198Y) Cd): monomero deftcno, Luws;i.na según Markham & ccl. (¡9821. * Rcso: .:ñtas eorrespondtcnte~, los carbonos del ~cido~rowca¡ñquico. 1. LOS carionos tercIarios fuer,’: úeu,rnsinados por el método DEPr. (1): mononlero ttquterdo. 283 - Tabla 6.12b.: Datos de ‘H-RMN del Compuesto XII. Frottin Comvneste XII 313” 656s flj~t¿Jfl 6,06s fl2~t¿Á4S Luteol? 662s 6.69s 6/6” 6.25s 575 d(2) 6,27s 818” — 6,07 d(2) — 6,98 d<2) - 702 .1(2) he. Protocatéou. - 6.22 d(2) - - 6,69 .1(8.5) 7,01 .1(8.5) 6 74 .1(9) 6 6 92 .1(8) 6.93 .1.1(9:2) 7,24 .1(8,5) 7,00.1.1(9:2) 7.44 .1.1(8:2) - OH-5/S” 12.98s 12,73s 13,Ols 13.OOs - 2 - - - 7,32 .1(2) 5/5” 6,88 .1(8.5) - - - 6 77 .1 8 6/6” 7.39 .1(8.5) - - - 7.27 dd(8:2) - hiloncustíavona ser¡n Geiger & Bokel (¡989), (.1): monénlero derecho, (1): monómero ¡iquierdo. ‘Luteolina según Geiger & ecl. (¡987). Resonancias correspondientes a los protones del ácido protoca¡équieo. 6.1.1.13. DIOSMETINA-7--O-TRIGLICOSIDO (Compuesto XIII) (Diosmet¡na-7-O-[2,4-di-O-(a-L.-ramno-piranosil)]-~-D-gIucopfranósido) La identificación del Compuesto XIII se llevó a cabo mediante métodos cromatográficos y cromatografía comparativa con patrón, así como mediante espectroscopia de Uy-vis, estableciendo las comparaciones correspondientes entre los datos obtenidos y los aportados anterionnente para este mismo compuesto en la bibliografía por Osterdahl (1978b y 1979a), quien lo aisló e identificó por primera vez en la especie Dicranum scopariwn. No se realizaron pruebas de EM o RMN por ser un estudio auxiliar para completar el espectro flavonoidico de Dicranum scopanum, con excepción y como ya se ha manifestado con anterioridad del nuevo compuesto identificado en la mencionada especie, la 5’,3”’-diOH-robustaflavona. Estas mismas consideraciones pueden aceptarse para los denominados sucesivamente Compuestos XIV y XV. Su movilidad cromatográfica, sobre todo su escaso desarrollo en la dimensión del TBA, indica la existencia de flavonoides glicosilados. De acuerdo a Markham (1982) y Mabry & col. (1970), la posición cromatográfica en TLC del Compuesto XIII, así como su espectro de UV se corresponden con los de flavonas glicosiladas. y más concretamente con él de la Diosmetina-7-O-triglicósido (Fig. 6.18). CH2OH OH OCH3 OH O HO HO OH Fig. 6.18.: Diosmetina-7-O-triglicósido. 284 6.1.1.14. APIGENINA-7-O-TRIGLICOSIDO (Compuesto XIV) (Apigenina-’7-O-[2,4-di-O-(a-L-ramnopiranosil)1-¡3-D-glucopiranósido) El Compuesto XIV, que identificamos como la Apigenina-7-O-triglicósido, fue aislado por primera vez por Nilsson & col. (1973) en la misma especie en que nosotros lo hemos hecho (Dicranun¡ scoparium), y posteriormente en la misma especie (Osterdahí, 1979a) y en Hvlocom¡um .splendens (Becker & col., 1986). Su movilidad cromatográfica sobre todo en la dimensión del IBA, su coloración mediante el uso de reactivos específicos hacia tonalidades amarillo-verdosas, así como su espectro de ultravioleta, son típicos de flavonas glicosiladas (Markham. 1982; Mabry & col., 1970) y más concretamente de la Apigenina-7-O-triglicósido (Becker & col., 1986). El espectro de ultravioleta en NaOMe muestra un típico efecto batocrómico en la banda 1 de +51 tun (384/334) respecto al del metanol, propio de flavonas con un hidroxilo libre en posición 4’-OH. El espectro en NaOAc refleja un ligero efecto batocrómico en la misma banda del espectro, ocasionado por la existencia de 7-OH libre. La adición de H 3B03 al anterior no modifica la absorbancia en ninguna de las dos bandas, indicando la inexistencia de o-diOH en el anillo E. El espectro en AId3 vuelve a mostrar un nuevo efecto batocrómico en la banda 1 del espectro, indicando la existencia de 5-OH libre en el anillo A, no existiendo modificación alguna en el espectro de CIH. Resumiendo, el Compuesto XIV ha de reunir 5,7 y 4’-OH así como carecer de o-diOH en el anillo B. A estas características se ajusta precisamente la apigenina (5,7,4’-triOH-flavona). Conociendo por los resultados de la TLC que ha de ser una apigenina glicosilada y sabiendo por la bibliografía que en Dicranum scoparium se había identificado con anterioridad la Apigenina-7-O-triglicósido, concluimos que el Compuesto XIV debe corresponderse con dicha flavona triglicosilada, cuya fórmula queda reflejada en la Fig. 6.19. 3 o 0 OH O 7 5 HO OH HO OH Fig. 6.19.: Apigenina-7-O-triglicósido. 285 6.1.1.15. LUTEOLINA-7-O-NEOHESPERIDOSIDO (Compuesto XV) [neohesperidósido= (2-O-a-L-ramnopiranosil)-0-D-glucopiranósido]. Esta flavona-O-diglicósido, también conocida como Iuteolina-7-O-ramnoglucósido, ya había sido aislada e identificada por primera vez en la misma especie estudiada por nosotros (Dicranum scoparium) por Nilsson & col. (1973) y posteriormente por Ósterdahl (1979a), así como en Hylocomium splendens (Becker, 1986; Becker & col., 1986), Hedwigia ciliata (Osterdahí, 1979 a y b) y Bqum pseudotriquetrum y 8. schleicheri (Stein, 1988b; Stein & Zinsmeister, 1991).). En su identificación se han seguido básicamente las mismas consideraciones metodológicas que se expusieron para el Compuesto XIII. En general, ésta se llevó a cabo mediante cromatografía comparativa con patrón en los diversos sistemas utilizados, así como con respecto a los datos presentados básicamente por Stein (1988b) Su movilidad cromatográfica, su coloración amarillo-verdosa a la luz ultravioleta tras el uso de reactivos específicos, así como su espectro de ultravioleta son típicos de flavonas diglicosiladas (Stein, 1988b; Markham, 1992; Mabry & col., 1970), e indican posiblemente que el Compuesto XV debe tratarse de un derivado de la luteolina sustituido en C-7 (Stein & Zinsmeister, 1990). Resumiento, podemos afirmar que el Compuesto XV es la Luteolina-7-O-neohesperidósido (Fig. 6.20.). De hecho, la identificación de dicho compuestd se corroboró mediante cromatografía comparativa con patrón por HPLC, utilizando una muestra patrón de Luteolina-7-O-neohesperidósido. al igual que se hizo para el Compuesto XIV. El espectro de masas, así mismo, muestra una señal de 595 um, típica de flavonas diglicosiladas (Stein, 1988b), que corrobora lo comentado anteriormente. -OH 2’ 3 ‘1~ Fig. 6.10.: Luteolina-7-O-neohesperidósido. 286 OH 6.1.1.16. ÁCIDOS FENOLICOS Y CUMARINAS El estudio de los ácidos fenólicos de musgos está adquiriendo cada día un mayor interés, como muestra la existencia de distintos trabajos al respecto (SaIm, 1994 en Fontinalis spp.; Davidson & col., 1989, etc.). En nuestro trabajo hemos querido poner de manifiesto su presencia en la especies estudiadas, aunque no hayamos profundizado en su identificación, La mayor parte de las especies estudiadas mediante ensayo por 2D-TLC pertenecientes a la familia Bartramiaceae, sintetizan ácidos fenólicos, cuya abundancia varía de unas especies a otras. Es particularmente interesante el contenido en ácidos fenólicos de las siguientes especies: Conostomum pusillum, Catoscopium nigrirum, Lejomela bartramioides, L. piligera, Anocolia intertexta, A. menziesii, Breutelia azorica, 8. dongata y Philonoris calcarea. La acción protectora de los ácidos fenólicos contra la depredación por herbívoros y su posible rol en las propiedades antibióticas de los musgos (Davidson & col., 1989; Harbome, 1988b; Banerjee & Sen, 1979) nos hace pensar en que habrán jugado, al igual que los flavonoides, un papel fundamental en la evolución de los musgos, tanto desde un punto de vista ecológico (competición con microorganismos del suelo) como de autodefensa contra agentes patógenos, principalmente virus y bacterias. Es por ello que estamos seguros que la química de tales ácidos fenólicos desempeñará un importante papel en la quimiosistemática y filogenia de los briófitos en un futuro no lejano, cuando el número de estudios realizados aumente lo suficiente. La única diferencia significativa en la composición en ácidos fenólicos de las especies estudiadas es el ácido clorogénico, sólo presente en la muestra de Rariramiapomiformis procedente de El Escorial (Madrid), identificado de acuerdo a Wagner & col. (1983). Se trata de un ácido fenólico glicosilado (Fig. 6.21), derivado del ácido cinámico, cuya función en las plantas con semilla parece estar relacionada con la regulación del crecimiento, sobre todo con la maduración de frutos (Barceló & col.. 1987). Ron & col. (1990) identificaron igualmente este ácido fenólico en 10 especies de musgos españoles, de ahí que no sea rara su presencia en Sariramia po,n<formis. Por su parte, la molécula precursora, el ácido cinámico, está relacionada con la biosíntesis de lignina y de los flavonoides. HO HO COOH Q CH—CH—CrO~7’~f HO OH —- Fig. 6.21.: Acido clorogénico 287 En cuanto a cumarinas, únicamente queremos mencionar que, las investigaciones acerca de este tipo de compuestos, muy relacionados con los flavonoides y ácidos fenólicos, están prácticamente iniciándose. Conocemos el trabajo de Jung (1993-94) quién identifica cumarinas en los musgos Tetraphis pellucida, Polytrichumformosum, P. alpinum, P. tenellum, P. juniperinum, 1’. commune, Atriclzum undutatum, Pogonatuni co¡nossum y P. urnigerum. Curiosamente, dichas especies se caracterizan por no sintetizar flavonoides (Anexo 1), por lo que las cumarinas podrían ser los compuestos que cumplieran las funciones a éstos encomendadas, aunque obviamente debe aún probarse. Unicamente hemos querido hacer mención a su reciente identificación y aislamiento en diversas especies de musgos, por lo importancia taxonómica, fisiológica y médica que pueda tener en un futuro próximo. 6.1.2. Flavonoides en Bartramiaceae Schwaegr. y Dicranaceae Schimp. 6.1.2.1. Distribución de flavonoides en Bartramiaceae Schwaegr. A continuación presentamos de forma tabulada (Tabla 6. 13), una recopilación realizada a partir de los resultados obtenidos mediante ensayo por cromatografía bidimensional en capa fina, que más tarde discutiremos. Estos se presentan, separando los géneros de la familia Bartramiaceae por sus respectivas subfamilias, de acuerdo a Griffin III & Buck (1989). Las secciones respectivas proceden de Engler (1924) para Conostomum, Corley & col. (1981) para Bartramia y, Griff¡n III & Buck (1989) para Breutelia y Phitonotis. Tabla 6.13.: Flavonoides en la familia Bartramzaceae. ¡ft L ¡ y”’ 1. Subfamilia Conostomoideae 1.1. Conostomum 1.1.1. SeccIón Clelstoorpldfrn. CcleLstccarpun, - - 4-4-+ - - + - - 4- - 4-4- 4-4-+ 1.1.2. SeccIón En-Con~tc.num (boreal. 4-4- (macrosheca ++ - 9 +4-+ 9 + + - + 9 2 - 4-4-+ - - C.peutast¡chum - - - C.pus¡IIum C.tetragonum +4- - 2 4- 2. Seabfamilia Bartramioideae 2.1. Bartranua 2.l.¡. Secd&i Bartnznl* B.haJler¡ana { +4-4- j 4-4- 1+4-4- 14- 4-4-44-4-4- J ++ ¡ 4-4- ¡ 288 - ¡+4j 4-4- ¡ ¡ 1- 1~ J4-4-4- TAXON 5 A Bpom’form~s 4+4 4-4- [4-4-4- Ir C J4+4- 4-4- OIt RT 14- MF + 14-4- 2.1.2. SeccIón Ithyphyllae 8 aIToLthyphy[la 4-4-i- BanguMuIoI’5 4-4-4- B.¡ihyphyhla 4-4- +4- 4- * 9 4-4-4- 4*4- 44- 4- +4-4 4-4- 4+ +4- +4- 4-44 BLongífolia 4- + - 1 - + 4- B.mathwesEi + - >1 - 4- 9 4-4-4- 4-4- 4-4- 4-4 - 4- 4-4- 4-4-4- 4-4- 4-4- 4- - + 4-4- - 7 4- - 4-4- 4- - 7 4-4- - - 4-4- 4-4-4- Bpap¡Ilaia - - Bpaiens + Bpolytrichoides Rpotodca 4-4 4-4- 4-4- 4-4- B.pru¡nata Brulescen, 4-4- 4-4- +4-4- 4-4- +4 + 4- - +4-4- +4-4- 4-4-4- +4- 4- 4-4-4- - 4-4-4- 4- 4-4-4- 4-4- 4-4-4- - - 4-4-4- - - - - - +44- + 1. bartramíoídes 4+ 9 + - +4-4- 4-4-4- LdeciduifoI~a 4-44- + 4- 4- - + 4-4-4- Ltopecií 4-4-4 4- 4- 4- +4- 4- 4-4-4- Lpul¡gera 4-4- 4- 9 4- - 4-4-4- 4+4- +4- 4-4- 4- 4- - 4- 4- 4-4-4- +4- 4-4- 4- - 4-44- 4-4- 4- 4-4-4- 8.ruwenzoriens¡s’ 4- Bvulcan¡ca 2.1.3. Sección Strictidiwn Bstr,cta - 2.2. Catoscoph¡m C nigc¡sum - - 2.3. Lejomela 2.4. Plagiepus Pteder,ana 4-4-4- 4-4- 3. Subfamilia Breutelloideae 3.1. Anacolja A.¡nsenenta AIaev¡sphaerr 4-4- 4- 4-4- + 9 4- Baríraniiarosea 4-4- +4- +4- 4- 4- 4- 4- 4-4- 4-4-4- 4-4-4- 4-4- + + - 4-4-4- 4-4- + 4-4- 4- 4-4- 7 4- +4+ 4-44- 4-4- + 4- - 4-4-4- Anieruieslí A.subsessilis + + A.webb¡i 3.2. Breutelia 3.2.1. Sección Acolcuas Ballionii - - 4- Bchrysea 1- Beugen’ae 289 ¡4-4- 4- 14- 4- [4-4-4- 7 rnpN B A O F Rl’ Integrí folia . 4- 7 H.subarcuata Binmeniosa 4- - +4- + - 4-4-4- 4- - 4- + 4- 3.2.2. Sección Aoacoliopsks Baifínis he 4-4- 7 Bunniecarpa ¡pendula DIII’ - 1+ ¡+4- 3.2.3. Sección Breuteil, B.arund¡n¡folia + Bausiro-arcuata 4- - + 4-4- 4- 4-4- 4- 4-4- 4-4- 4-4- + 7 4-4- ++ + + 7 4-4- 4-4- Bboliviensin Bchrysecoma 4- 7 Bdetlex¡folia + 7 4- 8d¡ffnacia 4- Bhun7bcrth’ Bpaiens - Bsquarrosa - 7 Bnthulrnanni 4- >‘ 4- - 4- 3.2.4. Sección Lycopodiobryiam - 1- - 4-4- 7 4- 4-4- - - 4- -, 4-4- - 4- 4-4- 7 4-4- >‘ - 4- + + + 4-4- ~: L 3.2.5. Sección Polvptichnun Blorenizil - - - 3.3. - 1:: 14¡ 4 4 - 14-4- 1. - J4-J4- Philonotis 3.3.’. SeccIón Catenularl. P,cabnifolia - - +4- - Wandína - + +4- 4- 4- 4- 4-4-4- Paustralis - 4- 4-4- 7 7 4- +4-4- P.caesputcna - +4- + + +4- 4-4- 4-4- Pualcarca’ + 4- + 4-4- +4-4- 4-4-4- Pcapiliar¡s + 4-4-4- 4- + + 4-4- P.tbntanr 4- 4-4-4- 4- 4- 4- 4-4- 4-4- PlancífoLia 4- +4- 7 ++ - 4-4- 4-4- Punarehica 4- + 4- 7 - 4- 4-4-4- Pinciana + - 7 7 - 4- 4-4-4- P turnentaria + +4- 7 + - 4- 4-4- 4- 4-4- + +4- - 4- 4-4- 3.3.2. Sección Euphilonfl 3.3.3. SeccIón Lelocarpus P.tjibodensis 290 - - Yflt~N WfP MP 3.3.4. SeccIón PbiIonotnoI PacueliL 4-4-4- 4- Pglaucescens 4-++ ++ Phastata 4-4- 4-4- P.beterc9hyLla 4- 4- Plax¡as¡ma 4-4- 4- Prevolula 4-4-4- 4- ¡‘rugida 4+4- Psecutda 4-4+ Psphaerncarpa’ 4-4-4- 4-4- 4- - - - Pthwajte,¡i 4-4- 4- 4-4- Piomentelta 4- 4- 4- 4- 7 +4- Pienuis Piuncitala - - + - 4-4- + - 4-4- - 4- +4- 4- 4- - 4-4- 4- - 4-4- 4-4- 4-4- - 4- 4- 4- - 4-4- +4- - 4+ + - 4 4- 4-4- - 4- 4- - - 4-4- > - 4- 4+ - 4- 4- - 4- 4- - B:ba,írantiaflavona A:artidrnóartramiaflavona D:23-dihidro-filocot¡uttavona F:f:tooseoflavona, C:dtcranolom:ea, RT:53>>-diOH-amentoflavooa y/o53>>-diOH-rntwraflavosa. DHF: otros dihidroflavonosdea. Ae.F: ácidos fendijeos, Fla,.: olios fisvonoides4- presencia. - ausencia, dato dudeno/tentativo. especit nteretsnte por poseer post’es nuevos compuestos. especicinteres ante por sintetizar posibles nuevos enacreciclos Concentración: 4-4-4- alta. 4-4- media, 4- baja (según intensidad de color en TLC). En todos los géneros investigados de la familia Bartramiaceae, y en la mayoría de sus especies, se detectó la presencia de flavonoides, por lo que podríamos afirmar, que la síntesis de compuestos fenólicos tipo flavonoide ocurre en la mayoría de las especies estudiadas en la familia. De los flavonoides identificados, casi todos ellos pertenecieron al tipo estructural de los biflavonoides, tiavonoides que parecen ser los que mayoritariamente sintetiza la familia. Markham (1988 y 1990) indica que se observa una tendencia ya sea a nivel de orden o familia, en el rango taxonómico elegido, a especializarse en la producción de un particular tipo de flavonoides (pe. flavonoles en Equisetales, flavonas en Lycopodiales e Isoetales y, biflavonas en Setaginellales y Psitophytales). Esta afirmación la basa principalmente en una diferente respuesta respecto a presiones selectivas que conducen a diferentes rutas biosintéticas. En este sentido, se considera que existe un avance en la evolución dependiendo del grado de elaboración de la ruta elegida. La presencia de ciertos tipos flavonoidicos de forma esporádica o en trazas, puede ser relíctica o indicar dicha presencia algún tipo de parentesco evolutivo. Todo ello concuerda en cierta manera con nuestros resultados, y con los que se disponen acerca de la familia, así como lo expuesto en el Anexo 1. Los biflavonoides, en este sentido, parecen ser el tipo de flavonoides en los que se ha especializado en sintetizar la familia Bartramiaceae, y la presencia de macrociclos bi y triflavonoidicos en ciertas especies de los géneros Anacolia, Bartramia y Plagiopus parece indicar la existenciade un elevado grado de parentesco entre estos tres taxones. Si pasamos a analizar ahora la composición flavonoidica de cada taxón, empezando por el mayor rango taxonómico considerado (subfamilia), vemos que no parece existir una diferencia significativa entre las tres subfamilias de Bartramiaceae. En todas ellas se sintetizan los biflavonoides , 291 típicos de la mayor parte de las especies de musgos, aunque eso si, se observa una tendencia a la reducción en la síntesis de biflavonoides en la subfamnilia Breutelioideae, considerada como la más evolucionada. A diferencia de Conostomoideae, tanto en Bartramioideae como en Breutelioideae se identificaron biflavonoides macrocíclicos. La subfamilia Conostomoideae, está compuesta por un único género (Conostomum) que se divide en dos secciones, cuya composición flavonoidica es sensiblemente distinta. La sección EuConostomum, de la que se estudiaron 5 especies, se caracteriza por la ausencia en ella de biflavonoides macrociclicos y filonotisflavona, mientras que la concentracción de 2,3-dihidrofilonotisflavona es relativamente alta en la mayoría de las especies, salvo en Conostomum pusiilum, que no sintetiza dicho biflavonoide pero sí es rica en ácidos fenólicos. Conosromum pentastic/-zum, a diferencia del resto de especies de la sección, sí sintetiza dicranolomina y 5’ .3’’‘-diOHamentoflavona/robustaflavona, siendo tambien rica en otros flavonoides. Por su parte, la sección Cleistocarpidium, sintetiza prácticamente los mismos biflavonoides que la sección anterior: alta concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona así como de otros flavonoides, pero no se identificaron ni dicranolomina ni 5’ 3” ‘-diON-amentoflavona/robustaflavona. Griffin III & Buck (1989) consideran al género Conostomum como el menos evolucionado de toda la familia, por tener rizoides lisos (Hirohama & Iwatsuki, 1980) y f¡lidios dispuestos en 5 filas, así como por otra serie de caracteres menores que ya se definieron en el apartado de antecedentes (pelos axilares tricelulares con célula basal coloreada). La composición biflavonoidica del género parece apoyar tales planteamientos, pues no existen flavonoides que supongan ciclación molecular ni otros tipos flavonoidicos definidos en subfamilias hipotéticamente más evolucionadas. En los TLCs realizados en las diversas especies de la familia Bartramiaceae se observaron, así mismo, en algunas especies ciertas manchas violetas que cambiaban a tonalidades amarillo-verdosas tras el uso de reactivos específicos. Este tipo de comportamiento y su Rf, son típicos de flavonas posiblemente glicosiladas. Son particularmente abundantes en las diversas especies del género Conostomum. De confirmarse en un futuro, sería la primera cita dentro de la familia Bartramiaceae de un flavonoide que no se correspondiera a la estructura de bi- o triflavonoide (excepción hecha del ácido bartrámico), y además vendría a apoyar la hipótesis de que el género Conostomum y la subfamilia Conostomoideae es la menos evolucionada de la familia Bartramiaceae, precisamente por sintetizar flavonas. En la subfamilia Bartramioideae, de la que se estudiaron 4 géneros, pueden, en primera instancia, separarse dos grupos bien definidos: de un lado los géneros que sintetizan flavonoides cíclicos (Bariramia y Ptagiopus) y de otro los que no (Catoscopium y Lejometa). En el género Bartransia se ha diferenciado la existencia de tres secciones, las cuales pueden separarse perfectamente de acuerdo a su composición flavonoidica: a) sección Jthyphyllae: sintetiza biflavonoides lineares y entre ellos la 5’-OH-amentoflavona, pero ningún otro tipo de flavonoides. La identificación de un dímero apigenina-luteolina en esta sección debe considerarse como un carácter de poca evolución, frente a las otras dos secciones que únicamente sintetizan biluteolinas, lo que supone la existencia de una hidroxilación más respecto a los dímeros apigenina-luteolina. No sintetiza biflavonoides macrocíclicos, ni ácidos flavonoidicos, y tampoco triflavonoides. Es rica de 2,3-dihidro-filonotisflavona y filonotisflavona. Unicamente B. pruinata y 8. polytrichoides parecen no sintetizar flavonoide alguno. Algunas especies sí sintetizan 292 otros dihidroflavonoides además de la 2,3-dihidro-filonotisflavona, caso de 8. angustifolia, 8. ithyphylla o B. afro-ithyphylla. La gran mayoría de sus especies sintetizan ácidos fenólicos. b) sección Bartramia: a la que pertenece 8. pomiformis, 8. halleriana y 8. mossmanniana entre otras, se caracteriza por la síntesis de macrociclos biflavonoidicos, triflavonoides lineares (triluteolinas) y ácidos flavonoidicos derivados de la luteolina. Sus especies sintetizan biflavonoides lineares pero únicamente biluteolinas (o dímeros con flavanona). La ciclación de sus biflavonoides respecto a la sección anterior podría tomarse como un paso evolutivo avanzado. Al igual que la sección anterior, supuestamente menos evolucionada, es rica en 2,3-dihidro-filonotisflavona, pero por regla general, no se identificó en las especies de esta sección ningún otro dihidroflavonoide. c) sección Strictidium: sintetiza biflavonoides lineares (biluteolinas o dimeros con flavonona), triflavonoides lineares y macrocíclicos. Que la ciclación de la molécula implique un monómero más se podría considerar como un paso evolutivo adelante. La ausencia en esta sección de ácidos flavonoidicos es difícil de comentar, pues exceptuando la sección anterior, sólo se conocen en Hypnaceae. Podría ser por ello una especialización de dicha sección Bartramia. A diferencia de las secciones anteriores, la concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona es baja. Tampoco sintetiza ningún otro dihidrobiflavonoide. En resumen, la composición flavonoidica del género Bartramia permite separar sin dificultad las tres secciones que lo componen, desde la aparentemente menos evolucionada Ithyphyllae (sin moléculas cíclicas) a las supuestamente más evolucionadas Bartramia (biflavonoides macrocíclicos) y Strictidium (triflavonoides macrocíclicos). Así mismo, de ello pueden obtenerse diversas consideraciones: 1. La ciclación molecular parece ser un paso evolutivo avanzado en la química flavonoidica del género. 2. La adición de un monómero a los compuestos biflavonoidicos, para la síntesis de triflavonoides, supondría, así mismo, un grado de mayor evolución. Lógicamente, la sección Strictidium que reune ambas consideraciones, podría ser considerada la más evolucionada del género. 3. Concentracciones relativamente altas de 2,3-dihidro-filonotisflavona, así como la existencia de otros dibidroflavonoides, sedan propios de las especies menos evolucionadas del género que, por lo general, pertenecen a la sección Ithyphyilae. El género Catoscopium. del que sólo se conoce una especie en el mundo (C. nigritum), perteneciente también a la flora ibérica, es rico en ácidos fenólicos y por lo general pobre en flavonoides. No se conoce en dicha especie la síntesis de biflavonoide alguno típico de musgos, ni siquiera de los del género anterior. Casas (1991) así como los autores de otras floras muscícolas europeas (Engler, 1924; Herzog; 1926; Augier, 1966), consideran que el género Catoscopium no pertenece a la familia Bartramiaceae sino a Ca¡oscopiaceae. Sin embargo, las investigaciones de Griffin III & Buck (1989)/vinieron a demostrar que los pelos axilares de Catoscopium eran típicos de la familia Bartraniiaceae y lo incluyeron dentro de ella, pasando a ser la familia Catoscopiaceae sinónima de esta última, como ya mucho antes había considerado Flowers (1935) y Lindberg (1879>. Incluso Griffin III & Buck (1989) afirmaban el parentesco existente entre este género y Plagiopus, ambos con filidios dispuestos en tres filas, por lo que decidieron incluirlo en la misma subfamilia 293 Bartramioideae. Sin embargo, la composición flavonoidica de Catoscopium nigritum es bastante distinta, ya no sólo a la mayoría de especies de la familia Bartranziaceae, sino en particular de la subfamilia Bartramioideae. Tanto en Plagiopus como en Bartrainia, género de la misma subfamilia que Catoscopiu¡n, se identificaron biflavonoides macrocíclicos así como otros biflavonoides de los que carece Catoscopium. Incluso en el género Leiomela, también de la misma subfamilia, aunque no se identificaron macrociclos, sí se detectó la presencia de otros biflavonoides derivados de la biluteolina. Por ello, creemos que se debe revisar de nuevo la ubicación del género Catoscopium dentro de la familia Bartramiaceae. A diferencia de Griffin III & Buck (1989), que estudiando sus pelos axilares lo incluyen dentro de la subfamilia Bartramioideae, creemos más adecuado, en base a su composición flavonoidica, crear dentro de la familia una subfamilia exclusiva del género que se denominaría subfamilia Catoscopioideae, que englobaría a una única especie (Catoscopium nigritum) caracterizada por no sintetizar biluteolinas. En cambio, su pertenencia a la familia Bartramiaceae la creemos del todo adecuada gracias a las conclusiones expuestas por los autores antes mencionados. El género Lejomela, no sintetiza macrociclos biflavonoidicos, pero en cambio sí 2,3-dihidrofilonotisflavona en alta concentracción. En todas sus especies, así mismo, se identificaron la filonotisflavona y la 5’,3”’-diOH-amentoflavona/robustaflavona, así como otros flavonoides. L. bartrainioides y L. piligera poseían además altas concentracciones de ácidos fenólicos. En conclusión, la no existencia de macrociclos y la alta concentracción de 2,3-dihidro-f¡lonotisflavona, nos permitiría considerar al género Lelomela como el menos evolucionado de la subfamilia Bartramioideae. Hirohama & Iwatsuki (1980) exponen el parecido que posee la ornamentación de los rizoides de Lejomela bartra,nioides con los de Bartramia ithyphylta. Tal parecido microscópico coincide con la composición flavonoidica, ya que ni Leiomela ni la sección Ithyphyllae del género Bartramia a la que pertenece 8. ithyphylta, sintetiza macrociclos. El parentesco evolutivo de Lelomela con Bartramia ithyphylla en base a su composición flavonoidica, nos permitiría concluir que se trata posiblemente del género menos evolucionado de la subfamilia, directamente emparentado con la sección Ithyphyllae del género Bartranua. En el género Plagiopus, del que sólo se investigó la especie ibérica P. oederiana, se detectó al igual que en Bartramia, la existencia de biflavonoides macrocíclicos (bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona), así como 2,3-dihidro-filonotisflavona, filonotisflavona, dicranolomina y 5’ ,3’ ‘-diOH-amentoflavona/robustaflavona. La no existenciade dihidroflavonoides en todo el género, así como las manifestaciones de Griffin III & Buck (1989) respecto a las relaciones de este género con Anacolia, ya que presenta fuertes afinidades en la ornarnentación de los rizoides con respecto a Anacotia sinensis (Hirohama & Iwatsuki, 1980), nos permitiría considerar que el género Plagiopus es posiblemente el más evolucionado de la subfamilia Bartramioideae. No obstante, de la misma manera que en Catoscopium, creemos conveniente realizar una revisión sobre la ubicación de este género en la familia, pues cabe la posibilidad de englobarlo dentro de la sección Banrainia del género Banramia, por la existencia de biflavonoides macrocíclicos. Griff¡n III & Buck (1989) consideran que el género Anacolia es el menos evolucionado de los que integran la subfamilia Breutelioideae, ya que tiene el aspecto típico del género Bartranzia desde un punto de vista morfológico, y además, su número cromosomático de n= 7,8 es considerado como un carácer plesiomórfico. Sin embargo, lo engloban en dicha subfamilia en base a la presencia 294 de ciertas innovaciones subflorales, de pelos axilares bicelulares, así como por su peculiar morfología de cápsula y esporas. Sin embargo, analizando la composición flavonoidica del género Anacolia, se demostró la síntesis de biflavonoides macrociclicos al igual que ocurre en el género Bartramia de la familia Bartramioideae. Hecho semejante ocurre en el género Plagiopus. De acuerdo a estos resultados, la acepción del género A naco/ja como el menos evolucionado de la subfamilia Rreutelioideae seria totalmente válida, ya que sintetiza macrociclos típicos de una subfamilia menos evolucionada (Barrramioideae). Bajo dichos fundamentos, la síntesis de biflavonoides macrociclicos en la familia Bartraniioideae debería considerarse como un carácter de menor evolución que tiende a perderse en la subfamilia más evolucionada de todas, sobre todo en los géneros supuestamente más evolucionados (Philonotis y Breutelia). Sin embargo, habíamos comentado con anterioridad, que la ciclación molecular en el género Bartramia había que considerarla como un paso evolutivo notable, ya que la sección más primitiva Ithyphyllae no sintetizaba flavonoides macrocíclicos, pero sí las secciones Bartra¡nia y Strictidium. Incluso afirmamos que la evolución de la ciclación molecular de los flavonoides de Bartramia, suponía que a medida que se consideraban especies más evolucionadas, dicha ciclación englobaba un mayor número de monómeros flavonoidicos. En resumen, resulta muy difícil, dentro de la sistemática actual de la familia Bartramiaceae, establecer si la presencia de macrociclos ha de considerarse como un paso atrás en la evolución, como así lo atestigua su ausencia en Breutelia. Más bien podríamos afirmar que la síntesis de macrociclos (bi y triflavonoides) es una especialización exclusiva y única en la subfamilia Bartramioideae del género Bartramia, y como tal debe considerarse tal carácter, sin otorgarle un significado filogenético definitivo. De las especies investigadas del género Anacolia, únicamente A. iaevisphaera y A. subsessilis sintetizaban bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona. Todo el género era rico en 2,3-dihidro- filonotisflavona (carácter hipotéticamente plesiomórfico) y en menor medida en filonotisflavona, dicranolomina y 5’,3”’-diOH-amentoflavona/robustaflavona. La mayoría de las especies sintetizaban ácidos fenólicos, siendo especialmente abundantes en A. intertexta y 4. menziesil. Anacolia laevisphaera posee una composición flavonoidica que incluye dos biflavonoides macrocíclicos (bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona). Atentiendo a tales resultados podríamos fácilmente pensar en la inclusión de este especie dentro de la sección Bartramia del género Bartramia, caracteriza por la síntesis de dichos macrociclos, o al menos dentro de la subfamilia Bartramioideae, junto a Bartramia y Plagiopus, géneros ambos que sintetizan macrociclos. Anacotia laevisphaera es según Flowers (1935), una especie con gran variabilidad en su crecimiento, así como en su tamaño y morfología de los filidios, lo que podría explicar en cierta forma sus relaciones con el género Bartramia, ante ciertas restricciones del medio que obligaran a dicha especie a especializarse en la síntesis de macrociclos. Cuando Flowers (1935) describió el género por primera vez, ya englobaba en él tanto Anacolia laevisphaera como A. subsessilis, lo que posteriormente fue confirmado por Van der Wijk & col. (1959). En base a todo lo anterior, queremos confirmar que la inclusión de ambas especies dentro del género Anacotia nos parece correcta, sobre todo por la existencia en ellas de ciertas especializaciones morfológicas (Engler, 1924; Goebel, 1930), de pelos axilares típicos de Breutelioideae (Griff¡n III, 1990), así como por la morfología de su espor¿fito (Griffin III & Buck, 1989). Sin embargo, dada la síntesis de biflavonoides macrocíclicos en ambas especies, creemos adecuada la creacción de una sección específica dentro del género Anacolia que englobe tanto a A. 295 laevisphaera como a A. subsessilis, que las separe del resto de especies del género, y emparente a éste directamente con la subfamilia Bartramiojdeae. Griffin III & Buck (1989) consideran que el género Breutelia es el más evolucionado de toda la familia así como de la subfamilia Breutelioideae, por su gran tamaño y por la presencia de caulidios a menudo divididos, con filidios aplicados y pelos axilares con células alares e intercalares. La ausencia de biflavonoides macrocíclicos confirmaría dichos postulados La 2 ,3-dihidro-f¡lonotisflavona es uno de los flavonoides mayormente identificados en la familia Bartramiaceae, que además nos - permite establecer ciertas diferencias dentro de las diversas secciones del género Breutelia. La sección Acoleus, de la que se estudiaron 8 especies, no sintetiza macrociclos y por lo general es pobre en 2,3dihidro-filonotisflavona excepto en 8. allionil y 8. chrysea, dicranolomina excepto en 8. pendula y 8. tomentosa, y carece de filonotisflavona. La mayoría poseen ácidos fenólicos, sobre todo 8. eugeniae y 8. pendula, y únicamente 8. eugeniae carece de flavonoide alguno. En la sección Anacoliopsis, a la que pertenece 8. affinis, la concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona es relativamente superior a la sección anterior, pero carece de dicranolomina. La sección Breutelia se caracteriza porque 8. chrysocoina, B. deflexifolia, 8. arundinifolia, 8. austro-arcuata, 8. dzffracta y 8. sthulmanni poseen 2,3-dihidro-filonotisflavona, pero en baja concentracción. Las seis especies sintetizan también 5’,3’ ‘-diOH-amentoflavona/robustaflavona y dicranolomina. El resto sólo ácido fenólicos y otros flavonoides. La cuarta sección, Lycopodiobryum, sintetiza dicranolomina en baja concentracción, pero en ninguna de sus especies se identificó 2,3-dihidro-filonotisflavona. Rica en ácidos fenólicos, sintetiza también 5’,3” ‘-diOR-amentoflavona/robustaflavona y otros flavonoides, pero no se identificó la filonotisflavona. La última sección, Polyptichium, se caracteriza al igual que la anterior, por no sintetizar 2,3-dihidro-filonotisflavona y sí dicranolomina y 5’,3”’-diOH- amentoflavona/robustaflavona, así como otros flavonoides, pero nunca filonotisflavona. La concentracción de ácidos fenólicos en esta sección es inferior a la de la anterior. Resumiendo, la concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavonaasí como la presencia/ausencia de dicranolomina, nos permite diferenciar la composición flavonoidica de cada una de las secciones del género Breutelia: 1. sección Acoleus: síntesis de 2,3-dihidro-filonotisflavona en pocas especies y en baja concentracción, y baja también de dicranolomina. 2. sección Anacoliopsis: concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona media (según intensidad de color en TLC) y no existe la síntesis de dicranolomina. 3. sección Breutelia: síntesis de 2,3-dihidro-filonotisflavona en casi todas las especies en baja concentracción, ocurriendo lo mismo con la dicranolomina. 4. sección Lycopodiobryum: no sintetiza 2,3-dihidro-filonotistlavonay sí dicranolomina en la mayoría de las especies pero en baja concentracción. 5. sección Polyptichium: idéntica a la anterior. De acuerdo a tales hechos, las secciones Lycopodiobryum y Polyptichium podrían considerarse como las más evolucionadas del género, por carecer de 2,3-dihidro-filonotisflavona, según los planteamientos ya expuestos con anterioridad. Algo similar a lo que ocurre en Breutelia se advierte en el último género que comentaremos, Philonotis. En la sección Catenularia del género Philonotis, existe en sus especies una alta 296 concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona, también de 5’ ,3”’-diOH-amentoflavona /robustaflavona, así como baja de ácidos fenólicos y otros flavonoides. La sección Euphilonotis, de la que se estudiaron 10 especies, presenta un comportamiento totalmente distinto: baja concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona, alta de filonotisflavona sobre todo en P. fontana y P. australis, síntesis de dicranolomina en baja concentracción, así como de 5’,3”’-diOH-amentoflavona /robustaflavona, y excepto P. calcarea el resto son pobres en ácidos fenólicos. En la sección Lejocarpus, a la que pertenece P. cjibodensis, al igual que la sección anterior, la concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona es baja. y también sintetiza filonotisflavona, dicranolomina y 5’,3”’- diOH-amentoflavona/robustaflavona aunque en bajas concentracciones. Finalmente, la sección Philonotula, posee una concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona superior a Catenularia, sobre todo en 1’. revoluta y P. sphaerocarpa, baja en filonotisflavona (a diferencia de Euphilonotis), dicranolomina en baja concentracción, y sintetizatambién 5’,3’ ‘-diOH-amentoflavona/robustaflavona pero no otros dihidrobiflavonoides. Al igual que en Breutelia, las secciones del género Philonotis pueden separarse entre sí en base a la concentracción en 2,3-dihidro-filonotisflavona, y a la ausencia/presencia de filonotisflavona. En resumen, la composición flavonoidica de la familia Sartraniiaceae viene a confirmar en parte la hipótesis filogenética que Griffln III & Buck (1989) establecieron para la familia (Fig. 6.22): la subfamnilia Conostomoideae podría ser la menos evolucionada, en un término medio y sintetizando biflavonoides macrocíclicos se encontraría la subfamilia Bartramioideae y, como la más evolucionada tendríamos a la subfarnilia Breutelioideae, en la cual la síntesis de macrociclos parece que tiende a perderse en los géneros más evolucionados (Breutelia), conservándose en los más primitivos (Anacolia). Sin embargo, el dendrograma que nosotros propondríamos como hipotético (Fig. 6.23), a diferencia del del Griffin III & Buck (1989), establece la existencia de una cuarta subfaniilia: Caroscopioideae, y se considera el género menos evolucionado de Bartramioideae a Leiomela. No obstante, aún quedan por investigar la composición flavonoidica de los géneros Quathlarnba, Fleischerobryum y Flowersia, por lo que tal dendrograma (Fig. 6.23) puede variar sustancialmente. Br,utelloldeae OusthIsmb. pt,IgonOIIS a., t rsmi. Bt.ut.Iba 1 - Pía gio p u. FI.Is eh.e obr yuni- Plow.rui. aartramio¡claae ConostonIuflS Conostomolcteaa Fig. 6.22.: Dendrograma que postula las interrelaciones filogenéticas en la familia Bartramiaeae según Griffin IR & Buck (1989), basindose en caracteres anatómicos, morfológicos y microscópicos. 297 - - Breutelioldeas PIagIOPUS Breutella PhIIonotis~: Bar t ram ¡ a Le Anac Olla a o ni e la — Bartramioideae Catoacopaum¿ \90n08 Catoscopioideae tomum. Conosttnnaidea@ Fig. 6.23.: Dendrograma hipotético que representaría las posibles relaciones filogenéticas existentes en Bartrandaceae de acuerdo a la composición flavonoidica. 6.1.2.2. Flavonoides y estatus taxonómico. En la revisión bibliográfica que acometimos como consecuencia de las investigaciones realizadas en la presente Memoria Doctoral, tuvimos conocimiento de la existencia de ciertos taxones “conflictivos, cuya ubicación dentro de la sistemática de la familia Barrramiaceae era confusa. En un intento, de una parte, de poder a través de la composición flavonoidica resolver tales problemas de índole taxonómico, y de otro, de corroborar ciertas hipótesis previamente establecidas a partir de otro tipo de estudios (anatómicos, morfológicos, etc.), iniciamos nuestro trabajo. En cualquier caso, nuestro interés en estos taxones conflictivos, ha sido básicamente comprobar si las apreciaciones que alcanzaban otros autores podrían paralelamente aceptarse mediante el estudio de la composición flavonoidica de dichos taxones. En caso afirmativo, nuestras investigaciones viniero a apoyar y corroborar las apreciaciones de dichos autores procedentes de investigaciones distintas, y en caso contrario, permitieron abrir una línea de debate sobre la ubicación de dichos taxones en la sistemática de la familia, de sus subfamilias o géneros. A. Bartramia rosea Herzog. En 1909, Herzog describió una especie muy peculiar de la flora andina de la familia Bartramiaceae, que denominó Banramia rosea. El color de la planta y particularmente sus fihidios, teñidos con tonalidades que variaban desde el rosa pálido hasta el rojo, e incluso en ocasiones rojo anaranjazado, hizo que dicho autor describiera esta especie como nueva para la ciencia. En particular, 298 Herzog (1909) incluyó Bartramia rosea dentro de la sección Strictidium del género Bartramia, a la cual pertenece entre otras la especie ibérica Bortramia stricta. El color de los filidios, y en menor medida el del caulido, era la base que dicho autor sustentaba para su identificación. Tras el material originalmente recolectado por Herzog en Bolivia, se llevaron a cabo otras recolecciones en Ecuador, Colombia y Venezuela (Griffin III, 1990) que pusieron de manifiesto que el hábitat más frecuente de esta especie eran los páramos, donde a menudo quedaba restringida su distribución. Este tipo de consideraciones de índole taxonómico que Herzog empleó a principio de siglo, han de verse desde otra perspectiva, como lógicamente sustenta Griffxn III (1990). De hecho, y exceptuando la coloración, tanto la morfología del vegetal, el hábitat, el detalle de los filidios incluyendo la forma, el margen y la areolación, son similares a los de otro taxón de mayor amplitud geográfica en la región montano-tropical, concretamente la especie Anocolia Iaevisphoero (Tayl.) Hower. En 1990, intentando solucionar esta posible sinonimia, Griffin III llevó a cabo un estudio de los pelos axilares de ambas especies, separándolas, de acuerdo a Herzog (1909), por su coloración. Los pelos axilares de Anacolio son significativamente distintos a los del género Bortramio, ya que consisten únicamente en dos células, la basal muy corta y pigmentada y la apical globosa, inflada y hialina. El examen que realizó de la especie definida por Herzog como Boriromio roseo, demostró que ésta poseía pelos axilares que se ajustaban perfectamente al tipo “Anocotio”. La conclusión que dedujo finalmente de sus investigaciones fue, que muy posiblemente Bartromio roseo era únicamente una variante de color de Anacolia toevisphoera, aunque ya expuso que para poder reafirmar tal hipótesis en su justa medida serían necesarias nuevas recolecciones así como nuevas investigaciones acerca del tipo de pelo axilar que presentaban. Tomando como referencia las apreciaciones de Griffin III (1990) iniciamos un estudio acerca de la composición flavonoidica de las dos especies nombradas, con el fin de comprobar si dichos planteamientos podrían ser ciertos. Anacolia laevisphaera es, dentro del género Anacotia, una de las especies que se caracteriza por tener un componente biflavonoidico más complejo. A diferencia de tres especies del mismo género investigadas (A. menziesii, A. webbii, A. intertexta), y al igual que A. subsessilis, A. Ioevisphoero se caracteriza por sintetizar biflavonoides macrocíclicos del tipo bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona, típicos en la sección Bartramio del género Bartramio. A. subsessilis por su parte únicamente sintetiza bartramiaflavona. El resto de biflavonoides (2,3dihidro-filonotisflavona, filonotisflavona, dicranolomina, 5’ ,3’ ‘-diOH-amentoflavona, 5’ ,3” ‘-diOHrobustaflavona) son sintetizados en cambio por las cinco especies de Anacotio referidas. Analizando la composición biflavonoica de Borrramia roseo se puso de manifiesto que esta “presunta’ especie sintetizaba exactamente los mismos biflavonoides que Anocolia laevisphoero, incluyendo ambos macrociclos (bartramiaflavona y anhidrobartramiaflavona). En el género Bariromio, la síntesis de biflavonoides macrocíclicos es exclusiva de la sección Boriromia, a la que pertenecen dos de las especies estudiadas en esta Memoria Doctoral (B. ha//enano y 8. pomiformis). Si como afirmaba Herzog (1909). Bontramio rosea se incluía dentro de la sección Strictidium, dicha especie no podría llevar a cabo la síntesis de biflavonoides macrocíclicos que no son propios de dicha sección, por lo que difícilmente dicha especie podría pertenecer realmente al género Bortromio y menos a la sección Stnictidium. Basándonos finalmente en la composición flavonoidica de Bontramia roseo, idéntica a la de 299 sintetizar 2,3-dihidro-filonotisflavona, y sólo 8. pendida y B. tomentosa sintetizan dicranolomina, así como por tener altas concentracciones de ácidos fenólicos y otros flavonoides. Las dos especies de la sección LycopodioNyum estudiadas, 8. e/ongata y 8. azorica tiene una composición idéntica entre ellas y respecto a 8. pendula y B. tomentoso, pero difieren sensiblemente respecto al resto de especies de Acoteus. A su vez, Hirohama & lwatsuki (1980) establecían las grandes semejanzas existentes en la morfología de los rizoides de 8. pendulo y 13. elongoto, que en ambas especies eran del tipo papiloso. En conclusión, las dos especies de la sección Lycopodiobryum investigadas, B. azorica y B. e/ongata, están íntimamente emparentadas con dos especies de la sección Acoteus, 8. pendido y 8. tomentosa, pero no con el resto. Tal parentesco podría apoyar la hipótesis de Griffin III & Buck (1989) de transferir 8. elongata a la sección Acoleus, aunque creemos más conveniente de acuerdo a su composición flavonoidica, mantener la sección Lycopodiobryum y trasferir 8. pendida y 8. tomentosa de la sección Acoleus a Lycopodiobryum. D. Bartramia ruwenzoriensis Broth. La especie Bartromio ruwenzoriensis fue incluida por Engler (1924), por primera vez, dentro de la sección Ithyphytloe del género Bortromia, junto a 8. ithyphyllo, por tratarse ambas de especies sinoicas (monoicas con anteridios y arquegonios protegidos por un mismo involucro), y no monoicas autoicas (con involucro distinto) como las especies de la sección Bortramia (Eu-Bortramio). Posteriormente no se ha utilizado la especie en ningún otro tipo de estudio taxonómico, lo que ha permitido su pertenencia a la misma sección que consideró Engler (1924). Sin embargo, como consecuencia del ensayo por TLC que realizamos en dicha especie, se puso de manifiesto que su composición flavonoidica era la siguiente: poseía una alta concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona, así como también relativamente altas de filonotisflavona y dicranolomina, y en menor medida de 5’,3” ‘-diOH-amentoflavona/robustaflavona. Carecía de ácidos fenólicos pero en cambio sintetizaba otros dihidroflavonoides así como un biflavonoide macrociclico, la bartramiaflavona, en baja concentracción. La existenciade macrociclos bitiavonoidicos en el género Bartramio, parece ser exclusiva de su sección Bortramia del género, mientras que en la sección Ithyphy/lae no se conoce por el momento ninguna especie que los sintetize. Este carácter lo utilizamos además en su momento, como signo de distinción entre ambas secciones. La alta concentracción de 2,3-dihidro-filonotisflavona, y la síntesis de otros dihidroflavonoides emparentan a esta especie con la sección posiblemente menos evolucionada Ithyphyllae. En conclusión creeríamos adecuado transferir la especie Bortromio ruwenzoriensis de la sección Ithyphy/loe a la sección Bartramia del género Bortromio, en base a que parece ser capaz de sintetizar bartramiaflavona. La existencia una alta concentracción de dihidroflavonoides, y especialmente de 2,3-dihidro-filonotisflavona, nos hacen considerarla posiblemente como una de las especies menos evolucionadas de la sección, y directamente emparentada con la sección Ithyphylloe. Creemos, sin embargo, que seria adecuado una revisión profunda acerca de otros aspectos morfológicos, anatómicos y microscópicos, que pudieran confirmar la hipótesis alcanzada en base a la composición flavonoidica. 301 6.1.2.3. Flavonoides en Dicranaceae Scbinip. Dicranoloma robustum y JUcrano/oma bi//ardieri fueron trasferidos al género Dicranum por Norris & Koponen (1989). Dada la compleja composición flavonoidica de estas especies (Markham & col., 1988), decidimos reinvestigar el patrón flavonoidico de Dicranum scoparium, identificando además de 1a5’,3”’-dihidroxi-amentoflavona una nueva biflavona, 1a5’,3”’-dihidroxi-robustaflavona. Estas dos biflavonas presentes en Dicranum scoparium también habían sido identificadas en las dos especies de Dicranoloma citadas. No obstante, en Dicranoloma spp. se identificaron además otras biluteolinas 2’-unidas que no lo fueron en cambio en Dicranum scoparíum. Esta significativa diferencia en la composición biflavonoidica entre Dicranum y Dicranoloma es de gran ayuda desde un punto de vista taxonómico, ya que sugiere que lo expuesto por Norris & Koponen (1989) no es del todo correcto, y por lo tanto, consideraríamos que Dicranoloma debe permanecer como un género a parte de Dicranum. No obstante, debemos admitir que existen problemas taxonómicos con el grupo Dicranum-Dicranoloma, que deben reflejarse en una revisión taxonómica concienzuda desde diversos puntos de vista, y entre ellos el fitoquimico. 6.1.2.4. Variación fenológica de la composición flavonoidica. En referencia a los flavonoides existentes en el espor¿fito, ya iniciamos un estudio preliminar (López-Sáez, 1992) en el cual se advirtió una variación cualitativa y posiblemente cuantitativa (por la concentracción de las manchas en TLC) respecto de los existentes en el gamet¿fito, en diferentes especies de briófitos de la familia Bar:ramiaceae, concretamente en Bartramia ithyphyl/a y 8. pomíformis, datos que concordaban con lo hasta entonces expuesto por Markham & col. (1978) y Seeger (1992). Esta diferente composición flavonoidica parece ir directamente relacionada con la fenología del musgo en cuestión, y más concretamente entre las generaciones gamet¿fito y espordfito. El problema con que contamos,en la mayor parte de los casos fue la imposibilidad de obtener material vegetal suficiente para acometer con garantías el estudio de la composición flavonoidica del espor¿fito de las especies del género Bartramia investigadas. Por norma general, apenas se recolectaron 1-2 g de espor¿fito por 250 g de gametdfito, lo cual dificultó el trabajo y lo redujo a un mero ensayo por TLC acerca de su patrón flavonoidico, sin poder emprender una analítica exhaustiva. Como antecedentes bibliográficos tenemos los trabajos de Markham & col. (1978), quienes ponen de manifiesto el cambio ‘drástico’ que se produce en la composición flavonoidica de la hepática Marchantia berteroana acompañando al proceso de reproducción sexual. Posteriormente, Seeger (1992) lleva a cabo un estudio de la composición biflavonoidica del musgo Rliytidiadelphus squarrosus, poniendo de manifiesto en él la variación que sufre la concentracción del biflavonoide S’-OH-robustaflavona a lo largo del año, encontrando la concentracción máxima durante los meses de abril y junio, y la mínima en noviembre. Tales diferencias las atribuye igualmente al proceso fenológico que sigue el musgo y a la aparición de la generación espor6fito y de la reproducción 302 sexual. Todos estos datos de la literatura vienen a confirmar que la composición flavonoidica de las generaciones esporofítica y gametofítica en briófitos es sensiblemente distinta, al menos cuantitativamente. En las especies que estudiamos con anterioridad (López-Sáez, 1992) se advirtió que tanto en Bartramia ithyphyl/a como en 8. pom(formis, la composición flavonoidica del gametófito era sensiblemente diferente de la del esporófito. De hecho, en el esporofito de ambas especies, apenas pudo llegar a identificarse con seguridad la presencia de algún flavonoide, por lo que hemos excluido estas especies de la presente Memoria Doctoral. En Dicranum scoparium se advirtió en cambio, una notable diferencia cualitativa en la composición flavonoidica de esporófito y gametófito. El ejemplo más claro es el compuesto que - denominamos DSe, exclusivo de la generación esporofitica y, que como ya se comentó con anterioridad parece tratarse de un 2,3-dihidro-biflavonoide, seguramente relacionado con la dicránolomina. El patrón en TLC del esporófito resultó ser además bastante más complejo, sobre todo en el sistema desarrollado en poliamida-6, donde además de diversas flavonas glicosiladas, así como de la 5’, 3” ‘-diOH-amentoflavona y 5’,3’ ‘-diOH-robustaflavona, pudieron detectarse otros flavonoides con la típica absorción al ultravioleta (púrpura oscuro) e idéntica respuesta al NA (color amarillo) que el resto de flavonoides. Así mismo, y sólo en el esporófito se detectó la presencia de un flavonoide de alto Rf que no cambiaba de color tras utilizar NA, por lo que posiblemente se tratara de una molécula macrocíclica. La TLC del esporófito de Dicranum scoparrum se compí-ica aún más por la existencia de numerosas manchas azuladas y grisáceas, correspondientes a diversos compuestos fenólicos de naturaleza no flavonoidica, de los que carece el gametófito. En Bartramia stricta la situación era totalmente distinta a la especie anterior, ya que mientras en el sistema desarrollado en poliamida de muestras gametofiticas, se identificaban los compuestos BS-1 a BS-8, en las esporofíticas sólo se hacía con los compuestos BS-2 a BS-7. La ausencia del Compuesto BS-1 en el esporófito puede interpretarse como una isomerización hacia Ciclo-Triluteolina, pero no hay explicación válida que no sea la fenologia para explicar la ausencia del Compuesto BS-8. En las TLCs desarrolladas en celulosa la situación era similar. En el gametófito se identificaban los compuestos BS-1 a BS-7 mientras que en el esporófito sólo BS-2, BS-6 y BS-7. Eso sí, la riqueza en ácidos fenólicos del esporófito era muy superior a la del gametófito. En conclusión, podemos afirmar que la composición flavonoidica de las generaciones esporofitica y gametofítica en musgos alberga sensibles diferencias, básicamente cuantitativas aunque también cualitativas. No se puede decir a ciencia cierta si una u otra generación se caracterizan por sintetizar determinados flavonoides o no, ya que depende en muchos casos de la especie que se esté investigando. Así, en Dicranum scoparium la composición flavonoidica del esporófito es mucho más compleja que la del gametófito, sintetizando incluso flavonoides de la que esta última carece. En Bartramja strjcta en cambio, es el gametófito el que posee una composición flavonoidica más compleja mientras que el esporófito posee siempre los mismos flavonoides que el gametófito con ausencia de alguno de ellos. Esta última situación parece ser la que se repite generalmente en las especies de la familia Bartramiaceae. En cualquier caso, la única generalización válida, es que la generación esporofítica es siempre muchísimo más rica que la gametofítica en otros compuestos fenólicos no flavonoidicos, principalmente en ácidos fenólicos. ‘ 303 6.1.23. Variación de la composición flavonoidica según la localización geográfica. Una primera aproximación, a la posible existencia de variaciones en la composición flavonoidica de las especies de la familia Bartramiaceae de acuerdo a su procedencia fue la que se obtuvo mediante los 79 ensayos por TLC que realizamos de diversas especies de la familia. En dichos ensayos, ya se manifestó que las principales diferencias eran de tipo cuantitativo y no cualitativo, por lo que decidimos en dicho caso, presentar únicamente una TLC por cada especie y sistema cromatográfico, que podría sin problemas generalizarse para cualquiera de las localidades de procedencia de la especie en cuestión. En un trabajo preliminar que concluyó con la Memoria de Licenciatura (López-Sáez, 1992) ya llegamos a las mismas conclusiones anteriores, estudiando diversas muestras poblacionales de Bartramia ha//enana, 8. ithyphylla y B. strtcta. Respecto a las distintas muestras de Bartramiapomiformis utilizadas, no se pudieron atestiguar diferencias significativas en el patrón cromatográfico de cada una de ellas (ver Tabla 5.2.). Se puede afirmar por ello, que la composición flavonoidica de la especie, sea cual sea su localización geográfica, es más o menos constante cualitativamente. La única diferencia observable es la ausencia de bartramiaflavona en la muestra procedente de El Atazar, quizás debido a la baja concentración de dicho compuesto más que a una ausencia real. Igual puede afirmarse de la ausencia de anhidrobartramiaflavona en la muestra de Canencia. En la muestra de Ordesa faltan BP-7 y BP-8, aunque tales diferencias cualitativas, al igual que en los casos anteriores, deben proceder de la baja concentracción de tales compuestos en la especie, como se demostró por HPLC. La única diferencia cualitativa sustancial observada es la referente a la identificación del ácido clorogénico exclusivamente en la muestra procedente de El Escorial, ya que esta muestra se recolecto en invierno, precisamente en el momento en que se estaba produciendo la elongación de la seta y los espordfitos aún inmaduros (ricos en ácidos fenólicos) eran numerosísimos. Las diferencias cuantitativas en cambio, si parecen albergar algún resultado positivo en el sentido de que existan diferencias geográficas. Siegel & col. (1989) ofrecen una estimación cuantitativa, de la composición flavonoidica referente a 16 compuestos distintos, para 17 muestras de Biyum capillare procedentes de localidades diferentes. Al igual que nuestros resultados, no encuentran diferencias cualitativas notables, pues esos 16 flavonoides se encuentran identificados en las 17 muestras de distinta procedencia. Por contra, si advierten diferencias cuantitativas respecto a algunos de tales compuestos. A las mismas conclusiones llegan Freitag & col. (1986) para P/agtomnium affine, no observando diferencia cualitativa alguna en el patrón cromatográfico de la especie, sea cual sea la localización geográfica de la muestra o la estación climatológica de recogida. En cambio, Stein & Zinsmeister (1991), sí advierten diferencias en el patrón flavonoidico de tres especies deBryaceae (Bryum caespiticumHedw., Bryumpseudotriquetrum (I-ledw.) Turn., y Bryum pallescens Scheleich.ex Schwaegr.) para diferentes hábitats, observables incluso en los cromatogramas realizados a partir de muestras procedentes de distintas localidades. Markham & col. (1976) admiten igualmente la existencia de razas geográficas en el patrón flavonoidico de la hepática Conocephatum conicum (L.) Underw. En Bartramia stricta, los resultados que muestra la Tabla 5.3 coinciden con lo expuesto para 304 Bartramia pomíformis, no existiendo básicamente diferencia cualitativa alguna. Unicamente está ausente el compuesto BS-7 en la muestra de Picadas. E] compuesto BS-1 en cambio sólo aparece en la muestra procedente de Villa del Prado. Al tratarse de un posible isómero de la Ciclo-Triluteolina, no es difícil suponer que a menudo se isomerize hacia ésta y por ello sea difícil su identificación, por lo que suponemos que es lo que ocurre con más frecuencia. En resumen, en las especies ibéricas del género Bartramia, y generalizando, en la familia Bartramiaceae, la composición flavonoidica no varía sustancialmente desde un punto de vista cualitativo, aunque sí pueden albergarse sensibles diferencias cuantitativas en muestras procedentes de distintas localidades. 6.2.ACTIVIDAD BIOLOGICA. Basándonos en los resultados previos de Iwu (1986) y McCleary & Walkington (1966), y dada la posibilidad de ensayar los flavonoides aislados en la presente Memoria Doctoral frente al virus del SIDA, acometimos los ensayos de actividad biológica en este sentido. De las 15 muestras flavonoidicas ensayadas, ninguna de ellas pareció teneruna fuerte actividad supresiva de la replicación del VIH. En referencia a la concentración de droga, se observa que con los compuestos 1, 2 y 6 a medida que aquella aumenta en los cultivos infectados, el porcentaje medio de p24 aumenta, es decir existe un aparente aumento del antígeno en los cultivos tratados con la droga frente a los cultivos control. Estos hechos podrían considerarse como un aumento de la replicación viral con la adicción de concentraciones superiores de droga, cuya causa no podemos determinar. Las drogas 2 y 6 son ambas 5’,3”’-diOH-biflavonoides (de robustaflavona y amentoflavona respectivamente), por lo que podríamos considerar que este tipo de biflavonoides tan hidroxilados no son nada efectivos en la terapia contra el SIDA (ver Tabla 5.56 Pp. 218-219). En el resto de drogas, de manera general, se produce un disminución del porcentaje medio de p24 a medida que aumenta la concentración de droga, lo que parece indicar que existe, en todos los casos, una disminución de la replicación viral, reflejada en una menor producción del antígeno p24 a medida que aumenta la concentración de droga en los cultivos (ver Tabla 5.56 Pp. 218-219). Con la droga 8 (amentoflavona) se observa la misma tendencia que acabamos de comentar. Sin embargo, aún con la concentración más alta (20 gM) no se alcanza un promedio de p24 que pueda incluirse dentro de alguno de los niveles de efectividad de la droga considerados, ya que el valor más pequeño alcanzado es de 77 y los límites para una menor efectividad (expresado como ~) están entre 50-69 % (ver Tabla 5.56 Pp. 218). Con la droga 5 (bartramiaflavona) ocurre un hecho contrario al anterior. A una concentración de 100 MM el % p24 es de -10 (efectividad máxima ***), pero la droga a dicha concentración es tóxica, ya que el promedio de células de los cultivos no infectados que sobreviven al ser tratados con este compuesto es inferior al 70% (ver Tabla 5.56 Pp. 218). Sin embargo, a una concentración no tóxica (20 MM) la droga no es en absoluto eficaz. .305 En base a todo lo anterior, desechamos las drogas 1, 2 y 6 (no producen disminución alguna de la replicación viral). 8 (su efectividad anti-VII-I es prácticamente nula a concentraciones no tóxicas) y 5 (sólo es efectiva a concentraciones tóxicas) como válidas para la quimioterapia frente al SIDA, por lo que no las incluimos en la Tabla 5.55 (Pp. 217). En el caso de la droga 5 (bartramiaflavona) debemos hacer sin embargo una salvedad, ya que no conocemos cual es su efectividad ni su toxicidad en concentraciones intermedias entre 20 y 100 gM. El valor de efectividad conseguido a estas concentraciones, si resultaran no tóxicas, podría ser el mismo o inferior que el obtenido a 100 MM. La bartramiaflavona (droga 5) es un biflavonoide macrocíclico mientras que la droga 7 (ciclotriluteolina) es un triflavonoide cíclico. En ambos casos, se trata de macrociclos, por lo que en principio podríamos pensar que su actividad anti-VIH debía ser parecida. Con la droga 7 (ciclotriluteolina) se consigue un nivel de efectividad * a una concentración 20 gM, pero no conocemos cual es su efectividad a concentraciones superiores. Por ello, podríamos pensar, que al igual que con la droga 7, la droga 5 sí podría ser efectiva a concentraciones inferiores a 100 MM sin ser tóxica. En las drogas 3 (dicranolomina), 4 (2,3-dihidro-filonotisflavona) y 7 (Ciclo-Triluteolina), el nivel de efectividad de droga máximo alcanzado es de * y siempre a una concentración de 20 pM, y en todos los casos sin ser tóxicas. Sin embargo, en las tres drogas, el valor de CC50 (concentración citotóxica) es relativamente bajo, ya que por encima de 20 vg/ml son todas tóxicas inhibiendo el 50% del crecimiento de las células que no había sido previamente infectadas por VIH en cultivos controles. Su EC50 es en cambio bastante alto, sobre todo en la droga 3, y en los tres casos entra dentro de los valores de toxicidad de dichas drogas. Es decir, sólo inhibirían el 50% de la replicación viral a concentraciones tóxicas. En base a ello, su índice terapéutico es muy pequeño, ya que a concentraciones relativamente altas (20 MM) son poco efectivas y algo más altas son tóxicas. La droga 9 (saponarina) que es una apigenina-O/C-diglicosilada tiene un índice de efectividad medio (expresado como **) a una concentración 100 gM, mientras que con 20 gM no es nada efectiva. Su CC50 es relativamente alta y superior a 100 ng/ml, mientras que su EC50 es de 80 vg/ml. En base a ello, inhibiría un 50% de la replicación de! virus a concentraciones no tóxicas. Su índice terapeútico en este caso es superior a 1.3, y por ello relativamente bajo, ya que aunque es capaz de inhibir el 50% de la replicación viral a concentraciones no tóxicas, éstas son lo suficientemente grandes como para que la droga no tenga un índice terapeútico alto. Sólo sería efectiva a concentraciones relativamente altas, por lo general cercanas a 100 MM, por lo que no es recomendable en la terapia contra el VIH. Las drogas 10 (quercetina) y 15 (eriodictiol) alcanzan un nivel de efectividad ** a concentraciones no tóxicas de 4 gM y 0.8 gM respectivamente. Por encima de dichas concentraciones, ambas drogas tienen un indice de efectividad *** pero son tóxicas (ver Tabla 5.55 Pp. 374-375). La droga 10 (quercetina) es sólo efectiva sin ser tóxica a concentraciones bajas. Su CC50 se sitúa precisamente a una concentración de 20 MM, relativamente baja, pero por contra, su EC50 es también muy bajo. Es decir, es capaz de inhibir un 50% de la replicación viral a concentraciones relativamente bajas (2 pg/ml = EC5Q), a las cuales también es tóxica (20 gg/ml = CC50). Esta combinación de ambos factores da lugar a un índice terapeútico de 10, que es el mayor que hemos obtenido en todos nuestros ensayos. Este índice terapeútico, sin ser muy alto si lo comparamos con el del ddC establecido en 25.000, es sin embargo significativo. De acuerdo a la Dra. 306 Ana San Félix (com. per.), una droga puede considerarse que tiene actividad viral significativa siempre y cuando su índice terapeútico sea superior a 10. Según ello, la droga 10 entraría en dicho intervalo y podríamos afirmar que al menos tendría cierta actividad antiviral (anti-VIH). Hay que tener en cuenta que, a la hora de comparar índices terapeúticos, se consideranunidades de magnitud, es decir valores de 1, 10, 100, 1000, 10.000 y así sucesivamente. Es decir, que por ejemplo, dos índices terapeúticos de 10 y 70 podrían considerarse muy parecidos ya que se encuentran dentro del mismo orden de magnitud. En este sentido, el indice terapéutico de la droga 10 (quercetina) sería del orden de 3 unidades de magnitud inferior al de la droga control ddC. La droga 10 o quercetina es un flavonol (3-OH-luteolina). Shu-Chen & col. (1992) demuestran que la quercetina tiene un cierto efecto inhibidor de la transcriptasa inversa, con un CC50 de 0.06, pero utilizando otro tipo de cultivos celulares. Estos resultados concuerdan con los nuestros, en el sentido de que podríamos afirmar que la quercetina tiene al menos cierta actividad anti-VIH, inhibiendo ligeramente la actividad de la retrotranscriptasa. Así mismo, Selway (1986) y Vanden Berghe & col. (1986) ya recojen que la quercetina es capaz de inhibir la actividad de ciertos virus tales como los del herpes, parainfluenza, polio, etc. La droga 15 (eriodictiol), al igual que la anterior droga 10, es sólo efectiva sin ser tóxica, a concentraciones muy bajas, cercanas a 0.8 gM. Su CC~ es de 4 gg/ml, muy bajo, pero se compensa con un EC50 también muy bajo de 0.8 hg/ml. Es decir, que es capaz de inhibir el 50% de la replicación viral a concentraciones muy bajas, a las cuales puede también llegar a ser tóxica (sobre 4 ~tg/ml= CC50). Con dichos valores, su índice terapeútico es de 5, y no entra, como si ocurría con la droga 10, dentro de los valores considerados que ha de reunir una droga con actividad antiviral significativa (índice terapeútico superior a 10). La droga 15 o eriodictiol es la flavanona derivada de la luteolina (2,3-dihidro-luteolina). Shu-Chen & col. (1992) consideran que la flavanona hesperetina (4’-metil-eriodictiol) con CC50 de 6.33, tiene un moderado efecto inhibitorio de la actividad de la transcriptasa inversa, mientras que la flavanona y otras flavonas (3-OH y 7-OH) con CC50 mayor de 100 tienen muy bajo efecto inhibitorio de la enzima virica. En cierta forma, estos resultados concuerdan con los nuestros, pues la droga 15 tiene cierto efecto inhibidor de la actividad viral sustentado en un índice terapeútico de 5, pero que en cualquier caso no puede incluirse dentro de los valores de actividad antiviral significativa. Selway (1986) y Vanden Berghe & col. (1986) recogen así mismo la actividad antiviral de ciertas flavanonas frente a ciertos tipos de virus entre los que no se encuentra el VIH. Las drogas 11 (luteolina-7-O-neohesperidósido), 12 (lucenina-2), 13 (apigenina-7-Otriglicósido) y 14 (isoorientina-3’-O-soforósido) poseen un indice de efectividad <‘“< a una concentración de 100 gM sin ser tóxicas, no siendo nada efectivas a concentraciones inferiores, excepto la droga 11 que tiene un valor de efectividad ** a 20 gM. Estos resultados concuerdan con los obtenidos para la droga 9, es decir, se necesitan concentraciones altas de droga para que esta sea efectiva. En las 4 drogas mencionadas, el valor de CC50 es siempre mayor de 100, pero su EC50 es también alto, lo que redunda en un índice terapeútico también bajo, excepto la droga 11 cuyo índice terapéutico llega a ser de 5. Generalizando, las drogas 11, 12, 13 y 14 sólo serían tóxicas a concentraciones altas pero sólo serian efectivas a concentraciones también altas, por lo que su valor terapéutico es muy bajo. 307 Resumiendo la discusión relativa a la actividad anti-viral de las 15 drogas ensayadas podríamos establecer los siguientes puntos: Las drogas 1, 2 y 6 (por no inhibir la replicación viral), la droga 8 (cuya efectividad antiviral es prácticamente nula) y la droga 5 (sólo es efectiva a concentraciones tóxicas) no parecen ser recomendables en la quimioterapia contra el SIDA. Las drogas 3, 4 y 7 poseen un indice terapeútico bajo, por lo que tampoco son recomendables en una terapida antiviral, incluso a concentraciones cercanas a 20 $M, a las que puede ser tóxicas y por ello poco seguras para la integridad humana. Las drogas 9, 11, 12, 13 y 14 tampoco parecen ser recomendables en una terapia contra el VIH, por necesitarse siempre de altas concentraciones de droga para ser algo efectivas. La droga 15 inhibe la replicación del virus a concentraciones bajas a las cuales es efectiva, pero a la vez puede ser tóxica, por lo que tampoco parece ser recomendable en una terapia antiviral. No obstante, recomendaríamos el ensayo mediante síntesis de compuestos derivados que aumentaran su índice terapeútico. La droga 10 o quercetina es la única que posee un índice terapeútico que permite considerar que esta droga tiene una moderada actividad antiviral. Su índice terapeútico es sin embargo muy bajo en comparación con el establecido para la droga patrón ddC. Al igual que en el caso anterior, recomendaríamos el ensayo mediante síntesis de compuestos derivados que aumentaran su índice terapeútico. Los 2’,3’-dideoxi-nucleótidos (ddN), derivados de adenosina (ddA), guanina (ddG), inosina (ddl) y citidina(ddC) y sus derivados como el AZT (3’-azido-2’,3’-dideoxi-timidina) son considerados actualmente, como potentes inhibidores de la replicación viral del VIH, en base al mismo cálculo relativo a la concentración de p24 que nosotros hemos realizado (Mitsuya & Broder, 1986; Perno & col., 1988), por lo que este indice es una manera correcta de medir la actividad viral y con ello la efectividad de una droga. La 2’,3’-dideoxi-timidina (ddT), diferencia de los anteriores, parece requerir de mayores concentraciones de droga para conseguir el efecto antiviral del resto de ddN. En el caso de la ddl, el efecto antiviral es teóricamente mediado por su conversión a ddA o ddG. En resumen, y a pesar de que los resultados no han sido del todo satisfactorios como para poder utilizar los flavonoides identificados en Bartramiaceae en la terapia contra el SIDA, podemos afirmar que, aún siendo estructuralmente muy distintos del AZT o ddl, así como de otras drogas hoy efectivas contra el VIII, albergan al menos cierta actividad inhibitoria de la transcriptasa inversa. Estos hechos, en principio, podrían explicarse si tenemos en cuenta que los musgos no pueden ser infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana y sería lógico pensar que las estructuras flavonoidicas que sinteticen no sean efectivas contra él. Sin embargo, podríamos hipotetizar, yen un futuro cercano emprenderemos tal estudio, que los biflavonoides y triflavonoides de Sartramiaceae serian más efectivos en la defensa del vegetal contra ciertos microorganismos del suelo, tales como bacterias, hongos y ciertos tipos de virus, ya que éstos comparten su hábitat, y por tanto los musgos se habrían especializado en la defensa contra ellos específicamente. De acuerdo a la Dra. Ana San Félix (com. per.), la polaridad de los biflavonoides de musgos (con 8 hidroxilos) y de sus triflavonoides (con 12 hidroxilos), podría ser la causa de su baja actividad anti-VIH, ya que esta relativa alta polaridad les impediría penetrar en la célula y llevar a cabo su actividad antiviral. - - - - - 308 Y!] ~F VN~?~J§~ Y C©ÑCD ¿J§II©}~ ~ Las incógnitas de la evolución se manifiestan en todos los niveles estructurales de los organismos vivos, desde el plano macroscópico hasta el micromolecular. De este último, en concreto, nos hemos ocupado en nuestro trabajo y, en particular, de la composición flavonoidica. Aunque, como afirmaba Seeligmann (1990), la distribución de los flavonoides en el Reino Vegetal exhibe características que a menudo resultan difíciles de interpretar, justamente cuando pretendemos incorporar a nuestro estudio un componente filogenético y evolutivo, creemos no obstante que los trazadores elegidos en nuestro trabajo pueden utilizarse tanto en la taxonomía como en la filogenia de briófitos, en comparación a otros criterios tradicionales utilizados en la clasificación taxonómica (Zinsmeister & Mijes, 1990). Sin embargo, puede constituir un riesgo intentar explicar la evolución de los flavonoides en &yophyta de la misma manera que se hace en Angiospermas (Seeligmann, 1990). Harborne (1977) consideraba la presencia de biflavonoides en 12 familias de Angiospermas como un relicto bioquímico primitivo que, obviamente no podemos admitir en briófitos donde, la complejidad estructural de los biflavonoides alcanza su grado máximo. Hay que tener en cuenta que, las “decisiones taxonómicas” en general, no se deben basar en un sólo tipo de criterios y, por ende, las consideraciones quimiosistemáticas que se realicen basándose en los flavonoides, puede ser igualmente valiosas, conduciendo a conclusiones ya no sólo más completas, sino más correctas. De acuerdo a los Anexos 1 y II, los tipos flavonoidicos más comunes en musgos son las flavonas glicosiladas y los biflavonoides. Las primeras, en la gran mayoría de los casos, están representadas por 0-glicósidos, siendo poco comunes los 0-glucurónidos y las C-glicósidos (Múes & Zinsmeister, 1988; Miles, 1989). La evidencia sobre la frecuente ocurrencia de biflavonoides en musgos, fue una gran sorpresa, sobre todo tras la primera cita dada en Dicranum scoparium referente a una biluteolina (Lindberg & col., 1974). Durante estos últimos años, las referencias sobre la identificación de biflavonoides es musgos han ido aumentando considerablemente, sobre todo tras la puesta en marcha de un adecuado sistema de ensayo por 2D-TLC, de un largo número de especies. Muchos de los biflavonoides hoy conocidos en musgos, supusieron la existencia de compuestos nuevos, hasta ese momento desconocidos, en base a distintos tipos de enlace interfiavonoidico entre los dos monómeros en las biluteolinas frecuentes en musgos. En la presente Memoria Doctoral se estudió la composición flavonoidica de 86 especies: De un lado 2 especies del género Selaginel/a de la familia Selaginel/aceae, caracterizadas por sintetizar únicamente biflavonas. A pesar de no ser briófitos, los compuestos aislados en dichas especies sirvieron como patrones estructurales en la identificación de otros biflavonoides y en los ensayos de actividad biológica. Una única especie de la familia Dicranaceae, Dicranum scoparium, en la que se identificó un segundo y nuevo biflavonoide respecto a la bibliografía(5’,3”’-diOH-robustaflavona) así como ciertas flavonas glicosiladas. 83 especies de la familia Bartram¡aceae pertenecientes a 8 géneros: Anacolia (5), Bartramia (18), Breutelja (23), Catoscopium (1), Conostomum (6), Lejome/a (4), Philonotis (25) y Plagiopus (1). Este - - - 309 Breute/la (23), Catoscopium (1), Conostomum (6), Lelomela (4), Philonotis (25) y Plagiopus (1). Este estudio incluyó por completo toda la flora muscícola ibérica de la familia Bartramiaceae, representada por 18 especies pertenecientes a 7 géneros. Se identificaron 15 estructuras flavonoidicas repartidas de la siguiente manera: 8 biflavonoides. De ellos, uno fue un dímero flavona-flavanona denominado 2,3-dihidrofilonotisflavona. Dos eran biflavonoides macrociclicos derivados de la luteolina, concretamente la bartramiaflavona (formada por dos ciclo-oxo tautómeros) y la anhidrobartramiaflavona. Los 5 biflavonoides restantes eran todos ellos biflavonas: 4 biluteolinas con distintas uniones entre ambos monómeros: 5’,8” (5’,3’ ‘ ‘-diOH-amentoflavona), 5’,6” (5’ ,3’ ‘ ‘-diOH-robustaflavona), 2’,8” (filonotisflavona) y 2’,6” (dicranolomina); y la última biflavona resulté ser un dímero luteolinaapigenina con enlace 5’,8” (5’-OH-amentoflavona). 3 triflavonoides. Dos de ellos eran triluteolinas lineares y además diastereómeros (bartramiatriluteolina y epi-bartramia-triluteolina) con uniones interfiavonoidicas del tipo filonotisflavona. El otro triflavonoide resultó ser una molécula macrocíclica que se denominó ciclo-bartramia-triluteolina, que supuso la primera cita de este tipo de compuestos (triflavonoides cíclicos) en la química de los productos naturales. 1 ácido flavonoidico derivado de la luteolina con un grupo ácido (ac. protocatéquico) en posición C-8. 3 flavonas glicosiladas derivadas de la diosmetina, luteolina y apigenina que se identificaron exclusivamente en Dicranum scoparium. La composición flavonoidica resultó ser un marcador quimiosistemático altamente válido, en la separación taxonómica de las distintas especies de Bartramiaceae en sus respectivas secciones, al menos en lo que respecta al género Bartramia, cuyas secciones pueden separarse sin problemas de acuerdo a sus flavonoides. Así mismo, la composición flavonoidica nos permitió corroborar ciertas hipótesis previamente establecidas sobre las correspondientes sinonimias de Bartramia rosea y Conostomum boreale, así como sobre una diferente ubicación dentro de las secciones respectivas de sus géneros de Bareramia ruwenzoriensis y Breutelia elongata. Muy posiblemente, ese variadisimo elenco de tipos flavonoidicos identificados en musgos, y más en particular los biflavonoides, puede ir directamente relacionado con la coevolución de musgos y microorganismos (bacterias, hongos, virus) que impedirían el crecimiento del vegetal, obligándole a la creación de unas defensas químicas que bien podrían ser Jos biflavonoides. Los briófitos constituyen una notable reserva de nuevas y raras estructuras, que suponen nuevos productos naturales. Muchas de ellas poseen una importante y probada actividad biológica, sobre todo farmacológica (Zinsmeister & col., 1987 y 1991; Zinsmeister & Múes, 1987; Becker, 1989; Becker & Wurzel, 1987). La actividad biológica de biflavonoides y triflavonoides abre un amplio abanico de espectativas de estudio desde el punto de vista de sus posibilidades antibióticas, tanto antibacíerianas, antifúngicas como antiviricas. No obstante, la función que éstos desempeñan en el vegetal aún no está bien definida, lo que aumenta el interés no sólo por identificar nuevas estructuras (caso de le Ciclo-Triluteolina y la Epi-Bartramia-Triluteolina) sino también por conocer que función cumplen y que significado tanto fisiológico como filogenético albergan. Dado el poder medicinal y antibiótico de los compuestos estudiados en la presente memoria - - - - 310 previa síntesis química en laboratorio, ya que su extracción del material biológico resulta difícil y posiblemente poco rentable económicamente. En este sentido, Salm (1993, com. per.) refiere la existencia en la actualidad de dos equipos de investigación en Mulhouse (Francia) y Saarbrúcken (Alemania) que trabajan en este camino, habiendo iniciado la síntesis en laboratorio de los biflavonoides más sencillos (tipo amentoflavona y/o robustaflavona) y otros algo más complejos (hipnogenoles), siguiendo diversas y variadas vías de síntesis en laboratorio (Muller & Fleury, 1991; Eicher, 1990). La síntesis de macrociclos (bartramiaflavona, anhidrobartramiaflavona y ciclotriluteolina) resulta por el momento imposible, pues los productos intermedios de síntesis no son los deseados (Salm, 1994). Por el momento, se están llevando a cabo estudios adicionales a los realizados, tales como la elucidación de la estructura por rayos X de los macrociclos antes nombrados (Salm, 1994). La actividad anti-VIH de las 15 muestras flavonoidicas estudiadas demostró que ninguna de ellas poseían una fuerte inhibición de la replicación viral. Unicamente la droga 10 (quercetina) demostró una moderada actividad antiviral, con un índice terapeútico de 10. En conclusión, la actividad antiviral (ami-VIII) de los flavonoides estudiados, y de acuerdo a Selway (1986), es limitada. Por ello, el uso de los flavonoides en la terapia antiviral, podría reducirse a su uso clínico en la profilaxis, más que a un tratamiento directo como antiviricos. En definitiva, las conclusiones que podemos extraer de la presente Memoria Doctoral son las siguientes: 1. Se han identificado 15 flavonoides: 8 biflavonoides (2 macrociclicos), 3 triflavonoides (uno de ellos cíclico), 1 ácido flavonoidico y 3 flavonas-O-glicosiladas. 2. El Compuesto IX (Epi-Bartramia-Triluteolina) es una estructura novedosa para la química flavonoidica de musgos. 3. La identificación de la Ciclo-Triluteolina (Compuesto X) aporta una nueva estructura flavonoidica (triflavonoides macrociclicos) en la química de los productos naturales. 4. La gran mayoría de las especies de la familia Bartramiaceae sintetizan flavonoides, principalmente biflavonas. 5. La subfamilia Conosromoideae y el género Conostomum son los menos evolucionados de la familia Bartramiaceae 6. La composición flavonoidica permite diferenciar las tres secciones del género Bartramia: Ithyphytlae (sin macrociclos), Bartramia (biflavonoides macrociclicos) y Srrictid¡um (triflavonoides cíclicos). La ciclación molecular parece ser un paso evolutivo avanzado en la química flavonoidica del género Rartramia, lo mismo que la adición de un tercer monómero de luteolina. 7. 311 8. Se propone la nueva subfamilia Catoscopioideae para la familia Bartramiaceae. 9. Los géneros Lelome/a y Plagiopus son respectivamente, el menos y el más evolucionado de la subfamilia Bartramioideae. 10. Los géneros Anacolia y Breutelia son respectivamente, el menos y el más evolucionado de la subfamilia Breute/ioideae. 11. Existe una tendencia a la reducción en la síntesis de biflavonoides en la subfamilia Breutelioideae, considerada la más evolucionada de la familia Bartramiaceae. 12. Concentraciones relativamente altas de 2,3-dihidro-filonotisflavona son propias de las especies menos evolucionadas de la familia Bartramiaceae. 13. Se considera Bartramia rosea una especie sinónima de Anacolia laevisp/taera. 14. Se valida Conostomum tetragonum y C. boreale es considerada sinónima de la anterior. 15. Se propone transferir Breutelia pendula y 8. tomentosa de la sección Acoleus a la sección Lycopodiobryum del género Breutelia. 16. Se propone transferir Bartramia ruwenzoriensis de la sección !thyphy/lae a la sección Bartramia del género Bartramia por sintetizar biflavonoides macrocíclicos. 17. La composición flavonoidica es sensiblemente diferente desde un punto de vista cuantitativo, en la generaciones esporofítica y gametofitica, existiendo igualmente ciertas diferencias cualitativas. 18. La composición flavonoidica de las especies ibéricas del género Bariramia no varia sustancialmente, desde un punto de vista cualitativo, con la localización geográfica. 19. Ninguno de los flavonoides ensayados frente al virus del SIDA (VIII) parece tener una fuerte actividad inhibitoria de la transcriptasa inversa. Sólo la quercetina y en menor medida el eriodictiol, tienen una actividad moderada. Los vegetales, y mis concretamente los musgos, suponen una fuente de productos naturales inagotable, y aunque en la presente Memoria Doctoral hemos querido poner de manifiesto la amplia variabilidad de compuestos químicos que poseen, podríamos afinnar que, los “principales descubrimientos” están aun por llegar. 312 ,. ABELLA, L., ALCALDE, M., ESTEBANEZ, B. & RON, E. 1992. Influence of Ambiental Factors of sporeling types in Bryophyta. Comunicación presentada al Sth International Palvnological Conpress Septiembre, 1992. Aix-en-Provence. ABOU-KARAM, M. & THOMAS SHIER, W. 1992. Isolation and characterization of an antiviral flavonoid from Waldsteinia fragarioides. J. Nat. Prod., 55 (10): 1525-1527. ACON, M. 1988. Inventario Muscícola de la Comunidad Autónoma de Madrid (Esuañat C.A.M. Madrid. AGRAWAL P.K. 1989. Carbon-13 NMR of Flavonoids. Elsevier. Amsterdam. AGRAWAL, P.K. & RASTOGI, R.P. 1981. ‘3C NMR-spectroscopy of flavonoids. Heterocvcles, 16: 21812236. ALBERT, A. 1971. Relations between molecular structure and biological activity: stages in the evolution of current concepts. Ann. Rey. Pharmacol., 11: 13. ALCALDE GALEOTE, M. 1994. Contribución al estudio del desarrollo protonemático en Bartramiaceae (Brvonsida. Brvovhvta). Memoria de Licenciatura (inédit.). Facultad de C.C. Biológicas. Universidad Complutense. Madrid. AL-HASAN, R.H., EL-SAADAWI, W.E., ALI, MA. & RADWAN, S.S. 1989. Arachidonic and eicosapentaenoic acids in lipids of Bryum bicolor Dicks. Effects of controlled temperature aud illumination. Brvoloaist, 92: 178-182. AL-HASAN, LII., EL-SAADAWI, W.E., ALI, M. &RADWAN, S.S. 1990. Lipidsofthegametophyteand sporophyte of Funaria hygrometrica. Comparison with lipids from leaves of vascular plants. Brvoloaist 93(1): 4449. AL-HASAN. R.H., KA’WASH, H.H. & RADWAN, S.S. 1991. Enrichment of Mosses with lipids and polyinsaturared fatty acíds by nitrogen starvation. Brvoloeist, 94 (2): ¡96-200. ALSTON, RE. 1968. C-Glycosyl flavonoids. En Mabry, T.J., Alston, R.e. & Runeckles, V.C. (Eds.): Recenta Advances in Phvtochemistrv (vol. 1). Appleton-Century-Crofts. New York. ANDERSON, L.E., CRUM, HA. & BUCK, W.R. 1990. List of the mosses of North America and North of Mexico. Brvolo2ist, 93: 448499. ANDERSON, W.H., HAWKINS, J.M., GELLERMAN, iL. & SCHLENK, H. 1974. Fatty acid composition as criterion in taxonomy of mosses. Journ. Hattori Bot. Lab., 38: 99-103. ANDO, II. & MATSUO, A. 1984. Applied Bryology. In Schultze, M. (Ed.): Advances in Brvolo2v (vol. 2). J. Cramer. Vaduz. ANHUT, 5. 1985. Phvtochemische Untersuchunpen an Moosen unter besonderer Berticksichtiaung der Flavonoide in Brvum canillare. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbríicken. ANHUT, 5. 1992. Die Verbreitunp nhenolischer Inhaltsstoffe in der Laubmoos~attunp Pla2iomnium und Sterilkulture von Brvum capillare. Dissertation. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. ANHUT, 5., BIEHL, J., SEEGER, T., MUES, R. & ZINSMEISTER, H.D. 1992. Flavone-&glicosides from the Mosses Plagiomnium elatum and Plagiomnium cuspidatum. Z. Naturforsch., 47c: 654-660. 313 ., ANHUT, 5., SEEGER, T., BIEHL, J., ZINSMEISTER, UD. & GEIGER, H. 1989a. Phytochemical studies of the rnoss species Plagionmium elatum and Plagiomnium cuspidatum. Journ. Hattori Bot. Lab., 67: 377-382. ANHUT, 5., SEEGER, T., ZINSMEISTER, HO. & GEIGER, U. 1989b. New dihydrobiflavones from the moss Plagioninium cuspidatum. Z. Naturforsch., 44c: 189-192. ANHUT, 5., ZINSMEISTER, HO., MUES, R., BARZ, W., MACHENBROK, K., KOSTER, J. & MARKHAM, K.R. 1984. The first identificationof isoflavonesfromabryophyte. Phvtochemistrv, 23: 1073-1075. ANYANWUTAKU, 1.0., ZIRBES, E. & ROSAZZA, P.N. 1992. lsoflavonoids from Streptomyces: origins of Genistein, 8-chlorogenistein, and 6,8-dichlorogenistein. J. Nat. Prod., 55 (10): 1498-1504. ASAKAWA, Y. 1981. Biologically active substances obtained from bryophytes. Joum. Hattori Bot. Lab., 50: 123-142. ASAKAWA, Y. 1982. Chemical constituents of the Hepaticae. In Herz, W., Grisebach, U. & Kirby, G.W. (Eds.): Pro2ress in the Chemistrv of Ornanic Natural Products (vol. 42). Springer-Verlag. Vienna. ASAKAWA, Y. 1986. Chemical relationships between algae, biyophytes and pteridophytes. L~ygi., 14: 5970. ASAKAWA, Y. 1990. Terpenoids and aromatic compounds with pharmacological activity from bryophytes. In Zinsmeister, HO. & MUes, R. (Eds.): Brvouhvtes: Their Chemistrv and Chemical Taxonomv Clarendon Press. Oxford. ASAKAWA, Y., TOKUNAGA, N., TOYOTA, M., TAKEMOTO, T. &SUIRE, C. 1979a. Chemosystematics of bryophytes 1. The distribution of terpenoids in bryophytes. Journ. Hattori Bot. Lab., 45: 395407. ASAKAWA, Y,, TOKUNAGA, N., TOYOTA, M., TAKEMOTO, T., HAITORI, 5., MIZUTANT, M. & SUIRE, C. 197%. Chemosystematics of bryophytes II. The distributionof terpenoids in Hepaticae and Anthocerotae. Journ. Hattori Bot. Lab., 46: 67-76. ASAKAWA, Y., TOYOTA, M. & TAKEMOTO, T. 1978. Biologicaily active substances of bryophytes. Lx Brvol. Soc. Japan, 2. 78-80. ASAKAWA, Y., TOKUNAGA, N., TAKEMOTO, T., HATTORI, 5., MIZUTANI, M. & SUIRE, C. 1980a. Chemosystematics of bryophytes IV. The distribution of terpenoids and aromatic compounds in Hepaticae and Anthocerotae. Joum. Hattori Bot. Lab., 47: 153-164. ASAKAWA, Y., TOYOTA, M., TAKEMOTO, T., FUJIKI, H. & SUGIMURA, T. 1980b. Biologically active substances isolated from liverworts. Planta Medica, 39: 233. AUDIER, U. 1966. Étude des compossés flavoniques par spectrométrie de masse. Bulí. Soc. Chem. France 9: 2892-2899. AUGIER, J. 1966. Flores des Brvophvtes. Ed. Paul Lechevalier. Paris. BABA, M., PAUWELS, R., HERDEWIJN, P., DE CLERCQ, E., DESMYTER, J. & VANDEPUTTE, M. 1987. Both 2’ ,3’-dideoxythymidine and its 2’ ,3’-unsaturated derivative(2’ ,3’-di-deoxythymidinene)are potent and selective inhibitors of human inmunodeficiency virus replication in vitro. Biochem. Bioohvs Commun., 142 (1): 128-134. BABA, K., TANIGUCHI, M. & KOZAWA, M. 1992. A spirobiflavonoidgenkwanol B from Daphne genkwa. Phvtochemistry, 31(3): 975-980. 314 . BAKER, W., FINCH, A.C.M., OLLIS, W.D. & ROBINSON, KW. 1963. The structures of the Naturally ocurring Biflavonyls. J. Chem. Soc.:1477-1490 BAKER, W. & OLLIS, W.D. 1961. Recent Develonments in the Chemistrv of Natural Phenolic Comvounds Pergamon Press. London BALZARINI, J., PERNO, CF., SCHOLS, O. & DE CLERQ, E. 1991. Activity of acyclic nucleoside phosphonate analogues against human inmunodeficiency virus in monocyte/macrophages and peripheral blood lympl-xocytes. Biochem. Biouhvs. Commun., 178 (1): 329-335. BANERJEE, RO. 1974. Studies on Antibiotic Activitv of Brvophvtes and Pteridonhvtes. Ph. D. Thesis. University of Kalyani. Kalyani. BANER.JEE, RO. & SEN, S.P. 1979. Antibiotic Activity of Biyophytes. Brvolopist, 82 (2): 141-153. BARCELO, J., NICOLAS, G., SAHATER, U. & SANCUEZ, R. 1987. Fisiología Ve2etal. FA. Pirámide. Madrid. BATE-SMITH, G.C. 1963. Usefulness of Chemistry in Plant Taxonomy as Illustrated by the Flavonoid Constituents. En Swain, T. (Ed.): Chemical P]ant Taxonomv. Academie Press. London. BAUER, B.J., SELWAY, W.T., BATCI-IELOR, L., TISDALE, M., CALDWELL, C. & YOUNG, DAB. 1981. 4’ ,6~Dichloroflavan (BW683C), a new anti-rhinovirus compound. Nature, 292: 369-370. BECKER, U. 1989. Hryophytes, a Rich source of Secondary Metabolites. Botanica Acta, 102: 181-182. BECKER, U., EICUER, T., MUES, R. & ZINSMEISTER, UD. 1992. Neue Naturstoffe aus MoosenErgebnisse emes interdisziplináren Forschungsprojektes. Ma2azin Forschunp-Universitát des Saarlandes, 1: 62-69. BECKER, U., WILKING, G. & HOSTETTMANN, K. 1977. Separation of isomeric glycoflavones by high pressure liquid chromatography. J. Chromatogr., 136: 174-175. BECKER, H. & WURZEL, G. 1987. Sind Lebermoose Arzneiptlanzen?. Pharmazie in unserer Zeit, 16 (5): 152-156. BECKER, R. 1986. Biflavonoide in Hvlocomnium solendens (Uedw.) B.S.G. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. BECKER, R., MUES, R., ZINSMEISTER, HO., HERZOG, F. & GEIGER, II. 1986. A new biflavone and futher flavonoids from the moss Hylocomium splendens. Z. Naturforsch., 41c: 507-510. BELADI, 1., PUSZTAI, R. & BAKAY, M. 1965. Inhibitory activity of tannic acid and flavonols on the infectivity of Herpevirus hominis and Uerpervirus suis. Naturwissenschaften, 52: 402-403. BELADI, 1., PUSZTAI, R., MUSCT, 1., BAKAY, M. & GABOR, M. 1977. Activity of some flavonoids against viruses. Aun. N.Y. Acad. Sci., 284: 358-364. BELKIN, M., FITZGERALD, OB. & FELIX, M.D. 1952/53. Tumor-damaging capacity of plants materials. II. Plants used as diuretics. J. Natí. Cancer Inst., 13: 741-744. BELL, EA. & CUARLWOOO, B.V. 1980. Secondarv Plant Products. Encyclopedia of PlantPhysiology. New Sciences (vol. 8). Springer Verlag. Berlin. BENOZ, G. & MARTENSSON, 0. 1961. Moss Anthocyanins. Acta Chem. Scand., 15: 1185. 315 O. & MARTENSSON, 0. 1963. Moss pigments II. The anthocyanins of Bryum rutilans Brid. and Bryum weigeleii Spreng. Acta Chem. Scand., 17: 266-272. BENOZ, BENOZ, O., MARTENSSON, O. & NILSSON, E. 1966a. Moss pigments IV. An investigation of te occurrence of proanthocyanidins in mosses. Acta Chem. Scand., 20: 277-278 BENOZ, O., MARTENSSON, O. & NILSSON, E. 1966b. Moss pigments. III. Isolation of some reddish pigments from Sphagnum species. Arkiv fór Kemi, 25: 215-221. BENOZ. G., MARTENSSON, O. & NILSSON, E. 1967. Moss pigments. VI. On the pigmentation of Sphagnum species. Bot. Notiser, 120: 345-354. BENOZ, O., MARTENSSON, O. & TERENIUS, L. 1962. Moss pigments 1. The anthocyanins of Bryum cryophilum O. Mart. Acta Chem. Scand., 16: 1183-1190. BENESOVA, y. & HEROUT, y. 1972. Components of liverworts. Their chemical stmctures and biological activity. Brvoohvtorum Bibliotheca, 13: 355-364. BERETZ, A., ANTON, R. & STOCLET, J.C. 1978. Inhibition of 3’,5’-AMP phosphodiesterase by biflavonoids and xanthones. Planta Medica, 36 (3): 193-195. BERETZ, A., JOLY, M., STOCLET, J.C. & ANTON, R. 1979. Inhibition of 3’ ,5’-AMP-phosphodiesterase by biflavonoids and xanthones. Planta Medica, 36: 193-195. BERTRAM, B. 1989. Flavonoide. Eme Klasse von Pflanzeninhaltsstoffen mit vielfáltigen biologischen Wirkungen, auch mit karzinogener Wirkung?. Deutsche Anotheker Zeituna, 47: 2561-2571. B.E.S. (Boletín Epidemiológico Semanal) (1983), n0 1593 1 S-24. Madrid. B.E.S. (Boletín Epidemiológico Semanal) (1989). Informes sobre Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), Marzo 1983-Marzo 1988, 175 Pp. Madrid. BESSON, E., CHOPIN, J., MARKHAM, K.R., MUES, R., WONG, U. & BOUILLANT, ML. 1984. Identification of neoschaftoside as 6-C-13-glucopyranosyl-8-C-B-arabinopyranosyl-apigenin. Phvtochemistrv, 23: 159-161. BEUTELMANN, P., KOUN, O., EULER, R. & HARTMANN, E. 1992. The uncommon fatty acid pattern of the Bryophytes: a valuable tool for the investigation of lipid biosynthesis. Crvnt. Bot., 3. 77-81. BIEHL, J. 1988. Flavonoideaus Pla~iomniumelatum <B.S.G.) Kov. Diplomarbeit. Universit~t des Saarlandes. Saarbrticken. BLANO, DE., LOGAN, A., MENSHUM, M. & STERNHELL, 5. 1968. The lignin of Sphagnum. Phvtochemistrv, 7:1373-1377. BOREL, G.A., SCHELLING, J.L. & MAGNENAT, P. 1976. The effect of flavonoid compounds cyanidanol-3 in acute viral hepatitis. Z. Gastroent., 14: 24-29. (±)- BRACKE, M.E., VYNCKE, B., DE PESTEL, O., VAKAET, L., BOURGOIS, L., LAREBEKE, N.y., BORTIER, FI. & MAREEL, MM. 1990. Effect of Flavonoids on Cancer celí invasiveness. In Das, NP. (Ed.): Flavonoids in Hiolo2v and Medicine III: Current issues in Flavonoids Research. National University of Singapore. BRASSEUR, T. & ANGELOT, L. 1986. La mélange diphénylborate d’aminoéthanol PEG 400. Un intéressant réactif de révélation des flavonoides. J. Chromatoar., 351: 351-355. - 316 . BREHM, B.G. & KRELL, 0. 1975. Flavonoidlocalizationinepidermal papillae of flowerpetals: a specialised adaptation for ultraviolet absorption. Science, 190: 1221-1223. BRIANCON-SCHEID, F., GUTH, A. & ANTON, R. 1982. High-perfomance liquid chromatography of biflavones from Ginkgo biloba L. 1. Chromatogr., 245: 261-267. BRILL-FESS, C. 1981/82. Die yerbreitun2 von Flavonoiden in cinigen Ordnunpen der Brvidae Staaísexamensarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbríicken. BRUCH, P., SCUIMPER, W.P. & VON GUMBEL, W.T. 1836-1855. Brvoloaia eurooeae seu aenera muscorum Europaeo~m mono2ravhiae illustrata (6 vols.). Stuttgart. BRUNETON, J. 1991. Elementos de Fitopuimica y de Farmacoanosia. Ed. Acribia. Zaragoza. CAMPBELL, E.O., MARKUAM, K.R., MOORE, N.A., PORTER, L.J. & WALLACE, J.W. 1979. Taxonomic and phylogenetic implicationa of comparative flavonoid chemistry of species in the family Marchantiaceae. Journ. Uattori Bot. Lab., 45: 185-199. CARRERAS, A. 1991. Miasmas y Retrovirus. Fundación Uriach 1838. Colección Histórica de Ciencias de la Salud, 2. Barcelona. CASAS, C. 1991. New checklist of Spanish mosges Orsis 6~ 3-26. CASAS, C., BRUGUES, M., CROS, R.M. & SERGIO, C. 1985-1992. Carto2rafia de Bribfits: Península Ibérica i les Illes Balears. Canáries. Acores i Madeira. Institut D’Estudis Catalaus. Barcelona. CASTALDO-COBIANCUI, R., yIOLANTE, U., GIOROANO, 5. & BASILE, A. 1986. Presenza di sostanze antibiotiche in Conocephalum conicum e Mnium undulatum. Giorn. Bot. Ital., 120 (suppl. 2): 125. CASTALDO-COBIANCUI, R., GIORDANO, 5., BASILE, A. & yIOLANTE, U. 1988. Ocurrence of antibiotic activity in Conocephalum conicum, Mnium undulatum and Leptodictyum riparium (Bryophytes). Oiorn. Bot. Ital., 122: 303-311. C D.C. 1983. Prevention of acquired inmune deficiency syndrome (AIOS) report of inter-agency recomrnendations. MMWR, 32: 101-103. CUAKRAVARTUY, B.K., RAO, Y.V., GAMBI-IIR, S.S. &GOOE, K.O. 1981. IsolationofAmentoflavone from Selaginella rupestris and its pharmacological activity on Central Nervous System, Smooth Muscles and Isolated Frog Ueart Preparations. Planta Medica, 43: 64-70. CUAN, B.G., WAISS JR., A.C., BINOER, R.G. & ELLIGER, C.A. 1978. Tnhibitionof Lepidopterous larval growth by cotton constituents. Ent. Exo. Anní., 24: 94-100 CHAPMAN, O.J. 1985. Geological factors and biochemical aspects of the origin of land plants. In Tiffney, BR (Ed.): Geological Factors and the Evolution of Plants. Yale University Press. New Haven. CHARI, VM., ILYAS, M., WAGNER, U., NESZMELYI, A., CHEN, F.C., CHEN, L.K., LIN, Y.C. & LIN, Y.M. 1977. 3C-NMR Spectroscopy of Biflavonoids. Phytochemistrv, 16: 1273-1278. CUAWLA, U., CHIRBER, S.S. & TIRUVENKATA, R.S. 1974. Volubilin, a new isoflavone-C-glycoside from Dalbergia volubilis flowers. Phvtochemistrv, 13: 2301-2304. CHEXAL, K.K., HANDA, B.K. & RAUMAN, W. 1970. Thin-layer chromatography of biflavonyls on silica gel stmcture-chromatographic behaviour correlaíions. J. Chromato2r., 48: 484-492. 317 .: CHIU, PL., PATTERSON, G.W. & FENNER, G.P. 1985. Steroles of Bryophytes. Phvtochemistrv, 24(2): 263-266. CHOPRA, R.N. & BHATLA, SC. (Eds.). 1990. Brvophvthe Develoument: Phvsiologv and Biochemistrv Clarendon Press. London. CILLERO, M. 1944. Aportación a la Flora briológica española. Anales Jard. Bot. Madrid, 5: 365-376. CLARK, W.D. 1987. Recovery of flavonoids from Dymethyl sulfoxide. Phvtochem. Bulí., 19 (1): 6-10. CODY, V., MIDDLETON Jr., E. & HARBORNE, iB. 1986. Plant Flavonoids in Biolo~v and Medicine Biochemical, Pharmacolo2ical and Structure-Activitv relationshiys. Alan R. Liss. Inc. New York. CODY, y., MIDDLETON Jr., E., HARBORNE, J.B. & BEREIZ, A. (Eds.): 1988. Plant Flavonoids in BioloEv and Medicine II: Biochemical. Cellular and Medicinal Progenies. Alan R. Liss., Inc. New York. CONNOLLY, J.D. 1990. Monoterpenoids and sesquiterpenoids from the Uepaticae. In Zinsmeister, H.D. & Mues, R. (Eds.jj: Brvonhvtes. Their Chemistrv and Chemical Taxonomv. Clarendon Press. Oxford. CONSTANTINOU, A., KIGUCHI, K. & HUBERMAN, E. 1990. Induction of Differentiation and DNA Stranol Brealcage in Human HL-60 and K-562 Leukemia Cdl by Genistein. Cancer Research, 50 (24): 2618-2624. COOPER-DRIyER, G. 1980. The Bol. Club, 197: 116-127. role offlavonoids and related componnós in fern Systematics. Bulí. Torrev COOPER-DRIVER, G. & HAUFLER, C. 1983. The changing role of chemistry in fern classification. Fem Gaz., 12 (5): 283-294. CORDERO, R.M. 1990. Ensayo sobre estructura. uresencia de flavonoides y natrón de germinación en el musgo Encalvuta vulgaris Uedw. Memoria de Licenciatura (inédit.). Facultad de Biología. Universidad Complutense. Madrid. CORLEY, M.F.y. & CRUNDWELL, A.C. 1991. Additions and amendments lo the mosses of Europe and te Azores. J. Bryol., 16: 337-356. CORLEY, M.F.y., CRUNDWELL, A.C., DULL, R., HILL, MO. & SMITH, A.J.E. 1981. Mosses of Europe and Ihe Azores; mi annotaled lisí of species, wilh synonyms from Ihe recent literature. J Brvol., 11: 609-689. CRAWFORD, D.J. 1978. Flavonoid chemistry and angiosperm evolution. Bot. Review, 44: 431-456. CROSBY, MR. & MAGTLL, R.E. 1981. A Dictionary of Mosses. Missouri Botanical Garden. M¡ssour’. CRUM, HA. & ANDERSON, L.E. 1981. Mosses of Easlern North America (vol. 1). Columbia Univ. Press. New York. CUTTING, W.C., DREISBACU, RU. & MATSUSHIMA, F. 1953. Anliviral chemotherapy.-VI. Parenteral and other effecís of flavonoids. Stanf. med. Bulí., 11: 227-229. CUTTING, WC., DREISBACH, RU. & NEFF, B.J. 1949. Antiviral chemotherapy.- III. Flavones and related compounds. Stanf. med. Bulí., 7:137-138. CZAPEK, F. 1899. Zur Chemie der Zelímembranen bei den Laub- und Labermoosen. Flora 86~ 361-381. 318 .. CZYGAN, F.C. 1980. Pigments in Plants. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. DANI, H.M., SANGEET & MONICA. 1990. Anti-carcinogenicity of flavonoids and other plant pigments as studied by microsomal degranulation and micronucleus techniques. In Das, NP. (Ed.): Flavonoids in Biologv and Medicine III: Current issues in Flavonoids Research. National University of Singapore. DAS, N.P.(Edj. 1990. Flavonoids in Biology and Medicine III: Current issues in Flavonoids Research National University of Singapore. DAS, NP. & LAW, K.H. 1990. Production studies on Flavonoids. InDas, NP. (Ed.): Flavonoids in Biologv and Medicine III: Current issues in Flavonoids Research. National University of Singapore. DAVIDSON, A.J., HARBORNE, iB. & LONGTON, R.E. 1989. Identification of hydroxycinnaniic and phenolic acids in Mnium homum and Brachythecium rutabulum and their possible role in protection against herbivory. Journ. Uattori Bot. Lab., 67: 415-422. DEAK, G., MUZES, O., LANO, 1., NEKAN, K., GONZALEZCABELLO, R., GERGELY, P. & FEHER, J. 1990. Effects of two Biflavonoids on certain cellular Immune Reactions In vitro. Acta Phvsiologica Hungarica, 76<2): 113-118. DE LEY, 1. & KERSTERS, K. 1975. Biochemical evolution in bacteria. In Florkin, M. & Stotz, E.U. (Eds.): Comprehensive Biochemistrv. Elsevier. Amsterdam. DENNO. R.F. & MeCLURE, M.S. 1983. Variable Plant and Herbivores in Natural and Managed Systems Academic Press. New York. DOMON, B. & UOSTETTMANN, 1<. 1985. Mass spectrometric studies of underivatized polyphenolic glycosides. Phytochemistry, 24 (3): 575-580. DOSSAJI, S.F. &MABRY, T.J. 1975. Chromatographicand UV-visiblespectral identificationofBiflavonoids. Rey. Latinoamer. Ouím., 6: 37-45. EFIMENKO, O.M. & DZENIS, A.J. 1962. Composition chemique des sphaignes. Komul. Izuchen. Fisiol Aktivn. Veshchestv. Niz. Rasten., 57: 3786h-3787a. EICHER, 1. 1990. Recent results from ihe synthesis of chemical constituens of bryophytes. In Zinsmeister, UD. & Múes, R. (Eds.): Hryovhytes: their chemistrv and chemical taxonomv. Clarendon Press. Oxford. EKMAN, R. & KARUNEN, P. 1980. Steiyl and wax esters in Dicranum elongatum. Phytocheniistry, 19: 12434244. ELKTNS, ER., HEUSER, iR. & CHIN, U. 1988. Detectionofadulteration inselectec fruitjuices. Food. Sci Technol., 30: 317-341. ELLIGER, C.A., CHAN, B.G. & WAISS ir., A.C. 1980a. Flavonoids as Larval Growth Inhibitors. Naturwissenschaften, 67: 358-360. ELLIGER, CA., CUAN, B.O., WAISS, A.C., LUNDIN, R.E. & HADDON, W.F. 1980b. Glycosylflavones from Zea mays that inhibit insect development. Phytochemistry, 19: 239-247. ENGELUARDT, U. 1977. Hochdruckflússigkeitschromatograyhie (2nd. Ed.). Springer-Verlag. Ueidelberg. ENGLER, A. 1924. Dic Natúrlichen Pflanzenfamilien. 10 Band. Musci <Laubmoose> 1. Hálfte. Duncker & Humbolt. Berlin. 319 . , ERDTMAN, H. 1956. Organic chemistry and conifer taxonomy. In Tood, A. (Ed.): Persoectives in Organic Chemistry. Interscience. New York. ERICKSON, M. & MIKSCUE, G.E. 1974. On the ocurrence of lignin or polyphenols in some mosses mx liverworts. Phvtoche~stn, 13: 2295-2299 ESTEBANEZ, B. 1991. Apuntes para la biología del musgo Grimmia orbicularis Bruch ex Wils (Grimmiaceae. Grimnúales. Brvousida. Brvophvtat Memoria de Licenciatura (inédit.). Facultad de Biología. Universidad Complutense. Madrid. ESTEBANEZ, Ii., ABELLA, L., ALCALDE, M. & RON, E. 1992. On the typification of Bartramia spores. (Bryophyta, Musci). Comunicación presentada al Sth International PalynologicalCongress. Septiembre, 1992. Aix-en-Provence. Francia. ETIEVANT, P. & SCHILICH, P. 1988. Varietal and geographic classification pigments and flavonoid compounds. J. Sci. Food Aaric., 42: 39-54. of French wines in terms of FARMER, V.C. 1953. The lignin of Sphagnum. Research, 6 (8): A1-A3. FARMER, V.C. & MORRISON, Rl. 1964. Lignin in Sphagnum and Phragmites and in peats derived from these plants. Geochim. Cosmochim. Acta, 28: 1537-1546. FELIX, U. 1988. Fungi on bryophytes, a review. Botanica Helvetica, 98 (2): 239-269. FENSELAU, C. 1984. Fast Atom Hombardment and Middle Molecule Mass Spectrometry. .1. Nat. Prod., 47 (2): 215-225. FERREL, JE., CUANG-SING, P.D.G., LOEN, G., KING, R., MANSOUR, J.M. & MANSOUR, TE. 1979. Structure/activity of flavonoids as inhibitors of cyclic AMP phosphodiesterase and relationship to quantum chemical indexes. Molec. Pharmacol., 16 (2): 556-558. FLOWERS, 5. 1935. Bartramiaceae. In Grout, A. J. (Ed.): Moss Flora of North America North of Mexico (vol. 2). Uafner Pub. Co. New York. FOO, L.Y., UELM, R. &KARCHESY, J. 1992. [5’,5’]-Bisdihydroquercetin:a B-ringlinkedBiflavonoidfrom Pseudotsuga menziesii. Phvtochemistry, 31(4): 1444-1445. FREITAG, P., MUES, R., BRILL-FESS, C., STOLL, M., ZINSMEISTER, UD. & MARKUAM, K.R. 1986. Tsoorientatin 3’-O- sophoroside and 3’-O- neohesperidoside from the moss Plagionxnium affine. Phvtochemistry, 25: 669-671. FRITSCH, R. 1982. índex to plant chromosome numbers- Bryophyta. Rennum Vegetabile, 108 (i-xiv): 1-268. FUJITA, Y., UEDA, T. & ONO, T. 1956. Essential oils of liverworts 1. Essential oh of Bazzania pompeana. Nippon Kagazu Zasshi, 77: 400-401. GADEK, PA., QUINN, C.J. & ASHFORD, A.E. 1984. Localization of the biflavonoid fraction in plant leaves, with special reference to Agathis robusta (C. Moore ex 1< Muell) F.M. Bail. Aust. J. Bot. 32: 15-31. GALENSA, R. 1988. Detection of Adulterations of Fruit Juices by HPLC-Determination of Flavonoids. GIl Supylem. Lebensmitt., 4:18-25. GALENSA, R. & HERRMANN, K. 1980. Analysis of flavonoids by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 189: 217-224. 320 :, GAUDETTE, D.C. & HOLUR, EJ. 1990. Effect of genistein, a tyrosine Kinase inhibitor, on V4 6619 - induced phosphosinositidephosphorylation inhuman platelets. Biochem. Biophys. Res. Comniun., 170 (1): 238-242. GEIGER, U. 1985. The identificationofphenolic compounds by colour reactions. In Sumere, C.F. & Lea, P.J. (bis.): Ann. Proceed. of tite Phvtochemical Societv of Europe : Tite Biochemistrv of Plant Plienolies (vol. 25). Clarendon Press. Oxford. GEIGER, U. 1990. Biflavonoids in bryophytes. In Zinsmeister, UD. & MUes, R. (Eds.): Eryphytes. Their Chemistrv and Chemical Taxonomv. Clarendon Press. Oxford. GEIGER, U., ANHUT, 5. & ZINSMEISTER, UD. 1988. Biflavones from some mosses. Z. Naturforsch. 43c: 1-4. GEIGER, U. & BOKEL, M. 1989. The biflavonoid pattern of Philonotis fontana (Uedw.) Brid. (Bartrarniaceae). Z. Naturforsch., 44c: 559-562. GEIGER, U. &MARKHAM, K.R. 1992. Campylopusaurone, mx auronoflavanonebiflavonoid from the mosses Campylopus clavatus and Campylopus holomitrium. Phvtochemistrv, 31(12): 4325-4328. GEIGER, H. & QUINN, C.J. 1975. Biflavonoids. In Harborne, J.B., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): Flavonoids. Chapman & Hall. London. GEIGER, H. & QUINN, C.J. 1982. Biflavonoids. In Harborne, J.H. & Mabry, T.J. (Eds.): TIte Flavonoids Advances in Research. Chapman & Hall. London. GEIGER, II. & QUINN, C.J. 1988. Biflavonoids. In Harbome, iB. (Ed.): The Flavonoids: Advances in Research since 1980. Chapman & Hall. London. GEIGER, U. & SCUWINGER, G. 1980. Felddesorptions Massenspektrometrie und thermische fragmentiening von Flavonoidglykosiden. Phvtochemistry, 19: 897-901. - GEIGER, U., STEIN, W., MUES, R. & ZINSMEISTER, H.D. 1987. Bryoflavone and heterobryoflavone. Two new isoflavone-flavone dimers from Biyum capillare. Z. Naturforsch., 42c: 863-867. GEIGER, U., SEEGER, T., HAUN, U., ZINSMEISTER, UD., MARKUAM, K. & WONG, H. 1993a. ‘U NMR Assignments in Biflavonoid Spectra by Proton-Detectec C-H Correlation. Z. Naturforsch., 48c: 821-826. GEIGER, U., VOIGT, A., ZINSMEISTER, H.D., LOPEZ-SAEZ, lA., PEREZ ALONSO, M.J. & VELASCO NEGUERUELA, A. 1993b. The Biflavones of Dicranum scoparium (Dicranaceae). L Naturforsch., 48c: 952. GELLERMAN, iL., ANDERSON, W.H., RICHARDSON, D.G. & SCHLENK, U. 1975. Distribution of arachidonic and eicosapentaenoic acid in tIte lipids of mosses. Biochem. Biovhvs. Acta, 388: 277-290. GELLERMAN, J.L, ANDERSON, W.U. & SCHLENK, H. 1972. Highly unsaturated lipids of Mnium, Polytrichum, Marchantia and Matteuccia. Bryolouist, 75: 550-557. GERAN, R.I., GREENBERG, N.U., MAC DONALD, MM., SCUUMACHER, A.M. & ABBOTT, B.J. 1972. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems (3rd. ed.). Cancer Chemotheranv Reo., Part. 3 (3): 1-103. USDUEW. Bethesda. GERSUENZON, J. & MABRY, T.J. 1983. Secondary metabolitesandthehigherclassificationofangiosperms. NordicJ. Bot., 3: 5-34. 321 , GUISALBERTI, EL. 1979. Propolis a rewiew. Bee World, 60: 59-84. GIANASSI, D.E. & CRAWFORD, D.J. 1986. Biochemical Systematics. II. A reprise. In Uecht, M.K., Wallace, B. & Prance, G.T. (Eds.): Evolutionary Biology (vol. 20). Clarendon Press. London. GIBES, R.D. 1974. Chemotaxonomy of P1owerin~ PlanIs (4 vols.). McGrill-Queens liniv. Montreal. GNANAMANICKAM, S.S. & MANSFIELD, J.W. 1981. Selective toxicity of wyerone and other phytoalexins to gram-positive bacteria. Phytochemistry, 20 (5): 997-1000 GOEBEL, K. 1930. Organographie der Pflanzen. G. Fisher Verlag. Jena. GORNALL, R.J., BOUM, B.A. & DAHLGREN, R. 1979. The distribution of flavonoids in tIte angiosperms. Bot. Notiser, 132: 1-30. GRASSO, SM. & SCHEIRER, D.C. 1981. Scanning electron microscopic observation of a moss-fungus association. Bryologist, 84: 384-530. GREGER, U. 1985. Vergleichende Phytochemie als biologische Disziplin. Plant Syst. Evol., 150: 1-13. GRIEFIN III, D. 1990. The use of axillary hairs in the taxonomy of two neotropical Bartramiaceae. J. Bryol. 16: 61-65. GRIFFIN III, D. & ACUÑA, M.L. 1983. Spore ornainentation studies in Anacolia (Musci;Bartramiaceae). Cryp. Bryol. Lichénol., 4:155-160. GRIFFIN III, D. & BUCK, W.R. 1989. Taxonomic and Phylogenetic Studies on tIte Bartrainiaceae. Brvoloaist 92 (3): 368-380. GRIMSLEY, N.U., GRIMSLEY, J.M. & HARTMAN, E. 1981. Fatty acid composition of mutants of the moss Physcomitriella patens. Phytochemistrv, 20: 1519-1524. GROSS, G.G. 1981. Phenolic Acids. In Conn, E.E. (Ed.): The Biochemistry of Plants (vol. 7). Academic Press. New York. GUNTUER, U. 1983. NMR-Spektroscopie. Georg Thieme Verlag. Stuttgart. GUPTA, KG. & SINGU, B. 1971. Ocurrence of antibacterial activity in moss extracts. Res. Bulí. Puniab Univ. Sci., 22 (1/2): 237-239. GUTTNER, J., VECKENSTEDT, A., HEINECKE, H. & PUSZTAI, R. 1982. Effect of quercetin on the course of mengo virus infection in immunodeficient and normal mice. A histologic study. Acta Virol. 26: 148-155. UABERLANDT, G. 1886. Beitráge zur Anatomie und Physiologie der Laubmoose. .lahrb. Wissensch. Bot. 17: 359-498. UAUN, U. 1993. Dissertation (en prensa). Universitát des Saarlandes. Saarbríiicken. UAUN, U., GEIGER, U. & ZINSMEISTER, H.D. 1994. Phvtochemistry (en prensa). HARBORNE, J.B. 1967. Comnarative Biochemistrv of tite Flavonoids. Academic Press. London. HARBORNE, J.B. 1975. Tite Biochemical Systematics of Flayonoids. In Uarborne, J.B., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): The Flavonoids. Chapman & Hall. London. 322 . HARBORNE, J.B. 1977. Flavonoids and the evolution of tIte Angiosperms. Bichem. Syst. Ecol., 5: 7-22. HARBORNE, J.B. 1984. Phvtochemical Methods. Chapman & Hall. London. UARBORNE, J.B. 1986. Nature, distribution and function of plant flavonoids. In Cody, y., Middleton Jr., E. & Harborne, J.B. (Eds.): Plant Flavonoids in Biologv and Medicine. Alan R. Liss Inc. New York. HARBORNE, J.B. 1988a. TIte Flavonoids- Advances in Research since 1980. Chapman & Hall. London. UARBORNE, J.B. 1988b. Introduction to Ecolo~ical Biochemistry. (3’ Ed.). Academic Press, London. HARBORNE, J.B. 1993. (Ed.). TIte Flavonoids. Advances inResearch since 1986. Chapm~ &Hail. London. UARBORNE, J.B. & MABRY, T.J. 1982. TIte Flavonoids. Advances in Research. Chapman & Hall. London. HARBORNE, J.B., MABRY, T.J. & MABRY, II. 1975. The Flavonoids. Chapman & Hall. London. HARBORNE, J.B. & TURNER, B.L. 1984. Plant chemosystematics. Academic Press. London. [JARDíN,J.M. & STUTTE, CA. 1980. Analysis of phenolic ami flavonoid conipounds by High-Pressure Liquid Chromatography. Anal. Biochem., 102: 171-175. HARTMANN, E., BEUTELMANN, P., VANDEKERKUOVE, O., EULER, R. & KOHN, G. 1986. Moss cdl cultures as sources of arachidonic and eicosapentaenoic acids. FEBS Letters, 198: 51-55. UARTWELL, J.L. 1971. Plants used against cancer. A survey. Llovdia, 34: 410-411. HAUTEVILLE, M., CUADENSON, M. & CHOPIN, J. 1973. Un nouveau type de flavonoides naturcís: les dihydroxy-2,5 flavanones, 1. Synthése du dihydroxy-2,6-méthoxy-4 dibenzoylméthane des bourgeons de Populus nigra et mise en évidence de sa structure cyclique. Bulí. Soc. Chem. France, 5:1781-1788. UEBANT, CH. 1974. Studies on tIte development of tIte conducting tissue-system in tIte gametophytes of some Polytrichales. II. Development and structure at maturity of tIte Itydroids of the central strand. Joum Hattori Bot. Lab., 38: 565-607. UEDENAS, L. 1991. Ekonomisk bryologi Tidskr., 85: 347-354. - en óversikt óver mossornas praktiska anvándbarhet. Svensk Bot HEDIN, PA. & WAAGEA, S.K. 1986. Roles of Flavonoids in Plant resistance to insects. In Cody, V., Middleton Jr., E. & Harborne, J.B. (Eds.): Plant Flavonoids in Biology and Medicine. Alan R. Liss, Inc. New York. HEGNAUER, R. 1962-1986. Bryophyta. In Uegnauer, R. (Ed.): Chemotaxonomie der Pflanzen (7 vols.). Birkhafiser. Basel. UEGNAUER, R. 1986. Phytochemistry and plant taxonomy mx essay on the chemotaxonomy of higher plants. Phvtochemistry, 25: 1519-1535. - UEROUT, V. 1990. Diterpenes and ItigIter terpenes from biyophytes. In Zinsmeister, UD. & Mijes, R. (Eds.): Brvophytes: Their Chemistrv and Chemical Taxonomv. Clarendon Press. Oxford. HERZEELDER, U. 1921. Beitrag zur Frage der Moosfárbungen. Beih. Bot. Centralblatt., A 38: 355-400. UERZOG, F. 1982. Dar Vorkommen von Flavonoiden in den Laubmoos-ordnungen Hvpnales. Leskeo-ET1 w167 11 Amblvstegiales und Sphagnales. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. 323 . UERZOG, T. 1909. Beitráge zur Laubmoosflora von Bolivia. Beih. Bot. Centralbí., 26: 74. UERZOG, T. 1926. Geographie der Moose. Gustav Fischer Verlag. Jena. HIROHAMA, T. 1977. Spore morphology of bryophytes observed by scarming electron microscope, 11. Bartramiaceae. Bu!!. Nar. Sci. Mus., B 3: 37-44. UIROUAMA, T. & IWATSUKI, Z. 1980. Surface ornamentation of rhizoids of tite species of Bartraniiaceae (Musci). Journ. Uattori Bot. Lab., 48: 259-275. UORVATH, J. 1977. New artificial host and non-host of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses. 1. Historical review. Acta Phytovathol. Acad. Sci. Uuna., 12: 177-214. UOSTETTMANN, 1<. & UOSTETTMANN, M. 1982. Isolation techniques for Flavonoids. In Uarbome, J.B. & Mabry, T.J. (Eds.): The Flavonoids: Advances in Research. Chapman & Uall. London. HOWE, J. & JARMAN, M. 1985. New techniques for mass spectometry of natural products. In Proaress in the Chemistry of Oraanic Natural Products (vol. 47). Springer-Verlag. New York. HUNECK, 5. 1963. Zur Chemie des Moose. 1. Dic erstrnalige Jso]iemng cines natñrlich vorkommendcn Azulens aus Calypodeia trichomanis (L.) Corda. Z. Naturforsch., 18b: 1126. UUNECK, 5. 1967. Inhaltsstoffe der Moose. IV. Die Isolierung von Drimenol aus Bazzania trilobata (L.) Lindberg. Z. Naturforsch., 22b: 462-463. HUNECK 5. 1969. Recent literature on the chemistry of liverworts and mosses. Brvol. LicItenol. 5: 49-51. HUNECK, 5. 1983. Chemistry and Biochemistry of Bryophytes. In: Schuster, R.M. (Eds.): New manual of Brvologv. The Hattori Botanical Garden. Nichinan. lEVEN, M., VANDEN BERGUE, DA., MERTENS, F., LAMMENS, E. & VLIETINCK, A.J. 1979. Screening of higIter plants for biological activities. 1.: Antimicrobial activity. Planta Medica, 36: 311321. INGUAM, J.L. 1983. Naturally Ocurring Isoflavonoids (1855-1981). In Herz, W., Grisebach, U. & Kirby, G.W. (Eds.): Proaress in tIte Chemistry of Organic Natural Products (vol. 43). Springer-Verlag. New York. IWU, M.M. 1985. Antihepatoxic constituents of Garcinia kola seeds. Exuerientia, 41(5): 699-700. IWU, M.M. 1986. BiflavonoidsofGarcinia: PItarmacological andBiologicalActivities. InCody, V., Middleton Jr., E. & Harborne, J.B. (Eds.): Plant Flavonoids in Biology aud Medicine: BiocItemical Pitarmacological and Structure-Activity Relationshius. Alan R. Liss, Inc. New York. JACOBS, M. & RUBERY, PU. 1988. Naturally occurring auxin transport regulators. Science, 241: 346-349. JAY, M., GONNET, i.F., WOLLENWEBER, E. & VOIRIN, B. 1975. Sur l’analyse qualitative des aglycones flavoniques dans une optique chimiotaxinomique. Phytochemistry, 14: 1605-1612. JUNG, M. 1993-94. Dissertation (en prensa). Universitát des Saarlandes. Saarbríicken. JURD, L. 1962. Spectral properties of flavonoid compounds. In Geissmann, TA. (Eds.): The Chemistrv of Flavonoid Comuounds. Pergamon Press-Macmillan. New York. KABIERSCU, W. 1936. Studien Uber die ostasiatischen Arten einiger Laubmoosfainilien (MniaceaeBartramiaceae). Hedwigia, 76: 1-94. 324 , .. KABIERSCU, W. 1937. Studien Uber dic ostasiatischen Arten einiger Laubmoosfamilien II (Rhizogoniaceae, Bartramiaceae, Aulaconiniaceae, Meeseaceae). Uedwigia, 77: 71-136. KALINOWSKI, HO., BERGER, 5. & BRAUN, 5. 1984. 3C-NMR Suektroscouie (S-399). Thieme Verlag. Stuttgart. KAWAI, 1. 1982. Systematic studies on tIte conducting tissue of tIte gametophyte in Musci (12). Anatomical characteristics of stems in some species of Bartramiaceae. Science Rep. Kanazawa Univ., 26 (2): 3150. KAWAT, 1. 1989. Systematic Studies on the conducting tissue of the gametophyte in Musci (16). Relationships between tIte Anatomical Characteristics of the stem and tIte Classification system. Asiau Jour. Pl. Sci. 1(2): 19-52. KINGSTON, D.G.I. 1979. Uigh Performance Liquid ChromatograpIty of Natural Products. J. Nat. Prod., 42: 237-260. KINZEL, U. & WALLAND, A. 1966. Zum Vorkommen von Shikimisáure bei Moosen und Farnen. Z Pflanzenyhysiol., 54: 371-374. KOHN, G., DEMMERLE, 5., VANDEKERKHOVE, O., BEUTELMANN, P. & HARTMANN, E. 1987. Distribution and chemotaxonomic significance of acetylenic fatty acids in mosses of tIte Dicranales. Phvtochemistrv, 26: 2271-2275. KONIG, B. & DUSTMAN, J.H. 1983. Investigation on tIte composition and possible virostatic effects of propolis of varied geographic provenance. Apidologie, 14: 278-280. KOPONEN, A., KOPONEN, T., PYYSALO, U., UIMBERG, K. & MANSIKKAMAKI. 1990. Composition of volatile compounds ir Splachnaceae. In Zinsmeister, H.D. & Miles, R. (Eds.): Bryophytes: TIteir Chemistrv and CItemical Taxonomy. Clarendon Press. Oxford. KOPONEN, T. & N¡LSSON, E. 1977. Flavonoid pattems and species pairs in Plagiomnium aud Rhizomnium (Mniaceae). Brvophytorum Bibliotheca, 13: 411-425. KOSKIMIES-SOININEN, K. & NYBERG, II. 1987. Effects of temperature and light on tIte lipids of Sphagnum magellanicum. Phvtochemistrv, 26: 2213-2222. KOZLOWSKI, A. 1921. Sur la saponarmne chez le Mnium cuspidatum. C.R. Acad. Sci. Paris, 173: 429-431. KREBS, KG., HEUSSER, D. & WIMMER, H. 1967. Sprúhreagentien. No. 263. In Stahl, E. (Eds.): Dúnnschichtchromato grauhie (vol. 2). Springer Berlin. KUBITZKI, K. 1987. Phenylpropanoid metabolism in relation to land plant origin and diversification. J. Plaut Physiol., 131: 17-24. KUBITZKI, K. & GOTTLIEB, O.R. 1984. Phytochemical aspects of angiosperm origin and evolution. Acta Bot. Neerí., 33: 457-468. KUBO, 1., KLOCKE, JA., MATSUMOTO, T. & NAOKI, U. 1983. Identification of two insect growth inhibitory biflavonoids in Podocarpus gracilior. Rey. Latinoam. Ouím., 14 (2): 59-61. LAUCK, y. 1984. Flavonoide in der Gattuna Rhizomnium. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandens. Saarbrúcken. 325 .. LEE, K.H., TAGAUARA, K., SUZUKI, U., WU, R.Y., HARUNA, M., HALL, I.H., UUANG, U.CU., ITO, K., JIDA, T. & LAI, J.S. 1981. Antítemor agents, 49. Tricin, Kaempferol-3-0-B-Dglucopyranoside and (±)-nortrachelogenin,antileukemic principIes from Wikstroemia indica. J. Nat Prod., 44 (5): 530-535. LEIDINGER, G. 1984. Flavonoidchemische Untersuchunaen in der Ordnung Bryales unter besonderer Berticksichtinaung von Rhizornnium magnifolium. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. LEVIN, DA. 1971. Plant phenolics: An ecological perspective. Amer. Naturalist, 105:157-181. LEWIS, NG. & VAMAMOTO, E. 1990. Lignin: ocurrence, biogenesis and biodegradation. Annu. Rey. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., 41: 455-496. LILJENBERG, C. & KARUNEN, P. 1978. Changes in the content of phytyl and geranylgeranyl esters of genninating Polytrichum commune spores. Phvsiol. PlanL, 44: 369-372. LIMPRICHT, KG. 1893. Meeseaceae. In Die Laubmoose Deutschlands Oesterreichs und der Schweiz (vol. 2). Springer-Verlag. Berlin. LIN, Y.M. & CHEN, F.C. 1975. TLC Rf values of Biflavonoids and titeir methylated derivatives. J Chromatogr., 104: D33-D34. LINDBERG, G., OSTERDAHL, B.G. & NILSSON, E. 1974. Chemical studies on BryopItytes: 5’-8”Biluteolin, a new biflavone from Dicranum scoparium. Chem. Script., 5: 140-144. LINDBERG, S.L. 1879. Muscori Scandinavici in Svstemate Novo Naturali Disoositi. Uppsala. LLORET, F. 1986. La vegetación briofítica rupícola en relación con los gradientes altitudinal e hídrico en el Montseny (Barcelona). Orsis, 2: 55-70. LLORET, E. 1987. Efecto de la altitud sobre la fenología de briófitos en el Pirineo Oriental. Anales Jard. Bot Madrid, 43 (2): 203-215. LOUMANN, C.E.J. 1903, Beitrag zur CItemie und Biologie der Lebermoose. Inaugural Dissertation, 1-42. Universitát Jena. LOPEZ-SAEZ, JA. 1992. Contribución al estudio de trazadores puimiosistemáticos en especies ibéricas del género Bartramia Hedw. (Bartramiaceae Schwaegr.. Brvovhytat Memoria de Licenciatura (inédit.). Facultad de Biología. Universidad Complutense. Madrid. LOPEZ-SAEZ, JA., PEREZ ALONSO, Mi. & VELASCO NEGUERUELA, A. 1994a. Flavonoids of Selaginella denticulata and 5. selaginoides. Fitoterania (en prensa). LOPEZ-SAEZ, JA., PEREZ ALONSO, M.J. & VELASCO NEGUERUELA, A. 1994b. Biflavonoides of Selaginella denticulata growing in Spain. Z. Naturforsch., 49c: 267-270. LOPEZ-SAEZ, JA., PEREZ ALONSO, M.J. & VELASCO NEGUERUELA, A. 1994c. The Biflavonoid Pattem of Selaginella selaginoides. Z. Naturforsch., 49c: 265-266. LOWRY, J.B., JALAN, A. & LEE, D.W. 1983. TIte origin of land plants: a reply to Swain. Taxon, 32: 101103. MABRY, T.J. & MARKHAM, K.R. 1975. Mass Spectrometry of Flavonoids. In Harborne, J.B., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): The Flavonoids. Chapman & Hall. London. 326 . . , MABRY, T.J., MARKHAM, K.R. & THOMAS, M.B. 1970. The Svstematic Identification of Flavonoids Springer-Verlag. Berlin. MADSEN, G.C. & PATES, AL. 1952. Ocurrence of antimicrobial substances in chlorophyllose plants growing in Florida. Bot. Gaz., 113: 293-300. MAGILL, RE. 1987. Bryophyta. ¡‘art 1 Mosses. Fascicle 2 (Gigaspermaceae-Bartraniiaceae). In Leistner, O.E. (Ed.): Flora of Souther Africa (Pan. 1(2)). Pretoria. MANDICH, L., BITTNER, M., SILVA, M. & BARROS, C. 1984. Phytochemical screening of medicinal plants studies of flavonoids. Rey. Latinoanier. Ouím., 15 (2): 80-82. MARKUAM, K.R. 1975. Isolation Techniques for Flavonoids. In Harborne, IB., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): TIte Flavonoids. Chapman & Hall. London. MARKHAM, K.R. 1982. Tecimipues of Flavonoid Identification. Biological Techniques Series. Academic Press. London. MARKUAM, K.R. 1988. Distribution of flavonoids in tIte lower plants aud its evolutionary significance. In Harborne, J.B. (Ed.): The Flavonoids. Advances in Research since 1980. Chapman & Hall. London. MARKUAM, K.R. 1990. Bryophyte flavonoids, tIteir structures, distribution and evolutionaxy significance. In Zinsmeister, UD. & Mlles, R. (Eds.): Bryoohvtes. Their Chemistry and Chemical Taxonomy Clarendon Press. Oxford. MARKHAM, K.R. , ANDERSEN, O.M. & VIOTTO, ES. 1988. Unique biflavonoids types from the moss Dicranoloma robustum. Phytochemistry, 27: 1745-1749. MARKHAM, K.R., CHARI, VM. & MABRY, T.J. 1982. Carbon-13 NMR Spectroscopy of flavonoids. In Harbome, IB. & Mabry, Ti. (Eds.): TIte Flavonoids-Advances in Research. CItapmau & Uall. London. MARKUAM, K.R. & GEIGER, U. 1993. ‘U-NMR Spectroscopy of flavonoids and their glycosides in hexadeuteriomethylsulfoxide. In Uarborne, J.B. (Ed.): The Flavonoids - Advances in research since 1986. Chapman & Hall. London. MARKHAM, K.R. & GIVEN, DR. 1988. The major flavonoids of mx Antartic Bryum. PhvtocItemistry, 27: 2843-2845. MARKUAM, K.R. & MABRY, T.J. 1968. A procedure for the ultraviolet spectral detection of orthodihydroxyl groups in flavonoids. Phvtochemistrv. 7: 1197-1200. MARKHAM, K.R. & MABRY, T.J. 1975. Ultraviolet visible and Proton Magnetic Resonance Spectroscopy of Flavonoids. In Harborne, J.B., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): The Flavonoids. Chapman & Hall. London. MARKUAM, K.R. & MOORE, N.A. 1980. Comparative flavonoid glycoside biochemistry as a chemotaxonomic tool in tite subdivision of tIte classical ‘genus” Lycopodium. Biochem. Svst. Ecol. 8:17-20. MARKHAM, K.R., MOORE, N.A. & PORTER, L.J. 1978. Changeover in flavonoid pattern accompagning reproductive structure formation in a Bryophyte. Phvtochemistrv, 17: 911-913. MARKAHM, K.R. & PORTER, L.J. 1969. Flavonoids in tIte green algae (ChloropItyta). Phvtochernistrv, 8: 1777-1781. 327 MARKHAM, K.R. & PORTER, L.J. 1978a. Chemical constituents of Bryophytes. In Reinhold, L., Harbome, iB. & Swain, T. (Eds.): Progress in Phvtochemistrv (vol. 5). Pergarnon Press. Oxford. MARKUAM, K.R. & PORTER, L.J. 1978b. Production of aurone by bryophytes in tIte reproductive phase. Phytochemistrv, 17: 159-160. MARKHAM, K.R., PORTER, Li. & CAMPBELL, E.O. 1977. The usefulness of flavonoid characters in studies of te taxonomy and phylogeny of liverworts. Brvoohytorum Bibliotheca, 13: 387-398. MARKUAM, K.R., PORTER, L.J., MUES, R., ZINSMEISTER, H.D. & BREHM, R. 1976. Flavonoid variation in tIte Liverwort Conocephalum conicum: evidence for geographic races. Phytochemistry, 15: 147-150. MARKHAM, K.R., SHEPPARD, C. & GEIGER, 1-1. 1987. 13-C NMR studies of some naturally ocurring amentoflavone and hinokiflavone biflavonoids. PhytocItemistrv, 26: 3335-3337. MARKHAM, K.R. & WILSON, R.D. 1988. Paper chromatographie mobilities of a range of flavone and flavonol O-glycosides. PhytocItem. Bulí., 20 (1): 8-12. MARKHAM, K.R. & WILSON, R.D. 1989. Paper cbromatograpbic mobilities of a range of flavonoid cglycosides. Phytochem. Bulí., 21(1): 2-4. MARSILI, A. & MORELLI, 1. 1968. Triterpenes from mosses-l. TIte ocurrence of 22(29)-hopene in Thamnium alopecurum (L.) Br. eur. ssp. eu-alopecurum Giac. Phvtochemistry, 7: 1705-1706. MARSILI, A. & MORELLI, 1. 1970. Triterpenes from mosses. II. Triterpenes from Thuidiumtamariscifolium. Phytochemistrv, 9: 651-653. MARSILI, A., MORELLI, 1., BERNARDINI, C. & FACCUIANI, M. 1972. Constituents of some mosses. Phytochemistrv, II: 2003-2005. MARSILI, A., MORELLI, 1. & IORI, AM. 1971. Triterpenes from mosses. III. 21-hopene and some other constituents of Pseudoscleropodium purum. Phytochemistry, 10: 432-433. MATTERI, CM. 1968. Morfología del protonema y formación de yemas en Philonotis (Bartramiaceae). ~ Mus. Arg. Cienc. Nat. Bernadino Rivadavia, 3 (8): 255-265. McCLEARY, JA., SYPUERD, P.S. & WALKINGTON, D.L. 1960. Mosses as possible sources of antibiotics. Science, 131:108. McCLEARY, JA. & WALKINGTON, DL. 1966. Mosses and antibiosis. Rey. Bryol. Lichénol., 34: 309-314. McCLURE, i.W. 1975. Physiology and Functions of Flavonoids. In Uarborne, J.B., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): The Flavonoids. Chapman & Hall. London. McCLURE, J.W. 1986. Physiology of flavonoids in plants. In Cody, V., Middleton Jr., E. & Harbome, J.B. (Eds.): Plaut Flavonoids in Biology and Medicine. Alan R. Liss, Inc. New York. McCLURE, J.W. & MILLER, H.A. 1967. Moss chemotaxonomy. A survey for flavonoids and titeir taxonomie implications. Nova Uedwigia, 14: 111-125. McNAIR, J.B. 1935. Angiosperm phylogeny on a chemical basis. Bulí. Torr. Bot. Club, 62: 515-532. MEIER, B. & STICUER, 0. 1986. The use of a high speed spectro photometric detector (diode array) in tIte UPLC analysis of medicinal plants. Pharm. Ind., 48: 87-91. 328 , MELCUERT, T.E. & ALSTON, R.E. 1965. Flavonoids from the moss Mnium affine Bland. Science, 150: 1170-1 171. MELTS, ML. & MacGREGOR, iT. 1981. Note. Mutat. Res., 88: 317. MENTLEIN, R. & VOWINICEL, E. 1984. Die roten Wandfarbstoffe des Torfmooses Sphagnum rubellum. Liebias Ann. CItem., 3:1024-1035. MIKSCHE, G.E. & YASUDA, 5. 1978. Lignin of «giant» mosses aud some related species. Phytochemistry 17: 503-504. MITSUYA, U. & BRODER, 5. 1986. Inhibition of the in vitro infectivity and cytopathic effect of human Tlymphotrophic virus type 111/ lymphoadenopathy-associated virus (HTLV-III/LAV) by 2’ ,3’dideoxynucleosides. Proc. Natí. Acad. Sci. USA, 83: 1911-1915. MITSUYA, U., MATSUKURA, M. & BRODER, 5. 1987. Rapid in vitro system for assessing activity of agents against UTLV III/LAV. In Broder, 5. (Ed.): AIDS: Modem concepts and therapeutic challenges. Marcel Dekker Inc. New. York. MITSUYA, II., WEINHOLD, K.J., FURMAN, PA., CLAIR, M.1-1.ST., LEIIREMAN, S.N., GALLO, RL., BOLOGNESI, D., BARRY, D.W. & BRODER, 5. 1985. 3’-azido-3’-deoxythymidine (BW A509U): An antiviral agent that inhibits the infectivity and citopathic effect of humna T-lymphotropic virus type II1/lymphoadenopathy-associated virus in vitro. Proc. Natí. Acad. Sci. USA, 82: 7096. MOLISCH, C. 1911. Uber das Vorkommen von Saponarin bei einem Lebermoss (MadotIteca platiphylla). ~L Deutsch. Bot. Ges., 29: 478-481. MONTAGNIER, L. 1993. SIDA: Los ItecItos. La esveranza. Selección OMS-CCE. Instituto Pasteur. Paris. MORI, A., NISUINO, C., ENOKI, N. & TAWATA, 5. 1987. Antibacterial activity and mode of action of plant flavonoids againsí Proteus vulgaris and Staphylococcus aureus. Phytochemistry, 26 (8): 22312234. MUES, R. 1985. The Relationship between Taxonomy aud CItemical Data. Bryological Times, 33: 1-3. MUES, R. 1988. Thin-layerchromatography (TLC) of flavonoidcompounds frombryophytes. In Glime, T.M. (Eds.): Methods in Brvologv. Hattori Bot. Lab. Nichinan. MUES, R. 1989. Chemosystematics of Bryophytes. In Das, NP. (Ed.): Proceedings of 3rd. International Symyosium on Flavonoids in Biologv & Medicine. Current Issues in Flavonoid Research. National University of Singapore. MIJES, R. 1990. TIte significance of flavonoids for tIte classification of bryophyte taxa at different taxonomie rank. In Zinsmeister, UD. & Mues, R. (Eds.): Brvovhytes. Their Chemistrv and Chemical Taxonomv. Clarendon Press. Oxford. MUES, R., LEIDINGER, O., LAUCK, V., ZINSMEISTER, UD., KOPONEN, 1. & MARKHAM, K.R. 1986. Rhizomniuni magnifolium and R. pseudopunctatum, tIte first Mosses to Yield Flavone Glucuronides. Z. Naturforsch., 41e: 971-975. MUES, R. & ZINSMEISTER, UD. 1988. The Chemotaxonomy of Phenolic Compounds in Bryophytes. Hattori Bot. Lab., 64: 109-141. MULLER, C. 1874. Muscinovo-granatenses Wallisianiadjectis nonnullisaliis muscis novis andinis vel tropicoAmericauis vel australasiacis. Linnaea, 38: 572-620. 329 . . MULLER, C. 1901. Genera Muscorum Frondosorum. Clases Shistocarporum. Cleistocarnorum. SteaocarDorum comníectentia. excentis Orthotrichaceis et Pleurocarois. Leipzig. MÚLLER, D. & FLEURY, LP. 1991. A New Strategy for the synthesis of Biflavonoids via Arylboronic Acids. Tetrahedron Letters, 32 (20): 2229-2232. MULLER, K. 1905. Beitrag nr Kenntnis der átherischen Ole bei Labermoosen. Uoppe-Seyler’s. Z. Phvsiol Chem., 45: 299-319. NAVASQUILLO, A. 1992. La Naturaleza: el mejor laboratorio farmaceútico y cosmético de todos los tiempos. En M.A.P.A. (Ed.): 1 Jornadas Ibéricas de Plantas Medicinales. Aromáticas MAPA-INIA. Madrid. y de Aceites Esenciales NEUIRA, K. 1983. Spore germination, protonema development and sporeling development. In Sehuster, R.M. (Ed.): New Manual of Bryology (vol. 1). Nichinari. NEU, R. 1957. Chelate von Diarylborsáuren mit aliphatiscIten Oxyalkylaminen als Reagenzien fúr den Nachweis von Oxyphenyl-benzo-~-pyronen. Naturwissenschaften, 44: 181-184. NIEMANN, 0.). 1980. Phenolics from Larix Needies. XV. IIihg-performance Liquid Cbromatography of L. gmelinii Flavonoids. Z. Naturforsh., C 35: 514-515. NIEMANN, G.J. & KOERSELMAN-KOOY, J.W. 1977. Phenolics from Larix needíes. XIII. Analysis of main Larix flavonoids by high-pressure liquid chromatography. Planta Medica, 31: 297-301. NIEMANN, G.J. & VAN GENDEREN, H.H. 1980. Chemical relationships between Pinaceae. BioeItem. Syst Ecol., 8: 237-240. NIENUAUS, F. 1985. Viren. Mykovlasmen and Rickettsien (UTE No. 1361). Ulmer. Stuttgart. NIKLAS, K.J. & GIANASSI, DE. 1978. Angiosperm paleobiochemistry of tIte succor creek flora (miocene) Oregon, USA. Am. J. Bot., 65 (9): 943-952. NILSSON, E. 1967. Moss pigments. 7. Preliminaiy investigations of tIte violet pigments in Sphagnum nemoreum. Acta Chem. Scand., 21: 1942-1951. NILSSON, E. 1969. Moss pigments.9.Scutellarin-glucoside in Bryum weigelii. Arkiv Kemi, 31: 475-480. NILSSON, E. 1973. Studies of flavylium compounds. 8. Application of proton NMR spectroscopy to tIte analysis of anthocyanidin pigments. Chemica Scripta, 4:1-7. NILSSON, E. & BENDZ, G. 1973. Flavonoids in bryophytes. In Bendz, G., Santensson, 1. & RunnstrómReio, V. (Eds.): Nobel 25 Symoosium (1973) Chemistrv in Botanical Clasaification. Academic Press. New York-London. NILSSON, E., LINDBERG, 0. & OSTERDAUL, BO. 1973. Chemical studies on Bryophytes. A new branched apigenin-7-triglycoside from Dicranum scoparium. Chemica Scrinta, 4: 66-68. NILSSON, E. & MARTENSSON, 0. 1971. Chemical studies on bryophytes. 11. (-)-16Ó-Uydroxy-kaurane from Saelania glaucescens (Uedw.) Broth. Acta Chem. Scand., 25: 1486-1487. NILSSON, E. & TOTTMAR, 0. 1967. Moss pigments. 5. Studies of phenolic ceIl wall polymers in Sphagnum nemoreum. Acta CItem. Scand., 21: 1558-1566. NISUIDA, Y. 1978. Studies on the sporeling types in mosses. Joum. Uattori Bot. Lab., 44: 371-454. 330 .,. NORRIS, Dii. & KOPONEN, T. 1989. Note. Acta Brvolichenologica Asiatica, 1:1. OGISO, A., SATO, A., SATO, 5. & TAMURA, C. 1972. Novel macrocyclic flavonoid glycosides, toxic components from Leucothoe keiskei. Tetrahedron Letters, 30: 3071-3074. OSTERDAUL, B.G. 1976. CItemical studies on Bryophytes. 17. A new Luteolin Tetraglycoside from Uedwigia ciliata. Acta Chem. Scand., H 30: 867-870. OSTERDAHL, B.G. 1978a. CItemical studies on Bryophytes. 19. Application of C-13 NMR in Structural Elucidation of Flavonoids C-glucosides from Hedwigia ciliata. Acta CItem. Scand., B 32: 93-97. ÓSTERDAUL, B.G. 1978b. Chemical studies on Bryophytes. 20. A New Branched flavonoid-O-triglycoside from Dicranum scoparium. Acta Chem. Scand., B 32: 714-716. OSTERDAUL, B.G. 1979a. Chemical studies on Biyophytes. Isolation and identification of flavones aud flavone glycosides. Acta Universitatis UDsaliensis. Abstracts of Upsala Dissertations from the Faculty of Sciencies, 516: 1-55. OSTERDAUL, B.G. 1979b. Chemical studies on Bryophytes. 21. Flavonoid Glycosides of Uedwigia ciliata. Acta CItem. Scand., B 33: 119-124. OSTERDAUL, B.G. 1979c. Chemical studies on Hryophytes. 22. Flavonoid C-Glycosides of Mnium undulatum. Acta Chem. Scaud., B 33: 400404. ÓSTERDAUL, B.G. 1983. Chemical studies on bryophytes. 23. 13-C NMR analysis of a biflavone from Dicranum scoparium. Acta CItem. Scand., B 37: 69-71. OSTERDAUL B.G. BENDZ G. & FREDGA A. 1976. lOth International Symnosium on tIte Chemistrv of Natural Products (IUPAC) (paper No. D 14). Dunedin. New Zealand. OSTERDAUL, B.G. & LINDBERG, G. 1977. Chemical studies on bryophytes. 18. Luteolin-7-Oneohesperidoside-4’-O-sophoroside, another new tetraglycoside from Uedwigia ciliata. Acta CItem Scand., B 31: 293-296. PATES, AL. & MADSEN, G.C. 1955. Ocurrence of antimicrobial substances inchloropItylloseplant growing in Florida. II. Bot. Gaz., 116: 250-261. PAUL, II. 1908. Die Kalkfeindlichkeit der Sphagna und ihre Ursache, nebst einem Anhang líber die Aufnahmefáhigkeit der Terfmoose flir Wasser. Mitt. Bayer Bot. Ges. (Moorkanst), 2: 63-118. PELTER, A., WARD, RS. & GRAY, T.1. 1976. The carbon-13 nuclear magnetie resonance spectra of flavonoids and related compounds. J. Chem. Soc. Perkin., 1: 2475-2483. PERNO, CF., VARCHOAN, R., COONEY, D.A., UARTMAN, N.R., GARTNER, 5., POPOVIC, M., UAO, Z., GARRARD, T.L., WILSON, Y.A., JOHNS, DG. & BRODER, 5. 1988. Inhibition of human inmunodeficiency vims (UIB-l /UTLV-IIIB,L) replication in fresh and cultured human peripheral blood monocytes/macrophages by azidothymidine and related 2’ ,3’-dideoxynucleosides. J. Exo. Mcd. 168: 1111-1125. PINCEMAIL, i., DEBY, C., DRIEU, K., ANTON, R. & GOUTIER, R. 1990. Flavonoids as “antioxidants”. In Das, NP. (Ed.): Flavonoids in Biologv and Medicine III: Current issues in Flavonoids Research National University of Singapore. POPOVIC, M., SARNGARADUARAN, MG., READ, E. & GALLO, R.C. 1984. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retrovimses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science (Wash. DC, 224: 497. 331 . PRYDE, A. & GILBERT, MT. 1979. Arrnlications of Uigh Permomance Lipuid CItromatogravhy. Chapman & Hall. London. QUINN, Ci. & GADEK, P. 1981. Biflavones of Dacrydium sensu lato. Phytochemistrv, 11: 1759-1761. RACOVITZA, A. 1959. Étude systématique et biologique des cbampignons bryophiles. Mem. Mus. Natl. I-Iist N~eIB., 10: 1-288. RADWAN, 5.5. 1975. The lipids in plant tissue cultures compared to tIte lipids of photosynthetic and nonphotosynthetic plants and plant organs. Fette Seifen Anstrichmittel, 77: 181-184. RAMAUT, J.L. 1959. Autoecologie du genre Sphagnum. Nat. BeIges, 40: 9-22. READUEAD, S.A. 1981. Parasitism of biyophytes by agarics. Can. J. Bot., 59: 63-67. REZNIK, 1-1. & EGGER, K. 1961. Benedicts Reagens als Indicator ifir phenolische ortIto-Dihydroxygruppen. Zeit. Analyt. Chemie, 183: 196-199. RICE, EL. 1984. Allelonathv. Academic Press. Orlando. RICUARDSON, PM. 1992. Structure, biosynthesis, evolution and physiological and ecological roles of plant flavonoids and related compounds important in chemoprevention. Cancer Chemourev., 353-360. RICHARDSON, PM. 1983. Flavonoids and Phylogenetic Systematics. En N.J. Platnick & VA. Funk (bis.): Advance in Cladisties (vol. 2). Columbia Univ. Press. New York. ROBBERECUT, R. & CALDWELL, M.M. 1978. Leaf epidermal transmittance of ultraviolet radiation and its implications for plant sensitivity to ultraviolet radiation induced injury. Oecologia, 32: 277-287. RON, M.E., VELASCO-NEGUERUELA, A., PEREZ-ALONSO, M.J. & CEREZO, J. 1990. Sobre la presencia de flavonoides en musgos. Anales iard. Bot. Madrid, 46:421-426. (Comunicación presentada al VII Symposium Nacional de Botánica Criptogámica, Madrid, 1987). RON, M.E., VELASCO-NEGUERUELA, A., PEREZ-ALONSO, Mi., BUADES, A., ESTEBANEZ, B. & LOPEZ-SAEZ, J.A. 1992. Consideraciones evolutivas sobre los musgos a partir de caracteres anatómicos y fitoquimicos. In Alemany, A. (Ed.): Historia Natural’91. Palma de Mallorca. RUDOLPH, U. 1963. Práparative Darstellung emes roten Wandfarbstoffs von Sphagnum magellanicum. Ber Dtsch. Bot. Ges., 76: 72-73. RUDOLPH, H. 1964. Zur Frage der Membranochromie bei Sphagnen. 1. Welche Faktoren bestimmen den Farbwechsel?. Flora, 155: 250-293. RUDOLPU, U. 1965. Zur Frage der Membranochromie bei Sphagnen. II. Der Versuch einer Charakterisierung chromatographisch rein dargesteller Kardinalpigmente. Planta <Berí.>, 64: 178-185. RUDOLPH, U. &iOUNK, A. 1982. Physiologicalaspects of phenolic compounds in the celí wallsofSphagna. Joum. Hattori Bot. Lab., 53: 195-203. RUDOLPU, U. & VOWINKEL, E. 1969. Sphagnorubin, magellanicum. Z. Naturforsch., 24b: 121 1-1212. cm kristallines Membranochrom aus Sphagnum SAlTO, 5. 1959. Studies on the germination ot the spore in some mosses. Sci. Rey. Shimane Univ., 9: 55-63. 332 . SAKAI, K., ICHIKAWA, T., YAMADA, K., YAMASUITA, M., TANIMOTO, M., UIKATA, A., IYUIN, Y. & KONDO, K. 1988. Antitumor principIes in mosses: tIte first isolation and identification of maytansinoids, including a novel 15-metItoxyansamitocin P-3. J. Nat. Prod., 51: 845. SALM, R. 1992. lsolierung und Strukturaufláurung von Biflavonoiden aus des Laubmoos Bartramia halleriana Diplomarbeit. UniversitAr des Saarlandes. Saarbríicken. SALM, R. 1994. Dissertation (en prensa). Universitát des Saarlandes. Saarbrticken. SALM, R., SEEGER, T. & ZINSMEISTER, H.D. 1993. Die Biflavonoidmuster des Laubmooses Bartramia halleriana. Z. Naturforsch., 48c: 531-532. SARIN, PS. 1988. Molecular pharmacologie approaches to tIte treatment of Aids. Ann. Rey. ¡‘harmacol., 28: 4 11-428. SATAKE, K. & MIYASAKA, K. 1984. Discovery of bacteria in tIte celí wall of tIte aquatic liverwort Jungermannia vulcanicola Steph. in an acid stream having pH 4.2-4.6. J. Bryol., 13: 277-279. SATAKE, K. & SUIBATA, K. 1986. Bacterial invasion of tIte celí wall of mi aquatie bryophyte Scapania undulata (L.) Dum. in bou acidie and near-neutral conditions. IIikobia. 9: 361-365. SATAKE, K., SHIBATA, K. & TANAKA, A. 1990. Discovery of bacteria in tIte cdl wall of a moss Drepanocladus fluitans in the acid lake Usoriko (Osoresanko), Japan. Lindbergia, 16: 138-142. SCHEIRER, D.C. & DOLAN, H.A. 1983. Bryophyte leaf epifora: an SEM and TEM study of Polytrichum comniune Uedw. Am. J. Bot., 70: 712-718. SCUEUER, P.J. 1973. The CItemistrv of Marine Natural Products. Academic Press. New York. SCHILLING, G. 1985. Recent advances in NMR-spectroscopy of plant phenolics. En Sumere, C.F. & Lea, P.i. (Eds.): Ann. Proc. of the Phytochemical Society of Europe (vol. 25>: The BiocItemistry of Plant Phenolics. Clarendon Press. Oxford. SCUIMPER, W.P. 1855. Corollarmum Brvologiae Europaeae. consyectum diagnosticum familiarum. generum et syecierum. adnotationes novas atcuue emendationes comylectens. Stuttgart. SCHNEIDER, G. 1985. Pharmazeutische Biolopie. (2nd. Ed.). BI-Wissenschaftsverlag. Mannheim. SCHOFIELD, W.B. 1985. Introduction to Bryologv. Macmillan. New York. SCURÓDER, E. 1991. Massensvektrometrie. Springer Verlag. Berlin. SCHWAEGRINCUEN, E. 1830. Species muscomm frondosorum. Pars 1. In Willdenow, CL. (Ed.): Caroli a Linnée Soecies Plantarum (editio quarta, tomus V, p.2, sectio prima). Berlin. SEEGER, T. 1988. Biflavonoide und Flavonglykoside aus Plagiomnium cuspidatum (Uedw.> T. Koy Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. SEEGER, T. 1992. Biflavonoide und strukturverwandte verbindungen aus Laubmoosen unter besonderer berticksichtigung der Bartramiaceae. Dissertation. Universitát des Saarlandes. Saarbríicken. SEEGER, T., GEIGER, U., MUES, R. & ZINSMEISTER, webbii. Z. Naturforsch., 48c: 529-530. UD. 1993a. The Biflavonoid Pattem of Anacolia SEEGER, T., GEIGER, U., ZINSMEISTER, UD. & ROZDZINSKI, W. 1993b. Biflavonoids from the moss Uomalothecium lutescens. PItytochemistrv, 34 (1): 295-296. 333 ., SEEGER, T., GEIGER, H. & ZINSMEISTER, UD. 1991. Bartramiaflavone, a macrocyclic biflavonoidfrom the moss Bartraniia poniiformis. Pbytochemistry, 5: 1653-1656. SEEGER, T., GEIGER, U., ZINSMEISTER, UD., FRAHM, J.P. & WITTE, L. 1992a. 3’, 3”’Binaringenin, a New Biflavonoid from Pilotrichella cuspidata (Meteoriaceae, Musci). Z. Naturforsch. 47c: 667-669. SEEGER. T., GEIGER, U. & ZINSMEISTER, UD. 1992b. Isolierung und Strukturaufldárung von BartramiaTriluteolin, Bartramiasáure und einigen Biflavonoiden aus dem Laubmoos Bartramia pomiformis. Z NaturforscIt., 47c: 527-530. SEEGER, T., ZINSMEISTER, UD. & GEIGER, H. 1990. The biflavonoid pattem of Rhytydiadelphus squarrosus (Uedw.) Warnst. Z. Naturforsch. 45c: 583-586. SEELIGMANN, P. 1990. Avances en Quimiosistemática Vegetal. Acad. Nac. Cs. Ex. Fis. Nat., 5: 89-104. SEIGLER, OS. 1981. Secondary Metabolites and Plant Systematics. In Conn, E.E. (Ed.): TIte Biochemistry of Plants. A comurehensive Treatise <vol. 71 Secondarv Plant Products. Academic Press. New York. SELWAY, J.W.T. 1986. Antiviral Activity of Flavones mid Flavans. In Cody, V., Middleton Jr., E. & Harborne, iB. (Eds.): Plant Flavonoides in Biologv and Medicine: Biochemical. ¡‘harmacological and Structure-Activitv RelationsItius. Alan R. Liss, Inc. New York. SENDRA, i.M., NAVARRO, J.L. & IZQUIERDO, L. 1988. C 18 solid phase isolation and high perfomance liquid chromatography ¡ ultraviolet diode array determination of fully methoxylated flavones in Citms juices. i. Chrom. Sci. 26: 443-448. SHAW, i. 1985. Exostomial ornamentation in the Bryales. Journ. Uattori Bot. Lab., 59: 303-324. SUIMIZU, M., ITU, T., TERASUIMA, 5., UAYASUI, T., ARASAWA, M., MORITA, N., KUROKAWA, 5., ITO, K. & UASHIMOTO, Y. 1984. Inhibition of lens aldose reductase by flavonoids. Phytochemistry, 23 (9): 1885-1888. SUU-CUEN, C., YIU-SHOU, U. &JUNG-YAN, L. 1992. Inhibitoryeffects of flavonoids on moloney murine leukemia virus reverse transcriptase activity. J. Nat. Prod., 55 (2): 179-183. SIEGEL, SM. 1962. The nlant celí wall. Pc.M. Press. New York. SIEGEL, SM. 1969. Evidence for tIte presence of lignin in moss ganetophores. Amer. J. Bot., 56 (2): 175‘79. SIEGEL, U. 1988. Em HPLC Fingernrint System fur Flavonoide aus Moosen verscItiedener Standorte am Beisniel von Brvum canillare Hedw. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. - SIEGEL, ZJNSMEISTER, H.D. & STEIN, W. 1989. A rapid HPLC-Fingerprint System br flavonoids of B¡yophytes. Journ. Uattori Bot. Lab., 67: 389-394. U., SIEVERS, II. 1992. Inhaltsstoffe und in vitro-Kultur des Laubmooses Hvonum cuoressiforme Hedw Dissertation. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. SIEVERS, U., BURKHARDT, G., BECKER, U. & ZINSMEISTER, H.D. 1992. Uypnogenols and other dihydroflavonols from the moss Uypnum cupressiforme. Phvtochemistrv, 31(9): 3233-3237. SIEVERS, U., BURKHARDT, G., BECKER, H. & ZINSMEISTER, UD. 1994. FurtIter biflavonoids aud 3’-phenylflavonoids froni Uypnum cupressiforme. Phvtochemistry 35 (3): 795-798. 334 .,. SIMON, E. 1987. Lyophyllum palustre, a parasite on Sphagnum. Svmv. Biol. Uung., 35: 165-174. SMITH, A.J.E. 1980. The moss flora of Britain and Ireland. Cambrigde University Press. Cambrigde. SMITU, A.i.E. 1986. Bryophyte phylogeny: fact or fiction?. J. Brvol., 14: 83-89. SOLBERG, Y. 1983. Lipids constituents of the moss Mniobryum wahlenbergii var. glaciale. Cryu. Brvol Lichénol., 4:129-144. SOMERSALO, 5., KARUNEN, P. & ARO, E. 1986. The acyl lipid composition of wheat leaves mid moss protonemata using a new non-carcinogenin extraction solvent system. Phvsioloaia Plantarum 68: 467470. SPIES, E. 1982. Flavonoidmuster von Plaaiomnium affine (Funck) Kop. Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbríicken. SPILKOVA, J. & HUBIK, J. 1988. Biologisehe Wirkungen von Flavonoiden. Pharmazie in unserer Zeil 17 (1): 1—9. SPILKOVA, 1. & UUBIK, J. 1992. Biologische Wirkungen von Flavonoiden. II. Pharmazie in unserer Zeit 4:174-182. SPJUT, R.W., SUFFNESS, M., CRAGG, G.M. & NORRIS, D.U. 1986. Mosses, Liverworts, and Uornworts Screened for Antitumor Agents. Economic Botanv, 40 (3): 310-338. SPíUT, R.W., CASSADY, J.M., McCLOUD, T., SUFFNESS, M., NORRIS, D.H., CRAGG, G. & EDSON, CF. 1988. Variation in Cytotoxicity and Antitumor Activity among samples of tIte moss Claopodium crispifolium (Thuidiaceae). Economic Botany, 42 (1): 62-72. STAFFORD, U.A. 1990. Flavonoid Metabolism. CRC Press. Boca Raton, PL. STAFFORD U.A. 1991. Flavonoid Evolution: An Enzymic ApproacIt. Plant Phisiol. 96: 680-685. STAUL, E. 1967. Díinnschichtchromatograyhie STAHL, E. 1969. TLC - - Em Laboratoriumshandbuch. Springer Verlag. Berlin. A Laboratorv Uandbook. (2nd. Ed.). Springer Verlag. Berlin. STEIN, W. 1985. Flavonoidmalonylester im Ganietonhyten und Syoroyhyten von Bryum canillare Diplomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrúcken. STEIN, W. 1988a. En Geiger (1990): Biflavonoids in bryophytes. In Zinsmeister, H.D. & Mues, R. (Eds.): Brvonhytes. Their Chemistrv and CItemical Taxonomy. Clarendon Press. Oxford. STEIN, W. 1988b. Em Beitrag zur Flavonoidchemie der Laubmoosfamilie Bryaceae. Dissertation. Universitát des Saarlandes. Saarbrticken. STEIN, W., ANHUT, 5., ZINSMEISTER, UD., MUES, R., BARTZ, W. & KOSTER, J. 1985. New flavone glucoside Malonylesters from Bryum capillare. Z. Naturforsch., 40c: 469-473. STEIN, W. & ZINSMEISTER, UD. 1990. New flavonoids from the moss Bryum pseudotriquetrum. Z Naturforsch., 45c: 25-3 1 STEIN, W. & ZINSMEISTER, UD. 1991. The ocurrence of Flavonoids in the moss family Bryaceae. Joum Uattori lot. Lab., 69: 195-202. 335 . STRACK, D., FUISTING, K. & POPOVICI, G. 1979. Uigh performance liquid chromatography analysis of oat (Avena sativa) flavone derivatives. J. Chromatogr., 176: 270-273. STRACK, D. & KRAUSE, i. 1978. Reversed phase high perfomance liquid chromatography separation of naturally ocurring mixtures of flavone derivatives. i. Chromatogr., 156: 359-361. STRAIN, U.U. 1958. Chloroplast pigments and chromatographic analysis. Annual Priestlev Lectures. Penn State Univ., 32: 1-180. SUIRE, C. 1975. Les données actuelles sur la chemie des Bryophytes. Rey. Brvol. Lichénol., 41: 105-256. SUIRE, C. & ASAKAWA, Y. 1979. Chemotaxonomy of Bryophytes: a Survey. In Clarke, G.C.S. & Duckett, J.G. (Eds.): BrvonItvte Svstematics. Academic Press. London. SUIRE, C. & ASAKAWA, Y. 1982. Recent Advances in the Chemotaxonomy of Liverworts. Beih. Nova Hedwigia, 71: 39-58. SWAIN T. 1974. Biochemical evolution in Plants. En Florkin, M. & Stotz, E.U. (Eds.): Comurehensive Biochemistry. Elsevier, Amsterdam. SWAIN, T. 1975. Evolution of flavonoid conipounds. In Harbome, IB., Mabry, T.J. & Mabry, U. (Eds.): The Flavonoids. CItapman & Hall. London. SWAIN, T. 1977a. Secondary compounds as protective agents. Ann. Rey. Plant Phvsiol. 28: 479-501. SWAIN, T. 1977b. Secondary compounds: primary products. Bot. Mus. Leafl. Uarv. Univ., 4: 35-57. SWAIN, T. 1980. Flavonoids as Chemotaxonomic Markers in Plants. In Czygan, P.Ch. (Ed.): Pigments in Plants. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. SWAIN, T. 1986. TIte Evolutionof Flavonoids. In Cody, V., Middteton, E. & Harborne, J.B. (Eds.): Plant Flavonoids in Biologv and Medicine: Biochemical. Pharmacolo~ical and Structure Activity Relationshios. Alan R. Liss, Inc. New York. TAYLOR, I.E.P., SUCOFIELD, W.B. & ELLIOT, A.M. 1970. Analysis of moss dehydrogenases by polyacrylamide disc electrophoresis. Canad J. Bot., 48: 367-369. TERNAI, B. & MARKUAM, K.R. 1976. Carbon-13 NnMR studies of flavonoids. 1. Flavones and flavonols. Tetrahedron, 32: 565-569. TíT, A., GHOGOMU TIU, R., SONDENGAM, B.L., MARTIN, MT. & RODO, B. 1992. Tetraflavonoids of Lophira alata. Phytochemistrv, 31(3): 98 1-984. TOMAS-LORENTE, F., GARCIA-VIGUERA, C., FERRERES, It, TOMAS-BARBERAN, FA. & NAVARRO, G. 1989. Análisis por UPLC de polifenoles en algunos vinos tintos españoles. Rey Agropuim. Tecn. Aliment., 29: 399-406. TRAUB, A. & GEIGER, H. 1975. Nachweis von 2.5.7.3’ .4’-Pentahydroxy-flavanon-5-glucosidin den Samen von Galega officinalis L. (Fabaceae). Z. Naturforsch., 30c: 823-824. TRENNHEUSER, F. 1992. Phvtochemische Untersuchuna and in vitro Kultur ausgewáhlter Vertreter der Anthocerotoysida. Dissertation. Universitát des Saarlandes. Saarbr(icken. TURNER, W.B. 1971. Fungal Metabolites. Academic Press. London. 336 .., VAN DER WIJK, R., MARGADANT, W.D. & FLORSCHUTZ, P.D. 1959. mdcx Muscorum (vol. 1). Utrecht. VANDEN BERGHE, D.A., lEVEN, M., MARTENS, F. & VLIETINCK. A. t978. Screening of higIter plants for biological activities. II: Antiviral activity. Llovdia, 5: 463-471. VANDEN BERGHE, DA., VLIETINCK, A.i. & VAN HOOF, L. 1986. Plant Products as potential antiviral agents. Bulí. Inst. Pasteur, 84: 101-147. VANDERKERKUOVE, O. 1977a. Isolierug unó Charakterisierug emes Dihydroflavonols bei dem Laubmoss Georgia pellucida (L.) Rabh. Z. Pflanzennhvsiol., B 82: 455-457. VANDERKERKHOVE, O. 1977b. Uber die Verbreitung von flavonoiden bei pleurokarpen Laubmossen. 1. Apigenin-7-rhainnoglucosid bei Uylocomium splendens (Uedw.) Br. Eur. Z. PflanzennItvsiol., B 85: 135-138. VANDERKERKHOVE, O. 1978a. Uber die Verbreitung von flavonoiden bei akrokarpen Laubmossen. 1. Dic Plavonoide von Mnium undulatum (L.) Uedw. Z. Pflanzenyhysiol., B 86: 135-139. VANDERKERKHOVE, O. 1978b. Uber dic Vcrbreitung von flavonoiden bei akrokarpen Laubmosscn. 11. Luteolin aus dem sporophyten von Ceratodon purpureus (L.) Brid. Z. Pflanzenuhvsiol., 86 (3): 279281. VANDERKERKHOVE, 0. 1980. Uber dic Verbreitung von flavonoiden bei pleurokarpen Laubmossen. II. Apigeninun Apigenin-7-rhamnoglucosidbei Pleurozium schreberi (Willd.)Mitt. Z. Pflanzenphysiol. E 100: 369-372. VANDEKERKUOVE, O., EULER, R., KOHN, G. & UARTMANN, E. 1984. Influence of stress conditions on tIte fatty acid pattems of tIte moss Leptobryum pyriforme. Journ. Uattori Bot. Lab., 56: 187-193. VAN HOOF, L., VANDEN BERGHE, D.A., UATFIELD, G.M. & VLIETINCK, A.i. 1984a. Plant antiviral agenís. V. 3-methoxyflavones as potent inhibitors of viral induced block of celí synthesis. Planta Medica, 50: 513-517. - VAN UOOF, L., VANDEN BERGUE, DA. & VLIETINCK, A. 1984b. 3-Methoxyflavones from EupItorbia grantii Oliver as potent recovering agents of virally induced block of host-cell synthesis. Arch. mt Phvsiol. Biochem., 92: B-l10-111. VAN HOOF, L., VANDEN-BERGUE, DA., PETIT, E. & VLIETINCK, A.J. 1981. Antimicrobial and antiviral screening of Bryophyta. Fitoterania, 52: 223-229. VAN HOOF, L., VANDEN BEROHE, D.A. & VLIETINCK, A. 1980. Screening of Poplar Trees for Antibacterial, Antifungal and Antiviral Activity. Biologia Plantarum, 22 (4): 265-273. VECKENSTEDT, A. & PUSZTAI, R. 1981. Mechanism of autiviral action of quercetin against cardiovirus infection in mice. Antivirol. Res., 1: 249-261. VELASCO, A., RON, E., PEREZ ALONSO, M.J., BUADES, A., LOPEZ-SAEZ, i.A., ESTEBANEZ, B. & JO VER DE CELIS, M. 1991. Estudio anatómico y presencia de flavonoides en varias especies de musgos acrocárpicos. Comunicación presentada al IX Simposio Nacional de Botánica Criptogámica Salamanca, 1991. España. VERGER, G. 1988. Enfermedades infecciosas (vol. 1). Antibióticos SA. Ediciones Doyma. Barcelona. 337 ,. VIOQUE, E. 1984. Spray reagents for thin layer chromatography (TLC) and paper chromatograpIty (PC). In Zwe¡g, G., Sherma, J. & Mangold, H.K. (Eds.): Handbook of Chromatographv. Linids. (vol. II). Boca Raton. VITT, D.U. 1984. Classification of tIte Bryopsida. In Schuster, R.M. (Ed.): New Manual of Bryology (vol. II). Hattori Botanical Laboratory. Nichinan. VOIGT, A. 1993. Dinlomarbeit. Universitát des Saarlandes. Saarbrticken. VOIRIN, B. 1972. Distributiondescomposés polyphénoliqueschez les Lycopodinées. Phytochemistry, 11:257262. VOSS E. 1975. Totalsunthese des Sphagnorubins. Dissertation. MatIt.-Nat. Fakultát d. Univ. Kiel. VOWINKEL, E. 1975. Torfmoosmembranochrome, 2. Die Struktur des Sphagnombins. CItem. Ber., 108: 1166-118 1. VRIJSEN, R., ROMBOUT, E., VAN HOOF, L., VANDEN BERGHE, DA. & BOEYE, A. 1984. 3Methylquercetin, mi inhibitor of tIte early stages of poliovirus replication. Arch. Int. Phvsiol Biochem., 92: B-113-l]4. WAGNER, U., BLADT, 5. & ZGAINSKI, E.M. 1983. Plant Drug Analvsis. Springer-Verlag. Berlin. WEITZ, 5. & IKAN, R. 1977. Bracteatin from tIte moss Funaria hygrometrica. Phytochemistry, 16: 11081109. WEYAND, J. 1993. Diylomarbeit (en prensa). Univesitát des Saarlandes. Saarbrticken. WILSCHKE, J. & RUDOLPH, U. 1988. HPLC Analysis of Phenolics in Mosses. In Glime, J.M. (Ed.): Methods in Brvology. Uattori Bot. Lab. Nichinan. WILSON, MA., SAWYER, J., 1-IATCHER, P.G., LERCU, H.E. III. 1989. 1,3,5- hydroxybenzene structures in mosses. PhytocItemistrv, 28 (5): 1395-1400. WOLFBEIS, O.S., FURLINGER, E., CHANDRA JHA, H. & ZILLIKEN, F. 1984. The Absorption and Fluorescence of Isoflavones and tIte effect of Shift Reagents. Z. Naturforsch., 39b: 238-243. WOLLENWEBER, E. 1981. Unusual flavanones from a rare american fern. Z. Naturforsch., 36c: 604-606. WOLLENWEBER, E. 1982. Suoolement Chromatoaranhie. GIT-Verlag. Darmstadt. WOLLENWEBER, E. & DIETZ, V.U. 1979. A table of mass spectral parent ions as mx aid in flavonoid analysis. Phvtochem. Bulí., 12: 48-52. WOLLENWEBER, E. & DIETZ, V.U. 1981. Ocurrence and distribution of free flavonoid aglycones inplants. Phvtochemistrv, 20 (5): 869-932. WOLTERS, E. 1964a. Dic Verbreitung antifungaler Eigenchaften bei Moosen. ~ 62: 88-96. WOLTERS, E. 1964b. Antibiotisch und toxisch wirkende substanzen aus algen und moosen. Planta Medica 12: 85-99. WOOD, RS. & JELLIS, G.J. 1984. Plant Diseases. Blackwell. Oxford. WREN, R.W. 1956. Potter’s New Cyclonedia of Botanical Dmgs and Preyarations. (lth. cd.). Sir Isaac Pitman & Sons Ltd. London. 338 . WYATT, R., LANE, D.M. & STONEBURNER, A. 1991a. Chemosystematics of tIte Mniaceae. II. Flavonoids of Plagiomnium Section Rosulata. Bryologist, 94 (4): 443-448. WYATT, R., LANE, DM. & STONEBURNER, A. 1991b. Chemosystematics of the Mniaceae. III. Sources of Intraspecific Variation in Flavonoids. Bryologist, 94 (4): 452-456. YOKOUCHI, Y., SATAKE, K. & AMBE, Y. 1984. Monoterpene composition of tIte aquatic liverwort Jungermania vulcanicola Steph. Brvologist, 87: 323-326. ZAPP, J. 1992. Phvtochemische Untersuchungen mx ausgewáhlten Lebermoosen der Gattung Anastroyhyllum sowie der beiden Laubmoose Dicranum scoyarium und Pleurozium schreberi. Dissertation. Universitát des Saarlandes. Saarbrticken. ZEUR, R. 1990. A simplified technique for assaying the production of bacteriostatie compounds by hepaties. Lindbergia, 16: 128-132. ZINSMEISTER, UD. & MIJES, R. 1980. The flavonoid chemistry of Bryophytes. Rey. Latinoamer. Ouim. 11: 23-29. ZINSMEISTER, H.D. & MUES, R. 1987. Moose als Reservoir bemerkenswerter sekundárer Inhalsstoffe. GIT Fachz. Lab., 31: 499-512. ZINSMEISTER, H.D. & MIJES, R. 1990. Brvouhvtes. Their Chemistrv and Chemical Taxonomy. Clarendon Press. Oxford. ZINSMEISTER, UD., BECKER, U. & EICHER, T. 1991. Bryophytes, a source of Biologically Active, Naturally Ocurring Material?. Anaew. Chem., 30: 130-147. ZINSMEISTER, U.D., MUES, R., BECKER, U. & EICUER, T. 1987. Moose als Reservoir bemerkenswerter sekundárer Inhaltsstoffe. Camnus, 6 (extra): 7-10. Universitát des Saarlandes. Saarbríicken. 339 ANEXOS ANEXO 1 Relación a. especias de musgos en la czua ha sido estudiad, el coswon.ote flavonoidico exceptuando los resultados de la presente memoria doctoral— prasencía de flavonoidas,-— ausancía de flavonoides en general sino se especifica un tipo concreto, -P~ ausencia da proantocianidinas - >7> —identificación tentativa-dato dudoso ono conocido.> (Sisteisática y autorías según Allderson & col., 1990 y Orosby & Maglíl, 198:> 1= flavonoides tipo (oh Referencias 2.. Subclase Sphagnidae .1 -Orden Spbapnalas 1. 1 - 1 - 5pta goacase SphagnutnsppSpbsgnum fistriatusut Spbagllum girgensobnii antocianidinas antocianidina 5 >2> Paul >1908> Mentido & VocisiRel >1984> Mcclure & Miller >1967> Sendz & col. >1969a> Efimanko & >3zenis >1962> Efis’eoko & ozínis (1962) Vowiokei >1975> Rudolph & Vowinkel. >1969> Seeger >1992> Rudolph & Johnk >1982> Secker (1986> Rudolph & Johnk >1982> Rudolph & Tohnk >1992> Benóz & col. >19665> Rudolpb & dohnk (1982> —p Spbagnueniagel lanícu,s’ antocianidinas >3> antocianidinas >3> -p antocianidinas >3> . . Sphagnum nenoteusi Spbagnusi palustre Sphagnunl plussolosrns SphagnuI3l ruballom Spbagnumsguarrosuis Spbagnumwarnstorfii 2 .Subclase Andreasidas 2.1 Orden >,ndreaeales 2 1. 1 Andrea Andresea rothii antocianidinas (1> antocianidinas >1> biflavonoidas antocianidinas >3> 4? Andrelía tupestris Becker (1986> Seager >1992> Sendz & col. >1966a> Mcclure & Miller >1987> Becker >1956> Saeger >1992> bifí avonoide 5 -p bit1avonoides Andreaca silsonil. 3 .Subclase Bryldae 3 . 1-Orden nicranalea 3.1.1. flitrichacese Mocione & Miller >1967> Vandekerkbove >l978b> Becker >1996> Seeger >1992> Mctlura & Miller >1967> Ceratodon purputeus fíavonas >1> OjÉrichoal flexicaule bifí avonoidaa OitricboITt paílidusl 3,1.2. biflavonoides biflavonoides biflavonnidas biflavonnides biflavonoides bitlavonoides cas,pylopusolavatus campylopus holoulitriusi Caispyiopus introf laxos OboriaodontiuTntsittanii. nicrane lía hoctreur>. neri nicranoloma robustus’ nicranoloma buí ardier>. Oicranum bonjeanhl Dicranus fuivus’ nicranus 1ongitoliu~s Di cranutil gol ysetuTs Dicranul ecop anua >3> >2> >3> >3,6?> bitíavonoides >6> biflavonoidas (1> biflavonoides biflavonoides >1> -8? flavonas-Odiglicósidos >1> flavonas-0-triglicósidos >1> flavonas-0-glic&sidos >4?> flavonas-0-digiicósidos >1> fiavonas-O-triglicósidos >2> fíavonas-0-triglioósidos >1> biflavonoides (1> bifíavonoides >1> -p biflavonoides bifiavonoides bitisvonoidas bitlavonoides bitíavonoides Dicranun tauricos Oicranuaiunduletus, Moiossitniusssetacalycinum Leocol 0515 serrulatu[TI Ortbodicranuras,ontanun Paraíaucobryun longifoliu’s Pilopogon grac~.lss Phlopogon longirostratuls 3.1.3. Laucobrvaceae Leucobryu,ncri. spuTs Leucobryua qlaucurs >1> >1> >2> >2> biflavonoides -p bit1avonoides bitlavonoides biflavonoides teucobrylím martianos l.4.calrlperscaaa cslymparas tahitense Octoblepbarua’ ~sp Syrrhopodoncrocaus Tbyridius, obtosifolius’ Tbyridiursconstrictus 3 . 1 5 .0 ycnersonacaae Oycnamoncaívcinus Geiger & Markhais (1992> >4arkhaai 10 Geiger >1990> Geiger u Markhais >1992> Wayassd >1993> acepar >1952> Seeger (1992> Mcclure & Miller >1967> Markhas, & col. >1998> Markhassinoeigar >1990> Seeger >1992> Markham & col. >1989> Becker >1986> Beoker >1986> Secker >1986> acodo & col. >1966a> Nilason & col >1973> Nilseon & col. >1973> Ron & col. >1990> óstardabl >1979a> isterdabí >1979a> isterdabí (197gb> isterdabí >19799> Ron & col. >1990> Moclure & Miller >1967> Bando & col. >1966a> Lindberg & col. >1974> istardahí >1983> Geiger & col. >1993b> Voigt >1993> Seagar >1992> Becker >1986> Seegen >1992> Secker (1986> Moclore & Miller >1967> MoClure & Miller >1967> Secker >1986> Bendí & col. >1966a> Seeger >1992> Saegar >1992> Mociora Moclure Seegen Moclore & Miller >1967> 6 Miller >1967> >1992> & Miller >1967> >4ctlore Sesgar McOlora Mcolura Mcclura & Millet >1992> & Miller & Miller & Miller 3. . biflavonoides biflavonoidas >2> Voigt 340 >1993> >1967> >1967> >1967> >1967> Mesotus ce latos biflavonoides bitlavonoides acoger >1992> Seeger >2992> Becker >1966) . 3 .1.6. Scbist ostegacese Schistostega pennata 3 1..? . Bryoxiph:acese Sryoxiphiumnorvegicum subsp. japonicus’ 3.1.6 .6ustichiaceae Bustiobia sproceaoa 3.1. 9.Rhabdoweisiaceae As’phidiummoogeotii Rhabdoweisia tugax llOrden piseidentales 3 .2.1. Fissident acese Fissidens adianíboides Éissidenscnlstatus + + biflavonoides Seeger (1992> + biflavonoides Sesgar >1992> biflavonoides acepen >1992> biflavonoides acepen >1992> bitlavonoides bifí avonoides Seeger Moclure Becker Sesgar biflavonoides Mcclure & Miller >1967> Seeger >1962> bit1 avonoides isotialOnas >1?> biflavonoides >1=> Mcclure Seeger cordero Cordero - . >1992> & Miller >1967> >1966> >1992> . Fiasidení polypbyllos Ordeo Buxbauniale. 1 Suxbauaiaceae tipbysciuni toliosos 3.3 3 3 . + 3.4-Orden pottiales 3.4.1 .Encalyptsceae >EncalyptaoiliStS Rncslypta síreptocarpa 900913.9*5 volganis 8?ot tiscese Anoec tangion compacto BnyoerytbrophvlluTT filiforme Leptodontionintenn¡pturn Torto].a rutalis Tortola sobolata Tortilla tortella TnichostoTIoS Tisuiense Tnidontios7 tasmanicus’ rriquetella papillata 3 - 5 - Ordan Orimiales 3.5.1. Oniosniacese onimia hartmalli i Oniosnia orbicolanis Cniemia ovalis Orimia torgosta Raoonittium aciculare Racomitrius heteroatichos Racoslitritim lanuginosos’ & Miller >1967> >1992> >1990> >1990> 3 .42. bitlavonoi des Seeger >1992> Becker >1966> Seegen >1992> Seeger >1992> Ron & col- >1990> Becker >1966> Mcclure & Miller >1967> Saeger >1992> Seeger >1992> bití avonoides bifí avonoides -p bitlavonoides biflavonoides a? bitlavonoides bifí avonoides Beodo & col. >19646> Estébanez >1991> Seeger >19921 McClore & Miller >1967> Ron & col, >1990> Roo & col. (1990> Ron & col. >1990> Bando & col. >1966a> Geiger & col. >1966) Moclune & Miller >1967> Seeger >1992> Seeger >1992> bitlavonoides Seeger >1992> soronas >1> biflavonoides bití avonoides bitísvonoidas Weitz & Skan >1977> Seeger >1992> Mcclore & Miller >1967> Seeger >1992> Becker >1966> Seeger >1992> acoger >1992> bitlavonoides antocianidinas >1?> antocisnidinas >1?> Seeger >1992> Nileson & Bando Nilsson & Beodo biflavonoides Seager >1992> atein & Zinsicister >1991> Stein >1906b> atein & Zinarneister >1991> Stein >l666b> Markban, & Citan >1966> Markbam & Given >1966> atein & Zinemeister (1991> atein >196gb> Stcin & Zinsseister >1991> Mcclure & Miller (1967> 51cm & Zinsacister >1991> Stein >1966b> Steio & col. >1965> ateinacol. (1965> SIam & col. >1965> SIam & col. >1965> aaYhut & col. >1964> Anbut & col. >1964> Mcflure & Miller >1967> Leidingen >1964> Geiger & col. >1967> Siegel & col. >1969> Siegel & col. >1969> Siegel & col. >1969> Siegel 1 col. >1969> Siegel & col. >1989> aLem >196gb> SIam >196gb> atein >2966b( ítem >1966b> aLem >196gb> ítem >1965> Sabor >1965> Anhun >1965> Asibul >1965> Sobun >1965> Sobun >1992> Anhon >3992> Anhut >19921 Anliol >1992> Robot >1992> flavonoles >1?> biflavonoides biflavonoldes >1> 4? bitlavonoides Racoinitrioto ptycbophyllua Phychoaitniace se Phycbositrius’ polvpbyllom 3 - 6 - Orden Funariales 3 - 6 1. Fumaria hygrometrica >2> . 2.5.2, biflavonoides . >1973> >1973> . . . . Funaniasubintegra Ob>’ sonaitrie lis patena Sohistidius apocarpohl Schistidiuu aariti’91os’ Sc>listidiosirivulare 3 E 2 . Splacbnacese Spl achone acapuil aceus Splacbnusi rubros’ api acunos’ Vasco baus’ 37Orden Eryalss 3 Y 1 Bn>aceae Anoeobryom spp. Anoeobryucn jolaceus Bnyusi alpinos Bryuni argenteoca flavonas >2> f1 avonas- O - g licosi dos >6> Bnyus’ bimus Bryom capillare Malones >1) tiavonas-O-giicdsidos >6> isoflavonas >2> isoflavonas -0-glicósidos >4> isofiavonas >2> isotlavonas-o-glicásidos >2> tlavonas-O-glicósidos >1> biflavonoides >2> flavonas >1> flavonas-0-glicósidos >6> isoflavonas >2> isoflavonss-0-glicúsidos biflavonoides >3> flavonas >1> flavonas-O-glicdsidos >8> isoflavonas >2> isotlavunas-O-glicdsidos bitiavonnides >3> tlavonas-O-glicdsidos >4> tiavonas >1> flavonas-O-glicdsidos >6> isoflavonas >2> isoflavonas-O-glicóaidos tlsvOi3as (1> flavonas-O-glicásidos >6> isoflavonas >2> isoflavonas-O-glicósidos biflavonoides >3> 341 >4> >4> >2> >4> Sryos’ cryophilos’ fiavonas >1> fiavonas-O-giicósidns >8> isoflavonas >2> isotlavonas-o-glicósidos >4> bifla-vonoidae >3> bifí avonnides antocianid>. nas >2> antocianidinas >2> Siegel >1988> Siegel >1988) Siegel >1988> Siegel >1988> Siegel >1988> Seeger >1992> Senda & Martenason >1961> Senda & col. >1962> Stein & Zinírseister >1991) Stein >198gb> antocianinas Merzfaider >1921> gtein & Zinsineister >1551> Stein & Zinsmelater >1551> Steio >158gb> ítem & Ziosneister >1581> ítem & Zinameister >1991> atein >198gb> ítem >188gb> ítem & Zinsmeister >1990> ítem & Zinss’aister >1990> atein & Zinsmeister >1990> ítem & Zjnas,eister >1990> ítem & Zmnsmeister (1990> ítem & ZinsTaester >1590> ítem & Zmoss’eiater >1991> itsmo >1988b> ítem >198gb> ítem >198gb> ítem >1988b> Stemn >1988b> ítem (198gb> acodo & Martansson >1563> ítem >lggga> ítem & Z.jnssaeister >1991> ítem & Ziosmeister >1991> Sfeio & Zmosmeister >1991> ítem & Zmnsmeister >1991> ítem & Zinss,eister >1991> ítem & Zmnsmeister >1991> ítem & Zinsineister >1991> ítem & Zioss’ester >1991> ítem & Zmnss’eister >1991> ítem (198gb> ítem >198gb> ítem >198gb> ítem (198gb> itsmo >198gb> ítem >198gb> Tramo >198gb> ítem >198gb> Stein >198gb> Moclore & Miller >196?> Seager >1992> Iqerofelder >1521> ítem & ninaseister >1551> ítem >158gb> Igerofelder >1521> Senda & >4arteossoo >1983> 5115500 >1969> senda & col- >196Ta> ítem & Zmnsmeistar (1991> iteil >158gb> McClore & Miller >1967> ítem & Ziiissiejster >1991> itsmo >158gb> ítem & Zmnsacistar >1991> ítem >198gb> Seeger >1992> ítem & Zmnss,eister >1991> ítem >198gb> 5r~’-om flaccidos Sayos’ pallens antocianines Bryoei pallesceos flavonas-C-glicósidos >3> flavoooles-0-glicósidos >21?> tíavonas-O-gíicósidos >3> flavonoles-0-glicósidos >21?> flavonas-C-glicásidos >3> flavonas,-O-glicós,3.dos, >8> tlavonas-0-diglicésidos >4> flavonoles >1> flavonoíes-0-diglicósidos >2> flavonoles-O-glicósidos >4> Bryoni pseodo triquetros, tlavonas-c-glicósidos >3> fiavonas-O-glicósidos >1> flavonas-O-diglicósidns >4> flavonoles >1> flavoooles-o-diglic&sidos >2,1?> flavonolas-O-glicésidos (3> antocianidinas >2> biflavonoidas >2> flavonas >1> tlavonas-O-glic&sidos >4> f iavonas-0-diglicósidcs >3> flavonas-O-glicóaidos >3> isoflavonas >1> isoflavonas-O-glicósidos >3.1?> isoflavonaa-0-diglicdsidos >1> bitíavonoides >2> antocianmnas (2?> bifiavonoides >2> flavonas >1> flavonas-o-glicdsidos (4> fiavonas-O-diglicdgidos (3> flavonas- 0-glicósidos >5> (soflavonas >1> isotiavooas-O-glicdsidos >22?> isoflavonas-O-diglicósidos >1> Sr3ols’ rotilaus ~5rIs, schleicberi Sryos, torqoesceos SarIs, truncoros bifí avonoides antociananas Sryus’ torbmnatos’ Sayos’ waigaiii e? pohíja -p onda antociana nas antocianidinas >2> flavonas-0-glicásidos >1?> biflavonoidea >1?> Pohila nutana biflavonoides >1?> Pobliawablenbargii Rbodobryus’ grandif olios’ Rhodobryum roscos, bitlavonoides Moiscege cinclidmos,stygmom 3.7.2. Moios’ ambiguos’ flavnnoles-O-diglicdsidos >1?> Mojos’ hornos’ -7 bUí avonoides Mnios’ atellare Plagiosmiors acoto, Plagionmios’ affine tlavonas-o-C-glioósidos >22?> flavonas-C-glicdsidos >1> flavongs-C-glicósidos >4,4?> flavonas-O-c-glic&sidos >7> flavonas >1> flavonas- 0-glicásidos >6> flavonas-O-c-glicósidos >1> flavonas-O-glicúsidos >1> flavonas-O-c-glicósidos E lavonas- 0-gí loja idos Plagiosmios’ciiiare Plagioaaniosacuspidatos’ fíavonas >1> flavonas-0-glioósidos >5> flavonas-o-gíioósidos >1> flavooas,-0-C-glicósidos >1> cbalconas-o-glicás,idos >1> biflavonoides >4> flavonas-O-C-glicásidos >3> flavonas- 0-0-glicásidos >1> 342 giehí >1988> Aaihot >1992> Siehí >1988> Anbut >1992> Malcbert & Alíton >1965> Becker >1986> Myatt & col. >1991b> Leidinger >1984> Sabut >1992> Saegar >1992) ejeM >1588> Aalhot >1552> Siehí >1988> Sacker >1588> Anbot >1992> Siehí >1998> Anhot >1992> Koponen & lailsion >197?> Freitag & col. >1986> Freitag & col. >1986> Melchert & níston >1966> Alston >1968> Myatt & col. >1991a> Myatt & col. >1991a> Myatt & col. >1991a> Myatt & col. >1991a> robot >1992> arilí-reas >1991/82) Brin-Fase >1981/82> ipies >1982> Koponen & Nilsson >1977> Myatt & col. >1991a y b> Myatt & col. >1991a y b> M~iatt & col- >19918 y b> Myatt & col. >19918 y b> Myatt & col. >1991a y b> Sabot & col. >1989a> Sabor & col. >1989í> <oponen & Nilison >1977> Mormure & Miller >1967> flavonas-O-C-giicjsidos >1> tiavongs-O-C-giic&sidos >1> biflavonoides >4> flavonas-O-C-glicúsidos >3> flavooas-O-diglicúsidos >1> bifiavonoides >4> tíavonas-O-C-glic6sidos >3> tlavonas-C-glicúsidos >3> bitiavonoidea Plagioss’Yios dru’s’nondii Plagioslllios, ciatos bitíavonoides >1> biflavonoides flavongs-C-siicósidos, >42?> fiavonas-o-diglic&sjdos >1> biflavonoides >1> flavonas >1> fíavonas-c-giicósidos >6> flavonas-O-C-glioósidos >1> flavonas-O-diglirásidos >1> flavonas-o-glicósidos >2> (9> tlavooas-c-glicósidos >6> flavonas-C-glioósidos >6> tlavooas-o-diglicúsidos >1> biflavonoides >1> tlavooas-c-glicósidos >6> tlavonas-O-diglicósidos >1> biflavonoides >1> Piggiosnios’ clip ticus tiavonas >1> flavonaS-O-glicósidoí >4> flavonas-O-C-giicjsjdoí >1> tlavooas-O-disíicósiaoí >1> tíavonas-O-giicésidos >1> Piagioas’iuss insigne fíavonas >1> f lavonas-C-glicásidos >3> flavonas-O-C-glicósidos >1> fiavooas-O-giicósmdos >1> Plagiocanius japonicos’ Plagios’oiusasediosa subsp. sedios’ + aobsp, corvatulus tíavonas >1> tlavonas-c-giicósidos (3> flavonal-O-O-glicúsidos >1> flgvonas-O-digiicds,idos >1> flavonas-o-giicdsidos >1> fiavonas >1> fíavonas-C-glicásidos >4> flavonaS-O-C-glioósidos >1> flavonaS-O-diglicósidos >1> Plagiosomus rostratos’ biflavonoides plagiosomus’ tezukae Plagios’niumundulatum flavooas-O-C-glicósidos >1> flavonas-C-glicósidos >6> flavonas-O-c-glicósidos >1> -p tlavonas-C-glicásidos flavongs-O-C-glicásidos >3> tlavonas-c-glicósmdos >1> biaoys’7ios’ harten >lhizos’nios’ s’agnitolmus flavonoles >?> flavonas-O-glioósidos >3> tlavonas-O-digliofsidos >3> Rhizosnioa pseudopuoctatos’ tlavongl-O-glioóSidos (3> tlavooas-O-digiicesidos (3> flavonas-O-glioósidos (3> tlavonas-O-diglicjSidos (3> flavonas-O-glicésldos >3> flavonas-O-digiicósjdog >3> fiavonas-o-giioésidos >3> flavonas-O-digiicúsidos >3> Lauck >1984> Lauok >1984> Leidioger >1994> Rhizon7llios’ ponotatus’ íobsp. chiotophyllosos Rbizos’rsiusstristuios’ 3.7.3 .AolacoTnntaceae Aulacoas’i os aodrogyoos’ Leidinger >1984> Walt & col. >1591b> Noponan & Nilason >18??> flavonoles >7> Ron & col. >1551> Habn >1893> Nabn & col. >1994> Seeger >1992> MoClore & Miller >1967> Mccíure & Miller >196?> Seeger >1992) Cabo >1993> Babo & col. >1994> Babo >1993> bifíavonoides >6> bit 1avonoides bit lavonoides Aolgcos,nios’ hetecoatiobus’ Ao1acoTs’7i097 palustre bitíavonoides biftavonoides <5> bitlavonoides trifiavonoides >1> Sartras,iaoeae Anacoligwebbii eartras’ia balleriana 3.7.4. Sartras’iaitbvpbylla Sartras’ia posiformia Melcbsrt & ríston >1869> Koziowski >i92i> Wyatt & col. >1991b> SieStí >1988> robot >1592> robOt >1892> robot >1892> Seeger >1968> Seeger >1968> robot & col. >1952> Seeger >1992> Roponen & Nilseon >1977> Geiger & col. >1988> Seeger >1992> <oponen & Nilsson >1977> Sabut & col. >19895> robot & col. >1588a> Sabor & col. >1969a> Wyett & cci. >195ta> Wvatt & col. >1991a> W>’att & col. >1991a> W>’att & col. >1991a> W>’att & col. >19918> Siebí >1988> robot >1992> Anbut & col. >1993> amebí >1988> Biebí >1966> Biebí >1988> robot >1992> rObot >1992> Anbot >1992> Zoponen & Nilsson >1977> Myatt & col. >1991a> Mygtt & col. >1991a> Mygtt & col. >ig9la> Myatt & col. (isgia> Myatt & col. >lSSía> 5i&11 >1588> AOhut >1952> ropoaleo & Nilason (1977> e8yatt & col. >195la> Wyatt & col. >1891a> Mystt & col- >18918> Wyatt & col. >1991a> Anhut >1992> Koponen & >jilsaon >1977> Koponen & Nilason >1977> robot >1992> siebí >1988> Myatt & col. >1991a> Wyatt & col. >1991a> Myatt & col, >1991a> Wyatt & col. >1991a> Wyatt & col. >1551a> Wyatt & col. >19918> Wyatt & col. >185ta> Wyatt & col, >188181 9! 3-att & col. >19918> Anhot >1992> Seeger >1992> Noponen & bOilason >19??> Ropooen & NilaSon >19??> Osterdabí >1979 a y c> istardabí (1979 a y o> Senda & col. >1966a> Harborne >196?> Vandeker>djove >19?ga> Vandekerkbove >1978a> robOt >1992> Roponeo & Nilason >1977> MOes & col. >1986> MOes & col. >1986> s’iebl >1988> robot >1992> Leidinger >1984> teidinger >1984> taook >1994> tauok >1984> Múes & col, >1986> Múca & col, >1986> bifiavonoides bifiavonoides biflavonoides biflavonoides biflavonoides >5> >6> >6> >5?> -p bifiavonoides >2, 1?> bifiavonoides >24?> bit lavonoides >6> triflavonoides >1> ácidos flavonoidicos >1> tritíavonoides >1,1?> 343 Seeger & coL >1983a> asís’ >1992> Sais’ >1954> asís’ & col. >1883> López-SEas >1882> Senda & col- >18668> Seeger & col. >1981> López-ISeo >1592> Seeger & col. >1852b> Seeger & col. >1592b> Seeger & col. >1852b> Saeger >1992> biflevonoides biflavonoides Sartraaia stricta Sreoteliachrysocos’a Sreoteliaeogeniee pbilonotis fontana >5?> >2,2?> Lápez-Sáez >1992> Sala >1994> Mcclore & Miller >196?> Geiger & aokel >1989> tópea-Siez >1992> McClure & Miller >1967> bitlavonoides >6> bitíavonoides Philono tis spbae rocarpe 5.?.8.Txaaiacase Tirria sostriaca bit1evonoides Mctlore & Miller >1967> Seeger >1582> bOcCítare & Miller >196?> bitlavonoides biflavonoides bití avonoides Sesgar Seeger Sesgar Motlore biflavonoides Seeger >1992> Mcclora & Miller bOcolore & Miller >1967> >196?> Moclore & Miller >196?> >1992> >1992> >1992> & Miller (1967> . . . Tirria s’egapoliteoa 3 .7.6. Sl3izogooiaceae Cryptopodios’ bartres’ioides Pyrrhobryosi bitarios’ Rhizogoniol disticbus bOhizogonios’ spiniforse 3 7 7 Hypoodeodracaae Hypnodendron cornetos Hypoodendrooveacoaoos’ Mniodendron tabiticus’ 2.7. aSpiriden tacase apiridena balfourianos 3 - 7.9. taptostos’ataoeae Laptostosos’ mcl inane Laptost 057051 cascrocarpus’ + + bitíavonoides bitíavonoides Seeger >1992> Seager >1992> + biflavonoides biflavonoides Seeger >1592> Seeger >1992> 3.7.10. Meesia triqostra Paludelía squarrose a - Orden OrtbotrichAlea 2.8.1 .Ottbotricbacaae Macrornitrios’ Macrocaitrios guetesla lenas Macros’itrios’ longipea Ortbotricbos’anos’alus Ortbotricbos’ lysllii Ortbot.ricbos, obtositolios’ ilota brocbii ilota pbyllaota Zygodon app. 3 - 9 - Orden Leucodontales 3.9.1. Fontmnalacece enti pyretica 3 a - ecciore Seeger Seeger Becker Secker Seegar Sesgar Sesgar Seeger bitlavonoides bitíavonoidas biflavonoides, biflavonoides biflavonoides biflavonoides -r >1967> pendí & col. >196Ta> Seis’ >1994> Seegar >1992> Moglore & Miller >1967> Sala >1994> bití evonoides Fontinalis novee-anglias Fontina lis aquesos a 3.9.2 clisaciaceas. Clirnacio, as’ericenos, clis’acios’ dendroides & Miller >1992> >1992> (1986> (1986> >1592> >1952> >1992> >1992> Moclure & Miller >1967> Senda & col, >1966a> Vandekerkbove (1990> Sesgar >1992> -p bitíavonoides .AYornodontaceaa anosodon ettenoatui 39,3 raloslodon rostratoz Aoosaodonviticuíoaoa >fedwigiacece ajedeigiaciliata Mcclore & Miller >1997> Secker >1986> McClore & Miller >1987> Senda & col. >1966a> Vaodekerkbove >1980> pecker >1986> 5 3.5.4. -p tlavooas-O-diglicósidos >3> tlavonas-O-triglic&sidos >3?> flavones-0-tetraglicásidos >2> flavonas-C-glicósidos >2. 1?> flavonas-C-glicdsidos >2, 1?> biflavonoides bitlevoooides tlavonas-O-tetreglicósidos >1> tlavonas-O-tstraglicósidos >1> biflavonoidee biflevonoidas Ibacocarpos bumboldtii 5.Leucodontaceae Antitrichie califoroica Antitricbiecortipsodo la acodo & col. >1966a> bOcolore & Miller >1967> isterdabí >1979 a y bí isterdabí >1979 a y b> ¿síerdabí >1579 a y b> teterdalal >1978 a y b> isterdahí >19788,1978> isterdabí >1978> isterdabí & col. >1976> isterdabí & Lmodbarg>1977> isterdebí >1976> Seeger >1992> Sesgar >1992> 3.9. Son & col. >1990> Son & col. >1990> Geiger & col. >1988> Sendo & col. >1966a> Secker >1986> Seeger >1992> Ron & col. >1990> Becker >1986> Sesgar >1992> Seeger >1992> biflevonoides >2> -p bit1 avonoidee Leucodonscioroide a . 3 Plerogonios’ gracile 9 - 6 - Seokeraceae Mos’alia falcitolia Somalia pulobella 19osalia trichornenoidas N+ckera cosplanata bitlavonoides biflavonoidee Seeger >1992> Sesgar (1992> Senda & col- >1966a> bOcolore & Miller >1567> Vandakerkhove >1977b> Sesgar >1992> Secker >1988> Vandekerkbova >1977b> Taeckar >1988> bOctlore Miller >196?> Mcclore & Miller >1967> Sesgar >1992> bifí avonoides bit1 avonoides -p biflavonoides NeC keraoriapa NackeredalpbusnenzíeslY Neckeropsis 1ep3neaoa Poro triclaus’ 1ongirostre 3.9, 7.RecopilacCaC Fiacopilos’ cepense Racopilos’cuspidigerosa bitlavonoides var. convo lotaceos, Ioacopilos’ítros’iteros’ bit lavonoides bit 1avonoides bit lavonoide5 Sesgar >1952> Moclure & Miller Sesgar >1952> Saeger >1592> Sesgar >1992> Pterobryaceae Garovaglia tebitensis Myorius’ bocbstetteri Tracbylos’a plenif olios Mcclore & Miller Sesgar >1992> Saeger >1992> >1997> bití avonoides bití avonoides Mcclure & Miller >1967> bitíavonoides >1967> 3.5.9. 3.9.9. Aarobryopsia longissis’a 344 Floribonda Corea Papillariais’ponderosa Pilotricbelle spp. Pilorricbella cospidata Squemidiorn nigriceos Weys,outhia cocbleaarifolia Weysaootbiamollis 3.9.10. Ptycbos’nieceae Clados’ni 00 Crí coides Ptycbosaaion acicolare + 7 Seeger >1992> Seeger >1992> Seeger >1992> & col Seeger >1992> Sesgar >1992> Seager >1992> hiEl avonoides Seeger >1992> Mormure & Miller >1967> Seeger >1992> bifíavonoides llTbaneoiaceae rbers’aiorn alopecoros 3.9. POayllog oniaccee Catagonius pefltos 3.9.13. Prionodontaceae Prionodon densos 3.9.14. Crypbaes’ceaa Caypbaea app. 3.5.15. Cyrtopodecaae Oyrtopusse tosos 3.9.26 .tepyrodontaceae Lepyrodon toseotosos var. toneriensís 3 15 Orden flookerialee 3 .l0l.flookeriacaee Acbropbyllos’ deotatos’ Oisricbopbyllos’ poichellus’ a6es’ir agia aurea >iookeria locena bitlevonoides biflavonoides hiEl avonoides biflavonoides >1> biflavonoides biflavonoides biflavonoides Vaodelaerkhove >1977b> Becker >1986> 3.9.12. »ookeriaacutifolia >bookeriopsis acicularia .Iiypopterygiacese Catbaros’oioociliatos’ Cyatbopboros bolbosoca Tlypopterygios’ filicolaefonuie Iypopt.erygiornnovae-zelaodiae Isypopt.erygiorneetigeros’ Lopidios, concionos’ 3 11 - Orden Hypnales >1992S> - bitíavonoides Seeger >0992> - bitlavonoides Seeger >1992> biflavonoidas Seeger >1992> + hiEl avonoides Seeger >1992> + biflavonoides Seeger >1552> bitlavonoides bitlavonoides Seeger >1992> Seeger >1992> MoClore & Miller >1967> Roo & col. >1990> Secker >1996> MoClore & Miller >196?> Mcclure & Miller >1967> biflavonoidee biflevonoides bitíevonoides biflavonoides bitlavonoides bUí avonoides Seeger Seeger Seeger Seeger Saeger Seeger >1992> >1992> >1992> >1992> >1992> >1992> biflavonoidaS hiEl avonoides Seeger Seeger Sacker Senda & Secker Seeger >1992> >1992> >19C6> 3.10.2 . ‘-3 3.11 -1. t,eakaaceae 9aplobyrnenios longinerve Iylocosiopsia sPPbeskea polvoarpa Le skee it a nervo Sa Pter’g 3.nendros’ filiforme -P bitlavonoides .Thoidiacea+ MyorelaC jolacea Thoidiopsis turforosa Tboidiusspp. Tboidios’ abietinos’ Ibuidios’ delicatoluTs col. >1988a> >1996> >1992> 3.11.2 biflavonoides bitíavonoidea hiEl avonoides Seeger >1992> Seeger >1992> Seegar >1992> Vandakerkbove >1980> Mctlore & Miller >196?> Vandekerkbove >19??b> Senda & col. leSFia> Sievers >1992> Vandekerkbove >1980> Roo & col. >1990> Sievere >1992> Sesgar >1992> Ibuidios, pbilibertii bitlevonoides >1> Tbuidios’ tarnarisoi folios hiflavonoides >1> Tajoidius tarnarisciiloyl biflavonoides .Asblystegiaceae Acrocladios, auricolatus’ Acrocladios’ cuspidatos’ Calliergon sSflllentosOtfl Calliergonellecospidata 3.11.3 hiEl avonoides Sesgar >1992> Vandakarkbove >1560> Sesgar >1992> Ron & col. >1590> Seeger >1992> Seeger >1992> Seeger >1992> Seeger >1992> Sievera >1992> Senda & 001. >1962> Secker >1986> Vaodekerkbove >1980> Vaodekerkbove >1960> MoClure & Miller >1967> Vanda8cerkbove >1577h> bitlavonoides biflavonoides bití avonoide s hiEl evonoides bitíavonoides biflavonoides >1> antocianidines >1.1?> cratoneoropais Spp. Cratoneoropaisre laica >3repaxaoclados Spp. Orapanocledos aduncos Orepanoclados pseudo-sersientosos Orepanocledosuncinatus »>‘groasblys,tegios’irrigoos’ Palaastriellecos’s’otata Scisrosios’ tricos tatus bOcorpidios’ scorpioides 3.11.4 .Sracbytbeciaceee Sracbytbeciusretlexus’ Bracbyt hecios rivulera =raob3.tbeciusrutabotos’ * hití avonoides Vandekerkbove >1977h> Vaodekerkhove >1990> Vandekarkhove >1990> Sievere >1992> Senda & col. >1966a> MoClore & Miller >1967> Senda & col. >1986a> Secker >1986> Seeger >1992> Secker >19a6> Vandekerkbove >1977h> Sievera >1992> Vandakerkbove >1980> Sievere >1992> Seeger & col. >1993b> Seeger >1992> Sievers >1992> Ron & col- >1990> Senda 1 col. >1566a> Becker >1996> Sievers >1992> Seeger >1992> Seeger >1992> Senda & col- >1986a> Vendekerkbove >1977h> Moclore & Miller >1967> Ron & col. >1990> Vaodekerkbove >1980> Secker >1986> Sesgar >1992> + hitíavonoides >1> biflavonoides Sievera >1992> Seeger >1952> bit 1avonoides Bracbytbecios’salebrosos Sryboiaoovae-angliae Cirripbyllus’ piliterom -p -p hiflavonoides Eorbyncbios’riparioidea Eorhyocbius’ roacitorsie £urbyoc bios sc blemobeas Surbynchiusstriatos’ Tiosalotbecios’ loteaceos bitlavonoides hiflavonoides >2> bitlavonoides >3> hitíavonoides hiflavonoides >2> isirnalorbecios, pbilippeanos’ »os’alotbaciussariceus’ -P tsot becioss’yosuroides Isor haciu~ns’yorus asot beciusa vivipatos’ Pleoropuswilkealanus Rbyncbostegiusriparioides Scleropodios’ poros’ 3. 11. 5.Zotodontaceae Entod onconcinnos e biflevonoides >2> • biflavonoides + bitíavonoides -p +7 345 Entodon ortbocarpua Entodon seductri,c - Plagior loeciaccee Plegiotbeciorn Plagi,otbecioa draytoni Plagiot beciorn lastos’ Sacker (1958> McClore & Mills,r >1967> 3,11,6 bit lavonoides Seeger >1592> Mcclore & Miller >196?> Hendí & col. >1966a> Secker >1986> Sievers >1992> Secker >19a6> Vaodekerkbove >1977b> Sievera >1992> Seeger >1992> -P +7 bitlavonoides Píagiotbe ciocaroseanusa Píagiorbeciusoodtalatos’ titlavonoides bitíavonoides 3. 11.7 .I4ypneceaa Ctenidios’solloscusa biflavonoides >2> biflavonoides I4eroogiella Seligeri TiyOCos’iosaflMoricorn flypnos’ aodoi >Syp nos’ copressiforme bifí evonoidas biflavonoides >2> -p biflavonoides >9> biflavonoides >9> aldebidos flavonoidicos >1> eldebidos flavonoidicos >1> ácidos E lavonoidicos >2> tlavonoles, >1> bitíavonoides >2> ácidos tíavonoidmnos (2> flevonoles >1> bifíavonoides >SypOostiaapOOeOs Sypnusa jotíandicos, Slypnusa íaCuoOíoli Hypoosa lindbergii Bypnusa aubisoponeos Mittanotbesaaios, desainotivus Orttaotfseciosacbryseos’ Ptilios’ crista-cestrensis biflavonoides >1> bitíavonoi des >2> bifíevonoides bit1evonoidea .5 -p biflavonoides >2> Pylaiaia poíyentba 3.11.8. Mylocornieoeae >Oyíocosius’spleodens -p biflavonoides >2> f 1ayunas- 0-gí icásidos biflavonoides biflavonoides >2> biflavonoides Ron & col. >1990> Beodo & col. >19668> VaOdekerkbova >1977b> MccMure í Miller >1967> Seckar & col. >1986> Becker & col. >1986> Sectar & col. >1586> Geiger & col. >1555> >Serzog >1982> Becker >1986> Secker (1956> Seeger >1992> Secker >1986> Roo & col. >1990> Beodo & col. >1966a> Vandekerkbove >1950> Vaodekerkbove >1950> Becker >1556> Seager >1992> Vandekerkbove 1977b> Seeger >1992> Seeger >1992> Seeger & col. >1990> Vandekerkbove >1977b> Beodo & col. >1966a> Vandekerkbove >19T?b> Secker >1956> YSSbo >1993> >Sabn >1993> Seeger >1992> Sievera >1992> Seeger >1992> bit1 avonoides MctMore & Miller >196?> Becker >1985> Seeger >1992> biflavonoides biflavonoides Mccíore & Miller >1957> Seeper >1992> Seeger >1992> bit1 evonoides bitlavonoides Seagar >1992> Seeger >1992> biflavonoides Seeger >1992> bifíavonoides Seeger >1992> -P tlavonas-o-diglic&sidos >1> biflavonoides >2,1?> flavonas-O-triglicásidos >1> flavonea-O-diglicúsidos >1?> biflavonoides >1> lavonas-0-triglicásidos biflavonoides (2,17> bitlatoooides 84y1 ocos’iusa 8? leorozius’ >3?> osibratoca schreberi -P flavonas, >1> flavonaa-O-diglictsidoe >1> biflavonoides > Rbytidiadelpboa loreos bitíavonoides bit1 avonoides biflavonoides >4,1?> Rbytidiadelpbos Sgoarroaus Rb>’tidiadelpbus triquetroa -p Fibytidiopsis robusta 3. Vandakerkbove > 1577b> Sievero >1992> Seeger >1992> Seckar >1986> Seeger >1992> Sievers >1992> Beodo & col. >1966a> McClore & Millar >1967> Sievera 1 col. >1952> bOievers >1552> Sievers & ccl. >1952> Sievera >1992> Sievera >1992> Sievers >4992> Sievera & col. >1994> Sievera 1 col. >1994> Sievars 1 col. >1994> Seeger >1992> s4cclura 1 Millar >1967> Sievera >1992> Secker >1985> Secker >1986> Sievera >1952> Siavers >1952> Seeger >1552> Hendí & col. (1966a> Hendí & col. >1966a> Mcclore & Miller >196?> Vandekerkbove >1977b> Sievera >1992> Beodo & col. >1966a> ll.9.Rbvtidiaceae Rbytidios’ cogoson +7 3.11.10. Ses’atopbyllaceae Acroporius pongeos Sersatopbyllorn asoenos, Wijkia extenoata 3 .ll.11.Lesbopbylleceae Cas’ptocbeete arboscola Les’topbyllorn clandestinos’ 3.11.12 .Scbioodisceae Ecbinodios’ bispifos’ 3.12 Orden Seligerales 3.12.1. S>indiaecaata 3-13-orden Tetraphidalea 3.13.1 .Tetrapbidaceae Tetraphis pellocida 1-? dibidroflavonoles dibidroflavonoles >1?> >1?> bitlevonoides 3 .13.2. calosmiaceee caloanion scbistos,tagiellos’ 3.14. Orden Poíytriohalee 3.14.1. Polytricbaceae Atricbos’ aogoStStus’ A rricbus’ ondo latos’ Mcciure & Miller <196?> Geiger inMarkbas’ >1988> Vandekerkhove >1977a> Secker >1986> Jong >1993—94> Seeger >1952> Mcclore & Miller >1967> Mcclore 1 Miller >1967> Bando & col. >1966a> Backar >1986> long >1593-94> Seagar >1992> -P bit1evonoides 346 > , Oawsoniasuparbe Dendroligotrichus dendroides Pogone tuso cos’ossos’ Pogonatumornigeros’ Polytricbadelpbos longisetos 8?olytricbos, alpinos, Polytricbuscoassuoe - torsosos’ j uniperinos obiense sexangolere tanelilas Seeger >1982> Seeger >1992> Jung >1993-94> Jung (1993-94> Saeger (2.992> Jung >1993-94> acodo & col. (aSEEs> bOcCiore & Miller >1967> Jung >1893—94> Seeger >1992> Jung >1993-94> Jung >1993-94> Mcclure & Miller >196?> Becker >1986> Jung >1992-94> biflevonoides -8? - Polvtricbos’ Polytricburn Polytricbos’ Polvtricbos Poivtricbos biflavonoides bitlavonoides biflavonoidea - AflEXO 2: Relación de flavonoidea identificados en nuesos Doctoral> >7>- - dato dudoso y/o tentativo- <Autorías exceptuando los reeultadoa de la presente Memoria aegún Anderson & col., 1990 y Crosby & sIagil, 1981> 1. PLAVONAS 1.1. Flavonas >aqliconaa APIGERINA <5,7,4’-trihidroxi-tlavona> Bryum srgenteum >Merkbem & Given,1588> Pleurozium schreberi >Vaodekerkbove,l5SO> Plagiomnius’ insigne (Wyatt & col., 19918> Plagiocnniom claros, >Wyatt & col,, 19918> Plagiomnius’ aftine bOyatÉ a col., 199la> Plagionsnioaa ellipticos’ >Wyatt & col., 1991a> Plagiosnitam sediusa 51112. ctarvatulurn >Wyatt & col., 19918> Plagiomnius, s,edios subap. medios, >Myatt & col. ,1991a> Plagios,niura ciliare (bOyabí & col- ,lSSla y b> Bibliografía adicional: Geiger & col. <1988), Mabry & col. <1970>, Wollenweber & tlietz <1981> col. >1587>. , Narkbam LUTEOLIRA <3’-bidroxi-apigenmoa- 5,7,3 .4 -tetrahidcoxi-flavona) Sryum sctoleicheci >Stein & Ziosmeiatec,1991;Stein,1958b> Bryom argenteus, >Marktoam & Given,1955> Bryum cepillare Siegel & coY ,,1989;Stein & col.,1955; Aobot,1985 y 1992;Siegel,l58S;Btein,lgSSb> Bibliografía adicional: Mebry & col, >1970>, Jay & col. >1575>, Markbam <1982>, Geiger & col. >1957 y 1988> , Wollenweber & Dieto >1981> 1.2, Flavonas C-olicosiladas ESCOPARINA c c isoer in 1 - 5 - O - ql mcdsido> >?>Plagiomniom atfine >Melchert & Aleton, 1965> Bibliografía adicional: Mabry & col. >1970> VITEXINA >apigenina-5-C->S-0-glocopiraoós,ido> >?>Plagiomnitarn attine >Melcbert & Alston,1565> Bibliografía adicional: Nabasy & col, (1970>, Marklaam & gilsOn >1989>, VITEXINA 2’’ -RAMNOSIPO <rasuosilvitexina- apigenina-S-G-ramnoglucósido( Eryom achleicheri >Stemo & Zinsaaeiater,1991;Stemn,1958b> Bibliografía adicional: Mabry & col. >1970> CRISOERIOL-6-C-ARABINOSIDO-S-C-EEXOSIDO <crisoeriol— loteolmoa-3-metiiéter— 5,7,4’-tribidroxi-3-metoxiflevone> <?>Plagiomnium aftmne Melohart & Alston,1965> Plagiomnios undulatoa >ástacdahi,1979 a y O> CRISQERIoL-6-C-SEXOSII3O-8-C-RAMNOSIDO >?>Plagiomnius elatun3 >Anlaot 8. col. .19898 y 1952; Anhot, 1592; Bietal,1988> CRISOERIOL-di-c-GLUCOSIDO >estallarina-2— crisoeriol-6,8-di-C-glucósido> Bryurn pseodotriqoetruaa >stein & Zinsmeister,1990; Socio, 1955b> Rryum palleacena <Stei;a a Zinas,eister,299; Steio,1988b> Bibliografía adicional: Nlarklías a Bilson >1589> VICENI&A-2 >apigenina-6, 8-di-C-glucdaido- apigenina-6-C-Z-D-plucopiranos’il-8-C-Z-o-glucopirsnósido> >?>Plagios’niom affine >Melchect & Alstoo, 1965> Bryum schleicheri Socio & Zinsmeister,1591; Stein, 1958b> l9ry-ua~ pallasceos & Zinsmeister, 1991; SOcio, 1955b> Eledmigia ciliata Qeterdabí, 1979 a y b, 1978a> Plagiocanios’ cospidatos <OsterdalIl, 1575 a y o> Plagiomniua undulatus, >Vandekerkhove, 1975e> Esryom pseodooriquebrua >Stein E, Zinsmeistsr,1590; Stein, 1988b> Bibliografía adicional Mabry & col. >1970>, Msrkbsm & bOilson >1989>. >80cm ScHA?ToSIDO >apigenina-6-C-8S-D-glocopiranosil-e-C-o-L-arabmnopirsnéeido> >8ryua achíaicherí >Stein & Zmnemeister, 1991; Stein, 1988b> Plagios,niomondulatoa <ústerdabl, 1979 a y o> Bibliografía adicional: Markham & Cilson >1989> 347 8, . ISoScHAFrosIDo >apigenins-6 -C-a-L-arabinopicanosil-5-C-d-12-glucopiranóeido> Sryum schlaicheri (SOcio, 1988; SEsin & Zinsmeistec,1591> Plagiomnius ondulatos’ >ésoerdalb, 19795 y Bibliografía adicional: Mackbam & Wilaon (1585> NEOSCHAFTOSIDO >spigenins-6-C-$-D-glucopirenosil-8-C-Z-L-srabinopirsnásido> Plagiomnios’ undulatom isterdahí, 1979a y c> Sibliografia adicional: Beason & col. <1954>, Markham & 9*ls’on <1989> NEOISOSCHAFTOSIDO >apigeomna-6 -C-&-L-arabmnopiraoosil-8-C-8S-D-glucopicanósido> Plagios,oiosondulatom <isterdahí, 1979a y o> LUCENINA-2 <luteolina-6,8-di-C-S-o-glocopiranásido> PlagioTsniom datos’ >Anbot & col., 1989a y 1992; AnlYut, 1992; Mabí, Bryom pseudotriqoetrus >Stein & Zines’eistsr,1990; 50cm, 1988b> Bryoca schleicheri >Stein & Zinsísciater, 1991; Stein, 1988>9> Bryuas pallescene (50cm & Zinsmeister, 1991; SOcio, 1588>9> 1588> Hedaigia cUlata >Ósterdahl,197g a y >9, 1978a> Bibliografía adicional: Markbas & Wilson >1989> ELATINA >loteolina-6-C-S-O-glucopiranosil-S-C-a-L-ras’nopiranósido> Plagiomniusa aletos, (AsibuL & col., lSSSa y 1552; Anbut, 1992; Bichí, 198$) LUTEOLINA-6-C-XILOSIBO-8-C-HEXOSIBO Plagiomnius’ datos’ <Anhur & col., Siebí, 1988> ORIENTINA (loteolins-8-C-Z-0-glucopiranosil> Plagiornniom alatom >Anbot & col., Sibliografía adicional: Mabry & col. 1989a y 1992; Anbut, 1992; 1985a y 1592; Anbut, 1552; Siehí, <1970>, Markhem E, bOilson >1585> ISQORIENTINA >luoeolmoa-6-C->S-o-glucopiraaiosií> Plagiosnius’ alatus’ (Anhor E, col., 1989a y 1992; Aobut, 1992; Siahí, Plagiosniuca affmoe >Fr-eioag & col., 1986> Bibliografía adicional: Mebry E, col. >1970>, Hackhaua & Milson <1959> 1.3. 1988> 1988> Flavonas 0-glicosiladas APIGENINA 7 -O-NEOBESPRAIDOSIflO >apigcnina-7-0[s’-L-ramnosil >1-2> glucoaa] - roitolina> Bryus scbleicheri >Stein & Zinsmsiater,1991; Socio, 1988>9> Hylocomium eplendene >Vandekerkhove, 1977>9> Plagiomnios’ claros’ <Anbot E, col., 1589a; Anhut, 1552; Mclii, 1988; Plaorozíos’ scbreberi >Vandakarkhove, 1980> Soyom pacudotriqoetros, (115am & Zinsmaistar, 1550; Stein, 1958b> Hedwigia ciliata >Óstardahl,1979 a y >9> Plagiomnios’ ellipticum >Wyatt & col., 19915> Plagiomniua mediusa sobap. medios, bOyato & col., 1991a> Plagiomniusa s’ediust aobsp. curvaoulom >Wyatt & col., 1991a> Píagiomniusa coepidatos’ <Anbut, 1992> Bibliografía adicional: Mabry & col. >1970> Wyatt a col., 1991a> APIGENINA 7 -0-TRIGLICOSIDO (apigeoina-70- [2,4-di-O>a-L-ramnopirsnosil> ) -SS-o--glocopiranésido> Dicranum scoparius’ Nilseon a col,, 1973; Osaterdalil, 1979a> lylocoTsiomsplendens >Sacker & col., 1956; <?( Becker, 1586> DIOSMETINA 7 -0-TRIGLICOSIDO <diossatina-7-O[2,4,-di-O- >«-b-raanopicanoail>] -iS-O-glucopiranisido; metoxiflavona> Iicraous’ scoparius’ >Óaterdahl,1979a y 1978>9> APOMETEGERINA 7 -O-GLICURONIDO >apometzgerioa—5,7,2 ,4’,$-pentaOH-3’,4’-dimetil-tlavons> Rhizoinnios’ magoifolios’ <Miles & col., 1986, Leidinger, Fihizomnios’ paeodoponctaoos’ >5-lilas E, col., 1986; Lauck, 1984, 1954> diosmatina— Lauck, 5,7,3’-trihidroxi-4’ 1984> LUTEOLINA 7 -0-RAMNOGLUCOSIDO a>ramnoglucosilrotinócido >-O-«-L-ramnosil >1-6> glucosa> b(asa,nooglocos’ilnachespecidésido >=O-a-L-rarnnosil >1-2> glucosa> Biccanos’ bOcopariusa <Nilseon & col,, 1973,no especifica ramnoglocosil; isterdahí, 1979a neoheaperidésido> 5ryure scblaicbari <Stein & Zinsmaistar,1951; Guam, 1955b: ambos neohesperidésido> Poyos pseudotriqoetrus’ >55cm E, Zinamaiatar,1990; Socio, 1988b:asbos neolicaperidósido> <7> Hylocoaios’ eplandeos <Sachar & col., 1956; Sacher, 1556:no especifican ramnoglocosil> Iledwigia ciliata <Óstardahl,1979 a y b:neohesperidáaido.> Bibliografía adicinonal: Mabry E, col. <1970>, Osterdahí E, Lindberg >1577>, Markhsm E, Milson >1988> LUTEOLINA 7 -O-NEOHESPERIDOSIDO- 6’ ‘ -MALONILESTER Sryus’ schlaicberi >Stein & Zinsmaister, 1991; 115am, 1988>9> sryos’ pseodooriqoetrom >55cm & Zinsasnaistar, 1990; 55cm, 1988>9> DIOSMETINA 7 -0-GLUCOSIDO (diosmetina 7-O-6-0-glocopicanósido> Bryosa cepillare Siegel a col., 1988> 1989; Socio & col., DIOSMETINA 7-O-GLUCoSIDO-6’ • -MALONILESTER Bcyom capillaca <Siegal & col., 1959, Steio E, col,, y 1988b> 348 1985; Anhot, 1985; 198$ y 1992; Anhut, 1985 y 1992; SOcio, Siegal, 1988b; 1988; Siagel, Socio, 1985 - LUTEOLINA 7 -0-GLUCOSIDO (luocolina 7-o-ft-D-glucopirandsido> s’ryus’ scblaicberi <110am & Zinss’aistcr, 1991; 5>9cm, 198Gb> Bryos’ arganteos’ <8laayklias’ & Citen, 1988> Bryos’ capillara (Siega E, col., 1989; Stain E, col., 1985; Anhut, 1985 y 1992> 1588>9> Bibliografía adicional: Slabry & col, (1970>, Markham (1982>, Catardahí & Lindberg Markhas’ & bOilson (1988> 6-HIDROXI-LUTEOLINA 7 -0-GLUCOSIDO )6-hidroxhi-lotaolina 7-0-8-D-glocopiranés’ido> Bryum acblcicbari >Stein & Zinss’cister, 1991; Stain, 1988>9> s’ryos’ cepillare (Siegal & col., 1989; 5>9cm & col., 1985; Siagal, 1992; LaiditYger, 1984> 6 -HIDROXI-LUTEOLINA 7 -0-GLUCOSIDO-6’ ‘ -MALONILESTER eryo>n schlcicbcri & Zinesicister, 1991; Stain, 1988>9) Bryusi capillare (Siagel & col., 1989; Stein & col., 1985; Anhut, y 1988>9) 1988; Siagal, (19??>, Stain, 1988>9; 1988; Socio, Ostardahí Anbot, >197gb), 1985 y 5>9cm LUTEOLINA 7 -GLUCOSIDO-6’ ‘ -MALONILESTSR Bryos’ scbleicbcri <Stain E, Zmocs’aistcr, Bryos’ cepillare (Giagel E, col., 1989; y 1988>9> eryos’ argeooaus’ (Marinas’ E, Civan, 1988) 1991; 5>9cm LUTEOLINA 7,4’ -di-O-NEOHESFERTDOSIDO bOedeigie ciliara )Óatcrdabl, 1975a E, Stein, col., 1985 y 1952> Siagel, y 1976) 1577> APIGRNILNA 7-O-flOggSpflrDOSIDO-4’ -O-SOFOROSIUO sladwigia ciliata (éstlerdabl,1979 a y b) APIGENINA 7-O-flOHESPERIDOSIDO-4’ -O-S-D-GLUCOSIBO Hadeigia ciliata (és>9ardahl, 1579>9> LUTEOLINA 7-O-NEOHESPERIUOSTUO-4’ -O-S-D-GLUCOSIbO Hadwigia ciliata >is>9ardelil, 1979>9) LUTEOLINA 7-O-6-fl-OLUCOSIDO-4’ -O-NEOHESPERIDOSIbO Hedeigia ciliata (óstardehl, 1979>9) APIGENINA 7 -0-Gtucosino (apigenina 7-O-fj-o-glucopiranósido) Gryuca capillare )Steio & col., 1585; Staio, 1988>9; Anhur, 1985 y 1992) Bryuu, arganteus’ (Markhes & Givan, 1988> Bibliografía adicional: Mabry & col. (1970>, Markbas’ & bOilson (1988> APIGENINA 7 -O-GLUCOSIDO-6’ -MALONILESTEE Bryos’ cepillare (Socio & col., 1985; Anhot, 1985 y 1992; 5>9cm, 1985 y 1588>9> & Civeo, 1988> 7-O-NEOHESPERIDoSTDO-6’ ‘ -MALONILESTER Bryos, pscudo>9riquatros’ (Socio & Zinsmaister,19g0; APIGENINA 50cm, 1988>9> LUTEOLINA 7 -0-GLUCURONIDO Rhizos,niom s’agoitolius’ (Mies & col,, 1586; Leocin, 1984; Ocidingar, Rhizos’nium pccudopunctatum (Mies & ccl., 1988; Lauck, 1584> Bibliografía adicional: Marinhas & bOilson (1988> CRISOERIOL 7 -0-GLUcURONIDO Fibizosinios’ s’agnutolios (Miles E, col., 1986; Laidinger, Fibizoenios’ pseodopuoctatus’ (Mies & col., 1986; Lauck, Bibliografía adicional: Merinhas’ & Milaon (1988> 1984; 1984) 7,3’ -DI-0-GLUCURONIDO Fihizosnius sagnifolius’ (Mies & col-, 1988;, taldlnger, 1984; Rhizos’nium pseudoponctctom (Miles, & col,, 1586; Laock, 1984> Laock, 1984) 1984> LUTEOLINA Laudo, 1984> SELGINA 7.5’ -DI-O-GLUCURONIDo (salgina— 5,7,3’ .4’ .5’ -pentaú>8-3 -e>atil-tíavona) Fibizomnios’ sagnifolios’ (Miles & col., 1986> Leidinger, ahizomnios’ pceodoponcta>9os’ <Miles & col., 1986; Lauck, 1984; 1984) Leuck, 1984) 7.3’ -OI-O-GLUCURONIDO )tricctina= 5,7,3’ .4,5pan>9ahidroxi-tlevone> Rbizos’niusa s’agnitoliurn (Mies E, col., 1586; Laidingar, Rbizos’nius’ pscodopunctatos’ (Mies 8, col., 1986; Laock, 1984; 1984> Leocin, 1584> TRICETINA ESCUTELLAREINA-7 -O-GLUcOSInO (escutellareina— 5,6,7,4’-tarraoll-tíavona) )?(Gryusa weigalii (Nilason, 1969) Bryos’ psaodotriqoetros’ 50cm & Zinseeistac, 1990) ESCUTELLAREINA-7-O-GLUCOSIDO-6’ ‘ ~MALONILESTER s’ryuTTI pseudoslriquetros’ <Socio & Zinamaister, 1990; ISOESCUTELLAREI&A >iaoescotellaramoa= eryos argcntausn 1985 1588>9> 7-O-NEOHESPERIDOSIGO-4’ -0-SOFOROSIDO (s,oforósido)2-O-5-o-glucopiranosil( -Z-o-glucopirandsido> Hadwigia ciliata (icoardabí, 1979a; Oetarda>31 & Lindberg, (Markbas’ SOcio, 1585; Anhot, 1985 y 1992> Siegel, 1988; SOcio, 1985 LUTEOLINA Bryos’ argentaus’ 1988; 7-O-5-12-GLUCOSIDO 5,7,8,4-oeorahidroxi-flavona> >Markbam 6 Civen, 1588> 349 bObemn, 1988>9) .-), HIPOLAETINA 7-O -S-D--GLUCOSIDO <8-bidrooci-lnteolinc-7-O-S-o-glocopiranósido) Bryus’ argenteos’ >Markhas’ E, Giveo, 1988) 1,4, Flavonas 0/0-glicosmíadas SAPONARINA <apigenina 6-C-ú-D-glucopiranosil -7-O-Z-D-glucopiranásido— iaovioaxmna-7-O-glucásido) plagiosanios’ cuspidatum )Melcliero & AlsOoo,1965; Kozlowaki, 1921; robot & col., 1589a y 1992; Zopenco Nilasoo, 1577; robot, 1992; Seeger, 198$> Plagiosniusa undolatus <isterdahí, 1979 a y c; Vandekarkbovc, 1978a; Zoponen E, Nilseon, 1977> Bibliografía adicional: Mabry & col, >1570>, Moliscb <1911), Marinhan & bOilson >1589> E, 3’ -O-NEOHESPERIDOSIDo Plagiomnius’ attmoc )Fraibeg & col., 1986) Bibliografía adicional: Merkl3as’ & Milson >1989) ISOORIENTINA ISOORIENTINA 3’ -0-SOFOROSIDO Plagios’oium affinc <Freitag & col,, 1585> Bibliografía adicional: Marinhas’ & Bilson (1989> ISOSCOPARINA 7-O-GLLTCOSIDO >6-c-%-o-glocopiranosil-crieoeriol-7-0-6-n-glucopiranósido> Plagiosoios’ cospidatos’ (Anbot E, col., 1989a y 1992; Anhot, LUTONARINA )6-C-Z-D-glocopiraooail-luteolina-7-O-S-D-glucopiranóaido= Plagios’oium cuspidetos’ >Aobut & col,, 1589a y 1992; Isooricooina-7-O-glucésido> Anhut, 1992; Sccgsr, 1588> 2. 2992; Saepar, 1992) PLAVONOLES 2.1, Plavonoles <agliconas 3- METOXI - KAEMPFTROL >kaes’pfcrol— 3-hidroxi-apigcnina) Gryum pecudotriguatrus (SOcio & Zioss’eistcr, 1990; XAEMPFEROL >{ypoos’ cupracasitorsie & col., 2.2, Plavonolas >Sievars’, 1992; Sievcrs Socio, l5$8b> 1554> O-c=licoailados OUERCETINA-3 -0-UIGLICOSIDO quercetina— 3-hidroxi-lutcolioa> >?(Mnios’ arisionicos’ >Mclchart E, Aleton, 1965> Bibliografía adicional: Mabry & col. <1970>, Merk>9as’ & Wilson >1988> - XAEMPFEROL 3 -0-GLUCOSIDO Bryus’ pallesceos (Socio E, Zinsaciatar, 1951; SOcio, 1988>9) Bryos’ pacudotriquatros’ (Socio & Zinsmeisoer, 1990; Gtein, 1988>9> Bibliogratía adicional: Markbae >1982), Marinhais & bOilson >1988). XAEMPFEROL 3 -O-NEOHESPERIDOSIDO (kacapfarol-3-o-[o-b-raaoosil >1-2> glucosa]> <?)Bryum pallasceos )Stein & Ziosaciatar, 1991; SOcio, 1988b> Bryus’ pscodotriqoctros’ (Socio E, Zinsaicister, 1990; SOcio, 1988b( Bibliografía adicional: Markhes’ & Milson >1988) KAEMPFEROL 3,4’ -di-O-GLUCOSIDO Bryuss palícaccos (Socio & Zinareciater, 1591; SOcio, 1988>9) Bryum ps’audotriqueoros’ <SOcio E, Zinss’aistar, 1990; SOcio, 1988>9> Bibliografía adicional: Markbam & bOilson >1988> XAEMPFEROL 3 -0-GALACTOSIDO Bryos’ pscodobriqoctrum <Sucio 1950; SOcio, 1988b> XAEMPFEROL 3-O-GALACTOSIDO-4’ -0-GLUCOSIDO Bryos’ pscudooriqoctrum (Socio E, ZinsTscistcr, 1990; SOcio, 1988b> KAEMPFEROL 3-O-GLUCOSIDO6’ ‘ -MALONILESTER Gryora paaudotriquctros’ <Socio & Ziosmeister, 1990; SOcio, 1988>9) 3, & Zioss’ciatcr, ISOSLAVONAS 3.1 - Isoflavones <egliconas> OROBOL >5,7,3’,4’-tatrabidroxiisoflavooa= 3’-bidroxi-gcnisoeioa> Bryos’ capillara <AnImo & col,, 1984; Siegel & col., 1989; $tcin E, rol,, 1985; Aohut, Siegel, 1988; SOcio, 1988>9) sryum schlcicheri (Socio & Zios,s,eister, 1991; SOcio, 1988>9> Bibliografía adicional: Mabry & col, >1570>, Geiger & col. >1987), Bambas >1982< PRATENSEINA <5,7,3-Oribidroxi-4’-metilctcr-iaoflavona) Bryos’ cepillare >Aohut & col. .1584; Aohot, Socio & col., 1985) Bibliografía adicional: Mabry & col, >1970). 3.2, Isoflavonas 198$ y 1992; Siagel, 1988; SOcio, 198eb; 1985 y 1992; Siagel E, col. 1585; O-QliCosiladaG OROBOL 7 -0-GLUCOSIDO <orobol-7-o-S-D-glocopirandsido> Bryos’ cepillare <Anhur & col. .1984; Socio & col, .1985; Siegal 1588; 50cm, 1988>9> Bryum cchlaicheri Socio & Zinameister, 1991; 110am, 1988>9> 350 & col., 1555; Aohut, 1985 y 1992; Sieqel, ) PRATENSEINA 7-O -GLUCOSIDO )pratanscioa-7-0-S-D-glucopirenósido) Bryurn capillare )N3but E, col., 1984; Gtein & col., Siagel, 1988; Steio, 1988b) OROBOL 7-O-GLUCOSIDO-6’ ‘-MALONILESTER sryum schleicbcri Socio & Zioss’cister, Gryum cepillare <Siagel & col., 1989; ORODOL (3’6 4’)-O-GLUCOSIDO Bryus’ schlaicbcri <Socio 1991~ Staio, socio & ccl., & Ziosaciater, 1991; OROBOL (3’¿ 4’>-O-GLUCOSIOO-6’’-’MALONILESTfl )?>Bryum scbleichcri (SOcio & Zioss>eistcr, OROBOL 7 -0-DIGLUCOSIDO Bryos’ scblaicbari (50cm & Zioas’cis’tcr, E, col., & col., 1989; Anbut, 1992; Siegel, 198$ 1988; y SOcio, 1992; 1988>9> 1588>9> Staio, Steio, 1551; Siagal 1588>9> 1985; Anhut, Steio, 1991; PRATENSEINA 7 -0-GLUCOSIDO- 6’’ -MALONILESTER Bryus’ cepillare Siegel & col,, 1989; Socio 4. 1985; 1988>9> 1988>9) 158$; Anlioo, 1952; Siagel, 1988; Stain, 1988>9) BIFLAVONOIDES 4.1. Bifíavonas )dis’eroa flavona-flavona y flavona-tlavanona 5’. ‘‘ DIRIDROXI- AMENTOBLAVONA >5,8’ - biluocolina> Racositrius lanugioosua Roo E, col,, 1550; Geiger & col, 1988) <?)Hcdwigia ciliaba <Osterdalil E, col,, 1986( Bartrasiia hallariana )Sals’ & col., 1993; Ss’ls’, 1992> Anacolia wa>9>9ii <Seeger E, col., 1993a; Geeger, 1992> 1990; Geiger Dicrenuin scopariun )Lindberg & col., 1974; isterdalil, 1979a y 1583 Ron E, col., Voigt, 1993) Baciner, 1986> >4ylocosoius splcodcna <Geiger & col,, 1988; Beciner & col., 1986 Antitrichia coroipeodula Geiger E, ccl. .1988> Dicranoloina robustos’ <Marinhas’ & col., 1988> Gryus scblcicheri SOcio, 1988 a y >9; Socio & Ziosíacistar, 1991) Philonotis tontana <Geiger E, Gokcl, 1985> Campylopus holomioriosa >Marklies’ in Geiger, 1950; Geiger & Marinlias’, 1552> Rbyoidiadelphus aqoarrosus (Seeger & col,, 1990; Seeger, 1552> Bartras’ia pos,itors’ic Seeger, 1992; Seeger E, col., 1992b; Lépez-Sáez, 1592> Bartras’ia iobypliylla )Ldpcz-Sácz, 1992) eartras’ia soricta >Lópcz-Sáaz, 1552> Dycncs’on calycinos’ VoigliO, 1993> caspylopos introflexos )Wcyeod, 1993) BrcoOclia chrysncoma Seis’, 1994) rolacomnios’ androgyoos’ (Haho, 3993> rolacomniusa palustre (Galio, 1993) 5’ .3’’ ‘DIBIBROXI-RORUSTAFLAVONA >5, 6’’ -biloteolmna) Garoras’ia halleriana <SalT,, & col,, 1993; Salas, 1992> Anacolia wcbbii Seegar & col., 1553a; Seeger, 1992> >Jylocos’iua splaodcos <Beciner & col,, 1986; Gccker, 1986> Anoitrichia curtipendula Geiger & col, .1988> Racoraitrius’ lanuginoso,,, <Geigar & col., 1988( oicraoolos’e robustra <Marinlias’ & col., 1988) Philooooia fontana <Geiger E, Boincí, 1989> Plagiomnius’ cospidatos’ (Aohot & col., 1989a y >9; Seeger, 1988; Anliut, 1992> Cas’pylopuc bolosnitrilis’ Marinlias’ in Geiger, 1990; Geiger & Markhas’, 1992) )?>Rhytidiadalpbus sqoarroBoc Seeger & col., 1990> s’ryuus cepillare Siagal E, col., 1989; Aobut, 1992; Siegel, 1988; Stein, 1988>9> cas’pylopus cíavatos <Geiger & Bambas, 1552> Dycoccoo calycious’ <Voigbt, 1993> ca,rnpylopus mntrotíexos >Wayand, 1953> Aulacos’oios’ aodrogynum <Galio, 1993( Aulacoanius’ palustre hab, 1993) Breotelia cbrys’ocos,a )Sals’, 1994) Dicranus scoparium <Geiger E, col., 1993>9; Voigt, 1993) 2, 3-DIHIDRO-5’ -HIDROXI-ROB!JSTAFLAVONA Plepiocnioa cospidaOos’ >Anboo & col,, 1989a y >9; Seeger, 1988; Aohut, 1992> 2’’, 3’’- DIHIORO-5’ A’’’ -DIHIDROXI-ROSUSTAFLAVONA (2’’ .2’’ -dibidro-5’ , 6’’- bilutcolmna> Oicranoloma robustos’ >Markbas’ & ccl., 1988> Oicranoloea >9illardieri <Marinlias’ E, col. .1988> 5’ -MIDROXI -AMENTOFLAVONA <luteolina>5’ .8’’> -apiganmna> Plagionanius’ clatuso >Gciger & col., Rbyoidiadalpbos equarrosos (Seeger 1988; Aohot & col., 1989a; Anlioo, & col. .1990; Seeger, 1992> 2, 3-DIRIDRO-5’ -HIDROXI-AMENTOFLAVONA Plagiosaniusa cuspidatos’ <Anhut & col., 1989a y >9; Seeger, Rliytidiadelplios sqoarros’us >Sceger & col., 1990; Seeper, 1992; Biclil, 1988; 1992) Aohuo, 1952> 2.3 -DINIBRO- 5’ 3’ ‘ ‘-DIHIDROXI -AMENrOFLAVONA >2,3-dibidro-5’ , 8’’ -bilutcolina> Phtíenotis tontana (Geiger & Boinel, 1989; López-Sácz, 1992> Plcgios’niusa coepidaOus’ >Anhot & col,, 19898 y b; Seeger, 1988; >?> Barorasia itbyphylla )López-Sácz, 1992> Aolaros’oius, aodrogyous’ Babo, 1553> Aulacos’oios’ palosore Rabo, 1993> Anhut, 1992> 351 1988> & col,, 1993>9; ) .> 5’ -HIDROXI -ROBUSTAFLAVONA <luteolina>5,6’> -apigenine> Rhytidiadclphos equarrosus’ <Seeger & col. 1990> O ICRAROLOMINA >2’, 6 -biluteolmna) Anacolia Mcbbui Seeger & col., 1993a; Seeger, 1592> nicranoloma robusourn <Bambas’ & col-, 1988> Pbiloootis fontana Geiger & Sokel, 1989) Sartrarnie posaiforuuis <tdpez-S~az, 1992; Seeger, 1992; Aulaconinius’ gabarra Galio, 1993> 2,3 -DIBIDRO-DICRANOLOMINA )2,3-dihidro-2’ 6’ -biluteolina) nicranoloma robustos’ <Marinhas Aolacos’niore aodrogyous’ Habo, & col,, 1593> Seeger & col., 1992>9) 1588> FILONOTISFLAVONA <2’, 8’’ -biluteolina> Anacolia wabliui Seeger & col,, 1993a; Seegar, 1992> Bartras’ia lialícriana >Sals & col., 1993; Sals’, 1992> Pbiloootis fontana Geiger & Gokeí, 1989; tópcz-Sácz, 1992> Dicrenoloras robocruin >Markhes’ mn Geiger, 1990; Markhas’ E, col,, 1988> Bartreusia pomifcrrnis (Seeger E, col., 1991 y 1992>9; Seeger, 1992> Baroramia stricta )Oépcz-Sáez, 1992> 2. 3-DIBIDRO-FILONOTISFLAVONA >2,3-dibidro-2’ , 8’’ -bilutcolmna o criodictiol)2’ 8 ‘ > -luOcolina> Anacolia wabbii Seeger & col., 1953s; Seeger, 1992> Bartras’ia hallariana <Sala & col,, 1993; Sals’, 1992) philonotis fontana <Geiger & Gokcl, 1989; Lápez-SAez, 1992> BarOrarais pos’ifors’is Seager & col,, 1992>9; Seeger, 1992) Aulacocanios’ androgyoum >Malin, 1993> APIGENINA-(3’,3’’’>-NARINGENINA Hos’alotbcciura lutesceos (Sievcrs, 1992> Hos’alotlicciurs, seciccos’ <Sievera, 1992) 81os’eiotlicciurn pbilippcaous’ )Sievars,, 1992) Ptilios’ criste-castrensis >Sievers, 1992> Otenidios’ solluccos’ (Sievara, 1992> Rliytidiopsis robusOa <Siavarca, 1592> 3’ ,3’ • ‘-BIAPIGEMINA HoTnaloobecios’ lutesceos Sesgar 2.3-DIHIDRO-3’ .3’’ ‘-BIAPIGENINA Hos’alotbcciom 4,2. lotasceos Siflavanonas & col,, 1993>9) & col., 1992>9> <Seeger diraeros flavaoooa-tlavaoooa 3’ 4’’’ -BINARINGENINA Piluoriobella cospidata Seeger E, col,, 19928> Orapanocladus adoncus Siaverra, 1992> lJoeualoobecios’ sariccusa Sievere, 1992> liorsalcobecius’ lotesceos Sievare, 1992; Seeger Gornalotbacios’ pliilippcanus’ (Sieversa, 1992> Entodon concmonus <Sievars, 1592) POilius’ crista-castransis Siavere, 1992> Ctenidiusa s’ollos’cus’ >Sicvars, 1992) Rbytidiopsis robusta Sievere, 1992> Tboidium tas’ariscmnua Sievere, 1992> Thoidiom pliilibaroii Sievera, 1992> 4,3. Dis’croa BRIOFLAVONA Bryos’ capillare HET MROB R YOF LAVO8TA Gryum capillara Gryua ecblaichari 4,4. Dímeros & col,, 1993b> isoflavooe-tlavona >Gaiger & col., 198?; Siegel & col., 1989; Geiger & col., 1987; Anbut, 1992; Siegel, <Staio, 1988a y >9; Socio & Zmoss’cicocr, Aobut, 1988; 1991) 1992; Siegal, SOcio, 1988>9; 1992; Seeger, 1988; Siegel aorona-tlavanooa CAI4PYLOPUSAURONA >aoreos’idina-5’,e’-ariodicoiol) Cas’pylopos clavaros Geiger & Maminhas,, 1992) Cas’pylopus bolocaitrios’ <Geiger & Maminhafia, 1992> Cas’pylopuc inoroflexos )Mayaod, 1993) 4.5, Biaorooas (d=s’cros aurona-aurona 5’. 5’’- BIAUREOSIDZNA Aulacosinios’ endrogynum )5<alin, 1993; Galio E, ccl,, 1994> Aulacosnoios’ palustre )Halin, 1992; Hahn & col,, 1994> 4,6. Eiflavoooidce s,acrociclicos BARTRANIAPLAVONA )2-liidroxi-2,3-dihidro-2,8’,8,2’’’-bilubaolioa> Bartras’ia balícriana <Sale, 1992; Salm & col., 1993> sertras’ia poraitorrais >Sccgcr & col,, 1991 y 1992>9; t,ópcz-Sácz, 352 1992) Socio, & col., 1988>9> 1989) .-,) ANHIDRO -BARTRAMIAFLAVONA >2’ 8’’ 8,2’’’ -biluOcolina) BartreTsia lialleriana )Sals’, 1952; Sals’ & ccl., 1953> Baroramia pomitorínis Seeger E, col., 1991 y 1992>9; Lipaz-Sáez, 4.7. Dís’cros’ con dihidrotíavonol dibidrotlavonol-flavonol HIPEOGENOL 3 <dibidrotlavonol-3’ ‘3’,, -nariogenina> Hypous’ cupraesitonse >Sicvers, 1992; Hypnus’ lind>9ergii >Sievers, 1992) 8<ypotatn aodoi Sievara, 1592) Sievers a col,, Sievcrs E, col,, 1992> Siavera & ccl,, 1954> ISIPNOGENOL 31 >dihidrotlavonol-3’ 3’’’ -inaempacrol> Hypoos’ cupresasitors’c <Sievera, 1992, Seager, 1992> diliidrotlavonol-flavaoona. <dibidroflavcnol-diliidroflavonol HIFEOGENOL A (dibidroflavonol-3’ 3’,, -dibidroflavoool( 8fypnus’ copreesitorme Sievera, 1992; Hypoos’ liodbergii Sievera, 1992> Hypoom andoi (Sicvcrs’, 1992> Gypoom jotíandicun, Sievere, 1992> HIPNOGENOL 32 )dibidrotlavoool-3’ 3’, >Eypoua coprcssiforme 1992; 1992> -dihidroflavoool) <Sievera, 1992) 3.3’ ‘-DIHIDROXI-TETRAHIDRO-OCHNAFLAVONA (3,5,7,4’ Hypoos’ 3’’ 5’’,’?’ ‘-lieptahidroxi-3’-O-4’ copresasitorsie >Sievcrs, 1992; ‘ ‘-biflavanona> Sievers & ccl., 1952> 3,3’ • A’’ ‘-TRZNXDROflTETRARZDRO-ROBUSTAFLAVONA >3,5,7,4’ ,3’’,5’’,7’’,3’’’,4’’’- nonabidroxi 3’- 6’’Idypoum coprecasiforme Sievera, 1992, Sievere & col., HYPNUMHIFLAVONOIDE B >l’’’,2’’’,3’’ l>ypoust ‘4’ ‘‘-octrabidro-3,5,’?,3’’,5’’,7’’- coprecaiforse <Sievere, 1992; ALLO-HYPNUMBIP’LAVONOIDE 3 Hypoos’ copresasitorsie Siavera, 1992> I5YPNUMBIFLAVONOTDE A >2,5,4’,2’’,E’’ ,7’’-bcxabidroxiHypouTn coprassifors,e Sievera, Siavers biflevenona> 1992> haxabidroxi-4’’’& col,, 4’’’-kcto>7-0-2’’’), 1992, Sievere & col., inato - 3-1’ ‘‘,4’-O-2’’’->9itlavaoooa) 1992) <8,1’’’>— 1994> b i t 1 avanena 5. AURONAS BRACTEATINA (4,6,3’,4’,5’-pcooaliidroxi-aurona> Funaria bygronncorica )Mcitz 6. E, Ikan, 1977> ANTOOIAZIPINAS 6.1. Antocianidlnes <arrlicooas) LUTEOLINIDINA (5,7,2’ 4’ -oetrahidroxi-aooociaoidmna> >7) Splachoos’ rubros’ <Nilason & Scodz, 1573> <7) Spíacbnos’ varacolosus’ )Nilssoo E, Bcodz, 1973> ESFAGNORRUBINA A Spliagous’ sagallanicos’ VoMinincí, 1975) Spbagoos’ nes’orcos’ >Rodolpb & Joboin, 1982> Spbagoos’ plos’ulosus’ <Rudolpin E, Jolink,1982> Spbcgnos’ warostortii >Rudolpli & ,Jolink, 1982> Spbcgnos’robellos’ <Rudolpb & ,Toliok, 1552> ESFAGNORRUBINA 3 Sphagoue spp. Meotício E, Vowiokel, 1984> Spbagoum ocs’oreus’ <Rodolpli & Johnk, 1982) Spbagoum plocolosoin >Rudolph & Joboin, 1982) Spliegounr warostorfii >Rodolph & JoboJo, 1982) Spliegnus’ rubellum )Rudolpb & Johoin, 1982> ESFAGNORRUBINA C Sphagoos’ spp, <Nenolcio & Vowinkel, 1584> Spbagnos’ ocs’orcom >Rudolpb & Joliok, 1582> Spbagooca plusiulosos’ >Rodolpli & Johok, 1582> Spbagouin warnatortii )Rodolph E, Johoin, 1982> Sphagnoe robeMos’ <Rudolph a Jobok, :982> Bibliografía adicional: Beodo & col. >1956>9 y 1967>, Nileson <1967), Nilsson & Totts’ar <1963, 1964, 1965>, Rudolph E, Vowmokcl (1969>, VeaS (1975> 6,2, Antocianidinas 0-glicosiladas LUTEOLINIDINA 5-O-GLUCOSII2O s’ryum cryophilum >scndz & Martensaen, 1961; Bryus rutilana Beodo & Martenason, 1563> Bryos’ weigelii seodo & Marteoscon, 1963> Gcodz & 353 col., 1962> >1967>, Rudolpli , LUTEOLINIDINA 5 -0-DIGLUCOSIDO Bryum cryophilu~u )Bcodz & Martenason, 1961; s’ryus waigelii (Benaz E, Martaneson, 1963> Bryos’ rotileos >Bcndz & Maroenason, 1963> Y. & col,, CEALCONA Chalconas 0-glicociladas 0-GLICOSIDO rlagios’niura ciliare <Wyatt ACIDOS FLAVONOIDICOS & col,, 19918 ACIDO BARTRARICO >luocolioa-8,2’ ‘-ácido protocatéqoico) Bartresiia pozaiforcais Seeger, 1992; ACIDO HIPNICO lsypoum copreesitorme y b> Seeger & col., 1952>9> (Sievere, 1992; Sievera & col., 1994> ACIDO HIP&ICO METILESTER >Jypous cupresaitorras <Sievere, 1992; Sievcrs & col,, 1994> 9. 1962> cHALcONAS 7.1. 8. Bendz ALOE8TIDOS FLAVoNOIOIcOS HYPNUMALDEHIDO >3,5,7,4’ -tetrabidroxi-3’ Hypnoos copressitoríae -(3’’ -tocreil-6’ >Sicvcrs, 1992; ‘ -bidroxifenil) -flavasiona> Sisvera & col., 1992> 10, TRISLAVONOIDES BARTRANIA - TRI LUTEOL INA <2’, 8’’, 2’’’, 6’’’ ‘-Orilutcoitína> Bartras’ie pos’itors’is Seeger, AULACOMNTUN-TRILUTEOLINA <5’, 8’’, 5’’’, 6’’’’ -triloteolina) Aulecomnius’ palustre <Helio, 1992; Seeger E, col., 1993> 354 1552>9>