Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

ADN eucaryote est étroitement emballés dans les noyaux des cellules en chromatine. Le bloc de construction fondamental de la chromatine est la particule de noyau nucléosome qui contient ~ 147 pb d'ADN enroulé autour d'un complexe octamérique composé de deux copies de chacun des quatre histones (H3, H4, H2A, H2B). protéines histones abritent une pléthore de modifications post-traductionnelles (PTM). Ces substitutions covalentes induisent des altérations de la structure de la chromatine, directement en affectant la physico - chimie du système et , indirectement , en recrutant des activités de remodelage de la chromatine ^{1, 2, 3.} Par ces moyens, PTM histones contrôlent la chromatine accessibilité et, par conséquent, réguler toutes les fonctions cellulaires à base d' ADN ^4.

PTM sont installés par des systèmes enzymatiques histones modifiant principalement sur les segments N-terminaux non structurées (queues) de histo noyau nucléosome incorporénda. En raison des nombreux sites de modification sur la séquence relativement courte des queues d'histones, PTM influencent mutuellement en induisant ou en bloquant les réactions de modification ultérieure, un effet connu comme modification diaphonie ^5. En raison de l'architecture symétrique globale du nucléosome, des réactions de modification et les mécanismes de diaphonie ont été pensés pour produire de manière similaire sur les deux copies de chaque histone nucléosomale (histones soeurs). Ce concept a été récemment contesté et par la suite infirmée. En particulier, les dosages enzymatiques in vitro sur histones H3 libre queue peptides et sur nucléosomes ont démontré qu'un ensemble de kinases H3 introduit la phosphorylation de manière asymétrique ^6. En outre, l' analyse LC-MS / MS à base d'affinité , la purification a révélé l'existence de nucléosomes asymétriquement H3 méthylée dans plusieurs types de cellules eucaryotes ^7. Ainsi, nucléosomes asymétriquement modifiés constituent des espèces nouvelles, etoutils sont nécessaires pour découvrir les mécanismes qui contrôlent leur formation et d'analyser les effets de diaphonie que cette asymétrie pourrait exercer.

Communément, Western blot (WB) et la spectrométrie de masse (MS) analyse ont été utilisées pour détecter PTM histones. En dépit de son application facile, WB souffre de problèmes de spécificité / réactivité croisée. En plus de cela, il est incapable d'exécuter simultanément l' analyse multi-PTM et la quantification directe des réactions de modification ^8. D'autre part, l' analyse MS emploie une instrumentation sophistiquée qui nécessite une formation de haut niveau, mais fournit une haute spécificité ainsi que la cartographie simultanée et la quantification de plusieurs PTM ^9.   Cependant, les deux méthodes sont perturbateurs et les complexes sont dissociés nucléosomales avant l'analyse, ce qui donne naissance à un mélange d'histones et / ou des peptides dérivés de l'histone. Cette manipulation supprime la possibilité de faire la distinction indépendanteréactions de modification qui se produisent sur chacun des deux histones sœurs et à faire rapport de l'état de modification spécifique de copie des histones nucléosomales.

Résonance magnétique (RMN) nucléaire évolué comme une méthode alternative pour cartographier les réactions PTM. La RMN est non perturbatrice et permet ainsi le suivi des événements PTM d'une manière en temps réel dans des mélanges reconstitués, et même dans des cellules intactes ^{10, 11.} Le développement des routines pour l' acquisition rapide de données, ainsi que pour la cartographie à haute résolution sur la base 2D méthodes de corrélation hétéro-nucléaire d'échantillons marqués par des isotopes ⁽¹⁵ N et / ou ¹³ C) ¹² a permis l'application simultanée de différents types de PTM, par exemple comme la sérine / thréonine / phosphorylation de la tyrosine, la lysine acétylation / méthylation et l' arginine ¹³ méthylation. Selon le PTM sous enquête, ¹⁵ N- ou ¹³ C-étiquetage protocols peuvent être utilisés pour marquer le groupe fonctionnel de la protéine qui sert de rapporteur de modification. Par conséquent, la cartographie PTM peut être réalisée en suivant le déplacement de déplacement chimique caractéristique du groupe fonctionnel correspondant 'à détecter la modification de l'environnement chimique. Dans la plupart des cas, les deux groupes NH et chimiques CH peuvent être utilisés pour signaler l'évolution du PTM d'intérêt.

Le protocole actuel décrit la génération de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Il combine la flexibilité de la spectroscopie RMN à la carte PTM utilisant à la fois ¹ H- ¹⁵ N et ¹ H- ¹³ C spectres de corrélation avec l'utilisation de protéines différentes étiquettes d'affinité pour la purification des complexes histone reconstitués sélectionnés. Notamment, le protocole utilise deux piscines différentes d'une histone particulière pour la reconstitution nucléosome. Ces piscines sont différentiellement marquée par un isotope (une avec 13 C), et ils sont fondus à une polyhistidine et une étiquette d'affinité streptavidine, respectivement. Une affinité schéma de purification en tandem avec Ni-NTA et la chromatographie à base de streptavidine initialement utilisé par Voigt et al. ⁷ est utilisé pour purifier des espèces asymétrique de leurs homologues symétriques (figure 1A). Octamères d'histones asymétriques sont utilisées ultérieurement pour reconstituer des complexes nucléosomales équivalents (figure 1B), en utilisant la méthode de dialyse de sel norme ^14. En outre, grâce à la même procédure et en ayant l'une des piscines d'histones pré-modifié, un PTM peut être incorporé de manière asymétrique sur les nucléosomes résultant. La réaction de ces substrats avec des enzymes de modification d' histone et la cartographie subséquente résonance magnétique nucléaire des événements de modification permettent la caractérisation des mécanismes de diaphonie à la fois en cis (préalablement modifié la copie histone) et en trans (unmodified copie histone) (figure 1C).

1. Reconstitution de nucléosomes avec Différentiellement Isotope marqué (et asymétriquement modifié) Soeur histones

NOTE: Le protocole actuel décrit la reconstitution de nucléosomes avec l' histone H3 différentielle marquée par un isotope. A cet effet, deux pools de l'histone H3 ont été utilisées; on était ¹⁵ N-étiquetés et contenait un 6xHis-tag à l'extrémité N-terminale et la seconde ¹³ C-étiqueté et contenait le peptide Strep (de WSHPQFEK) fusionnée à l'extrémité N-terminale. On a séparé les deux mots-clés de la séquence native H3 avec une Tobacco Etch Virus (TEV) site de reconnaissance de protéase. Pour préparer les nucléosomes supplémentaires asymétriquement modifiés, l'une des deux piscines H3 est inclus dans une forme préalablement modifiée. Modification préalable d'un pool d'histones peut être effectuée en faisant réagir l'histone marquée par un isotope d'intérêt avec l'enzyme histone modifiant respectivement en présence du nécessaire pour chaque type de cofacteurs de réaction / donneurs PTM ¹6. La mise en place efficace du PTM respectif peut être déterminée par spectroscopie RMN ou par spectrométrie de masse. Les quantités des histones / ADN utilisées ici sont des recommandations bruts afin d'obtenir une préparation de nucléosomes à une concentration approximative de 10 pm (mesurée par la concentration d'ADN à 260 nm) .Cet rendement final est suffisante pour enregistrer des spectres de RMN de bonne qualité relativement courts temps d'acquisition.

1. Reconstitution d'un octamère d'histone avec différentiellement marquée par un isotope (et asymétriquement modifié) histone H3
   NOTE: Recombinant protéines histones peuvent être produites en quantités mg dans BL21 (DE3) pLysS ^14. Pour obtenir des histones marqués par des isotopes, le même protocole d' expression / purification est suivi à l'exception de l' utilisation pour la croissance bactérienne d' un milieu minimal contenant ¹⁵ _NH4CI et / ou ^13C-glucose comme sources d'azote et de carbone, ¹⁵ N ou ¹³ C-étiquetage respectively. histones purifiées sont largement dialysées contre 5 mM β-mercaptoéthanol et stockées lyophilisées avant utilisation.
   1. Des aliquotes de dissoudre histone lyophilisées contenant environ 5 mg de chacun des histones dans 1 ml de tampon dépliage (7 M de guanidinium-HCl, 20 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de DTT). Inclure les deux types de histone H3. Mélanger par pipetage et ne pas vortex. Gardez les tubes sur la glace pendant 30 minutes pour permettre déroulement complet.
   2. Déterminer la concentration exacte de chacun des histones en mesurant l'absorbance à 280 nm contre un tampon dépliage et à l'aide des coefficients d'extinction calculés avec l'outil ProtParam du portail ExPASy. ¹⁵
   3. Mélanger les principaux histones à des rapports équimolaires, en gardant à l'esprit d'inclure 50% chacune des deux piscines de l'histone H3. Commencer par utiliser la totalité du contenu de l'histone moins concentré et ajouter tous les autres en conséquence.
   4. Ajuster la concentration finale en protéine d'environ 1 mg / ml en utilisant un tampon dépliage.
   5. transfer du mélange à une membrane de dialyse 6 kDa coupure et dialysé contre 1 à 2 litres de tampon de repliement refroidi (10 mM de Tris pH 7,5, 2 M de NaCl, 1 mM d'EDTA, 2 mM DTT) à 4 ° C. Changer le tampon au moins une fois après la dialyse est poursuivie pendant au moins 3 h. Effectuer une dernière dialyse O / N à 4 ° C.
   6. Récupérer la matière dialysée et enlever les précipités par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C sur la vitesse maximale (normalement pas de précipitation doit être observée). Déterminer la concentration octamère en mesurant l'absorbance à 280 nm. Dans les calculs, utiliser les coefficients d'extinction ajoutés des histones, en gardant à l'esprit de doubler chaque valeur.
   7. On concentre à un volume final de ~ 2 ml en utilisant une unité de filtre centrifuge 10 kDa coupure. Recalculer concentration octamère et la perte de l'estimation. A ce stade, une concentration comprise entre 50 octamère - 100 uM devrait être obtenue.
   8. Connecter la colonne de filtration sur gel (indiqué dans le tableau des matériaux) à unSystème FPLC et équilibrer avec 2 volumes de colonne (CV) de 0,22 um filtré et dégazé repliage tampon à un débit de 1 mL / min et une limite de pression de 0,5 MPa.
      NOTE: Le gel filtration terme doit être effectuée dans la chambre froide ou dans une armoire froide.
   9. Injecter le matériau concentré en utilisant un débit de 1 mL / min et de recueillir 1,0 - 1,5 ml fractions.
   10. Suivez le profil chromatographique et observer histone octamère élution à ~ 65 - 68 ml.
       NOTE: Un petit épaulement du pic d'élution et un pic à ~ 80 ml indique l'existence de libre tétramères H3-H4 et dimères H2A-H2B, respectivement.
   11. Exécuter 20 ul de chaque fraction collectée dans un gel SDS-PAGE à 18%.
       NOTE: Diluer les échantillons par un facteur d'au moins 2 avec de l' eau avant de les charger sur le gel pour réduire la concentration élevée en sel et donc, d' éviter les distorsions. Il en va de même pour les ultérieures analyses SDS-PAGE d'échantillons dans du tampon de repliement.
   12. Piscine fra pertinentections contenant des octamères pures jugées par la répartition égale des 4 histones sur le gel coloré et déterminer la concentration comme avant (étape 1.1.7).
   13. Connecter un ml de Ni-NTA colonne 1 (Table des Matières) à un système FPLC et équilibrer avec 10 CV de 0,22 um filtrée et dégazée repliage tampon à un débit de 1 mL / min.
       REMARQUE: La chromatographie Ni-NTA doit être exécutée dans la chambre froide ou en armoire froide.
   14. Passer octamère purifié par Ni-NTA en utilisant un débit de 1 mL / min.
   15. Recueillir accréditive et conserver les échantillons SDS-PAGE / analyse WB (20 pi et 4 pi, respectivement). Par la suite, laver la colonne avec 10 CV de repliement tampon ou jusqu'à ce qu'un signal de référence est atteint.
   16. Éluer avec 10 CV de tampon contenant 250 mM d'imidazole en utilisant un débit de 1 mL / min repliage. Conserver les échantillons pour SDS-PAGE / analyse WB (20 pi et 4 pi, respectivement).
   17. Équilibrer une colonne d'affinité 1 ml d'acstreptavidine ommerciaux (Table des matières) avec 10 CV tampon de repliement contenant 250 mM imidazole en utilisant une configuration de flux batch / gravité.
       REMARQUE: Cette étape chromatographique doit être effectuée dans la chambre froide.
   18. Passer Ni-NTA élution à travers la colonne d'affinité streptavidine commerciale.
   19. Recueillir l'écoulement à travers et conserver les échantillons SDS-PAGE / analyse WB (20 pi et 4 pi, respectivement). Par la suite, laver avec 10 CV de tampon de repliement.
   20. Eluer avec 10 CV de tampon contenant 2,5 mM desthiobiotine repliement. Conserver les échantillons pour l'analyse SDS-PAGE / WB (20 et 4 pi respectivement).
   21. Mesurer la concentration octamère, ajouter 10 fois moins protéase TEV et laisse la réaction continuer pendant une nuit à 4 ° C dans un tube de centrifugeuse en plastique standard.
       NOTE: La quantité nécessaire de TEV pour obtenir une digestion complète (suppression des étiquettes d'affinité) dépend de l'origine (construction) et sur l'activité (fraîchement préparé, TEV recombinant est plusactif par rapport à celui enregistré pendant des périodes prolongées à - 80 ° C). Essayez initialement en ajoutant 10 fois moins TEV par rapport à l'octamère (estimé que les concentrations de protéines) et ajuster en conséquence.
   22. Vérifiez la digestion efficace en exécutant 20 pi du mélange avant et après TEV addition sur un gel SDS-PAGE 18%. Si la digestion est incomplète, ajouter plus de TEV protéase et continuer l'incubation pour un autre 3-4 h.
   23. Dialyser échantillon contre un tampon de repliement en utilisant une membrane de dialyse de 50 kDa-coupure pour éliminer la protéase TEV et ajuster la composition du tampon.
   24. Concentrer l'octamère asymétrique purifié en utilisant une unité de 10 kDa de coupure centrifuge filtre (la même unité de filtration de l'étape 1.1.7 peut également être utilisé) à un volume de 1,0 à 2,0 ml. Mesurer la concentration finale. Soit utiliser peu de temps après pour la reconstitution nucléosome ou ajuster à 50% (v / v) de glycérol pour stocker à -20 ° C pendant de longues périodes. À ce stade, et attend au moins 70% de perte au cours des étapes précédentes, ee concentration de octamère devrait être de l'ordre de 20-50 uM.
2. reconstitution nucléosomes
   1. Si octamère a été stockée dans 50% de glycerol, on dialyse pendant une nuit à 4 ° C contre le tampon de repliement avant de procéder à la reconstitution du nucléosome.
   2. Réglez l'ADN (contenant un nucléosome-positionnement séquence) concentration de sel à 2 M de NaCl en utilisant un M de NaCl solution mère 5.
      NOTE: L'ADN purifié soit isolé après purification d'un plasmide qui contient des copies multiples de la séquence désirée ou synthétisé par l' amplification par PCR devrait être stocké concentrée à ~ 50 um dans de l' eau ou un tampon Tris-EDTA standard.
   3. Mélanger octamère et l'ADN en utilisant le rapport optimal déterminé à partir d'un test à petite échelle. Utiliser un tampon de repliage pour ajuster le volume final de ~ 3,0 ml. Toujours ajouter l'octamère dernier pour éviter tout risque de mélange de l'octamère et l'ADN à <2 M concentrations en sel.
      1. Effectuer petit-sc initialrecompositions ale pour déterminer le octamère: rapport d'ADN qui conduit à des rendements de nucléosomes optimaux. Pour cela, assembler trois réactions de 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 et 1,1: 1,0: ADN octamère ratios dans un volume compris entre 50-100 ul. En règle générale, utiliser une concentration d'ADN de 5 uM.
      2. Procéder à la reconstitution comme décrit ci-dessous (étapes 1.2.4-1.2.8) et à la fin, estimer la quantité de soluble et de bonne qualité nucléosome reconstitué en mesurant la concentration d'ADN à 260 nm et en exécutant un gel à 6% d'ADN natif PAGE , colorés avec du bromure d'éthidium, respectivement (figure 5A).
   4. Transférer le mélange à une membrane de dialyse 6 kDa-coupure et dialyser contre 1 L de repliement tampon pendant une nuit à 4 ° C.
   5. Réduire la concentration en sel du tampon de dialyse d'une manière progressive à partir de 2, à 0,85, 0,64 et 0,2 M de NaCl, respectivement. Gardez l'échantillon dans chaque tampon pendant au moins 3 h. Parfois précipité est formé après la dernière transition. Dans ce cas, continuer dialyse comme prévu et retirer précipité par centrifugation microfuge à la fin de l'étape suivante.
   6. Le transfert de la membrane de dialyse dans un bêcher de 1 litre de tampon d'essai (25 mM de NaH ₂ PO ₄ / Na ₂ HPO ₄ pH 6,8, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT) et continuer la dialyse O / N à 4 ° C.
   7. Prélever un échantillon, enlever tout précipité formé à l'étape 1.2.5 par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C sur la vitesse maximale et concentré en utilisant une unité de filtre centrifuge 30 kDa-coupure à un volume final de 300 pi ~.
   8. Mesurer la concentration d'ADN à 260 nm, exécuter un gel de 18% de protéine SDS-PAGE (4 pi de l'échantillon) et un gel à 6% PAGE natif ADN (0,2 pi de l'échantillon) et de l'échantillon de conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines. La concentration finale devrait être de l'ordre de 10-20 uM.

2. Analyse RMN des réactions de modification sur les deux soeurs histones

NOTE: Cession de2D ¹ H- ¹⁵ N spectres de corrélation de queues d'histones nucléosomales peut être trouvé à des références ^{16, 17, 18.} En outre, les affectations de CH _x groupes de lysines, sérines et threonines sur 2D spectres de corrélation ¹ H- ¹³ C peut être trouvé à la référence ^16.

1. Configuration RMN et l' enregistrement des spectres de référence
   NOTE: Des essais enzymatiques ont été effectuées en utilisant 140 pi de l'échantillon nucléosome dans un tampon d'essai dans un tube de RMN 3 mm à 300 K. Les différents tubes RMN avec d' autres volumes d'échantillon peut également être utilisé. La température mentionnée ci - dessus est approprié pour obtenir une bonne qualité ¹ H- ¹⁵ N spectres de corrélation de queues d'histones nucléosomales et de bonnes activités enzymatiques. 2D-SOFAST-HMQC ¹ H- ¹⁵ N et 2D-HSQC ¹ H- ¹³ C spectres ont été enregistrés respectivement avec une configuration tchapeau confère des temps d'acquisition similaires. Paramètres d'acquisition typiques sont 128 transitoires avec 1.024 ⁽¹ H) x 128 ⁽¹⁵ N) de points complexes et 32 transitoires avec 1.024 ⁽¹ H) x 64 ⁽¹³ C) des points complexes pour les deux types de spectres de corrélation différents. Pour les deux spectres 2D, le temps d'acquisition était de ~ 30 min.
   1. Régler 300 K lorsque la température de l'échantillon dans le spectromètre. Ajouter 10% de D ₂ O (v / v) à l'échantillon à être utilisé pour le verrouillage de la fréquence du spectromètre.
   2. Placer l'échantillon dans le spectromètre et effectuer des opérations de base (verrouillage, réglage, dsépaisseur). En outre, de déterminer des longueurs d'impulsion optimales et les paramètres généraux d'acquisition.
   3. Enregistrement 1D et 2D ¹ H- ¹⁵ N et ¹ H- ¹³ spectres de référence C.
   4. spectres de référence des processus et veiller à ce que les signaux à utiliser pour cartographier les réactions de modification sont bien résolus et avoir de bonnes intensités.
   5. Récupérer l'échantillon et transférer it pour un tube de microcentrifugation.
2. Mise en place de la réaction enzymatique, suivi par RMN et l' analyse quantitative
   1. Copier et organiser une série de 2D entrelacé ¹ H- ¹⁵ N et ¹ H- ¹³ C spectres. Visez un temps total d'acquisition de plusieurs heures et ajuster en conséquence dans un nouveau cycle sur la base des taux enzymatiques obtenus à partir de la première réaction.
   2. Ajouter à l'échantillon des cofacteurs nécessaires pour le type respectif de réaction de modification (ATP 1 mM / 2 mM de _MgCl2 pour la phosphorylation, 1 mM de l' acétyl-CoA pour acétylation, 1 mM de SAM pour la méthylation, etc.).
   3. Ajouter l'enzyme d'intérêt, mélanger par pipetage, transférer l'échantillon dans le tube RMN et par la suite dans le spectromètre (effectuer rapidement ces opérations).
      NOTE: S'il n'y a pas de données sur l'activité enzymatique attendue, ajuster le substrat à l' enzyme rapport molaire à 10: 1. Effectuer un premier galop d'essai et d'ajuster en conséquence pourla course réelle.
   4. Effectuer un calage automatique rapide et utiliser le reste des paramètres à partir des spectres de référence.
   5. Initier la série des entrelacée 2D ¹ H- ¹⁵ N et ¹ H- ¹³ C Les spectres.
   6. Suivez la progression de la réaction en temps réel et arrêter l'acquisition lorsque la réaction atteint la fin ou à un niveau souhaité.
   7. Les spectres de processus comme précédemment avec les mêmes paramètres.
   8. Répétez l'ensemble exécution à l'aide d'un ordre d'acquisition différents pour les deux types de spectres de corrélation. Si dans la première expérience d' un ¹ H- ¹⁵ N corrélation était la première fois dans la série, maintenant démarrer avec une C corrélation ¹ H- ^13. Par cela et ayant en même temps d'acquisition pour les deux spectres, il est possible de tracer et de comparer les réactions PTM sur les deux histones marqués par des isotopes différentiellement sur la même échelle de temps. En outre, il est possible de calculer les moyennes et les barres d'erreur de tracé.
      NOTE: Un thorough description des méthodes d'analyse du signal RMN et la quantification ultérieure des réactions enzymatiques peuvent être trouvés ici ^19.
   9. Sélectionnez signaux RMN de chaque spectre RMN évolution temporelle qui signalent la progression de la réaction et de calculer leurs intensités de signal relatives à l'aide d'un logiciel de visualisation et d'analyse pour les spectres RMN. Pour ce faire, pour des signaux qui rendent compte non modifié, ainsi que l'état modifié. Extraire des niveaux de modification.
   10. Tracer les valeurs calculées de niveaux de modification en fonction du temps de réaction.

Espèces octamères correctement repliées sont isolées après une course du mélange de reconstitution à travers une colonne de filtration sur gel (Figure 2). La piscine reconstituée octamère contenant les trois types de octamères différents est soumis au régime tandem de purification par affinité. Des échantillons sont prélevés toutes les étapes et analysées par SDS-PAGE et ensuite BM. La vérification de l'exécution correcte du protocole qui aboutit à l'isolement d'espèces asymétrique est obtenue par suite de la présence des deux marqueurs d'affinité (His) et la streptomycine dans les différents échantillons (figure 3). Par la suite, les marqueurs d'affinité sont retirés après digestion par la protéase TEV (figure 4). octamères asymétriques disposés de balises d'affinité sont utilisés pour reconstituer les nucléosomes asymétriques. Dans un premier temps, une petite reconstitution essai à l'échelle est utilisée pour déterminer le rapport molaire optimal de l'ADN: octamère qui se traduit par une forteobtenir la formation d'un complexe monodispersée. Par la suite, le rapport de mélange optimisé est utilisé pour reconstituer nucléosomes dans une grande échelle. Reconstitution des nucléosomes sont analysés par des protéines / ADN des gels et par spectroscopie de RMN pour l'assemblage correct et la présence des sœurs différentiellement histones H3 marqués par des isotopes , respectivement (figure 5). Un exemple d'application est représenté dans la figure 6. En particulier, marqué par un isotope de façon différentielle et asymétriquement phosphorylée sur H3S10 nucléosomes sont amenés à réagir avec Gcn5 acétyltransférase et acétylation H3K14 de H3 sur les deux copies est suivie en temps réel par spectroscopie RMN. L'analyse révèle que H3S10 phosphorylation stimule H3K14 acétylation par Gcn5 en cis par rapport à trans.

Figure 1: Diagramme pour la préparation de Différentiellement Isotope-labeled (et asymétriquement modifié) nucléosomes. (A) Reconstitution et tandem purification par affinité de manière différentielle marquée par un isotope (et asymétriquement modifié) octamères d'histones. (B) de reconstitution des nucléosomes en combinant les octamères purifiées asymétriques et une séquence d' ADN nucléosome positionnement. (C) la surveillance de RMN en eis et en trans modification diaphonie après mélange des nucléosomes marqués par des isotopes asymétriquement modifiés et de manière différentielle avec des enzymes modifiant les histones. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Reconstitution des histones octamères. Un profil d'élution par filtration sur gel du mélange d'histones replié. Le pic majeur à ~ 70 ml correspond aux octamères d'histones. A 14 - gradient gel SDS-PAGE à 20% (coloration au bleu de Coomassie) des fractions éluées correspondant au pic octamère montre la stoechiométrie correcte histone. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Purification de Asymmetric histones octamères. 14-20% de gel gradient SDS-PAGE (Coomassie) et WB contre les riques et streptomycine affinité étiquettes d'échantillons des différents stades du schéma tandem de purification par affinité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Retrait de l'affinité Tag. 18% de gel de SDS-PAGE (coloration de Coomassie) des octamères d'histones asymétrique purifiés avant et après mélange avec la protéase TEV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Caractérisation biochimique et RMN du Différentiellement Isotope marqué nucléosomes. (A) un gel à 6% d'ADN native-PAGE (coloration au bromure d' éthidium) d'une reconstitution nucléosome petit test à l' échelle en utilisant différents rapports molaires de l' ADN: octamère (gauche). 6% de gel PAGE natif ADN (coloration de bromure d'éthidium) d'une reconstitution nucléosome à grande échelle en utilisant l'ADN optimisé: octamère rapport molaire (à droite). (B) 18% de gel de protéine SDS-PAGE (coloration de Coomassie) de nucléosomes reconstitués montre la bonne stœchiométrie des quatre histones. (C) ¹ H- ¹⁵ du spectre N SOFAST-HMQC de la copie H3 ¹⁵ N marqué de nucléosomes marqués par des isotopes différentiellement (seulement H3 résidus de queue sont visibles - le noyau de la protéine est invisible en raison du taux de tumbling lent). (D) ¹ H- ¹³ C spectre HSQC de ¹³ copie marquée au C H3 nucléosomes marqués par un isotope de manière différentielle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: RMN suivi de In cis et trans En Modification Cross-talk Imposée par Asymmetric Phosphorylation de H3S10 sur l'activité acétylation H3K14 de Gcn5 Acetyltransferase. (A) Représentation schématique des isotopes étiquetés et asymétriquement phosphorylée sur H3S10 nucléosomes ont réagi avec Gcn5 acétyltransférase et la cartographie d'acétylation H3K14, en cis et trans différentiellement. (B) ¹ H- ¹⁵ N SOFAST-HMQC et ¹ H- ¹³ C spectres HSQC (régions sélectionnées) des nucléosomes asymétriques avant et après réaction avec Gcn5. (C) résolue en temps suivi RMN du H3K14 acétylation par Gcn5 sur nucléosomes asymétriquement H3S10 phosphorylés. Les moyennes et les variations (barres d'erreur) à partir de deux expériences indépendantes sont présentés. Reproduit avec la permission ^16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandecette figure.

Pour la reconstitution du nucléosome, le protocole actuel utilise une matrice d' ADN long de 165 pb contenant la séquence de 601 Widom de positionnement ²⁰ nucléosome, mais une performance similaire est prévu à l' aide de différentes longueurs de matrices d'ADN. Le protocole a été conçu et utilisé en utilisant des types asymétriques de l'histone H3. Avec le même principe, la méthode peut être appliquée aussi pour les autres histones et peut en outre être utilisé pour reconstituer des complexes porteurs de deux histones distinctes avec différentes étiquettes isotopiques. Le protocole peut également être légèrement modifié pour reconstituer un premier sous-complexes d'histone et non directement Histone octamères. À la suite de cette modification, tétramères H3-H4 asymétriques peuvent être reconstituées en utilisant le même schéma de purification en tandem. Ces derniers sont mélangés avec reconstitués séparément dimères H2A-H2B et de l' ADN pour assembler nucléosomes ^16. Les rendements finaux et la performance globale de l'protoc modifiéeol sont semblables à l'original.

Le protocole est fortement dépendante de la capacité des deux colonnes d'affinité pour lier efficacement l'espèce concernée et donc de produire, à la fin des complexes asymétriques très purs. Il est lourd de fournir une preuve directe et concrète que le complexe purifié final est en effet et seulement asymétrique. Cependant, l' analyse WB des échantillons de toutes les étapes de purification avec les anticorps appropriés fournit des indications fiables pour le succès du système de purification en tandem (Figure 3). Les mêmes résultats, et par conséquent une assurance supplémentaire, ont été obtenues en analysant les mêmes échantillons pour détecter la présence des marqueurs d'affinité par des procédés de RMN ^16. Pourtant, si l'analyse WB indique la contamination des espèces asymétriques avec les symétriques, une petite variation peut être adoptée lors de la première étape de purification (Ni-NTA) qui peuvent améliorer les résultats. En particulier, au lieu d'une élution isocratique, un gradien imidazole t élution (10-250 mM) peut être utilisé et ensuite, seules les premières fractions d'élution qui sont fortement enrichies en l'espèce asymétriques sont mises en commun et dirigé à travers la colonne d'affinité. Elle peut être évaluée par analyse WB des fractions d'élution pour la présence de l'étiquette strep d'affinité.

La sélection de l'isotope étiquette par rapport à la PTM d'intérêt est relativement souple , car la plupart des cas, la RMN est capable de mapper le même PTM utilisant à la fois ¹ H- ¹⁵ N et ^{13 1} H- Ccorrelation spectres. Cependant, pour certains acides aminés, comme lysines, la dispersion de déplacement chimique pour les ¹ H- ¹³ résonances secondaires à chaîne C est plutôt limitée. En outre, lorsque les sites cibles d'une enzyme de modification de la lysine ne sont pas connus, spécifiques au site de lecture de la lysine PTM est pas simple. Dans ces cas, les méthodes alternatives utilisent des sites sélectifs ¹³ C-marquage, associé à la production d'histone semi-synthétique"> 21 ou l'utilisation de séquences d'impulsions RMN nouvellement créées qui permet la détection spécifique des états de modification par excitation sélective routines ^22. La spectroscopie RMN confère plutôt une faible sensibilité. À cet égard, des quantités relativement élevées de nucléosomes (gamme uM) sont nécessaires pour effectuer la réactions enzymatiques. Cela empêche l'évolution de la méthode pour une configuration à haut débit.

Parallèlement, une nouvelle méthode chimique a été introduit pour la synthèse de nucléosomes chimiquement purs, asymétriquement modifiés, avec des rendements élevés, portant défini PTM ^23. Cette approche a été utilisée, en combinaison avec fluorographie, pour étudier les mécanismes de diaphonie PTM. En raison de la capacité à faible résolution des méthodes fluorographiques dans la détection de PTM, les conclusions ont été tirées indirectement en comparant les activités enzymatiques globales sur un ensemble de nucléosomes portant différentes combinaisons de PTM symétriques et asymétriques, plutôtque par l'observation directe des réactions PTM sur les sites correspondants de chaque histone sœur. Cependant, l'incorporation des histones marqués par des isotopes et l'utilisation de la spectroscopie RMN pour PTM lecture pourraient constituer le procédé susmentionné un outil supplémentaire pour haute résolution analyse de PTM de nucléosomes asymétriquement modifiés.

Dans le cadre de l'identification de nouveaux types de nucléosomes asymétriquement modifiés dans l'avenir, la méthode actuelle vise à constituer un outil de haute résolution pour l' analyse en cis et dans les réactions de diaphonie PTM trans sur des substrats nucléosomales. En particulier, une grande importance est le décodage des mécanismes de diaphonie qui donnent lieu à des nucléosomes ²⁴ bivalents qui contiennent dissymétrique, les deux PTM transcriptionnellement actifs et répressives.