Capítulo 1:
Limitaciones para el estudio de células y tejidos
Capítulo 2:
Nociones básicas de óptica
Capítulo 3:
La imagen. Sistemas ópticos
Capítulo 4:
El microscopio compuesto
Capítulo 5:
El microscopio electrónico
Capítulo
6:
Técnicas especiales de microscopía
LA MICROSCOPÍA:
HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CÉLULAS Y TEJIDOS
CAPÍTULO
6
TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA
6.1.-Microscopio de campo oscuro
6.2.-Microscopio de contraste de fase
6.3.-Microscopio de luz polarizada
6.4.-Microscopio de contraste por interferencia diferencial
6.5.-Microscopio de fluorescencia
6.6.-Microscopio de luz ultravioleta
6.7.-Microscopio confocal
6.8.-Otros tipos de microscopios
Además de los tipos de microscopios mencionados anteriormente, se describen a continuación otros microscopios con aplicaciones muy concretas y de uso más especializado:
6.8.1.-Microscopios de barrido con sondas
También denominados de sonda de barrido (scanning probe microscopes): Son instrumentos primordiales en la nanociencia. Se constituyen básicamente de una plataforma y una sonda o aguja fina que recorre la superficie de la muestra con gran precisión (escaneo o barrido). Este filamento se coloca muy cerca (a 1 nm) del objeto a estudiar, generando una corriente eléctrica y se desplaza por la superficie, captando electrones que se escapan en lo que se llama efecto túnel. Los electrones saltan de la punta a la muestra y viceversa. La corriente del efecto túnel varía dependiendo de la distancia entre la sonda y la muestra. De esta manera se reproduce la topografía o relieve de la muestra con una alta resolución y mediante programas informáticos, la imagen es traducida por la computadora, pudiéndose distinguir un átomo de otro y se genera una imagen en tres dimensiones.
Dependiendo del tipo de sonda se puede obtener información sobre las propiedades químicas, eléctricas, mecánicas o físicas de la microestructuras o nanomateriales (127). Como aplicaciones en biotecnología se realiza el estudio genético de moléculas de ADN, ARN (128) y la manipulación y desplazamiento de átomos para ser colocados donde se requiera. Estos microscopios deben estar colocados sobre un sistema anti-vibración y van acoplados a una computadora. Dentro de esta categoría de microscopios se citan los más importantes:
•
Microscopio de efecto túnel: Creado por Binning y Rohrer
en el año 1981, por lo que fueron laureados con el Premio Nobel
en 1986 por este descubrimiento. Es el prototipo inicial de esta generación
de microscopios. Los materiales deben ser conductores o semi-conductores
(fig. 6-31, 6-32).
Figura 6-31.- Imagen que muestra la sonda (punta de la aguja) situada a una distancia muy corta de la superficie de la muestra. Tomado de Microscopios de barrido con sondas. Nanoquímica. (127).
Figura 6-32.-Micrografía de la superficie de un cristal en el cual se aprecian los átomos de silicio, mediante la técnica de microscopio de efecto túnel. Tomado de Díaz C. Página de electrónica. Átomo (129).
• Microscopios de fuerza atómica: Es un instrumento mecano-óptico similar al microscopio de efecto túnel, pero también se emplea en materiales no conductores, como las muestras biológicas. La sonda es una aguja un tanto más fina, de escasos micrómetros de largo y de unos 10nm de diámetro, la cual se dobla al desplazarse sobre la muestra, detectando de esta manera las irregularidades en la superficie, “palpando la muestra” y por ende su forma. Se captura la información proveniente de la fuerza magnética de superficie de la muestra lográndose ver moléculas muy pequeñas y átomos. Este microscopio tiene muchas aplicaciones en biología celular (130, 131, 132, 133) (figs. 6-33, 6-34, 6-35).
Figura 6-33.-Imagen de la sonda sobre la superficie del material en estudio en un microscopio de fuerza atómica. Tomado de Microscopios de barrido con sondas. Nanoquímica. (127).
Figura 6-34.-Microscopio de fuerza atómica. Tomado de Nano y micro-partículas en materiales multicomponentes. Análisis de imagen (134).
Figura 6-35.-Estudio del efecto de antibióticos sobre la superficie de células sanguíneas humanas (glóbulos rojos). Imagen tomada con microscopio de fuerza atómica. Tomado de Cole E. (135).
•
Otros microscopios de barrido con sondas:
- Microscopio de barrido térmico: Mide la conductividad térmica
de la superficie del espécimen y de esta manera se obtiene información
sobre la topografía (127).
- Microscopio de barrido óptico de campo cercano: Emplea una fibra óptica por la cual se hace pasar un haz de luz, el cual a su vez pasa por una micro-abertura (en el orden de decenas de nanómetros). La sonda es inmóvil y el espécimen se desplaza, midiendo las propiedades ópticas y la topografía de la muestra. La resolución puede alcanzar alrededor de 100 nanómetros (127).
- Microscopio
de iones en campo: Los ejemplares se observan en una cámara de
alto vacío la cual es cargada con un gas como el helio o el neón.
La muestra se congela y se le aplica un voltaje positivo; los átomos
del gas se ionizan y el material provoca una magnetización que
repele los iones, los cuales chocan sobre un detector que recoge la
información, obteniéndose así una imagen de alta
definición por los iones gaseosos rechazados. Se emplea para
el análisis de átomos, en el estudio o microanálisis
de nanomateriales y elaboración de microsondas para microscopios
de barrido con sondas. Es uno de los microscopios que ha permitido la
obtención de imágenes muy nítidas a escala atómica
(136) (fig. 6-36)
Figura 6-36.-Imagen de la punta muy fina de una aguja o nanosonda de tungsteno, en donde cada estructura esférica corresponde a un átomo. Las estructuras alargadas corresponden a trazas dejadas por los átomos en movimiento durante la captura de la imagen (1 s). Imagen obtenida con un microscopio de iones en campo. Tomada de Physics new graphics. The sharpest man made thing (137).
6.8.2.-Microscopio de fluorescencia de excitación con dos fotones
Es otro de los microscopios novedosos y recientes más importantes para la investigación biológica que permite un estudio no invasivo y la formación de imágenes en 3D. Está basado en una técnica relacionada con la microscopía confocal que permite obtener cortes ópticos de especímenes fluorescentes pero con mayor poder de penetración (hasta un milímetro).
El principio consiste en un método especial para excitar las moléculas fluorescentes con ventajas obvias sobre el microscopio confocal. La excitación de la molécula fluorescente se realiza mediante la absorción simultánea de dos fotones (con la técnica de fluorescencia convencional la molécula fluorescente absorbe un fotón). Esto se logra al hacer incidir de manera discontinua y pulsátil (en intervalos de picosegundos) un laser altamente enfocado y ha permitido el estudio de células vivas y otros especímenes, los cuales pueden ser observados por un tiempo más prolongado.
De esta manera la emisión de la fluorescencia se cuadriplica y se disminuye notablemente el daño ocasionado por el laser sobre las células. Esta técnica es ideal para localizar reacciones fotoquímicas y de moléculas efectoras. La técnica microscópica se complementa con computadoras altamente eficientes (138, 139) (fig. 6-37).
Figura 6-37.- Estudio “In vivo” realizado con microscopía de dos fotones. La mayor penetración permite el monitoreo de la actividad neuronal y de los cambios morfológicos de las células nerviosas en el cerebro de un ratón vivo. Este microscopio puede detectar señales fluorescentes de las capas más profundas (hasta 0.9 mm) de la superficie de la corteza cerebral, de manera que se pueden observar las neuronas de todas las capas de la corteza en el animal vivo. Tomado de Nemoto T. Section of Information Processing (Two-photon microscopy) (140).
Este tipo de microscopio muy particular que fue introducido en el año
1974 (141) y su equivalente en microscopía electrónica,
denominado microscopio electrónico acústico de barrido
(142). Están basados en la generación de ondas sonoras
que inciden sobre el espécimen y las variaciones en el sonido
reflejado determinan el contraste y la formación de una imagen.
Las ondas reflejadas por el espécimen son colectadas por un transductor
que transmite la señal a un monitor de rayos catódicos.
Este tipo de microscopio se empleó principalmente en la observación
de la ultraestructura celular con una resolución comprendida
entre 0.5-0.7 µm. En algunos modelos se utilizó agua como
un medio de inmersión que facilitaba la distribución de
las ondas sonoras. Tanto el escaso poder de resolución como la
baja calidad de las imágenes obtenidas por esta técnica
determinaron que el microscopio acústico tuviera poca aceptación
ya que sus aplicaciones eran muy limitadas en las investigaciones científicas.
AUTOEVALUACIÓN PARA EL CAPÍTULO 6:
1. ¿Cuáles son los principios básicos de las técnicas especiales de microscopía en la búsqueda de un buen balance entre el contraste y la resolución para obtener imágenes microscópicas?
2. Cite los tipos de microscopios especiales que permiten ampliar las posibilidades del microscopio fotónico común.
3. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de campo oscuro? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
4. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de contraste de fase? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
5. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de campo oscuro? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
6. ¿Cuáles son los tipos de iluminación de contraste de fase?
7. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de luz polarizada? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
8. ¿En qué consiste la isotropía y la anisotropía?
9. ¿Qué es la birrefringencia?
10. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de fluorescencia? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
11. ¿Qué es la fluorescencia? Cite algunos fluorocromos empleados en microscopía.
12. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de luz ultravioleta? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
13. ¿Cuál es el fundamento del microscopio confocal o láser de barrido? ¿Cuáles son sus aplicaciones?
14. Enumere las ventajas del microscopio confocal sobre el microscopio fotónico común.
15. Cite algunos tipos de microscopio de barrido con sondas. Explique sus principios y aplicaciones en los estudios de las células y tejidos.
16. ¿Cuál es el fundamento del microscopio de fluorescencia de excitación de dos fotones? ¿Qué ventajas presenta este microscopio sobre los demás microscopios de fluorescencia y sobretodo en la obtención y preparación de los especímenes?
LECTURA SUGERIDA PARA EL CAPÍTULO 6:
2. Basics of Polarizing Microscopy. Olympus.
3. Wilhem S., Grobles B., Gluch M., Heinz H. Confocal Laser scanning microscopy. Carl Zeiss Jena GmbH.
4. Claxton, N., Fellers, T., Davidson, M. (2008). Laser scanning confocal microscopy.