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6 LAGARTOS

1 LAGARTO. 6 LAGARTOS. 3 LAGARTOS. CRISTALES DE PROTEÍNA. Tamaño. Forma Frágiles. Sensibles - Interacciones débiles - Alto contenido de solvente (20-80%) * Difusión Derivados complejos * Estructura Nativa No-centrosimétricos - Sólo 65 G. Espaciales

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  1. 1 LAGARTO 6 LAGARTOS 3 LAGARTOS

  2. CRISTALES DE PROTEÍNA Tamaño. Forma Frágiles. Sensibles - Interacciones débiles - Alto contenido de solvente (20-80%) * Difusión Derivados complejos * Estructura Nativa No-centrosimétricos - Sólo 65 G. Espaciales Alto volumen celdilla elemental - Gran número de reflexiones - Baja intensidad del espectro - Intensidad decrece drásticamente en el tiempo

  3. CRISTALIZACIÓN Principio: - Mínimo de solubilidad - Población única * Difusión Derivados complejos * Estructura Nativa Factores: - {Proteína}: 5-30 mg/ml - {Precipitante}: sales, disolventes, PEG - pH: buffer - T: 4,20º - Aditivos: - Iones M - Inhibidores - agentes reductores

  4. DIFUSIÓN DE VAPOR Proteína + Precipitante Precipitante

  5. 1mm

  6. X-Ray N2 Detector

  7. La l debe ser proporcional al tamaño del objeto. La distancia entre puntos es inversamente proporcional a la distancia entre nudos de la red. A medida que nos alejamos del centro la difracción es más débil. La geometría de los puntos de difracción está relacionada con la geometría de la red.

  8. PROBLEMA DE LA FASE Espacio Real Espacio Recíproco TF Densidad electrónica r (x y z) Factor de estructura |F(h k l)| + F (h k l) siempre ?? ??? r (x y z) = 1/V S |F(h k l)| exp {-2pi (hx+ky+lz)+ iF (h k l)} I(h k l)  |F(h k l)|2 Remplazamiento Molecular Remplazamiento Isomorfo MAD SOLUCIÓN

  9. FAMILIA ESTRUCTURAL GLOBINAS 1ash 1flp 1ithb Hemoglobin (ascaris suum) Hemoglobin (lucina pectinata) Hemoglobin (urechis caupo) 2hgb 2gdm 1mbc Leghemoglobin (lupinus luteus) Hemoglobin (glycera dibranchiata) Myoglobin (sperm whale) Percentage identity matrix 1flp 100 1ithb 22.8 100 2gdm 21.2 18.0 100 1mbc 18.5 15.1 17.0 100 2hbg24.4 23.1 19.9 22.1 100 1ash 13.3 10.1 15.8 15.9 14.6

  10. REMPLAZAMIENTO MOLECULAR Determinar las posiciones de las moléculas dentro de la celdilla cristalina. Función de Rotación Función de Translación Modelo Cuerpo Rígido Parámetros: - Completitud y calidad de los datos. - Homología entre el modelo molecular y las moléculas reales que constituyen el cristal ( > 30%). - Tamaño del modelo molecular respecto al contenido de la celdilla.

  11. REMPLAZAMIENTO ISOMORFO MULTIPLE - MIR Incluir átomos pesados en el cristal nativo que queden en posiciones fijas de la molécula sin deformar ni la celdilla ni la conformación de la proteína. LAS DIFERENCIAS EN INTENSIDADES DEBEN SER EXCLUSIVAMENTE DEBIDAS A LOS ATOMOS PESADOS MÉTODO: 1. Preparación de, al menos, un derivado (Hg, Au, Pt, U, Sm...Xe,Kr). 2. Toma de datos de difracción para nativa y derivados. 3. Aplicación de función de Patterson y obtención coordenadas del metal. 4. Refinamiento parámetros átomo pesado y cálculo ángulos de fase. 5. Cálculo de mapas de densidad electrónica de la proteína.

  12. MIR Derivado de Sm de Hal2 INCONVENIENTES: 1. Errores en |FPH| y |FP|. 2. No isomorfismo (4% < dmin). 3. Desorden en sitios minoritarios. 4. Escalado.

  13. MAD VENTAJAS: 1. No hay problemas de isomorfismo. 2. Da mejores resultados a alta resolución. DISPERSIÓN ANÓMALA: Espectro de fluorescencia de un cristal de proteína con Se-Met. Para determinadas E del haz de Rayos X se produce un fenómeno de absorción y resonancia de electrones de capas internas. Modificación de la contribución del átomo pesado a cada spot de difracción (efecto anómalo). F(h k l)  F (-h, -k, -l) (D |F|anom)2 (x, y , z) anom

  14. MAD MÉTODO: 1. Inclusión de dispersores anómalos en la estructura. Categoría Dispersor Anómalo Metaloproteínas metales de transición Fe, Cu, Zn, Mn otros metales Ca, Mo Remplazamiento de metales Ca2+, Mg2+ por Lantánidos Tb,Ho,Yb Zn por Mercurio Hg Complejos con átomos pesados derivados comunes Pt,Au,Hg,Pb,W,U Compuestos con “cluster” Ta,W Proteínas modificadas Selenometionina o selenocisteína Se Telurometionina Te nucleótidos Bromados o Iodados Br, I 2. Medida del espectro de absorción. 3.Toma de datos de difracción de rayos X a diferentes longitudes de onda. 4. Medida de los pares de Friedel { (h k l ), (-h, -k -l)} INCONVENIENTES: -Medidas cuidadosas. -Uso de diferentes l Radiación sincrotrón.

  15. SÍNTESIS DE FOURIER MR - MIR - MAD {(x y z)} F= S fj exp{2pi(hx+ ky+ lz)} Cristalógrafo |FCAL| + FCAL r (x y z) = 1/V S|FOBS| exp {-2pi (hx+ky+lz)+ iFCAL} |FOBS| DATOS EXPERIMENTALES

  16. MR - MIR - MAD MODELO INICIAL ERRORES GRAVES MEJORA DE LAS FASES REFINAMIENTO MODELADO - Analítico. -Datos estereoquímica - Gráfico - Experiencia Cristalógrafo - Elimina errores más graves MODELO FINAL

  17. REFINAMIENTO El modelo cambia para minimizar las diferencias entre los datos experimentales y los obtenidos a partir del modelo. Exray=S {|FOBS | - k |FCAL|}2 ET = Exray + Eempirical Eempirical=Sbonds Kb(b-bo)2 + Sangles K(- o)2 + Storsional Kf(1+ cos(nf-d))+ SVDV +...... TIPOS: - Mínimos cuadrados. - Gradiente conjugado. - Dinámica Molecular. U(x) DT CONTROL: - Estereoquímica. - Factor de desacuerdo, R. R = S {|FOBS | - k |FCAL|}/ S {|FOBS | } x

  18. MAPA DE DENSIDAD ·ELECTRÓNICA El mapa de densidad electrónica depende de la resolución. BAJA: 5Å MEDIA: 3Å ALTA: 1.7Å

  19. TRAZADO DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA

  20. MODELO FINAL CON ESFERA DE SOLVATACIÓN

  21. VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL Plot de Ramachandran

  22. VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL 1. R y Rfree (R < 0.2, Rfree =R+(5-10)% ) 2. Estereoquímica del modelo frente a la ideal. 3. Distribución de factores térmicos. 4. Ajuste en densidad.

  23. MODELO ESTRUCTURAL FINAL FICHERO DE COORDENADAS “pdb” Factor de ocupación Coordenadas:(x, y, z) ....................................................................... ATOM 1 CB ASP 9 -31.877 64.364 9.7111.0037.33 6 ATOM 2 CG ASP 9 -31.408 65.701 9.1621.0041.83 6 ATOM 3 OD1 ASP 9 -32.254 66.612 8.9981.0044.35 8 ATOM 4 OD2 ASP 9 -30.189 65.848 8.9181.0043.38 8 ATOM 5 C ASP 9 -32.205 62.836 7.7641.0028.21 6 ATOM 6 O ASP 9 -31.876 63.319 6.6831.0030.25 8 ATOM 9 N ASP 9 -33.860 62.883 9.6311.0033.61 7 ATOM 11 CA ASP 9 -32.913 63.691 8.8111.0031.98 6 ....................................................................... Factor térmico (B)

  24. INFORMACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL TIPOS: - ESTÁTICA {x y z}: - Estruct. terciaria. Dominios Funcionales - Estruct. Cuaternaria. - DINÁMICA {B}: - Flexibilidad funcional en bucles. -Termoestabilidad. INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA. INTERACCIONES PROTEINA-LÍPIDOS. INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: - Reconocimiento. - Estabilización. - Procesos Catalíticos. SUPERFICIES MOLECULARES: - Determinación de zonas accesibles. - Importancia del Potencial Electrostático.

  25. ESTRUCTURA CUATERNARIA Concanavalina de Cannavalia Brasiliensis La diferente agregación de los monómeros en la estructura cuaternaria provoca variaciones en su función biológica. GCMBE FEBS Letters 405, 114-118 (1997)

  26. INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA S-Adenosilmetionina Sintetasa MONÓMERO El centro activo se crea por el empaquetamiento de dos monómeros. TETRÁMERO Sitio de unión a metionina GCMBE (1999)

  27. ESTRUCTURA CUATERNARIA HAL3at El empaquetamiento cristalino es función del estado de agregación biológico de la proteína. Trímero (unidad fisiológica) GCMBE (1999) Empaquetamiento Cristalino.

  28. FLEXIBILIDAD FUNCIONAL EN BUCLES Lipasa Fungica Candida A Lid GCMBE (1999)

  29. TERMOESTABILIDAD Mutante Termoresistente TR1 Un puente salino provoca la estabilización del plegamiento. PROTEINS 33: 567-576 (1998) GCMBE DB= BNAT -BMUT

  30. INTERACCIONES PROTEINA-LIPIDOS Complejo Ternario Lipasa-Colipasa-Micela La unión del complejo Lipasa-Colipasa a una micela de sal biliar es necesaria para su activación in vivo. GCMBE EMBO Journal Vol. 16, 18, 5531-5536 (1997) El anclaje del complejo proteico a la micela se produce mediante residuos polares en la superficie micelar y mediante residuos hidrofóbicos y aromáticos en el interior de la micela.

  31. INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO Complejo ternario Hal2p-Metal-sustrato Hal2p hidroliza PAP a AMP. Es imprescindible la presencia de metales divalentes. Hal2p es inhibida por Li y Na. CLAVE para la tolerancia salina ya que es esencial para la vida celular. GCMBE EMBO Journal (1999). En prensa SITIO DE UNIÓN A METALES SITIO DE UNIÓN AL SUSTRATO

  32. SUPERFICIES MOLECULARES Aspartato Descarboxilasa (PanD) PanD descarboxila L-Asp para producir Ala. GCMBE Barril beta doble  Nature Struct. Biol. (1998). STRUCTURE (1999) El centro activo es inaccesible. Se propone movimiento relativo de protómeros para permitir la entrada del sustrato. La superficie molecular sugiere interacción con otros componentes celulares.

  33. INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: RECONOCIMIENTO b-Glucosidasa de Bacillus polymyxa GCMBE J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998) El Glu 405 puede acomodar Glucosa y Galactosa al estabilizar el OH(4) ecuatorial o axial. Glu405

  34. INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: PROCESOS CATALÍTICOS Lipasa pancreática La apertura del flap en el dominio catalítico permite la entrada del sustrato. J. BIOL. CHEM. Vol.271, 18007-18016 (1996) La estabilización del sustrato se realiza mediante residuos hidrofóbicos y la hidrólisis mediante la tríada catalítica (Ser, His, Asp).

  35. SUPERFICIES MOLECULARES ZONAS ACCESIBLES Mutante FNR-E301A La mutación provoca la creación de una cavidad que modifica el proceso de reoxidación de la enzima. GCMBE PROTEINS. (1999). La nueva cavidad permite el acceso del O molecular y la formación intermedio de la reacción flavin- hidroperóxido. Od

  36. SUPERFICIES MOLECULARES POTENCIAL ELECTROSTÁTICO Mutante FNR-R264E El potencial electrostático creado por los residuos cargados puede determinar la interacción entre proteína-proteína o proteína-ligando. GCMBE BIOCHEMISTRY. (1998). Líneas de campo en la FNR. Sección del potencial en la FNR.

  37. SUPERFICIES MOLECULARES POTENCIAL ELECTROSTÁTICO Octámero BglA El Glu306 en la superficie del octámero podría servir como “atractor” de azucares en BglA. GCMBE J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998)

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